CN1679930A

CN1679930A - 人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白疫苗及其用途

Info

Publication number: CN1679930A
Application number: CN 200510004991
Authority: CN
Inventors: 赵清正; 千新来
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Beijing Yunhe Jinfan Technology Co ltd
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2025-01-31
Also published as: CN1299769C

Abstract

本发明涉及修饰的人乳头瘤病毒16型(HPV－16)E6/E7基因和改造的分枝结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因融合在一起所得到的融合基因，该融合基因的制备方法，含有该融合基因的高效表达载体的构建和表达载体，利用该融合基因所获得的重组蛋白疫苗，以及所述融合基因和重组蛋白疫苗在制备防治人乳头瘤病毒相关肿瘤药物中的应用。实验证实，本发明重组蛋白疫苗具有较强的免疫能力及抗肿瘤功能，且不需要与任何其它免疫佐剂联合应用。

Description

人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白疫苗及其用途

技术领域

本发明涉及一种人乳头瘤病毒和热休克蛋白融合基因、其表达载体和重组蛋白疫苗，尤其涉及修饰的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)E6/E7和改造的分枝结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)融合基因，该融合基因的制备方法，含有该融合基因的高效表达载体的构建和表达载体，利用该融合基因所获得的融合蛋白，以及所述融合基因和融合蛋白在制备防治人乳头瘤病毒相关疾病及肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病、多发病。目前肿瘤治疗中的三大常规治疗方法：手术、放疗和化疗虽已经有了一定的发展，但是，手术切除为局部治疗手段，而恶性肿瘤呈浸润性生长，且易经过血管和/或淋巴管发生远处转移，因而对于中晚期恶性肿瘤患者单纯手术很难达到完全清除癌细胞的目的；放疗也是以局部为主的治疗手段，同样存在手术治疗中的缺陷，且许多恶性肿瘤对放射治疗并不敏感；化疗是全身治疗手段，但是其面临着耐药和毒副作用大的缺点。因此，研究恶性肿瘤新的治疗措施及开发新的防治用生物药物是各国肿瘤学工作者关注的重要课题之一。

国内外大量流行病学和临床研究已经证明：HPV，特别是HPV16型，与宫颈癌、食管癌、肺癌、头颈部恶性肿瘤、胃贲门癌、皮肤癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、阴茎癌、肛门癌以及大肠癌等恶性肿瘤的发生密切相关。HPV与宫颈癌的病因学关系已经得到广泛的认可，HPV16型是引起宫颈癌的主要病毒病因。一个涉及上海、广州、北京、四川和香港5省市和地区的多中心研究(Int.J.Cancer，100：327-331，2002)的资料显示：在我国78.7-87.7％的宫颈癌患者有HPV感染，其中61.7-91.8％为HPV16感染。对HPV的致癌机理研究显示：HPV感染宿主细胞后，其两个癌基因E6和E7稳定整合到宿主细胞基因组DNA中并持续表达，这是HPV诱导细胞发生恶性转化和维持恶性表型的关键。因此，E6和E7成为人们研究癌变机理和防治用新生物制品的热点。研究还显示：用HPV的主要壳蛋白L1作为疫苗对预防HPV感染有效，但对已感染者无预防和治疗作用；该疫苗制备困难是其另一个缺点，因为VLP(病毒样颗粒)的制备耗时、耗材料、操作繁杂、需要经过3次超离心并且收率太低(仅为上超离心时蛋白总量的万分之二到万分之五)，因而给规模化批量生产带来了很多困难。近年来的研究表明，单独使用原核表达的E6或E7蛋白作为治疗性疫苗有一定的防治效果，研究者曾设想使用未改造的E6/E7融合蛋白作为疫苗以期提高防治效果，但由于E6本身或E6/E7融合蛋白表达水平太低而无应用价值。且由于是未经改造的野生型癌基因产物，其安全性受到人们的质疑。含有E6和E7基因的病毒，或以质粒为载体的DNA疫苗，由于可能整合到细胞基因组中，也存在安全性问题。用合成的多肽作为疫苗，成本高且受MHC限制，使用范围有限。

大量的研究显示：对于肿瘤等严重危害人类健康的疾病，免疫治疗是一种有效的方法。目前正在开发的多种高度纯化的新型疫苗虽具有良好的特异性和低毒性，但需要与高效的佐剂配合使用。对于佐剂的深入研究拓展了免疫治疗的空间。但是，一方面由于不同的佐剂即使对同样的抗原也可产生不同的效果；另一方面，由于对机体而言，佐剂是外源性物质，并且佐剂诱导的天然免疫应答特异性低，因此，可能引起一系列的毒副反应(包括局部炎症、长期难以消退的结节、囊肿、致瘤作用、致畸作用和交叉免疫反应等)。因此，佐剂的应用具有必须考虑的有效性、安全性、选择性、可控性及其它理论、技术和制造等问题。如：经典的铝佐剂虽与普通的疫苗联合使用在提高抗体水平和安全性方面已获得长期的实践证实，但其对基因工程蛋白或多肽在诱导细胞免疫能力方面则无作用，加上对其作用机理了解较少，使之很难满足新型疫苗的需要；再如，尽管弗氏不完全佐剂(IFA)在动物和人类中均证明是最成功的佐剂之一，但其可能的副作用人们仍有担心，如：应用局部常形成结节，甚至液化形成囊肿，有报道其在雄Swiss小鼠中有致瘤作用(BullWHO，1969；41：617-621)，但在BALB/c和C57BL/6小鼠中不致瘤，因而就安全性问题仍存在担心。最后，目前尽管已经开发了多种新型佐剂，但安全性及作用机理等仍有待深入研究。

大量的研究已经证明：热休克蛋白具有强有力的免疫原性，如：①从肿瘤或病毒感染细胞分离的hsps复合物可以诱导强有力的抗肿瘤或抗病毒免疫；②分枝杆菌感染时，有高频的以hsp70和60等为靶点的人CD4⁺T细胞出现；③hsps的多个鼠和人的B细胞和T细胞表位已经被鉴定，并可为哺乳动物细胞识别。这促使研究者利用hsps的这种特性发展感染性疾病疫苗和肿瘤免疫治疗的策略，同时也为其被用作无佐剂载体提供了依据。研究者将hsp70与疟疾小肽(NANP)40、HIV-1p24、卵清蛋白等共价连接后，在无其它佐剂条件下，激发了以这些肽或基因工程蛋白为靶点的特异性体液和细胞免疫反应。特异性CD8⁺CTL反应的诱导在抗肿瘤免疫中起重要作用，可能的机制有：①与hsp70共价连接的目的蛋白本身含有T细胞表位，由于附加了hsp70的T细胞表位，因而免疫原性更强；②与hsp70共价连接的目的蛋白含有多种已知或尚未知的抗原表位，可以充分发挥其作用；③hsp70融合蛋白可通过激活共享的专职抗原递呈细胞(APCs)，提供特异的同族CD4⁺辅助性T细胞，激活目的蛋白特异的CD8⁺CTL；④hsp70具有伴侣功能、可帮助蛋白折叠、可促进与之共价连接的蛋白泛素化而被很好的加工、TBhsp70融合蛋白可通过受体介导的内吞作用被专职的APCs摄取、hsp70融合蛋白可在体内外刺激专职APCs上调MHC I和II分子及共刺激分子的表达，这不仅有利于目的蛋白进入专职APCs并递呈到相应的细胞亚单位，而且有利于MHC-肽复合物的形成并递呈到细胞表面；⑤近年的研究(J.Exp.Med.，191：403-408，2000)显示：hsp70融合蛋白诱导目的蛋白的CD8⁺CTL反应，不仅不需要佐剂，也不需要其伴侣功能，还克服了MHC的限制，还不需要CD4⁺T细胞的帮助。综上所述，TBhsp70融合蛋白免疫治疗可以诱导CD8⁺CTL反应，不需要佐剂，不需要CD4⁺T细胞的帮助，不受MHC限制，不需要病毒载体，避免了DNA疫苗的DNA序列潜在的安全性问题，并且容易大量制备、安全性好。在加上恶性肿瘤患者自身免疫力低下，癌细胞MHC分子和共刺激分子等表达下调，HIV感染引起CD4⁺T细胞显著破坏等，这些都使得hsp70融合蛋白在发展抗肿瘤、抗HIV及其它感染性疾病的免疫治疗策略上具有明显的优势。

发明内容

本发明目的之一是克服现有技术的不足，提供一种能够有效治疗与HPV相关的肿瘤且不需要免疫佐剂的重组蛋白疫苗。

本发明目的之一是通过以下技术途径来实现的：

本发明的一种能够有效治疗与HPV相关的肿瘤且不需要免疫佐剂的重组蛋白疫苗，它是由hsp70蛋白中ATP结合位点161-370位氨基酸序列、人乳头瘤病毒E6蛋白1-120位的氨基酸序列和E7蛋白总共98个氨基酸序列连接而成，其中将E6蛋白第50位的亮氨酸修饰为甘氨酸，将E7蛋白的第24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸的分别修饰为甘氨酸；其中人乳头瘤病毒E6蛋白位于该重组蛋白的氨基端，hsp70蛋白位于该重组蛋白的羧基端。

本发明重组蛋白疫苗优选的具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

本发明重组蛋白疫苗具有较强的免疫能力及抗肿瘤功能，且不需要免疫佐剂。

本发明的目的之二是提供一种编码上述重组蛋白疫苗的融合基因。

本发明的目的之二是通过以下技术途径来实现的：

本发明的一种融合基因，由经改构并修饰的人乳头瘤病毒E6/E7基因和改造的分枝杆菌热休克蛋白70基因融合而成，该融合基因包括hsp70基因编码ATP结合位点的一部分(161-370氨基酸)的核苷酸序列；HPV的E6基因编码前1-120位的氨基酸的核苷酸序列，包括E6中的完整的B-表位(1-23aa)和2个CTL表位(29-38aa；52-61aa)；HPV的E7基因编码总共98个氨基酸的核苷酸序列，包括E7中的4个CTL表位(7-15aa；11-20aa；49-57aa和79-87aa)、Th表位(48-54aa)和3个B表位(1-18aa；25-37aa和43-60aa)。另外，E6基因的编码第50位赖氨酸、E7基因的编码第24位半胱氨酸和E7基因的编码第26位谷氨酸的密码子，采用定点突变方法进行基因突变，以去除其结合抑癌基因的作用，增加所表达重组蛋白疫苗的安全性。

本发明融合基因的特点是能够在宿主中高效表达目的融合蛋白且具有较强的免疫能力及抗癌功能。

该融合基因通过以下步骤制备：

(A)获取TBhsp70、E6和E7基因；

(B)将E6基因的编码第50位赖氨酸、E7基因的编码第24位半胱氨酸和E7基因的编码第26位谷氨酸的密码子进行定点突变；

(C)将TBhsp70基因编码ATP结合位点的一部分(161-370氨基酸)的核苷酸序列、E6基因编码前1-120位的氨基酸的核苷酸序列和E7基因编码总共98个氨基酸的核苷酸序列融合。

本发明的又一个目的是提供含有上述融合基因的表达载体及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明还有一个目的是提供上述重组蛋白疫苗和融合基因在医学中的应用。

本发明更进一步的目的是提供上述重组蛋白疫苗在制备治疗和/或预防HPV相关肿瘤药物中的应用。

本发明的人乳头瘤病毒E6/E7和分枝杆菌热休克蛋白70融合基因可用于制备安全、有效、能高效表达、容易大量制备的用于防治HPV相关肿瘤如宫颈癌等的蛋白疫苗，该蛋白疫苗诱导特异性CD8⁺CTL反应且不需要任何佐剂。由于恶性肿瘤患者自身免疫力低下，癌细胞MHC分子和共刺激分子等表达下调，因此，本发明重组蛋白疫苗在发展抗HPV相关肿瘤及其它感染性疾病免疫治疗策略上具有明显的优势。

附图说明

图1 SDS-PAGE分析mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白的表达、纯化及融合蛋白的鉴定(Western blot)

M：蛋白分子量标准；1：纯化的融合蛋白；2：BL21(DE3)空细菌诱导0小时；3、4：转PET30a(+)空载体的BL21(DE3)细菌诱导0小时、4小时；5、6：转PET30a(+)-mE6△/mE7/TBhsp70△重组质粒的BL21(DE3)细菌诱导0小时、4小时；7、8：E6、E7 Western blot鉴定

图2无佐剂重组mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗预防TC-1细胞的攻击和再攻击

-◆-PBS组

-■-hsp70△组

-▲-mE6△/mE7组

-■-mE6△/mE7/hsp70△组

图3无佐剂重组mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗预防TC-1肿瘤细胞的攻击(接种TC-1细胞43天后的肿瘤平均体积)

图4无佐剂重组mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗抑制已经形成的实体肿瘤的生长

-◆-PBS组

-■-mE6△/mE7/hsp70△组

以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

[实施例]

一、分枝杆菌热休克蛋白70基因、人乳头瘤病毒E6和E7基因的获得、改造及mE6△/mE7/hsp70△融合基因和重组原核表达质粒载体的构建

1.分枝杆菌热休克蛋白70基因的获得和改造

培养分枝结核杆菌，提取基因组DNA，用PCR方法扩增hsp70基因编码ATP结合位点的一部分(161-370氨基酸)的核苷酸序列(命名为TBhsp70△)，序列两端分别引入BamH I和Xho I限制性酶切位点，经序列分析后，与GeneBank比较序列一致。

2.人乳头瘤病毒E6和E7基因的获得

从HPV16阳性的宫颈癌患者肿瘤组织中提取基因组DNA，用PCR方法分别扩增E6和E7基因，经序列分析，E7基因DNA序列与国外报道一致，共编码98个氨基酸；E6基因DNA序列除了第259位的T→C外，其余于与国外报道一致，共编码158个氨基酸。该点突变导致编码的氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸(E6蛋白中第87位氨基酸)。该点突变位于E6已知表位之外，故对其免疫原性无影响。

3.人乳头瘤病毒E6和E7基因的定点突变

由于E6基因所编码的蛋白中的第50位的亮氨酸引起抑癌基因p53失活的关键位点，E7基因所编码的蛋白中的第24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸是抑癌基因Rb失活的关键位点，故通过定点突变的方法将这三个位点改变为甘氨酸。以去除其结合并灭活抑癌基因的活性，增加疫苗的安全性。突变后的E6和E7基因分别命名为mE6和mE7。

4.mE6△/mE7/TBhsp70△融合基因和重组原核表达质粒载体的构建

以上述mE6为模板用PCR方法扩增其编码前1-120位氨基酸的核苷酸序列，并在其5′端引入NcoI限制性酶切位点。然后用PCR分段延长方法在mE6△的3′端逐步加上E7基因编码总共98个氨基酸的核苷酸序列，并在其3′端加上BamH I限制性酶切位点。经序列分析证明所获得的融合基因序列正确无误，保留了突变位点。命名为mE6△/mE7。然后用Nco I和BamH II分别双酶切PET30a(+)质粒和mE6△/mE7融合基因，回收后，用T4 DNA连接酶12℃连接过夜，转化DH5α感受态细菌，在氨苄青霉素LB琼脂平板上筛选阳性克隆，挑取单菌落扩增并提取重组质粒载体。命名为PET30a(+)-mE6△/mE7。用BamH I和Xho I分别双酶切hsp70△和PET30a(+)-mE6△/mE7，回收，同上连接、转化、筛选、挑取单菌落扩增并提取重组质粒。命名为PET30a(+)-mE6△/mE7/TBhsp70△。至此，成功构建了mE6△/mE7/TBhsp70△融合基因(测序结果见SEQ ID NO：1)及其重组原核表达质粒载体。同时构建的仅含TBhsp70△的重组质粒载体命名为PET30a(+)-TBhsp70△。

二、高效表达工程菌的构建及融合蛋白的表达鉴定

将上述构建的重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，并随机挑取80个单菌落观察表达情况。37℃摇菌至OD₆₀₀为0.5-0.6时，用1mM(终浓度)的IPTG诱导蛋白表达，4小时后取样走SDS-PAGE电泳(12.5％)，然后用考马氏亮蓝染色，脱色液脱色后可见约52KD的融合蛋白条带(图1)。然后用抗his-tag、HPV16E6和E7的单克隆抗体(Santa Cruz公司)分别对表达的蛋白进行Western blot分析鉴定(图1)，证明该蛋白是目的融合蛋白，且分子量与预计相符。再用同样条件进行发酵，取不同时间点(1-5小时)的样品经SDS-PAGE电泳分析，同时与已知浓度的BSA为参照标准同时进行电泳，经染色及脱色后，用自动成像扫描仪进行光密度分析，当发酵培养4小时后，目的蛋白表达达饱和状态，占菌体总量的30％左右。进一步的实验证明该融合蛋白以包含体的形式存在。

三、蛋白产物的纯化和透析复性(以100ml培养的细菌为例)

1.诱导及收获细胞

37℃培养高效表达工程菌至OD₆₀₀为0.5-0.6时，用1mM(终浓度)的IPTG诱导蛋白表达，4小时后离心收获细胞，用裂解缓冲液(150mM NaCL，NP401％，脱氧胆酸0.5％，SDS 0.1％)重悬细胞并在冰浴中进一步超声破碎细胞。

2.包含体的制备及溶解

12000g，4℃离心，20分钟，弃去上清，用10ml变性抽取/洗涤缓冲液(50mMNa₃PO₄，6M盐酸胍，300mM NaCL)冰上充分溶解沉淀；12000g，4℃离心，20分钟，保存上清于4℃冰箱中。

3.平衡树脂及上载融合蛋白

取6ml亲和层析介质即TALON^TMMetal亲和层析树脂储存液，3600g，4℃离心，5分钟；用10ml变性抽取/洗涤缓冲液平衡2次，将含包含体的溶液与树脂混合，用10ml变性抽取/洗涤缓冲液洗2次后，小心装入层析柱中。

4.洗涤杂蛋白和洗脱融合蛋白

用20ml变性抽取/洗涤缓冲液洗涤层析柱，流速：0.5ml/分钟；用20ml咪唑洗脱缓冲液(45mM Na₃PO₄，5.4M盐酸胍，270mM NaCL，150ml咪唑)洗脱融合蛋白，流速：0.3ml/分钟，分步收集，每管0.5ml。

5.透析复性及蛋白浓缩

将洗脱的融合蛋白溶液装入透析袋，对含不同浓度的盐酸胍的PBS进行透析，逐级降低盐酸胍的浓度直至对不含盐酸胍的PBS进行透析。透析完成后用PEG20000浓缩融合蛋白至需要的浓度。

6.融合蛋白纯度鉴定和定量

取透析复性并浓缩的蛋白溶液5-10ul进行SDS-PAGE电泳分析(图1)蛋白的纯度(＞95％)，按Bradford方法测定蛋白浓度。

用以上方法反复试验，融合蛋白回收率在50-60％。用1L发酵液，按比例放大上述步骤，最终可得产品(纯度＞95％)150-180mg。

[试验例1]本发明融合蛋白疫苗预防肿瘤效果试验

将C57BL/6雌性小鼠(购自中国医学科学院实验动物中心，体重18-20克)随机分为四组：PBS组、TBhsp70△组、mE6△/mE7组和mE6△/mE7/TBhsp70△组，每组10只。分别用PBS(0.2ml)、TBhsp70△(含1.5nM蛋白的PBS0.2ml)、mE6△/mE7(含1.5nM蛋白的PBS0.2ml)、mE6△/mE7/TBhsp70△(含1.5nM融合蛋白的0.2mlPBS)经皮下注射(腹股沟处)进行免疫，第一次免疫2周后，同上加强免疫一次，加强免疫2周后，用6×10⁴TC-1肿瘤细胞于皮下右肋腹侧进行攻击(TC-1是用HPV16型E6和E7基因及激活的Ras癌基因转化而成的小鼠肿瘤细胞，由美国Johns Hopkins大学吴博士惠赠)，观察实验动物出瘤时间、测量肿瘤大小并计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长径×短径²/2。结果显示：mE6△/mE7/hsp70△组出瘤时间晚，7只至实验结束(43天)未见肿瘤生长，3只虽长出肿瘤，但其中2只又完全消退，即至实验结束仅有1只荷瘤鼠。而3个对照组所有实验动物均有肿瘤生长(图2)。实验第43天时PBS组、hsp70△组、mE6△/mE7组和mE6△/mE7/hsp70△组肿瘤平均体积分别为：3835.2±172.7mm³、3685.3±158.6mm³、3135.3±181.7mm³和10mm³(图3)。实验第51天，用更大剂量的TC-1肿瘤细胞对mE6△/mE7/hsp70△组9只无瘤鼠进行再攻击，结果显示：有2只小鼠有一过性的肿瘤生长，但之后又完全消退(图2)。

以上结果说明：无佐剂mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫后，可以使免疫实验动物产生强有力的特异性抗肿瘤免疫反应，该免疫反应可排斥癌细胞的攻击，防止肿瘤的形成，因而具有预防作用。可用于在HPV16感染的高危人群防止HPV相关肿瘤的发生。

[试验例2]本发明融合蛋白疫苗抑制肿瘤的生长作用试验

鉴于预防实验结果已经说明单用hsp70△或mE6△/mE7实验动物均不能产生特异性的抗肿瘤免疫反应，所以随后的研究不再单独设组。实验动物、免疫方法等同上。先将20只小鼠于皮下右肋腹侧接种TC-1肿瘤细胞，1.3×10⁵/只，待肿瘤平均体积达5mm³时，随机分组，10只/组，并进行第一次免疫，2周后加强免疫一次。观察肿瘤大小和小鼠生存时间，按上述公式计算肿瘤体积。结果显示：mE6△/mE7/hsp70△组肿瘤生长明显受到抑制，实验第35天时PBS组和mE6△/mE7/hsp70△组肿瘤平均体积分别为：3508.4±156.9mm³和408.5±80.3mm³(图4)，PBS组和mE6△/mE7/hsp70△组荷瘤鼠平均生存时间分别为：34.2天和80.8天，其中mE6△/mE7/hsp70△组有2只动物肿瘤完全消退，获得长期生存。

以上结果说明：无佐剂mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫，可以使免疫实验动物产生强有力的特异性抗肿瘤免疫反应，该免疫反应可以明显抑制已经形成的实体肿瘤的生长，因而具有治疗作用。可用于HPV相关肿瘤的治疗。

[试验例3]本发明融合蛋白疫苗对肿瘤转移的预防和治疗作用

实验动物和免疫方法同试验例2，先免疫2次，4周后尾静脉注射TC-1肿瘤细胞(2×10⁴/只)，接种TC-1细胞5周后处死小鼠观察肺转移情况(如果肉眼未见转移则将肺全部包埋，连续切片观察镜下转移情况)。结果显示：PBS组10只小鼠全部发生肺转移(其中7只肉眼可见转移灶，3只在显微镜下可见肺转移)；mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白组有2只在显微镜下可见转移，8只肉眼和镜下均没有转移(表1)。

表1

组别	肉眼转移	镜下转移	无转移	转移率(％)
组别	肉眼转移	镜下转移	无转移	转移率(％)	PBS组mE6△/mE7/hsp70△	70	32	08	10020

说明无佐剂mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫后，可以使免疫实验动物产生强有力的特异性抗肿瘤免疫反应，该免疫反应可以防止肿瘤细胞的转移，因而具有预防转移的作用。可用于HPV相关肿瘤细胞转移的预防。

先尾静脉注射TC-1肿瘤细胞(2×10⁴/只)，1周后随机分组，每组10只，治疗分2组，一组在给TC-1细胞1周后开始免疫(治疗1组)，另一组在给TC-1细胞5周后开始免疫(治疗2组)，各组均在免疫5周后处死小鼠观察肺转移情况(如果肉眼未见转移则将肺全部包埋，连续切片观察镜下转移情况。结果显示：PBS组10只小鼠全部发生肺转移(其中8只肉眼可见转移灶，2只在显微镜下可见肺转移)；治疗1组有1只可见肉眼转移，2只在显微镜下可见转移，7只肉眼和镜下均没有转移；治疗2组有2只可见肉眼转移，3只在显微镜下可见转移，5只肉眼和镜下均没有转移(表2)。

表2

组别	肉眼转移	镜下转移	无转移	转移率(％)
组别	肉眼转移	镜下转移	无转移	转移率(％)	PBS组mE6△/mE7/hsp70△(治疗1组)mE6△/mE7/hsp70△(治疗2组)	812	223	075	1003050

说明无佐剂mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫后，可以使免疫实验动物产生强有力的特异性抗肿瘤免疫反应，该免疫反应可抑制转移性肿瘤的生长，因而对肿瘤转移有作用。可用于HPV相关肿瘤细胞转移的治疗。

综上，本发明的优点是人乳头瘤病毒E6/E7和分枝杆菌热休克蛋白70融合基因可用于制备安全、有效、能高效表达、容易大量制备的用于预防和治疗HPV相关肿瘤(如宫颈癌等)及其转移的融合蛋白疫苗，本发明重组蛋白疫苗诱导特异性CD8⁺CTL反应不需要佐剂。由于恶性肿瘤患者自身免疫力低下，癌细胞MHC分子和共刺激分子等表达下调，再加上目前对于蛋白疫苗来讲，最佳的佐剂和载体的缺乏已经严重困扰了蛋白疫苗的发展，因此，本发明重组蛋白疫苗在发展抗HPV相关肿瘤及其它感染性疾病免疫治疗策略上具有明显的优势。无疑具有重要的临床应用价值。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所

<120>人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白疫苗及其用途

<130>20050126

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1293

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60

cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120

aagcaacagt tactgcgacg tgaggtaggt gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180

tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240

agtgagtata gacattatcg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300

aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 420

gatctctacg gttatggtca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 480

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 540

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 600

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accaaagctt 660

gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg 720

ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc 780

ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc 840

ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag 900

gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc 960

gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg 1020

atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc 1080

ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgcca 1140

序列表

gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aaccaaacaa gggcgtcaac 1200

ccagatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg 1260

aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg taa 1293

<210>2

<211>430

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Gly Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Arg Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu

115 120 125

His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly

130 135 140

Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly

145 150 155 160

Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr

165 170 175

序列表

Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr

180 185 190

His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly

195 200 205

Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Lys Leu Glu Lys Glu Gln

210 215 220

Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu

225 230 235 240

Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp

245 250 255

Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val Val Asp Trp Leu

260 265 270

Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu Thr Lys Asp Lys

275 280 285

Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu

290 295 300

Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Val

305 310 315 320

Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln Leu Thr Arg Ala

325 330 335

Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg Thr Arg Lys Pro

340 345 350

Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val Ser Glu Ile Asp

355 360 365

His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro Ala Val Thr Asp

370 375 380

Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn

385 390 395 400

序列表

Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu

405 410 415

Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro

420 425 430

Claims

1、一种重组蛋白疫苗，该重组蛋白疫苗是由hsp70蛋白中ATP结合位点161-370位氨基酸序列、人乳头瘤病毒E6蛋白1-120位的氨基酸序列和E7蛋白总共98个氨基酸序列连接而成，其中将E6蛋白第50位的亮氨酸修饰为甘氨酸，将E7蛋白的第24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸的分别修饰为甘氨酸。

2、按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其特征是选自下述任一氨基酸序列：1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；2)在严紧的杂交条件下与编码1)的氨基酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

3、按照权利要求2所述的重组蛋白疫苗，其特征是选自下述氨基酸序列：SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4、按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其特征是：人乳头瘤病毒E6蛋白位于该重组蛋白的氨基端，hsp70蛋白位于该重组蛋白的羧基端。

5、编码权利要求1～4任意一项重组蛋白疫苗的核苷酸序列。

6、按照权利要求5所述的核苷酸序列，其特征是具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

7、含有权利要求5～6任意一项所述核苷酸序列的表达载体。

8、含有权利要求7所述表达载体的宿主细胞。

9、权利要求1～4任意一项所述的重组蛋白疫苗在制备治疗和/或预防与人乳头瘤病毒相关的疾病及肿瘤药物中的用途。

10、权利要求5～6任意一项所述的核苷酸序列在制备治疗和/或预防与人乳头瘤病毒相关的肿瘤药物中的用途。