CN117866909A - 一种杂交瘤细胞株及其在生产cd74单克隆抗体上的应用 - Google Patents
一种杂交瘤细胞株及其在生产cd74单克隆抗体上的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株G4_mCD74，所述杂交瘤细胞株G4_mCD74于2023年10月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC No.C2023310；还包括杂交瘤细胞株在生产CD74单克隆抗体上的应用。发明实现对抗癌药物领域的拓展，通过CD74抗原获得一种杂交瘤细胞株，其产生的CD74单克隆抗体能够直接作用至实体肿瘤上，通过CD74单克隆抗体逆转耗竭性CD8+T细胞的耗竭，以及阻断CD276/CD74免疫检查点通路，来使得CD8+T细胞重新获取杀伤肿瘤细胞的功能，抑制癌细胞的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其在生产CD74单克隆抗体上的应用。
背景技术
肿瘤是危及人类生命财产安全的重要疾病，目前针对实体肿瘤的主要治疗方式仍以外科手术治疗为主，药物治疗为辅。然而临床中相当比例肿瘤患者在确诊时已处于疾病晚期，错过了最佳手术时机，针对此类患者，临床常用的治疗手段包括但不限于化疗、放疗、靶向药物治疗、免疫治疗等。尽管药物治疗手段方式众多，不少实体瘤(如肾癌等)对放化疗不敏感，靶向药物治疗易耐受，且免疫抑制剂(如靶向PD1/PD-L1)响应率仅有30％，因此仍需寻找新的有效治疗靶点，制定新的治疗策略。
CD74又称MHC-Ⅱ相关恒定链，是一类不依赖于MHC-Ⅱ类分子表达的非多肽性Ⅱ型跨膜糖蛋白。
CD74具有跨膜段且表达于细胞膜上，在巨噬细胞和树突状细胞中，CD74可以辅助MHC分子递呈抗原启动机体免疫应答；可作为受体和巨噬细胞迁移抑制因子相互作用，发挥促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、生成前列腺素E2等生物功能；也可以通过增加肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞和髓系来源抑制性细胞等浸润，促进肿瘤抑制性免疫微环境的形成，上述研究均表明CD74是潜在的肿瘤治疗靶点。
因此，如何生产获取CD74是实现通过CD74治疗肿瘤的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株及其在生产CD74单克隆抗体上的应用，以解决现有技术中如何生产获取CD74以实现通过CD74治疗肿瘤的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株G4_mCD74，所述杂交瘤细胞株G4_mCD74于2023年10月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNo.C2023310。
作为本发明的一种优选方案，所述杂交瘤细胞株G4_mCD74由阳性杂交瘤细胞制得。
作为本发明的一种优选方案，所述杂交瘤细胞株G4_mCD74的制备方法包括如下步骤：
取小鼠脾脏进行细胞融合，通过HAT培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞；
将所述阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法亚克隆得到单克隆细胞株，每次亚克隆期间进行2-3轮间接ELISA筛选，得到符合要求的阳性单克隆细胞株；
建株得到目标细胞株。
作为本发明的一种优选方案，所述杂交瘤细胞株G4_mCD74用于生产CD74单克隆抗体。
作为本发明的一种优选方案，所述CD74单克隆抗体的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列，以及轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株在生产CD74单克隆抗体上的应用。
作为本发明的一种优选方案，由所述杂交瘤细胞株生产的CD74单克隆抗体用于抑制癌细胞的增殖。
本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：
本发明通过杂交瘤细胞株G4_mCD74分泌获取用于治疗肿瘤的CD74单克隆抗体，所获得的CD74单克隆抗体能够直接作用至实体肿瘤上，抑制CD8+T细胞耗竭过程，同时阻断小鼠免疫检查点通路CD276/CD74，进而改善小鼠抗肿瘤免疫，抑制癌症的发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供CD74介导CD8+T耗竭的分布示意图；
图2为本发明提供实施例1中所得抗原SDS-PAGE检测电泳图示；
图3为本发明提供实施例1中所得杂交瘤细胞株G4_mCD74的镜下形态；
图4为本发明提供实施例1中编码抗体的cDNA 一级结构示意图；
图5为本发明提供实施例1中所得杂交瘤细胞株G4_mCD74分泌物CD74单克隆抗体重链可变区基因测序；
图6为本发明提供实施例1中所得杂交瘤细胞株G4_mCD74分泌物CD74单克隆抗体轻链可变区基因测序；
图7为本发明提供实施例1中所得CD74抗体SDS-PAGE检测电泳图示；
图8为本发明提供实施例1中所得CD74抗体抑制膀胱癌生长的图表；
图9为本发明提供实施例1中所得CD74抗体抑制膀胱癌进展实物图；
图10为本发明提供实施例1中所得CD74抗体抑制肾癌生长的图表；
图11为本发明提供实施例1中所得CD74抗体抑制肾癌进展实物图；
图12为本发明提供实施例1中皮下肿瘤免疫荧光染色的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在肿瘤刚发生时，肿瘤微环境中的效应CD8+T处于功能活化状态，负责杀伤肿瘤细胞以抑制肿瘤进展；临床实践中肿瘤患者确诊时有相当比例已处于进展阶段，由于持续的肿瘤抗原暴露等原因，该阶段的肿瘤微环境中存在大量无功能CD8+T细胞(即耗竭性CD8+T细胞)。
经研究表明，相比于正常的CD8+T细胞，CD74分子在耗竭性CD8+T细胞表面显著高表达，表明CD74分子介导肿瘤微环境中CD8+T细胞由活化状态到无功能的耗竭状态的过渡；此外，肿瘤细胞高表达的CD276配体通过结合肿瘤微环境中CD8+T细胞表面的CD74受体抑制机体的细胞免疫反应，从而使肿瘤得以逃避免疫系统的监视和杀伤，进一步导致肿瘤进展。
通过图1所示，图1为耗竭性CD8+T细胞群的分布示意图，可知CD74本身是肾癌肿瘤微环境中CD8+T细胞耗竭的标志物，其介导CD8+T细胞由正常趋于耗竭的过程。
相比于功能正常的CD8+T细胞，CD74分子在耗竭性CD8+T细胞表面显著高表达，表明CD74分子介导肿瘤微环境中CD8+T细胞由活化状态到无功能的耗竭状态的过渡。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，此杂交瘤细胞株能够生产出CD74单克隆抗体，CD74单克隆抗体能够直接作为抗肿瘤药物的应用，CD74单克隆抗体并非是敲低肿瘤细胞中的CD74，而是通过抑制CD8+T细胞耗竭过程和阻断小鼠免疫检查点通路CD276/CD74，进而改善小鼠肾癌免疫浸润以及抑制肾癌的发展，表明CD74单克隆抗体能够作为注射剂药物直接作用至含有癌细胞的动物体内，拓宽了CD74单克隆抗体的应用范围。
因此CD74单克隆抗体治疗可以抑制CD8+T细胞的耗竭，使之重新获得杀伤肿瘤细胞的功能，进而抑制肿瘤进展。
CD74单克隆抗体能够抑制耗竭性CD8+T细胞表面CD74分子的显著高表达，以逆转耗竭性CD8+T细胞的耗竭，使得耗竭性CD8+T细胞重新获得杀伤肿瘤细胞的功能；
且能够阻断生物体免疫检查点通路CD276/CD74，以阻断CD276配体与肿瘤微环境中CD8+T细胞表面的CD74受体的结合，以使得CD8+T细胞重新获得杀伤肿瘤细胞的功能。
此杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株G4_mCD74，于2023年10月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC No.C2023310，英文名称为Hybridoma cell line G4_mCD74。
以下通过具体实施例说明杂交瘤细胞株G4_mCD74的制备方法：
实施例1：
蛋白抗原制备：
以CD74蛋白为模板，采用大肠杆菌系统表达蛋白的56-279AA(Gln56-Leu279)，载体采用pET28b，N端添加GS linker及6*His标签，酶切位点采用NdeI/EcoRI，表达纯化测试后选择最佳的表达纯化条件进行放大生产，得到免疫抗原；
其中，CD74的蛋白序列如下：
MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPERCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLPKSAKPVSQMRMATPLLMRPMSMDNMLLGPVKNVTKYGNMTQDHVMHLLTRSGPLEYPQLKGTFPENLKHLKNSMDGVNWKIFESWMKQWLLFEMSKNSLEEKKPTEAPPKVLTKCQEEVSHIPAVYPGAFRPKCDENGNYLPLQCHGSTGYCWCVFPNGTEVPHTKSRGRHNCSEPLDMEDLSSGLGVTRQELGQVTL
蛋白共计279AAs，大小31.55KDa；pI 8.61；无信号肽，30-55AAs为跨膜螺旋，疏水性强。
抗原种属：小鼠。
得到的免疫抗原序列为：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLPKSAKPVSQMRMATPLLMRPMSMDNMLLGPVKNVTKYGNMTQDHVMHLLTRSGPLEYPQLKGTFPENLKHLKNSMDGVNWKIFESWMKQWLLFEMSKNSLEEKKPTEAPPKVLTKCQEEVSHIPAVYPGAFRPKCDENGNYLPLQCHGSTGYCWCVFPNGTEVPHTKSRGRHNCSEPLDMEDLSSGLGVTRQELGQVTL
免疫抗原的制备方法如下：
(1)大肠感受态制备
1)第一天将-80℃拿出来的甘油菌划线活化；
2)第二天下午从新鲜平板上挑单菌落接种于4ml LB培养基中，过夜培养；
3)第三天早上按1:100比例转接200ml(1L摇瓶)37℃，220rpm摇至OD值在0.4-0.6之间即可拿出放冰上冰浴30min；
4)4000rpm，10min离心，收集200ml菌液；
5)按3ml菌液/1mlCaCl2(0.1M)缓慢重悬，冰浴30min；
6)4000rpm，5min离心，去掉上清；
7)按3ml菌液/0.7mlCaCl2(0.1M)+0.3ml甘油(30％)缓慢重悬；
8)分装，按100ul/管分装，分装完后标记好放-80℃。
(2)质粒小提
1)取培养过夜的菌液8000rpm离心3min；
2)弃上清，用枪吸取残留的液体，使细胞沉淀尽可能干燥；
3)菌体沉淀重悬浮于250μl溶液P1中(用枪反复吹匀)；
4)加入250μl溶液P2(盖紧管口，温和颠倒离心管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，静置5min；
5)加入350μl溶液P3，盖紧管口，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀。12000rpm离心10分钟；
6)上清液移入吸附柱管中(提前用平衡液BL平衡)，吸附1-2min，12000g离心1min，重复此步骤一次；
7)弃上清，向柱中加入500ulPW漂洗液，12000rpm离心1分钟，重复此步骤一次；
8)弃上清，空管子在12000rpm离心3分钟；
9)将吸附柱盖子打开，放入烘箱静置3min，同时预热一管水备用；
10)取新的1.5mlEP管，在吸附柱的膜中间加入50ul预热的水，静置吸附2min，12000rpm离心3分钟。
(3)质粒转化
1)向100μL感受态细胞悬浮液中加入2μL待转化的质粒，轻轻混匀，冰浴30min左右；
2)在42℃的水浴中热激90sec，立即置于冰上保存2min，再加入200μL LB培养基(不含抗性)，37℃摇床200rpm震荡培养45min左右；
3)将培养好的菌液涂布在选择性平板固体培养基上(含相应抗生素)，待菌液被培养基充分吸收后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜；
4)大肠转化后次日挑单克隆进行菌落PCR鉴定，哺乳转化挑单克隆接种后中大提，昆虫系统转化后需活化4h并梯度涂板，次日挑蓝斑进行菌落PCR鉴定。
(4)菌落PCR
1)向做好标记的EP管内加入10ul无菌水；
2)用10ul的无菌枪头挑取平板上的单菌落，打入EP管内，用枪头反复吹打，使菌落充分溶解在无菌水中；
3)将EP管内的菌液取1ul加入对应单号标记的PCR小管中；
4)向EP管内剩余的菌液中加入500ul对应抗性的LB培养基，置于37℃摇床中200rpm震荡培养，用于后续的测序或者质粒提取；
5)将PCR管盖好盖子(盖子盖紧)，放入PCR仪中开始运行；
菌落PCR体系和程序见表1)运行完成后，跑DNA胶检测阳性克隆。
表1菌落PCR体系和程序：
(5)SDS-PAGE检测
如图2所示为所制备抗原SDS-PAGE检测结果，具体实验步骤为：
1)安装夹心式垂直版电泳槽；
2)配胶：根据所测蛋白质分子量的范围，选择合适的分离胶浓度；
3)检查做胶台面，垂直电泳槽，制胶板、制胶容器是否洁净干燥；
4)在电泳槽上装配好制胶板，压实，确保制胶板底部平整，并用夹具夹紧；
5)根据实验主要分离蛋白的大小，选择合适的凝胶浓度；
6)配制分离胶；
7)配制浓缩胶；
8)制胶完成，如凝胶不能用完，可以将余下的凝胶保存于盛有少量电泳缓冲液的自封袋中置5℃冷柜中保存；
9)上样：大肠杆菌表达测试和放大检测样品取15μl；枯草芽孢杆菌表达测试和放大样品取20μl；哺乳和昆虫样品取20μl，勿吸到树脂；
10)电泳：开始120V电泳，待跑到浓缩胶下面再调为200V直至电泳完毕；
11)染色：切去浓缩胶后，小心取下剩下分离胶，置于染色缸中，可用微波炉稍微加热下，在置于摇床上进行染色，勿太快，防止胶块破碎；
12)脱色：将染好的胶块取出置于平皿中，用清水洗涤，再换清水放摇床上，直至颜色变浅，条带清晰。
上述为CD74免疫抗原的制备过程。
以下通过CD74免疫抗原来制备菌株。
选取材料：
1)根据实验需求选取相应的动物，打开笼盒盖，核对动物信息是否与牌标识一致；
2)取需要免疫的大鼠，注意大鼠动向，慢慢将手伸入鼠笼，以免惊动大鼠，抓住大鼠尾巴，将其提出；
3)选择前肢腋下及后脚掌免疫：一人一只手固定大鼠尾巴，一只手固定大鼠颈部，另一人免疫，免疫两后脚掌，两前肢腋下，注射，四点共注射0.5mL，可见明显鼓包；
4)免疫好之后将大鼠放回，准备下一只。
免疫方案如表2所示。
表2免疫方案
1、进行血清效价间接ELISA检测
检测抗原：CD74
(1)Elisa抗原包被
1)包被：计算所需的抗原体积，包被液体积，蛋白包被浓度为1-2ug/ml，多肽包被浓度为1-5ug/ml；
2)封闭：从37℃温箱中或从4℃冰箱中取出包被好的酶标板将其中的包被液甩入水池内，然后将5％ Milk以每孔300ul的量依次加入，盖上盖子放入37℃温箱温育1小时，如果封闭是在下午四点后进行，则孵育为4℃冰箱过夜；
3)洗涤：从37℃温箱中或从4℃冰箱中取出包被和封闭好的酶标板，将封闭液甩入水池，用PBST洗涤3次。
依照项目号、顺序号的顺序整理好，将板进行装袋。放入-20℃备用，保质期2个月，超过2个月应丢弃。如果需要马上加一抗，则直接加一抗孵育，无需放入冰箱-20℃保存。
(2)Elisa检测
血清效价间接ELISA检测及竞争ELISA检测结果如表3、表4所示，详细实验方案如下：
1)一抗孵育：根据实验需求加入一抗，每孔100ul，盖上盖子放入37℃温箱温育60分钟后取出，甩去一抗用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干；
2)二抗孵育：根据实验需求加入对应种属二抗，每孔100ul，盖上盖子放入37℃温箱温育30分钟后取出，甩去二抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干；
3)TMB显色：将准备好的TMB显色液倒入一个套有PE手套的干净加样槽中，用排枪以每孔100ul的量依次加入酶标板孔中，盖上盖子放入温箱5-10分钟，观察显色情况；
4)终止：打开酶标仪，预热1分钟，从温箱取出酶标板，将2M HCl以每孔50ul的量依次加入酶标板孔中；
5)读数：打开Thermo酶标仪软件，选择450-620nm波长，将酶标板底部用吸水毛巾擦净后放进酶标仪卡槽内，点击start读数。
表3血清效价间接ELISA检测结果
综合血清效价及验证结果，选择3号大鼠进入融合实验。
2、细胞融合、亚克隆筛选及建株
取脾脏进行细胞融合，通过HAT培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法亚克隆得到单克隆细胞株，每次亚克隆期间进行2-3轮间接ELISA筛选，得到符合要求的阳性单克隆细胞株后建株。
(1)细胞融合
1)将已进行加强免疫的Balb/c小鼠固定，摘除眼球取血。然后颈椎脱臼处死小鼠，置于75％的酒精中消毒至少30秒；
2)小鼠全血于室温下静置1小时，然后4℃过夜保存。次日将小鼠全血3000rpm离心15min，小心吸取上层血清做为杂交瘤筛选阳性对照，-20℃冰箱分装保存；
3)用大头针固定小鼠四肢，使其仰面朝上，用第一套镊子和剪刀剪开表皮，用第二套镊子和剪刀剪开腹壁肌肉层，第三套镊子和剪刀分离并取出脾脏；
4)分别取3个直径10cm的培养皿，加入10ml 1640基本培养基。在第一个培养皿中漂洗脾脏一次；在第二个培养皿中，用镊子去除脾脏表面残留结缔组织(不要撕破脾脏被膜)；在第三个培养皿中，用两个载玻片磨砂面轻轻碾磨，碾破脾脏被膜后，即可得到脾细胞；
5)用10ml移液管吸取碾磨充分的脾细胞悬液经细胞筛过滤，转移到50ml的无菌离心管中；
6)再次吸取10ml 1640基本培养基反复冲洗培养皿2-3次后经细胞筛过滤，转移到步骤5)中的50ml无菌离心管中，经1500rpm离心6min；
7)弃去上清，用10ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，充分悬浮脾细胞沉淀，再添加30ml 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，经1500rpm离心6min；
8)重复步骤7一次；
9)弃去上清，用5ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，重悬脾细胞沉淀。取出约0.2ml细胞悬液，经20-40倍稀释后进行脾细胞计数，融合之前室温放置；
10)细胞离心间期，将sp2/0细胞收集在50ml无菌离心管中，经1000rpm离心5min；
11)弃去上清，用10ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，悬浮骨髓瘤细胞沉淀，再添加30ml 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，经1000rpm离心5min；
12)重复步骤11一次；
13)弃去上清，用5ml 1640基本培养基反复吹打10-15次重悬骨髓瘤细胞沉淀。取出约0.2ml细胞悬液，经10-20倍稀释后进行细胞计数，融合前室温放置；
14)融合开始前，打开恒温水浴锅，将温度调到37℃。将PEG和1640基本培养基放在水浴锅中预热；
15)根据细胞计数结果，将所需的脾细胞和骨髓瘤细胞分别混匀后按5：1比例在50ml离心管中混合；
16)1000rpm离心5min，弃去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀；
17)将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG(1min内加入1ml)，加入PEG过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端温柔地搅拌，静止90s；
匀速加入已预热的1640基本培养基(第一次)：1min内加入1ml，边加边温柔地搅拌；
匀速加入已预热的1640基本培养基(第二次)：1min内加入2ml，边加边温柔地搅拌；
匀速加入已预热的1640基本培养基(第三次)：3min内加入9ml，边加边温柔地搅拌；
匀速加入已预热的1640基本培养基，边加边温柔地搅拌直至40ml，将离心管置于37℃水浴中静置3min；
18)已融合的细胞悬液经800rpm离心5min，去上清，松动细胞沉淀；
19)加5ml HAT培养基，温柔地吹打10次悬浮细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96孔细胞培养板。
(2)亚克隆筛选
1)制备细胞悬液：在显微镜下观察，选择生长状态良好的杂交瘤细胞制备细胞悬液；
2)按细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在10个/毫升左右；
3)取一新24孔培养板置于超净工作台，分别在A1、A2、A3孔中加入900ul的15％HT选择培养基，将做有限稀释的24孔培养板中的杂交瘤细胞混匀并取出100微升的细胞悬液，加入至新24孔培养板的A1孔，用1ml的移液管反复吹打10次左右，然后从A1孔单道移液器(20-100ul)取出100微升至A2孔。以此类推，直至稀释到A3孔；
4)从A3孔取120个细胞放入V型槽中，用10ml移液管分两次吸取15％HT选择培养基于V型槽中，使V型槽中培养基的总体积为16ml，反复吹打8次左右。在接种96孔培养板时，200μl/孔加1-6六列为每孔1.5个细胞。余下6.4ml细胞悬液再补加6.4ml 15％HT选择培养基，反复吹打8次左右，200μl/孔加7-12六列，为每孔0.75个细胞；
5)置37℃8％ CO2培养箱，培养5天后，第七天在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，有单细胞克隆团的在板盖上打上标记“1”，有两个以及两个以上细胞克隆团的在板盖上打上标记“√”，做好记录并统计结果；
6)约第8-9天可以收获培养液上清用于检测抗体；
7)选择单克隆生长孔生长良好阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。
(3)建株
建株克隆及CD74 ELISA检测表4所示，及依据建株上清效价间接ELISA检测结果，筛选符合要求的阳性单克隆细胞株后建株。
表4建株克隆及其CD74 ELISA检测结果
| 建株克隆 | 1-D1-B2 | 11-A12-D7 | G4-mCD74 | 19-H4-D1 |
| CD74 | 2.72 | 1.08 | 3.78 | 2.57 |
| 建株克隆 | 36-H1-F12 | 48-H9-G10 | 85-B11-G1 | 88-F7-E8 |
| CD74 | 2.47 | 0.95 | 2.53 | 2.23 |
| 建株克隆 | 35-C7-1-G7 | 阴性对照 | 阳性对照 | |
| CD74 | 2.35 | 0.07 | 2.62 |
最终得到G4-mCD74目标细胞株，命名为杂交瘤细胞株G4_mCD74，图3所示为杂交瘤细胞株G4_mCD74镜下形态。
杂交瘤细胞株G4_mCD74测序
(1)杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区测序原理
从杂交瘤细胞株G4-mCD74中提取总RNA，并进行反转录PCR扩增cDNA，抗体的可变区序列通过亚型特异性引物进行PCR进行扩增，产物分别亚克隆到T载上，并进行测序分析。
编码抗体的cDNA一级结构示意图如图4所示：
(2)实验材料及方法
从上述杂交瘤细胞株(G4-mCD74)中提取总RNA，用oligo-dT为引物，进行RT-PCR扩增总cDNA。以cDNA为模板，VH或VL可变区片段分别使用正向简并引物(根据V或L基因设计)和反向恒定区特异性引物进行nested-PCR扩增。PCR产物连接到T载上，转化后进行菌落PCR，挑选阳性单克隆抗体进行测序分析。
CD74单克隆抗体的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列，以及轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
测序获得的序列用在线软件Vbase2和IMGT/V Quest进行分析。
测序结果序列分析如下：
重链可变区(VH)
DNA序列：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGTTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCATGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCCGTGACTATGGCATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCAACCATTAGTTATGATGGTAGTAGTATTTATTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAAAAGCACTCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCGACTTATTACTGTTCGGACTTTGATTATTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCA
氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFRDYGMAWVRQAPTKGLEWVATISYDGSSIYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCSDFDYWGQGVMVTVSS
轻链可变区(VL)
DNA序列：
GACATCCAGATGACCCAGGCTCCATCTTCCCTGCCTGCATCTCTGGGAGACAGAGTCACTATTAGTTGTCGGGCAAGTCAAGACATTGGAAATTATTTAAGATGGTTCCAGCAGAAACCGGGGAAATCTCCTAGGCTTATGATTTATGGTACAACCCACTTGGCAGCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTGACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGAAGATATGGCAGACTATTACTGTCTACAGTCTAGAGAGTCCCCTCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
氨基酸序列：
DIQMTQAPSSLPASLGDRVTISCRASQDIGNYLRWFQQKPGKSPRLMIYGTTHLAAGVPSRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMAD YYCLQSRESPLTFGSGTKLEIK
IMGT序列分析结果见表5：
杂交瘤细胞株G4_mCD74能够生产CD74单克隆抗体，上述氨基酸序列即为CD74单克隆抗体的氨基酸序列，以下提供一种CD74单克隆抗体的生产方法。
抗体生产及检测
CD74抗体效价检测如表6所示。
具体实验方案如下：
使用杂交瘤细胞株G4_mCD74进行细胞培养，用上清培养法生产抗体，用protein G法纯化抗体。
实验方法如下：
1)待纯化样品5000g，离心5min，收集上清；
2)将上清液加到protein G柱子里，流穿收集到15ml离心管里；
3)上样结束后，用10倍柱体积PBS洗涤柱子；
4)在洗涤柱子的同时，准备1.5ml的灭菌EP管，预先在每个收集管里加入50ul 1MpH 9.0Tris-HCl；
5)用0.1M甘氨酸溶液(pH 2.5)1ml进行洗脱，用1.5ml EP管收集洗脱液。收集结束立刻上下颠倒EP管进行混匀，用pH试纸测试洗脱液是否为中性；
6)洗脱完毕后，再次往protein G柱里加入3倍柱体积的0.1M甘氨酸溶液(pH 2.5)彻底洗脱柱子，再用二级水5倍柱体积清洗柱子，接着用20％乙醇2倍柱体积清洗柱子，流尽后，柱子底端盖紧帽子，加入2倍柱体积20％乙醇4℃保存柱子；
7)将洗脱下来的抗体室温离心12000rpm 2-3min，弃沉淀，取上清液测OD450值，计算抗体浓度。公式：抗体浓度(mg/ml)＝OD450/1.4×稀释倍数)，如无法显示代表浓度过高，用排枪吸出200ul打回原管中，再吸取20ul原抗体溶液，后加180ul 1*PBS稀释10倍，混匀，进行检测；
8)根据测得的OD450算出的抗体浓度，取2ug抗体跑胶；
9)取抗体样品送检Elisa，包被抗原：CD74；包被浓度：5μg/ml，100μl/well；包被稀释液：CBS，pH9.6；二抗：Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(FC)；抗体效价：检测值/空白对照>＝3时的最高稀释比例；阴性对照：免疫前血清；空白对照：PBS；
10)表7所示为CD74抗体亚型检测结果；
11)表8及图7所示为CD74抗体SDS-PAGE检测，结果表明，通过杂交瘤细胞株G4_mCD74得到了一种CD74单克隆抗体。
表6 CD74抗体效价检测
表7抗体亚型检测
| 抗体克隆号 | 抗体亚型 |
| 14-G4-G3 | IgG 2b |
表8 SDS-PAGE检测
| 编号 | 样本 | 描述 |
| 1 | 2ug抗体(14-G4-G3) | 12％还原性SDS-PAGE |
| 2 | 2ug抗体(14-G4-G3) | 12％非还原性SDS-PAGE |
所述CD74单克隆抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
对CD74单克隆抗体的功能进行检测，检测如下：
1)模型构建：
用含10％胎牛血清的1640培养基培养小鼠膀胱癌MB49及小鼠肾癌细胞系Renca，购买6-8周龄、雌性C57小鼠(18只)及Balb/c小鼠(10只)饲养于SPF环境；
于上述品系小鼠右侧腋窝皮下分别注射50万/0.1毫升MB49细胞、100万/0.1毫升Renca细胞，待肿瘤自然生长1周左右，各小鼠右侧腋窝局部触及皮下肿瘤如绿豆大小，即为小鼠皮下膀胱癌及肾癌模型构建成功。
给药方案及数据收集
将各品系小鼠随机各分为两组，对照组腹腔注射IgG抗体，实验组腹腔注射上述CD74体内抗体，剂量为5mg/kg体重，模型构建第6天开始给药并测量小鼠皮下瘤体积，给药频次为一周2次，测量频次为间隔一天一次，测量至第7-8次时处死小鼠，取出皮下瘤拍照并绘制肿瘤生长曲线。
图8、9所示为本发明所述CD74体内抗体在小鼠水平抑制膀胱癌、肾癌生长的曲线；
如图10、11所示，腹腔注射本发明所述CD74体内抗体，C57小鼠皮下膀胱癌及Balb/c小鼠皮下肾癌明显小于对照组，说明本发明所述的CD74体内抗体能够显著抑制膀胱癌、肾癌的进展。
且皮下肿瘤免疫荧光染色发现使用抗体组的CD8+T细胞浸润明显多于对照组(图12)，能够直接作用至实体肿瘤上，对肾癌和膀胱癌进行治疗，抑制CD8+T细胞耗竭过程，同时阻断小鼠免疫检查点通路CD276/CD74，进而改善机体抗肿瘤免疫，抑制癌症的发展。
实施例1表明，将CD74体内抗体注入至实验小鼠体内后，能够显著抑制膀胱癌、肾癌的进展，且耗竭性CD8+T细胞的数量显著降低，其主要作用机理为抑制CD8+T细胞耗竭过程，同时阻断小鼠免疫检查点通路CD276/CD74，使CD8+T细胞重新获得杀伤肿瘤细胞的功能，进而抑制肿瘤进展。
在现有的技术中，对于CD74的研究，一般是将其作为独特有用的药物递送靶抗原，通过将抗癌药物与CD74相关抗原缀合在一起，实现抗癌药物对癌细胞的作用，或对CD74进行阻断，其应用范围局限于其他治疗剂的组合治疗的组合物中。
此外，免疫反应过程中T细胞活化需要两种不同信号：第一信号源于T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞表达的抗原肽-MHC复合物相互作用，第二信号源于共刺激分子和T细胞膜上表达的相应受体相互作用。B7家族蛋白参与调节T细胞活化的第二信号，其中CD276在多种肿瘤高表达，与抑制T细胞激活、增殖和效应细胞因子(IFN-γ和IL2)的释放，从而介导肿瘤的免疫逃避密切相关。
研究发现肿瘤细胞高表达的CD276配体通过结合肿瘤微环境中CD8+T细胞表面的CD74受体抑制机体的细胞免疫反应，从而使肿瘤得以逃避免疫系统的监视和杀伤。
因此CD74单克隆抗体治疗可以通过阻断CD276/CD74免疫检查点通路，使CD8+T细胞重新获得杀伤肿瘤细胞的功能，进而抑制肿瘤进展。
通过本实施例的杂交瘤细胞株及其在生产CD74单克隆抗体上的应用，可以实现对抗癌药物领域的拓展，通过CD74抗原获得一种杂交瘤细胞株，其产生的CD74单克隆抗体能够直接作用至实体肿瘤上，对肾癌和膀胱癌进行治疗，抑抑制耗竭性CD8+T细胞表面CD74分子的显著高表达，以逆转耗竭性CD8+T细胞的耗竭，使得耗竭性CD8+T细胞重新获得杀伤肿瘤细胞的功能，进而改善小鼠抗肿瘤免疫，抑制癌症的发展。
以上实施例仅为本申请的示例性实施例，不用于限制本申请，本申请的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本申请的实质和保护范围内，对本申请做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本申请的保护范围内。
Claims (7)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，
命名为杂交瘤细胞株G4_mCD74，所述杂交瘤细胞株G4_mCD74于2023年10月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNo.C2023310。
2.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株，其特征在于，
所述杂交瘤细胞株G4_mCD74由阳性杂交瘤细胞制得。
3.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株，其特征在于，
所述杂交瘤细胞株G4_mCD74的制备方法包括如下步骤：
取小鼠脾脏进行细胞融合，通过HAT培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞；
将所述阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法亚克隆得到单克隆细胞株，每次亚克隆期间进行2-3轮间接ELISA筛选，得到符合要求的阳性单克隆细胞株；
建株得到目标细胞株。
4.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株，其特征在于，
所述杂交瘤细胞株G4_mCD74用于生产CD74单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株，其特征在于，
所述CD74单克隆抗体的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列，以及轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.一种如权利要求1-5任一项所述杂交瘤细胞株在生产CD74单克隆抗体上的应用。
7.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株在生产CD74单克隆抗体上的应用，其特征在于，
由所述杂交瘤细胞株生产的CD74单克隆抗体用于抑制癌细胞的增殖。
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