CN112898401A - 一种钙网蛋白组合肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明在于提供CRT组合肽及其用途，所述组合肽由CRT的优势表位组成，所述CRT优势表位，分别为：CRT aa.6‑14、CRT aa.1‑9、CRT aa.8‑16、CRT aa.13‑21、CRT aa.313‑321、CRT aa.195‑203。包含上述六条CRT优势表位的CRT组合肽的杀伤效果显著地高于包含上述三条、四条、五条CRT优势表位的CRT组合肽；发明包含所述六条优势表位的CRT组合肽、核酸或者药物组合肽可有效杀伤HPV，并对HPV引发的相关疾病方面有疗效。

Description

一种钙网蛋白组合肽及其用途

技术领域

本发明涉及一种钙网蛋白(calreticulin，CRT)及其用途，具体地本发明涉及一种CRT组合肽及其该组合肽作为一种药物有效杀伤HPV，并对HPV引发的相关疾病有疗效。本发明还涉及所述CRT组合肽的优选剂量。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)及相关宫颈癌在女性恶性肿瘤发病率中高居第二位，仅次于乳腺癌。根据宫颈癌病因学研究表明，99％的宫颈癌患者体内均检测到高危型HPVDNA的表达。全世界平均每年约有35万以上的患者死于宫颈癌，并且其数量呈上升趋势。在全球范围内，平均每一分钟新增一例宫颈癌患者，平均每两分钟便有一例患者死于宫颈癌。在我国，平均每年约有13万新患宫颈癌的女性，占世界宫颈癌新发病例总数的28％。

HPV是无包膜的双链闭环小型DNA病毒，其基因组编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白和L1、L2两个晚期蛋白。其中E1、E2蛋白参与调控HPVDNA的复制和转录。E2蛋白还可以抑制编码E6和E7蛋白基因的表达。

根据已有数据显示，目前发现有100种以上不同类型的HPV。在多种类型的HPV中，高危型HPV包括但不局限于HPV16、18、31、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82的感染与宫颈癌以及宫颈癌前病变的发生密切相关。并且在高危型HPV亚型中，HPV16、HPV18是最常见的致癌类型，在我国的流行病学研究中显示，宫颈癌患者中HPV16以及HPV18的阳性率高达50％以上。

目前为止，在国际和国内市场上有2价、4价和9价HPV预防性疫苗。众所周知，预防性疫苗对已经感染了HPV的患者尤其对于长期持续感染HPV的患者而言，单纯的注射预防性HPV疫苗治疗效果甚微。并且，目前国际市场和国内市场还未有治疗已感染HPV而引发疾病的药品和治疗方法。

钙网蛋白(calreticulin，CRT)基因位于第19号染色体(p13.2-p13.3)，由9个外显子和8个内含子构成，其开放阅读框(ORF)长度为1254bp，编码由417个氨基酸组成的酸性蛋白质。目前发现钙网蛋白存在于除酵母外的所有细胞中。钙网蛋白的结构和功能区域由N区(aa 1-180)由反向平行的β-折叠和螺旋-转折-螺旋组成球形三维结构，所述区域是钙网蛋白于重金属(Zn²⁺)结合的区域。在体外所述区域还可以和其他内质网分子伴侣、细胞核受体的DNA结合域和核酸相互作用。钙网蛋白N区的另一功能是与P区一起维持其分子伴侣的功能；P区(aa 181-290)是一个富含脯氨酸的区域，它能与内质网腔的其他分子伴侣相互作用；C末端区(aa 291-400)带有高密度的负电荷，可高容量结合Ca²⁺，参与Ca²⁺在内质网的储存。C末端区存在KDEL内质网滞留信号，该信号与钙网蛋白在内质网中滞留密切相关。

表位(epitope)又称抗原决定簇(antigenic determinant)是具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够被其识别的部位。在免疫应答中，B细胞表位可以刺激机体产生体液免疫反应，T细胞表位可以诱发机体产生CTL免疫应答反应。在先前的文献和专利中均有介绍，在治疗瘤重疾病或一些癌症疾病中，抗原表位起着重要的作用。但是一般而言，表位肽是包含但不局限于9个氨基酸(9aa)、10个氨基酸(10aa)、11个氨基酸(11aa)，其与MHC-I分子的亲和力不够高，并且因为肽段很短进而易被多种肽酶降解、半衰期短，使其在体内激发T细胞应答的效果不理想。为了解决以上困难，一般地，人们会在特异性抗原表位使用自身带有分子伴侣或是佐剂的蛋白分子(例如，热休克蛋白70等)修饰。但是我们最新的研究发现，将计算机预测的多个CRT优势表位组合的CRT组合肽可以无须添加分子伴侣或佐剂等蛋白分子直接注射，或可以无须添加HPV抗原直接诱导CTL细胞，并且所述CRT组合肽可有效杀伤HPV，并对感染HPV所导致的宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、息肉、疣等病变有疗效。具体地，所述CRT组合肽具有多个优势表位，可以多点杀伤靶细胞，进而有效解决单个抗原表位肽免疫原性低、易降解等缺点。这为HPV感染所致宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、息肉、疣等病变提供了新方法与新方向。

此外，本发明涉及的CRT的优势表位，具体地，本发明涉及六条CRT优势表位，分别为：CRT aa.6-14、CRT aa.1-9、CRT aa.8-16、CRT aa.13-21、CRT aa.313-321、CRT aa.195-203。更具体地，包含上述六条CRT优势表位的CRT组合肽的杀伤效果显著地高于包含上述三条、四条、五条CRT优势表位的CRT组合肽，我们定义为CRT优选组合肽。

发明内容

发明目的

本发明的一个目的在于提供CRT组合肽及其用途。具体地，所述“用途”是指CRT组合肽可以有效杀伤HPV，并对HPV引发的相关疾病有疗效。具体地，所述相关疾病包括但不局限于：宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、息肉、疣。

本发明的另一个目的在于提供一种核酸，该核酸能够编码本发明所述CRT组合肽。

本发明的另一个目的在于提供一种CRT组合肽，所述CRT组合肽由上述核酸编码。

本发明的另一个目的在于提供CRT的优势表位，具体地，所述CRT的优势表位为：CRT aa.6-14、CRT aa.1-9、CRT aa.8-16、CRT aa.13-21、CRT aa.313-321、CRT aa.195-203。

本发明所述的CRT组合肽包含上述CRT的任何两条、三条、四条、五条、六条优势表位组合的组合肽。

优选地，上述CRT组合肽优选六条优势表位组合的组合肽。

本发明的另一个目的在于提供一种本发明包含所述六条优势表位的所述CRT组合肽、核酸或者药物组合肽可有效杀伤HPV，并对HPV引发的相关疾病方面有疗效。

创新点

众所周知，钙网蛋白(calreticulin，CRT)可作为细胞内质网中钙结合蛋白和分子伴侣，同时CRT具有调节蛋白质折叠、钙稳态和细胞凋亡等生物学作用。作为一种佐剂CRT也可以提高抗原提呈效果。但是，本发明发现CRT优势表位组成的CRT组合肽可以直接作为药物注射，用于HPV转阴并有效杀伤HPV。具体地，本发明的有益效果为：

(1)我们通过计算机预测6条CRT优势表位，分别为CRT aa.6-14、CRT aa.1-9、CRTaa.8-16、CRT aa.13-21、CRT aa.313-321、CRT aa.195-203。具体地，所述6条CRT优势表位分别有4条位于N区(分别为CRT aa.6-14、CRT aa.1-9、CRT aa.8-16、CRT aa.13-21)、1条位于P区(CRT aa.195-203)、1条位于C区(CRT aa.313-321)。

(2)包含上述6条优势表位的CRT组合肽比包含任意两条或任意三条或任意四条或任意五条优势表位的CRT组合肽的HPV杀伤性更强，我们将包含上述6条优势表位的CRT组合肽定义为CRT优选组合肽。

附图说明：

图1接种TC-1-HPV16 E7的裸鼠施用不同浓度CRT组合肽的CTL杀伤率；

图2接种TC-1-HPV16 E7的裸鼠施用不同浓度CRT组合肽的瘤重；

图3接种TC-1-HPV16 E7的裸鼠施用最优浓度(20mg/ml)下三条、四条、五条和六条优势表位的CRT组合肽的杀伤率。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

在一些实施方案中，所述CRT组合肽选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列。

(1)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

(2)在上述(1)中的氨基酸序列中，具有1个以上5个以下(优选为4个以上、3个以下或2个以下)的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基酸序列；

(3)与上述(1)中的氨基酸序列具有80％以上(优选为90％以上、95％以上、98％以上或99％以上或100％)同源性(或同一性)的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述CRT组合肽是包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6中任意两条或任意三条或任意四条或任意五条或六条CRT组合肽。优选地，所述CRT组合肽为SEQ ID NO:1-6组合的组合肽(即SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列)。以下，我们将包含上述六条CRT优势表位的CRT组合肽(SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列)定义为CRT优选组合肽。

具体地，通过以下方式预测所述CRT优势表位：通过NCBI网站获得CRT的蛋白质序列(网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)。结合生物信息学分析CRT蛋白的MHC抗原结合表位，预测HLA-A*02：01限制性抗原决定簇，筛选出一致性高、特异性以及亲和力强、免疫原性以及抗原性好的CRT的肽片段作为T细胞表位候选片段。通过以上方法共预测6个CRT优势表位，分别为CRT aa.6-14(表示CRT的氨基酸序列的6-14位)、CRT aa.1-9(表示CRT的氨基酸序列的1-9位)、CRT aa.8-16(表示CRT的氨基酸序列的8-16位)、CRT aa.13-21、CRT aa.313-321(表示CRT的氨基酸序列的313-321位)、CRT aa.195-203(表示CRT的氨基酸序列的195-203位)。

根据本发明的实施方式，所述CRT组合肽的氨基酸序列为下述中的任意两条或任意三条或任意四条或任意五条或六条的氨基酸序列，优选地，CRT组合肽为SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列。

(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列PLLLGLLGL；

(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列LLGLLGLAV；

(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列GLAAEPAV；

(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列VLGLDLWQV；

(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列MLLSVPLLL；

(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列SLEDDWDFL；

在上述(1)中的氨基酸序列中，具有1个以上3个以下(优选为1个以上2个以下)的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基酸序列；

与上述(1)-(6)中的氨基酸序列具有80％以上(优选为90％以上、95％以上、98％以上或者99％以上)同源性(或同一性)的氨基酸序列。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述CRT组合肽为CRT优选组合肽，其序列为SEQ ID NO:7，具体氨基酸序列如下所示：

PLLLGLLGLLLGLLGLAVGLAAEPAVVLGLDLWQVMLLSVPLLLMLLSVPLLLSLE DDWDFL。

特别地，本发明所述CRT组合肽作为一种药物，无需添加任何例如白介素2(IL-2)、干扰素ɑ(IFN-ɑ)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)等细胞因子，可单独注射使用。通过体外诱导单个核细胞(PBMC)增殖并特异性杀伤HPV。其中所述HPV特异性的CTL细胞可以在体外抑制、杀伤HPV等细胞的生长。

本发明提供了一种核酸，所述核酸能够编码上述本发明的CRT组合肽。

作为上述核酸的序列没有特别的限定，只要其能够编码本发明提供的CRT组合肽即可，例如，上述核酸序列中编码本发明提供的CRT组合肽中的某一氨基酸的密码子还可以为该密码子的同义密码子。

本发明提供了一种药物组合肽，所述药物组合肽包含本发明所述的任一种CRT组合肽。作为所述药物组合肽，可作为疫苗组合肽使用直接注射。

本发明中，所述HPV相关疾病是哺乳动物所患的HPV感染引起的疾病，所述哺乳动物可以为灵长类动物和/或啮齿类动物，特别是人。

作为本发明的药物组合肽的剂型，可以为注射剂。

本发明的一个目的在于提供CRT组合肽的用途。具体地，所述“用途”是指CRT组合肽可以直接用于杀伤HPV，并对HPV引发的相关疾病有疗效。

在本发明中，给药上述本发明的CRT组合肽或者药物组合肽的方式没有特别的限定，例如给药方式可以选自皮下给药、皮内给药、粘膜内给药、粘膜下给药、肌肉内给药和/或腹腔内给药等任意一种形式。

本发明的另一个目的在于提供CRT组合肽作为一种新型HPV药物注射的优选剂量。

具体地，给药剂量取决于疾病的类型、严重度，以及取决于个体的特征(例如一般健康状态、年龄、性别、体重和对药物的耐受性)。

具体地，所述CRT组合肽的施用剂量范围可以为20-200μ1，优选地，所述CRT组合肽的施用的优选剂量可以为80-100μ1，更优选地，所述CRT组合肽混合物的施用的优选剂量可以为90-100μ1。但具体给药剂量取决于疾病的类型、严重度，以及取决于个体的特征(例如一般健康状态、年龄、性别、体重和对药物的耐受性)。

实施例1.CRT功能表位的在线预测

运用生物信息学方法进行CTL表位预测，主要是基于与MHC-I类分子结合特性的预测方法和针对抗原加工处理过程的表位预测方法，再通过后期的体内和体外的实验进行验证。基于抗原肽与MHC-I类分子结合特性的预测方法基序法(Binding motifs)、矩阵法(Matrices)、人工神经网络(Artificial neural networks,ANNs)和基于三维结构的表位预测算法；针对抗原加工处理过程的表位预测方法包括针对蛋白酶体裂解基序和TAP-肽亲和力的CTL表位预测工具。

目前鉴定CTL表位的方法一般为通过网络数据库预测表位，初步确定研究的范围，然后通过分子模拟的方法初步探讨置换或修饰多肽为模拟表位的可能性。最后通过体内和体外实验验证所鉴定表位的免疫原性。

本实施例通过SYFPEITHI数据库进行CTL表位初步预测，并结合PREDEPP数据库进行MHCI类结合基序以及多项式评分法综合预测CTL表位的方法非常普遍，并且可信度也较单一的SYFPEITHI数据库预测表位具有更高的可信度。具体地预测步骤可以概括为：使用SYFPEITHI数据库→PREDEPP数据库→基序法→多项式评分。

具体地，对于HLA-A*02：01，九肽的两个锚点分别位于肽链的第2位氨基酸残基和羧基末端(即第9位氨基酸残基)。第2位氨基酸残基应是亮氨酸(L)或蛋氨酸(M)，第9位氨基酸残基应是缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或L进行筛选。

多项式方案是指当某残基R出现在某肽的第I位时，不考虑其他肽序列的情况下，该残基对于整个肽与MHC-I类分子的结合自由能提供了一个常量Ri，用在第I位为残基R的大量多肽的IC50的负log10值的平均值在估计此常量。本发明选择分值大于-23(阈值)的抗原肽作为可能的候选肽。

通过上述方法可共预测6个CRT优势表位，分别为CRT aa.6-14、CRT aa.1-9、CRTaa.8-16、CRT aa.13-21、CRT aa.313-321、CRT aa.195-203。

使用Fmoc固相合成法人工合成CRT优势表位，具体地，所述CRT优选组合肽的序列为SEQ ID NO:7，具体氨基酸序列如下所示：

PLLLGLLGLLLGLLGLAVGLAAEPAVVLGLDLWQVMLLSVPLLLMLLSVPLLLSLE DDWDFL。

Fmoc固相合成法人工合成的CRT优选组合肽使用PBS溶解，浓度定为1mg/ml，过滤后备用。

实施例2.裸鼠实验

裸鼠移植瘤方案：

实验准备裸鼠25只，4-6周龄，体重15-20g，SPF级，并使用标准颗粒饲料喂养，饮水和所接触器材均经过消毒灭菌处理。25只裸鼠随机分配至实验组20只，其中分别定义为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4以及对照组(每组裸鼠5只)。

取TC-1-HPV16细胞，计数，调整细胞浓度至2×10⁶个/ml。于第1天在小鼠右侧后肢前皮下接种细胞100μl TC-1-HPV16细胞悬液，即每只2×10⁵个，接种后每隔2天观察一次移植瘤的生长情况。于接种TC-1-HPV16细胞悬液后第7天开始对裸鼠进行免疫。具体地，实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别使用浓度为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的CRT腹腔注射100μ1进行免疫。对照组裸鼠使用100μ1PBS进行对照。其中，CRT免疫治疗每隔三天注射一次，共注射6次。于接种移植瘤第30天处死小鼠，手术剥取肿瘤组织并称重拍照。同时取小鼠脾细胞进行CTL杀伤试验的检测。

HPV特异CTL活性的测定按照上述实验组、对照组裸鼠脾脏的单个淋巴细胞，将计数后的脾细胞置于6孔板中，分别用含有阳性刺激物PMA或CRT 1mg/ml、CRT 5mg/ml、CRT10mg/ml、CRT 20mg/ml的10％胎牛血清(IL-2)的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO2培养箱培养5天，分别作为实验组和对照组的效应细胞。靶细胞为TC-1-HPV16E7细胞。

结果显示：接种TC-1-HPV16E7细胞的裸鼠，在免疫CRT浓度为20mg/ml时，CTL杀伤率最大为61.32％，随着浓度的增加，杀伤率没有显著性变化，并且免疫浓度为20mg/ml CRT的裸鼠的瘤重也最低为0.01716g。由此推测，裸鼠免疫CRT的最优剂量为20mg/ml(图1、图2)。

上述实验结果表明，CRT作为一种药物可直接注射并可以有效杀伤移植裸鼠体内的TC-1-HPV16细胞。

进一步地，我们研究显示，本发明的CRT优选组合肽(SEQ ID NO:1-6)可以有效杀伤移植裸鼠体内的TC-1-HPV16细胞(以上述CRT的杀伤性作为对照)。具体地，基于裸鼠免疫CRT的最优剂量20mg/ml，准备上述裸鼠20只，同上接种TC-1-HPV16细胞，实验组接种TC-1-HPV16细胞悬液后第7天对裸鼠进行免疫。具体地，实验组分别使用浓度为20mg/ml的CRT组合肽(SEQ ID NO:1-6)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-3)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-4)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-5)腹腔注射，以相同浓度的CRT整段肽段为对照。所述CRT组合肽免疫治疗每隔三天注射一次，共注射6次。于接种移植瘤第30天处死小鼠，手术剥取肿瘤组织并称重并拍照。同时取小鼠脾细胞进行CTL杀伤试验的检测。

结果显示：接种TC-1-HPV16细胞的裸鼠在使用20mg/ml的CRT组合肽(SEQ ID NO:1-6)时的CTL杀伤率显著性的高于接种同等浓度的CRT组合肽(SEQ ID NO:1-3)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-4)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-5)(图3)，并与免疫CRT整段肽段的HPV杀伤性接近。并且接种20mg/ml的CRT组合肽(SEQ ID NO:1-6)的裸鼠的瘤重低于接种同等浓度的CRT组合肽(SEQ ID NO:1-3)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-4)、CRT组合肽(SEQ ID NO:1-5)的裸鼠的瘤重，并与免疫CRT整段肽段的瘤重接近。由此推测，所述CRT组合肽优选包含六条CRT优势表位的CRT组合肽(SEQ ID NO:1-6)并定义为CRT优选组合肽(图1-图3)。更具体地，所述CRT优选组合肽的疗效接近CRT整段肽段的疗效。进而从以下体外杀伤实验做进一步的验证CRT优选组合肽的疗效。

实施例3体外杀伤实验

CRT优选组合肽-CTL细胞免疫：

Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，纯度在90％以上，收获率可达80-90％，活细胞百分率在95％以上，并使用不同剂量的所述CRT优选组合肽进行诱导培养，收集细胞后ELISA试剂盒对其杀伤性进行检测。

具体地步骤如下：调节PBMC细胞浓度至2×10⁶个/ml并接种于培养瓶，置于37℃、5％的CO2培养箱孵育2小时，收集贴壁细胞以及悬浮细胞。

其中所述贴壁细胞使用rhGM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(500U/ml)的X-VIVO15培养液10ml置于37℃、5％的CO2培养箱中诱导，并于第3天补加添加rhGM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(500U/ml)的X-VIVO15培养液10ml。第5天于实验组1分别加入5μ1、10μ1、20μ1、100μ1终浓度为1mg/ml的CRT优选组合肽、对照组不加任何药物作为诱导。第6天加入终浓度为500U/ml的TNF-ɑ诱导DC成熟。最后于第7天收获成熟的DC细胞。

悬浮细胞重悬于无血清的X-VIVO15的培养液中，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，添加终浓度为1000U/ml的IFN-Υ，然后将培养瓶置于37℃、5％的CO2培养箱中孵育。于第2天添加终浓度为100U/ml的IL-1ɑ、终浓度为1000U/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的CD3单抗，培养至第5天时补加含有终浓度为1000U/ml的IL-2的无血清X-VIVO15的培养液。于第7天收获CTL杀伤细胞。

上述CTL细胞与DC细胞按数量比60:1的比例混合培养，并每隔3天补加含有终浓度为1000U/ml的IL-2的无血清X-VIVO15的培养液，共培养7天后得到靶向特异性CTL杀伤细胞。

CRT优选组合肽-CTL细胞的体外杀伤：

本试验使用的靶细胞为CaSki细胞。

具体地，将不同体积CRT优选组合肽诱导的CTL细胞作为实验组，无诱导的CTL细胞作为对照组。所述实验组和对照组细胞作为效应细胞。每组设3个复孔，使用含有10％FCS的RPMI-1640培养基补充至200μL。每孔加入1×10⁴个靶细胞50μL，然后按照效靶比5:1、10:1、20:1加入不同数量和体积的效应细胞。

CRT优选组合肽-CTL细胞体外杀伤HPV16的效果如下：

表1不同剂量的实验组CRT优选组合肽-CTL细胞杀伤率(％)

试验结果显示，5μ1、10μ1、20μ1以及100μ1的CRT优选组合肽诱导的CTL细胞在效靶比为5:1、10:1、20:1的平均杀伤率均高于对照组，并且差异具有统计学意义，即P<0.01，其中，在CRT优选组合肽为100μ1、效靶比在20:1时的杀伤性最强，为69.6±2.5(％)。进而我们推测，所述CRT优选组合肽的施用剂量范围为20-200μ1，优选地，所述CRT优选组合肽施用的优选剂量为80-100μ1，更具体地，所述CRT优选组合肽施用的优选剂量为90-100μ1；具体给药剂量要根据诸如一般健康状态、年龄、性别、体重和对药物的耐受性等具体特征确定。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 合肥瑞城生生物科技有限公司

<120> 一种钙网蛋白组合肽及其用途

<141> 2021-02-05

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Gly Leu Ala Ala Glu Pro Ala Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln Val

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu

1 5

<210> 7

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Val Gly Leu Ala Ala Glu Pro Ala Val Val Leu Gly Leu Asp Leu

20 25 30

Trp Gln Val Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Met Leu Leu Ser

35 40 45

Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu

50 55 60

Claims (10)

1.一种CRT组合肽，其特征在于，CRT组合肽包含SEQ ID NO:1-6中任意两条、任意三条、任意四条、任意五条或六条CRT优势表位；所述CRT优势表位分别为：

(1)SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；

(2)在上述(1)中的氨基酸序列中，具有1个以上3个以下的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基酸序列；

(3)与上述(1)中的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的CRT组合肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸能够编码权利要求1-2中任意一项所述的CRT组合肽。

4.一种药物组合肽，所述药物组合肽包含权利要求1-3中任意一项所述的CRT组合肽和/或核酸。

5.权利要求1-4中任意一项所述的CRT组合肽或核酸或药物组合肽应用，其特征在于，在杀伤HPV并对HPV引发的相关疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的CRT组合肽或核酸或药物组合肽应用，其特征在于，HPV引发的相关疾病包括但不局限于HPV感染所致宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、息肉和/或疣。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的CRT组合肽或核酸或药物组合肽，其特征在于，是注射剂。

8.根据权利要求1-4所述的CRT组合肽或核酸或药物组合肽，其特征在于，浓度为1mg/ml，施用剂量范围为20-200μ1，。

9.根据权利要求8所述的CRT组合肽或核酸或药物组合肽，其特征在于，浓度为1mg/ml，其施用剂量为80-100μ1。

10.根据权利要求9所述的CRT组合肽或核酸或药物组合肽，其特征在于，浓度为1mg/ml，其施用剂量为90-100μ1。

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