CN118339190A - Ccl11的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及CCL11靶向递送抗原形成的免疫增强递送系统。该系统是趋化因子CCL11融合相应抗原分子，并在抗原分子末端添加T2标签，以这种方式进一步增强免疫原性。该系统可以是核酸载体或者是融合蛋白等形式应用于相应抗原所引起的疾病的预防和/或治疗。本发明利用CCL11与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将不同的抗原蛋白转运到DC细胞表面，提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。本发明关键点在于给抗原中添加的T2序列可以增强免疫效果。

Description

CCL11的用途
本申请要求于2022年01月24日提交中国专利局、申请号为202210076816.7、发明名称为“CCL5的用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及CCL11靶向递送抗原形成的免疫增强递送系统。
背景技术
人体时刻面对着外界治病微生物的攻击以及自身正常细胞的癌变。免疫系统是人体应对病原微生物以及自身肿瘤细胞的有力武器。免疫系统的应答过程包括识别，反应以及效应三个阶段。每个阶段由人体组成免疫系统的蛋白，细胞，组织和器官协调完成。在整个应答过程中的识别阶段，免疫系统需要对自身抗原和病原进行区分，以免产生对自身的攻击。识别之后会进入针对特定病原的反应阶段，包括产生大量的蛋白以及特异性细胞。这些蛋白和细胞在效应阶段对病原进行清除并形成针对相应病原的免疫记忆。
病毒、细菌、真菌和寄生虫等病原微生物经常会引起大规模流行性疾病。譬如2019年底爆发的SARS-CoV-2已经在全球范围内传播。病原微生物侵入人体后有的诱发一过性疾病不在人体长期潜伏，但有的病原体会在人体细胞，组织内长期潜伏并引起相应的疾病。因而需要预防性疫苗预防病原微生物的传播，需要治疗性疫苗治疗清除病原微生物所寄宿的细胞。这需要免疫系统产生体液免疫以及细胞免疫反应。而措施正是利用病原微生物的特异性抗原注射人体引起免疫识别。并且既往的经验告诉我们引起的免疫反应越强则疫苗的预防和治疗效果越好。
CCL11属于CC家族趋化因子成员。主要表达在小肠，心脏和肾脏以及胰腺。TNFa和IL-4等促炎症细胞因子可以上调CCL11的表达。CCL11发挥趋化功能主要通过其受体CCR3。研究表明CCR3表达在DC细胞以及嗜酸性粒细胞中DC细胞是专职抗原提呈细胞主要介导抗原的识别。嗜酸性粒细胞除具有经典抗菌作用外，还可以与增强特异性T细胞免疫反应介导抗肿瘤免疫反应。基于以上将抗原分子与CCL11相融合会增强抗原的免疫原性，启动更强的免疫应答，为更强效力的疫苗制备提供选择。
树突状细胞(DC)是专职抗原提呈细胞，是组成免疫系统的重要成分。他们在血液中循环同时也驻留在全身各处，主要负责吞噬，加工和呈递抗原。在免疫识别阶段发挥至关重要的作用。DC细胞对抗原的识别程度决定着免疫反应的强弱。
肿瘤起源于自身组织细胞因而很难被免疫系统所识别，但肿瘤细胞相比于正常组织细胞通常会高表达或者突变某些促癌基因以促进肿瘤细胞的增殖、存活。这些高表 达或者突变的基因产物通常只具有很弱的免疫原性，因而不会引起很强的免疫应答去消除这些肿瘤细胞。因而如何调动免疫系统产生强力的免疫反应成为清除肿瘤的关键。
肿瘤疫苗通过免疫增强已有的抗肿瘤反应或启动初始T细胞来诱导患者的效应T细胞功能，抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在抗肿瘤过程中发挥重要作用。DC细胞是唯一能激活初始CD8+T细胞的专职抗原呈递细胞，对细胞外肿瘤抗原通过MHC-I进行摄取、加工和交叉提呈，对产生有效的CTL至关重要。因此，通过偶联DC细胞表面分子将肿瘤抗原递送至DC细胞是有效诱导CD8+T细胞免疫应答的肿瘤治疗策略。
目前，已经探明的能够对DC细胞的递呈起到增强作用的分子包括XCL-1，但仍亟待探明更多的能够起到促进递呈作用的DC细胞表面分子。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供T2片段和/或CCL11靶向递送抗原形成的免疫增强递送系统。
本发明提供了：
如I)～VI)中的至少一种在提高抗原递呈效果中的应用；
I)、如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的T2片段；
II)、趋化因子CCL11；
III)、与I)或II)具有80％以上同源性，且具有相同或相似功能的片段；
IV)、编码I)或II)的核酸分子；
V)、在IV)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；
VI)、与V)完全互补或部分互补的核酸分子。
本发明中，T2片段由31个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO：4。研究表明，经过人工改造后的T2片段具有增强人体内免疫的效果。
本发明中，所述CCL11为趋化因子CCL11，其来自于人类或其他动物，其为全长序列，或具有CCL11活性的部分片段。本发明发现，CCL11能够递送抗原到DC细胞，从而提高递呈效果，增强免疫反应。
本发明还提供了一种融合蛋白，其包括CCL11和抗原。或包括CCL11、抗原和T2片段。
本发明实施例，所述融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、CCL11、linker、抗原和T2片段。
本发明中，所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤。
本发明中，所述CCL11为人源CCL11序列，所述抗原为HPV16的E6蛋白和/或HPV16的E7蛋白。
一些实施例中，所述融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、CCL11、linker、 HPV16的E6蛋白、HPV16的E7蛋白和T2片段。
一些具体实施例中，所述IgE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述CCL11的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述linker为(G 5S)n，其中n为1～10；本发明实施例中，所述linker序列为GGGGGSGGGGG。
所述HPV16的E6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述HPV16的E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
一些具体实施例中，所述融合蛋白的C端还包括FLAG标签序列，其氨基酸序列为DYKDDDDK，但该序列只为鉴定蛋白表达的标签不影响序列的免疫效果。
本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸。
本发明所述的编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本发明提供了一种核酸片段，其包括编码本发明所述融合蛋白的核酸、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA。其中，所述5’-UTR为β-globin-2，所述3’-UTR为2β-globin，所述3’-端PolyA的长度为120bp。所述核酸片段的结构为5’UTR-CCL11-E6E7-3’UTR-A(120)。
本发明还提供了含有编码所述融合蛋白的转录单元。
所述转录单元中包括启动子和编码所述融合蛋白的核酸。
一些实施例中，所述转录单元还包括终止子。
一些具体实施例中，所述启动子为CMV或者CMV/R启动子。
本发明还提供了表达载体，其包括骨架载体和编码所述融合蛋白的核酸。
本发明中，所述骨架载体选自pVAX1系列载体、或pVR系列载体。
本发明还提供了转化或转染所述重组载体的重组宿主。
本发明所述重组宿主的宿主细胞为细菌或哺乳动物细胞。
本发明所述融合蛋白的制备方法，其包括培养本发明所述重组宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。
本发明提供了一种将病毒、细菌、真菌、肿瘤等抗原物质输送到CCR3阳性抗原提呈细胞中的递送系统。该系统由趋化因子CCL11融合相应抗原分子，并在抗原分子末端添加T2标签以进一步增强免疫原性，该系统可以是核酸载体或者是融合蛋白形式用于相应抗原所引起疾病的预防或治疗。
本发明提供了一种抗原递送系统在制备预防或治疗性疫苗中的用途，所述输送系统包括：与CCR3结合的配体CCL11。
本发明所述的融合蛋白、核酸、表达载体、宿主、权所述制备方法制得的融合蛋白，和/或所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物在制备防治疾病的产品中的应用。
本发明还提供了一种防治疾病的产品，其包括：所述的融合蛋白、核酸、表达载体、宿主、所述制备方法制得的融合蛋白，和/或所述制备方法制得的含有所述融合 蛋白的培养物。
本发明还提供了一种防治疾病的方法，其为给予本发明所述的防治疾病的产品。
本发明中，所述防治包括预防和/或治疗，具体包括提高血清中抗体水平、预防肿瘤的形成、抑制肿瘤生长，提高机体对肿瘤的免疫反应能力。
本发明中，所述疾病包括由病毒和/或病原菌引起的疾病。或者所述疾病为肿瘤。
本发明中，所述防治疾病的产品包括药物和/或疫苗。本发明中，所述疫苗为DNA疫苗、重组蛋白疫苗或mRNA疫苗。
本发明中，所述给予的方式包括口服、注射和/或电转。
相关研究和多方实验都显示出并非所有CC家族趋化因子成员都可以与抗原分子融合来增强免疫原性；只有部分会与抗原分子相融合去增强抗原的免疫原性，启动更强的免疫应答，为更强效力的疫苗制备提供选择。例如相关研究指出4-1BBL-S、4-1BBL-Fc、CD80-Fc等与抗原分子相融合会较大程度增强抗原的免疫原性，但是GM-CSF、mlL-23、IL-15SAG1等与抗原分子相融合不具有增强免疫原性的作用。
本发明利用CCL11与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将不同的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。本发明中的T2序列经实验测定其具有非常强的免疫增强效果，可以在促进抗原呈递的过程中进一步激发体液和细胞免疫反应，最终达到抑制相关肿瘤生长的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1示CCL11趋化DC细胞和嗜酸性粒细胞能力分析；
图2示编码融合蛋白核苷酸的载体图谱；其中图2中的A示pVR-CCL11-E6E7-T2、图2中的B示pVR-CCL11-E6E7、图2中的C示pVR-E6E7的质粒图谱；
图3示检测pVR-CCL11-E6E7-T2、pVR-CCL11-E6E7和pVR-E6E7的三种质粒目的基因的表达情况，利用蛋白免疫印迹技术(Westernblot)检测C端带有Flag标签的融合蛋白编码核苷酸的表达情况；
图4示不同融合基因对小鼠进行预防型免疫用于后期测试特异性T细胞反应的时间轴；
图5示不同融合基因对小鼠进行免疫后特异性T细胞反应的流式检测结果；
图6示不同融合基因对小鼠进行免疫后特异性抗体反应的检测结果；
图7示不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行治疗型免疫和接瘤时间轴；
图8示各组处理的细胞瘤体积。
具体实施方式
本发明提供了CCL11靶向递送抗原形成的免疫增强递送系统，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明所述CCL11是一种人体内重要的趋化因子，它属于CC趋化因子家族(CC chemokines)中的一员，其可以特异性的在人体心脏和肾脏高水平表达。本发明研究表明CCL11能够用于递送物质到专职抗原提呈细胞，特别是DC细胞和嗜酸性粒细胞从而增强DC细胞的递呈效果和T细胞的招募效果。
本发明中，所述CCL11可为人源片段，也可为其他动物来源的片段，例如鼠源，兔源、猴源、猪源等，其可为完整的CCL11，也可为其中具有CCL11活性的片段或突变体，本申请对此不做限定。本申请实施例中，以人源CCL11为实验对象，验证CCL11对抗原的递呈效果的提高。所述人源CCL11的氨基酸序列为：SEQ ID NO：3。
本发明所述融合蛋白中，所述T2序列是由T4噬菌体纤维蛋白C末端的一段短肽(T4 phageheadfibritin)改造而来，种属来源属于外源序列，该序列在人体内完全没有，不会出现增强免疫后对人体其他蛋白造成杀伤的问题。有报道认为该序列可以在某些情况下促进某些蛋白的三聚体化。本发明中发现T2这段作为经过人工改造后的多肽序列具有人体内的免疫增强效果。本发明中，T2片段由31个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO：4。
本发明所述融合蛋白中的抗原的个数至少为1个。例如，可为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个及以上。在本发明的研究中，对1个或2个抗原的融合效果进行实验，都表现出良好的效果。
本发明所述抗原来自病毒、细菌、真菌、寄生虫和/或肿瘤的蛋白。一些实施例中，所述抗原来自病毒的衣壳蛋白或非结构蛋白、病原菌的膜蛋白、鞭毛蛋白或肿瘤的表面抗原。其可为的完整片段，也可为其抗原决定簇。其可仅含有一个抗原决定簇，也可以由多个抗原决定簇串联而成，也可以为一个抗原决定簇重复串联两次或以上。
本发明中，所述病毒包括但不限于HPV病毒、HCMV、EBV、HCV、HIV、HBV、VZV和/或冠状病毒中至少一种；
本发明中，所述肿瘤包括但不限于肝癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、血液肿瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和/或结直肠癌中至少一种。
一些实施例中，所述抗原为HPV病毒的E2、E5、E6和/或E7蛋白或其突变表位。 所述HPV病毒包括各种亚型的HPV病毒，例如，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和/或HPV58型。
一些实施例中，所述抗原为EB病毒的LMP1、LMP2、EBNA1或其突变表位。
一些实施例中，所述抗原为冠状病毒的S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白或其表位。所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV和/或SARS-CoV-2。
一些实施例中，所述抗原为VEGFR2，Survivin，FAP等泛癌蛋白
一些实施例中，所述抗原为肝癌的GPC3蛋白和/或AFP蛋白。
一些实施例中，所述抗原为前列腺癌的PSA，PSMA，PSCA，PAP和/或STEAP1。
一些实施例中，所述抗原为乳腺癌的Her2/neu和/或BCAR3的优势表位。
一些实施例中，所述抗原为黑色素瘤的MAGE-A3，ISR2，NY-ESO-1，Melan A，gp100，Tyrosinase，TRP1和/或TRP2。
一些实施例中，所述抗原为血癌的Immunoglobulin idiotype，Immunoglobulinκ-Chain和/或Immunoglobulinλ-chain。
一些实施例中，所述抗原为结直肠癌的AIM2，HT001，TAF1B，Micoryx和/或TGFβRII。
一些实施例中，所述抗原为卵巢癌的folate receptor-α。
一些实施例中，所述抗原为多种原癌基因、抑癌基因和/或肿瘤特异性抗原的P53，IDH1/2，BAGE，GAGE1，GAGE2，CAG3，RAGE，CEA，CDK4，CASP-8，KRAS，bcr/abl和/或MUC-1。
本发明利用CCL11与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将上述的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，从而提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。在此前的预实验中，上述蛋白中包括HPV16的E6或E7的蛋白在内的多个抗原的递呈效率已经被验证能够被CCL11提高。本发明实施例中，以HPV16的E6和E7蛋白为案例，证明CCL11对抗原蛋白递呈效率的提高效果，其他蛋白与CCL11融合后也会起到良好的效果。
本发明中为了保证融合蛋白中各功能片段不受空间位阻影响而顺利地折叠，在片段间添加linker，其中，CCL11与HPV病毒抗原蛋白之间的linker为GGGGGSGGGGG。不同抗原之间可以通过(G 5S)n和/或AGA相连。
在本发明中，为了提高融合蛋白的表达效果，在CCL11的N端添加促使融合蛋白分泌到胞外的信号肽。一些实施例中，所述信号肽为IgE信号肽。具体的，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5
在本发明中，为了方便融合蛋白的纯化，在融合蛋白的C端添加标签。所述标签选自本领域熟知的重组蛋白纯化标签。一些实施例中，所述标签为DYKDDDDK。
一些具体实施例中，所述融合蛋白的结构为自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CCL11蛋白序列、linker序列(GGGGGSGGGGG)、E6E7蛋白序列、T2蛋白序列、Flag标签序列。具体的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15。
本发明所述的编码蛋白的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA或RNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。
在本发明中，对表达融合蛋白的DNA序列进行了优化，这些优化包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。
本发明所述的预防是指在肿瘤发生前给予本发明所述的药物能够起到降低肿瘤发生风险的作用。本发明所述的治疗是指在肿瘤发生之后给予本发明所述的药物，能够抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积或延缓肿瘤的生长速度。本发明实施例中，以小鼠移植瘤细胞TC-1为实验对象，验证融合蛋白疫苗的效果。
本发明中还提供了融合蛋白的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。本发明提供的转录单元中，包括CMV或CMV/R启动子、CMV增强子和编码融合蛋白的核酸片段。
本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中，编码本发明提供的融合蛋白的核酸可构建于各种真核表达载体中。例如，其骨架载体可以是pVAX1系列载体、或pVR系列载体(参见中国专利ZL 202110624820.8)。
本发明所述的宿主细胞，为含有核酸载体和/或目标基因的原核或真核宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。
本发明实施例中，所述融合蛋白的制备方法采用诱导重组宿主表达的方式，所述培养物可以为培养获得的菌体、细胞体、培养液、或者有上述培养物中经提取和/或纯化获得的物质。
本发明提供的防治疾病的产品包括：所述的融合蛋白、核酸、表达载体、宿主、所述制备方法制得的融合蛋白，和/或所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物。本发明中，所述防治疾病的产品包括药物和/或疫苗。所述疫苗中还包括药学上可接受的运载体、赋形剂和/或佐剂。所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
本发明所述的预防是指在疾病发生前给予本发明所述的防治疾病的产品，从而能够起到降低疾病发生风险的作用。本发明所述的治疗是指在疾病发生之后给予本发明所述的防治疾病的产品，能够改善病症，抑制疾病发展，使患者恢复健康。例如，将本发明所述的产品用于防治肿瘤，能够提高血清中抗体水平、抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积或延缓肿瘤的生长速度。本发明实施例中，以小鼠移植瘤细胞TC-1为实验对象，验证融合蛋白疫苗的效果并获得良好的效果。
本发明实施例中，涉及的片段的氨基酸序列和编码的核酸片段如表1：
表1本发明涉及的氨基酸序列和编码的核酸片段
SEQ ID NO.1 HPV16的E6蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.2 HPV16的E7蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.3 CCL11的氨基酸序列
SEQ D NO.4 T2多肽氨基酸序列
SEQ ID NO：5 IgE信号肽
SEQ ID NO.6 质粒pVR-CCL11-E6E7-T2的核苷酸序列
SEQ ID NO.7 质粒pVR-CCL11-E6E7的核苷酸序列
SEQ ID NO.8 质粒pVR-E6E7的核苷酸序列
SEQ ID NO.9 质粒pVR-CCL11-E6E7-T2中编码融合蛋白的DNA序列
SEQ ID NO.10 质粒pVR-CCL11-E6E7中编码融合蛋白的DNA序列
SEQ ID NO.11 质粒pVR-E6E7中编码融合蛋白的DNA序列
SEQ ID NO.12 质粒pVR-CCL11-E6E7-T2中编码融合蛋白的mRNA序列
SEQ ID NO.13 质粒pVR-CCL11-E6E7中编码融合蛋白的mRNA序列
SEQ ID NO.14 质粒pVR-E6E7中编码融合蛋白的mRNA序列
SEQ ID NO.15 质粒pVR-CCL11-E6E7-T2中融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.16 质粒pVR-CCL11-E6E7中融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.17 质粒pVR-E6E7中融合蛋白的氨基酸序列
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
从小鼠淋巴结以及外周血分别分离DC细胞和嗜酸性粒细胞后进行趋化实验。趋化小室(碳酸脂膜Transwell小室：5μm；Costar，Cat：3422)的上室中放入上述分离的细胞，根据实验室前期工作基础加入细胞数量为1×10 6/100μl/孔。将趋化小室放入含有600μL培养基的下室，培养基中含有趋化因子CCL11。同时设置自发迁移对照组以及CCL11细胞因子组，所加入的细胞数目相同。设置3个复孔。CCL11因子采用E.coli纯化重组鼠CCL11蛋白，根据实验室前期已有的工作基础，100ng/ml为最佳趋化效率剂量。4小时后收集趋化下室中的细胞，并进行流式分析CCL11对各类免疫细胞的趋化能力。结果显示：CCL11能有效的从上室中募集各类免疫细胞细胞到下室中(P＜0.001)(图1)。
实施例2融合基因或蛋白疫苗的抗原设计方案及哺乳动物表达质粒的构建与制备
构建pVR-CCL11-E6E7-T2质粒：根据人乳头瘤病毒亚型HPV16的E6和E7蛋白，人源CCL11蛋白及T2多肽序列构建融合蛋白CCL11-E6E7-T2。在融合蛋白CCL11-E6E7-T2的N末端连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽；在融合蛋白CCL11-E6E7-T2的C末端连接一个DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。
最终得到的融合蛋白，自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CCL11蛋白序列、linker序列(GGGGGSGGGGG)、E6蛋白序列、E7蛋白序列、T2蛋白序列、Flag标签序列。
将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO：8将该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CCL11-E6E7-T2质粒。如图2中的A所示。
构建质粒pVR-CCL11-E6E7：同样的令最终构建的融合基因自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CCL11蛋白序列、linker序列(GGGGGSGGGGG)、E6E7蛋白序列、Flag标签序列。
将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO：10将该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CCL11-E6E7质粒。如图2中B所示。
构建pVR-E6E7质粒：在人乳头瘤病毒亚型HPV16的E6和E7蛋白序列之前在连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽，之后连接DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。
使得最终得到的融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、E6E7蛋白序列、Flag标签序列。如图2中的C所示。
将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO：11该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-E6E7质粒。
具体的，在本实施例所阐述的实验中构建的质粒模式实际上为：pVR-CCL11-抗原-T2、pVR-CCL11-抗原及其对照质粒pVR-抗原。在本实施例的实验中抗原使用的是HPV16亚型的E6E7融合蛋白。
实施例3
构建质粒的体外细胞转染实验(以实施例2构建的抗原为HPV16 E6和E7蛋白的载体为例，对含有其他抗原的载体转染的方式与此相同)：
转染前24小时，在6孔细胞培养板内接种1×10 6个HEK293T细胞，待细胞密度长到80％以上时开始转染试验。转染时提前在37℃水浴锅中预热细胞培养基、无血清的Opti-MEM培养基。转染时将3微克空载体(Vector)，pVR-CCL11-E6E7-T2表达载体，pVR-CCL11-E6E7表达载体，pVR-E6E7表达载体和12μL PEI转染试剂先后加入到200μL无血清的Opti-MEM中，混合均匀后，室温下静置10分钟。将需要转染的细胞更换新鲜培养基，轻柔加入上述转染体系，轻轻摇匀。将细胞放回细胞培养箱中培养6小时后换液。转48小时后收取细胞用Western Blot检测E6E7融合基因质粒HEK293T细胞中的表达效果。
将收集细胞，加入60μL的含有PMSF或Cocktail蛋白酶抑制剂的0.5％NP40裂解缓冲液。充分重悬细胞，4℃旋转裂解细胞30分钟。12000rpm，4℃离心裂解液10分钟，收集上清至新的1.5mL EP管中，弃掉沉淀。根据样品实际体积加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混合均匀后将样品放在100℃空气浴中加热10分钟，立即进行Western blot，利用Flag标签抗体(Sigma，F3165)进行检测，结果如图3显示空载体(Vector)无蛋白表达，pVR-CCL11-E6E7-T2和pVR-CCL11-E6E7表达蛋白大小位置明显高于pVR-E6E7，说明实验组质粒pVR-CCL11-E6E7-T2、pVR-CCL11-E6E7和对照组质粒pVR-E6E7都能够顺利正常在哺乳动物细胞中表达。
实施例4
探索CCL11趋化因子和T2多肽分别对于融合基因疫苗诱导细胞特异性T细胞反应的影响(以抗原为HPV16 E6和E7蛋白的疫苗为例，对含有其他抗原的疫苗诱导T细胞反应的步骤与此相同)：
鉴于融合基因在哺乳动物细胞可以正常表达。我们提取单独pVR-CCL11-E6E7-T2、pVR-CCL11-E6E7、pVR-E6E7质粒，利用TERESA活体基因导入仪对小鼠进行免疫质粒电转，质粒剂量25μg，加上阴性对照PBS组共4组，每组5只。按照图4的时间轴标注的免疫策略对小鼠进行免疫，之后在D14对各组小鼠进行采血并加入加了肝素的PBS溶液中。将样品整体进行3000rpm离心5min。弃上 清，剩余沉淀采用震荡法打散后加入1mL裂红液于室温裂解1min。后将全部样品进行1200rpm离心6min。弃去上清，使用700μL的PBS溶液洗涤一次。第二次1200rpm离心6min。弃去上清后加入300μL灭活过的10％FBS的1640培养基，重悬沉淀后，加入1μL E7蛋白tetramer(E7-tetramer)染色1h。流式染色：CD8-FITC；E7-tetramer-PE。流式结果如图5所示。结果显示，在相同剂量组别的比较中所有CCL11-E6E7-T2组的E7特异性T细胞数量都远远多于E6E7组。在相同剂量组别的比较中所有CCL11-E6E7-T2组的E7特异性T细胞数量都多于CCL11-E6E7组。在相同剂量组别的比较中所有CCL11-E6E7组的E7特异性T细胞数量都多于E6E7组。这说明，CCL11趋化因子在抗原蛋白的N端可以有效诱导抗原分子与特异性免疫细胞的结合，从而大大加强了抗原分子交叉呈递的效果，使得CCL11最终能够诱导出抗原分子更强的特异性免疫反应。另外，T2多肽在抗原蛋白C端可以有效加强抗原分子在细胞免疫过程中的免疫强度，大大增加了特异性T细胞产生的数量，起到了免疫增强因子的决定性作用。
实施例5
探索CCL11趋化因子和T2多肽分别对于融合基因疫苗诱导体液免疫反应的影响(以抗原为HPV16 E6和E7蛋白的疫苗为例，对含有其他抗原的疫苗诱导T细胞反应的步骤与此相同)：
接下来我们评价了是否CCL11也可以增强体液免疫应答。我们提取单独pVR-CCL11-E6E7-T2、pVR-CCL11-E6E7、pVR-E6E7质粒，利用TERESA活体基因导入仪对小鼠进行免疫质粒电转，质粒剂量25μg，加上阴性对照PBS组共4组，每组5只。按照图4的时间轴标注的免疫策略对小鼠进行免疫，之后在D21对各组小鼠进行采血，不加入抗凝剂。将样品整体进行3000rpm离心20min。取上清。提前一天将实验室自行纯化的E6E7融合蛋白用PBS稀释，包被到ELISA板子上，每孔200μl含有蛋白10μg，放于4°过夜。第二天洗涤板子并用封闭液封闭室温2小时。将采取的小鼠血清1：100稀释后加100μl到孔中后放于4℃过夜。第三天ELISA显色。结果如图6所示。结果显示，在相同剂量组别的比较中所有CCL11-E6E7-T2组的E7特异性抗体数量都远远多于E6E7组。在相同剂量组别的比较中所有CCL11-E6E7-T2组的E7特异性抗体数量都多于CCL11-E6E7组。在相同剂量组别的比较中所有CCL11-E6E7组的E7特异性抗体数量都多于E6E7组。这说明，CCL11趋化因子在抗原蛋白的N端可以有效诱导抗原分子与特异性免疫细胞的结合，从而大大加强了抗原分子交叉呈递的效果，使得CCL11最终能够诱导出抗原分子更强的特异性免疫反应。另外，T2多肽在抗原蛋白C端可以有效加强抗原分子在细胞免疫过程中的免疫强度，大大增加了特异性抗体产生的数量，起到了免疫增强因子的决定性作用。
实施例6
融合基因疫苗对小鼠移植瘤细胞TC-1同种移植瘤的治疗效果(以抗原为HPV16 E6和E7蛋白的融合基因疫苗为例，对含有其他抗原的疫苗对肿瘤干预效果的验证步骤与此相同)：
鉴于在细胞和体液免疫实验中CCL11-E6E7-T2等疫苗的效果优良。我们又对融合基因免疫的TC-1同种移植瘤的治疗效果进行实验探索。除采用DNA疫苗形式外我们还合成了CCL11-E6E7-T2的mRNA疫苗形式并用纳米颗粒包裹，具体过程为将5’UTR-CCL11-E6E7-3’UTR-A(120)分别连入克隆载体pGEM-3Zf(+)(promega)中，完成体外转录表达系统的构建，命名为pGEM-CCL11-E6E7，体外转录系统的UTR序列如下：
5-UTR(β-globin-2)
3-UTR(2β-globin)
重组质粒线性化，单酶切反应体系如下表：反应条件为37℃，3h
组成 体积(μL)
Xho I 4
重组质粒 12μg
10×CutSmart Buffer 5
dd H 2O 补加
Total 50
体外转录反应：
1、选用T7-Flash Scribe TM Transcription Kit(Cell script)进行体外转录，在体外转录体系配制过程中，将UTP替换为N1-Methylpseudouridine-5’-Triphosphate(Trilink Biotech)。
反应体系如下表所示，反应条件为：第一步反应结束后，35℃，30min；第二步，反应后，35℃，15min。
试剂 体积(μL)
Rnase-Free Water X
线性化DNA 1μg
10×T7转录溶液 2
100mM ATP 1.8
100mM CTP 1.8
100mM GTP 1.8
100mM UTP 1.8
100mM DTT 2
Script Cuard Rnase In hibitor 0.5
T7-Flash Scribe Enzyme Solution 2
Total 20
上述产物 20
Rnase-free DnaseI 1
Total 21
mRNA加帽：选用试剂盒ScriptCap TM Cap 1 Capping System(Cell script)进行操作。
Cap-mRNA纯化
选用MEGAclear TMKit Purification(Invitrogen)试剂盒进行纯化反应。
脂质体纳米颗粒LNP-Man的制备
DOTAP((2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵)、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DSPE-PEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)均购自上海艾韦特医药科技有限公司；DSPE-PEG2000-Man购自西安昊然生物科技有限公司；
采用旋转蒸发法制备纳米颗粒。LNP-Man制备的具体操作过程如下：
1)按摩尔比DOTAP∶DOPE∶DSPE-PEG2000-Man＝50∶50∶1，依次加入圆底烧瓶中，加入6mL三氯甲烷，直至固体充分溶解；
2)水浴超声15min；
3)将圆底烧瓶装入旋转蒸发仪中，圆底烧瓶内溶解物需没过水面以下。转速
为100rpm，旋转蒸发15min；
4)取下圆底烧瓶，放置通风橱内，加入8mLHEPES缓冲液，将瓶内壁上的
薄膜溶解下来；
5)水浴超声30min；
6)将超声好的溶液通过0.22μm的滤膜，过滤三次，即得到所需脂质体纳米颗粒LNP-Man。
LNPs/mRNA的制备
用制备的阳离子脂质纳米材料LNP-Man与mRNA按照设定的N/P＝10∶1(摩尔 比)混合，计算所需的LNPs和mRNA的体积；将LNPs与mRNA混合前分别加入等体积的10mM HEPES缓冲液；混合后的LNPs/mRNA在漩涡振荡器上震荡1min，室温静置30min。同时我们还纯化了CCL11-E6E7-T2蛋白用于疫苗对照。采用如图7中的时间轴对小鼠进行接瘤和质粒治疗性免疫。每次免疫接种量为25μg。在接瘤后开始对小鼠进行免疫两次分别为D4和D11。之后按照相同方法进行量瘤，统计肿瘤体积。绘制肿瘤生长曲线如图8所示。结果显示，pVR-CCL11-E6E7-T2质粒、CCL11-E6E7-T2-mRNA以及CCL11-E6E7-T2蛋白的三组相较pVR-E6E7质粒组更早发生肿瘤生长抑制，且pVR-CCL11-E6E7-T2质粒、CCL11-E6E7-T2-mRNA以及CCL11-E6E7-T2蛋白的三组在接瘤第17天前后移植瘤完全消失，达到了完全的肿瘤治疗效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (12)

  1. 如I)～VI)中的至少一种在提高抗原递呈效果中的应用；
    I)、如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的T2片段；
    II)、趋化因子CCL11；
    III)、与I)或II)具有80％以上同源性，且具有相同或相似功能的片段；
    IV)、编码I)或II)的核酸分子；
    V)、在IV)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；
    VI)、与V)完全互补或部分互补的核酸分子。
  2. 融合蛋白，其包括CCL11和抗原；或包括CCL11、抗原和T2片段。
  3. 根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，自N端→C端依次包括：IgE信号肽、CCL11、linker、抗原和T2片段。
  4. 根据权利要求2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤；
    所述病毒包括HPV病毒、EBV、HCV、HIV、HBV、VZV或冠状病毒中至少一种；
    所述肿瘤包括肝癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、血癌、卵巢癌、结直肠癌中至少一种。
  5. 编码权利要求2～4任一项所述融合蛋白的核酸。
  6. 核酸片段，其包括权利要求5所述的核酸、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA。
  7. 表达载体，其包括骨架载体和权利要求5所述的核酸，或者权利要求6所述的核酸片段。
  8. 转化或转染权利要求7所述表达载体的宿主。
  9. 权利要求2～4任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求8所述宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。
  10. 权利要求2～4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的核酸片段、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主、权利要求9所述制备方法制得的融合蛋白，和/或权利要求9所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物在制备防治疾病的产品中的应用。
  11. 一种防治疾病的产品，其特征在于，其包括：权利要求2～4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的核酸片段、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主、权利要求9所述制备方法制得的融合蛋白，和/或权利要求9所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物。
  12. 一种防治疾病的方法，其特征在于，给予权利要求11所述的产品。
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