CN109897106A - 纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种纳米抗体。该抗体：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

Description

纳米抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及纳米抗体及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及纳米抗体、分离的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物、纳米抗体在制备药物中的用途以及制备纳米抗体的方法。

背景技术

活体细胞不停地进行新陈代谢活动，就必须不断地与周围环境进行物质交换，而细胞膜上的离子通道就是这种物质交换的重要途径之一。离子通道是一类跨膜蛋白，负责离子在细胞内与细胞外之间的特异运输。通过控制离子的流向，离子通道在兴奋性组织中可快速调节各种细胞信号，在非兴奋性组织中则缓慢地调节着细胞的增殖、体积、凋亡、迁移和粘附等过程。离子通道广泛参与神经系统、心血管系统、免疫系统、内分泌系统中的多种活动。到目前为止，已发现超过55种因离子通道突变而导致的遗传病，被称为离子通道病(channelopathy)，累及心血管、神经、运动等多个系统。由于离子通道作用广泛，因此它们成为许多相关疾病治疗的靶点。据报道，离子通道靶点，主要包括配体门离子通道和电压门离子通道，占所有药物靶点的～14％，是继GPCR之后的第二大类靶点，离子通道药物在全球的销售额达到120亿美元以上。这些结果均表明，离子通道参与众多的生命过程，与许多疾病相关，其靶点药物的开发一直是研究的热点，具有十分广阔的应用价值。

离子通道往往结构复杂，由多个独立的跨膜亚基组成。编码离子通道的基因占人类基因组的～1.5％，并且呈现出高度的多样性。结构的复杂性与多样性，使得靶向药物的开发具有很强的挑战性。截止2015年，在预测的400多个离子通道中，只有少数几个靶点的药物被开发出来。目前，已上市或在研的离子通道药物主要为小分子化学药物和生物毒素等。然而，这些药物具有选择性较差的缺点，无法满足临床上的应用。相比较而言，抗体具有以下优势：特异性强，能够精准识别靶点，从而减少由于脱靶而产生的副作用；便于改造，通过蛋白工程的手段对抗体进行修饰，从而提高其亲和力或者优化其药代动力学特征。

抗体一直是人们用来研究蛋白质的重要工具，被广泛应用于科学研究与疾病诊断。随着技术的进步，抗体药物的开发速度大幅增长。截至2013年2月，共有34个抗体药物获得美国FDA批准上市。并且，还有30个左右的抗体处于Ⅲ期临床阶段，或者等待审批，还有数百个抗体处于多种疾病的早期临床试验。根据EvaluatePharma的数据，2015年全球销量排名前10位的药物中，有6款是单抗或重组蛋白药物，并且这些药物的单品年销售额都在65亿美元以上，而且保持6％以上的增长速度。全球在售单抗药物在生物药中的占比超过30％，在研单抗药物在生物药中的占比是70％。2015年全球销售总额达到916亿美元，近10年年均复合增长率达到31.65％。因此可见，单克隆抗体药物的需求依然巨大。

然而，针对离子通道靶点，迄今尚无成熟的抗体药物问世。因此，开发和获得针对离子通道靶点的抗体药物是科学家拭待解决的关键问题。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

DNA免疫中，由于裸露的DNA在细胞之间不易传递，并且抗原呈递细胞(APC)吸收抗原也存在一定的难度，因此DNA通常难以激活免疫系统，产生的免疫反应较弱，尤其是在大动物免疫中。鉴于DNA免疫反应弱的不足，高灵敏度的筛选方法在制备离子通道抗体中就显的异常关键，而高通量DNA测序技术为从海量的抗体基因库中快速发现功能抗体分子提供了可能。本发明将DNA免疫与高通量测序技术相互结合，充分发挥各自的独特优势，提供了一种新的靶向抗体开发方法，成功获得了针对阳离子通道TRPV3的抗体。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述抗体：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

MGRWQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSTYRMTWVRQAPGKGLEWVSDISPGGGVTSYADTVKGRFTISRDNFKNALYLQMNSLKPEDTAVYYCAKRDLGLRDWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：1)。

MVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSLDYYAFAWFRQAPGKEREGVSCISDSGGSTNYADSVKGRFAISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAKRDLGLRDWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO：2)。

MAVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCVSSGSVFSQNAMGWYRQVPGKRRELITHIQSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKRDLGLRDWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO：3)。

根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。根据本发明实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。根据本发明实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述细胞携带前面所述的核酸构建体或前面所述的表达载体。根据本发明实施例的宿主细胞能够高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括：前面所述的纳米抗体；以及药学上可接收的佐剂。根据本发明实施例的药物组合物能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第七方面，本发明提出了前面所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗TRPV3相关性疾病。前面所述的纳米抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，利用前面所述的纳米抗体制备的药物能够有效预防或治疗TRPV3相关性疾病。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种制备前面所述纳米抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采集使用表达载体进行免疫接种的澳洲羊驼的外周血单核细胞和血清，所述表达载体携带编码TRPV3的基因；对所述单核细胞进行免疫组建库和高通量测序处理，以获得抗体基因库；对所述血清进行亲和纯化和质谱测序处理，以便获得抗体氨基酸序列；将所述抗体基因库与所述抗体氨基酸序列进行比对，以便获得前面所述的分离的核酸；利用携带所述核酸的原核表达载体转化原核细胞，并对转化后的原核细胞进行诱导处理，以便获得目的抗体。根据本发明实施例的上述方法解决了复杂抗原——TRPV3蛋白的制备难题，方法中将高通量测序和DNA免疫相互结合，解决了DNA免疫后免疫反应过低的问题，所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性的优势。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的针对TRPV3的纳米抗体的制备方法流程图；

图2是根据本发明实施例的表达载体pCMV-TRPV3-GFP结构示意图；

图3是根据本发明实施例的未免疫的羊驼血清和经过免疫的羊驼血清中的TRPV3蛋白；

图4是根据本发明实施例的TRPV3纳米抗体克隆的ELISA筛选结果；

图5是根据本发明实施例的SDS-PAGE电泳检测TRPV3-VHH6在大肠杆菌中的表达情况；以及

图6是根据本发明实施例的TRPV3-VHH6纯化后ELISA亲和力检测结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

纳米抗体

在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述抗体：(1)具有SEQ ID NO：1～3所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有如下较普通抗体的独特性质，包括：(1)高水溶性、高耐性和稳定性。正常抗体VH结构域单独表达时通常形成包涵体，或者暴露的疏水域相互黏附；而纳米抗体VHH由于其FR2中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性增加，聚合性减少；而且即使以包涵体形式表达，也很容易复性，这样可以大大提高作为药物的利用率。(2)高抗原结合性。纳米抗体能够识别独特的构造表位，比普通抗体有更广泛的抗原结合能力,可以达到常规抗体所不能达到的机体部位和分子位置，为我们打开了大型抗体无法到达的很多靶目标。(3)低免疫原性。纳米抗体因其相对分子质量很小且只有一个结构域，所以对人体的免疫原性较弱，与人的生物相容性较好。(4)较强的组织穿透力。纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的组织如实体瘤等发挥作用；并且多余未结合的纳米抗体能够很快的被清除，这相对于单克隆抗体组织穿透力差、不易被清除的不足，更有利于疾病的诊断。另外，纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障，这样的特性为脑部给药提供了新方法，有望成为治疗老年痴呆症的新药。(5)高表达性。因纳米抗体相对分子质量小、结构简单，由单一基因编码，所以它很容易在微生物中合成，能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达，而且其相对价格低廉、可进行大规模生产，易于普及和应用。

根据本发明的具体实施例，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，所述的抗体的框架区1具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

MGRWQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:4)。

MTWVRQAPGKGLEWVSD(SEQ ID NO:5)。

SYADTVKGRFTISRDNFKNALYLQMNSLKPEDTAVYY(SEQ ID NO:6)。

GQGTLVTVSA(SEQ ID NO:7)。

GFTLSTYR(SEQ ID NO:8)。

ISPGGGVT(SEQ ID NO:9)。

CAKRDLGLRDW(SEQ ID NO:10)。

分离的核酸

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

根据本发明的具体实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：11～13所示核苷酸序列。

ATGGGCCGTTGGCAGCTGGTTGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTTCAACCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTTTCACCCTGAGCACCTACCGTATGACCTGGGTGCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGCCTGGAATGGGTTAGCGACATCAGCCCGGGCGGTGGCGTGACCAGCTACGCGGACACCGTTAAGGGTCGTTTCACCATTAGCCGTGATAACTTTAAAAACGCGCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAGCCGGAGGATACCGCGGTGTACTATTGCGCGAAACGTGACCTGGGCCTGCGTGATTGGGGTCAAGGCACCCTGGTGACCGTTAGCGCG(SEQ ID NO:11)。

ATGGTGCAGCTGGTTGACAGCGGTGGCGGTCTGGTGCAACCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTTTCACCAGCCTGGATTACTATGCGTTCGCGTGGTTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGAGCGTGAAGGTGTGAGCTGCATCAGCGACAGCGGCGGTAGCACCAACTACGCGGATAGCGTTAAGGGCCGTTTTGCGATTAGCCGTGACAACGCGAAAAACACCGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAGCCGGAGGATACCGCGGTTTACTATTGCGCGAAACGTGACCTGGGTCTGCGTGATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTTAGCAGCGCG(SEQ ID NO:12)。

ATGGCGGTGCAGCTGGTTGAGAGCGGTGGCGGTCTGGCGCAACCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGTGAGCAGCGGCAGCGTTTTCAGCCAGAACGCGATGGGCTGGTATCGTCAAGTGCCGGGCAAGCGTCGTGAACTGATCACCCACATTCAGAGCGGCGGTAGCACCTACTATGCGGACAGCGTTAAGGGCCGTTTTACCATCAGCCGTGATAACGCGAAAAACACCCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAGCCGGAGGACACCGCGGTGTACTATTGCGCGAAACGTGACCTGGGTCTGCGTGATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTTAGCAGCGCG(SEQ ID NO:13)。

发明人发现，根据本发明实施例的上述核酸所编码的抗体在ELISA检测中阳性反应明显。

需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

核酸构建体

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导抗体在宿主中表达的一个或多个控制序列。根据本发明的实施例，控制序列包括但不限于U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。本发明实施例所提出的核酸构建体可在适合条件下，与表达载体连接后，在适宜的宿主细胞中高效表达上述纳米抗体，进而可有效用于对TRPV3相关性疾病的特异性治疗或预防。根据本发明实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

表达载体

在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。所述表达载体的类型不受特别限制，只要能够实现前面所述的核酸构建体在受体细胞中高效表达即可，表达载体包括但不限于反转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺病毒相关病毒载体。本发明实施例所述提出的表达载体可在适合条件下，在表达宿主中高效表达上述纳米多肽，所述表达载体可有效用于对TRPV3相关性疾病的特异性治疗或预防。根据本发明实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

宿主细胞

在本发明的第五方面，本发明提出了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述细胞携带前面所述的核酸构建体或前面所述的表达载体。根据本发明实施例的宿主细胞能够高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

根据本发明的具体实施例，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得。采用何种转染或转化的方式是根据宿主细胞的性质以及待转核酸构建体或表达载体的性质所决定的，只要能够在所述宿主细胞中实现前面所述多肽的高效表达并对宿主细胞的良好的细胞状态不产生较大影响即可。根据本发明的实施例，所述宿主细胞在合适条件下可高效表达上述纳米抗体，所述宿主细胞可有效用于对TRPV3相关性疾病的特异性治疗或预防。

需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述多肽表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合多肽表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体表达的条件。

药物组合物

在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括：前面所述的纳米抗体；以及药学上可接收的佐剂。根据本发明实施例的药物组合物能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

用途

在本发明的第七方面，本发明提出了前面所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗TRPV3相关性疾病。前面所述的纳米抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，利用前面所述的纳米抗体制备的药物能够有效预防或治疗TRPV3相关性疾病。

根据本发明的具体实施例，所述TRPV3相关性疾病为手掌和足跖部位皮肤高度角化为特征的慢性皮肤病。根据本发明的再一具体实施例，所述TRPV3相关性疾病为残毁性皮肤角化病口周皮肤病或局灶型掌跖角化病。利用前面所述的纳米抗体制备的药物在治疗残毁性皮肤角化病口周皮肤病(Olmsted Syndrome)或局灶型掌跖角化病方面效果更佳。

更进一步，本发明提出了一种治疗方法。根据本发明的实施例，该治疗方法包括：对患者给予治疗有效量的前面所述的纳米抗体、前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体、前面所述的表达载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物。如前所述，本发明实施例所提出的治疗方法，包括给予任一种有效量的前面所述的纳米抗体等，均可有效治疗或预防TRPV3相关性疾病。

在本文中所使用的术语“给予”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明实施例中的多肽、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物可以通过任何常见的途径给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明实施例中的纳米抗体、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。本文使用的“治疗”涵盖将发明实施例中的纳米抗体、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物给予个体以治疗，包括但不限于将含本文所述的给予有需要的个体。

制备前面所述纳米抗体的方法

在本发明的第八方面，本发明提出了一种制备前面所述纳米抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采集使用表达载体进行免疫接种的澳洲羊驼的外周血单核细胞和血清，所述表达载体携带编码TRPV3的基因；对所述单核细胞进行免疫组建库和高通量测序处理，以获得抗体基因库；对所述血清进行亲和纯化和质谱测序处理，以便获得抗体氨基酸序列；将所述抗体基因库与所述抗体氨基酸序列进行比对，以便获得前面所述的分离的核酸；利用携带所述核酸的原核表达载体转化原核细胞，并对转化后的原核细胞进行诱导处理，以便获得目的抗体。根据本发明实施例的上述方法解决了复杂抗原——TRPV3蛋白的制备难题，方法中将高通量测序和DNA免疫相互结合，解决了DNA免疫后免疫反应过低的问题，所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性的优势。

根据本发明的具体实施例，进一步包括对诱导处理产物进行纯化处理。发明人发现，经过纯化处理，抗体的亲和力显著提高。

需要说明的是，根据本发明实施例的纳米抗体及其用途和制备方法、编码所述纳米堕胎的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才发现和完成的。

下面将结合实施例进一步对本发明的方案进行解释。如前所述，本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

以下实施例的方法可概括如下：利用TRPV3表达质粒免疫羊驼，获得外周血单核细胞和血清，分别采用免疫组库测序技术和质谱技术，得到高质量的纳米抗体基因库和肽段库，然后通过基因库与肽段库的比对，从中筛选得到TRPV3特异性的纳米抗体表达基因，再将该基因转至大肠杆菌中，从而建立了能够在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，用于纳米抗体的制备。

为了方便理解，发明人将根据本发明实施例的针对TRPV3的纳米抗体的制备方法示于图1。

下面详细描述本发明TRPV3纳米抗体的制备过程：

1.表达载体构建

通过化学合成的方法，合成人TRPV3基因的表达序列，其序列为：ATGAAAGCCCACCCCAAGGAGATGGTGCCTCTCATGGGCAAGAGAGTTGCTGCCCCCAGTGGGAACCCTGCCATCCTGCCAGAGAAGAGGCCGGCGGAGATCACCCCCACAAAGAAGAGTGCACACTTCTTCCTGGAGATAGAAGGGTTTGAACCCAACCCCACAGTTGCCAAGACCTCTCCTCCTGTCTTCTCCAAGCCCATGGATTCCAACATCCGGCAGTGCATCTCTGGTAACTGTGATGACATGGACTCCCCCCAGTCTCCTCAGGATGATGTGACAGAGACCCCATCCAATCCCAACAGCCCCAGTGCACAGCTGGCCAAGGAAGAGCAGAGGAGGAAAAAGAGGCGGCTGAAGAAGCGCATCTTTGCAGCCGTGTCTGAGGGCTGCGTGGAGGAGTTGGTAGAGTTGCTGGTGGAGCTGCAGGAGCTTTGCAGGCGGCGCCATGATGAGGATGTGCCTGACTTCCTCATGCACAAGCTGACGGCCTCCGACACGGGGAAGACCTGCCTGATGAAGGCCTTGTTAAACATCAACCCCAACACCAAGGAGATAGTGCGGATCCTGCTTGCCTTTGCTGAAGAGAACGACATCCTGGGCAGGTTCATCAACGCCGAGTACACAGAGGAGGCCTATGAAGGGCAGACGGCGCTGAACATCGCCATCGAGCGGCGGCAGGGGGACATCGCAGCCCTGCTCATCGCCGCCGGCGCCGACGTCAACGCGCACGCCAAGGGGGCCTTCTTCAACCCCAAGTACCAACACGAAGGCTTCTACTTCGGTGAGACGCCCCTGGCCCTGGCAGCATGCACCAACCAGCCCGAGATTGTGCAGCTGCTGATGGAGCACGAGCAGACGGACATCACCTCGCGGGACTCACGAGGCAACAACATCCTTCACGCCCTGGTGACCGTGGCCGAGGACTTCAAGACGCAGAATGACTTTGTGAAGCGCATGTACGACATGATCCTACTGCGGAGTGGCAACTGGGAGCTGGAGACCACTCGCAACAACGATGGCCTCACGCCGCTGCAGCTGGCCGCCAAGATGGGCAAGGCGGAGATCCTGAAGTACATCCTCAGTCGTGAGATCAAGGAGAAGCGGCTCCGGAGCCTGTCCAGGAAGTTCACCGACTGGGCGTACGGACCCGTGTCATCCTCCCTCTACGACCTCACCAACGTGGACACCACCACGGACAACTCAGTGCTGGAAATCACTGTCTACAACACCAACATCGACAACCGGCATGAGATGCTGACCCTGGAGCCGCTGCACACGCTGCTGCATATGAAGTGGAAGAAGTTTGCCAAGCACATGTTCTTTCTGTCCTTCTGCTTTTATTTCTTCTACAACATCACCCTGACCCTCGTCTCGTACTACCGCCCCCGGGAGGAGGAGGCCATCCCGCACCCCTTGGCCCTGACGCACAAGATGGGGTGGCTGCAGCTCCTAGGGAGGATGTTTGTGCTCATCTGGGCCATGTGCATCTCTGTGAAAGAGGGCATTGCCATCTTCCTGCTGAGACCCTCGGATCTGCAGTCCATCCTCTCGGATGCCTGGTTCCACTTTGTCTTTTTTATCCAAGCTGTGCTTGTGATACTGTCTGTCTTCTTGTACTTGTTTGCCTACAAAGAGTACCTCGCCTGCCTCGTGCTGGCCATGGCCCTGGGCTGGGCGAACATGCTCTACTATACGCGGGGTTTCCAGTCCATGGGCATGTACAGCGTCATGATCCAGAAGGTCATTTTGCATGATGTTCTGAAGTTCTTGTTTGTATATATCGTGTTTTTGCTTGGATTTGGAGTAGCCTTGGCCTCGCTGATCGAGAAGTGTCCCAAAGACAACAAGGACTGCAGCTCCTACGGCAGCTTCAGCGACGCAGTGCTGGAACTCTTCAAGCTCACCATAGGCCTGGGTGACCTGAACATCCAGCAGAACTCCAAGTATCCCATTCTCTTTCTGTTCCTGCTCATCACCTATGTCATCCTCACCTTTGTTCTCCTCCTCAACATGCTCATTGCTCTGATGGGCGAGACTGTGGAGAACGTCTCCAAGGAGAGCGAACGCATCTGGCGCCTGCAGAGAGCCAGGACCATCTTGGAGTTTGAGAAAATGTTACCAGAATGGCTGAGGAGCAGATTCCGGATGGGAGAGCTGTGCAAAGTGGCCGAGGATGATTTCCGACTGTGTTTGCGGATCAATGAGGTGAAGTGGACTGAATGGAAGACGCACGTCTCCTTCCTTAACGAAGACCCGGGGCCTGTAAGACGAACAGCAGATTTCAACAAAATCCAAGATTCTTCCAGGAACAACAGCAAAACCACTCTCAATGCATTTGAAGAAGTCGAGGAATTCCCGGAAACCTCGGTGTAG(SEQ ID NO：14)，通过酶切位点SgfI和MluI，将表达序列插入pCMV-AC-GFP骨架，得到表达载体pCMV-TRPV3-GFP，如图2所示。

2.羊驼免疫

取800μg的pCMV-TRPV3-GFP质粒，溶解于任式液，注射到羊驼的后腿肌肉中。免疫之前从羊驼的耳缘静脉采集血液10mL。每隔两周免疫一次，同时采集外周血。总共免疫4次。

3.血清检测

免疫4次后，采用western blot的方法，检测血清中是否含有针对TRPV3的抗体产生。分别用未免疫的羊驼血清和经过4次免疫的羊驼血清，来检测三种不同来源的蛋白(U251细胞裂解液、CHO细胞裂解液和小鼠脑组织提取物)中TRPV3的表达。由图3可知，经过免疫的血清能够成功检测到TRPV3蛋白，表明经过4轮DNA免疫，羊驼体内产生了针对TRPV3的抗体。Western blot检测过程为：

①取适量待检测样品，与上样缓冲液混合，煮沸10min；

②将样品加到15％的SDS-PAGE胶中进行电泳，80V电泳直至蛋白进入分离胶，之后将电压上升至120V。当样品中的溴酚兰迁移至凝胶的最下端时，电泳结束；

③转膜：装好转膜系统后，加入适量的transfer buffer，冰浴条件下380mA转膜40min；

④将膜置于封闭缓冲液中，在摇床上封闭约1h；

⑤将未免疫血清和免疫血清加到封闭缓冲液中，与膜共同孵育1h；

⑥用TBST洗膜3次，每次5min；

⑦将二抗用封闭缓冲液稀释4000倍后，与膜在室温一起孵育30～60min；

⑧用TBST洗膜3次，每次5min；

⑨在暗室中，将膜与化学发光试剂一起孵育约1min，用滤纸吸去过剩的液体后将膜置于暗匣中(发光面朝上)，并在其上压上一块适当大小的X光片，盖上暗匣，压片5～10s；

⑩将X光片经显影、定影后，保存。

4.免疫组库测序

(1)外周血单核细胞的分离、RNA的提取及逆转录

①采用Percoll密度梯度离心分离纯化羊驼外周血单核细胞；

②将单核细胞用PBS溶液清洗几次后，加入1mL TRIzol，混匀，室温静置10min；

③加入0.2mL氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，溶液分成上下两层；

④在4℃条件下，12 000rpm离心15min；

⑤小心吸取上层清液(约0.6mL)到一新的离心管中；加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀后室温放置5min，观察白色沉淀析出；

⑥在4℃条件下，12 000rpm离心10min，倒掉上清液，收集RNA沉淀；加入1mL 75％乙醇(DEPC水稀释)洗涤RNA，7 500rpm离心5min(4℃)；

⑦弃乙醇，吹干后加入20-100uL的RNase-free或高温灭菌的DEPC水溶解(加水量依RNA的多少而定)；

⑧取1uL样品测定样品浓度以及纯度。

采用Life Technologies公司的SuperScript III First-Strand cDNASynthesis试剂盒进行逆转录反应。具体为：

①在RNase-free或DEPC处理过的200uL离心管中，配制如下反应体系1，总体积10uL：

②65℃反应5min后立即置于冰上；

③在10uL反应体系1中，配制反应体系2，总体积20uL：

④65℃反应10min,65℃反应30-60min；

⑤95℃处理3min或70℃处理15min，是RNA聚合酶失活；

(2)免疫组库建库

以反转录产物cDNA为模板，扩增羊驼传统抗体和纳米抗体的免疫组库。按照以下体系配置PCR反应体系，总体积50uL：

其中，正向引物CALL001的序列为：5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(SEQ ID NO：15)-3′；反向引物CALL002的序列为：5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO：16)-3′。

PCR反应条件如下：

PCR反应结束后，在2％的琼脂糖凝胶中回收750bp左右的DNA片段。以回收产物作为模板，进行下一轮的PCR扩增，PCR体系如下：

其中，正向引物CA-HV，包含7条引物，等比例混合，序列分别为：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGSAKGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(SEQ ID NO：17)-3’5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGCVGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(SEQ ID NO：18)-3’

5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCAGGTAMAGCTGGAGGAGTCTGG(SEQ ID NO：19)-3’

5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGCCGTGCAGCTGGTGGATTCTGG(SEQ ID NO：20)-3’

5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGG(SEQ ID NO：21)-3’

5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTCCAGCTGGTGCAGCCAGGG(SEQ ID NO：22)-3’

5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGG(SEQ ID NO：23)-3’

反向引物CA-HJ包含4条引物，等比例混合，序列分别为：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTKGAGACAGTGACCAGGGT(SEQ ID NO：24)-3’

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGACGGTGACCAGGGT(SEQ ID NO：25)-3’

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO：26)-3’

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGACACGGTGCCCAGGTG(SEQ ID NO：27)-3’

PCR反应条件如下：

PCR产物经过磁珠纯化，步骤如下：

①按照样品体积加入1倍体积磁珠(100μL)并混匀，静置5min，瞬时离心3秒；

②将1.5mL离心管转移放置在磁力架上，静置3-5min至澄清；

③小心吸去上清，不要触及磁珠(1.5mL离心管放在磁力架上)；加入500μL 75％乙醇，轻轻吹打磁珠2-3次，等待30秒，弃上清；

④置恒温混匀仪37℃干燥3-5min左右；

⑤往1.5mL离心管中加入30μL nuclease-free water，充分混匀，静置5min，然后置于磁力架约5min至澄清；

⑥将30μL澄清液转移至事先准备好的新1.5mL离心管中。

以上述磁珠纯化的产物为模板，进行第三轮PCR扩增，反应体系为：

PCR反应条件如下：

PCR反应结束后，在2％的琼脂糖凝胶中回收500bp左右的纳米抗体基因片段，用于上机测序。

(3)上机测序

取适量的免疫组库文库DNA样品，在Hiseq PE250平台进行序列测定，得到抗体的基因序列库。

5.抗体氨基酸序列测定

(1)亲和纯化

①在去离子水中溶解配体(TRPV3的一小段多肽，序列为：CSYYRPREEEAIPHP)，与sephorase 4B按照1:1混匀；

②调节pH值至13,40℃震荡富裕16h；

③用去离子水洗掉未交联的配体；

④将交联好的基质转移至1M，pH＝8.0的乙醇胺中，40-50℃过夜；

⑤使用含0.5M NaCl的0.1M的醋酸盐缓冲液(pH＝4.5)，与含有0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)交替洗脱交联配体基质混合物，去除未交联的配体；

⑥装柱：将与配体偶联后的基质倒入层析柱内，关闭下部流出口，使基质自然缓慢下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1mL/min的速度流出；

⑦上样：向柱子中倾倒样品，使样品缓慢流出，并即时回收流出液；

⑧用平衡缓冲液洗涤基质5个柱体积，每200μl接一管，回收洗涤液；

⑨洗脱：洗脱缓冲液为平衡缓冲液添加不同浓度NaCl配置而成；使用不同平衡缓冲液及不同离子强度缓冲液进行洗脱，回收样品，1mL/管。

(2)多抗的酶解处理

①胃蛋白酶酶解：

在25mM磷酸盐缓冲液(pH 2.5)中，以胃蛋白酶水解GPC1多抗，切SDS-PAGE胶获取F(ab’)2片段，对F(ab’)2片段进行胶内酶解，所得肽段以高效液相色谱仪梯度洗脱，分为6个组分，冷冻真空干燥，以流动相A相溶解，上样量1μg，进行质谱分析。

其中：胃蛋白酶水解条件为：多克隆抗体50μg，胃蛋白酶：多克隆抗体(w/w)为1:100，多克隆抗体浓度1μg/μl，37℃水浴16小时，加入Tris缓冲液(Ph 9.0)调节反应体系至中性。

SDS-PAGE分离条件为：浓缩胶浓度5％，分离胶浓度12％，每孔上样量5-6μg。

②串联酶解

F(ab’)2胶粒脱色，在25mM NH₄HCO₃溶液中，以10mM DTT、55mM IAM对二硫键进行还原烷基化后，以F(ab’)2片段：酶(w/w)为1:10的比例加入测序级Glu-C酶，37℃水浴4小时，以同样比例加入测序级胰蛋白酶，37℃水浴16小时，所得肽段以高效液相色谱仪梯度洗脱，1管/分钟，收集24管，每4管合并成1管，成为6个组分

梯度洗脱条件为：岛津Prominence纳流液相色谱仪；Gemini C18柱(5μm,250×4.6mm)；流动相A相为含有25％乙腈、25mM KH2PO4的水溶液，流动相B相为含有25％乙腈、25MM KH2PO4、500mM KCL的水溶液；C18柱(3μm,25cm×75μm)；洗脱梯度0-5％B相2分钟，5-10％B相4分钟，10-15％B相4分钟，15-20％B相4分钟，20-30％B相4分钟，30-80％B相2分钟，80-5％B相2分钟，5％B相8分钟；流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长245nm，分析时间30分钟。收集从5分钟开始，29分钟结束。

(3)质谱分析

液相-质谱条件为：DIONEX UltiMate 3000纳流液相色谱仪，Thermo ScientificQ Exactive HF质谱分析仪；流动相A相为0.1％蚁酸水溶液，流动相B相为含有0.1％蚁酸水溶液和80％乙腈的混合溶液；洗脱梯度为0-5％B相5分钟，5-25％B相40分钟，25-35％B相5分钟，35-80％B相2分钟，80％B相2分钟，80-5％B相0.5分钟，5％B相15.5分钟；流速0.3μl/min，柱温40℃，检测波长245nm，分析时间1小时。

6.信息分析

首先，利用二代高通量测序进行参考数据库的构建，得到蛋白的序列(targetsequences)，根据该蛋白序列构建反向序列库(decoy sequences)，将target sequences和decoy sequences合并作为下游数据分析的database。

其次，基于上述数据库，利用Mascot软件进行搜库鉴定，具体的参数如下：Enzyme,Trypsin、GluC+trypsin、chymotrypsin+trypsin；Peptide Mass Tolerance,10ppm；Fragment Mass Tolerance 0.05Da；Fixed Modifications,Carbamidomethyl(C)；Variable modifications:Deamidated(NQ),Oxidation(M)等参数，采用Percolator软件对鉴定肽段进行谱图水平的1％FDR(false discovery rate)过滤，获得可信的鉴定肽段。鉴定获得的肽段依据数据库进行蛋白的归并并对归并后的蛋白list进行蛋白水平的1％FDR获得可信的蛋白list。

然后，对Trypsin、GluC+trypsin、chymotrypsin+trypsin多酶组合酶解肽段，采用谱图计数的方法对鉴定获得的蛋白进行定量分析，得到不同蛋白的定量结果，比较分析不同蛋白的定量值；

最后，结合二代测序结果进行BCR各个区域覆盖度及其全长覆盖度的分析统计；筛选获得表达含量高，覆盖度较高的蛋白列表及其所对应的gene ID，尤其是筛选获得BCR各个区域覆盖度较高的蛋白；这些蛋白将作为特异性抗原刺激产生的特异性抗体，并作为下游的实验验证的靶向蛋白。

所谓覆盖度指的是，质谱鉴定到的肽段的氨基酸序列长度与二代测序参考数据库中对应该条抗体克隆的核酸序列翻译成氨基酸序列的长度的比值。覆盖度越高，表明该条抗体克隆在多抗样本中能够被真实鉴定到，质谱鉴定的可信度越高。

蛋白内切酶Trypsin是胰蛋白酶；蛋白内切酶chymotrypsin是糜蛋白酶，或者胰凝乳蛋白酶；蛋白内切酶GluC(又称金黄色葡萄菌V8蛋白酶)是丝氨酸蛋白酶。

7.纳米抗体的筛选

根据信息分析的结果，从免疫组库数据中挑选出抗原特异的纳米抗体序列，采用化学合成的方法进行合成，并将这些序列通过NcoI和NheI酶切位点，克隆到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21菌株。经过1mM IPTG过夜诱导，收集菌体，在PBS中重悬，超声破碎。12 000rpm离心40min，收集破碎上清，进行ELISA测试。具体为：

①将TRPV3多肽溶解于0.1M的NaHCO₃溶液，浓度为1ng/μL，取100μL包被ELISA板，4℃过夜；

②倒掉包被液，用PBS/Tween洗涤5次，加入200μl 2％的BSA，室温静置2h，对ELISA板进行封闭；

③去掉封闭液，用PBS/Tween对板洗涤5次；

④取100μL裂解上清至ELISA板中，室温1h；

⑤弃去裂解液，PBS/Tween洗涤5次；加入100μL 1000倍稀释的鼠抗HIS标签的抗体，室温1h；

⑥弃去上清，PBS/Tween洗涤5次，加入100μL 2000倍稀释的抗鼠AP抗体，室温1h；

⑦弃去上清，PBS/Tween洗涤5次，加入100μL新鲜配置的磷酸酶底物溶液，静置10-20min，读取405的吸光值，吸光值为空白对照的2倍以上为阳性克隆。

根据信息分析的结果，从免疫组库数据中挑选出9条纳米抗体序列进行表达，经过ELISA检测，其中有3株克隆呈现阳性反应，如图4所示。其中，克隆TRPV3-VHH6的阳性反应明显强于其它克隆，其抗体表达序列为：ATGGGCCGTTGGCAGCTGGTTGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTTCAACCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTTTCACCCTGAGCACCTACCGTATGACCTGGGTGCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGCCTGGAATGGGTTAGCGACATCAGCCCGGGCGGTGGCGTGACCAGCTACGCGGACACCGTTAAGGGTCGTTTCACCATTAGCCGTGATAACTTTAAAAACGCGCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAGCCGGAGGATACCGCGGTGTACTATTGCGCGAAACGTGACCTGGGCCTGCGTGATTGGGGTCAAGGCACCCTGGTGACCGTTAGCGCG(SEQ ID NO:1)。

8.TRPV3纳米抗体的诱导表达和ELISA分析

将筛选的克隆TRPV3-VHH6在16℃条件下，1mM的IPTG诱导16h后，菌体经过超声破碎，并用镍柱进行纯化。纯化具体步骤为：

①在填充柱中加入Ni-IDA填料；

②将上述TRPV3-VHH6纳米抗体表达菌体超声破碎上清加入到镍柱中，使流穿液以2mL/min的速度流出；

③用至少20倍柱体积以上的清洗缓冲液(10mmol/L咪唑)洗涤，去掉杂蛋白；

④用等体积的洗脱缓冲液(100mmol/L咪唑)，并收集洗脱液；

纯化出的抗体，采用SDS-PAGE电泳检测TRPV3-VHH6的表达情况。图5显示，TRPV3-VHH6在大肠杆菌中成功表达，如图5中的箭头位置所示，分别对应纳米抗体的二聚体和单体形式，与预期大小相同。由图可知，TRPV3-VHH6主要是二聚体的形式存在，单体较少。

进一步地，采用ELISA检测纯化出的抗体的活性。结果显示，纯化出的抗体对抗原有非常高的亲和力；与未纯化的菌体上清相比，纯化后抗体的亲和力显著提高，如图6所示。

由以上数据表明，通过DNA免疫，结合免疫组库测序，能够从羊驼中分离出高亲和力的离子通道纳米抗体。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 纳米抗体及其制备方法和应用

<130> PIDC3173843

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 纳米抗体的氨基酸序列

<400> 1

Met Gly Arg Trp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser

20 25 30

Thr Tyr Arg Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Asp Ile Ser Pro Gly Gly Gly Val Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Ala

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Arg Asp Leu Gly Leu Arg Asp Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 纳米抗体的氨基酸序列

<400> 2

Met Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Leu Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ala Phe Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

35 40 45

Val Ser Cys Ile Ser Asp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Lys Arg Asp Leu Gly Leu Arg Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala

115

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 纳米抗体的氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ser Ser Gly Ser Val Phe Ser Gln

20 25 30

Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Thr His Ile Gln Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Arg Asp Leu Gly Leu Arg Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala

115

<210> 4

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区1的氨基酸序列

<400> 4

Met Gly Arg Trp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区2的氨基序列

<400> 5

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Asp

<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区3的氨基酸序列

<400> 6

Ser Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Phe Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr

35

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区4的氨基酸序列

<400> 7

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区1的氨基酸序列

<400> 8

Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区2的氨基酸序列

<400> 9

Ile Ser Pro Gly Gly Gly Val Thr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区3的氨基酸序列

<400> 10

Cys Ala Lys Arg Asp Leu Gly Leu Arg Asp Trp

1 5 10

<210> 11

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗体的核酸的核苷酸序列

<400> 11

atgggccgtt ggcagctggt tgagagcggt ggcggtctgg ttcaaccggg cggtagcctg 60

cgtctgagct gcgcggcgag cggtttcacc ctgagcacct accgtatgac ctgggtgcgt 120

caggcgccgg gcaagggcct ggaatgggtt agcgacatca gcccgggcgg tggcgtgacc 180

agctacgcgg acaccgttaa gggtcgtttc accattagcc gtgataactt taaaaacgcg 240

ctgtacctgc aaatgaacag cctgaagccg gaggataccg cggtgtacta ttgcgcgaaa 300

cgtgacctgg gcctgcgtga ttggggtcaa ggcaccctgg tgaccgttag cgcg 354

<210> 12

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗体的核酸的核苷酸序列

<400> 12

atggtgcagc tggttgacag cggtggcggt ctggtgcaac cgggcggtag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cgagcggttt caccagcctg gattactatg cgttcgcgtg gtttcgtcag 120

gcgccgggca aggagcgtga aggtgtgagc tgcatcagcg acagcggcgg tagcaccaac 180

tacgcggata gcgttaaggg ccgttttgcg attagccgtg acaacgcgaa aaacaccgtg 240

tacctgcaaa tgaacagcct gaagccggag gataccgcgg tttactattg cgcgaaacgt 300

gacctgggtc tgcgtgattg gggccaaggc accctggtga ccgttagcag cgcg 354

<210> 13

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗体的核酸的核苷酸序列

<400> 13

atggcggtgc agctggttga gagcggtggc ggtctggcgc aaccgggcgg tagcctgcgt 60

ctgagctgcg tgagcagcgg cagcgttttc agccagaacg cgatgggctg gtatcgtcaa 120

gtgccgggca agcgtcgtga actgatcacc cacattcaga gcggcggtag cacctactat 180

gcggacagcg ttaagggccg ttttaccatc agccgtgata acgcgaaaaa caccctgtac 240

ctgcaaatga acagcctgaa gccggaggac accgcggtgt actattgcgc gaaacgtgac 300

ctgggtctgc gtgattgggg ccaaggcacc ctggtgaccg ttagcagcgc g 351

<210> 14

<211> 2376

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> TRPV3基因的核苷酸序列

<400> 14

atgaaagccc accccaagga gatggtgcct ctcatgggca agagagttgc tgcccccagt 60

gggaaccctg ccatcctgcc agagaagagg ccggcggaga tcacccccac aaagaagagt 120

gcacacttct tcctggagat agaagggttt gaacccaacc ccacagttgc caagacctct 180

cctcctgtct tctccaagcc catggattcc aacatccggc agtgcatctc tggtaactgt 240

gatgacatgg actcccccca gtctcctcag gatgatgtga cagagacccc atccaatccc 300

aacagcccca gtgcacagct ggccaaggaa gagcagagga ggaaaaagag gcggctgaag 360

aagcgcatct ttgcagccgt gtctgagggc tgcgtggagg agttggtaga gttgctggtg 420

gagctgcagg agctttgcag gcggcgccat gatgaggatg tgcctgactt cctcatgcac 480

aagctgacgg cctccgacac ggggaagacc tgcctgatga aggccttgtt aaacatcaac 540

cccaacacca aggagatagt gcggatcctg cttgcctttg ctgaagagaa cgacatcctg 600

ggcaggttca tcaacgccga gtacacagag gaggcctatg aagggcagac ggcgctgaac 660

atcgccatcg agcggcggca gggggacatc gcagccctgc tcatcgccgc cggcgccgac 720

gtcaacgcgc acgccaaggg ggccttcttc aaccccaagt accaacacga aggcttctac 780

ttcggtgaga cgcccctggc cctggcagca tgcaccaacc agcccgagat tgtgcagctg 840

ctgatggagc acgagcagac ggacatcacc tcgcgggact cacgaggcaa caacatcctt 900

cacgccctgg tgaccgtggc cgaggacttc aagacgcaga atgactttgt gaagcgcatg 960

tacgacatga tcctactgcg gagtggcaac tgggagctgg agaccactcg caacaacgat 1020

ggcctcacgc cgctgcagct ggccgccaag atgggcaagg cggagatcct gaagtacatc 1080

ctcagtcgtg agatcaagga gaagcggctc cggagcctgt ccaggaagtt caccgactgg 1140

gcgtacggac ccgtgtcatc ctccctctac gacctcacca acgtggacac caccacggac 1200

aactcagtgc tggaaatcac tgtctacaac accaacatcg acaaccggca tgagatgctg 1260

accctggagc cgctgcacac gctgctgcat atgaagtgga agaagtttgc caagcacatg 1320

ttctttctgt ccttctgctt ttatttcttc tacaacatca ccctgaccct cgtctcgtac 1380

taccgccccc gggaggagga ggccatcccg caccccttgg ccctgacgca caagatgggg 1440

tggctgcagc tcctagggag gatgtttgtg ctcatctggg ccatgtgcat ctctgtgaaa 1500

gagggcattg ccatcttcct gctgagaccc tcggatctgc agtccatcct ctcggatgcc 1560

tggttccact ttgtcttttt tatccaagct gtgcttgtga tactgtctgt cttcttgtac 1620

ttgtttgcct acaaagagta cctcgcctgc ctcgtgctgg ccatggccct gggctgggcg 1680

aacatgctct actatacgcg gggtttccag tccatgggca tgtacagcgt catgatccag 1740

aaggtcattt tgcatgatgt tctgaagttc ttgtttgtat atatcgtgtt tttgcttgga 1800

tttggagtag ccttggcctc gctgatcgag aagtgtccca aagacaacaa ggactgcagc 1860

tcctacggca gcttcagcga cgcagtgctg gaactcttca agctcaccat aggcctgggt 1920

gacctgaaca tccagcagaa ctccaagtat cccattctct ttctgttcct gctcatcacc 1980

tatgtcatcc tcacctttgt tctcctcctc aacatgctca ttgctctgat gggcgagact 2040

gtggagaacg tctccaagga gagcgaacgc atctggcgcc tgcagagagc caggaccatc 2100

ttggagtttg agaaaatgtt accagaatgg ctgaggagca gattccggat gggagagctg 2160

tgcaaagtgg ccgaggatga tttccgactg tgtttgcgga tcaatgaggt gaagtggact 2220

gaatggaaga cgcacgtctc cttccttaac gaagacccgg ggcctgtaag acgaacagca 2280

gatttcaaca aaatccaaga ttcttccagg aacaacagca aaaccactct caatgcattt 2340

gaagaagtcg aggaattccc ggaaacctcg gtgtag 2376

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CALL001的序列

<400> 15

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物CALL002的序列

<400> 16

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV的序列

<400> 17

cagacgtgtg ctcttccgat ctagsakgtg cagctggtgg agtctgg 47

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV的序列

<400> 18

cagacgtgtg ctcttccgat ctaggcvgtg cagctggtgg agtctgg 47

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV的序列

<400> 19

cagacgtgtg ctcttccgat ctagcaggta magctggagg agtctgg 47

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV的序列

<400> 20

cagacgtgtg ctcttccgat ctaggccgtg cagctggtgg attctgg 47

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV的序列

<400> 21

cagacgtgtg ctcttccgat ctaggaggtg cagttggtgg agtctgg 47

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV的序列

<400> 22

cagacgtgtg ctcttccgat ctaggtccag ctggtgcagc caggg 45

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物CA-HV序列

<400> 23

cagacgtgtg ctcttccgat ctagcaggtg cagctgcagg agtcgg 46

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物CA-HJ序列

<400> 24

ctacacgacg ctcttccgat ctkgagacag tgaccagggt 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物CA-HJ序列

<400> 25

ctacacgacg ctcttccgat ctggagacgg tgaccagggt 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物CA-HJ序列

<400> 26

ctacacgacg ctcttccgat ctggagacgg tgacctgggt 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物CA-HJ序列

<400> 27

ctacacgacg ctcttccgat ctggacacgg tgcccaggtg 40

Claims (10)

1.一种TRPV3纳米抗体，其特征在于，所述抗体：

(1)具有SEQ ID NO：1～3所示氨基酸序列；或

(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述TRPV3纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述的抗体的框架区1具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸为：

编码权利要求1或2所述抗体的核酸或其互补序列。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，具有SEQ ID NO：11～13所示核苷酸序列。

5.一种核酸构建体，其特征在于，包含：

编码序列，所述编码序列为权利要求3或4所述的核酸，以及

可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。

6.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的表达载体，

可选地，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括：

权利要求1或2所述的纳米抗体；以及

药学上可接受的佐剂。

9.权利要求1或2所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗TRPV3相关性疾病，

任选地，所述TRPV3相关性疾病为手掌和足跖部位皮肤高度角化为特征的慢性皮肤病，

任选地，所述TRPV3相关性疾病为残毁性皮肤角化病口周皮肤病或局灶型掌跖角化病。

10.一种制备权利要求1或2所述纳米抗体的方法，其特征在于，包括：

采集使用表达载体进行免疫接种的澳洲羊驼的外周血单核细胞和血清，所述表达载体携带编码TRPV3的基因；

对所述单核细胞进行免疫组建库和高通量测序处理，以获得抗体基因库；

对所述血清进行亲和纯化和质谱测序处理，以便获得抗体氨基酸序列；

将所述抗体基因库与所述抗体氨基酸序列进行比对，以便获得权利要求3或4所述的分离的核酸；

利用携带所述核酸的原核表达载体转化原核细胞，并对转化后的原核细胞进行诱导处理，以便获得目的抗体，

优选地，进一步包括对诱导处理产物进行纯化处理。