CN111529699A - 一种基于sct的hpv肿瘤疫苗的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于SCT的HPV肿瘤疫苗的制备方法及其应用；以质粒pUC57为模板载体构建HPV16 E6和OVA mRNA疫苗对移植瘤小鼠进行免疫，产生了抗肿瘤免疫作用；在模板质粒GD191上连接多肽E6、E7形成SCT质粒，进行体外模拟含有抗原肽的SCT载体对HPV16阳性患者的治疗性效果。构建OVA SCT mRNA疫苗免疫小鼠，能特异性的激发免疫应答，产生更强的免疫反应。本发明的SCT mRNA疫苗可用于肿瘤疫苗激活机体免疫反应的理论研究，以及临床，预防和治疗宫颈癌的放化疗耐药、转移和复发，提高宫颈癌患者的生存质量和生存率。

Description

一种基于SCT的HPV肿瘤疫苗的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于SCT的HPV肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
背景技术
核酸疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗之后的第三代疫苗，分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。
随着我国DNA重组技术的突破与应用，DNA疫苗是以分子生物学为基础，逐渐形成的一种全新的免疫防治剂。DNA疫苗又称“裸”DNA疫苗或者基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达。表达的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗目前已经成为一种潜在的、重要的对抗癌症的免疫治疗手段。与传统的普通疫苗相比，DNA疫苗自身具有良好的安全性和稳定性，便于存储，制造成本较低，可以通过不同途径接种。并且质粒DNA在宿主体内可存在较长时间，抗原基因可在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生免疫应答，免疫效果可靠。此外，用核心蛋白保守DNA序列制备的基因疫苗对病原体(细菌或病毒)的各变异亚型都可产生免疫应答，从而避免因病原体变异而造成的免疫逃避问题。尽管DNA疫苗具有显著的优越性，但同时也存在一些问题。虽然质粒DNA一般不会整合到宿主细胞的基因组上，目前也未发现插入突变的证据，但不能完全排除少数质粒DNA插入到染色体上引起突变的可能性，一旦整合到基因组中就可能使细胞癌基因激活或抑癌基因失活。另外限制DNA疫苗发挥其潜能的一个主要问题是裸的DNA没有在体内复制的能力，并且MHC(major histocompatibility complex，MHC)I类分子对编码抗原肽的有效呈递也会影响DNA疫苗的潜能。
研究表明，能够提高DNA疫苗潜力的一种重要的方法是加强抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)中MHC I类分子对编码抗原肽的有效提呈。MHC I类分子是由重链(α链)和β2M(beta-2microglobulin)组成的一种异二聚体的糖蛋白，分布于所有有核细胞表面，在细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的免疫反应中扮演着重要的角色。在伴侣蛋白的参与下，MHC I类分子组装为二聚体，其抗原肽结合槽与适合的抗原肽结合，形成复合物，结合抗原肽的MHC I类分子经高尔基体转运至细胞膜上，提呈给CD8+CTLs。CTLs可高效、特异性地杀伤感染胞内寄生病原体(病毒和某些胞内寄生菌)的细胞、肿瘤细胞等靶细胞，而不损害正常细胞。利用基因工程技术将抗原肽、β2M和MHCI类分子重链用接头(linker)组成单链三聚体(single-chain trimer，SCT)，可以绕过抗原提呈过程，将抗原肽稳定的表达于细胞表面。由于多肽是共价连接的，因此SCT比自身的MHCI类分子-多肽复合物更能在细胞表面稳定存在。在DNA疫苗接种后，SCT能够有效的刺激多肽特异性的CTLs，使机体产生抗肿瘤免疫应答。这种提前组装的分子能够绕过正常的抗原提呈过程，并且能够抵抗病毒引发的免疫逃避机制。此外，SCT并不会受到抗原加工和提呈过程中产生畸变的影响，而且可以对抗原肽进行选择，从而使用最具有免疫原性的表位，产生更强的免疫反应，对肿瘤细胞产生更强的杀伤作用。
由于DNA疫苗递送至靶细胞的效率低下，因此在近二十年间，研究者们把目光聚焦到了mRNA疫苗的研究中。mRNA可以通过体外cDNA模版尤其是质粒DNA转录而成，转录后期在mRNA增加蛋白质编码的开放阅读框(open reading frame，ORF)，使合成的mRNA具有编码蛋白质的功能。ORF至少由两个重要元素组成：“帽子”(cap)和“尾巴”(tail)。此外，增加不转录区域(untranslated regions，UTRs)及其他复合物协助mRNA的稳定转录。通过对mRNA的模版质粒DNA序列、cap、tail及UTRs等设计及产物纯化，得到所需的mRNA，这种裸露的mRNA产物在体内试验表达特异性产物，使机体产生预防感染。研究中发现，在给予mRNA产物1天后，用重组粒细胞集落刺激因子即可刺激机体产生Thl型免疫应答。mRNA疫苗具有佐剂特性，疫苗含有强效的佐剂才更加有效，佐剂提供危险信号，激发、支持适应性免疫系统对特定抗原产生免疫应答。mRNA作为佐剂可以刺激多种细胞分泌TNF-α、IFN-γ，表达出佐剂特性的免疫刺激性，刺激不同的免疫应答。mRNA疫苗利用宿主细胞机制，在体内将mRNA翻译成相应的抗原，从而模拟病毒感染来引起强力的体液和细胞免疫反应。并且，抗原的最终位置由分泌信号肽和跨膜结构域决定，可以在设计中将蛋白质导向所需的细胞位置，因此，抗原可以被跨膜表达，分泌表达或胞内表达。更重要的是，由于mRNA其完全合成的性质，几乎任何序列都可以设计为mRNA疫苗并在动物模型中快速测试。但是，有由于mRNA自身的不稳定性及体内外广泛存在的RNA酶，mRNA疫苗的研究长期以来一直没有实质性的突破。本专利所研究的佐剂辅助的SCT mRNA疫苗有效的绕过了抗原提呈过程，表达在细胞表面，刺激细胞分泌多种细胞因子，产生了强烈的免疫应答。
迄今，mRNA疫苗已广泛应用于前列腺癌、急性骨髓白血病、转移黑色素瘤、成神经细胞瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等多种类型肿瘤的治疗研究。其中，宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤，在发展中国家女性恶性肿瘤发病率中居第2位，仅次于乳腺癌；死亡率居第3位，仅次于乳腺癌和肺癌。近年来，宫颈癌的发病率呈逐年增加的趋势。人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是导致宫颈癌的主要病因，宫颈癌的发病机制与HPV基因组的整合密切相关。HPV基因组由3部分组成：早期基因域(E)、晚期基因域(L)及长调控域(LCR)。早期基因域(E)中的E6、E7是致癌基因，其编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子。E6、E7蛋白是病毒性癌蛋白，负责细胞周期中的细胞失调和HPV相关的凋亡途径，并且与细胞内两种主要抑癌蛋白p53和pRb的结合以及调控可以明显改变细胞生长周期和DNA修复，从而导致基因组的不稳定性，成为细胞转化和永生化的必要条件，这些蛋白质在所有与病毒相关的癌细胞中组成型表达，因此成为了抗原特异性免疫治疗疫苗的代表性潜在靶点。
目前针对多种HPV亚型的预防型疫苗已经上市，2006年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了全球首个HPV预防性疫苗Gardasi(美国默沙东公司，佳达修，HPV6/11/16/18四价疫苗)。2007年美国FDA批准了英国葛兰素史克(GSK)公司旗下的Cervarix(卉妍康，HPV16/18二价疫苗)，它添加了佐剂AS04，具有更高的平均血清抗体滴度。2014年FDA批准的九价HPV疫苗Gardasil 9在原来的基础上增加了5种致癌病毒基因型(HPV31/33/45/52/58)。但预防性疫苗对已存在的HPV感染的患者无效，因此研制治疗性宫颈癌疫苗亦成为热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中可用的治疗性宫颈癌疫苗较少的缺陷，提供一种基于SCT的HPV肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种基于SCT的HPV肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、在大肠杆菌通用克隆载体pUC57上连入多肽HPV16 E6和OVA，构建成E6(pUC57)和OVA(pUC57)两个质粒；
S2将线性化的E6(pUC57)和OVA(pUC57)载体质粒转录成mRNA；
S3、构建含有HPV16 E6 aa18-26肽段的SCT质粒载体(GD191-E6-β2M-MHC I*02：01)和HPV16 E7 aa11-20肽段的SCT质粒载体(GD191-E7-β2M-MHC I*02：01)。
该基于SCT的HPV肿瘤疫苗可以用于预防和治疗宫颈癌中。
将SCT质粒载体与mRNA佐剂一起使用。
优选的，所述的mRNA佐剂采用以下方法制备：
S1、称取脱水山梨糖醇三油酸酯500±50mg、角鲨烯4.3±0.2g、脂质体400±30mg混合后置于37℃使用匀浆器剪切30min得到油相；
S2、配置10mmol/L的柠檬酸盐缓冲液，并称取500±50mg的聚山梨酯85溶解于柠檬酸盐缓冲液中形成水相；
S3、将得到的油相缓慢加入水相后继续置于37℃剪切2min得到混合物，使用ATS均质机在24K RPM下将该混合物均化5-7次以产生白色乳液，将白色乳液在无菌条件下用0.22μm过滤一次。
本发明的有益效果：
1、本发明将抗原肽、β2M和MHC I用接头连成SCT，相较于普通的疫苗，能特异性的激发免疫应答，产生更强的免疫反应，对肿瘤疫苗的研发有指导意义。
2、本发明开发了新的mRNA佐剂制备工艺，该佐剂配合mRNA疫苗使用能激发更强的免疫反应。
3、利用接种肿瘤细胞小鼠进行疫苗安全性和有效性的检测，目标成功构建新的佐剂辅助的mRNA抗宫颈癌疫苗，可应用于临床，预防宫颈癌的放化疗抵抗、转移和复发，同时该项目也为mRNA疫苗应用于其他肿瘤提供抗原选择和免疫接种等研究基础。
4、本发明构建出了RNA疫苗体外合成模板的载体，并合成了RNA疫苗所需的元件，该段合成序列克隆到载体pUC57上，后续实验只需要在此基础上改造即可，无需再次合成全部长度。并且研究证明用此模板载体合成的mRNA疫苗具有抗原特异性免疫响应，适合用于肿瘤疫苗的研发。
本发明以质粒pUC57为模板载体构建HPV16 E6和OVA mRNA疫苗对移植瘤小鼠进行免疫，产生了抗肿瘤免疫作用。在此基础上，本发明在模板质粒GD191上连接多肽E6、E7形成SCT质粒，进行体外模拟含有抗原肽的SCT载体对HPV16阳性患者的治疗性效果。同时本发明构建OVA SCT mRNA疫苗免疫小鼠，相较于普通的疫苗，能特异性的激发免疫应答，产生更强的免疫反应。本研究发明的SCT mRNA疫苗不仅可以用于肿瘤疫苗激活机体免疫反应的理论研究，而且将来有可能应用于临床，预防和治疗宫颈癌的放化疗耐药、转移和复发，提高宫颈癌患者的生存质量和生存率。同时本发明对mRNA肿瘤疫苗的接种方式进行了比较，以及抗宫颈癌疫苗的抗原设计进行研究，这些都为今后mRNA疫苗的广泛应用提供了理论基础。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1，E6(pUC57)载体的质粒图谱；
图2 OVA(pUC57)载体的质粒图谱；
图3，GD191载体的质粒图谱；
图4，VP64-IgK-β2M-MHC I质粒图谱。
图5，E6(pUC57)mRNA疫苗在小鼠体内抑制肿瘤增殖曲线；
图6，OVA(pUC57)mRNA疫苗在小鼠体内抑制肿瘤增殖曲线；
图7，GD191-E6-β2M-MHC I和GD191-E7-β2M-MHC I质粒的转染效率；
图8，HPV16阳性患者的ELISPOT实验；
图9，OVA SCT mRNA疫苗在小鼠体内抑制肿瘤增殖曲线；
图10，VP64-IgK-OVA-β2M-MHC I以及VP64-IgK-E6-β2M-MHC I转染效率。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
本发明在大肠杆菌通用克隆载体pUC57上连入多肽HPV16 E6和OVA，构建成E6(pUC57)和OVA(pUC57)两个质粒。通过T7 mScriptTM Standard mRNA Production System试剂盒将线性化的E6(pUC57)和OVA(pUC57)载体质粒转录成mRNA并免疫小鼠，检测HPV mRNA疫苗对小鼠的抗肿瘤免疫作用。同时本发明也构建了含有HPV16 E6 aa18-26肽段的SCT质粒载体(GD191-E6-β2M-MHC I*02：01)和HPV16 E7 aa11-20肽段的SCT质粒载体(GD191-E7-β2M-MHC I*02：01)，转染到人肾上皮细胞HEK293T内，然后与HPV16阳性患者的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)共培养16-18个小时，通过ELISPOT实验检测细胞分泌IFN-γ的情况，从而检测表达E6、E7蛋白的细胞能否进一步激活HPV16阳性患者的CD8+T细胞反应，达到在体外模拟含有抗原肽的SCT载体对HPV16阳性患者的治疗性效果。有研究表明HPV16 E6蛋白aa41-50肽段和OVA蛋白aa257-264肽段具有免疫原性，是由H-2Kb呈现的限制性肽表位。因此，本发明在小鼠身上检测OVA蛋白aa257-264肽段以及HPV16 E6蛋白aa41-50肽段的免疫原性。模拟构建人源和鼠源的含有OVA蛋白aa257-264肽段和HPV16 E6蛋白aa41-50肽段的SCT质粒载体，通过T7 mScriptTM Standard mRNAProduction System试剂盒将线性化的载体质粒转录成mRNA，检测这种基于SCT的mRNA疫苗对小鼠的抗肿瘤免疫作用。
一、材料与方法
1、人源载体质粒的构建
将一些用于RNA疫苗的元件序列克隆到大肠杆菌通用克隆载体pUC57上，形成载体pUC57-RNA，这个载体装载不同的抗原肽就能制备不同的疫苗。把HPV16 E6和OVA肽段克隆到载体pUC57-RNA上，形成E6(pUC57)(图1)和OVA(pUC57)(图2)载体质粒。
HPV16 E6和E7多肽交由公司合成，PCR扩增外源片段。使用Tolo bio的Ezmax One-Step无缝克隆试剂盒将外源片段克隆到载体GD191(图3)上，形成GD191-E6-β2M-MHC I和GD191-E7-β2M-MHC I载体质粒。构建的克隆全部转化E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆，测序验证正确的使用QIAGEN试剂盒提取质粒E6-pUC57、OVA-pUC57、GD191-E6-β2M-MHC I、GD191-E7-β2M-MHC I。
2、鼠源SCT载体质粒的构建
把鼠源的β2M和MHC克隆到过表达质粒VP64载体上，制备成VP64-IgK-β2M-MHC I(图4)。将该质粒的IgK、β2M和MHC部分切下连接到载体pUC57-RNA上，形成mice-pUC57质粒。使用tolo bio的Ezmax One-Step无缝克隆试剂盒将外源片段HPV16 E6克隆到载体VP64上，将OVA克隆到载体VP64和mice-pUC57上，构建的克隆全部转化E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆，测序验证正确的使用QIAGEN试剂盒提取质粒VP64-IgK-OVA-β2M-MHC I、VP64-IgK-E6-β2M-MHC I、mice-pUC57-IgK-OVA-β2M-MHC I。
3、mRNA的制备
通过PstI限制性核酸内切酶将质粒DNA线性化，将线性化的DNA模板用T7mScriptTM Standard mRNA Production System试剂盒转录成加帽的mRNA并通过LiCl沉淀纯化。
4、mRNA佐剂的制备
称取脱水山梨糖醇三油酸酯(Span-80，Sigma，#S6760)500mg、角鲨烯(Squalene，Sigma，#S3626)4.3g、脂质体(DOTAP，Sigma，#890890P)400mg混合后置于37℃使用匀浆器(Pro 200型精密组织匀浆器，PRO Scientific Inc.，#02200)剪切30min得到油相。然后配置10mmol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.5)，并称取500mg的聚山梨酯85(TWEEN-85，Sigma，#P4634)溶解于柠檬酸盐缓冲液中形成水相。将得到的油相缓慢加入水相后继续置于37℃剪切2min得到混合物。使用ATS均质机(Nano Homogenize Machine，ATS EngineeringLimited，#AH-1500)在24K RPM下将该混合物均化5-7次以产生白色乳液，将白色乳液在无菌条件下用0.22μm过滤一次。使用前将制剂储存在4℃。
5、mRNA复合物疫苗的使用
一只小鼠使用免疫加帽的mRNA剂量为40μg，用nuclease-free water稀释至50μL，同时加入改良的MF59佐剂50μL混合均匀，皮下注射共100ul。
二、人源质粒载体诱导的免疫应答水平
1、HPV16 E6(pUC57)mRNA疫苗和OVA(pUC57)mRNA疫苗体内激活T细胞免疫应答反应
有效的肿瘤免疫疫苗能够诱导出抗原特异的免疫响应，从而达到治疗或预防肿瘤的目的。因此有必要通过mRNA疫苗免疫C57BL/6小鼠，鉴定其诱导的T细胞免疫应答的水平。
①HPV16 E6(pUC57)mRNA疫苗治疗实验
通过皮下注射小鼠肺上皮细胞TC-1构建小鼠模型，成瘤一周后提取每只小鼠的PBMC测定IFN-γ，此时并没有检测到IFN-γ的分泌，说明没有激活特异性T细胞。然后给治疗组注射HPV16 E6(pUC57)mRNA疫苗，对照组注射PBS，一周后再次提取PBMC测定IFN-γ。结果表明，在给予mRNA疫苗之后，小鼠体内的PBMC会分泌更多的IFN-γ来抵抗肿瘤细胞的增殖，激活特异性T细胞。免疫后测量小鼠皮下移植瘤的大小变化及免疫小鼠的荷瘤生存期。对照组的移植瘤逐渐增大，治疗组移植瘤逐渐缩小，直至消瘤(图5)，表明HPV16 E6(pUC57)mRNA疫苗能够有效的抑制TC-1肿瘤的生长，对肿瘤清除能力较强，有良好的治疗效果。
②OVA(pUC57)mRNA疫苗治疗实验
通过皮下注射小鼠纤维瘤细胞MCA205-WT-OVA构建小鼠模型，成瘤一周后提取每只小鼠的PBMC，用OVA peptide刺激，测定IFN-γ，此时检测到少量IFN-γ的分泌，激活特异性T细胞的效应较弱。然后给治疗组注射OVA(pUC57)mRNA疫苗，对照组注射PBS，一周后再次提取PBMC测定IFN-γ。结果表明，在给予mRNA疫苗之后，小鼠体内的PBMC会分泌更多的IFN-γ来抵抗肿瘤细胞的增殖，激活特异性T细胞效应增强。免疫后测量小鼠皮下移植瘤的大小变化及免疫小鼠的荷瘤生存期。对照组的移植瘤逐渐增大，治疗组移植瘤逐渐缩小，直至消瘤(图6)，表明OVA(pUC57)mRNA疫苗能够有效的抑制MCA205肿瘤的生长，对肿瘤清除能力较强，有良好的治疗效果。
2、人源SCT质粒载体体外激活T细胞免疫应答反应
用GD191-E6-β2M-MHC I和GD191-E7-β2M-MHC I的质粒转染293T细胞，48小时后用流式测定转染效率(图7)。以未转染质粒的293T细胞为对照，GD191-E6-β2M-MHC I质粒的转染效率为30.3％，GD191-E7-β2M-MHC I质粒的转染效率为31.6％，这两种质粒均有30％左右的转染效率，说明大概有30％的293T细胞表面表达有SCT，即有30％的293T细胞呈递了E6、E7肽段。
为了验证GD191-E6-β2M-MHC I和GD191-E7-β2M-MHC I是否能够绕过抗原加工过程呈递在转染细胞的表面，本发明将上述转染率为30％的293T细胞与HPV16阳性患者的PBMC共培养16-18个小时，检测IFN-γ的分泌，结果如图8所示。与对照组(293T+HPV16 PBMC共培养)相比，转染有GD191-E6-β2M-MHC I和GD191-E7-β2M-MHC I这两种质粒的293T细胞更能够激活E6、E7抗原特异性T细胞的活化，分泌更多的IFN-γ。
三、鼠源SCT质粒载体激活T细胞免疫应答反应
1、鼠源SCT质粒载体体内激活T细胞免疫应答反应
通过给治疗组皮下注射mice-pUC57-IgK-OVA-β2M-MHC I mRNA疫苗、对照组不注射构建小鼠模型，一周后提取每只小鼠的PBMC，给与OVA peptide刺激并测定IFN-γ分泌水平，此时检测到IFN-γ的分泌，说明激活特异性T细胞。然后注射小鼠T淋巴瘤细胞EG7-OVA，一周后再次提取PBMC测定IFN-γ。结果表明，在给予mRNA疫苗的小鼠体内的PBMC会分泌更多的IFN-γ来抵抗肿瘤细胞的增殖，激活特异性T细胞效应增强。注射肿瘤细胞后测量小鼠皮下移植瘤的大小变化及免疫小鼠的荷瘤生存期。对照组的移植瘤逐渐增大，预防组移植瘤增大后缩小，基本维持稳定(图9)，且预防组移植瘤明显小于对照组移植瘤，表明OVA SCTmRNA疫苗能够有效的抑制EG7肿瘤的生长，有良好的预防效果。
2、鼠源SCT质粒载体体外激活T细胞免疫应答反应
用VP64-IgK-OVA-β2M-MHC I以及VP64-IgK-E6-β2M-MHC I的质粒转染293T细胞，24小时后用流式测定转染效率(图10)。以未转染质粒的293T细胞为对照，这两种质粒的转染效率都在25％左右，说明大概有25％的293T细胞表面表达有SCT，即有25％的293T细胞呈递了OVA、E6肽段，能激活相应的免疫应答反应。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于SCT的HPV肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在大肠杆菌通用克隆载体pUC57上连入多肽HPV16 E6和OVA，构建成E6(pUC57)和OVA(pUC57)两个质粒；
S2将线性化的E6(pUC57)和OVA(pUC57)载体质粒转录成mRNA；
S3、构建含有HPV16 E6 aa18-26肽段的SCT质粒载体(GD191-E6-β2M-MHC I*02：01)和HPV16 E7 aa11-20肽段的SCT质粒载体(GD191-E7-β2M-MHC I*02：01)。
2.权利要求1制备的基于SCT的HPV肿瘤疫苗在预防和治疗宫颈癌中的应用。
3.权利要求1所述的基于SCT的HPV肿瘤疫苗的使用方法，其特征在于，将SCT质粒载体与mRNA佐剂一起使用。
4.权利要求1所述的基于SCT的HPV肿瘤疫苗的使用方法，其特征在于，所述的mRNA佐剂采用以下方法制备：
S1、称取脱水山梨糖醇三油酸酯500±50mg、角鲨烯4.3±0.2g、脂质体400±30mg混合后置于37℃使用匀浆器剪切30min得到油相；
S2、配置10mmol/L的柠檬酸盐缓冲液，并称取500±50mg的聚山梨酯85溶解于柠檬酸盐缓冲液中形成水相；
S3、将得到的油相缓慢加入水相后继续置于37℃剪切2min得到混合物，使用ATS均质机在24K RPM下将该混合物均化5-7次以产生白色乳液，将白色乳液在无菌条件下用0.22μm过滤一次。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113350499A (zh) * 2021-06-29 2021-09-07 贵州医科大学 鸡卵清蛋白OVA mRNA在制备非特异性免疫刺激剂中的应用
CN114887070A (zh) * 2022-06-06 2022-08-12 郑州大学第一附属医院 一种脾脏靶向的纳米药物
WO2024140767A1 (zh) * 2022-12-29 2024-07-04 仁景(苏州)生物科技有限公司 用于预防或治疗hpv感染相关疾病的多核苷酸分子

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113350499A (zh) * 2021-06-29 2021-09-07 贵州医科大学 鸡卵清蛋白OVA mRNA在制备非特异性免疫刺激剂中的应用
CN114887070A (zh) * 2022-06-06 2022-08-12 郑州大学第一附属医院 一种脾脏靶向的纳米药物
CN114887070B (zh) * 2022-06-06 2023-09-22 郑州大学第一附属医院 一种脾脏靶向的纳米药物
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