JP2002508156A

JP2002508156A - Ｈｓｐ６０ファミリーのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ熱ショックタンパク質

Info

Publication number: JP2002508156A
Application number: JP2000527654A
Authority: JP
Inventors: リーミッツェン，; ジャンウィスニュースキー，
Original assignee: ストレスジェンバイオテクノロジーズコーポレイション
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1998-12-29
Publication date: 2002-03-19
Also published as: EP1042480A1; US20060039922A1; AU1866099A; WO1999035270A1; CA2315880A1

Abstract

(57)【要約】ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓに対して特異的な、単離された核酸分子を含む方法および組成物、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓに対して特異的な、ベクター構築物および単離されたポリペプチドが、提供される。このような組成物および方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染を診断するため、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌に対する免疫応答を生じるために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓＨｓｐ６０タンパク質（そのフラグメント）、ならびにこのようなタン
パク質およびフラグメントをコードする核酸分子、ならびにこのようなタンパク
質および核酸分子の使用に関する。

【０００２】（発明の背景）世界保健機関は、世界中で、５歳以下での小児の死亡の約３０％、すなわち約
４００〜５００万人が、急性呼吸感染から生じると見積った。ＤａｖｉｄＫｌ
ｅｉｎ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅｓ：
ＲｅｖｉｅｗａｎｄＵｐｄａｔｅ、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｒｕｇＲｅｓ
ｉｓｔａｎｃｅ１：４９、１９９５。これらの死亡の原因となる最も頻繁な原
因となる因子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、
これはまた、肺炎球菌として呼ばれ、そして静脈洞炎、耳炎、肺炎、菌血症、お
よび髄膜炎のような広範な種々の感染を生じる。この生物は、健康な小児の１５
〜３５％および呼吸感染を患う小児の８０％までの呼吸粘膜に見出される。Ｇｒ
ａｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４２：９２３．１９８０；Ｈｅｎｄｌｅ
ｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３２：５５、１９７５。さらにＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、７０，０００の髄膜炎での死亡、
ならびに敗血症および他の感染に由来する同様の数の死亡の原因である。

【０００３】発展途上国では、肺炎球菌感染は、５歳以下の小児のうちの約１２０万人の死
亡の原因であり、これは、全ての肺炎に関連する死亡の約４０％に対応する。世
界保健機関、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅ
ｓは、１９９３年１１月１５〜１７日の会合の報告書（ＷＨＯ／ＡＲＩ／９４．
３４）中で報告した。工業国では、アメリカ合衆国を例として挙げると、肺炎球
菌は、一般の集団における重篤な病的状態、ならびに高齢者および免疫無防備状
態の集団の死亡の主な原因である（Ｋｌｅｉｎら（前出））。肺炎球菌は、年を
取った成人において、任意の他の感染因子よりも多い死亡（約５０，０００件）
を生じる。ハイリスクな個体は、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、無脾症、
アルコール症およびＨＩＶ感染を患う個体を含む。肺炎球菌はまた、２歳以下の
小児に対して大きな危険性を引き起こす。２歳未満の乳児では、肺炎球菌は、髄
膜炎、菌血症および中耳炎の主要な原因である。生命の初めの２年内では、約２
５％の小児が肺炎球菌により引き起こされる中耳炎を経験し、６歳までに割合は
７５％にまで上昇する。フィンランドでは、２歳の小児は、平均して、中耳炎の
１つより多いのエピソードを経験した。急性中耳炎の症例の約半数は、肺炎球菌
により引き起こされたと決定された。Ｅｓｋｏｌａ，Ｊ．およびＫａｅｙｈｔｙ
，Ｈ．、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２７：５３、１９９５。

【０００４】肺炎球菌は、型特異的莢膜多糖類を有するグラム陽性生物である。８３の異な
る型の特異性が同定されており、そしてアメリカのシステムで１〜８３と命名さ
れている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５０：９７〜１２１、１
９９０。異なる肺炎球菌の多糖類の構造は、ＴｈｅＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅｓ２：２８２〜３６３（Ａｓｐｉｎａｌ編、１９８３）中でＫｅｎｎｅお
よびＬｉｎｄｂｅｒｇにより総説されている。

【０００５】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫応答を生成
する効果的な方法に対する必要性は、昔から認識された。１９４５年には、単離
された莢膜多糖類は、ヒトにおいて型特異的防御を提供し得ることが実証された
。ＭａｃＬｅｏｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．８２：４４５〜６５、１９４５。し
かし、この防御は、完全な防御に必要とされる異なる多糖類の数が多いことに起
因して不適切であった。ワクチンにおける関心は、感染の抗生物質処置の成功に
よりすぐに鎮静した。

【０００６】最近、有効なワクチンの開発における関心が再び始められた。１つの理由は、
肺炎球菌のような被包性細菌により引き起こされる感染疾患の抗生物質の処置が
、いつも罹患および死亡を予防するとは限らないこということである。類似の例
について、治癒したＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ髄膜炎は、後
天性の精神遅滞の主要な原因であった。Ｓｅｌｌら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ４
９：２０６〜１１、１９７２。ワクチン開発において再び始まった関心について
の別の重要な理由は、肺炎球菌の抗生物質耐性株の出現および迅速な広がりであ
った。例えば、フランスのパリにおける２つの病院では、患者から単離された耐
性株の頻度は、１９８７年で１．８％であったのが１９９０年では１７％に上昇
した。スペインのバルセロナでは、耐性の割合は、１９７９年で４．３％であっ
たのが１９９０年では４０％に上昇した。ＬｏｎｋｓおよびＭｅｄｅｉｒｏｓ、
ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＴｈｅｒａｐｙ１７９：５２３〜３５、１９
９５を参照のこと。多剤耐性肺炎球菌はまた、アメリカ合衆国の５０の州のうち
１８を含む多数の国で出現した。

【０００７】８３の莢膜型のうち１４に対する多糖類抗原を含むワクチンが開発され、そし
て１９７８年に発表された。ＬｏｎｋｓおよびＭｅｄｅｉｒｏｓ（前出）。この
ワクチンは、２３の異なる多糖類を含む第２世代ワクチンの作製により１９８３
年に改良された。しかし、このワクチンを使用する２つの大きな研究（１つは、
２８３７人の患者）は、この改良されたワクチンが肺炎球菌菌血症に対して約５
７％のみの効力であったことを示した。Ｂｕｔｌｅｒら、ＪＡＭＡ２７０：１
８２６、１９９３。

【０００８】多糖類に基づいたワクチンの弱点は、これらのワクチンの効力がこれらのワク
チンに非常に応答しにくい２歳未満の乳児において問題であるということである
。Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈら、ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉａ
ｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ３９１〜４０２（Ｈａｂｅｒａｎｄ
Ｋｒａｕｓｅ編、１９７７）。さらなる弱点は、多糖類に基づくワクチンによ
り産生される抗体が主にＩｇＭアイソタイプであり、従って、免役応答が抗原に
対する第２の曝露で増強されないということである。

【０００９】多糖類に基づくワクチンについてのこれらおよび他の問題は、当該分野におい
て、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関する免疫応答を生
成するために使用され得る、改良された組成物に対する需要が存在することを実
証する。

【００１０】Ａ型ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（「ＧＡＳ」）としても呼ばれる、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｒｏｇｅｎｅｓに関して、急性咽頭炎（連鎖球菌性咽
頭炎）から、心臓弁の変性（急性リウマチ熱）および急性溶連菌感染後性糸球体
腎炎を含む侵襲性疾患に及ぶ、多数のヒト疾患状態と原因的に関連するグラム陽
性細菌でもある。Ｆａｃｋｌａｍ、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＧｒｏｕｐ
ＡＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｍａｎｕａｌｏｆ
ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１〜２２（Ｌｅｎｎｅｔｔｅ、
Ｂａｌｏｗｓ、ＨａｕｓｌｅｒおよびＴｒｕａｎｔ編、１９８０）。この細菌に
よる感染はまた、インペチゴ（化膿性粘膜感染）、侵襲性筋膜炎（すなわち、人
喰いバクテリア症）、腫脹および皮膚膿瘍（膿皮症）、猩紅熱、、敗血症、重篤
なトキシックショック様症候群および肺炎を生じ得る。

【００１１】抗生物質治療の適用の前に、リウマチ熱は、小児における死亡および全身性感
染を生存した個体における慢性心臓疾患を生じる主な原因であった。発展途上国
では、リウマチ熱はなお、非常に大きな問題である。インドでは、６百万人を越
える就学年齢の子供がリウマチ性心臓疾患を患っていると見積もられている。Ａ
ｇａｒｗａｌら、ＬａｎｃｅｔＩ９１０〜１１、１９８１。アメリカ合衆国
では、ＣＤＣは、毎年Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ誘導性咽
頭炎の２５００〜４０００万人の症例が生じており、医者への訪問、培養研究お
よび抗生物質治療のために２０億ドル以上の費用がかかっていると見積もった。
生物により引き起こされるトキシックショック様症候群においてもまた上昇が存
在している。現在、連鎖球菌性およびブドウ球菌性トキシックショック様感染の
１０，０００〜１５，０００症例がアメリカ合衆国で毎年生じている。現在、Ｇ
ＡＳ感染は、抗生物質を用いて処置されているが、肺炎球菌（上記に詳述される
）を含む他の細菌について公知であることを考慮した場合、抗生物質耐性株の増
殖が懸念される。

【００１２】ＧＡＳは、ラムノースおよびＮ−アセチルグルコサミンを含む、それらのＡ型
糖質細胞壁部分によって他の連鎖球菌から区別される。ＧＡＳの異なる株は、血
清学的に、それらのＭタンパク質またはＴ抗原に基づいて分類される。ＧＡＳは
、病理学的な株を特徴付けるための原則的な基礎を形成する、８０〜１００の異
なるＭタンパク質群に分類され得る。このＭタンパク質は、表面タンパク質であ
り、そして主要な病原性因子および主要な保護性抗原の両方である。Ｌａｎｃｅ
ｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：３０７、１９６２。Ｍタンパク質に対
する抗体は、オプソニンであり、そして食細胞による細菌の殺傷を促進する。Ｌ
ａｎｃｅｆｉｅｌｄ、前出。

【００１３】Ｍタンパク質は、ワクチンの構成に潜在的に有用であるが、いくつかの障害が
効果的なワクチンまでの道のりに残っている。第１に、このＭタンパク質は、ヒ
ト組織、特に心筋層と交差反応するエピトープを含む。ＤａｌｅおよびＢｅａｃ
ｈｙ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：１１３、１９８５。従って、抗Ｍタンパク
質抗体は、疾患を予防するよりもむしろ疾患を生じ得る。第２に、ＧＡＳの全て
の８０〜１００の異なる株に対するワクチンを産生することは実用的であり得な
い。少数の型のＭタンパク質のみを含む任意のワクチンは、部分的にのみ有効で
あり得る。第１の問題は、免疫源のような交差反応性エピトープを欠損するＭタ
ンパク質フラグメントを使用することによって克服され得るが（Ｄａｌｅら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８〜９４、１９９３）、このようなアプロー
チは未だ、証明されておらず、そして多数の異なるＭタンパク質に対する免疫化
の後者の問題はまだ、克服されることが必要である。従って、当該分野において
、Ｍタンパク質の抗原性に基づかないＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対する免疫原性応
答を生成することを提供する組成物が必要である。

【００１４】（発明の要旨）本発明は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓに特異的な単離された核酸分子を含む
方法および組成物、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓに特異的なベクター構
築物および単離されたポリペプチドを提供する。このような組成物および方法は
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染を診断するため、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ細菌に対する免疫応答を生じるために有用である。

【００１５】従って、本発明の１つの局面において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙ
ｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０をコードする、単離された核酸分子を提供する。いく
つかの実施態様において、単離された核酸分子は、以下からなる群から選択され
る：（ａ）配列番号１のヌクレオチド１５〜１６５２の配列を含む単離された核
酸分子；（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１５〜１６４０の配列を含む単離され
た核酸分子；（ｃ）配列番号５のヌクレオチド１５〜１６４９の配列を含む単離
された核酸分子；（ｄ）配列番号７のヌクレオチド１５〜１６５２の配列を含む
単離された核酸分子；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載される配列番号１、３、５ま
たは７のヌクレオチドの任意の１つにそれぞれ相補的な、単離された核酸分子；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の１つの核酸分子に対して高ストリンジェンシー条
件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。

【００１６】１つの局面における別の局面において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド
１５〜１６５２、配列番号３のヌクレオチド１５〜１６４０、配列番号５のヌク
レオチド１５〜１６４９、もしくは配列番号７のヌクレオチド１５〜１６５２の
任意の１つの核酸分子、またはそれらの相補体に対して高ストリンジェンシー条
件下において特異的にハイブリダイズする、単離された核酸分子を提供する。さ
らなる局面において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１５〜１６５２、配
列番号３のヌクレオチド１５〜１６４０、配列番号５のヌクレオチド１５〜１６
４９、もしくは配列番号７のヌクレオチド１５〜１６５２の任意の１つの少なく
とも２５％の連続するヌクレオチド塩基を含むセグメントまたはそれらの相補体
に同一のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、あるいは配列番号２、４
、６もしくは８の任意の１つを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むＨ
ｓｐ６０、または配列番号２、４、６もしくは８の任意の１つに記載されるポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％相同である改変Ｈｓｐ６０をコードする単離
された核酸分子を提供する。

【００１７】１つの実施態様において、本発明は、上記のような単離された核酸分子であっ
て、すなわち、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６
０またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０に対して
特異的な抗体によって選択的に結合され得るポリペプチドをコードする分子を提
供する。

【００１８】１つの局面におけるさらに別の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ
酸残基１〜５４５、配列番号４のアミノ酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ
酸残基１〜５４４、および配列番号８のアミノ酸残基１〜５４５から選択される
、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドの少なくとも８つのア
ミノ酸をコードする、単離された核酸分子を提供し、ここで、コードされるＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合
体に結合し得る。

【００１９】なおさらなる局面において、本発明は、単離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０ポリペプチドおよび単離されたＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０ポリペプチドを提供する。

【００２０】いくつかの実施態様において、単離されたＨｓｐ６０ポリペプチドは、配列番
号２のアミノ酸残基１〜５４５、配列番号４のアミノ酸残基１〜５４１、配列番
号６のアミノ酸残基１〜５４４、および配列番号８のアミノ酸残基１〜５４５か
ら選択される、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドの任意の
１つのアミノ酸配列、またはそれらの改変体を含み、好ましくは、ここでこのポ
リペプチドは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６
０および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０
のいずれかに対して特異的な抗体によって選択的に結合され得る。さらなる実施
態様において、この単離されたＨｓｐ６０ポリペプチドは、融合タンパク質を作
製するためにさらなるポリペプチドに融合される。

【００２１】なおさらにさらなる局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基１〜
５４５、配列番号４のアミノ酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ酸残基１〜
５４４、および配列番号８のアミノ酸残基１〜５４５から選択される少なくとも
８つのアミノ酸を含む、単離されたＨｓｐ６０ポリペプチドを提供し、ここで、
このＨｓｐ６０ポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体に結合し得、そして
ヒトにおけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する免疫応答を誘発または増強し
得る。

【００２２】特定の実施態様において、単離されたＨｓｐ６０ポリペプチドは、タンパク質
分解性切断または化学合成に由来し、Ｈｓｐ６０またはその一部をコードする核
酸分子を含む形質転換宿主細胞の発現産物である。さらなる特定の実施態様にお
いて、単離されたＨｓｐ６０ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１〜５
４５、配列番号４のアミノ酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ酸残基１〜５
４４、および配列番号８のアミノ酸残基１〜５４５から選択されるＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドの任意の１つに対して９５％より大き
い相同性を含み、そしてここで、Ｈｓｐ６０ポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０のいずれか、または両方に対して特異的
な抗体によって選択的に結合され得る。

【００２３】なおさらに別の局面において、本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、
ここで、このポリペプチドは、本明細書中に記載される１つ以上の核酸分子を含
む形質転換宿主細胞の発現産物である。

【００２４】なおさらにさらなる局面において、本発明は、本明細書中に記載される１つ以
上の核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施態様において、このベクタ
ーは、Ｈｓｐ６０またはその一部をコードする単離された核酸分子に作動可能に
連結されたプロモーターを含む発現ベクターであり、好ましくは、選択マーカー
もしくは同定マーカーをさらに含み、および／またはここで、このプロモーター
は、構成性プロモーターもしくは誘導性プロモーターである。本発明はまた、こ
のようなベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施態様において、この宿
主細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞からなる群から
選択される。

【００２５】なおさらに他の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなＨｓ
ｐ６０ポリペプチドを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液と組み合わせて
含む組成物を提供する。特定の実施態様において、この組成物は、全身投与、経
口投与または非経口投与に適切である。

【００２６】さらに他の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなＨｓｐ６
０ポリペプチドの有効量を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液と組み合
わせて哺乳動物に投与する工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する哺
乳動物における免疫応答を誘発または増強するための方法、本明細書中に記載さ
れるようなＨｓｐ６０ポリペプチドに結合されている標的抗原を、薬学的に受容
可能なキャリアまたは希釈液と組み合わせて哺乳動物に投与する工程を包含する
、標的抗原に対して哺乳動物における免疫応答を誘発または増強するための方法
を提供する。

【００２７】別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるような単離された核酸
分子を含む組成物を提供し、ここで、この単離された核酸分子は、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ以外の生物由来のＨｓｐ６０タンパク質の対応するポリペプチド
との少なくとも１つのアミノ酸の相違を有するポリペプチドをコードする。

【００２８】本発明のこれらの局面または他の局面は、本明細書および添付された図面を参
照すれば明確になる。さらに、種々の参考文献は、特定の手順または組成物（例
えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する本明細書中で示される；すべての
このような参考文献は、これらの全体が本明細書中で参考として援用される。

【００２９】（発明の詳細な説明）本発明は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓに特異的な単離された核酸分子および
ポリペプチドを含む方法および組成物、ならびにベクター構築物、抗体、および
単離された核酸分子およびポリペプチドに関連する他の物質を提供する。このよ
うな組成物および方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染の診断に、および
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対する免疫応答を生じるために有用であ
る。

【００３０】「熱ショック遺伝子」としても公知の「ストレス遺伝子」はまた、ストレッサ
ー（例えば、熱ショックまたはグルコース欠乏またはグルコース添加）への（こ
の遺伝子を含む）生物の接触または曝露に起因して、活性化されるか、そうでな
ければ検出可能に上方制御される遺伝子である。所定の「ストレス遺伝子」はま
た、このような相同遺伝子それ自体がストレッサーによって誘導されなかったと
しても、公知のストレス遺伝子ファミリー内のこのような相同遺伝子（例えば、
Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、およびＨｓｐ９０ストレス遺伝子ファミリー内の特定
の遺伝子）を含む。本明細書中で定義される、「熱ショックタンパク質」（「Ｈ
ｓｐ」）としても公知である「ストレスタンパク質」は、ストレス遺伝子により
コードされ、それゆえ、代表的には、生物がストレッサーに接触または曝露され
た際に有意に多い量で生成される、タンパク質である。本明細書中で使用される
用語、ストレス遺伝子およびストレスタンパク質の各々は、文脈がそうでないこ
とを示さない限りは、他方を含む。ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ、なら
びに他の生物由来のＨｓｐは、重要な細胞プロセス（例えば、タンパク質合成な
らびにタンパク質複合体の組み立ておよび解体）に関与するようである。

【００３１】種々のストレス遺伝子およびストレスタンパク質は、当該分野で周知であり、
そして例えば、Ｈｓｐｌ００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、Ｈ
ｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、ＴＦ５５、Ｈｓｐ４０、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、Ｈ
ｓｐ２０−３０、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ１０、ユビキチン、カルネキシン
、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ、およびタンパク質ジスルフ
ィドイソメラーゼを含む。Ｍａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．Ｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｌａｂ．Ｒｅｓ．２５：５９−７０，１９９５；Ｐａｒｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．
，およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３
７−４９６（１９９３）；米国特許第５，２３２，８３３号（Ｓａｎｄｅｒｓら
）。

【００３２】細菌では、優勢なストレスタンパク質は、約６０および７０ｋＤａの分子サイ
ズを有するタンパク質（すなわち、それぞれ、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ７０）で
ある。Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０は、代表的に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）および染料クーマシー
ブルーを用いる染色パターンに基づいて約１〜３％の細菌細胞タンパク質を表す
が、ストレスが多い条件下では２５％という高いレベルまで蓄積する。従って、
Ｈｓｐは、動物の環境によって侵入細菌に対して与えられるストレスに起因して
、その侵入細菌において生成され、そしてこのＨｓｐは、宿主に対して提示され
、そしてそれに対して宿主が免疫応答を高める、最も重要な細菌抗原のうちのい
くつかとなった。それゆえ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐを動物に投与
することにより、このＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐは、動物内における
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する、好ましくは、このような細菌感染に対
する抵抗性を提供する、免疫応答を誘導し得る。従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓのＨｓｐ６０遺伝子の単離により、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ関連疾障
害の診断および阻害に有用な、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０の単離
されたポリペプチドまたはフラグメントもしくは改変体の生成のための足場が提
供される。

【００３３】本明細書中で用いられる、「ポリペプチド」とは、全長タンパク質およびその
フラグメントをいう。

【００３４】本明細書中で用いられる、「ペプチド」とは、化学的に生成されたかまたは生
物学的に生成されたかにかかわらず、タンパク質全体のフラグメントをいう。

【００３５】本明細書中で用いられる、「免疫原性の」とは、免疫応答を惹起する、抗原ま
たは組成物をいう。

【００３６】「単離された核酸分子」とは、その供給源細胞（それが通常存在する染色体を
含む）から、少なくとも一回は実質的に純粋な形態で分離された、別個のフラグ
メントの形態の、またはより大きな核酸構築物の構成要素としての、ポリヌクレ
オチド分子をいう。核酸分子は、当該分野で周知の広範な種々のヌクレオチドお
よび分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸アナログ、またはこれらの任意の組合せを含む
）から構成され得る。

【００３７】本明細書中で用いられる、「ベクター」とは、目的の核酸配列の発現および／
または複製を指向し得る、ポリヌクレオチドの組み立て物をいう。このような組
み立て物は、所望であれば、他の構成要素（例えば、タンパク質、脂質、または
リポタンパク質コート）の一部として、ベクターの送達のためか、または他の目
的のために含まれ得る。

【００３８】「発現ベクター」とは、目的の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター
配列を少なくとも有するポリヌクレオチドベクターをいう。

【００３９】本明細書中で用いられる、「プロモーター」とは、作動可能に連結された核酸
配列の転写を指向するエレメントを含むヌクレオチド配列をいう。最小では、プ
ロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む。プロモーター領域はまた、
定義からして、転写を増強するエンハンサーエレメントを含み得る。

【００４０】（Ａ．ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓＰ６０遺伝子およびポリペプチ
ド）本明細書中で用いられる、Ｈｓｐ６０とは、約６０ｋＤａの熱ショックタンパ
ク質を生成する、Ｈｓｐ６０ファミリーの遺伝子由来の熱ショック遺伝子をいう
；ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６０遺伝子および遺伝子産物のヌク
レオチドおよびアミノ酸配列を、図１〜４（配列番号１〜８；このような配列は
また、Ｈｓｐ６０遺伝子を単離するために用いられるＰＣＲプライマーを含む）
に示す。本発明の状況では、Ｈｓｐ６０が、野生型／天然タンパク質配列、なら
びにネイティブなタンパク質配列の他の改変体（対立遺伝子を含む）およびフラ
グメントを含むことが理解されるべきである。手短には、このような改変体は、
天然の多型から生じ得るか、または組換え方法論もしくは化学合成によって合成
され得、そして１以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失などによって野生型タンパ
ク質とは異なり得る。さらに、ネイティブな配列に相同な領域では、改変体は、
好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を、そして特定の実施態様
では、９７％または９８％よりも大きな相同性を有するべきである。当業者によ
って認識されるように、Ｈｓｐ６０または改変体をコードするヌクレオチド配列
は、コドンの縮重、ヌクレオチド多型、またはヌクレオチドの置換、欠失、もし
くは挿入に起因して、本明細書中に提示されるネイティブな配列とは異なり得る
。

【００４１】「ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０をコードする単離された核酸分子
」とは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅ
ｓのＨｓｐ６０ポリペプチドをコードし得る核酸配列をいう。このような分子の
いくつかの実施態様を配列番号１〜４に示すが、本発明の状況では、１以上のこ
れらの遺伝子に対する参照は、この遺伝子の改変体、すなわち、天然に存在する
改変体またはこの遺伝子（そして適切な場合には、この遺伝子およびそれらの改
変体によりコードされるこのタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）
に実質的に類似である配列を含むことが理解されるべきである。本明細書中で用
いられる、ヌクレオチド配列とは、以下の場合に「実質的に類似する」と考えら
れる：（ａ）このヌクレオチド配列が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのネイティ
ブな遺伝子のコード領域に由来し、そして実質的に同じ生物学的活性を保持する
（例えば、この配列の部分または上記の配列の対立遺伝子改変体を含む）；また
は（ｂ）このヌクレオチド配列が高いストリンジェンシーの下で本発明のヌクレ
オチド配列にハイブリダイズし得る（すなわち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由
来のヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズし得る）；または（ｃ）このヌ
クレオチド配列が、（ａ）もしくは（ｂ）に規定されるヌクレオチド配列に対し
て、遺伝コードの結果として縮重している（すなわち、異なるコドン配列を用い
て同じアミノ酸をコードする配列）；または（ｄ）これが、（ａ）、（ｂ）、も
しくは（ｃ）に記載される配列のいずれかの相補体である。

【００４２】本発明の１つの局面は、動物を免疫するための組換えタンパク質の生成のため
のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０ヌクレオチド配列の使用である。そ
れゆえ、主要組織適合遺伝子複合体に結合し得、そして免疫原性応答を惹起もし
くは増強し得るポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、本発明によ
り開示される任意の長さ（好ましくは２４ヌクレオチド以上の長さ）の核酸の使
用は、本発明により意図される。免疫原性応答は、公知の方法（例えば、マウス
またはウサギに目的の抗原を抗原投与し、その後、血漿を収集し、そして目的の
抗体が存在するか否かを決定すること）により容易に試験され得る。Ｔ細胞応答
の検出のために特に有用な他のアッセイは、増殖アッセイ、Ｔ細胞細胞傷害性ア
ッセイ、および遅延型過敏症についてのアッセイを含む。目的の抗原に特異的な
抗体がその動物によって生成されたか否かを決定する際には、多くの診断ツール
（例えば、血漿由来抗体に対する標識抗原の結合の試験、または目的の抗原に結
合させたタグを用いる酵素連結免疫アッセイの使用）が利用可能である。

【００４３】本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０遺伝子は、種々の方法を用
いて入手され得る。例えば、核酸分子は、１以上のこれらのＨｓｐ６０に反応性
の単数もしくは複数の抗体を用いてスクリーニングすることにより、ｃＤＮＡま
たはゲノム発現ライブラリーから入手され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７を参照のこと）。さらに、
ランダムプライムＰＣＲ（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄＰＣＲ）が用いられ
得る（例えば、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．２５４：２７５，１９
９５を参照のこと）。さらに、特に、特定の遺伝子または遺伝子ファミリーが所
望される場合には、改変版のランダムプライムＰＣＲもまた、用いられ得る。１
つのこのような方法では、プライマーのうちの一方は、ポリデオキシチミンであ
り、そして他方は、関連するＨｓｐのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基
づく縮重プライマーである。

【００４４】他の方法をまた用いて、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０をコードす
る核酸分子を入手し得る。例えば、核酸分子は、本明細書中に提供される配列情
報を用いて、例えば、放射性標識、酵素標識、タンパク質標識、蛍光標識などを
用いて標識され得るプローブを合成することにより入手され得、そしてファージ
、プラスミド、ファージミド、または他のウイルス性ベクター中に構築されたゲ
ノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイズさせ得る
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこ
と）。ＲＮＡまたはゲノム核酸配列を表すＤＮＡもまた、実施例１に示すような
、ｃＤＮＡ配列の５’側および３’側の配列に相補的なプライマーの対を用いる
増幅により入手され得る。クローニングを容易にするために、制限部位もまた、
プライマーに組み込み得る。

【００４５】本明細書中に提供されるＨｓｐ６０遺伝子の改変体（対立遺伝子を含む）は、
天然の改変体（例えば、多型、変異体）から容易に単離され得るか、合成され得
るか、または構築され得る。変異体を生成するための多くの方法が開発されてい
る（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照
のこと）。手短には、ヌクレオチド置換を生成するための好ましい方法は、変異
される単数または複数の塩基にまたがり、そして変異した単数または複数の塩基
を含む、オリゴヌクレオチドを利用する。このオリゴヌクレオチドは、相補的な
一本鎖核酸にハイブリダイズし、そして第２鎖合成は、このオリゴヌクレオチド
から開始される。二本鎖核酸は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の原核
生物、酵母、または他の真核生物）への形質転換のために調製される。標準的な
スクリーニングおよびベクター増幅プロトコルを用いて、変異体配列を同定し、
そして高収量を得る。

【００４６】同様に、Ｈｓｐ６０遺伝子の欠失および／または挿入は、種々の公知の方法の
いずれかにより構築され得る。例えば、この遺伝子は、制限酵素を用いて消化さ
れ得、そして配列が欠失されるかまたは挿入もしくは大きな置換がされるように
さらなる配列と再連結されるように再連結され得る。当該分野で公知の、改変体
配列を生成する他の手段（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕ
ｂｅｌら（前出）を参照のこと）が用いられ得る。さらに、改変体配列の確認は
、代表的に、制限酵素マッピング、配列分析、またはハイブリダイゼーションに
より達成される。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに特異的な免疫原性応答を惹起す
るポリペプチドをコードする改変体は、本発明の状況において有用である。

【００４７】上記で留意したように、本発明はまた、単離されたポリペプチドを提供する。
本発明の状況の中では、状況からそうでないことが明確でない限り、このような
ポリペプチドは、上記で議論したような１以上のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの
Ｈｓｐ６０遺伝子由来の遺伝子産物またはそれらの誘導体の、全体、または部分
／フラグメントを含むことが理解される。本発明の１局面では、このタンパク質
は、ネイティブな遺伝子の一部によってコードされるか、またはネイティブな遺
伝子の誘導体によってコードされ、そしてこのタンパク質またはそのフラグメン
トは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対して特異的な免疫応答を惹起または増強
する。

【００４８】本発明の「精製された」Ｈｓｐ６０ストレスタンパク質は、そのタンパク質を
生成する細胞から精製されている、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６
０ファミリーの熱ショックタンパク質である。例えば、本発明のＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドは、界面活性剤精製工程を含むかまたは
含まない種々の標準的な方法により精製され得る。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓのＨｓｐ６０は、他の方法の中でも、適切な宿主およびベクター系を用
いて培養し、組換えＨｓｐ６０（本明細書中にさらに考察される）を生成するこ
とにより単離され得る。次いで、このような細胞株由来の上清もしくはＨｓｐ６
０封入体が、またはＨｓｐ６０が上清中に排出されない場合は細胞全体が、種々
の精製手順により処理され得る。例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ
６０含有組成物を、適切な精製マトリックス（例えば、適切な支持体に結合した
抗Ｈｓｐ６０抗体）に適用し得る。あるいは、陰イオン交換樹脂もしくは陽イオ
ン交換樹脂、ゲル濾過、または親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラ
フィー、もしくは逆相クロマトグラフィーが、このタンパク質を精製するために
用いられ得る。Ｈｓｐ６０ポリペプチドはまた、市販のタンパク質濃縮フィルタ
ー（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾
過ユニット）を用いて、または減圧透析により、濃縮され得る。別の代替法では
、上清は、上記のタンパク質濃縮フィルターのうちの１つを用いて最初に濃縮さ
れ得、続いて濃縮物が、上記のような適切な精製マトリックスに適用され得る。

【００４９】１つの実施態様では、本発明の単離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓ
ｐ６０は、当該分野で周知の遺伝子操作技術を利用して組換え形態で生成される
。例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０は、ニッケルキレート化マ
トリックスでの精製を可能にするヒスチジンタグ化分子として発現され得る。あ
るいは、他のタグ（ＦＬＡＧおよびＧＳＴを含む）が用いられ得る。次いで、会
合したタグが、精製の最終工程において除去され得る。例えば、特定のベクター
については、Ｈｉｓタグ化タンパク質がトロンビンとともにインキュベートされ
得、タグとＨｓｐ６０ポリペプチドとの間の認識配列の切断を生じる（例えば、
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＥＴベクター）。グラム陰性細菌宿主からのＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０の精製後、タグ化されているかタグ化され
ていないかにかかわらず、上記のように、Ｈｓｐ６０調製物におけるエンドトキ
シンのレベルを低減させることが必要である。

【００５０】（Ｂ．ベクター、宿主細胞、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨＳＰ６０
の発現）特定のベクター（例えば、ｐＵＣ）が、多コピーの目的のヌクレオチド分子を
生成するために使用され得、ならびに遺伝子操作技術（例えば、部位特異的変異
誘発）のために有用であることが当該分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前
出）を参照のこと。本開示に対して特に興味深いのは、発現ベクターである。発
現ベクターは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０の核酸分子に作動可能
に連結された、転写プロモーターエレメント／転写エンハンサーエレメントを含
む。発現ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」
）のいずれか，またはこの２つの組合せ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）から
構成され得る。必要に応じて、発現ベクターは、ポリアデニル化配列または１以
上の制限部位を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および用いる発現ベクタ
ーに依存して、他の遺伝的エレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸制限部
位、エンハンサー、転写誘導性を付与する配列、および選択マーカーまたは同定
マーカーとして用いるのに適切なタンパク質をコードする遺伝子）もまた、本明
細書中に記載される発現ベクターに取り込まれ得る。

【００５１】ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０遺伝子の操作および発現は、Ｈｓｐ
６０遺伝子を発現し得る発現ベクターを含有する宿主細胞を培養することにより
達成され得る。このようなベクターまたはベクター構築物は、適切な転写調節エ
レメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドをコードする、合成またはｃＤＮＡ由来の
いずれかの核酸分子またはゲノムＤＮＡフラグメントを含む。発現ベクター内の
適切な調節エレメントは、種々の供給源（細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆
虫、または植物の遺伝子を含む）に由来し得る。適切な調節エレメントの選択は
、選択される宿主細胞に依存し、そして本明細書を考慮して当業者によって容易
に達成され得る。調節エレメントの例は、転写プロモーターおよびエンハンサー
、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、およびリボソーム
結合配列（翻訳開始シグナルを含む）を含む。

【００５２】上記のいずれかのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドをコ
ードする核酸分子は、広範な種々の原核生物性および真核生物性宿主細胞（細菌
、哺乳動物、酵母、または他の真菌、ウイルス、昆虫、および植物の細胞を含む
）によって発現され得る。宿主細胞の選択はまた、使用者の所望に応じてグリコ
シル化されているか（ｇｌｙｃｏｓｏｌａｔｅｄ）またはグリコシル化されてい
ない（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｏｌａｔｅｄ）Ｈｓｐ６０の生成を支持し得る。こ
のような細胞を形質転換またはトランスフェクトして核酸を発現させるための方
法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら，米国特許第４，７０
４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら，ＰＮＡＳＵＳＡ７５：１９２９−１９３３
，１９７８；Ｍｕｒｒａｙら，米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌ
ｌら，米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら，米国特許第４，７８４
，９５０号；Ａｘｅｌら，米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら
，米国特許第４，７６６，０７５号；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版
，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ
，１９８９を参照のこと；植物細胞については、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ
，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−１０７１，１９９４；Ｐａ
ｓｚｋｏｗｓｋｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２，１９９２を参照
のこと）。

【００５３】本発明を実施するために適切な細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えばＥ．
ｃｏｌｉＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ））、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏ
ｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々の種、な
らびに当業者に周知の他の多くの細菌種を含む。

【００５４】細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中で機能するプロモーター、１以
上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的なプロモ
ーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター
系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８を参照のこと）、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎら，
Ｇｅｎｅ８７：１２３−１２６，１９９０）、ｔｒｐプロモーター（Ｎｉｃｈ
ｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１０
１：１５５，１９８３）ならびにｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら，Ｇｅ
ｎｅ２０：２３１，１９８２）を含む。代表的な選択マーカーは、種々の抗生
物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺
伝子）を含む。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドは、当該
分野で周知であり、とりわけ、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ２
：９５，１９７７を参照のこと）、ｐＵＣプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９
、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９）（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ１０１：２０−７７，１９８３；ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉ
ｎｇ，Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６８，１９８２を参照のこと）、ならびにｐ
ＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を含む。

【００５５】本発明を実施するために適切な真菌宿主細胞は、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ属の種々の種（ＭｃＫｎｉｇｈｔら，米国特許第４，９３５，３４９号
）を含む。酵母および真菌に適切な発現ベクターは、とりわけ、酵母に関してＹ
Ｃｐ５０（ＡＴＣＣ第３７４１９号）、およびａｍｄＳクローニングベクターｐ
Ｖ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：１６９，１９８
９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ７６：１０３５−１０３９，１９７８）、ＹＥｐｌ３（Ｂｒｏａｃｈら，
Ｇｅｎｅ８：１２１−１３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２
１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ２７５：１０４−１０８，１９７８）、なら
びにそれらの誘導体を含む。

【００５６】酵母における使用のために好ましいプロモーターは、酵母解糖遺伝子（Ｈｉｔ
ｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０，
１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１：４１９−４３４，１９８２）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝
子（Ｙｏｕｎｇら，ｉｎＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＭ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｌｌａｅｎｄ
ｅｒら（編），３５５頁，Ｐｌｅｎｕｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２；Ａｍ
ｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１，１９８３）
由来のプロモーターを含む。真菌ベクターに関して有用なプロモーターの例は、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ解糖遺伝子由来のプロモーター（例
えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら，ＥＭＢＯＪ．４：２０９
３−２０９９，１９８５））を含む。発現単位はまた、転写ターミネーターを含
み得る。適切なターミネーターの一例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉ
ｇｈｔら，同書，１９８５）である。

【００５７】細菌ベクターを用いる場合と同様に、酵母ベクターは、一般的に選択マーカー
を含み、これは、そのために表現型アッセイが存在して形質転換体が選択される
ことを可能にする、優勢な表現型を示す任意の数の遺伝子の一つであり得る。好
ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補足するか、抗生物質耐性を提
供するか、または細胞に特定の炭素源を利用することを可能にするマーカーを含
み、そしてｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈら、同書）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら
、Ｇｅｎｅ８：１７、１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）
を含む。別の適切な選択マーカーはｃａｔ遺伝子であり、これは酵母細胞にクロ
ラムフェニコール耐性を与える。

【００５８】真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、
Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ７５：１９２９〜１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１７４０〜１７４７、１９８４
）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ３０１：１６７〜１６９、１９８３
）によって記載された。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する選択
マーカーによって相補される遺伝子欠損を含み得る。特定の宿主および選択マー
カーの選択は、本明細書を考慮して、当業者のレベル内で十分である。

【００５９】酵母の形質転換についてのプロトコルもまた、当業者に周知である。例えば、
形質転換は、ＤＮＡを有する酵母のスフェロプラストの調製（Ｈｉｎｎｅｎら、
ＰＮＡＳＵＳＡ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）またはＬｉＣｌの
ようなアルカリの塩を用いる処理（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１５３：１６３、１９８３）のいずれかによって容易に達成され得る。真菌の
形質転換もまた、Ｃｕｌｌｅｎらによって記載されたようにポリエチレングリコ
ールを使用して行われ得る（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：３６９、１９
８７）。

【００６０】ウイルスベクターは、上記のようなＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０
をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むものを含
む。広範な種々のプロモーターが、本発明の状況内で利用され得、これらは例え
ば、ＭｏＭＬＶＬＴＲ、ＲＳＶＬＴＲ、ＦｒｉｅｎｄＭｕＬＶＬＴＲ、
アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：７８１〜
７８４、１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター／エ
ンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅＴｈｅｒａｐ．５：４５７〜４６３、１９９４）、ＨｅｒｐｅｓＴＫ
プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハン
サー／プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーターおよびサイトメ
ガロウイルス最後期プロモーターのようなプロモーターを含む。このプロモータ
ーはまた、組織特異的プロモーターであり得る（例えば、ＷＯ９１／０２８０５
；ＥＰ０，４１５，７３１；およびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと）。上記
に述べたプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レ
トロウイルスプロモーター（上記に述べたプロモーターならびにＨＩＶプロモー
ターのような他のプロモーターを含む）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）お
よび細菌、真菌、もしくは寄生生物特異的な（例えば、マラリア特異的）プロモ
ーターは、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染する特異的な細胞また
は組織を標的化するために利用され得る。

【００６１】従って、本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドは、
種々のウイルスベクターから発現され得、これらのベクターには、例えば、ヘル
ペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）、アデノウ
イルスベクター（例えば、ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９３／９１９１；Ｋｏｌ
ｌｓら、ＰＮＡＳ９１（１）：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓ
ｌｅｒら、ＰＮＡＳ９０（２４）：１１４９８〜５０２、１９９３；Ｇｕｚｍ
ａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８（６）：２８３８〜４８、１９９３；Ｇ
ｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２〜１２０７、１９９３；
Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ７５（２）：２０７〜２１６、１９９３；Ｌｉら、
ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．４（４）：４０３〜４０９、１９９３；Ｃａｉｌ
ｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７〜１２９１
、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０〜１３
４、１９９３；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２〜３７８
、１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１（２）：１９５〜２０
２、１９９１）、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄｖｉｒａｌ）ベクター（Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ９０（２２）：１
０６１３〜１０６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイル
スベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．５：４５７
〜４６３、１９９４）、ポックスウイルスベクター（ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰ
ａｏｌｅｔｔｉ、ＰＮＡＳ７９：４９２７〜４９３１、１９８２；ならびにＯ
ｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２
）：６５３〜６６０、１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、ＥＰ０，
４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９１／０２８５；ＷＯ９４／０３
６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９
，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８）が含まれる。種々
の実施態様では、ウイルスベクターそれ自体、またはウイルスベクターを含むウ
イルス粒子のいずれかが、以下に記載される方法および組成物において利用され
得る。

【００６２】本発明を実施するために適切な哺乳動物細胞は、とりわけ、ＰＣ１２（ＡＴＣ
Ｃ番号ＣＲＬ１７２１）、Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）
Ｃ神経芽細胞腫、ＳＨＳＹ５アドレナリン作動性神経芽細胞腫、ＮＳ２０Ｙおよ
びＮＧ１０８−１５マウスコリン作動性細胞株、またはラットＦ２後根神経節細
胞株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ
（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１；ＢＨＫ５７０細胞株（受託番号ＣＲＬ
１０３１４の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された）、Ｃ
ＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）
、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
３６：５９〜７２、１９７７）、およびＮＳ−１細胞を含む。他の哺乳動物細胞
株は、本発明中で使用され得、これらは、ＲａｔＨｅｐＩ（ＡＴＣＣ番号ＣＲ
Ｌ１６００）、ＲａｔＨｅｐＩＩ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ
（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７５．１）、ヒト
肝ガン（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−５２）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ８０６
５）、マウス肝臓（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２９．１）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣ
Ｃ番号ＣＣＬ９．１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号１５８１）、ＨＩ
Ｔ−Ｔ１５（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７７７）、およびＲＩＮｍ５ＡＨＴ２Ｂ（
ＯｒｓｋｏｖおよびＮｉｅｌｓｏｎ、ＦＥＢＳ２２９（１）：１７５〜１７８
、１９８８）を含む。

【００６３】本発明を実施する上での使用についての哺乳動物発現べクターは、クローニン
グされた遺伝子またはｃＤＮＡの転写を方向付けることが可能なプロモーターを
含む。好ましいプロモーターは、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーター
を含む。ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（
Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ４１：５２１〜５３０、１９８５）、サイトメガ
ロウイルス最後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４、１９８１）、ＭＭＴＶ
ＬＴＲ、ＲＳＶＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａを含
む。細胞プロモーターは、マウスメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍ
ｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）、アクションプロモーター（ａ
ｃｔｉｏｎｐｒｏｍｏｔｅｒ）、マウスＶ_Hプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：７０４１〜７０４５
、１９８３；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：５４９６、
１９８７）およびマウスＶ_Hプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ３３：８５〜９３、１９８３）を含む。プロモーターの選択は、少なくとも部分的には、所望
される発現のレベルまたはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に依存す
る。

【００６４】このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流かつ目的のペプチドま
たはタンパク質をコードするＤＮＡ配列から上流に位置するＲＮＡスプライシン
グ部位のセットを含み得る。好ましいＲＮＡスプライシング部位は、アデノウイ
ルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列の
下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた、この発現ベクター中に含まれる
。適切なポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニ
ル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、前出）、アデノウイルス５
Ｅ１Ｂ領域、およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、
Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：３７１９〜３７３０、１９８１）由来のポリ
アデニル化シグナルを含む。発現ベクターは、非コードウイルスリーダー配列（
例えば、プロモーターとＲＮＡスプライシング部位との間に位置するアデノウイ
ルス２３成分リーダー）を含み得る。好ましいベクターはまた、エンハンサー
配列（例えば、ＳＶ４０エンハンサー）を含み得る。発現ベクターはまた、アデ
ノウイルスＶＡＲＮＡをコードする配列を含み得る。適切な発現ベクターは、
市販の供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ
．）から得られ得る。

【００６５】クローニングされたＤＮＡ配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カル
シウム媒介トランスフェクションによって（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ１４：
７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、ＳｏｍａｔｉｃＣ
ｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ
ｄｅｒＥｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６、１９７３）、エレクトロポ
レーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ．１：８４１〜８４５、１９８２
）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，
１９８７）によって、培養された哺乳動物細胞に導入され得る。一般的には、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。クローニングされたＤＮＡを安定に組
み込んだ細胞を同定するために、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに、選択マ
ーカーが一般的に細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞における使用のた
めの好ましい選択マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトト
レキセートのような薬物に対する耐性を与える遺伝子を含む。この選択マーカー
は、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、
ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Ｔｈｉ
ｌｌｙ（ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒ
ｗｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）によって概説さ
れる。

【００６６】適切なベクターを含む哺乳動物細胞は、ある時間の期間、代表的には１〜２日
間増殖することが可能であり、目的のＤＮＡ配列の発現を開始することが可能で
ある。次いで、薬物選択が、安定な様式で選択マーカーを発現する細胞の増殖に
ついて選択するために適用される。増殖可能な、選択マーカーを用いてトランス
フェクトされた細胞について、薬物濃度が段階的な様式で増加され得、クローニ
ングされた配列のコピー数の増加について選択され、それによって発現レベルを
増加させる。導入された配列を発現する細胞は、所望の形態または所望のレベル
の目的のタンパク質の産生について選択かつスクリーニングされる。次いで、こ
れらの判断基準を満たす細胞は、クローニングされ、そして産生のためにスケー
ルアップされ得る。

【００６７】当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞もまた、本明細書を考慮して、本発明中
で有用であり得る。例えば、昆虫細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現するためのベク
ターとしてのバキュロウイルスの使用は、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ．
Ｓｃｉ．２８：２１５〜２２４、１９９０）によって概説されている。

【００６８】当該分野で公知の多数の植物宿主細胞もまた、本明細書を考慮して、本発明中
で有用であり得る。例えば、植物細胞中で遺伝子を発現するためのベクターとし
てのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用は、Ｓｉｎｋａ
ｒら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７〜５８、１９８７
によって概説されている。

【００６９】宿主細胞におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドまた
はそのフラグメントの発現に際して、そのポリペプチドまたはペプチドは、本明
細書中で以前に議論したような方法を利用して、予備的に宿主細胞から放出およ
び／または単離され得る。

【００７０】上記に記述したように、Ｈｓｐ６０を発現させることが所望される宿主細胞に
依存して、そのタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞中で活性であるプロ
モーターを含む発現ベクターに導入される。発現ユニットの他の成分（例えば、
コード領域の末端の、転写はされるが翻訳はされない配列）もまた、特定の利用
される宿主に従って選択され得る。場合によっては、高レベルの発現を確かにす
るために、介在配列を人工的に導入することが必要であり得る。発現レベルが十
分に高い場合には、発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色によってモニターされ得
る。さらに、そのタンパク質がタグを伴って産生された場合、抗タグ抗体による
検出が行われ得、そしてタグを伴わずに産生された場合、宿主の相同なタンパク
質を認識しない抗Ｈｓｐ−６０抗体による検出が利用され得る。さらに、タンパ
ク質の同定のための当該分野で公知の任意の方法が、この目的のために利用され
得る（例えば、高分解能電気泳動法、または二次元電気泳動）。

【００７１】（Ｃ．本発明のＨｓｐ６０ポリペプチドに対する抗体の調製）別の局面において、本発明のタンパク質は、特異的に結合する抗体（すなわち
、結合パートナー）を調製するために利用され得る。従って、本発明はまた、こ
のような抗体を提供する。本発明の状況において、用語「抗体」は、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、それらのフラグメント
（例えば、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦａｂフラグメント）、および組換え的もしくは合成的に産生された結合パートナーを含む。このような結合パートナーは、モ
ノクローナル抗体の特異的な結合を可能にする可変領域を取り込む。このことは
、抗体が本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０遺伝子の１つから産
生されるペプチドに選択的に結合することが可能であることを意味する。モノク
ローナル抗体または結合パートナーのアフィニティーは、当業者によって容易に
決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１
：６６０〜６７２、１９４９を参照のこと）。

【００７２】ポリクローナル抗体は、当業者によって、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、七面鳥、ウサギ、マウス、またはラット）
から容易に産生され得る。手短に言えば、所望のタンパク質またはペプチドは、
腹腔内、筋肉内、眼内または皮下注射を通して動物を免疫するために利用される
。目的のタンパク質またはペプチドの免疫原性は、アジュバント（例えば、フロ
イント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）の使用を通して
増加され得る。何度かの追加免疫の後、少量の血清のサンプルが収集され、そし
て所望のタンパク質またはペプチドに対する反応性について試験される。

【００７３】特に好ましいポリクローナル抗血清は、バックグラウンドよりも少なくとも３
倍高いシグナルを与える。一旦、動物の力価が、タンパク質に対するその反応性
の点でプラトーに達したならば、毎週の採血によるか、または動物を全採血する
ことによってのいずれかで、より大量のポリクローナル抗血清が容易に得られ得
る。

【００７４】モノクローナル抗体はまた、周知の技術（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同
第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，
９９３号を参照のこと；ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＡｎａｌｙｓｅｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅ
ａｒｎ、およびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編
）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ、１９８８もまた参照のこと）を用いて容易に生成され得る。手短に言えば、
１つの実施態様において、対象の動物（例えばラットまたはマウス）に、所望の
タンパク質またはペプチドを注射する。所望の場合、種々の技術が、そのタンパ
ク質によって生成される、結果として起こる免疫応答を増大させるために、より
大きい抗体の反応性を発生させるために利用され得る。例えば、所望のタンパク
質またはペプチドは、別のタンパク質（例えば、オボアルブミンまたはキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））と結合され得るか、またはアジュバント
（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）
の使用を通じる。最初の免疫応答の誘発は、好ましくは腹腔内、筋肉内、眼内、
または皮下経路を通してであり得る。

【００７５】最初の免疫化の１〜３週間後の間に、その動物は再免疫化される。次いで、そ
の動物は試験のために屠殺され得、そしてその血清は、上記に記載されたような
アッセイを使用して所望の抗原に対する結合について試験され得る。さらなる免
疫化はまた、所望のタンパク質またはペプチドに対するその反応性において、そ
の動物がプラトーに達するまで達成され得る。次いで、その動物は所望のタンパ
ク質またはペプチドの最終の追加免疫を与えられ得、そして３〜４日後に屠殺さ
れ得る。この時点において、脾臓およびリンパ節が収集され得、そして、組織を
網状のふるいに通すことによって、または細胞を包み込む脾臓もしくはリンパ節
の膜を破裂させることによって、単一の細胞懸濁液に破壊され得る。１つの実施
態様において、低張性の溶液の添加によって赤血球が引き続いて溶解され、その
後すぐに等張性に戻される。

【００７６】別の実施態様において、モノクローナル抗体の調製のために適切な細胞は、イ
ンビトロ免疫化技術の使用を通して得られ得る。手短に言えば、動物は屠殺され
、そして脾臓およびリンパ節細胞が上記に記載されたように取り除かれる。単一
な細胞懸濁液が調製され、そしてその細胞は、上記に記載されたような免疫応答
を生成するために適切な目的のタンパク質またはペプチドの形態を含む培養に入
れられる。続いて、そのリンパ球は収集され、そして以下に記載されるように融
合される。

【００７７】上記に記載されるようなインビトロ免疫化の使用を通して得られた細胞、また
は免疫化された動物由来の細胞は、ウイルス（例えば、エプスタイン−バーウイ
ルス（ＥＢＶ））を用いるトランスフェクションによって不死化され得る。（Ｇ
ｌａｓｋｙおよびＲｅａｄｉｎｇ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ８（４）：３７７〜３
８９、１９８９を参照のこと）。あるいは、好ましい実施態様において、収集さ
れた脾臓および／またはリンパ節細胞懸濁液は、モノクローナル抗体を分泌する
「ハイブリドーマ」を作り出すための適切なミエローマ細胞と融合される。適切
なミエローマ株は、好ましくは、抗体の構築または発現を欠損しており、そして
さらに、免疫化された動物由来の細胞と同系である。多くのこのようなミエロー
マ細胞株は、当該分野で周知であり、そしてアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄのような供給源か
ら入手し得る（細胞株およびハイブリドーマのカタログ、第６版、ＡＴＣＣ、１
９８８を参照のこと）。代表的なミエローマ株には、ヒトについては、ＵＣ７
２９−６（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８０６１）、ＭＣ／ＣＡＲ−Ｚ２（ＡＴＣＣ番
号ＣＲＬ８１４７）、およびＳＫＯ−００７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８０３３
）；マウスについては、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８１
）、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ９）；そしてラットについ
ては、Ｙ３−Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６３１）、およびＹＢ２
／０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６６２）を含む。特に好ましい融合株は、ＮＳ−
１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ１８）およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
番号ＣＲＬ１５８０）を含み、これらはマウス、ラット、またはヒトの細胞株
のいずれかとの融合に利用され得る。ミエローマ細胞株と免疫化された動物細胞
株由来の細胞との間の融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用（Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗお
よびＬａｎｅ、前出を参照のこと）またはエレクトロフュージョン（Ｚｉｍｍｅ
ｒｍａｎおよびＶｉｅｎｋｅｎ、Ｊ．ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ．６７：１６
５〜１８２、１９８２を参照のこと）の使用を含む、種々の方法によって達成さ
れ得る。

【００７８】融合後、その細胞は、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０またはＤＭＥ
Ｍ（ダルベッコ改変イーグル培地、ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅ
ｘａ、Ｋａｎ））を含む培養プレート中に置かれる。その培地はまた、さらなる
成分（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、
Ｕｔａｈ、またはＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、免疫化のために使用さ
れたのと同一の種の生まれたての動物から収集した胸腺細胞、または培地を固め
るための寒天を含み得る。さらに、その培地は、融合された脾臓細胞およびミエ
ローマ細胞の増殖を選択的に可能にする試薬を含むべきである。特に好ましいも
のは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）（Ｓｉ
ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）の使用である
。約７日後、生じる融合細胞すなわちハイブリドーマを、所望の抗原を認識する
抗体の存在を決定するためにスクリーニングし得る。いくつかのクローンの希釈
および再アッセイに続いて、目的のタンパク質に結合する抗体を産生するハイブ
リドーマが単離され得る。

【００７９】他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る。（Ｈｕ
ｓｅら、「λファージにおける免疫グロブリンレパートリーの大きなコンビナト
リアルライブラリーの生成」Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１、１
９８９を参照のこと；Ｓａｓｔｒｙら、「モノクローナル触媒抗体の生成のため
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおける免疫学的レパートリーのクローニ
ング：重鎖可変領特異的ｃＤＮＡライブラリーの構築」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５７２８〜５７３２、１９８９もまた参照のこ
と；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイ
ブリドーマに対する迅速な代替手段」ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ３：１〜９、１９９０もまた参照のこと；これらの
参考文献は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
から入手可能な市販の系を記載しており、この系は組換え技術を通して抗体の産
生を可能にする）。手短に言えば、ｍＲＮＡを、Ｂ細胞集団から単離し、そして
λＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（Ｈ）ベクターおよびλＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（Ｌ）ベクタ
ー中に重鎖および軽鎖の免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製するた
めに利用する。これらのベクターは、個々にスクリーニングされ得るか、または
同時発現されてＦａｂフラグメントまたは抗体を形成し得る（Ｈｕｓｅら、（前
出）を参照のこと；Ｓａｓｔｒｙら、（前出）もまた参照のこと）。陽性プラー
クは、続いて非溶解性プラスミドに転換され得、これはＥ．ｃｏｌｉからのモノ
クローナル抗体フラグメントの高レベルの発現を可能にする。

【００８０】同様に、結合パートナーはまた、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の
可変領域を組込むために組換えＤＮＡ技術を利用して構築され得る。これらの結合パートナーの構築は、本明細書中に提供される開示を与えられた当業者によ
って、容易に達成され得る（Ｌａｒｒｉｃｋら、「混合プライマーを用いるポリ
メラーゼ連鎖反応：単一のハイブリドーマ細胞からのヒトモノクローナル抗体可
変領域遺伝子のクローニング」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：９３４〜９３
８、１９８９；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、「治療のためのヒト抗体の再形成」、Ｎ
ａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２７、１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、「タンパ
ク質工学による抗原に対するアフィニティーおよび特異性を高めた抗体の産生」
、Ｎａｔｕｒｅ３２８：７３１〜７３４、１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、
「ヒト抗体の再形成：抗リゾチーム活性の移植」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１
５３４〜１５３６、１９９８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓエキソトキシンに融合された２つの抗体の可変ドメインからなる組換えイムノ
トキシン」、Ｎａｔｕｒｅ３３９、３９４〜３９７、１９８９を参照のこと；
「生合成抗体結合部位」という標題の米国特許第５，１３２，４０５号もまた参
照のこと）。手短に言えば、１つの実施態様において、目的の特異的抗原結合ド
メインの所望のタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、特
異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから増幅され、そ
してヒト抗体を産生する細胞のゲノムに直接的に挿入される。（Ｖｅｒｈｏｅｙ
ｅｎら、（前出）を参照のこと；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、（前出）もまた参照の
こと）。この技術は、特異的に結合するマウスまたはラットのモノクローナル抗
体の抗原結合部位を、ヒト抗体に移すことを可能にする。このような抗体は、ヒ
トにおける治療使用のために好ましい。なぜなら、それらはラットまたはマウス
抗体と同様に抗原性ではないからである。

【００８１】代替的な実施態様において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ由来の可変領域をコードする遺伝子は、その可変領域に対するオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によっ
て合成され得るか、または市販の供給源から購入され得る。例えば、とりわけ、
Ｖ_Ha領域、Ｖ_Hb領域、Ｖ_Hc領域、Ｖ_Hd領域、Ｃ_H1領域、Ｖ_L領域、およびＣ_L領域
に対するプライマーを含む、マウスおよびヒトの可変領域に対するプライマーは
、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能であ
る。これらのプライマーは、重鎖または軽鎖の可変領域を増幅するために使用さ
れ得、次いでこれらは、ＩＭＭＵＮＯＺＡＰ^TM（Ｈ）ベクターまたはＩＭＭＵＮ
ＯＺＡＰ^TM（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなベクターにそれぞ
れ挿入され得る。次いで、これらのベクターは、発現のためにＥ．ｃｏｌｉに導
入され得る。これらの技術を利用して、Ｖ_HドメインおよびＶ_Lドメインの融合を
含む大量の一本鎖ポリペプチドが産生され得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４２：４２３〜４２６、１９８８を参照のこと）。

【００８２】モノクローナル抗体および他の結合パートナーは、多くの宿主系において産生
され得、これらは、組織培養物、細菌、真核細胞、植物、および当該分野で公知
の他の宿主系を含む。

【００８３】一旦適切な抗体または結合パートナーが得られれば、それらは当業者に周知で
ある多くの技術によって単離または精製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）を
参照のこと）。適切な技術には、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラ
ム、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラ
ム上での精製、またはこれらの技術の任意の組み合わせが含まれる。本発明の状
況において、用語「単離された」とは、抗体または結合パートナーを規定するた
めに使用する場合、「実質的に他の血液成分を含まない」ことを意味する。

【００８４】本発明の結合パートナーは、多くの使用を有する。例えば、抗体は、このよう
なタンパク質を有する細胞を同定するためのフローサイトメトリーにおいて利用
され得る。手短に言えば、細胞上の目的のタンパク質またはペプチドを検出する
ために、その細胞は、目的のタンパク質に特異的に結合する、標識されたモノク
ローナル抗体とともにインキュベートされ、続いて、結合抗体の存在の検出を行
う。本発明における使用に適切な標識は、当該分野において周知であり、とりわ
け、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ
）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および金コロイドを含む。フロー
サイトメトリーにおける使用のために特に好ましいものはＦＩＴＣであり、これ
は、「フルオロセインイソチオシアネートの抗体への結合。Ｉ．結合条件の実験
」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１８：８６５〜８７３、１９７０におけるＫｅｌｔｋ
ａｍｐの方法に従って精製抗体に結合され得る。（Ｋｅｌｔｋａｍｐ、「フルオ
ロセインイソチオシアネートの抗体への結合。ＩＩ．再現方法」Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ１８：８７５〜８８１、１９７０；Ｇｏｄｉｎｇ、「抗体の蛍光色素と
の結合：標準的方法の改変」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３：２１
５〜２２６、１９７０もまた参照のこと。）この抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓに対する標的薬剤、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染を決定す
るための診断薬としてもまた使用され得る。

【００８５】（Ｄ．本発明のＨｓｐ６０ポリペプチドまたはそれらに対する抗体を利用する
アッセイ）種々のアッセイを、本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅおよびＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６０ポリ
ペプチド、またはそのようなＨｓｐ６０ポリペプチドに特異的に結合する抗体を
検出するために利用し得る。例示的なアッセイが、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１
９８８に詳細に記載される。そのようなアッセイの代表的な例は、以下を含む：
向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降、酵素
結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、阻害または
競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ、免疫スティック（ディップスティ
ック）アッセイ、同時免疫アッセイ、イムノクロマトグラフィーアッセイ、免疫
濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイオセン
サーアッセイおよび低光検出アッセイ（ｌｏｗ−ｌｉｇｈｔｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎａｓｓａｙ）（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５
３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｔｙＭａ
ｎｕａｌ（前出）もまた参照のこと）。

【００８６】蛍光抗体試験（ＦＡ−試験）は、本発明のタンパク質の一つに結合し得る蛍光
標識された抗体を用いる。検出のための視覚的決定は、蛍光顕微鏡を用いる技術
者によってなされ、定性的な結果を生じる。一つの実施態様において、このアッ
セイを組織サンプルまたは組織学的切片の検査に用いる。

【００８７】ラテックスビーズ凝集アッセイにおいて、本発明の一つ以上のタンパク質に対
する抗体を、ラテックスビーズに結合させる。次いで、ラテックスビーズに結合
した抗体を、もしあれば、サンプル中の所望のタンパク質への抗体の結合を許容
する条件下でサンプルと接触させる。次いで、この結果を視覚的に読みとり、定
性的な結果を得る。一つの実施態様において、この形式は、現場試験の分野で用
いられ得る。

【００８８】酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）は、本発明により提供された抗体を利用し得る多
くの異なるアッセイを含む。例えば、不均一な間接ＥＩＡは、本発明の抗体およ
びアフィニティー精製した抗ＩｇＧ免疫グロブリン調製物と結合させた固相を用
いる。好ましくは、固相は、ポリスチレンマイクロタイタープレートである。次
いで、この抗体および免疫グロブリン調製物を、当該分野で周知の条件である、
抗体が結合し得る条件下でサンプルに接触させる。そのようなアッセイの結果は
、視覚的に読み取り得るが、好ましくは、定量的な結果を産生するＥＬＩＳＡプ
レートリーダーのような分光光度計を用いて読み取る。代替的な固相ＥＩＡ形式
は、磁石を使うアッセイの手順の間、移動可能なプラスチックコートされた鉄金
属ビーズを含む。さらに別の代替は、低光検出免疫アッセイ形式である。この高
感度形式において、適切に標識された結合抗体によって産生される光放射が、自
動的に定量される。好ましくは、その反応は、マイクロタイタープレートを用い
て行われる。

【００８９】代替的な実施態様において、放射活性追跡は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）を行うためにＥＩＡにおける酵素媒介検出と置換される。

【００９０】捕捉抗体サンドイッチ酵素アッセイにおいて、所望されるタンパク質を、固相
（好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレート）に結合した抗体と標識
された抗体との間に結合させる。好ましくは、この結果を、ＥＬＩＳＡプレート
リーダーのような分光光度計を用いて測定する。

【００９１】連続的なアッセイ形式において、試薬を、段階様式における捕捉抗体とインキ
ュベートし得る。試験サンプルを、まず捕捉抗体とインキュベートする。洗浄工
程に続いて、標識された抗体とインキュベートする。同時アッセイにおいては、
連続的なアッセイで記載した２つのインキュベート期間を組み合わせる。これは
、１つのインキュベート期間と洗浄工程を排除する。

【００９２】ディップスティック／免疫スティック形式は、固相が、ポリスチレンマイクロ
タイタープレートである代わりに、ポリスチレンパドルまたはディップスティッ
クであることを除いて、本質的に免疫アッセイである。試薬は、同一であり、そ
して形式は、同時であるか、連続的なものであるかのいずれかであり得る。

【００９３】クロマトグラフストリップ試験形式において、捕捉抗体および標識された抗体
を、代表的には、ニトロセルロースまたはセルロースアセテートに結合した多孔
性の高いナイロンである、クロマトグラフストリップ上で乾燥させる。捕捉抗体
を、通常ストリップの片方の端で、線状に噴霧乾燥させる。この末端において、
ストリップと接触する吸着材料が存在する。ストリップの他の末端に、標識され
た抗体を、膜内への吸着を防ぐための手法により沈殿させる。通常、抗体に結合
させた標識は、ラテックスビーズまたはコロイド状の金である。アッセイは、標
識された抗体の前にサンプルを直ちに適用することにより開始され得る。

【００９４】免疫濾過／免疫濃縮形式は、大きな固相表面に、濃縮しかつ抗体への抗原の結
合を促進するサンプル／試薬の指向性の流れを組み合わせたものである。好まし
い形式において、この試験サンプルを、標識された抗体とプレインキュベートし
、次いで、繊維フィルターまたはニトロセルロース膜などのような固相に適用す
る。固相をまた、捕捉抗体でコートされたラテックスまたはガラスビーズでプレ
コートする。分析物の検出は、標準的な免疫アッセイと同じである。サンプル／
試薬の流れは、減圧または基礎をなす吸収材料の運搬作用のいずれかにより改変
され得る。

【００９５】限界バイオセンサーアッセイは、低コストで多くのサンプルのスクリーニング
に受け入れられる、感度が良く、機器を備えたアッセイである。一つの実施態様
において、このようなアッセイは、光を扱うことのできる電位差計の使用を含み
、ここで反応は、捕捉抗体、架橋している抗体およびウレアーゼと結合した抗体
による所望のタンパク質の結合に起因するｐＨ変化の検出を含む。結合している
場合のｐＨの変化は、電気的な電位（μボルト）への変換により測定測定可能に
もたらされる。アッセイは、代表的に、非常に少ない反応容量で行われ、そして
非常に感度がよい。さらに、報告されたアッセイの検出限界は、毎分１，０００
分子のウレアーゼである。

【００９６】本発明はまた、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓを検出するのためのプローブおよ
びプライマーを提供する。

【００９７】本発明のこの局面の一つの実施態様において、プローブは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡに
特異的にハイブリダイズし得るように提供される。本発明の目的のために、プロ
ーブは、高ストリンジェンシー条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（前出）を参照のこ
と）下でハイブリダイズする場合、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡに「ハイブリダイズし得る」
。好ましくは、プローブを、６５℃で、６×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液
（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（前出））、０．１％ＳＤＳ、そして６５℃で０．２×
ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳの存在下で、過剰なプロー
ブを取り除くための少なくとも１回の洗浄のような高ストリンジェンシー条件下
で適切なヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするために用い得る。本明細
書で提供された他の方法を除いて、プローブ配列を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａ
ｌＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対するハイブリダイゼーションを可能にするが、
他の生物、特に他の細菌の配列由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対するハイブリ
ダイゼーションを可能にしないように設計する。プローブは、例えば、サンプル
中で細胞から暴露された核酸にハイブリダイズさせるために用いられる。次いで
、ハイブリダイズしたプローブを検出し、それにより所望の細胞の核酸の存在を
示す。好ましくは、細胞の核酸は、ハイブリダイゼーションに先立ってＰＣＲの
ような増幅手順を行う。

【００９８】本発明のプローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）
のいずれかからなり得、そして約１２ヌクレオチドの長さしかなく、通常は約１
４〜１８ヌクレオチドの長さであり、そしておそらく、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子の全長配列ほどの長い長さで
あり得る。プローブのサイズの選択は、プローブの用途に多少依存しており、そ
して当業者の範囲内である。

【００９９】適切なプローブを当該分野で周知の技術を用いて構築および標識し得る。例え
ば、１２塩基のより短いプローブを、合成的に生成し得る。１．５ｋｂ未満の約
７５塩基のより長いプローブを、好ましくは、例えば、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ、
ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、またはビオチン−ｄＡＴＰのような標識された前駆
体の存在下でＰＣＲ増幅することにより生成させる。１．５ｋｂより大きいプロ
ーブは、一般的に、関連したプローブを含むプラスミドを用いて細胞をトランス
フェクトし、大量にトランスフェクトした細胞を増殖させ、そしてトランスフェ
クトした細胞由来の関連した配列を精製することにより最も簡単に増幅させる（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（前出）を参照のこと）。

【０１００】プローブを、例えば、放射活性マーカー、蛍光マーカー、酵素的マーカーおよ
び色素生産性マーカーを含む種々のマーカーで標識化し得る。³²Ｐの使用は、特
定のプローブの作製または標識化のために特に好ましい。

【０１０１】本発明のこの局面の特徴は、プローブをサンプル中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０ｍＲＮＡまたはＤＮＡの存在を検
出するために用い得ることである。しかし、細菌が限られた数しか存在しないな
らば、それをより容易に検出または獲得し得るように関連する配列を増幅するこ
とが有益であり得る。

【０１０２】種々の方法が、選択された配列を増幅するために用いられ得、これらには、例
えば、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１
１９７−１２０２、１９８８；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３３９：４０１
−４０２、１９８９；Ｌｏｍｅｌｉら、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．３５（９
）：１８２６−１８３１、１９８９；米国特許第４，７８６，６００号を参照の
こと）およびＬＣＲまたはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を用いるＤＮＡ
増幅（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第
４，８００，１５９号を参照のこと；切れやすい結合の使用を含む代替的な検出
／増幅システムを記載する、米国特許第４，８７６，１８７号および同第５，０
１１，７６９号もまた参照のこと）または十分に当業者のレベルの範囲内である
他の核酸の増幅手順を含む。ＰＣＲに関して、例えば、その方法は、当該分野で
公知のように変更し得る。ＰＣＲをまた、逆のドットブロットハイブリダイゼー
ションとの組み合わせにおいても用い得る（Ｉｉｄａら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１４：１６７−１７２、１９９３）。ＰＣＲ産物を、ｄ
ＵＴＰを組み入れることにより定量的に分析し得（Ｄｕｐｌａａ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６、１９９３）、そしてサンプルは、ＰＣ
Ｒ−遺伝子プローブ検出のための濾過サンプルであり得る（Ｂｅｊら、Ａｐｐｌ
．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：３５２９−３５３４、１９９１
）。

【０１０３】好ましい実施態様において、ＰＣＲ増幅を、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０ＤＮＡを検出するために用いる。手短に言
えば、ＤＮＡサンプルを、一本鎖ＤＮＡを生成するために、９５℃で変性させる
。次いで、特異的なプライマーを、プライマー中のＡＴ／ＧＣの比率に依存して
、３７℃から７０℃で一本鎖ＤＮＡにアニールさせる。プライマーをテンプレー
トに対して逆の鎖を生成するために、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて７２
℃で伸長させる。これらの工程が１サイクルを構成し、これは、選択された配列
を増幅するために繰り返され得る。

【０１０４】代替的な好ましい実施態様において、ＬＣＲ増幅を、増幅のために利用する。
ＬＣＲプライマーを、上流プライマーの５’塩基が、所望の遺伝子を有するＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの株を特異的に検出するための所望の遺伝子中の独特の
塩基対に対してハイブリダイズし得るように合成される。

【０１０５】別の好ましい実施態様において、プローブを、自動の、非同位体ストラテジー
に用い、ここで、標的の核酸配列をＰＣＲにより増幅し、次いで所望の産物を、
比色定量オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉ
ｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ）（ＯＬ
Ａ）によって決定する（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：８９２３−８９２７、１９９０）。

【０１０６】選択された配列の増幅のためのプライマーを、高い特異性でありかつ標的の配
列と安定な二重鎖を形成する配列から選択すべきである。プライマーはまた、特
に３’末端で非相補的であるべきであり、それら自体または他のプライマーとダ
イマーを形成すべきではなく、そしてＤＮＡの他の領域と二次構造または二重鎖
を形成すべきではない。一般的に、約１８〜２０ヌクレオチドのプライマーが、
好ましく、そして当該分野で周知の技術を用いて容易に合成され得る。ＰＣＲ産
物および他の核酸増幅産物は、当該分野で公知の技術を用いて定量し得る（Ｄｕ
ｐｌａａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６、１９９３；
Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１０２６−１０３０
）。

【０１０７】さらに、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかが結合し得る基質
を含有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに特異的なバイオチップアレイは、現
在のバイオチップ技術と組み合わせて本明細書に開示される本発明を用いて生産
され得る。米国特許第５，４４５，９３４号。このような基質とＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０配列由来のオリゴヌクレオチドまたは本発明のＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより、高いスル
ープットスクリーニング手段を、多くのサンプル中の特異的なＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃａｌ株を同定するために作製し得る。

【０１０８】（Ｅ．薬学的組成物および方法）本発明の別の局面は、１つ以上の上記に記載したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０ポリペプチドまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０に対
する抗体を、１つ以上の薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、アジュバ
ント、結合剤または希釈剤との組み合わせで含む組成物および方法を提供する。
そのような組成物を、好ましくはヒトであるレシピエント動物における免疫応答
を誘発または増強し、そしてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する、または本発
明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０に融合した抗原と関連した生物体
に対する保護免疫性または部分的な保護免疫性を、好ましくは誘導または増強す
るために使用し得る。

【０１０９】好ましくは、そのようなキャリア、アジュバント、結合剤または希釈剤は、利
用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。通常のそのような組
成物の調製は、単離したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０ポリペプチド
と、緩衝剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（１０残基より少ない
）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、糖質（グルコース、スクロースまたは
デキストリンを含む）、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオンおよび他の
安定化剤、ならびに賦形剤との組み合わせを必要とする。中性の緩衝化生理食塩
水または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は、模範的な適切な希
釈液である。アジュバントの例は、ヒトのためのミョウバンまたは水酸化アルミ
ニウムを含む。

【０１１０】本明細書を考慮すると、投与の量および頻度を、臨床試験において最適化し得
、そして処置する疾患または障害、要求される免疫誘導、増強または保護の程度
、および多くの他の因子のような因子に依存していることが当業者に明らかであ
る。

【０１１１】１つの実施態様において、組成物を経口的に投与し、そして精製されたＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０は、腸の管腔に位置する細胞のような細胞に
取り込まれる。あるいは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０組成物は、
皮下経路、または他の非経口経路を介して、非経口的に投与され得る。他の経路
には、頬／舌下、直腸、経鼻、局所（経皮および目のような）、膣、肺、動脈内
、筋肉内、腹腔内、眼内、鼻腔内、または静脈内、あるいは間接的にが挙げられ
る。本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０組成物は、溶液として調
製および投与され得るか、または固体の形態で投与され得るか、もしくは投与と
組み合わせて溶液中に再懸濁して投与され得る固体の形態（例えば、凍結乾燥し
た）として調製され得る。

【０１１２】用途に依存して、組成物中の注入されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ
６０の量は、一般的に、生理学的に受容可能なキャリア、結合剤または希釈液と
の組み合わせにおいて、約０．１μｇ〜１０００ｍｇ、代表的には、約１μｇ〜
１００ｍｇ、好ましくは、約１０μｇ〜１０ｍｇ、および好ましくは、約１００
μｇ〜１ｍｇで変動する。追加免疫を、２〜６週間後に行ない得る。

【０１１３】本発明の薬学的組成物を、好ましくは消費者が受容し得るパッケージング材料
とともに容器内に配置し得、これは、本発明での使用のために適切なキットを提
供するためのそのような薬学的組成物の使用を考慮に入れた使用説明書を提供す
る。一般的に、そのような使用説明書は、試薬の濃度ならびに、実施態様におい
ては薬学的組成物を再構成するために必要とされ得る賦形剤成分または希釈液（
例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）の相対的な量を記載する具体的な表現が
含まれる。

【０１１４】本発明のＨｓｐ遺伝子産物をまた、ワクチンと結合している免疫学的キャリア
として用い得る。Ｈｓｐは、他のキャリアと異なり免疫抑制効果を有さないため
に、抗原の有益なキャリアである。Ｂａｒｒｉｏｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．２２：１３６５−１３７２，１９９２；ＳｕｚｕｅおよびＹｏｕｎｇ、Ｓ
ｔｒｅｓｓ−ＩｎｄｕｃｉｂｌｅＣｅｌｌｕｌａｒＲｅｓｐｏｎｓｅｓ７
７：４５１−４６５、１９９６（Ｕ，Ｆｅｉｇｅら、編）を参照のこと。このよ
うなキャリアは、結合した分子に対する免疫応答の増強を誘導するために用い得
る。それゆえ、本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＨｓｐ遺伝子産物をキャ
リア（結合タンパク質または融合タンパク質における）として用い得る。

【０１１５】本発明のさらなる局面は、腫瘍の処置および／または予防のためのＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０遺伝子および遺伝子産物の使用である。その方法
は、癌を有する個体への、癌に対する個体の免疫応答を誘発および／または増強
するために効果的な量の、本明細書中で議論する精製されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓＨｓｐ６０遺伝子産物を含む組成物の投与を含む。本発明はまた、癌
に対する個体の免疫化の方法、またはそのような個体における少なくとも部分的
には効果的な保護免疫応答を提供する方法を提供し、この方法は、個体の免疫化
に効果的な量の本明細書中で議論する精製されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
Ｈｓｐ６０を含む組成物の個体への投与を含む。

【０１１６】好ましくは、癌の処置は、実質的に菌体内毒素を有さない、高度に精製された
ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０遺伝子産物、そして同じものに関連す
る方法および組成物の使用を含む。このように高度に精製されたタンパク質は、
例えば、そのような菌体内毒素に関連した逆の副作用を受けないので、ヒトの癌
の処置に特に有益である。特に、その組成物は、癌に対する免疫応答の誘導また
は免疫応答の増強の両方を含む、個体に存在する癌に対する免疫応答を誘導し得
る。例えば、処置される癌は、肉腫および／または乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺
癌、膵臓癌および肝臓癌のような内皮細胞癌であり得る。本発明はまた、個体に
今まで存在しなかった癌に対する免疫化による部分的にまたは完全にのいずれか
での保護免疫応答を提供し得る組成物を提供する。

【０１１７】本発明のさらなる局面は、本発明のＨｓｐ６０遺伝子産物を用いる免疫化、ま
たは動物の細胞内で発現されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０遺伝子
もしくはそれらのフラグメントを含むベクターを送達するための遺伝子転移技術
の使用のいずれかによる種々の細菌性疾患からの保護である。本発明の組成物お
よび方法はまた、癌の予防を提供し得る。

【０１１８】本明細書に記載した組成物および方法論は、種々の使用に適切である。この目
的のためにこの後に続く実施例は、例示の目的で提供され、制限するものではな
い。

【０１１９】（実施例）（実施例１）（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐの遺伝子の単離）慣用方法により調製された、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ（ＡＴＣＣ６３１４）およびＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ
（ＡＴＣＣ１２３４４）由来のゲノムＤＮＡを、Ｄｒ．ＬｅｅＷｅｂｅｒ、Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｖａｄａＲｅｎｏ、から得た。

【０１２０】Ｈｓｐ６０ＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応の使用により単離した。プラ
イマーを、他の生物体由来の公知のＨｓｐ６０配列のＮ−およびＣ−末端相同性
に基づいて設計した。ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＤＮＡのＤＮＡ増幅を、Ｔ
ａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行なった。約２０の異
なるプライマー対を異なる反応条件を用いて試験した。１対（対１）を、Ｈｓｐ
６０−１遺伝子を増幅し得るとして同定し、そしてＨｓｐ６０−２配列を増幅し
得るとして第２（対２）を同定した。Ｈｓｐ６０配列を増幅させ得る反応混合物
は、総用量５０μｌ中に、０．５μｇのゲノムＤＮＡ、縮重プライマーの対の各
々に付き５０ｐｍｏｌ、各５００μＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、２ｍＭＭｇＳＯ₄、および１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含んだ。以下の２対の縮重プライマ
ーを、首尾よく利用した：

【０１２１】

【化１】上記の配列において、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを意味し、そしてＨは、Ａ、
ＣまたはＴ（Ｇではない）を意味する。

【０１２２】反応は、９４℃１分間、５０℃２分間および７２℃２分間で３５サイクル行な
った。ＰＣＲ産物を、０．６％の低融点アガロースゲル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）
上で分子量マーカーと共に電気泳動した。臭化エチジウムで染色した後、ＤＮＡ
断片を、低強度、長波長ＵＶイルミネーション下で可視化し、そして約１．６ｋ
ｂｐのフラグメントを切り出した。ＤＮＡをゲル断片から、フェノール抽出およ
びエタノール沈殿により単離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。精製したフラグメン
トを、ｐＣＲＩＩＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結
し、そして連結混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５ａ株を形質転換した。（
コンピテント細胞は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより得た）組換えプ
ラスミドを、標準的なアルカリ溶解法によりカナマイシン耐性コロニーから単離
し、そしてＤＮＡインサートのプラスミド中での存在を、ＥｃｏＲＩ消化で、消
化して、続いてアガロースゲル電気泳動を行ない、そして臭化エチジウム染色に
より消化産物を可視化して確認した。

【０１２３】（実施例２）（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０のヌクレオチド配列分析）組換えｐＣＲＩＩに基くクローンに存在するインサートを、ＣｉｒｃｕｍＶ
ｅｎｔ配列決定キット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、³⁵Ｓ−ｄ
ＡＴＰおよび以下に列挙したプライマーを用いて配列決定した。特定のＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０遺伝子を含む複数のクローンを配列決定した：
配列は、３つの独立したＰＣＲ反応由来である、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０−１遺伝子の５つのクローン、単独ＰＣＲ反
応由来である、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６
０−２遺伝子の２つのクローン、３つの独立したＰＣＲ反応由来であるＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−１遺伝子の４つのクロー
ン、そして単独ＰＣＲ反応由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅ
ｓＨｓｐ６０−２遺伝子の２つのクローンおよび第３のクローンの一部から得
た。配列決定反応は、変性６％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル（６０ｃｍ長
）で分画し、そしてゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーに曝露させ
た。オートラジオグラフを手動で解読し、そして配列データを、組み立て、そし
てＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒソフトウェア（ＣＥＡ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて他
の公知のＨｓｐ６０遺伝子と比較した。

【０１２４】使用した配列決定プライマー：

【化２】各Ｈｓｐ６０遺伝子のための配列決定ストラテジーを、図５に示す。Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０−１遺伝子（Ｐ６０−
１と呼ばれる）、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ
６０−２遺伝子（Ｐ６０−２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅ
ｓＨｓｐ６０−１遺伝子（Ｙ６０−１）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−２遺伝子（Ｙ６０−２）のヌクレオチド配列、
および対応する推論されたアミノ酸配列を、図１〜４（配列番号１〜８）に示す
。

【０１２５】ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０タンパク質と、放線菌Ｈｓｐ６５お
よびＧｒｏＥＬタンパク質との比較は、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアパッケー
ジ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．）の、ＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールを用いて決定
し、そしてＧｅｎｂａｎｋに列挙された遺伝子およびタンパク質に対する配列類
似性を、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒ
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｍａｔｉｏｎ、ＮＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ
、ＭＤ）を用いて明らかにした。そのような配列の１つの比較を、図１０に示す
。

【０１２６】（実施例３）（組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０の発現）挿入物（Ｈｓｐ６０遺伝子）は、組換えｐＣＲＩＩに基づくプラスミドから、
制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切り出された。ベクターＰＣＲＩＩ
のポリリンカー領域中で、ＮｄｅＩは、正方向ＰＣＲプライマー♯１Ｆまたは♯
２Ｆの内部を切断し、そしてＥｃｏＲＩは、逆方向ＰＣＲプライマー♯１Ｒまた
は♯２Ｒの下流の短い距離で切断する。Ｈｓｐ６０遺伝子配列を含むＤＮＡフラ
グメントは、低融点アガロースゲル上で分画され、このゲルから精製され、そし
てＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで二重に消化したｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターＤＮＡ（
Ｎｏｖａｇｅｎ）中に連結された。ライゲーション反応物を使用し、コンピテン
トＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５ａ細胞を形質転換し、そして形質
転換体を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンＤを含むＬｕｒｉａブロスプレート上
で選択した。ＤＮＡは、標準的なアルカリ溶菌法を使用して単一コロニーから単
離され、そして正しい挿入物の存在は、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩでの消化およ
びアガロースゲル電気泳動によって検証された。この得られた発現プラスミドは
、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０−１遺伝子
（ｐＥＴＰ６０−１と呼ばれる）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅＨｓｐ６０−２遺伝子（ｐＥＴＰ６０−２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−１遺伝子（ｐＥＴＹ６０−１）または
ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−２遺伝子（ｐＥ
ＴＹ６０−２）のいずれかを含んだ。発現プラスミドの模式図を図６〜図９に示
す。

【０１２７】それらのプラスミドが、挿入されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０
遺伝子を発現し得るか否かについて試験するため、この発現プラスミドを、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション
によって導入し、そして形質転換体コロニーを、上記のようにカナマイシン含有
プレート上で選択した。１ｍｌの培養物を単一コロニーとインキュベートし、そ
して形質転換体を、この培養物が濁るまで３７℃で増殖した。組換え遺伝子の誘
導の前（誘導していない培養物）に、タンパク質の分析のためにアリコートを取
り出した後、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭで添加
し、そして培養物を、さらに１時間または２時間インキュベートした（誘導した
培養物）。誘導した培養物および誘導していない培養物の１００μｌのアリコー
トを、１２，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。細菌ペレットを、１００μｌ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中で溶解し、そして３分間煮沸した。溶
解産物の１０μｌのアリコートを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０タンパク質は、クマシーブルー
染色後、約６０ｋＤａの見かけの分子量で移動する顕著なバンドとして検出可能
であり、このバンドは、誘導したサンプルでは存在したが、誘導していないサン
プルでは存在しなかった。

【０１２８】（実施例４）（組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０の精製）組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０発現プラスミドを含む細菌を
、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンＤを補充した２×ＹＴ培地（１リットル当たり
トリプトン２０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ）中３７℃で、６
００ｎｍでの光学濃度が０．５〜０．８まで増殖し、次いで、０．５ｍＭのＩＰ
ＴＧで３時間誘導した。次いで、培養物を氷上で冷やし、そして細菌を、７，０
００×ｇで５分間（４℃）の遠心分離により収集した。細菌ペレットを−８０℃
で凍結した。

【０１２９】凍結した細菌ペレットを破砕し、ブレンダーに移し、そして２００ｍｌの緩衝
液Ａ（６Ｍグアニジニウム塩酸、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、
０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール）中でホモジナイズした。

【０１３０】溶解産物を、１０，０００×ｇでの１５分間（４℃）の遠心分離により清澄化
した。この上清溶液を、緩衝液Ａ中で平衡化した５０ｍｌのＮｉ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ（ＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含
む約１００ｍｌのスラリーと室温で一晩混合した。次いで、この樹脂を、約２０
０ｍｌの緩衝液Ａを用いて濾紙上で洗浄し、少量の同じ緩衝液中で再懸濁し、そ
してグラスクロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に重力で充填（ｇ
ｒａｖｉｔｙ−ｐａｃｋ）した。

【０１３１】このカラムを、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍｌの緩衝液Ａで
洗浄した。このカラムをさらに、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、０
．５ｍＭ β−メルカプトエタノール（２００ｍｌ）中の６〜０Ｍグアニジニウ
ム塩酸／０〜１ＭＮａＣｌ勾配を用いて洗浄し、次いで、２００ｍｌの５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカ
プトエタノールを用いて洗浄し、そして最後に、２００ｍｌの５０ｍＭイミダゾ
ール、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１．０
２５ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノールを用いて洗浄した。
次いで、カラムを、１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５
、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール中の５％〜１００％の１Ｍイミダゾ
ール、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、０．５
ｍＭ β−メルカプトエタノールから構成される緩衝液勾配の２００ｍｌを用い
て展開した。９ｍｌの画分を収集した。流速は、４〜５ｍｌ／分であり、そして
クロマトグラフィーを、２８０ｎｍでの吸光度によりモニターした。

【０１３２】最も高い濃度の組換えタンパク質を含む画分を、上記のように１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより同定し、透析バック（１２ｋＤａカットオフ）中にプールした
（通常５〜６画分）。次いで、タンパク質溶液（約５０ｍｌ）を、３リットルの
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（２．７ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、４．３ｍＭＮ
ａ₂ＨＰＯ₄、２．７ｍＭＫＣｌ、０．１３７ＭＮａＣｌ）の３回の交換に対
して冷やして、透析した。透析されたタンパク質を、等分し、そして−８０℃で
貯蔵した。通常、２００〜４００ｍｇの組換えタンパク質を得た（ローリーに従
うタンパク質アッセイにより見積もった）。

【０１３３】（実施例５）（精製組換えＨｓｐ６０の特徴付け）ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０として組換えタンパク質を明白に同
定するため、精製された組換えタンパク質を、Ｎ末端およびＣ末端配列決定に供
した（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙＦａｃｉｌｉｔｙ、Ｗ．Ａｌｔｏ
ｎＪｏｎｅｓＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ、ＬａｋｅＰｌａ
ｃｉｄ、ＮＹにより行われた）。これらの決定は、精製組換えタンパク質が、配
列番号５〜８の推定アミノ酸配列から予測されるＣ末端配列およびＮ末端配列を
有することが示された（Ｅ．ｃｏｌｉ細菌中で代表的に切断プロセスされるＮ末
端メチオニンを除く）。

【０１３４】（実施例６）（公知の抗Ｈｓｐ６０モノクローナル抗体との組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓＨｓｐ６０タンパク質の反応性）精製された組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０タンパク質を、以
下の市販される抗体との反応性について分析した：Ａ）Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｈｓｐ６０に対して惹起されたウサギ
ポリクローナル抗体ＳＰＡ−８０４（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）。この抗体は、広範な範囲の原核生物および真核生物（藍細菌門
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、ならびに霊長類細胞株、マウス細胞株、
ハムスター細胞株、ラット細胞株を含む）由来のＨｓｐ６０を認識する。Ｂ）ヒトＨｓｐ６０に対して惹起されたマウスモノクローナル抗体ＳＰＡ−８０
７（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。そのエピトープ
は、そのタンパク質の残基３８３〜４１９の間に位置する。この抗体はまた、種
々の他の種（霊長類、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｈｙｏｄｙｓ
ｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｉｎｎｏｃｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｉｎ
ｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ、酵母、およびホウレンソウ葉緑体を含む）由来の
Ｈｓｐ６０と交差反応する。Ｃ）ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＧｒｏＥＬに対して惹起されたマウス
モノクローナル抗体ＳＰＡ−８７０（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）。この抗体は、真核生物Ｈｓｐ６０タンパク質を認識しない。Ｄ）ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＢＣＧＨｓｐ
６０に対して惹起されたマウスポリクローナル抗体（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。この抗体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉｇｒｏＥＬまたは真核生物Ｈｓｐ６０と交差反応しない。Ｅ）組換えヒスチジンタグを認識するマウスモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ
）。

【０１３５】０．１μｇ、０．５μｇまたは１μｇの組換えタンパク質を含むサンプルを、
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画し、そしてタンパク質を、ニトロセルロース
上に電気ブロットした。抗体ＳＰＡ−８０４、ＳＰＡ−８０７、ＳＰＡ−８７０
、および抗ＢＣＧＨｓｐ６０を用いる分析についてのブロットを、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の５％スキムミルクで室温で一晩ブロックした。
次いで、ブロットを、一次抗体（１：５００希釈で使用された抗ＢＣＧＨｓｐ
６０抗体を除いて１：１０００希釈）を含む同じ緩衝液中で１時間インキュベー
トした。ブロットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳを用いて３回
（各１０分）洗浄し、そして５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およ
びヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体（Ｓｉｇｍａ）
またはヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体（Ｓｉｇｍ
ａ）（１：１０００希釈）を含有するＰＢＳ中でそれぞれさらに１時間インキュ
ベートした。上記のように、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で３回洗
浄した後、ブロットを、アルカリホスファターゼ反応緩衝液（１００ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂）中に浸し、次いで、シグナルが明確に見える（約１５分）まで、同じ緩衝液中の
０．０５％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、０．０５％５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）中で発色させた。

【０１３６】類似の手順を、ＴＢＳ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ）中の３％ウシ血清アルブミン中でブロックしたことを除いて、抗
ヒスチジンタグ抗体についても行った。一次抗体および二次抗体を、ＴＢＳ単独
中で希釈し、そして一次抗体（１：５００希釈）を用いて２時間インキュベーシ
ョンした。洗浄を以下のように実行した：ブロットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴＢＳ中で１０分間２回まず洗
浄し、そしてＴＢＳ中で１０分間１回洗浄した。

【０１３７】組換えヒスチジンタグ化Ｈｓｐ６０タンパク質を、過剰発現Ｅ．ｃｏｌｉ細胞
から精製し、そしてポリクローナル抗体ＳＰＡ−８０４および抗ＢＣＧＨｓｐ
６０ならびにモノクローナル抗体ＳＰＡ−８７０、ＳＰＡ−８０７、ならびに抗
ヒスチジンタグ抗体を用いてウエスタンブロット上でプローブした。表１に示さ
れるように、ＳＰＡ−８０４は、全ての４つのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨ
ｓｐ６０タンパク質を認識した。対照的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０−２、ＳＰＡ−８７０と交差反応しなかったＳＰ
Ａ−８０７は、いずれのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０−２タンパク
質とも反応し得ず、そして抗ＢＣＧＨｓｐ６０は、いずれのＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓＨｓｐ６０とも交差反応し得なかった。予測されたように、抗Ｈｉ
ｓタグ抗体は、Ｈｉｓタグ化タンパク質として発現されていた全ての組換えタン
パク質と反応した。陽性反応性は、「＋」で示すが、陽性反応の欠損は、「−」
で示す。

【０１３８】

【表１】これらのデータは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０が他の生物のＨ
ｓｐ６０と抗原性的に異なることを実証する。それらはまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０−１およびＨｓｐ６０−２を区別し得ることを示す。そ
して、それらは、２つの異なる連鎖球菌種由来の関連Ｈｓｐ６０が抗体によって
差示的に認識され得るという証拠を提供する。

【０１３９】（実施例７）（組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０のペプチドフラグメントの
調製および同定）精製した組換えタンパク質（１ｍｇ／ｍｌで５０ｍｇ）を、２．５ｍｇのＬｙ
ｓ−Ｃエンドペプチダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用い
て３７℃で１時間消化した。消化反応物を、キャピラリー電気泳動（３Ｄ−ＨＰ
ＣＥ機器、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）により分画した。反応物を、５０
ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４７）中で７５ｕのむきだしの石英
ガラスキャピラリーを通じて１５ｋＶで泳動した。あるいは、逆相クロマトグラ
フィー（１１００シリーズＨＰＬＣ機器、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を
、０．１％のトリフルオロ酢酸の存在下で水中の０〜６０％アセトニトリル勾配
で展開したハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ＰＲＰ−１５ｍカラム上で実行し
た。Ｈｓｐ６０タンパク質の個々のＲＰ−ＨＰＬＣで分離されたペプチドを、Ｈ
ｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰａｌｏＡｌｔ
ｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによる質量分析法によって同定した。組換えＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０の消化物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを、
図１１に示す。

【０１４０】（実施例８）（内因性ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＨｓｐ６０の同定）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ６３１４）お
よびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１２３４４）か
ら抽出された総タンパク質を、Ｄｒ．ＬｅｅＷｅｂｅｒ（Ｎｅｖａｄａ大学、
Ｒｅｎｏ）から入手した。等量の両方の抽出物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける
タンパク質バンドの染色強度に基づいて同等化した）を、５０ｎｇの精製したＢ
ＧＣＨｓｐ６０（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と
並行して１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。ニトロセルロース上に電気転
移した後、実施例６に記載されるように、フィルターをブロックし、抗体ＳＰＡ
−８０４を用いてプローブし、そして抗体シグナルを検出した。

【０１４１】一方、同様に調製されたフィルターを、抗体ＳＰＡ−８０７またはＳＰＡ−８
７０の１：３０００希釈を用いて１時間インキュベートした。ブロットを、水で
２回リンスし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて３回（各５分）
洗浄し、次いで、５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１：３０
００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（
Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中でさらに１時間インキュベートした。その後、フィ
ルターを、水でリンスし、上記のように０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で洗浄し、ＥＣＬ基質混合物（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で平衡化し、プラスチック
ラップで包み、そして１５秒間から２０分間の間、Ｘ線フィルムに曝露した。

【０１４２】これらの実験から得られた結果を、表２に要約する。抗体ＳＰＡ−８０４は、
両方の連鎖球菌抽出物と強く反応した。対照的に、抗体ＳＰＡ−８０７は、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抽出物と弱く反応したが
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抽出物とは強く反応し
た。最後に、抗体ＳＰＡ−８７０は、両方の連鎖球菌抽出物と弱く反応した。実
施例６（表１）で決定された抗体特異性に基づくと、Ｈｓｐ６０−２は、連鎖球
菌細胞中では豊富であるが、Ｈｓｐ６０−１は、低レベルでのみ発現されると結
論付けられる。おそらく、Ｈｓｐ６０−１は、より高いストレス誘導性Ｈｓｐ６
０タンパク質である。

【０１４３】

【表２】利用された抽出物の量を、系列希釈を含むクーマシー染色ゲルを比較すること
によって正規化した。

【０１４４】上記から、本発明の特定の実施態様は、例証の目的のために本明細書中で記載
されているが、種々の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなさ
れ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によっ
ては限定されない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０
−ｌ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１およ
び２）を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０
−ｌ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１およ
び２）を示す。

【図２Ａ】図２Ａは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０
−２遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３およ
び４）を示す。

【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０
−２遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３およ
び４）を示す。

【図３Ａ】図３Ａは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−１
遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および６
）を示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−１
遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および６
）を示す。

【図４Ａ】図４Ａは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−２
遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８
）を示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０−２
遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８
）を示す。

【図５】図５は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ
６０遺伝子の配列を推定するために用いられる配列決定ストラテジーの模式図で
ある。

【図６】図６は、発現ベクターｐＥＴＰ６０−１、ｐＥＴＰ６０−２、ｐＥＴＹ６０−
１、およびｐＥＴＹ６０−２のマップを示し、これらのベクターはそれぞれ、Ｓ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６０遺伝子を
含む。

【図７】図７は、発現ベクターｐＥＴＰ６０−１、ｐＥＴＰ６０−２、ｐＥＴＹ６０−
１、およびｐＥＴＹ６０−２のマップを示し、これらのベクターはそれぞれ、Ｓ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６０遺伝子を
含む。

【図８】図８は、発現ベクターｐＥＴＰ６０−１、ｐＥＴＰ６０−２、ｐＥＴＹ６０−
１、およびｐＥＴＹ６０−２のマップを示し、これらのベクターはそれぞれ、Ｓ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６０遺伝子を
含む。

【図９】図９は、発現ベクターｐＥＴＰ６０−１、ｐＥＴＰ６０−２、ｐＥＴＹ６０−
１、およびｐＥＴＹ６０−２のマップを示し、これらのベクターはそれぞれ、Ｓ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨｓｐ６０遺伝子を
含む。

【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０遺伝子（配列番号２およ
び４）ならびにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子（配列番号６および８
）と、他の生物由来の類似の遺伝子（配列番号９〜３４）との比較を示す。

【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０遺伝子（配列番号２およ
び４）ならびにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子（配列番号６および８
）と、他の生物由来の類似の遺伝子（配列番号９〜３４）との比較を示す。

【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０遺伝子（配列番号２およ
び４）ならびにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子（配列番号６および８
）と、他の生物由来の類似の遺伝子（配列番号９〜３４）との比較を示す。

【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０遺伝子（配列番号２およ
び４）ならびにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子（配列番号６および８
）と、他の生物由来の類似の遺伝子（配列番号９〜３４）との比較を示す。

【図１０Ｅ】図１０Ｅは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０遺伝子（配列番号２およ
び４）ならびにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０遺伝子（配列番号６および８
）と、他の生物由来の類似の遺伝子（配列番号９〜３４）との比較を示す。

【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨ
ｓｐ６０遺伝子のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨ
ｓｐ６０遺伝子のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨ
ｓｐ６０遺伝子のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図１１Ｄ】図１１Ｄは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＨ
ｓｐ６０遺伝子のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウィスニュースキー，ジャンカナダ国ブイ０エス１エヌ０ブリティッシュコロンビア，スーク，タラプレイスアールアール２ 5004 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA31 CA04 DA02 DA05 EA04 GA11 HA01 HA03 4B065 AA01X AA49Y AA90X AB01 BA02 CA24 CA46 4C085 AA32 BA14 CC07 4H045 AA10 BA10 BA41 CA11 DA86 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓ
ｐ６０をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６
０をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】単離されたヌクレオチド分子であって、以下：（ａ）配列番号１のヌクレオチド１５〜１６５２の配列を含む、単離された核
酸分子；（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１５〜１６４０の配列を含む、単離された核
酸分子；（ｃ）配列番号５のヌクレオチド１５〜１６４９の配列を含む、単離された核
酸分子；（ｄ）配列番号７のヌクレオチド１５〜１６５２の配列を含む、単離された核
酸分子；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載される配列番号１、３、５または７のヌクレオチ
ドの任意の１つにそれぞれ相補的な、単離された核酸分子；および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の１つの核酸分子に対して高ストリンジェンシー
条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子、からなる群から選択される、単離されたヌクレオチド分子。
【請求項４】単離された核酸分子であって、配列番号１のヌクレオチド１
５〜１６５２、配列番号３のヌクレオチド１５〜１６４０、配列番号５のヌクレ
オチド１５〜１６４９、もしくは配列番号７のヌクレオチド１５〜１６５２の任
意の１つの核酸分子、またはそれらの相補体に対して高ストリンジェンシー条件
下において特異的にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項５】単離された核酸分子であって、配列番号１のヌクレオチド１
５〜１６５２、配列番号３のヌクレオチド１５〜１６４０、配列番号５のヌクレ
オチド１５〜１６４９または配列番号７のヌクレオチド１５〜１６５２の任意の
１つの少なくとも２５％の連続するヌクレオチド塩基を含むセグメントまたはそ
れらの相補体に同一のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】単離された核酸分子であって、配列番号２、４、６もしくは
８の任意の１つを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むＨｓｐ６０、ま
たは配列番号２、４、６もしくは８の任意の１つに記載されるポリペプチドに対
して少なくとも９５％相同である改変Ｈｓｐ６０をコードする、単離された核酸
分子。
【請求項７】ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓ
ｐ６０またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０に対
して特異的な抗体によって選択的に結合され得るポリペプチドをコードする、請
求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】配列番号２のアミノ酸残基１〜５４５、配列番号４のアミノ
酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４４、および配列番号８の
アミノ酸残基１〜５４５から選択される、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ
６０ポリペプチドの少なくとも８つのアミノ酸をコードする、単離された核酸分
子であって、ここで、該コードされたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０
ポリペプチドが、主要組織適合遺伝子複合体に結合し得る、単離された核酸分子
。
【請求項９】単離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅＨｓｐ６０ポリペプチド。
【請求項１０】単離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅ
ｓＨｓｐ６０ポリペプチド。
【請求項１１】配列番号２のアミノ酸残基１〜５４５、配列番号４のアミ
ノ酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４４、および配列番号８
のアミノ酸残基１〜５４５、から選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＨｓ
ｐ６０ポリペプチドの任意の１つのアミノ酸配列またはそれらの改変体を含む、
単離されたＨｓｐ６０ポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０および／またはＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０のいずれかに対して
特異的な抗体によって選択的に結合され得る、単離されたＨｓｐ６０ポリペプチ
ド。
【請求項１２】前記Ｈｓｐ６０ポリペプチドが、融合タンパク質を作製す
るためにさらなるポリペプチドに融合される、請求項９〜１１のいずれか１項に
記載の、単離されたＨｓｐ６０ポリペプチド。
【請求項１３】配列番号２のアミノ酸残基１〜５４５、配列番号４のアミ
ノ酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４４、および配列番号８
のアミノ酸残基１〜５４５から選択される少なくとも８つのアミノ酸を含む、単
離されたＨｓｐ６０ポリペプチドであって、ここで、該Ｈｓｐ６０ポリペプチド
は、主要組織適合遺伝子複合体に結合し得、そしてヒトにおけるＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓに対する免疫応答を誘発または増強し得る、単離されたＨｓｐ６０
ポリペプチド。
【請求項１４】前記ポリペプチドが、タンパク質分解性切断由来である、
請求項１１に記載の単離されたＨｓｐ６０ポリペプチド。
【請求項１５】前記ポリペプチドが、化学合成由来である、請求項１１に
記載の単離されたＨｓｐ６０ポリペプチド。
【請求項１６】前記Ｈｓｐ６０が、該Ｈｓｐ６０またはその一部をコード
する核酸分子を含む形質転換宿主細胞の発現産物である、請求項１１に記載の単
離されたＨｓｐ６０ポリペプチド。
【請求項１７】前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４
５、配列番号４のアミノ酸残基１〜５４１、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４
４、および配列番号８のアミノ酸残基１〜５４５から選択されるＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓのＨｓｐ６０ポリペプチドの任意の１つに対して９５％より大きい
相同性を含み、そしてここで、該Ｈｓｐ６０ポリペプチドが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨｓｐ６０もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＨｓｐ６０のいずれか、または両方に対して特異的
な抗体によって選択的に結合され得る、請求項１１に記載の単離されたＨｓｐ６
０ポリペプチド。
【請求項１８】単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、請
求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、形質転換宿主細胞の発現産
物である、単離されたポリペプチド。
【請求項１９】請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子
を含む、ベクター。
【請求項２０】前記ベクターが、前記Ｈｓｐ６０またはその一部をコード
する単離された核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクタ
ーである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】選択マーカーまたは同定マーカーをさらに含む、請求項２
０に記載のベクター。
【請求項２２】前記プロモーターが、構成性プロモーターまたは誘導性プ
ロモーターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】前記宿主細胞が、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、お
よび昆虫細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】請求項９〜１６のいずれか１項に記載のＨｓｐ６０ポリペ
プチドを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液と組み合わせて含む、組成物
。
【請求項２６】前記組成物が、全身投与に適切である、請求項２５に記載
の組成物。
【請求項２７】前記組成物が、経口投与に適切である、請求項２５に記載
の組成物。
【請求項２８】前記組成物が、非経口投与に適切である、請求項２５に記
載の組成物。
【請求項２９】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する哺乳動物の免疫応答
を誘発または増強するための方法であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは
希釈液と組み合わせて、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のＨｓｐ６０ポリ
ペプチドの有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】標的抗原に対して哺乳動物における免疫応答を誘発または
増強するための方法であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液と組み
合わせて、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のＨｓｐ６０ポリペプチドに結
合されている該標的抗原を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子
を含む組成物であって、ここで、該単離された核酸分子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ以外の生物由来のＨｓｐ６０タンパク質の対応するポリペプチドの少な
くとも１つのアミノ酸の相違を有するポリペプチドをコードする、組成物。