CN110330562B - 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用 - Google Patents

用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110330562B
CN110330562B CN201910528504.3A CN201910528504A CN110330562B CN 110330562 B CN110330562 B CN 110330562B CN 201910528504 A CN201910528504 A CN 201910528504A CN 110330562 B CN110330562 B CN 110330562B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
adrenergic receptor
immunogenic peptide
vaccine
immunogenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910528504.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110330562A (zh
Inventor
廖玉华
邱志华
李畅
廖梦阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Original Assignee
Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd filed Critical Wuhan Huajiyuan Biotechnology Development Co ltd
Priority to CN201910528504.3A priority Critical patent/CN110330562B/zh
Publication of CN110330562A publication Critical patent/CN110330562A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110330562B publication Critical patent/CN110330562B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于治疗高血压的α1D‑肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用；所述免疫原性肽段的氨基酸序列为CGITEEXGY，如SEQ ID No.1所示，其中，X为随机氨基酸。α1D‑肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗由上述的用于治疗高血压的α1D‑肾上腺素能受体的免疫原性肽段与载体偶联制备而成。本发明将优选设计出的α1D‑肾上腺素能受体的2个免疫原性肽段分别与Qβ‑2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白载体偶联成功制备成2种载体疫苗。该免疫原性载体疫苗可以应用于制备治疗高血压药物。

Description

用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用。
背景技术
高血压是严重危害人类健康的世界性问题，是心脑血管病的主要危险因素。目前我国心血管患病率及死亡率仍处于上升阶段，推算全国有约2.7亿高血压人群，心血管死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民疾病死亡构成的40％以上(2016年)。尽管高血压的治疗已经获得巨大进步，但高血压仍然存在的高发病率和极低控制率让人们不断寻找新的手段去改善这一局面。
高血压的发生发展涉及复杂的病理生理机制，其中交感神经系统活性亢进参与了高血压的发生和发展。针对交感神经系统的临床药物主要分为α受体阻滞剂和β受体阻滞剂。β受体阻滞剂降压效果与其他类降压药物相比较弱，对高血压患者心血管终点事件的改善并没有其他种类的降压药物明显，而且β受体阻滞剂具备系列副作用，包括增加胰岛素抵抗、血脂异常、新发糖尿病、疲劳和体重增加等，使其应用受限。α受体阻滞剂降压效果显著，为最强效降压药物之一，广泛应用于难治性高血压、恶性高血压和肾性高血压等，不受限于肾功能衰竭，且可部分改善糖脂代谢。但是，由于目前临床上现有的α受体阻滞剂(如广泛使用的特拉唑嗪、哌唑嗪)不能特异性拮抗某一α1-肾上腺素受体(α1-AR)亚型，导致特异性不强，副作用较多，是恶化心血管终点事件的重要原因之一，且国内上市的α受体阻滞剂需每日多次服药，进一步恶化患者的依从性，始终只是二线用药。因此，针对α1-AR特定亚型进行阻滞的新型药物的研发至关重要。
α1-AR根据编码的cDNA及药理和功能特性分三种亚型，分别为α1A-AR、α1B-AR、α1D-AR，它们的结构相似，但它们的分布和生物学作用存在差异，其中主要是α1A-AR和α1D-AR对血压进行调节。不同于α1D-AR，α1A-AR在心脏有广泛分布，越来越多的研究证据表明α1A-AR对心脏具有保护作用，不可轻易阻断，而α1D-AR主要分布于动脉上，包括主动脉、肠系膜动脉、冠状动脉和肾动脉等，在心肌上没有分布，具有更好的血管选择性。α1D-AR与高血压的发生、发展和维持关系更大。在高血压动物模型中，抑制α1D-AR可以预防和逆转血管重构，且这一保护作用不依赖于降低血压。最新的临床试验表明扩血管类的α1-AR阻滞剂可以降低心衰病人的再发病率和死亡率，而主要针对α1A-AR的阻滞剂并不能改善这一结局，提示特异性针对α1D-AR的阻滞剂更具心血管保护意义。
迄今为止，国际上没有特异性针对α1-AR的阻滞剂上市，尤其是针对α1D-AR的阻滞剂。
鉴于以上原因，研发特异性针对α1D-AR的阻滞剂不仅可以有效降低血压，且可避免对心脏产生不良影响，是极值得探索和深入的工作。
发明内容
本发明的第一目的是针对α1-AR阻滞剂研发及治疗的困境，提供了用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用；该免疫原性肽段特异性作用于α1D-肾上腺素能受体(α1D-AR)，从而起到治疗高血压。
本发明的第二目的是还提供了免疫原性肽段的应用，利用该免疫原性肽段得到治疗性降压疫苗，该疫苗能有效抑制α1D-AR的作用，降低高血压动物血压，并改善靶器官重构。
上述治疗性降压疫苗是一种新型的免疫学治疗手段，为重大慢性疾病的治疗提供了新思路。治疗性降压疫苗是高血压治疗研究的新领域，与传统的化学合成药物相比，其特异性强，作用时间长，每间隔1～3月甚至更长时间给药一次且能够保持长期平稳有效的降低血压，从而更好的保护靶器官、降低费用和改善治疗的依从性。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段，所述针对α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段的氨基酸序列为CGITEEXGY，如SEQ ID No.1所示，其中，X为随机氨基酸。
进一步地，所述X为V、A、L和I中任意一种。
再进一步地，所述用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段的氨基酸序列为CGITEEVGY，如SEQ ID No.2所示。
再进一步地，所述用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段的氨基酸序列为CGITEEAGY，如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一种上述免疫原性肽段在制备治疗高血压的产品中应用。
本发明还提供了一种用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗，所述用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗由上述的用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段与载体偶联制备而成。
作为优选方案，所述载体为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白。
本发明的有益效果：
1、根据α1D-肾上腺素能受体的胞外环氨基酸序列、亲水性、抗原性、可及性等特性，综合生物信息学和药理学方法，本发明设计出了α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段CGITEEXGY，其中，X为V、A、L和I中任意一种；同时，本发明优选了两个免疫原性肽段，分别为CGITEEVGY和CGITEEAGY；并通过验证得出这两个肽段能有效诱导免疫大鼠体内产生特异性抗体；
2、选择合适的载体是研制疫苗成功的关键，本发明选用Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白。
3、本发明将优选设计出的α1D-肾上腺素能受体的2个免疫原性肽段分别与Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白载体偶联成功制备成2种载体疫苗。将制备得到的载体疫苗免疫自发性高血压大鼠，研究用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗是否降低自发性高血压大鼠的血压和L-NAME引起的血压升高，实验结果表明用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗能有效降低自发性高血压大鼠的收缩压，并且对L-NAME引起的血压升高降压作用更强。因此，用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗可以应用于制备治疗高血压药物。
附图说明
图1为实施例2中载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004的SDS-PAGE凝胶电泳检测图；
图中，泳道VLP为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白单体、泳道Vaccine1为疫苗ADRQβ-CY-9，泳道Vaccine 2为疫苗ADRQβ-004；
图2为实施例3中载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004免疫雄性SHR后分别产生的抗CY-9和抗ADR-004短肽抗体滴度图；
图中，CY-9和ADR-004分别代表抗CY-9和抗ADR-004短肽抗体；
图3为实施例3中载体疫苗ADRQβ-004免疫雄性SHR后产生的抗CY-9短肽抗体滴度和抗ADR-004短肽抗体滴度对比图；
图中，ADR-004和CY-9分别代表抗ADR-004和抗CY-9短肽抗体；
图4为实施例3中载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004免疫雄性SHR后产生的降压效应图；
图中，control代表空白对照组SHR，CY-9代表接受载体疫苗ADRQβ-CY-9免疫的雄性SHR；ADRQβ-004代表接受载体疫苗ADRQβ-004免疫的雄性SHR；**P<0.01vs空白对照组；***P<0.001vs空白对照组；
图5为实施例4中载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004免疫雄性SHR后产生的抗CY-9和抗ADR-004短肽抗体滴度图；
图中，CY-9和ADR-004分别代表抗CY-9和抗ADR-004短肽抗体；
图6为实施例4中载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004免疫雄性SHR并进行L-NAME干预后产生的降压效应图；
图中，control代表空白对照组SHR，VLP代表对照载体组SHR，L-NAME+VLP代表干预载体组SHR，CY-9代表接受载体疫苗ADRQβ-CY-9免疫的雄性SHR，ADRQβ-004代表接受载体疫苗ADRQβ-004免疫的雄性SHR，prazosin组代表哌唑嗪组SHR；**P<0.01vs干预载体组组；***P<0.001vs干预载体组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段以下简称α1D-AR免疫原性肽段，用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗以下简称α1D-AR免疫原性载体疫苗，α1D-肾上腺素能受体以下简称α1D-AR。
实施例1：α1D-AR免疫原性肽段的制备
根据氨基酸亲水性、空间构象、B细胞表位的特点，设计出α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段CGITEEXGY如SEQ ID No.1所示，其中，X为V、A、L和I中任意一种；
同时，本发明优选了两个免疫原性肽段，氨基酸序列分别为CGITEEVGY如SEQ IDNo.2所示，命名为CY-9和CGITEEAGY如SEQ ID No.3所示，命名为ADR-004；
采用PSSM-8型肽自动合成仪(日本SHIMADZU公司)合成上述的2条肽段，合成的2条肽段经高效液相色谱分析2条肽段的纯度，经检测2条肽段的纯度均达到98％以上。将得到的2条肽段冻干，分装后置于冻存管中，-80℃冻存备用。
实施例2：制备α1D-AR免疫原性载体疫苗
一、利用Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，制备2种载体疫苗：ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004。具体制备过程如下：
1)制备Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白载体：Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的英文缩写为：Qβ-2aa VLP，以下均用Qβ-2aa VLP表示Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白。
Qβ-2aa VLP的制备方法为：
1a)获取表达Qβ-2aa VLP的重组菌株：该重组菌株为大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1，此重组菌株能诱导产生Qβ-2aa病毒样颗粒蛋白。大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1的保藏号为CCTCCNO：M209282，具体的制备过程参见中国专利：一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途，授权公开日为CN 101921733B授权公告日2013.06.05。
1b)诱导表达Qβ-2aa VLP：首先从液氮罐中取出保藏的大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1重组菌株，将该重组菌株活化后，涂布至LB固体培养基平板上，37℃温箱培养过夜，挑取单个菌落培养于LB液体培养基，37℃恒温摇床培养5h后，加入0.2M的IPTG诱导重组菌株表达Qβ-2aa VLP，诱导6小时，收集菌液并进行超声裂解，获取裂解上清液；
1c)Qβ-2aa VLP的纯化：裂解上清液经过硫酸铵沉淀，酸化处理，疏水层析，凝胶层析后得到纯化后的Qβ-2aa VLP；
1d)Qβ-2aa VLP的鉴定：将纯化后的Qβ-2aa VLP用二硫苏糖醇(DTT)进行解配处理，将解配后的Qβ-2aa VLP凝胶电泳鉴定其分子量，电镜观测其形态大小和粒径；最后通过试验结果确定得到的蛋白即为Qβ-2aa VLP；
2)α1D-AR免疫原性载体疫苗的制备：将实施例1中得到的2条肽段分别与载体Qβ-2aa VLP进行偶联反应，偶联反应采用异双功能交联剂(Sulfo-SMCC)，得到2种α1D-AR免疫原性载体疫苗，分别为ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004。
3)将步骤2)得到的载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
二、利用牛血清白蛋白，制备2种载体疫苗：ADRBSA-CY-9和ADRBSA-004。具体的制备过程如下：
1)称重异双功能交联剂(Sulfo-SMCC)1mg和二甲基亚砜(DMSO)10μl、90μl 50mMPBS(PH：7.4，含1mM EDTA)吹打混匀得到Sulfo-SMCC体系；
2)取牛血清白蛋白(BSA)1mg，用50mM PBS定容到200ul得到BSA体系，PBS(PH：7.4，含1mM EDTA)；
3)Sulfo-SMCC体系与BSA体系混匀，37℃温箱中反应30分钟，间隔5分钟上下颠倒轻轻摇晃一次，使BSA活化；
4)将活化后的混合物加入到100KD的TFF浓缩柱(Millipore，美国)中，用50mM PBS(pH 7.0，含1mM EDTA)加满浓缩柱，离心5,000g 15min，离心后剩余液体量在50-100ul为佳，共离心两次以洗脱掉未结合的Sulfo-SMCC；
5)α1D-AR免疫原性肽段配制：将实施例1中得到2条α1D-AR免疫原性肽段各取500ug，用50ul ddH2O溶解后加入活化并洗脱后的体系中，用50mM PBS(pH 7.0，含1mMEDTA)补足终体积为500ul，离心1050rpm/min反应2h；
6)最终反应体系即偶联完成的载体疫苗为ADRBSA-CY-9和ADRBSA-004。
实施例3：α1D-AR免疫原性载体疫苗对自发性高血压大鼠血压水平的影响
将载体疫苗ADRQβ-CY-9和ADRQβ-004定期免疫自发性高血压大鼠(SHR)，探讨α1D-AR免疫原性载体疫苗是否降低SHR的血压。具体试验过程为：
1)选用4周龄的雄性SHR进行主动免疫，具体分为3组如下：
第一组：空白对照组(control)：第6，20和34天时分别在背部皮下多点注射PBS，剂量为300μl/只，共10只；
第二组：ADRQβ-004疫苗组(ADRQβ-004)：第6，20和34天时分别在背部皮下多点免疫载体疫苗ADRQβ-004，剂量为300μg/只，共8只；
第三组：ADRQβ-CY-9疫苗组(ADRQβ-CY-9)：第6，20和34天时分别在背部皮下多点免疫载体疫苗ADRQβ-CY-9，剂量为300μg/只，共8只；
2)采血：分别在第0，10，24，38，52和66天鼠尾采血，常温3000rpm 10min离心收集上清，-80℃保存备用；
3)ELISA实验
由于免疫动物的疫苗载体为Qβ-2aa VLP，为了避免交叉反应，采用BSA作为载体分别与ADR-004和CY-9免疫原性短肽偶联成疫苗，包板测定相应的针对ADR-004和CY-9免疫原性短肽的抗体滴度，BSA作为载体与短肽偶联成疫苗的具体过程见实施例2；
3a)包板：将载体疫苗ADRBSA-004和ADRBSA-CY-9各取100μg，分别加入到10ml包被稀释液(PH9.6，0.05M NaCO3-NaHCO3缓冲液)中混匀后加入96板中，100μL/孔，4℃湿盒孵育过夜；
3b)封闭：第二天弃包被液，加入浓度为1％BSA的PBS缓冲液，100μL/孔，37℃封闭2h；
3c)封膜：封闭后弃封闭液，拍干并室温晾干后，贴上ELISA包被膜；
3d)将上述血清取出，冰上解冻后，用ELISA法测定相应抗体滴度，具体步骤如下：
3e)倍比稀释：将血清上清用浓度为10％FBS的PBS缓冲液作为稀释液，做1：100，1：1000，1：5000，1：10000，1：20000，1：40000的梯度倍比稀释；
3f)孵育一抗：用移液器将1：1000，1：5000，1：10000，1：20000，1：40000倍比稀释后的血清标本加入到步骤3a)中的96孔板中，100μl/孔，37℃温箱、孵育2h；
3g)孵育二抗：一抗孵育完成后，弃液体并用洗涤液(0.03％PBST PH7.4)洗3遍，拍干，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的二抗(1：3000稀释稀释液为10％FBS的PBS缓冲液)，100μl/孔，37℃温箱中孵育0.5h；
3h)显色：二抗孵育完成后弃液体并用洗涤液(0.03％PBST PH7.4)洗3遍，拍干，然后加入TMB显色液，100μl/孔，室温观察颜色变化；
3i)终止反应：待空白对照孔颜色刚刚开始变绿后，加入终止液(1M稀盐酸)，100μl/孔；
3j)读数：加入终止液后，放在酶标仪上在450nm波长下读出吸光度(OD)值；
3k)结果分析：以OD值不小于空白对照组的2.1倍作为待测标本阳性的标准，然后计算出相应标本的抗体滴度值。结果如图2，结果显示2组疫苗组分别产生了针对ADR-004或者CY-9免疫原性短肽的特异性抗体，且滴度较高；
4)ADR-004与CY-9短肽的交叉反应：
由于免疫动物的疫苗载体为Qβ-2aa VLP，为了避免交叉反应，采用BSA作为载体与CY-9短肽偶联成疫苗ADRBSA-CY-9，包板测定ADRQβ-004疫苗组针对CY-9短肽的抗体滴度，BSA作为载体与短肽偶联成疫苗的具体过程见实施例2；
ELISA具体实施方法同前，结果分析以OD值不小于空白对照组的2.1倍作为待测样本阳性的标准，然后计算出相应样本的抗体滴度值。结果如图3。结果显示ADRQβ-004疫苗组产生了针对CY-9免疫原性短肽的特异性抗体，说明ADR-004与CY-9免疫原性短肽有较强的交叉反应；
5)血压水平测量
采用Softron BP98A鼠尾血压计在第0，7，18，23，31，38，47，52，59和66天对动物血压进行监测。具体监测方法如下：
4a)预热：将待测动物放置于37℃加热笼中预热15分钟；
4b)固定：预热后，将待测动物转移至相应的有加热功能的固定笼套内，将露出的鼠尾从测量传感器中穿过，将传感器置于鼠尾根部位置，以待血压测量；
4c)测量：将传感器与Softron BP98A鼠尾血压计通过数据线连接，然后开始进行血压的测量，每次测量6组读数，取平均值。
测量在上午9点钟至11点钟之间进行，测量过程中保持环境的安静，室温保持在25℃。结果如图4。结果显示，2组疫苗组均显著降低了SHR的血压。
实施例4：α1D-AR免疫原性载体疫苗对一氧化氮合酶抑制剂L-NAME引起的血压升高的影响
将载体疫苗ADRQβ-004和ADRQβ-CY-9定期免疫SHR，并在SHR的饮用水中加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，探讨α1D-AR免疫原性载体疫苗是否降低L-NAME引起的血压升高。具体试验过程为：
1)选用4周龄的雄性SHR主动免疫，具体分为6组如下：
第一组：空白对照组(control)：第2，16，30，58和86天时分别在背部皮下多点注射PBS，剂量为300μl/只，共6只；
第二组：对照载体组(VLP)：第2，16，30，58和86天时分别在背部皮下多点注射Qβ-2aa VLP，剂量为300μg/只，共5只；
第三组：干预载体组(L-NAME+VLP)：第2，16，30，58和86天时分别在背部皮下多点注射Qβ-2aa VLP，剂量为300μg/只，共7只；
第四组：ADRQβ-004疫苗组(ADRQβ-004)：第2，16，30，58和86天时分别在背部皮下免疫载体疫苗ADRQβ-004，剂量为300μg/只，共11只；
第五组：ADRQβ-CY-9疫苗组(ADRQβ-CY-9)：第2，16，30，58和86天时分别在背部皮下免疫载体疫苗ADRQβ-CY-9，剂量为300μg/只，共11只；
第六组：哌唑嗪组(prazosin组)：第11天后通过灌胃法给予哌唑嗪，剂量为0.5/kg/d，共11只；
第75-103天在第三组至第五组的饮用水中加入L-NAME，剂量为50mg/L，共持续4周；
2)采血：分别在第0，7，21，35，49，63，77，91和103天鼠尾采血，常温3000rpm 10min离心收集上清，-80℃保存备用；
3)ELISA实验
由于免疫动物的疫苗载体为Qβ-2aa VLP，为了避免交叉反应，采用BSA作为载体分别与ADR-004和CY-9免疫原性短肽偶联成疫苗，包板测定相应的针对ADR-004和CY-9免疫原性短肽的抗体滴度，BSA作为载体与短肽偶联成疫苗的具体过程见实施例2；
ELISA具体实施方法同前，结果分析以OD值不小于空白对照组的2.1倍作为待测样本阳性的标准，然后计算出相应样本的抗体滴度值。结果如图5。结果显示两组疫苗组分别产生了针对ADR-004或者CY-9的特异性抗体；
4)血压水平测量
采用Softron BP98A鼠尾血压计在第0，7，14，21，29，36，45，52，65，79，85，92和100天对动物血压进行监测，具体监测方法同前，结果如图6。结果显示，与对照组相比，两组疫苗组均产生了显著的降压效应，并且在加入L-NAME后，两组疫苗的降压效应较之前更强。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 武汉华纪元生物技术开发有限公司
<120> 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 1
Cys Gly Ile Thr Glu Glu Xaa Gly Tyr
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 2
Cys Gly Ile Thr Glu Glu Val Gly Tyr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 3
Cys Gly Ile Thr Glu Glu Ala Gly Tyr
1 5

Claims (4)

1.一种用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段，其特征在于：所述用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段的氨基酸序列为CGITEEVGY，如SEQID No.2所示。
2.一种用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段，其特征在于：所述用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段的氨基酸序列为CGITEEAGY，如SEQID No.3所示。
3.一种权利要求1所述免疫原性肽段或权利要求2所述免疫原性肽段在制备治疗高血压的产品中应用。
4.一种用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗，所述用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性载体疫苗由权利要求1所述的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段或权利要求2所述的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段与载体偶联制备而成；其中，所述载体为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白。
CN201910528504.3A 2019-06-18 2019-06-18 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用 Active CN110330562B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910528504.3A CN110330562B (zh) 2019-06-18 2019-06-18 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910528504.3A CN110330562B (zh) 2019-06-18 2019-06-18 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110330562A CN110330562A (zh) 2019-10-15
CN110330562B true CN110330562B (zh) 2022-12-27

Family

ID=68142493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910528504.3A Active CN110330562B (zh) 2019-06-18 2019-06-18 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110330562B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108948183A (zh) * 2018-06-05 2018-12-07 武汉华纪元生物技术开发有限公司 α1受体和AT1受体抗原类似物多肽及其抗体检测试剂盒和应用
CN109467599A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 武汉华纪元生物技术开发有限公司 短肽atr001以及由短肽制备具有偏向性调节at1r功能的单克隆抗体和应用
CN109663124A (zh) * 2019-02-14 2019-04-23 武汉华纪元生物技术开发有限公司 针对人血管平滑肌细胞l型钙通道和血管紧张素1型受体的嵌合型二价降压疫苗及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109467599A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 武汉华纪元生物技术开发有限公司 短肽atr001以及由短肽制备具有偏向性调节at1r功能的单克隆抗体和应用
CN108948183A (zh) * 2018-06-05 2018-12-07 武汉华纪元生物技术开发有限公司 α1受体和AT1受体抗原类似物多肽及其抗体检测试剂盒和应用
CN109663124A (zh) * 2019-02-14 2019-04-23 武汉华纪元生物技术开发有限公司 针对人血管平滑肌细胞l型钙通道和血管紧张素1型受体的嵌合型二价降压疫苗及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Therapeutic Vaccines against Human and Rat Renin in Spontaneously Hypertensive Rats;Qiu Z等;《PLoS ONE》;20160625;第08卷(第06期);e66420 *
Vaccine Targeted Alpha 1D-Adrenergic Receptor for Hypertension;Chang Li等;《Hypertension》;20191014;第74卷;1551–1562 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110330562A (zh) 2019-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114057894B (zh) 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
Timmerman et al. Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS™ technology
CN106046155B (zh) 用于治疗hbv感染及相关疾病的多肽及抗体
US9452204B2 (en) Chimeric peptides comprising HER-2 B-cell epitopes and Tcell helper epitopes
WO2004031238A2 (en) Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
JP5187883B2 (ja) 抗原ペプチドおよびその利用
EP4029878A1 (en) Ykl-40-targeting human monoclonal antibody
CN109663124B (zh) 针对人血管平滑肌细胞l型钙通道和血管紧张素1型受体的嵌合型二价降压疫苗及其应用
CN110330562B (zh) 用于治疗高血压的α1D-肾上腺素能受体的免疫原性肽段及其应用
CN110964104B (zh) 可结合hpv18病毒的蛋白质及其应用
CN107074925B (zh) 用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的物质和方法
US20170198014A1 (en) Polypeptides and their use for treating influenza
CN106883295B (zh) 人内皮素a型受体免疫原性肽段及其载体疫苗
CN109678946B (zh) 人血管平滑肌细胞l型钙通道免疫原性肽段及其疫苗和应用
CN109758575B (zh) 充分多样的双亲性mhc ii结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用
US20060024314A1 (en) Antibodies and cyclic peptides which bind CEA (carcinoembryonic antigens) and their use as cancer therapeutics
CN107522785B (zh) 抗egfr突变体iii单克隆抗体、制备方法及其应用
CN111440241A (zh) 一种包含特异性结合ros1的单克隆抗体的癌症试剂盒
WO2015165368A1 (zh) 抗her2中和活性单克隆抗体及其应用
CN103539840B (zh) 表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用
CN114276438B (zh) 可结合人乳头瘤病毒的抗体20f6及其应用
CN114276439B (zh) 可结合人乳头瘤病毒的抗体50a11及其应用
JPH02504284A (ja) 抗原、および、抗イディオタイプ抗体、または抗原に対する細胞受容体に特異的な抗体に共通のアミノ酸配列に由来する免疫原および生物学的活性ペプチド
CN102127147B (zh) 表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用
CN107589262B (zh) 用于检测乳腺癌的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant