CN109467599B

CN109467599B - 短肽atr001以及由短肽制备具有偏向性调节at1r功能的单克隆抗体和应用

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Publication number: CN109467599B
Application number: CN201710807113.6A
Authority: CN
Inventors: 陈霄
Original assignee: Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2037-09-08
Also published as: WO2019047921A1; CN109467599A

Abstract

本发明公开了一种短肽ATR001以及由短肽制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体和应用，该短肽ATR001，其氨基酸序列为AFHYESQ，杂交瘤细胞CQ8‑A2D9，其保藏编号为：CCTCC NO：C2017108。本发明运用单克隆抗体技术制备针对AT1R单克隆抗体，且该抗体可以偏向性调节AT1R功能，在血管重构类疾病，如高血压、动脉粥样硬化、动脉瘤中发挥治疗作用。

Description

短肽ATR001以及由短肽制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及短肽和单克隆抗体，具体地指一种短肽ATR001以及由短肽制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体和应用。

背景技术

肾素-血管紧张素系统(RAS)是调控人体生理功能的重要系统。肾素是由肾脏球旁细胞产生和分泌的一种蛋白水解酶，可水解血管张素原(AGT)生成血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)。心脏、血管、肾、肺等组织中广泛分布的血管紧张素转化酶(ACE)，可将AngⅠ降解为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，此外，AngⅠ也可在组织蛋白酶、弹性蛋白酶、糜酶(chymase)等作用下生成AngⅡ，或由内肽酶直接降解为血管紧张素1-7(Ang1-7)等一些列小分子活性物质。同时血管紧张素转化酶2(ACE2)也可作用于AngⅡ生成血管紧张素1-7(Ang1-7)等活性小分子。

目前研究表明，RAS通过两种方式发挥作用：一种是肾球旁细胞分泌的肾素及肝脏释放的AGT进入血液循环，通过一系列酶的水解作用生成活性小分子片段发挥生理作用。另一种是以旁分泌方式在局部生成AngII等活性分子发挥作用。目前认为，AngⅡ是RAS中最主要的生物活性肽，与相应受体结合发挥生物学效应，其中AT1受体(AT1R)是最关键的一种AngⅡ受体。作为一种G蛋白耦联受体(GPCR)，AT1R有典型的七次跨膜α螺旋结构，主要分布在血管、心脏、肾脏、脂肪等组织和器官。AngⅡ和AT1R结合后发挥以下作用：

1、缩血管，升血压；

2、促进细胞增生和肥大；

3、促进间质纤维化；

4、参与细胞凋亡；

5、调节细胞代谢；

6、促凝血作用；

7、促进醛固酮生成；

8、作用于中枢神经系统，调节水盐代谢，影响交感神经张力。

AT1R在人体血压调节中起重要作用，对高血压疾病的发生发展发挥着举足轻重的作用。有研究表明AngⅡ和AT1R作用，可激活血管内皮细胞膜上的NADH/NADPH氧化酶，诱导产生超氧阴离子(O^2-)，O^2-一方面可直接收缩血管，另一方面可与NO相互作用，抑制NO的舒血管作用，并可促进H₂O₂、NO₂、PGF2等缩血管物质的产生。此外，AngⅡ还可刺激内皮素的释放，最终导致血管平滑肌增殖和收缩、内皮损伤、血管壁重构而引起高血压病的发生和发展。

AT1R也参与了动脉粥样硬化的发生与发展过程。研究发现，相比Ldlr^-/-小鼠，AT1R与Ldlr基因双敲的小鼠能明显减轻高胆固醇血症诱导的动脉粥样硬化程度。Wassmann等还研究证实apoE与AT1R基因双敲小鼠能有效阻断高胆固醇饮食所致的血管的氧化应激、内皮功能失调、动脉粥样硬化病变形成，且独立于血压和血脂水平。进一步研究表明，AngⅡ通过AT1R激活血管内皮细胞细胞膜上的NADP/NADPH氧化酶，产生的O^2-，进而活化NFκB，启动MCP-1表达，促使血中单核/巨噬细胞向血管壁聚集并迁移至内皮下，随后向炎症表型变化，参与泡沫细胞的形成等动脉粥样硬化早期病变。

多项动物实验表明，AT1R与腹主动脉瘤(AAA)的发生发展关系密切。利用apoE^-/-小鼠皮下持续泵注AngⅡ已成为研究腹主动脉瘤最常用的动物模型之一。apoE^-/-或Ldlr^-/-泵注高浓度的AngⅡ后表现出管径扩张、血栓形成、血管中层平滑肌凋亡和缺失、弹力纤维断裂、细胞外基质沉积、血管外膜大量炎细胞浸润、MMPs/TIMPs失衡等人腹主动脉瘤病变相似的变化，且上述变化与血压和血脂水平无关。有研究表明，血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素1受体拮抗剂(ARB)能抑制实验动物动脉瘤的发生发展、降低动脉瘤患者死亡率。

尽管ARB在临床上已经广泛运用，但是近年来发现GPCR可以和下游多种G蛋白，甚至非G蛋白(如β-arrestin)耦联，配体在和GPCR相互作用时，可以选择性使GPCR与某些G蛋白或β-arrestin耦联，偏向某些信号途径，称之为配体的偏向性。以AT1R为例，AngⅡ与之结合后，可以通过耦联Gq激活PKC使得胞内钙增加，继而开始下游的磷酸化酶激活途径。Gq活化同时，可以通过GPCR相关蛋白激酶5(GRK5)使得AT1R胞内部分磷酸化，β-arrestin2与之结合，通过β-arrestin2介导的脱敏作用被定向降解或再循环到细胞表面。最近研究表明，β-arrestin活化后亦可开启下游信号转导，如ERK的活化且不受Gi蛋白抑制剂PTX影响。除了上述Gq和β-arrestin2的参与外，理论上AngⅡ和AT1R的结合还可以耦联Gi，Gi作为GPCR的抑制性调控，也认为参与受体的内化脱敏和胞内磷酸化酶激活途径。受体作用的偏向性调节更具精确靶向作用，可以发挥需要发挥的作用，同时避免因全部阻断而导致的不良效应的产生。对受体的偏向性调节是目前药物研发的热点，但是尚无偏向性调节AT1R的药物研制成功。

AT1R胞外第二环对受体功能至关重要，早期研究显示在先兆子痫和难治性高血压患者血清中可以检测到针对AT1R胞外第二环的自身抗体，该抗体可以加重血管损害，促进高血压发生发展。为了寻找既能阻断AT1R激活效应，又能偏向性调节AT1R的药物，我们对AT1R胞外表位序列进行了筛选验证，同时针对所筛选的AT1R靶点序列的抗体进行了单克隆化筛选，并在高血压、动脉粥样硬化及动脉瘤动物模型上确证了其效应。

发明内容

本发明提供了一种短肽ATR001以及由短肽制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体和应用。本发明运用单克隆抗体技术制备针对AT1R单克隆抗体，且该抗体可以偏向性调节AT1R功能，在血管重构类疾病，如高血压、动脉粥样硬化、动脉瘤中发挥治疗作用。

为实现上述目的，本发明保护了一种制备杂交瘤细胞CQ8-A2D9的短肽ATR001，其氨基酸序列为AFHYESQ。

本发明还保护了一种杂交瘤细胞CQ8-A2D9，其保藏编号为：CCTCC NO：C2017108。

上述杂交瘤细胞CQ8-A2D9已于2016年11月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCC NO：C2017108；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。

本发明还保护了一种上述杂交瘤细胞CQ8-A2D9的制备方法，包括以下步骤：

1)短肽ATR001与载体蛋白KLH进行耦联作为免疫耦联抗原；

2)免疫耦联抗原与弗氏佐剂混合免疫小鼠，然后去免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，检测筛选获得杂交瘤细胞CQ8-A2D9。

进一步地，所述步骤1)中，短肽ATR001的氨基酸序列为AFHYESQ；

本发明还保护了上述杂交瘤细胞CQ8-A2D9制备单克隆抗体anti-AT1R的方法，所述杂交瘤细胞CQ8-A2D9保藏编号为：CCTCC NO：C2017108。

上述制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体anti-AT1R的方法，具体方法如下：

1)将杂交瘤细胞CQ8-A2D9制备腹水；

2)利用腹水制备纯化，得到单克隆抗体anti-AT1R。

单抗隆抗体技术原理是：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂；而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。能够生成针对单一抗原表位的，具有高度特异性和高亲和力的抗体。

上述方法制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体anti-AT1R，所述单克隆抗体anti-AT1R的氨基酸序列包括重链或轻链，其序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

本发明还保护了一种利用上述制备得到具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体anti-AT1R在治疗高血压、动脉粥样硬化和动脉瘤的药品中的应用。

本发明的有益效果在于：由ATR001制备的单克隆抗体anti-AT1R能偏向性调节AT1R，从而发挥在血管重构类疾病(高血压、动脉粥样硬化、动脉瘤)中的保护作用。

附图说明

图1为anti-AT1R抗体对AngⅡ诱导ERK磷酸化影响；

图2为anti-AT1R抗体对AngⅡ诱导JNK磷酸化影响；

图3为anti-AT1R抗体对AngⅡ诱导细胞内钙离子浓度变化影响，图中AT1R-antibody即为anti-AT1R；

图4为单抗注射第二天单抗组小鼠血清抗体滴度情况图；

图5为实验过程中小鼠血压变化情况图；

图6为单克隆抗体anti-AT1R主动脉大体动脉粥样硬化斑块较对照图，图中mAb是指anti-AT1R抗体，Val是指缬沙坦，Con是对照组；

图中，图6A为血管病变大体图；图6B为血管大体病变面积统计图；

图7为单克隆抗体anti-AT1R主动脉瓣斑块面积较对照组图，图中mAb是指anti-AT1R抗体，Val是指缬沙坦，Con是对照组；

图7A为主动脉瓣环切片图；图7B为主动脉瓣环病变统计图；

图8为单克隆抗体anti-AT1R对AAA成瘤率及瘤体大小对比图，C是对照，S是AngⅡ灌注组，A是AngⅡ灌注加anti-AT1R抗体；

图中，图8A为动脉瘤大体图；图8B为动脉瘤发生率统计图；

图8C为动脉瘤直径大小统计图；图8D为动脉瘤病理分类统计图；

图9为单克隆抗体anti-AT1R保护血管壁完整性示意图，C是对照，S是AngⅡ灌注组，A是AngⅡ灌注加anti-AT1R抗体组。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的，以下实施例中的定量试验，均设置有三次重复实验，结果取平均值，如无特殊说明，实施例中的常规药品制备如下：

a.下述实验中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM两种基础培养基，配好后过滤除菌(0.22um)，分装，4℃保存。

不完全RPMI-1640培养基配方为：

不完全DMEM培养基(用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存)配方：

完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml+小牛血清15-20ml；

HT培养基配方：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml+HT贮存液1ml；

HAT培养基配方：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml+HT贮存液1ml+A贮存液1ml

b.氨基喋呤(A)贮存液(100×，4×10-5mol/L)：

称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4)，溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，-20℃保存。

c.次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10^-2mol/L，T：1.6×10^-3mol/L)：

称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，-20℃冻存。

d. L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×，0.2mol/L)：

称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine，MW 146.15)，用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，-20℃冻存。

e.青、链霉素(双抗)溶液(100×)：

取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶(4-5ml/瓶)，-20℃冻存。

f.7.5％NaHCO₃溶液：称取分析纯NaHCO₃ 7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，盖紧瓶塞，4℃保存。

g. HEPES溶液(1mol/L)：

称取23.83g HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW 238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，4℃保存。

h.8-氮鸟嘌呤贮存液(100×)：

称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine，MW152.1)，加入4mol/L NaOH1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1％浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)。

i.50％PEG：

称取PEG1000或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5％NaHCO₃调pH至8.0。

实施例1杂交瘤细胞CQ8-A2D9的制备

1、小鼠脾细胞的获得

1)免疫抗原获得

针对序列AFHYESQ进行多肽合成纯度≥85％的短肽ATR001，然后短肽ATR001与载体蛋白KLH进行耦联作为免疫抗原；

2)动物免疫

用免疫抗原免疫4-6只6周龄的Balb/c小鼠(活体小鼠)，常规周期：3周-2周-2周……强化周期：2周-2周-1周……使小鼠抗血清ELISA效价≥1:80000，具体步骤如下：

(1)初次免疫，免疫抗原使用量：50ug/只，加弗氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周；

(2)第21天第二次免疫，剂量途径同上，加弗氏不完全佐剂，间隔2周；

(3)第35天第三次免疫，剂量同上，加弗氏不完全佐剂或不加佐剂，腹腔注射，7-10天后采血进行ELISA检测效价，检测免疫效果，间隔2周；

(4)加强免疫，剂量50ug，腹腔注射；

(5)在最后一次加强免疫后第3天，取脾融合，取效价≥1:80000的小鼠脾细胞。

2、细胞融合及杂交瘤筛选

1)骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：

a.于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备)；

b.融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内；

c.1000r/min离心5-10分钟，弃去上清；

d.加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。

e.取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数＝4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数＝5个中方格细胞数×106/2

2)脾淋巴细胞的准备：

取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×10⁸-2.5×10⁸个脾细胞。

3)饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)的制备：

将小鼠处死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×10⁵/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96孔培养板每孔需2×10⁴个细胞，24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×10⁶个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml，然后置37℃6％CO₂的培养箱中培养。

4)细胞融合

①将1×10⁸脾细胞与1×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀；

②1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净；

③在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；

④用1ml吸管在30s内加入预热的50％PEG1ml，边加边轻轻搅拌；

⑤吸入吸管静置1min；

⑥加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml；

⑦800rpm,5分钟，弃去上清；

⑧加入5ml完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至40-50ml。分装96孔细胞培养板，每孔100ul,然后将培养板置37℃，5％CO₂培养箱内培养；

⑨6h后补加选择培养基，每孔50ul，3天后用选择培养基半换液；

⑩经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测；

5)杂交瘤细胞的筛选

①抗原用包被液稀释至10ug/ml；

②以100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时；

③弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干；

④每孔加100ul封闭液37℃封闭1小时；

⑤洗涤液洗3次；

⑥每孔加100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干；

⑦加酶标二抗，每孔100ul，37℃孵育1小时，洗涤，拍干；

⑧加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37℃20分钟；

⑨以2mol/L H₂SO₄终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值；

⑩结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3SD为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。即得到杂交瘤细胞CQ8-A2D9，并将杂交瘤细胞CQ8-A2D9于2016年11月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCC NO：C2017108；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。

实施例2

1、杂交瘤亚克隆及建株

①制备小鼠脾细胞为饲养细胞；

②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度；

③按每毫升加入5×10⁴-1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞；

④每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100ul；

⑤37℃、5％CO₂培养6天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

⑥取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存，亚克隆2-3次，得到单克隆细胞2-5株。即为杂交瘤细胞CQ8-A2D9

2、单抗生产

①腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml。

②7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵/0.2ml。

③间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；

④将腹水离心(2000r/min 5分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。

3、单克隆抗体的纯化

取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L pH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调pH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS(含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA)中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，即为单克隆抗体anti-AT1R：分装，冻存备用。

将单克隆抗体anti-AT1R进行测序，该单克隆抗体anti-AT1R的氨基酸序列包括重链或轻链，其序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

结果：选取两个克隆株，运用ELISA方法，我们检测制备单克隆抗体滴度，结果表明，抗体效价≥1:80000

Clone ID	Blank	1:1000	1:3000	1:9000	1:27000	1:81000	1:243000	1:729000
									CQ8-A2D9	0.076	2.419	2.145	1.804	1.172	0.563	0.294	0.165
CQ8-C3B7	0.076	2.651	2.434	2.116	1.47	0.832	0.414	0.204

实施例3单克隆抗体anti-AT1R对稳定表达AT1R CHO细胞ERK和JNK磷酸化的影响

1.培养AT1R-CHOK1细胞系(PerkinElmer)：含10％FBS的DMEM/F12完全培养基，5％CO₂细胞培养箱培养；

2.AT1R-CHOK1中检测AngⅡ诱导的ERK和JNK的磷酸化

将AT1R-CHOK1接种于六孔板中，密度80％左右，过夜培养。然后以HBS饥饿2h，做AngⅡ浓度梯度刺激和时间梯度刺激，Western Blot检测p-ERK/ERK和p-JNK/JNK的表达。

3.检测单克隆抗体anti-AT1R对AT1R激活引起ERK/JNK磷酸化的影响

细胞培养、种板见步骤1、2。HBS饥饿2h后ARB组和单抗组分别以洛沙坦和单克隆抗体anti-AT1R预孵育1h，而后各组(除control组外)均以AngII刺激，Western Blot检测单克隆抗体anti-AT1R对AT1R激活引起ERK和JNK磷酸化的影响，结果如下：

结果表明单克隆抗体anti-AT1R可以有效抑制AngII诱导的ERK(图1)及JNK磷酸化(图2)。我们也检测了稳定表达AT1R的CHO细胞内钙离子浓度的变化，结果表明单克隆抗体anti-AT1R对AngII诱导的细胞内钙离子浓度增加无影响(图3)，即单克隆抗体anti-AT1R并不完全通过经典的AT1R-Gq-PKC途径起作用，单克隆抗体anti-AT1R偏向性调节AT1R的功能。

实施例4单克隆抗体anti-AT1R在高血压中的降压作用

以Balb/c小鼠皮下埋泵灌注AngⅡ构建高血压模型，单抗组(A组)于埋泵当日鼠尾静脉注射anti-AT1R单克隆抗体100μg/只，肼屈嗪组(J组)于埋泵前一周开始以肼屈嗪3mg/kg/d灌胃。

分别监测各组埋泵前、埋泵后2周和4周血压变化，发现anti-AT1R抗体能显著降低AngⅡ模型小鼠血压(如图4～5)。

实施例5单克隆抗体anti-AT1R在抗动脉粥样硬化中的作用

首先构建西方饮食诱导的动脉粥样硬化(AS)小鼠模型，即给apoE^-/-小鼠高脂喂养17周，每周把anti-AT1R单抗(mAb)20ug和100ug分别鼠尾静脉回输apoE^-/-小鼠，17周后对apoE^-/-小鼠主动脉大体进行油红染色，发现粥样硬化斑块面积显著下降(图6)。主动脉瓣瓣环进行冰冻切片油红染色，发现anti-AT1R单抗显著减小粥样硬化斑块(图7)。

实施例6单克隆抗体anti-AT1R在抗动脉瘤中的作用

首先构建AngⅡ诱导的腹主动脉瘤(AAA)小鼠模型，即给apoE^-/-小鼠皮下埋入微型渗透泵持续给予AngII 1000ng/kg/min 28天，发现单克隆抗体anti-AT1R能显著降低apoE^-/-小鼠AAA的发生率，减轻瘤体严重程度(图8)。瘤体血管横截面病理检测发现对照组血管显著扩张，并伴血栓形成，而单克隆抗体anti-AT1R保护血管的形态结构相对完整(图9)。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 武汉华纪元生物技术开发有限公司

<120> 短肽ATR001以及由短肽制备具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 小鼠杂交瘤(mouse hybridoma)

<400> 1

Glu Val Leu Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Pro Arg Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Thr Pro Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Tyr Asp Tyr Arg Ile Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Ser Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

210 215 220

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

290 295 300

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

305 310 315 320

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

325 330 335

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Val Pro Pro Pro Lys

340 345 350

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

355 360 365

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

370 375 380

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385 390 395 400

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

405 410 415

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

420 425 430

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 小鼠杂交瘤(mouse hybridoma)

<400> 2

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Pro Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Ala Asn Ile Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Phe Ile Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Met Phe Pro Pro Ser Pro Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn Phe Ser Pro

130 135 140

Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro Ile Thr Gln

145 150 155 160

Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Asp Asn Lys Tyr Met Ala

165 170 175

Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser His Asn Ser

180 185 190

Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu Lys Ser Leu

195 200 205

Ser Pro Ala Glu Cys Leu

210

Claims

1.一种杂交瘤细胞CQ8-A2D9，其保藏编号为：CCTCC NO：C2017108。

2.由杂交瘤细胞CQ8-A2D9制备单克隆抗体anti-AT1R的方法，其特征在于：所述杂交瘤细胞CQ8-A2D9保藏编号为：CCTCC NO：C2017108。

3.根据权利要求2所述制备单克隆抗体anti-AT1R的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将杂交瘤细胞CQ8-A2D9制备腹水；

2）利用腹水制备纯化，得到单克隆抗体anti-AT1R。

4.一种具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体anti-AT1R，其特征在于：所述单克隆抗体anti-AT1R的氨基酸序列包括重链和轻链，其序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

5.一种利用权利要求4所述具有偏向性调节AT1R功能的单克隆抗体anti-AT1R在制备治疗高血压、动脉粥样硬化和动脉瘤的药品中的应用。