CN114409744B - Hpv抗原表位及其鉴定方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种HPV抗原表位及其鉴定方法、应用，该HPV抗原表位包括HPV E6蛋白的65‑72位氨基酸。本发明利用筛选优化后的HPV抗原表位的鉴定方法获得了一种HPV抗原表位，并对获得的所述HPV抗原表位进行应用，进一步获得了多种优势突变体，所述HPV抗原表位或突变体制备的药物、疫苗可有效治疗多种癌症，且其安全性更高、副作用更小。

Description

HPV抗原表位及其鉴定方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及HPV抗原表位及其鉴定方法、应用，更具体地，本发明涉及一种鉴定HPV抗原表位的方法、分离的肽、突变体、表达载体、抗原呈递细胞、免疫效应细胞、试剂在制备试剂盒中的用途、试剂盒、所述分离的肽或表达载体或抗原呈递细胞或免疫细胞在制备药物中的用途、药物、疫苗和诊断系统。
背景技术
人乳头瘤病毒（HPV）感染是几乎所有浸润性宫颈癌和部分肛门生殖器恶性肿瘤和口腔癌的致病原因。以宫颈癌为例，人乳头瘤病毒的持续感染是导致子宫颈癌的主要致病因素，当前已发展为世界上第四大常见女性癌症，疾病负担十分严重。
随着精准医疗号角的吹起，各种免疫治疗的肿瘤靶向药踊跃出现。其中肿瘤疫苗因其高度特异性，疗效强，不良反应发生率低等特性，获得了极高的研发关注。已有的HPV肿瘤免疫疗法以预防性HPV疫苗为主，已上市的预防性疫苗主要为HPV2价、4价及9价疫苗，可以针对特定的几种HPV高危分型及低危分型病毒进行免疫保护。但预防性疫苗以预防为主，并不能清除已存在的感染，对已感染的HPV患者来说并不能起到治愈的效果，HPV 治疗性疫苗的研发及临床应用变得刻不容缓。
HPV 治疗性疫苗通过产生针对HPV病毒颗粒的中和抗体来刺激细胞介导的免疫反应，从而针对特异性靶标杀死受 HPV感染的细胞。HPV病毒属人乳头瘤空泡病毒 A 属的双链球形 DNA 病毒，结构简单、无包膜。其基因组编码了6种早期调控蛋白 ( E1、E2、E4、E5、E6、E7) 和两种晚期结构蛋白( L1 和 L2)。早期基因编码蛋白负责病毒 DNA的复制、转录、癌变及转化。设计HPV治疗性疫苗通常针对的靶抗原基因为病毒早期蛋白E6和E7。E6和E7蛋白一直以来被认为是HPV相关研究中最关键的致癌蛋白。HPV病毒感染发生后，由病毒增殖衍生的E6、E7表达蛋白可以通过影响p53抑癌基因和PRB视网膜母细胞瘤蛋白来促进肿瘤后期的快速发生及发展。同时，两种蛋白序列在广泛的HPV亚型中均得到了良好的保护，可以作为HPV治疗性疫苗探索性研究中极具吸引力和应用性的靶标。
通常治疗性疫苗会将来源于靶标具有潜在治疗效力的靶抗原以多种形式传递给抗原呈递细胞(Antigen-Presenting Cell, APC)，从而递送至主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex， MHC) 分子上，激活抗原特异性的CD8 +毒性T细胞或CD4 +辅助 T细胞产生特异性免疫反应，以达到治疗作用。主要组织相容性复合物是一种存在于脊椎动物的庞大基因家族编码的细胞表面分子，其与机体免疫反应关系十分密切。在人类中，其又被称为人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）。HLA具有高度多态性，化学本质是一类糖蛋白，在所有有核细胞中均有表达。Ⅰ类HLA抗原的特异性取决于HLA分子的α重链，由HLA-A、B、C位点编码，并由此衍生出HLA-A、B、C的不同基因分型。HLAⅠ类复合物的主要功能是将HLAⅠ类来源于宿主或外来物如病毒表达蛋白等的基因产物，通过胞内内源机制加工后翻译剪切形成关键的治疗性抗原肽，近而通过形成的MHC复合物将抗原肽呈递给CD8+细胞毒性T细胞启动和调节特异性免疫应答。抗原多肽序列相关的抗原决定簇，即被称之为HLAⅠ类限制性抗原表位。因HLA基因的高度多态性，HLA-A、B、C基因来源的不同对应了 HLA-A、B、C不同分型限制性抗原表位，在HPV相关的病毒感染病患研究中，HLA-A0201基因分型占比最高。同时，已知的HPV病毒分型，约有200种以上。综合生物学特性及致癌潜能，通常被分为高危性和低危性。低危型 HPV 如 6、11、42、43、44 等，常引起外生殖器疣等良性病变，高危型 HPV分型如 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等与宫颈癌及上皮内病变关系密切，其中高危致病分型又以HPV16型在各类病患中占比最高，治疗性更为迫切。因此，鉴定HPV16型病毒的HLA-Ⅰ类限制性多肽表位对于治疗性疫苗的制备具有重要意义。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：HPV治疗疫苗是免疫治疗领域的研究热点，其中，获得有效的HPV病毒表位是极其关键的，发明人通过对HLA-I类MHC-抗原肽复合物进行免疫亲和捕获，固相萃取复合物中的抗原肽，并采用超高效液相色谱-质谱技术对获得的抗原肽进行分析，从而鉴定出HPV病毒表位。
由此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种鉴定HPV抗原表位的方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤：1）将HLA-I类抗体与载体以1mL：5mg-1mL：2mg的体积质量比进行结合，以获得免疫亲和柱；2）将HPV阳性细胞进行裂解处理；将步骤2）所获得的细胞裂解液进行过柱处理，所述柱为所述免疫亲和柱，以获得包含HPV抗原肽的HLA复合物；3）将所述包含HPV抗原肽的HLA复合物进行固相萃取，以获得肽段。发明人对鉴定HPV抗原表位的方法进行了筛选和优化，当所述HLA-I类抗体与载体以1mL：5mg-1mL：2mg的体积质量比进行结合时，抗体的结合率较高，将获得的包含HPV抗原肽的HLA复合物进行固相萃取时鉴定通量较高，本发明实施例的方法显著提高了获得与所述HLA-I类分子有效结合的HPV抗原肽的概率，显著缩短了鉴定时间。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的肽。根据本发明的实施例，包括下列中的至少之一：1）HPV E6蛋白的65-72位氨基酸；2）HPV E7蛋白的4-11位氨基酸；3）HPVE7蛋白的75-82位氨基酸；4）HPV E7蛋白的75-83位氨基酸；5）HPV E7蛋白的77-86位氨基酸；6）HPV E7蛋白的77-90位氨基酸；以及7）HPV E7蛋白的79-88位氨基酸。根据本发明实施例的分离的肽是由HPV E6或E7早期编码区表达翻译获得的，所述分离的肽可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种HPV 抗原表位。根据本发明的实施例，包括下列中的至少之一：1）HPV E6蛋白的65-72位氨基酸；2）HPV E7蛋白的4-11位氨基酸；3）HPV E7蛋白的75-82位氨基酸；4）HPV E7蛋白的75-83位氨基酸；5）HPV E7蛋白的77-86位氨基酸；6）HPV E7蛋白的77-90位氨基酸；以及7）HPV E7蛋白的79-88位氨基酸。根据本发明实施例的HPV 抗原表位是由HPV E6或E7早期编码区表达翻译获得的，所述HPV 抗原表位可以由HLA-I类分子呈递，被CTL或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种突变体。根据本发明的实施例，相较于野生型HPV E6蛋白，所述突变体在除锚定位外具有至少一个突变位点。根据本发明的具体实施例，获得的HPV抗原表位的第2和9位（对于8肽来说，为第8位）氨基酸为HLA的锚定位，表位中的其他位点氨基酸进行取代后，依然可以具备相同或相关的免疫原性及其潜在治疗效果，即可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种突变体。根据本发明的实施例，相较于野生型HPV E7蛋白，所述突变体在除锚定位外具有至少一个突变位点。根据本发明的具体实施例，获得的HPV抗原表位的第2和9位（对于8肽来说，为第8位）氨基酸为HLA的锚定位，表位中的其他位点氨基酸进行取代后，依然可以具备相同或相关的免疫原性及其潜在治疗效果，即可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第二方面所述的分离的肽、第三方面所述的HPV抗原表位、或第四方面或第五方面所述的突变体。根据本发明实施例的核酸分子编码获得的分离的肽、HPV 抗原表位或突变体可以由HLA-I类分子呈递，被CTL或TIL细胞识别，即被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带表达第二方面所述的分离的肽或第三方面所述的HPV抗原表位或第四方面或第五方面所述的突变体的核酸或第六方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导多肽在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，进而可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽或HPV抗原表位的肿瘤的特异性治疗或预防。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，携带前面所述的核酸分子、表达载体、分离的肽、HPV抗原表位或突变体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的实施例，所述宿主细胞在合适条件下可高效表达上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，所述重组细胞可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽或HPV抗原表位的肿瘤的特异性治疗或预防。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种抗原呈递细胞。根据本发明的实施例，所述细胞可呈递前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体。根据本发明的实施例，呈递前面所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的抗原呈递细胞可有效引起患者针对肿瘤特异性抗原-上述分离的肽/HPV抗原表位/突变体的免疫反应，进而激活CTL特异性杀伤功能，本发明实施例所提出的抗原呈递细胞具有显著的治疗表达上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的功效，其治疗的效果显著，安全性高。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种免疫效应细胞。根据本发明的实施例，所述免疫效应细胞可识别前面所述的多肽、HPV抗原表位、突变体或识别在细胞表面呈递前面所述的多肽或所述的HPV抗原表位或突变体的抗原呈递细胞。根据本发明的实施例，所述免疫效应细胞可特异性杀伤共表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤细胞。
在本发明的第十一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于检测前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断HPV或者检测HPV的治疗效果。所述试剂可以对所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体进行准确检测，如，检测生物样品中是否含有所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，由于所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体在被HPV感染的组织中高表达，因此，包含所述试剂的试剂盒可以准确诊断生物样品来源的个体是否被HPV感染，进一步地，是否为HPV高风险个体。同理，被HPV感染的个体在治疗过程中，利用所述试剂盒进行检测，可以检测治疗过程中HPV的变化，如加重、减缓或治愈等。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，包括适于检测前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体的试剂。所述试剂可以对所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体进行准确检测，如，检测生物样品中是否含有所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，由于所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体在被HPV感染的组织中高表达，因此，包含所述试剂的试剂盒可以准确诊断生物样品来源的个体是否被HPV感染，进一步地，是否为HPV高风险个体。同理，被HPV感染的个体在治疗过程中，利用所述试剂盒进行检测，可以检测治疗过程中HPV的变化，如加重、减缓或治愈等。
在本发明的第十三方面，本发明提出了前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防HPV相关疾病。如前所述，所述分离的肽、HPV抗原表位、突变体、编码所述分离的肽或HPV抗原表位或突变体的核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞均可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的特异性治疗或预防，因此，包含部分或全部上述物质的药物同样具有显著的治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第十四方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，包含前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞。如前所述，所述分离的肽、HPV抗原表位、突变体、编码所述分离的肽或HPV抗原表位或突变体的核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞均可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的特异性治疗或预防，因此，包含部分或全部上述物质的药物同样具有显著的治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第十五方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，包含前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体或抗原呈递细胞。如前所述，本发明实施例的核酸分子、表达载体或重组细胞在合适的条件下表达前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体，抗原呈递细胞可以表达所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，当其与HLA-I类分子结合后，被抗原呈递细胞呈递，使其被CTL或TIL细胞识别，即被表达HLA-I类分子的抗原呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫。因此，本发明实施例所提出的疫苗具有显著的治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第十六方面，本发明提出了一种预防HPV相关疾病的方法。根据本发明的实施例，给与受试者前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞、免疫效应细胞、药物或疫苗。如前所述，本发明实施例所提出的预防方法，包括给予任一种有效量的前面所述的分离的肽、突变体等相关物质，均可有效治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽或HPV抗原表位的肿瘤。
在本发明的第十七方面，本发明提出了前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测HLA。根据本发明实施例的分离的肽、HPV抗原表位、突变体及能够间接获得所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的物质均可与HLA进行结合，因此，上述物质可用于制备有效检测HLA的试剂盒，所述试剂盒可以准确的定性或定量检测生物样本的HLA，更进一步地，也可对个体中HLA水平进行检测，以判断所述个体的状态，如所述个体的HLA水平显著低于或高于正常水平。
在本发明的第十八方面，本发明提出了一种检测HLA的试剂盒。根据本发明的实施例，包括第前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞。如前所述，分离的肽、HPV抗原表位、突变体及能够间接获得所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的物质均可与HLA进行结合，因此，包含上述物质的试剂盒可以准确的定性或定量检测生物样本的HLA，更进一步地，也可对个体中HLA水平进行检测，以判断所述个体的状态，如所述个体的HLA水平显著低于或高于正常水平。
在本发明的第十九方面，本发明提出了一种诊断受试者体内是否含有HPV的方法。根据本发明的实施例，包括检测受试者来源的生物样品是否携带前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子的步骤。如前所述，所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体及核酸分子存在于被HPV感染的个体内，因此，通过检测来源于受试者的生物样品是否携带所述物质，可以有效诊断受试者体内是否含有HPV。
在本发明的第二十方面，本发明提出了一种诊断系统。根据本发明的实施例，包括：肽检测装置，所述肽检测装置用于检测受试者来源的生物样品是否携带前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体；诊断结果确定装置，所述诊断结果确定装置与所述肽检测装置相连，用于基于所述生物样品是否携带所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，确定所述患者是否患肿瘤。如前所述，所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体存在于被HPV感染的受试者体内，根据本发明实施例的诊断系统能够检测所述生物样品是否携带所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，因此，所述诊断系统可以准确判断所述生物样品来源的受试者是否为肿瘤患者。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的诊断系统的结构图；
图2显示了本发明的研究技术方案流程图；
图3-A和3-B显示了表位E7 77-86 RTLEDLLMGT（二价前离子574.8.26++）验证阳性数据分析图谱，其中，Retention Time表示保留时间，Intensity表示密度，Replicate表示重复数，Peak Area percentage表示峰值面积的占比；
图4-A和4-B显示了表位E7 75-83 DIRTLEDLL（二价前体离子-544.3033++）验证分析图谱；
图5-A和5-B显示了表位E7 4-11 DTPTLHEY（二价前体离子-488.2245++）验证分析图谱；
图6-A和6-B显示了表位E7 75-82 DIRTLEDL（二价前体离子-487.7613++）验证分析图谱；
图7-A和7-B显示了表位E7 79-88 LEDLLMGTLG（二价前体离子-531.2810++）验证分析图谱；
图8-A和8-B显示了表位E6 65-72 NPYAVCDK（二价前体离子-488.7211++）验证分析图谱；
图9-A和9-B显示了表位E7 77-90 RTLEDLLMGTLGIV（三价前体离子-510.9568+++）验证分析图谱；
图10显示了质谱检测系统中多肽携带离子情况的举例分析图；
图11显示了HPV特异性CTL细胞制备的工艺流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本文中，“表位”，又称抗原决定簇，是指免疫应答中被特异的效应分子或T淋巴细胞、B淋巴细胞识别的抗原分子的特定结构位点，从而诱导细胞免疫和体液免疫，产生免疫效应。如，本申请中的HPV抗原表位存在于HPV中，能够与HLA-I类分子结合。
本文中，“锚定位”是指HPV抗原表位与HLA-I类分子结合时，HLA-I类分子接纳HPV抗原表位的结构，是位于该分子远膜端的抗原结合槽，分析天然HPV抗原表位的一级结构，发现都带有两个或两个以上与HLA-I类分子抗原结合槽相结合的特定部位，称锚定位。该位置的氨基酸残基称为锚定残基 (anchor residue)。
本文中，“抗原呈递细胞”是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给T细胞的一类免疫细胞。APC主要包括单核-吞噬细胞、树突状细胞、B细胞、朗格汉斯细胞以及肿瘤细胞的病毒感染的靶细胞等。
本文中，“免疫效应细胞”是指在免疫应答中参与清除异物抗原和行使效应功能的免疫细胞。
鉴定方法
一方面，本发明提出了一种鉴定HPV抗原表位的方法，包括以下步骤：1）将HLA-I类抗体与载体以1mL：5mg的体积质量比进行结合，以获得免疫亲和柱；2）将HPV阳性细胞进行裂解处理；将步骤2）所获得的细胞裂解液进行过柱处理，所述柱为所述免疫亲和柱，以获得包含HPV抗原肽的HLA复合物；3）将所述包含HPV抗原肽的HLA复合物进行固相萃取，以获得肽段。根据本发明实施例的方法显著提高了获得与所述HLA-I类分子有效结合的HPV抗原表位的概率，显著提高了鉴定效率和鉴定的准确性。
根据本发明的一些具体实施方案，所述裂解处理是在裂解液中进行，所述HPV阳性细胞在所述裂解液中的终浓度为0.5e8-1e8/mL。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HLA-I类为anti-HLA-Ⅰ类A、B、C 抗体（W6/32，ATCC HB-95）。
根据本发明的一些具体实施方案，所述载体为Protein A琼脂糖凝胶。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV阳性细胞为HPV 16阳性细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV 16阳性细胞为Caski细胞和/或Siha细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，进一步包括以下步骤：5）对步骤4）获得的所述肽段进行检测，以便获得所述HPV抗原表位。根据本发明的一些具体实施方案，所述检测包括PRM靶向质谱分析，以对获得的所述肽段的序列进行鉴定。
由于HPV基因调控等免疫逃逸效应的影响，免疫多肽表位的暴露往往会被降低至相对较低的呈递丰度水平，直接鉴定免疫多肽表位难度较大。已有的HPV质谱鉴定样品处理方法主要为通过免疫亲和纯化方法利于HLA免疫复合物抗体捕获生物样品中与之相互作用的HLA复合物分子，后通过萃取复取复合物分子中的肽段进行高分辨质谱鉴定而得以实现。本发明对流程中关键点的样品制备及仪器分析均做了系统性优化，由此获得高质量的分析数据，以提高HPV免疫多肽表位鉴定成功的概率。
其中，优化部分包括如下内容：HPV阳性生物样本使用了HPV16型阳性细胞株Caski(人子宫颈癌上皮)细胞系系及Siha(人子宫颈鳞状细胞癌)细胞系(人子宫颈鳞状细胞癌)细胞（经HLA-A0201转染构建）细胞系。在免疫亲和实验过程中，根据裂解液的优化配比，每次亲和纯化实验采用8e8以上细胞计数起始量的细胞样本进行膜蛋白裂解。免疫亲和纯化利用生物体内存在的抗原、抗体间高度特异性的亲和力作用而进行分离、纯化，抗原抗体可通过非共价键结合在分子表面，并通过后续实验条体的改变而得以分离。影响免疫亲和纯化实验关键的除了抗体的高效及特异性外，实验过程中针对抗原抗体亲和的反应形式及反应体系、抗原样品的基质影响、孵育及洗脱条件的优化及后续样品的分离纯化等等都会影响实验的最终效率。仪器分析使用EASY-nLC 1000超高效液相色谱系统对免疫亲和纯化后的多肽检测样品进行液相梯度分离后进入Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行依PRM靶向质谱分析。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，约35cm柱长)串联，以500nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：0~5 min，5%流动相B(98% ACN，0.1% FA)；5~45min，流动相B从5%线性升至25%；45~50min，流动相B从25%升至35%；50~52min，流动相B从35%升至80%；52~54min，80%流动相B；54~54.5min，流动相B从80%降至5%；54.5~65min，5%流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪并按如下参数进行检测。经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Orbitrap FusionLumos (Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)进行MSOT+tMS2OT模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为2kV；一级质谱扫描范围350~1,400m/z；分辨率设置为60,000，最大离子注入时间(MIT)为50ms；二级质谱碎裂模式为HCD，碎裂能量设置为30；分辨率设置为30,000，最大离子注入时间(MIT)为50ms，AGC设置为：一级4E5, 二级5E4。
分离的肽
一方面，本发明提出了一种分离的肽，包括下列中的至少之一：1）HPV E6蛋白的65-72位氨基酸；2）HPV E7蛋白的4-11位氨基酸；3）HPV E7蛋白的75-82位氨基酸；4）HPV E7蛋白的75-83位氨基酸；5）HPV E7蛋白的77-86位氨基酸；6）HPV E7蛋白的77-90位氨基酸；以及7）HPV E7蛋白的79-88位氨基酸。根据本发明一些具体实施例的分离的肽是由HPV E6或E7早期编码区表达翻译获得的，所述分离的肽可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
根据本发明的一些具体实施方案，所述分离的肽的长度不超过15个连续的氨基酸。
根据本发明的一些具体实施方案，所述分离的肽的长度超过6个连续的氨基酸。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV E6蛋白为HPV16 E6蛋白。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV E7蛋白为HPV16 E7蛋白。
根据本发明的一些具体实施方案，所述分离的肽包含与HLA-A、HLA-B或HLA-C分子结合的氨基酸片段。
根据本发明的一些具体实施方案，所述分离的肽包括SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列中的至少之一。根据本发明的一些具体实施方案中的分离的肽是由HPV E6或E7早期编码区表达翻译获得的，所述分离的肽可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
NPYAVCDK（SEQ ID NO:1）。
DTPTLHEY（SEQ ID NO:2）。
DIRTLEDL（SEQ ID NO:3）。
DIRTLEDLL（SEQ ID NO:4）。
RTLEDLLMGT（SEQ ID NO:5）。
RTLEDLLMGTLGIV（SEQ ID NO:6）。
LEDLLMGTLG（SEQ ID NO:7）。
另一方面，本发明提出了一种HPV 抗原表位，包括下列中的至少之一：1）HPV E6蛋白的65-72位氨基酸；2）HPV E7蛋白的4-11位氨基酸；3）HPV E7蛋白的75-82位氨基酸；4）HPV E7蛋白的75-83位氨基酸；5）HPV E7蛋白的77-86位氨基酸；6）HPV E7蛋白的77-90位氨基酸；以及7）HPV E7蛋白的79-88位氨基酸。根据本发明实施例的HPV 抗原表位是由HPV E6或E7早期编码区表达翻译获得的，所述HPV 抗原表位可以由HLA-I类分子呈递，被CTL或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV 抗原表位包括SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列中的至少之一。
再一方面，本发明提出了一种突变体，所述突变体在除锚定位外具有至少一个突变位点。根据本发明的具体实施例，获得的HPV抗原表位的第2位氨基酸通常为HLA的锚定位，表位中的其他位点氨基酸进行取代后，例如，本申请中将所述E6 HPV抗原表位的第1位、第3位、第5位、第6位、第7位进行突变，依然可以具备相同或相关的免疫原性及其潜在治疗效果，即可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
根据本发明的一些具体实施方案，相较于野生型HPV E6蛋白，所述突变体具有如下突变位点中的至少之一：第65位、第67位、第69位、第70位和第71位。
根据本发明的一些具体实施方案，所述野生型HPV 16 E6蛋白具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL（SEQ ID NO：25）。
根据本发明的一些具体实施方案，相较于前面所述的分离的肽（HPV E6，SEQ IDNO:1），所述突变体具有如下突变中的至少之一：1）第1位的N突变为F；2）第3位的Y突变为L；3）第5位的V突变为E；4）第6位的C突变为L；和第7位的D突变为V。
根据本发明的一些具体实施方案，所述突变体具有SEQ ID NO：8-12所示的氨基酸序列。根据本发明的具体实施例，具有所示氨基酸序列的突变体可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
NPLAVCDK（SEQ ID NO：8）。
NPYAVCVK（SEQ ID NO：9）。
FPYAVCDK（SEQ ID NO：10）。
NPYAVLDK（SEQ ID NO：11）。
NPYAECDK（SEQ ID NO：12）。
又一方面，本发明提出了一种突变体，所述突变体在除锚定位外具有至少一个突变位点。根据本发明的具体实施例，获得的HPV抗原表位的第2和9位氨基酸通常为HLA的锚定位，表位中的其他位点氨基酸进行取代后，依然可以具备相同或相关的免疫原性及其潜在治疗效果，即可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
根据本发明的一些具体实施方案，相较于野生型HPV E7蛋白，所述突变体具有如下突变位点中的至少之一：第75位、第77位、第79位、第80位和第82位。
根据本发明的一些具体实施方案，所述野生型HPV 16 E7蛋白具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP（SEQ ID NO：26）。
根据本发明的一些具体实施方案，所述突变体相较于野生型HPV E7蛋白具有如下突变中的至少之一：1）第75位的D突变为F或Y；2）第77位的R突变为L或P；3）第79位的L突变为Y或缺失；4）第80位的E突变为Y；5）第82位的L突变为T。
根据本发明的一些具体实施方案，相较于前面所述的分离的肽（HPV E775-83 ，SEQID NO:4），所述突变体具有如下突变中的至少之一：第1位、第3位、第5位、第6位、第8位。
根据本发明的一些具体实施方案，相较于前面所述的分离的肽（HPV E775-83 ，SEQID NO:4），所述突变体具有如下突变中的至少之一：1）第1位的D突变为F或Y；2）第3位的R突变为L或P；3）第5位的L突变为Y或缺失；4）第6位的E突变为Y；5）第8位的L突变为T。
根据本发明的一些具体实施方案，所述突变体具有SEQ ID NO：13-17所示的氨基酸序列。根据本发明的具体实施例，具有所示氨基酸序列的突变体可以由HLA-I类分子呈递，被CTL细胞或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
FIRTLYDTL（SEQ ID NO：13）。
YIRTLEDLL（SEQ ID NO：14）。
DIPTEDLL（SEQ ID NO：15）。
DIRTYEDLL（SEQ ID NO：16）。
DILTLEDLL（SEQ ID NO：17）。
预防或治疗组合物
另一方面，本发明提出了一种核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的分离的肽、所述的HPV抗原表位或突变体。根据本发明的一些具体实施方案的核酸分子编码获得的分离的肽、HPV抗原表位或突变体可以由HLA-I类分子呈递，被CTL或TIL细胞识别，进而可被表达HLA-I类分子的呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫，构成了HPV阳性肿瘤的免疫应答的生理靶标，进行高灵敏度及特异性检测，对于HPV相关疾病的预防和治疗来说具有重要价值。
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸分子具有SEQ ID NO:18-24所示核苷酸序列中的至少之一。
编码NPYAVCDK（SEQ ID NO:1）的核酸包括：
AAUCCAUAUGCUGUAUGUGAUAAA（SEQ ID NO:18）
编码DTPTLHEY（SEQ ID NO:2）的核酸包括：
GAUACACCUACAUUGCAUGAAUAU（SEQ ID NO:19）
编码DIRTLEDL（SEQ ID NO:3）的核酸包括：
GACAUUCGUACUUUGGAAGACCUG（SEQ ID NO:20）
编码DIRTLEDLL（SEQ ID NO:4）的核酸包括：
GACAUUCGUACUUUGGAAGACCUGUUA（SEQ ID NO:21）
编码RTLEDLLMGT（SEQ ID NO:5）的核酸包括：
CGUACUUUGGAAGACCUGUUAAUGGGCACA（SEQ ID NO:22）
编码RTLEDLLMGTLGIV（SEQ ID NO:6）的核酸包括：
CGUACUUUGGAAGACCUGUUAAUGGGCACACUAGGAAUUGUG（SEQ ID NO:23）
编码LEDLLMGTLG（SEQ ID NO:7）的核酸包括：
UUGGAAGACCUGUUAAUGGGCACACUAGGA（SEQ ID NO:24）。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
再一方面，本发明提出了一种表达载体，携带表达前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体的核酸。所述表达载体的类型不受特别限制，只要能够实现前面所述的核酸构建体在受体细胞中高效表达即可，表达载体包括但不限于反转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺病毒相关病毒载体。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导多肽在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明的一些具体实施方案所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，进而可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽或HPV抗原表位的肿瘤的特异性治疗或预防。
又一方面，本发明提出了一种重组细胞，携带前面所述的核酸分子、表达载体、分离的肽、HPV抗原表位或突变体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。转化或转染可采用电转、病毒转染或感受态细胞转化的方式进行。采用何种转染或转化的方式是根据宿主细胞的性质以及待转核酸构建体或表达载体的性质所决定的，只要能够在所述宿主细胞中实现前面所述多肽的高效表达并对宿主细胞的良好的细胞状态不产生较大影响即可。根据本发明的一些具体实施方案，所述宿主细胞在合适条件下可高效表达上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，所述重组细胞可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的特异性治疗或预防。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合分离的肽、HPV抗原表位或突变体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述多肽表达的条件。
一个方面，本发明提出了一种抗原呈递细胞，所述细胞可呈递前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体。根据本发明的实施例，呈递前面所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的抗原呈递细胞可有效引起患者针对肿瘤特异性抗原-上述分离的肽/HPV抗原表位/突变体的免疫反应，进而激活CTL特异性杀伤功能，本发明实施例所提出的抗原呈递细胞具有显著的治疗表达上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的功效，其治疗的效果显著，安全性高。
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗原呈递细胞是通过下列至少之一获得的：将具有抗原呈递能力的细胞与所述多肽接触；将前面所述的核酸或表达载体导入所述具有抗原呈递能力的细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述具有抗原呈递能力的细胞为树突状细胞、B细胞或单核-吞噬细胞。
另一方面，本发明提出了一种免疫效应细胞。根据本发明的实施例，所述免疫效应细胞可识别前面所述的多肽、HPV抗原表位、突变体或识别在细胞表面呈递前面所述的多肽或所述的HPV抗原表位或突变体的抗原呈递细胞。根据本发明的实施例，所述免疫效应细胞可特异性杀伤共表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫效应细胞是通过下列方式获得的：将前面所述的抗原呈递细胞与具有免疫效应能力的细胞接触。
根据本发明的一些具体实施方案，所述具有免疫效应能力的细胞为T细胞，优选为CD8+T细胞。发明人发现，通过呈递前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体的抗原呈递细胞与具有免疫效应能力的细胞接触，抗原呈递细胞可活化具有免疫效应能力的未激活细胞，递呈抗原-前面所述的多肽，进而激活具有免疫效应能力的细胞，大量产生免疫效应细胞，该免疫效应细胞具有特异性杀伤呈递抗原-所述多肽的靶细胞的作用。CD8+T细胞接受抗原呈递细胞激活作用的能力更强，获得的CD8+T细胞的特异性杀伤呈递抗原-所述分离的肽/HPV抗原表位的靶细胞的作用更强。
在再一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，包含前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞。如前所述，所述分离的肽、HPV抗原表位、突变体、编码所述分离的肽或HPV抗原表位或突变体的核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞均可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的特异性治疗或预防，因此，包含部分或全部上述物质的药物同样具有显著的治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
根据本发明的一些具体实施方案提供的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的上述物质的活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应) 的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
同时，发明人发现宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌或扁桃体癌，尤其是宫颈癌组织特异性高表达上述分离的多肽或HPV抗原表位，进而当肿瘤为上述肿瘤时，该药物治疗的有效性得到进一步提高。
又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，包含前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体或抗原呈递细胞。如前所述，本发明实施例的核酸分子、表达载体或重组细胞在合适的条件下表达前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体，抗原呈递细胞可以表达所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，当其与HLA-I类分子结合后，被抗原呈递细胞呈递，使其被CTL或TIL细胞识别，即被表达HLA-I类分子的抗原呈递细胞递呈给CTL或TIL细胞而激活特异性T细胞免疫。因此，本发明实施例所提出的疫苗具有显著的治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。同时，发明人发现所述疫苗可以有效治疗或预防宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌或扁桃体癌，尤其是宫颈癌组织特异性高表达上述分离的多肽、HPV抗原表位或突变体，进而当肿瘤为上述宫颈癌时，该药物治疗的有效性得到进一步提高。
根据本发明的一些具体实施方案，所述疫苗呈适于吸入或者注射方式给药的形式。
根据本发明的一些具体实施方案，所述疫苗还包含至少一种佐剂。
用途
一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于检测前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体，所述试剂盒用于诊断HPV或者检测HPV的治疗效果。所述试剂可以对所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体进行准确检测，如，检测生物样品中是否含有所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，由于所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体在被HPV感染的组织中高表达，因此，包含所述试剂的试剂盒可以准确诊断生物样品来源的个体是否被HPV感染，进一步地，是否为HPV高风险个体。同理，被HPV感染的个体在治疗过程中，利用所述试剂盒进行检测，可以检测治疗过程中HPV的变化，如加重、减缓或治愈等。
另一方面，本发明提出了前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防HPV相关疾病。如前所述，所述分离的肽、HPV抗原表位、突变体、编码所述分离的肽或HPV抗原表位或突变体的核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞或免疫效应细胞均可有效用于对肿瘤，特别是同时表达HLA-I类分子和上述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的特异性治疗或预防，因此，包含部分或全部上述物质的药物同样具有显著的治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV相关疾病包括下列中的至少之一：宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌和扁桃体癌。发明人发现所述药物可以有效治疗或者预防上述疾病，尤其是宫颈癌组织特异性高表达上述分离的多肽、HPV抗原表位或突变体，进而当疾病为上述宫颈癌时，该药物治疗的有效性得到进一步提高。
再一方面，本发明提出了前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HLA。根据本发明的一些具体实施方案的分离的肽、HPV抗原表位、突变体及其相应物质可与HLA结合，因此，上述物质可用于制备有效检测HLA的试剂盒。
试剂盒
一个方面，本发明提出了一种试剂盒，包括适于检测前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体的试剂。所述试剂可以对所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体进行准确检测，如，检测生物样品中是否含有所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，由于所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体在被HPV感染的组织中高表达，因此，包含所述试剂的试剂盒可以准确诊断生物样品来源的个体是否被HPV感染，进一步地，是否为HPV高风险个体。同理，被HPV感染的个体在治疗过程中，利用所述试剂盒进行检测，可以检测治疗过程中HPV的变化，如加重、减缓或治愈等。
又一方面，本发明提出了一种检测HLA的试剂盒，包括前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述，分离的肽、HPV抗原表位、突变体及其相应物质可与HLA结合，因此，包含上述物质的试剂盒可用于有效定性或定量检测HLA。
预防或治疗方法
一方面，本发明提出了一种预防或治疗HPV相关疾病的方法，给予受试者前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞、免疫效应细胞、疫苗或药物。如前所述，本发明的一些具体实施方案所提出的预防方法，包括给予任一种有效量的前面所述的分离的肽等物质，均可有效治疗或预防表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤。
根据本发明的一些具体实施方案，所述HPV相关疾病包括下列中的至少之一：宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌和扁桃体癌。
给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。
本发明实施例中的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸、表达载体、重组细胞、抗原呈递细胞、免疫效应细胞、药物、疫苗的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。
术语“治疗有效量”是指足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。本文使用的“治疗”涵盖将发明实施例中的分离的肽、HPV抗原表位、突变体、核酸、表达载体、重组细胞、疫苗、抗原呈递细胞、免疫效应细胞或药物给予个体以治疗，包括但不限于将含本文所述的给予有需要的个体。
诊断方法
一方面，本发明提出了一种诊断受试者体内是否含有HPV的方法，包括检测受试者来源的生物样品是否携带前面所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体或核酸分子的步骤。如前所述，所述的分离的肽、HPV抗原表位、突变体或核酸分子存在于被HPV感染的个体内，因此，通过检测来源于受试者的生物样品是否携带所述物质，可以有效诊断受试者体内是否含有HPV。
诊断系统
最后，本发明提出了一种诊断系统。根据本发明的实施例，参考图1，该诊断系统包括：肽检测装置100；诊断结果确定装置200。其中，肽检测装置100用于检测受试者来源的生物样品是否携带前面所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体，诊断结果确定装置200与所述肽检测装置100相连，用于基于生物样品是否携带所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体，确定所述患者是否患有肿瘤。如：可以采用质谱仪检测受试者血清中是否存在所述的分离的肽、HPV抗原表位或突变体，进而通过质谱数据分析装置确定受试者血清中是否存在该分离的肽、HPV抗原表位或突变体，确定所述患者是否患有肿瘤。发明人发现，所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体在肿瘤组织中特异性高表达，本发明实施例所提出的诊断系统可用于有效确定特异性高表达所述多肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤患者。
另外，发明人发现，宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌或扁桃体癌特异性高表达所述多肽，本发明实施例所提出的诊断系统对上述肿瘤的诊断准确性进一步提高。
同时，发明人发现HLA-I类分子与所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体有着较强的亲和力，所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体通过与细胞表面HLA-I类分子结合进而激发一系列的免疫反应。因而，本发明实施例所提出的诊断系统诊断出同时表达HLA-I类分子和所述分离的肽、HPV抗原表位或突变体的肿瘤患者的几率更高。
需要说明的是，根据本发明实施例的分离的肽、HPV抗原表位、突变体及其用途、编码所述分离的肽或HPV抗原表位或突变体的核酸、表达载体、重组细胞、药物、抗原呈递细胞、免疫效应细胞、疫苗、试剂盒、治疗和诊断HPV的方法和系统是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才发现和完成的。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 HPV抗原表位的鉴定
本实施例采用免疫亲和的方法获得免疫多肽，具体操作流程如图2所示，具体操作步骤如下：
1.1 HLA蛋白复合物（主要组织相容性复合物(MHC)I类复合物分子）的获得
本实验的具体实验操作如下：
1）取1mL protein A Sepharose CL-4B（GE healthcare） 50% resin至Poly-PrepChromatography Columns中，流穿超纯水及PBS清洗后，流穿4mg anti-HLA-Ⅰ类A、B、C 抗体（W6/32，ATCC HB-95）；
2）流穿PBS后，流穿交联平衡液（200mM 三乙醇胺）；
3）流穿交联反应液，容留1mL交联反应液（50mM DMP）后关闭下通路，室温（25℃）静置1小时；
4）流穿交联终止液（100mM乙醇胺）；
5）流穿PBS，容留1mLPBS，制备的抗体亲和柱成品4℃冰箱保存备用；
6）使用HPV16型阳性细胞株Caski(人子宫颈癌上皮)细胞系、Siha(人子宫颈鳞状细胞癌)细胞系进行免疫多肽样品制备，上述细胞系均经HLA-A0201转染构建，采用8e8以上HPV阳性细胞系裂解提取，膜蛋白裂解液由0.5%脱氧胆酸钠，2%吡喃葡萄糖苷PBS缓冲液组成；
7）在收集后的HPV细胞样品中加入1x 细胞裂解液，使细胞终浓度为0.5e8-1e8个/mL，瞬时涡旋振荡混匀后于4℃、20 rpm上下颠倒混匀1小时；
8）将步骤7）获得的产物经4℃、14000g低温高速离心30min，离心后的上清用0.8µm滤膜过滤，滤液4℃保存备用。
9）将步骤8）获得的滤液流穿经抗体亲和柱，使用缓冲液1（150mM NaCl,20mM Tris(pH=8)水溶液）、2（400mM NaCl,20mM Tris(pH=8)水溶液）、3（20mM Tris(pH=8)水溶液）清洗，并使用每次1mL醋酸进行洗脱，每次洗脱液收为一个组分，共收集5组分，获得组分1-5，同时将5个组分混合，获得组分6，以获得含有免疫多肽的所述HLA蛋白复合物。
1.2 HLA蛋白复合物及免疫多肽分离及检测
1.2.1固相萃取分离HLA蛋白复合物
本实施例采用固相萃取方法对步骤1.1中获得的HLA蛋白复合物进行分离。具体的实验操作如下：
将实验1.1收集的合并后的6种组分分别流穿经30% ACN/0.1% FA水溶液流穿活化及.1% FA水溶液流穿酸化平衡后的Waters Sep-pak tC18固相萃取小柱（WAT036790），并使用30% ACN/0.1% FA水溶液进行固相萃取洗脱；然后将洗脱液收集后使用冻干机或浓缩仪进行浓缩，-20℃保存待质谱检测。
1.2.2免疫多肽的质谱检测
将实验1.2.1获得的免疫多肽进行二级分离及质谱检测，使用EASY-nLC 1000超高效液相色谱串联Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪系统对免疫多肽样品进行DDA高通量质谱鉴定分析，具体实验操作如下：
获得的所述HPV免疫多肽首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，约35cm柱长)串联，以500nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：0~5min，5%流动B(98% ACN，0.1% FA)；5~45min，流动相B从5%线性升至25%；45~50min，流动相B从25%升至35%；50~52min，流动相B从35%升至80%；52~54min，80%流动相B 54~54.5min，流动相B从80%降至5%；54.5~65min，5%流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪并按如下参数进行检测：经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪OrbitrapFusion Lumos (Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)进行MSOT+tMS2OT模式检测，主要参数设置为：离子源电压设置为2kV；一级质谱扫描范围350~1,400m/z；分辨率设置为60,000，最大离子注入时间(MIT)为50ms；二级质谱碎裂模式为HCD，碎裂能量设置为30；分辨率设置为30,000，最大离子注入时间(MIT)为50ms，AGC设置为：一级4E5, 二级5E4。对候选目标离子进行靶向采集。
1.2.3 免疫多肽靶向数据分析
使用skyline靶向数据分析方法针对上述1.2.2步骤获得的12051条多肽样品分析是否具备合成肽相同的靶向捕获迹象。
将经质谱靶向采样后不同批次的下机检测样品文件及合成多肽采样后下机检测样品文件原始数据导入skyline分析软件，用于检查离子在样本及合成肽样本中的鉴定及匹配。
结果图中下机样品文件及合成肽样品文件如下：图3-A和3-B：检测样品：(1)caski-1；(2)caski-2；(3)caski-3；（4）合成肽样品 caski-mix；图4-A和4-B：检测样品：(1)caski-1；(2)caski-2；(3)caski-3；（4）合成肽样品：caski-mix；图5-A和5-B：检测样品：(1)caski-1；(2)caski-2；(3)caski-3；（4）合成肽样品：caski-mix；图6-A和6-B：检测样品：(1)caski-1；(2)caski-2；(3)caski-3；(4)siha-1；(5)siha-2；（6）合成肽样品：caski-siha-mix；图7-A和7-B：检测样品：(1)siha-1；(2)siha-2；(3)siha-3；（4）合成肽样品：siha-mix；图8-A和8-B：检测样品：(1)caski-1；(2) caski-2；(3) caski-3；（4）合成肽样品： caski-mix；图9-A和9-B：检测样品：(1)siha-1；(2) siha-2；(3)siha-3；（4）合成肽样品：siha-mix。
本实验中，成功验证到的肽段在样本及合成肽样本中的鉴定及匹配满足以下条件：XIC出峰的液相保留时间一致，误差不超过3min；匹配的质量精度不超过10ppm；匹配子离子数超过5个以上。具体的实验结果如图3-A、3-B、4-A、4-B、5-A、5-B、6-A、6-B、7-A、7-B、8-A、8-B、9-A、9-B所示，其中，图中每例提取谱图展示的左上方已标明合成肽及样品的信息，提取出的结果具备数据分析中标出的匹配标准阳性。
检测分析中，多肽在正离子模式下质子化形成带电前体离子。带电前体离子最初位于N端或碱性残基侧链上，但由于内部裂解，可沿主链移动，在不同的位点断裂后生成子离子片段。其中：有三种不同类型的主链键可以断裂成肽片段：烷基羰基（CHR-CO），肽酰胺键（CO-NH）和氨基烷基键（NH-CHR）。
在经HCD及CID碰撞生成二级离子检测的质谱系统中，因为肽酰胺键（CO-NH）最脆弱的，b和y离子是最常见的离子类型，举例说明，如图10所示，其中，b、y离子右下角标注数字代表氨基酸残基的数目。
因此，本发明制备的免疫多肽样品新鉴定的HPV特异性免疫多肽表位的序列如下所示：
E6 65-72 NPYAVCDK（SEQ ID NO:1）。
E7 4-11 DTPTLHEY（SEQ ID NO:2）。
E7 75-82 DIRTLEDL（SEQ ID NO:3）。
E7 75-83 DIRTLEDLL（SEQ ID NO:4）。
E7 77-86 RTLEDLLMGT（SEQ ID NO:5）。
E7 77-90 RTLEDLLMGTLGIV（SEQ ID NO:6）。
E7 79-88 LEDLLMGTLG（SEQ ID NO:7）。
实施例2 酶联免疫斑点法（ELISPOT）评估HPV特异性肿瘤抗原肽免疫原性
实验采用T2细胞负载新鉴定的实施例1所述的7种HPV16型特异性混合抗原多肽，通过T2细胞的抗原提呈功能呈递给细胞毒性T细胞CTL，T2细胞的TAP（抗原提呈转运）分子缺陷通过有效负载外源多肽，实验抗原提呈后而激活免疫应答。实验设置阳性对照组、阴性对组及供试品组。将经细胞培养处理对数生长期的T2（ATCC：CRL-1992）活细胞收集后，经培养基稀释重悬至5e5个/mL细胞密度备用。每组取1mL T2细胞组，阳性对照组加入植物血凝素PHA（Sigma,货号L8902-25MG），PHA终浓度为4μg/mL；阴性对照组不添加处理；供试品组添加新鉴定HPV抗原肽混合物处理，抗原多肽混合物终浓度约为5μg/mL，CO2培养箱中培养3.5h。取制备好的T2细胞和CTL细胞进行ELISPOT铺板，每孔分别加入50μL CTL细胞及50μLT2细胞。于37℃、5% CO2培养箱培养18h后使用试剂盒（Human IFN-gamma ELISpotPRO(ALP)，货号：3420-2AST-10）进行抗体孵育、显色后使用EliSpot读板仪进行分泌IFN-γ斑点计数。
ELISPOT检测IFN-γ分泌光斑数实验数据如表1所示，其中，供试品组的IFN-γ斑点数量相对阴性对照组显著增多。说明鉴定HPV特异性肿瘤抗原多肽具有良好的免疫原性。
表1 ：
试验组别 阴性对照组 阳性对照组 供试品组（鉴定表位混合处理组）
IFN-γ斑点数 25 289 377
实施例3 酶联免疫斑点法（ELISPOT）评估HPV特异性肿瘤抗原肽突变体的免疫原性
本实施例中，发明人替换了实施例1或2获得的有效抗原表位的非权重位点氨基酸，探索该方式是否可以增强CTL表位的免疫原性及潜在药效。具体地，针对HLA-A0201分型，发明人对除2和9位氨基酸外的其他位点进行氨基酸取代，并对获得的突变体提进行免疫原性检测。具体的实验操作如下：
3.1 HPV特异性肿瘤抗原肽突变体的制备
本实施例中，发明人对上述鉴定到的HPV抗原表位中的E7 75-83 DIRTLEDLL及E6 65-72 NPYAVCDK进行改造，经合成后用于后续实验。获得的突变体的氨基酸序列如表2和表3所示。
3.2 HPV特异性肿瘤抗原肽突变体免疫原性检测
采用ELISPOT检测实验，验证步骤3.1获得的HPV抗原表位的所述变体是否能够激活CD8+T细胞的免疫反应。
实验设置阳性对照组、阴性对组及供试品组。将经细胞培养处理对数生长期的T2（ATCC：CRL-1992）活细胞收集后，经培养基稀释重悬至5e5个/mL细胞密度备用。每组取1mlT2细胞组，阳性对照组加入植物血凝素PHA（Sigma,货号L8902-25MG），PHA终浓度为4μg/mL；阴性对照组不添加处理；供试品组分别单独添加新鉴定的2种HPV抗原肽及其对应的突变体处理，抗原多肽DIRTLEDLL及其突变形式多肽设置终浓度约为5μg/mL，采用HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基进行培养，CO2培养箱中培养3.5h。取制备好的T2细胞和CTL细胞进行ELISPOT铺板，每孔分别加入50μL T细胞及50μL T2细胞。于37℃、5% CO2培养箱培养18h后使用试剂盒（Human IFN-gamma ELISpotPRO (ALP)，货号：3420-2AST-10）进行抗体孵育、显色后使用EliSpot读板仪进行分泌IFN-γ斑点计数。
测试多肽具有免疫原性的要求如下：斑点数(测试多肽)/斑点数(无关多肽)＞2；即，测试多肽引起的斑点数超过无关多肽斑点数目的两倍以上，表明测试多肽具有免疫原性，关于上述HPV抗原表位E7 75-83 DIRTLEDLL及其突变体的ELISPOT检测结果见如表2所示。
表2：
验证多肽及其变体 实验斑点数 阴性斑点数 倍数（实验组/阴性对照组）
DIRTLEDLL（SEQ ID NO:4） 245 33 7.42
DIRTYEDLL（SEQ ID NO：16） 209 28 7.46
DILTLEDLL（SEQ ID NO：17） 256 37 6.91
FIRTLYDTL（SEQ ID NO：13） 312 24 13
YIRTLEDLL（SEQ ID NO：14） 328 32 10.25
DIPTEDLL（SEQ ID NO：15） 279 33 8.45
由表2结果可知，制备的HPV抗原肽的突变体引起的斑点数均优于突变前的目标表位（DIRTLEDLL），表明本发明中的多肽及其突变体均具有良好的免疫原性，可以特异性地激活CD8+T细胞免疫反应。
关于上述HPV抗原表位E6 65-72NPYAVCDK及其突变体的ELISPOT检测结果见如表3所示，测试优选变体多肽引起的斑点数均优于突变前的目标表位，表明本发明中的多肽及其优选变体形式均具有免疫原性，可以特异性地激活CD8+T细胞免疫反应。
表3：
多肽及其变体 实验组斑点数 阴性对照组斑点数 倍数（实验组/阴性对照组）
NPYAVCDK（SEQ ID NO:1） 235 29 8.1
FPYAVCDK（SEQ ID NO：10） 316 31 10.19
NPYAECDK（SEQ ID NO：12） 281 35 8.03
NPYAVLDK（SEQ ID NO：11） 299 34 8.79
NPLAVCDK（SEQ ID NO：8） 336 26 12.92
NPYAVCVK（SEQ ID NO：9） 385 32 12.03
实施例4 HPV特异性CTL小鼠模型体内药效检测
HPV特异性CTL使用来源于HPV阳性的感染患者采集的外周血，通过体外制备工艺进行制备，具体制备的工艺流程如图11所示，其中，HPV特异性抗原多肽mix是指实施例1获得的7种抗原多肽的混合物，具体实验操作如下：
将宫颈癌阳性细胞caski接种至6-8周龄的重度免疫联合缺陷小鼠NOG dKO小鼠皮下，待成瘤生长至平均体积约50-75mm3时随机分为PBS（对照）组， HPV特异性CTL高剂量组静脉注射组、HPV特异性CTL高剂量联用人白介素2（IL-2）腹腔给药组，HPV特异性CTL低剂量联用人白介素2（IL-2）腹腔给药组（n=3），进行HPV特异性CTL小鼠模型初步体内药效实验。HPV特异性 CTL高剂量组采用进行静脉注射CTL细胞2*10e7/只/次，24h内给药2次；HPV特异性CTL低剂量组采用进行静脉注射CTL细胞2*10e6/只/次，24h内给药2次；人白介素2（IL-2）采用10000U/只/天，腹腔连续给药14天。HPV特异性 CTL在第14天重复给药，维持CTL细胞在体内的存留比例及治疗效果。培养至38天对小鼠进行处理，获取肿瘤，并称重，计算肿瘤（体积）抑制率。皮下移植Caski小鼠模型（NOG dKO）中HPV特异性CTL药效实验设计及肿瘤抑制数据如表3所示，不同给药组给药对肿瘤生长抑制程度表现不同，小鼠培养至38天，高剂量HPV特异性CTL单药组（TGI=31%），高剂量HPV特异性CTL联用IL-2组（TGI=63%）、低剂量HPV特异性CTL联用IL-2组（TGI=52%），表现出显著的肿瘤抑制效果。
表4：
Figure 303204DEST_PATH_IMAGE001
其中，iv表示静脉注射，ip表示腹腔注射。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
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Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2
<400> 2
Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3
<400> 3
Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4
<400> 4
Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5
<400> 5
Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6
<400> 6
Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7
<400> 7
Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 8
<400> 8
Asn Pro Leu Ala Val Cys Asp Lys
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 9
<400> 9
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Val Lys
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10
<400> 10
Phe Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11
<400> 11
Asn Pro Tyr Ala Val Leu Asp Lys
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 12
<400> 12
Asn Pro Tyr Ala Glu Cys Asp Lys
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13
<400> 13
Phe Ile Arg Thr Leu Tyr Asp Thr Leu
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14
<400> 14
Tyr Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15
<400> 15
Asp Ile Pro Thr Glu Asp Leu Leu
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16
<400> 16
Asp Ile Arg Thr Tyr Glu Asp Leu Leu
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17
<400> 17
Asp Ile Leu Thr Leu Glu Asp Leu Leu
1 5
<210> 18
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18
<400> 18
aauccauaug cuguauguga uaaa 24
<210> 19
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19
<400> 19
gauacaccua cauugcauga auau 24
<210> 20
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20
<400> 20
gacauucgua cuuuggaaga ccug 24
<210> 21
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21
<400> 21
gacauucgua cuuuggaaga ccuguua 27
<210> 22
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22
<400> 22
cguacuuugg aagaccuguu aaugggcaca 30
<210> 23
<211> 42
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 23
<400> 23
cguacuuugg aagaccuguu aaugggcaca cuaggaauug ug 42
<210> 24
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 24
<400> 24
uuggaagacc uguuaauggg cacacuagga 30
<210> 25
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 25
<400> 25
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 26
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 26
<400> 26
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro

Claims (16)

1.一种突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：8~12任一项所示。
2.一种表达载体，其特征在于，携带表达权利要求1所述的突变体的核酸。
3.一种分离的抗原呈递细胞，其特征在于，携带权利要求2所述的表达载体。
4.根据权利要求3所述的分离的抗原呈递细胞，其特征在于，所述分离的抗原呈递细胞为树突状细胞、B细胞或单核-吞噬细胞。
5.一种分离的免疫效应细胞，其特征在于，所述分离的免疫效应细胞可识别权利要求3或4所述的分离的抗原呈递细胞。
6.根据权利要求5所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述分离的免疫效应细胞是通过下列方式获得的：
将权利要求3或4所述的分离的抗原呈递细胞与具有免疫效应能力的细胞接触。
7.根据权利要求6所述的分离的免疫效应细胞，其特征在于，所述具有免疫效应能力的细胞为T细胞。
8.根据权利要求6所述的分离的免疫效应细胞，其特征在于，所述具有免疫效应能力的细胞为CD8+T细胞。
9.检测权利要求1所述的突变体的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断HPV或者检测HPV的治疗效果。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括适于检测权利要求1所述的突变体的试剂。
11.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的表达载体、权利要求3-4任一项所述的分离的抗原呈递细胞或权利要求5-8任一项所述的免疫效应细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗HPV相关疾病。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述HPV相关疾病包括下列中的至少之一：宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌和扁桃体癌。
13.一种药物，其特征在于，包含权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的表达载体、权利要求3-4任一项所述的抗原呈递细胞或权利要求5-8任一项所述的免疫效应细胞。
14.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求3-4任一项所述的抗原呈递细胞。
15.根据权利要求14所述的疫苗，其特征在于，进一步包括至少一种佐剂。
16.一种诊断系统，其特征在于，包括：
肽检测装置，所述肽检测装置用于检测受试者来源的生物样品是否携带权利要求1所述的突变体；
诊断结果确定装置，所述诊断结果确定装置与所述肽检测装置相连，用于基于所述生物样品是否携带所述突变体，确定所述受试者是否患肿瘤；
其中，所述肿瘤为宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、口腔癌、喉癌、食道癌、鼻腔内癌或扁桃体癌。
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