CN106883295B - 人内皮素a型受体免疫原性肽段及其载体疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种人内皮素A型受体免疫原性肽段及其载体疫苗，所述人内皮素A型受体免疫原性肽段的氨基酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9中的一种；人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗由人内皮素A型受体免疫原性肽段与载体偶联制备而成，所述载体为Qβ‑2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白或钥孔血蓝蛋白。本发明获得的人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗能有效治疗肺动脉高压。

Description

人内皮素A型受体免疫原性肽段及其载体疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人内皮素A型受体免疫原性肽段及其载体疫苗。
背景技术
肺动脉高压(PAH)是以肺小动脉增生和重构为特征的严重慢性疾病，导致肺动脉压力进行性升高并最终发生右心衰竭和死亡，其发病率相对较低，但预后极差，我国5年的生存率20.8％。近20年来治疗PAH药物取得了一定的疗效，如内皮素受体拮抗剂，使PAH中位生存时间由80年代的2.8年，延长到5年，但该类药价格昂贵，治疗上难以普及，迫切需要寻找方便、有效且价廉的新治疗方法。治疗性疫苗是针对患者个体的新型免疫学治疗手段，为重大慢性疾病的治疗提供了新思路。治疗性PAH疫苗是PAH治疗研究的新领域，如研制成功，与传统的化学合成药物相比，其作用时间长，每间隔1～3月甚至更长时间给药一次且能够保持长期平稳有效的降低肺动脉压力，从而降低费用、改善治疗的依从性。
如何选择合适的靶点和载体是PAH等治疗性疫苗研制成功的关键，因为治疗性疫苗主要针对自身抗原或免疫耐受外来抗原，治疗性疫苗必须与载体结合才能打破免疫耐受，产生治疗效应，可选择的靶点理论上有内皮素1(Endothelin，ET-1)与人内皮素A型受体(ETAR)，但由于ET-1血循环浓度极低，绝大多数通过旁分泌和自分泌发生作用，在ET-1产生后还未与ET-1疫苗抗体结合即发挥效能，因此，ET-1不是理想的PAH治疗靶点。在系统性硬化、干燥综合征等病人中发现存在ETAR的自身抗体，提示ETAR具有抗原性，因此ETAR是PAH治疗性疫苗的理想靶点。因此，研制出有效诱导ETAR抗体产生并抑制EI-1诱导的激动效应的疫苗是亟待解决的问题。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供一种有效治疗肺动脉高压的人内皮素A型受体免疫原性肽段及其载体疫苗。
本发明的第一目的是提供一种人内皮素A型受体免疫原性肽段，所述人内皮素A型受体免疫原性肽段的氨基酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9中的一种。
优选地，所述人内皮素A型受体免疫原性肽段的氨基酸序列为SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7中的一种。
本发明的第二目的是提供一种人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗，所述人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗由人内皮素A型受体免疫原性肽段与载体偶联制备而成。
优选地，所述载体为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白或钥孔血蓝蛋白，以下钥孔血蓝蛋白简称KLH。
更优选地，所述Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白内包裹有CPG-ODN。
本发明的第三目的是人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗应用于制备治疗肺动脉高压药物。
本发明的有益效果是：
1、根据ETAR的胞外环氨基酸序列、亲水性、抗原性、可及性等特性，综合生物信息学、药理学方法，本发明设计出了针对ETAR的9条肽段，并通过验证出这些肽段能有效诱导ETAR抗体产生并抑制EI-1诱导的激动效应。
2、将设计出的针对ETAR的9个肽段分别与载体偶联成功制备成9种载体疫苗，并将这9种载体疫苗分别免疫雄性新西兰大白兔，免疫得到血清，利用ELISA法测定血清抗体滴度，筛选出抗体滴度在1：40000以上的ETAR免疫原性载体疫苗，对应9条肽段中筛选出5条肽段，由这5条肽段制备而成的ETAR免疫原性载体疫苗的抗体滴度均不小于1：40000。
3、选择合适的载体是研制疫苗成功的关键。本发明选用Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白或KLH，选优选用Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白包裹佐剂，在Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白内部包裹进免疫佐剂，增强免疫应答，从而构成一个简单高效的抗原呈递系统。
4、将制备得到的载体疫苗免疫大鼠，研究ETAR免疫原性载体疫苗是否降低肺动脉高压模型大鼠的肺动脉压力，实验结果表明ETAR免疫原性载体疫苗能降低肺动脉高压模型大鼠的肺动脉压力，因此，此类载体疫苗可以应用于制备治疗肺动脉高压药物。
附图说明
图1为实施例2中载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ的SDS-PAGE凝胶电泳检测图；泳道Vaccine1为疫苗ETAR EC10-Qβ，泳道Vaccine 2为疫苗ETAR YC9-Qβ、泳道Vaccine 3为疫苗ETAR RC8-Qβ、泳道VLP为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白单体、泳道Vaccine 4为疫苗ETAR EM7-Qβ、泳道Vaccine 5为疫苗ETARTF10-Qβ。
图2为实施例3中抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10短肽抗体对ET-1引起细胞外信号蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平影响的免疫印迹结果图，其中图2A为抗ETAR-EC10短肽抗体的免疫印迹结果图；图2B为抗ETAR-YC9短肽抗体的免疫印迹结果图；图2C为抗ETAR-RC8短肽抗体的免疫印迹结果图；图2D为抗ETAR-EM7短肽抗体的免疫印迹结果图；图2E为抗ETAR-TF10短肽抗体的免疫印迹结果图；图中EC10、YC9、RC8、EM7、TF10对应代表抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10短肽抗体；P-ERK代表磷酸化的ERK1/2；T-ERK代表总的ERK1/2；*P<0.05vs空白对照组，#P<0.05vs ET-1刺激组。
图3为实施例4中载体疫苗免疫SD大鼠后产生的抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10短肽抗体滴度图，图中EC10、YC9、RC8、EM7、TF10分别对应代表抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10短肽抗体。
图4为实施例5中测量载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAREM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心室收缩压的变化图。其中，EC10-Qβ、YC9-Qβ、RC8-Qβ、EM7-Qβ、TF10-Qβ分别代表载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ；*P<0.05vs空白对照组，#P<0.05vs单存野百合碱处理组。共分为五组：(1)Con(n＝3)：不做任何处理；(2)MCT组(n＝3)：单次皮下注射野百合碱60mg/Kg；(3)MCT+Bos组(n＝3)：单次皮下注射野百合碱60mg/Kg，第二天给予波生坦灌胃100mg/Kg/day；(4)疫苗组(每种疫苗免疫3只)：载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETARRC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ，400ug/只，于0,14,21天皮下多点免疫共三次，然后在第三次免疫后第二天单次皮下注射野百合碱60mg/Kg；(5)MCT+VLP组(n＝3)：400μg免疫载体Qβ-2aa-CPG-ODN VLP进行皮下多点免疫，其余同疫苗组一样。
图5为肺组织α-SMA免疫组化染色鉴定载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETARRC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ对野百碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉血管重构α-SMA染色图；其中，图5A～5I依次为空白对照组动物肺脏α-SMA染色图、单独MCT注射组动物肺脏α-SMA染色图、MCT注射后波生坦灌胃组动物肺脏α-SMA染色图、疫苗ETAR EC10-Qβ组动物肺脏α-SMA染色图、疫苗ETAR YC9-Qβ组动物肺脏α-SMA染色图、疫苗ETAR RC8-Qβ组动物肺脏α-SMA染色图、疫苗ETAR EM7-Qβ组动物肺脏α-SMA染色图、疫苗ETAR TF10-Qβ组动物肺脏α-SMA染色图、空载组(Qβ-2aa-CPG-ODN VLP)动物肺脏α-SMA染色图。图5J表示肺组织α-SMA免疫组化染色后计算的中膜厚度百分比图；图5K表示肺组织α-SMA免疫组化染色后α-SMA阳性面积占血管面积的百分比图。其中，EC10-Qβ、YC9-Qβ、RC8-Qβ、EM7-Qβ、TF10-Qβ分别对应代表载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ，MT％代表中膜厚度百分比；*P<0.05vs空白对照组，#P<0.05vs单存野百合碱处理组。
具体实施方式
以下结合说明附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗以下简称ETAR免疫原性载体疫苗，人内皮素A型受体以下简称ETAR。
实施例1：ETAR免疫原性肽段的制备
根据生物信息学技术如氨基酸亲水性、空间构象、B细胞表位的特点，设计出针对ETAR胞外氨基酸序列的ETAR免疫原性肽段9条，分别命名为HI10、RF9、EC10、YC9、RC8、EM7、TF10、CK8、NE9，具体氨基酸序列为，HI10：SEQ ID No.1；RF9：SEQ ID No.2；EC10：SEQ IDNo.3；YC9：SEQ ID No.4；RC8：SEQ ID No.5；EM7：SEQ ID No.6；TF10：SEQ ID No.7；CK8：SEQID No.8，NE9：SEQ ID No.9。
采用PSSM-8型肽自动合成仪(日本SHIMADZU公司)合成上述的9条肽段，合成的9条肽段经高效液相色谱分析9条肽段的纯度，经检测9条肽段的纯度均达到92％以上。将得到的9条肽段冻干，分装后置于冻存管中，-80℃冻存备用。
实施例2：制备ETAR免疫原性载体疫苗
一、利用Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白，制备9种载体疫苗ETAR RF9-Qβ、ETAREC10-Qβ、ETAR YC9-Qβ、ETAR RC8-Qβ、ETAR EM7-Qβ、ETAR TF10-Qβ、ETAR CK8-Qβ、ETAR HI10-Qβ、ETAR NE9-Qβ。具体制备过程如下：
1)制备Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白：Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的英文缩写为：Qβ-2aa VLP，以下均用Qβ-2aa VLP表示Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白。
Qβ-2aa VLP的制备方法为：
1a)获取表达Qβ-2aa VLP的重组菌株：该重组菌株为大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1，此重组菌株能诱导产生Qβ-2aa病毒样颗粒蛋白。大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1的保藏号为CCTCCNO：M209282，具体的制备过程参见中国专利：一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途，授权公开日为CN 101921733B授权公告日2013.06.05。
1b)诱导表达Qβ-2aa VLP：首先从液氮罐中取出保藏的大肠杆菌DH5α/pGEXQβ-A1重组菌株，将该重组菌株活化后，涂布至LB固体培养基平板上，37℃温箱培养过夜，挑取单个菌落培养于LB液体培养基，37℃恒温摇床培养5h后，加入0.2M的IPTG诱导重组菌株表达Qβ-2aa VLP，诱导6小时，收集菌液并进行超声裂解，获取裂解上清液；
1c)Qβ-2aa VLP的纯化：裂解上清液经过硫酸铵沉淀，酸化处理，疏水层析，凝胶层析后得到纯化后的Qβ-2aa VLP；
1d)Qβ-2aa VLP的鉴定：将纯化后的Qβ-2aa VLP用二硫苏糖醇(DTT)进行解配处理，将解配后的Qβ-2aa VLP凝胶电泳鉴定其分子量，电镜观测其形态大小和粒径；最后通过试验结果确定得到的蛋白即为Qβ-2aa VLP；
2)制备载体：取步骤1c)纯化后Qβ-2aa VLP 375μg与佐剂：CPG-ODN 2OD配制成为装配体系(其中，CPG-ODN购自由上海生工生物工程公司)，室温放置60小时，Qβ-2aa VLP将进行自组装，同时包裹装配体系内的CPG-ODN，装配完成后用凝胶层析纯化，得到载体：Qβ-2aa-CPG-ODN VLP；
3)ETAR免疫原性载体疫苗的制备：将实施例1中得到的9条肽段分别与载体Qβ-2aa-CPG-ODN VLP进行偶联反应，偶联反应采用异双功能交联剂(Sulfo-SMCC)，得到9种ETAR免疫原性载体疫苗，分别为ETAR RF9-Qβ、ETAR EC10-Qβ、ETAR YC9-Qβ、ETAR RC8-Qβ、ETAR EM7-Qβ、ETAR TF10-Qβ、ETAR CK8-Qβ、ETAR HI10-Qβ、ETAR NE9-Qβ。
4)将步骤3)得到的载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
二、利用载体KLH，制备9种载体疫苗ETAR RF9-KLH、ETAR EC10-KLH、ETAR YC9-KLH、ETAR RC8-KLH、ETAR EM7-KLH、ETAR TF10-KLH、ETAR CK8-KLH、ETAR HI10-KLH、ETAR NE9-KLH，具体的制备过程如下：
1)称重异双功能交联剂(Sulfo-SMCC)1mg和二甲基亚砜(DMSO)10μl、90μl 50mMPBS(PH：7.4，含1mM EDTA)吹打混匀得到Sulfo-SMCC体系；
2)取KLH 1mg，用50mM PBS定容到200ul得到KLH体系，PBS(PH：7.4，含1mM EDTA)；
3)Sulfo-SMCC体系与KLH体系混匀，37℃温箱中反应30分钟，间隔5分钟上下颠倒轻轻摇晃一次，使KLH活化；
4)将活化后的混合物加入到100KD的TFF浓缩柱(Millipore，美国)中，用50mM PBS(pH 7.0，含1mM EDTA)加满浓缩柱，离心5,000g 15min，离心后剩余液体量在50-100ul为佳，共离心两次以洗脱掉未结合的Sulfo-SMCC；
5)ETAR免疫原性肽段配制：将实施例1得到9条肽段各取500ug，用50ul ddH2O溶解后加入活化并洗脱后的体系中，用50mM PBS(pH7.0，含1mM EDTA)补足终体积为500ul，离心1050rpm/min反应2h；
6)最终反应体系即为偶联完成的载体疫苗ETAR RF9-KLH、ETAR EC10-KLH、ETARYC9-KLH、ETAR RC8-KLH、ETAR EM7-KLH、ETAR TF10-KLH、ETAR CK8-KLH、ETAR HI10-KLH、ETARNE9-KLH。
实施例3ETAR免疫原性载体疫苗针对性抗体的体外功能研究
一、ETAR免疫原性肽段的筛选：优选ETAR免疫原性肽段为EC10，YC9，RC8，EM7，TF10。具体试验过程为：
将实施例2得到的9种ETAR免疫原性载体疫苗：ETAR RF9-Qβ、ETAR EC10-Qβ、ETARYC9-Qβ、ETAR RC8-Qβ、ETAR EM7-Qβ、ETAR TF10-Qβ、ETAR CK8-Qβ、ETAR HI10-Qβ、ETAR NE9-Qβ在第1、14、28天皮下多点免疫雄性新西兰大白兔，其中，作为对照组，2只雄性新西兰大白兔免疫载体Qβ-2aa-CPG-ODN VLP，每种ETAR免疫原性载体疫苗免疫2支雄性新西兰大白兔，一共20只被免疫的雄性新西兰大白兔，免疫剂量为500ug/只。第7、14、21、28、35天取血用ELISA法测定抗体滴度，筛选出抗体滴度在1：40000以上的ETAR免疫原性载体疫苗为ETAREC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ，因此，优选ETAR免疫原性肽段为EC10，YC9，RC8，EM7，TF10。
二、制备抗体以及中和抗体：抗体为抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10，中和抗体为NEC10，NYC9，NRC8，NEM7，NTF10。具体试验过程为：
将实施例3中免疫载体疫苗ETAR EC10-Qβ，ETAR YC9-Qβ，ETAR RC8-Qβ，ETAR EM7-Qβ，ETAR TF10-Qβ后的大白兔在第35天后处死，分别取血，经硫酸铵沉淀、疏水、亲和、抗肽纯化后获得目的抗体：分别为ETAR免疫原性载体疫苗免疫大白兔产生的短肽抗体，分别为抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10。将抗ETAR-EC10与过量的肽段EC10中和后形成中和抗体NEC10，将抗ETAR-YC9与过量的肽段YC9中和后形成中和抗体NYC9，将抗ETAR-RC8与过量的肽段RC8中和后形成中和抗体NRC8，将抗ETAR-EM7与过量的肽段EM7中和后形成中和抗体NEM7，将抗ETAR-TF10与过量的肽段TF10中和后形成中和抗体NTF10。
三、抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10短肽抗体对细胞外信号蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影响研究，具体试验过程为：
1)制备过表达ETAR的CHO细胞系
1a)过表达ETAR质粒的构建：以pcDNA3.1为克隆载体，载体长度在5.4kb，载体具有Ampicillin抗性，HindIII/Xhol为克隆位点，将人ETAR基因插入其中，ETAR的氨基酸序列如SEQ ID No.10，进行过表达ETAR质粒的构建，得到重组质粒pcDNA3.1-ETAR。
1b)过表达ETAR的CHO细胞系的构建：其中，CHO细胞系购自武汉Procell公司)
首先种板：将CHO细胞系用胰酶消化后用细胞计数板在倒置显微镜下计数，5×105个细胞/孔，种于24孔板中；
然后转染：将重组质粒pcDNA3.1-ETAR依据转染试剂盒操作步骤进行；转染试剂盒的名称为：Attractene Transfection Reagent Lot No.148019994Qiagen。
稳转：转染后24小时，将细胞消化并计数，稀释后种于96孔板中，使每孔中平均有1～2个细胞，12小时后，培养基换为含有400ug/ml G418的高糖/Ham’s F12完全培养基，每隔三天换液，2周后选择有单个细胞群落的孔消化至六孔板中，不断繁殖，即得到单克隆来源的过表达ETAR的CHO细胞系，以下过表达ETAR的CHO细胞系命名为CHO-ETAR；
2)抗ETAR-EC10、抗ETAR-YC9、抗ETAR-RC8、抗ETAR-EM7、抗ETAR-TF10短肽抗体对细胞外信号蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影响试验，分为共5组平行试验，分别为EC10组，YC9组，RC8组，EM7组，TF10组，每组试验包括一块6孔板，每组试验的具体操作如下：
2a)种板：将CHO-ETAR用胰酶消化计数后，以2×105个细胞每孔种于6孔板中；
2b)饥饿培养：待细胞形态完全形成，密度在75％左右后，将培养基吸出，用PBS洗两遍后，加入0.5％FBS的高糖DMEM/Ham’s F12培养基饥饿培养16小时；
2c)各组所加刺激：细胞饥饿培养16小时后，在对应的孔中吸出培养基后加入含有BQ123(10-9mmol/L)、ETAR抗体(1:100)、中和抗体(1:100)0.5％FBS的高糖DMEM/Ham’s F12培养基，温箱中孵育30min后，加入终浓度为10-11M的ET-1，温箱中孵育15min后收细胞；其中，每个孔中加入的物质如表1:
表1
Figure BDA0001193425730000101
2d)细胞总蛋白的提取：加入ET-1刺激15min后，迅速将培养基吸出，用预冷的PBS冲洗两遍后，加入蛋白裂解液40ul，使之将细胞完全覆盖冰上孵育30min后用细胞刮刮下并用微量移液枪收集入1.5ml的离心管中，点震10s、间隔30s、共点震10次，4℃12000rpm15min离心，吸取上清移入200ul的EP管中，所取上清即为细胞总蛋白；每个孔中的细胞总蛋白进行免疫印迹实验。
2e)免疫印迹实验的具体操作过程为：
制胶：按照SDS-PAGE凝胶配置说明书配置10％的分离胶和5％的浓缩胶，室温静置1小时或者4℃过夜后拿出置于电泳槽中，加入电泳内液和电泳外液，拔出齿梳，排空各个齿梳孔中的气泡；
上样：60V恒压预电泳30min，细胞总蛋白用微量移液器加于各个上样孔中；
电泳：先使用70V恒压电泳，待可见Marker条带分开后说明已经进入分离胶，此时将电压调至110V进行恒压电泳直至溴酚蓝移至凝胶的最底部、Marker各条条充分分离，结束电泳；
转膜：电泳结束后，将凝胶取出，切取出目的蛋白位置的凝胶置于滤纸上面，根据凝胶剪取相应大小的PVDF膜并将PVDF膜置于甲醇中活化后平铺于凝胶上面，然后往转膜槽中加入预冷的转膜缓冲液后放置于冰浴中，300mA恒流转膜，转膜50min；
封闭：转膜完成后取出膜置于1×丽春红中浸泡染色用以以判断转膜是否成功，然后用5％浓度脱脂奶粉的TBST缓冲液，室温摇床封闭2小时；
孵育一抗：抗P-ERK抗体(CellSignaling，美国)用抗体稀释液按照1：1000稀释，将封闭好的PVDF膜取出用ddH2O漂洗后4℃孵育过夜；
一抗回收：取出PVDF膜用0.15％TBST缓冲液洗3×8min；
二抗孵育：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(Invitrogen，美国)按1：3000用5％浓度脱脂奶粉稀释，常室温摇床孵育2小时；
洗膜：弃二抗，取出PVDF膜用0.15％TBST缓冲液洗3次，每次洗8min；
发光及成像：配制ECL试剂：A液：B液＝1：1混合后孵育PVDF膜，吸出ECL混合液，蛋白凝胶成像系统对目的蛋白进行显影，储存并用凝胶成像系统分析各条带的灰度值。结果如图2A，图2B，图2C，图2D，图2E所示。
实施例4：ETAR免疫原性载体疫苗对野百合碱诱导的肺动脉高压模型大鼠肺动脉压力的影响。
将载体疫苗ETAR EC10-Qβ、ETAR YC9-Qβ、ETAR RC8-Qβ、ETAR EM7-Qβ、ETAR TF10-Qβ免疫正常SD大鼠后用野百合碱(MCT)单次皮下注射进行构建肺动脉高压模型大鼠，探讨ETAR免疫原性载体疫苗是否降低肺动脉高压模型大鼠的肺动脉压力。具体试验过程为：
1)主动免疫和药物干预，具体分为5组如下：
第一组：空白对照组(Con组)：不给予任何干预措施；
第二组：野百合碱组(MCT组)：给予单次皮下注射MCT 60mg/kg；
第三组：波生坦灌胃组(Bos+MCT组)：给予单次皮下注射MCT60mg/kg后的第二天用波生坦灌胃,波生坦的剂量为每天100mg/kg；
第四组：疫苗组(载体疫苗+MCT组)：载体疫苗ETAR EC10-Qβ、ETAR YC9-Qβ、ETARRC8-Qβ、ETAR EM7-Qβ、ETAR TF10-Qβ在0、2、4周时分别在背部皮下多点免疫，剂量为400ug/只，在疫苗第三次免疫后第二天给予单次皮下注射MCT 60mg/kg；
第五组：空载组(VLP组)：用载体Qβ-2aa-CPG-ODN VLP在0、2、4周时分别在背部皮下多点免疫，剂量为400ug/只，在第三次免疫后第二天给予单次皮下注射MCT 60mg/kg。
2)采血：分别在第-28、-10、7、21、28天(MCT注射记为第1天)鼠尾采血，RT 3000rpm15min离心取上清，-80℃保存备用。
3)ELISA免疫印迹实验
由于免疫动物时所选用的载体为Qβ-2aa-CPG-ODN VLP，为了避免交叉反应，采用KLH作为载体与短肽偶联成疫苗后包板测定相应抗体的滴度，KLH作为载体与短肽偶联成疫苗的具体过程见实施例2。
1)包板：将载体疫苗ETAR KLH-EC10，ETAR KLH-YC9，ETAR KLH-RC8，ETAR KLH-EM7，ETAR KLH-TF10各取100ug，分别加入到10ml包被稀释液(PH9.6 0.05M NaCO3-NaHCO3缓冲液)中混匀后加入96孔板中，100ul/孔，4℃湿盒孵育过夜；
2)封闭：第二天弃包被液，加入浓度为1％BSA的PBS缓冲液，100ul/孔，37℃封闭2h；
3)封膜：封闭后弃封闭液，拍干并室温晾干后，贴上ELISA包被膜；
4)将上述血清取出，冰上解冻后，用ELISA法测定相应抗体滴度，具体步骤如下：
4a)倍比稀释：将血清上清用浓度为10％FBS的PBS缓冲液作为稀释液，做1：100，1：1000，1：5000，1：10000的梯度倍比稀释；
4b)孵育一抗：用移液器将1：1000倍比稀释后的血清标本加入到步骤1)中的96孔板中，37℃温箱、孵育2h；
4c)孵育二抗：一抗孵育完成后，弃液体并用洗涤液(0.03％PBST PH7.4)洗3遍，拍干，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的二抗(1：3000稀释稀释液为10％FBS的PBS缓冲液)，37℃温箱中孵育0.5h；
4d)显色：二抗孵育完成后弃液体并用洗涤液(0.03％PBST PH7.4)洗3遍，拍干，然后加入TMD显色液，100ul/孔，室温观察颜色变化；
4e)终止反应：待空白对照孔颜色开始变绿后，加入终止液(1M稀盐酸)，100ul/孔；
4f)读数：加入终止液后，放在酶标仪上在450nm波长下读出吸光度(OD)值；
4g)结果分析：以OD值不小于空白对照组的2.1倍作为待测标本阳性的标准，然后计算出相应标本的抗体滴度值。结果如图3，结果显示各载体疫苗免疫大鼠后均产生了抗特定人内皮素1受体A型免疫原性肽段的抗体。
实施例5肺动脉压力测定MCT注射后第28天右心导管法测量右心室收缩压，具体操作如下：
1)麻醉：MCT注射后第28天，用1％戊巴比妥钠生理盐水(4ml/kg)腹腔注射麻醉；
2)固定：待动物麻醉成功后，采取仰卧法将动物牙齿、四肢进行固定；
3)分离右侧颈静脉：将右侧颈部皮肤剪掉，采用顿性性分法分离出右侧颈静脉，并将其表面的结缔组织剥离；
4)压力测量：将自制的PE导管(sci美国)插入右侧颈静脉，然后逆行插入右心室，待感到强烈的心跳时连接压力传感器(adinstruments公司，澳大利亚)，观察压力记录仪(adinstruments公司，澳大利亚)上面出现的波形，直至测出右心室压力波形。结果如图4：结果显示MCT组和空载组较空白对照组肺动脉压力明显升高，人内皮素1受体A型免疫原性载体疫苗组肺动脉压力较空白对照组升高但是和MCT组和空载组比较有所降低，特别是疫苗ETAR EC10-Qβ、ETAR YC9-Qβ组肺动脉压力和波生坦灌胃组肺动脉压力降低幅度无明显差异。
5)标本留取：在右心室收缩压测定后，迅速取出肺脏，在PBS中漂洗两遍后切勿一小块肺脏浸泡在4％多聚甲醛中，组织经常规脱水，石蜡切片，行α-SMA染色，观察肺细小动脉血管重构，如图5A～5I所示。
6)统计学分析数据以均数±标准差表示，用SPSS23.0软件进行统计处理，治疗前后比较采用t检验，组间差异比较采用方差分析(ANOVA)，以P<0.05具有显著性差异。结果如图5J～5K所示。图5J表明MCT组和空载组的细小动脉管腔面积占细小动脉横截面积的百分比较空白对照组明显降低，而载体疫苗组较MCT组和空载组细小动脉管腔面积占细小动脉横截面积的百分比升高，特别是疫苗ETAR EC10-Qβ组和波生坦灌胃组细小动脉管腔面积占细小动脉横截面积的百分比升高更为明显。图5K表明MCT组和空载组细小动脉管壁厚度占细小动脉直径的百分比较空白对照组明显增高，而载体疫苗组较MCT组和空载组细小动脉管壁厚度占细小动脉直径的百分比较空白对照组降低，特别是疫苗ETAR EC10-Qβ组和波生坦灌胃细小动脉管壁厚度占细小动脉直径的百分比较空白对照组降低更为明显。
Figure BDA0001193425730000151
Figure BDA0001193425730000171
Figure BDA0001193425730000181
<110>武汉华纪元生物技术开发有限公司
<120>人内皮素A型受体免疫原性肽段及其载体疫苗
<160>10
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
His Asn Tyr Cys Pro Gln Gln Thr Lys
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工合成
<400>2
Arg Trp Pro Phe Asp His Asn Asp Phe
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工合成
<400>3
Glu Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人工合成
<400>4
Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工合成
<400>5
Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>人工合成
<400>6
Glu Gln His Lys Thr Cys Met
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工合成
<400>7
Thr Cys Met Leu Asn Ala Thr Ser Lys Phe
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人工合成
<400>8
Cys Met Leu Asn Ala Thr Ser Lys
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工合成
<400>9
Asn Glu Met Asp Lys Asn Arg Cys Glu
<210>10
<211>1284
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
atggaaaccc tttgcctcag ggcatccttt tggctggcac tggttggatg tgtaatcagt 60
gataatcctg agagatacag cacaaatcta agcaatcatg tggatgattt caccactttt 120
cgtggcacag agctcagctt cctggttacc actcatcaac ccactaattt ggtcctaccc 180
agcaatggct caatgcacaa ctattgccca cagcagacta aaattacttc agctttcaaa 240
tacattaaca ctgtgatatc ttgtactatt ttcatcgtgg gaatggtggg gaatgcaact 300
ctgctcagga tcatttacca gaacaaatgt atgaggaatg gccccaacgc gctgatagcc 360
agtcttgccc ttggagacct tatctatgtg gtcattgatc tccctatcaa tgtatttaag 420
ctgctggctg ggcgctggcc ttttgatcac aatgactttg gcgtatttct ttgcaagctg 480
ttcccctttt tgcagaagtc ctcggtgggg atcaccgtcc tcaacctctg cgctcttagt 540
gttgacaggt acagagcagt tgcctcctgg agtcgtgttc agggaattgg gattcctttg 600
gtaactgcca ttgaaattgt ctccatctgg atcctgtcct ttatcctggc cattcctgaa 660
gcgattggct tcgtcatggt accctttgaa tataggggtg aacagcataa aacctgtatg 720
ctcaatgcca catcaaaatt catggagttc taccaagatg taaaggactg gtggctcttc 780
gggttctatt tctgtatgcc cttggtgtgc actgcgatct tctacaccct catgacttgt 840
gagatgttga acagaaggaa tggcagcttg agaattgccc tcagtgaaca tcttaagcag 900
cgtcgagaag tggcaaaaac agttttctgc ttggttgtaa tttttgctct ttgctggttc 960
cctcttcatt taagccgtat attgaagaaa actgtgtata acgagatgga caagaaccga 1020
tgtgaattac ttagtttctt actgctcatg gattacatcg gtattaactt ggcaaccatg 1080
aattcatgta taaaccccat agctctgtat tttgtgagca agaaatttaa aaattgtttc 1140
cagtcatgcc tctgctgctg ctgttaccag tccaaaagtc tgatgacctc ggtccccatg 1200
aacggaacaa gcatccagtg gaagaaccac gatcaaaaca accacaacac agaccggagc 1260
agccataagg acagcatgaa ctga 1284

Claims (6)

1.一种人内皮素A型受体免疫原性肽段，其特征在于：所述人内皮素A型受体免疫原性肽段的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
2.一种人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗，其特征在于：所述人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗由权利要求1所述的人内皮素A型受体免疫原性肽段与载体偶联制备而成。
3.根据权利要求2所述的人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗，其特征在于：所述载体为Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白或钥孔血蓝蛋白。
4.根据权利要求3所述的人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗，其特征在于：所述Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白内包裹有佐剂。
5.根据权利要求4所述的人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗，其特征在于：所述佐剂为CPG-ODN。
6.一种如权利要求2所述的人内皮素A型受体免疫原性载体疫苗在制备治疗肺动脉高压药物的应用。
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