CN114075293A

CN114075293A - 包含突变的hpv16 e6蛋白的融合蛋白和疫苗组合物

Info

Publication number: CN114075293A
Application number: CN202010818452.6A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Changsha Nuo Meng Biomedical Co ltd
Current assignee: Changsha Nuo Meng Biomedical Co ltd
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN114075293B

Abstract

本发明涉及包含突变的HPV16 E6蛋白的融合蛋白、包含所述融合蛋白的疫苗组合物，以及所述融合蛋白和疫苗组合物用于治疗和/或预防与人乳头瘤病毒(HPV)感染相关的疾病的用途。

Description

包含突变的HPV16 E6蛋白的融合蛋白和疫苗组合物

发明领域

本发明涉及与HPV感染相关的疾病的治疗和/或预防领域。特别地，本发明涉及包含突变的HPV16 E6蛋白的融合蛋白、包含所述融合蛋白的疫苗组合物，以及所述融合蛋白和疫苗组合物用于治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病的用途。

背景技术

乳头瘤病毒(papillomaviruses，PV)是诱发上皮过度增生性病变的无包膜DNA病毒。乳头瘤病毒在自然界广泛分布，在人类中，已经分离鉴定了超过200种类型的人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)。

根据感染位点可以将HPV分类为嗜皮肤组和嗜黏膜组(例如，感染口腔粘膜和感染生殖器粘膜)。嗜皮肤组的HPV引起的皮肤相关疾病包括扁平疣、足底疣等；嗜黏膜组HPV引起的粘膜相关疾病包括喉乳头瘤和肛门生殖器疾病(例如，宫颈癌)(Bernard,H-U.,2005.J.Clin.Virol.328:S1-S6)。

根据诱发病变的性质不同，可以将HPV分类为诱发恶性肿瘤的致癌型(包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等高危型及HPV 26,30,53,66,67,69,70,73,82,85等可能及可疑高危型)，及诱发疣状增生等良性病变的低危型(包括HPV 6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,90,91,106等)。

目前已发现多种恶性肿瘤与高危型HPV(例如，HPV16和HPV18)感染相关，所述恶性肿瘤包括宫颈癌、阴道癌、阴唇癌、阴茎癌、肛周癌、口咽癌、口腔癌等，其中宫颈癌与HPV感染的关系最紧密且危害最大。宫颈癌是世界范围内第三高发的妇科恶性肿瘤，年发病率约52.7万，其中亚洲地区28.5万；中国的年发病数约7.5万。因此，迫切需要一种有效的针对高危型HPV的疫苗，其可以治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病。

对HPV的致癌机制研究发现，HPV感染诱导细胞恶性转化的关键是，HPV的两个晚期基因E6和E7整合到宿主细胞基因组中，并在细胞中稳定表达。HPV E6和E7通过分别结合并促进肿瘤抑制蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的降解而发挥病毒癌蛋白的作用(Yugawa，T.和Kiyono，T.，Reviews in medical virology 19：97-113，2009)。因此，HPV E6和E7可作为HPV相关肿瘤及癌前病变治疗的靶分子。鉴于HPV16是世界范围内的优势流行病毒型别，约53.5％的宫颈癌是由HPV16感染引起的，其余46.5％的宫颈癌由其它约22种高危型和可疑高危型HPV感染引起，因此，深入研究HPV16 E6为基础的治疗性和/或预防性疫苗具有重大意义。

已在多种不同的表达体系中进行了HPV16 E6的表达生产。但研究发现野生型HPV16 E6蛋白在真核表达系统中的表达量低，在原核表达系统中的可溶性差。此外，野生型HPV16 E6蛋白的应用还存在免疫原性差、诱发的免疫反应以体液免疫为主、具有潜在的诱导细胞恶性转化的活性等问题。由于宫颈病变的消退还与细胞免疫应答的存在相关(Deligeoroglou，E.等，Infectious diseases in obstetrics and gynecology2013)，因此，需要设计这样的HPV疫苗，所述疫苗中的HPV16 E6蛋白衍生物能够大量制备且可溶性好、能够诱导稳健的HPV E6特异性T细胞免疫和体液免疫、且不具有诱导细胞恶性转化的活性。

发明概述

本发明人通过锐意研究，开发了一种包含突变的HPV16 E6蛋白、三聚化结构域和具有免疫刺激活性的氨基酸序列融合蛋白，其能够在原核生物中大量表达且可溶性好、能够诱导稳健的HPV E6特异性T细胞免疫和体液免疫、且因为去除了诱导细胞恶性转化的位点而不再具有诱导细胞恶性转化的活性，从而获得了一种有效的针对高危型HPV的疫苗，能够用于治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病。

因此，在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含突变的HPV16 E6蛋白、三聚化结构域和具有免疫刺激活性的氨基酸序列，所述突变的HPV16 E6蛋白与野生型HPV16E6蛋白相比，去除了野生型HPV16 E6蛋白内部具有的诱导细胞恶性转化的位点。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白中的突变的HPV16 E6蛋白是将野生型HPV16 E6蛋白的第37位、40位、70位及73位的半胱氨酸(C)置换为另一天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述另一天然存在的氨基酸残基是丝氨酸(S)。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白中的三聚化结构域位于突变的HPV16 E6蛋白C端，例如，所述所述三聚化结构域具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白中的所述具有免疫刺激活性的氨基酸序列位于三聚化结构域C端，例如，所述具有免疫刺激活性的氨基酸序列如SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3所示。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在第二方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。

在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸，优选地，所述载体为原核表达载体。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸，或者其包含含有编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。

在第五方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含本发明的融合蛋白和可药用载体，例如，赋形剂和/或佐剂。在一个实施方案中，所述佐剂为铝佐剂、油包水乳剂、水包油乳剂、TLR刺激剂或这些佐剂的组合物，优选地，所述佐剂为TLR刺激剂，例如，所述佐剂为聚肌苷酸-聚胞苷酸及CpG寡聚核苷酸的组合物。

在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物还包含突变的HPV16 E7蛋白和/或至少1种选自其他高危型HPV的突变E6和/或突变E7蛋白。

在第六方面，本发明提供了本发明的融合蛋白的用途或本发明的疫苗组合物的用途，用于制备治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病的药物，优选地，所述药物能够诱导体液免疫和细胞免疫，例如，所述与HPV感染相关的疾病是宫颈癌。

在第七方面，本发明提供了本发明的融合蛋白的用途或本发明的疫苗组合物的用途，用于制备针对HPV的抗体，优选地，单克隆抗体。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1显示了变体16E6-C4、变体16E6-C7、变体16E6-C13免疫小鼠后，免疫血清中的HPV16E6特异性抗体滴度的分析。**：P<0.05。

图2显示了本发明的包含突变的HPV16 E6蛋白的融合蛋白在大肠杆菌细胞中的表达鉴定。结果显示，2种包含突变的HPV16 E6蛋白的融合蛋白(即，融合蛋白16E6fR1；融合蛋白16E6fR2)均可在大肠杆菌细胞中可溶性表达。泳道1和2分别表示大肠杆菌细胞裂解上清中表达的融合蛋白16E6fR1及包涵体中表达的融合蛋白16E6fR1；泳道3和4分别表示大肠杆菌细胞裂解上清中表达的融合蛋白16E6fR2及包涵体中表达的融合蛋白16E6fR2；泳道5和6分别表示大肠杆菌细胞裂解上清中表达的野生型16E6及包涵体中表达的野生型16E6；泳道7和8分别表示转化pET42a空载体的大肠杆菌细胞裂解上清及包涵体。

图3显示了野生型16E6、融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2、融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f免疫小鼠后，免疫血清中HPV16E6特异性抗体滴度的分析。**：P<0.05；***：P<0.001。

图4显示了融合蛋白16E6fR2联合polyI:C佐剂及CpG佐剂接种小鼠后，免疫血清中HPV16E6特异性抗体滴度的分析。***：P<0.001。

图5显示了融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2联合polyI:C佐剂及CpG佐剂接种小鼠后，诱发的HPV16E6特异性细胞免疫反应水平分析。***：P<0.001。

发明详述

本发明提供了一种包含突变的HPV16 E6蛋白、三聚化结构域和具有免疫刺激活性的氨基酸序列融合蛋白和疫苗组合物。本发明还提供了该融合蛋白和疫苗组合物用于制备治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病的药物的用途；以及用于制备针对HPV的抗体的用途。

除非下文中另外定义，否则本说明书中的术语如本领域通常所用那样使用。

I.定义

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。

如本文所用，“野生型HPV16 E6”或“野生型16E6”指的是人乳头瘤病毒类型16(HPV16)的E6蛋白(例如，具有NCBI数据库ACK57857.1序列)。野生型HPV16 E6为小的碱性蛋白质(例如，NCBI数据库ACK57857.1的HPV16 E6包含158个氨基酸)，具有细胞转化的活性，大约16-19kD。在高危性HPV例如HPV-16中，E6和E7蛋白质对于其宿主即鳞状上皮细胞的永生是必需的。已经显示，高危性HPV的E6基因产物与p53形成复合体，并促进p53降解。

如本文所用，“E6AP”指的是泛素蛋白连接酶E3A(ube3A，也称为E6相关蛋白或E6AP)。GenBank登录号NM_130838.1、NM_130839.1和NM_000462.2提供代表不同同工型的E6AP的人mRNA序列。

本文中使用的“编码序列”是由可翻译成氨基酸的密码子组成的多核苷酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译成氨基酸，但可以认为它是编码区的一部分。任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)不是编码区的一部分。编码区的边界通常由5’末端的起始密码子、编码所得多肽的氨基末端的起始密码子和编码所得多肽的羧基末端的3’末端的翻译终止密码子确定。

对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守的氨基酸置换：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。

“优化的”多核苷酸序列是指这样的编码多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已经相对于天然存在的编码该多肽的多核苷酸序列进行了突变以增强该多核苷酸序列的性质。在一些实施方案中，进行优化以提高转录水平、提高翻译水平、提高稳态mRNA水平、提高或降低调节蛋白的结合、提高或降低剪接、或提高由多核苷酸序列产生的多肽的产量。可以对多核苷酸序列进行改变以对其进行优化的实例包括密码子优化、G/C含量优化、去除重复序列、去除富含AT的元件、去除抑制转录或翻译的顺式作用元件、添加或去除poly-T或poly A序列、添加转录起始位点周围的增强转录的序列(例如Kozak共有序列)、去除可形成茎环结构的序列、去除去稳定序列及其两种或更多种组合。

术语“融合蛋白”包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列等的连接，所述第一氨基酸序列在自然界中不与所述第二氨基酸序列等天然连接。通常存在于不同蛋白质中的氨基酸序列可以在融合多肽中组合在一起。可以通过化学合成或通过表达多核苷酸来产生融合蛋白。

术语“宿主”指可以向其引入本发明的多核苷酸或载体的任何生物或其细胞，可以是真核生物或原核生物。在一个具体的实施方案中，术语“宿主”指原核生物。

术语“赋形剂”指任一种被添加至本发明的疫苗中以提供所需要的稠度、黏度或稳定效用的非免疫原性物质。

“佐剂”指当添加至免疫原性剂如抗原时，在暴露于该混合物的受试者个体中非特异性提高或增强对该免疫原性剂的免疫应答的物质。

免疫应答如体液免疫应答或细胞免疫应答的“刺激”意指应答的增加，其可产生自引发应答和/或增强应答。

如在本文HPV感染中所用的术语“预防”指的是防止或者阻止个体受到HPV感染。

如在本文HPV感染中所用的术语“治疗”指的是缓解或者减缓HPV感染介导的病理过程。该术语包括使用本发明的融合蛋白或疫苗组合物缓解HPV感染引发的症状或病症或阻止HPV感染引发的疾病。

II.本发明的融合蛋白

本发明的融合蛋白包含突变的HPV16 E6蛋白、三聚化结构域和具有免疫刺激活性的氨基酸序列。所述突变的HPV16 E6蛋白、三聚化结构域和/或具有免疫刺激活性的氨基酸序列之间任选地通过肽接头有效连接，所述肽接头是例如GS或(GGGS)n，其中n是约1-20，且优选1、2、3或4。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有如下氨基酸序列。

融合蛋白16E6fR1的氨基酸序列：

融合蛋白16E6fR2的氨基酸序列

II.A.突变的HPV16 E6蛋白

野生型HPV16 E6蛋白在细胞转化的诱导和维持中起主要作用。野生型HPV16 E6蛋白主要通过刺激许多宿主细胞关键调节蛋白的破坏而作为癌蛋白发挥作用。野生型HPV16E6蛋白与宿主E6AP结合，并通过靶向26S蛋白酶体来灭活肿瘤抑制物p53和p73。随后，DNA损伤和染色体不稳定性提高，并导致细胞增殖和癌症发生。

野生型HPV16 E6蛋白是天然存在的HPV16 E6蛋白，其实例包括但不限于以下序列：NCBI登录号ACK57857.1，GenBank登录号AGS42365.1，AGS42372.1，ABO15571.1，AGS42373.1，ABK32509.1，AHZ96692.1，AAL01368.1，AFS64243.1，AGS42377.1，AGS42352.1，AAD33252.1，AGS42313.1，BAN15947.1，ACK57853.1，NP_041325.1，AGS42269.1，AEV66122.1，AGS42267.1，ACL12310.1，ABO61749.1，AAL01351.1，AAV91676.1，AGS42341.1，AGS42314.1，BAN15937.1，ACS92692.1，AAM29170.1，AAQ10712.1，AAL96621.1，AAL96623.1，AGS42353.1，ADY75574.1，AAL96604.1，AEV66140.1，ACK57870.1，ACJ66712.1，AFS64227.1，AAL96619.1，AAL96620.1，ABO61747.1，ACK57855.1，ADH94042.1，AFS64252.1，AAL96612.1，AFS64257.1，AAL96614.1，ACJ66716.1，BAN15946.1，ADY75573.1，AGS42315.1，AAA91673.1，AAA91669.1，AAA91674.1，AAA91680.1，AAA91681.1，AAA91668.1，AAA91658.1，AAA91662.1，AAA91667.1，AAA91676.1，AAA91671.1，AAA91656.1，AAA91682.1，AAA91657.1，AAA91660.1，AAA91677.1，AAA91678.1，AAA91672.1，AAA91661.1，AAA91664.1，AAA91675.1，AAA91665.1，AAA91663.1，AAA91659.1，AAA91654.1，AAA91666.1，AAA91679.1和AAA91655.1。

野生型HPV16 E6蛋白可来自但不限于HPV16 Phi1、Tha7、Alg1、Sen32、Fra25、Fra63、114K、114B、Z-1194等变异株的E6蛋白。相应HPV16变异株的截短型E6蛋白的序列中氨基酸残基的编号可参照NCBI登录号ACK57857.1进行。

本发明的融合蛋白中的突变HPV16 E6蛋白与野生型HPV16 E6蛋白相比，去除了野生型HPV16 E6蛋白内部具有的诱导细胞恶性转化的位点。在一些实施方案中，所述突变的HPV16 E6蛋白是将野生型HPV16 E6蛋白的第37位、40位、70位及73位的半胱氨酸(C)置换为另一天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述突变的HPV16 E6蛋白是将野生型HPV16 E6蛋白的第37位、40位、70位及73位的半胱氨酸(C)置换为丝氨酸(S)。在一个实施方案中，所述突变的HPV16 E6蛋白是将野生型HPV16 E6蛋白的第37位、40位、70位及73位的半胱氨酸(C)置换为苏氨酸(T)。所述丝氨酸(S)、苏氨酸(T)之间的置换为“保守性置换”。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白中的突变HPV16 E6蛋白具有如下SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列：

1 MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILESVYS KQQLLRREVY DFAFRDLCIV

61 YRDGNPYAVS DKSLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INCQKPLCPE

121 EKQRHLDKKQ RFHNIRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL(SEQ ID NO:9)

本发明的融合蛋白中的突变HPV16 E6蛋白不能与p53结合，因此不再具有诱导细胞恶性转化的活性。

II.B.三聚化结构域

本发明的融合蛋白包含三聚化结构域，以使得与之融合表达的突变HPV16 E6蛋白形成三聚体，从而帮助并稳定突变HPV16 E6蛋白形成正确的、免疫原性更高的构象，以期待达到更好的HPV治疗与预防效果。

本发明的融合蛋白经在宿主细胞中表达后，以稳定的可溶性三聚体形式存在。

本发明的融合蛋白中包含的三聚化结构域可以是T4噬菌体fibritin蛋白质中的折叠子三聚化结构域(foldon trimerization domain)，其序列如SEQ ID NO:1(GSGYIPEAPR DGQAYVRKDG EWVLLSTFL)所示。

II.C.具有免疫刺激活性的序列

本发明的融合蛋白可以利用具有免疫刺激活性的序列。免疫应答如体液免疫应答或细胞免疫应答的“刺激”意指所述应答的增加，其可产生自引发应答和/或增强应答。

本发明的融合蛋白可包含任一类型的具有免疫刺激活性的序列。确定免疫系统的刺激的多种方法已经描述于本领域中，参见例如美国公开号20070027098。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含至少一个如SEQ ID NO:2(GLQQVLL)所示的具有免疫刺激活性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含至少一个如SEQ ID NO:3(APPHALS)所示的具有免疫刺激活性的氨基酸序列。

又在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含至少一个如SEQ ID NO:2所示和至少一个如SEQ ID NO:3所示的具有免疫刺激活性的氨基酸序列。

III.编码本发明融合蛋白的多核苷酸

编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列是密码子优化的。术语“密码子优化的”是指改变其来源核酸分子的基因或编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变由DNA编码的多肽。这样的优化包括用在该宿主生物体的基因中较频繁使用的一种或多种密码子替代其来源核酸分子的密码子。

由于许多氨基酸由多于一种密码子决定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽的范围内变化，而不改变由DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

许多生物体显示出使用特定密码子来编码在生长的肽链中插入特定氨基酸的偏好。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关联，其继而被认为尤其取决于被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可获得性。所选择的tRNA在细胞中的优势一般是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，基于密码子优化，可以设计基因以用于在特定生物体中的最佳基因表达。

密码子使用表可获自http://www.kazusa.or.jp/codon/的“密码子使用数据库”。另外，可以使用多种算法和计算机软件程序来计算最优序列。

在一个实施方案中，编码本发明融合蛋白的核苷酸序列对于人表达是密码子优化的。在另一个实施方案中，编码本发明融合蛋白的核苷酸序列对于原核表达或真核表达是密码子优化的。

在一个实施方案中，编码本发明融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。又在一个实施方案中，编码本发明融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。作为对照的野生型HPV16 E6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

野生型HPV16 E6的核苷酸序列

编码融合蛋白16E6fR1的核苷酸序列

编码融合蛋白16E6fR2的核苷酸序列

IV.包含本发明的多核苷酸的载体

本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。合适的载体包括表达载体。

当将表达载体导入合适的宿主细胞中时，表达载体能够导致其中插入的编码序列转录和翻译。

本发明的表达载体包含编码本文中所述融合蛋白的优化的多核苷酸。

已经在本领域中广泛地描述了表达载体，并且是本领域技术人员公知的。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。可从商业供应商处获得一些常用的表达载体，例如，pBR322、pUC18、pUC19等。

在一个实施方案中，将编码本文中所述融合蛋白的优化的多核苷酸连接入表达载体pET42a(Novagen公司，目录号70561-3)。

V.重组宿主细胞

为了获得本发明的融合蛋白，优选使用被本发明的多核苷酸或载体转化的宿主细胞。

被转化的宿主细胞有利地为细菌细胞，如大肠杆菌细胞，或者酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。

在一个实施方案中，使用大肠杆菌作为宿主细胞来表达本发明的融合蛋白。外源蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解，因此，选择蛋白酶缺失的宿主非常有利于外源蛋白的表达。在一个优选的实施方案中，使用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞，这是一种蛋白酶缺失的大肠杆菌。

本领域公知，使用大肠杆菌作为宿主细胞时，外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体。目前国内外对包涵体中的蛋白质体外复性研究较多，但这个过程往往费时、费力、且不经济，因此，外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是期望的。

当在大肠杆菌中表达野生型HPV16 E6基因时，仅有非常小的一部分野生型HPV16E6蛋白表达在细胞裂解上清液中，而绝大多数的野生型HPV16 E6蛋白表达在包涵体中(附图2的泳道5和6)。

令人吃惊的是，当在大肠杆菌中表达本发明的融合蛋白时，本发明的融合蛋白绝大多数表达在细胞裂解上清液中(附图2的泳道1、泳道3)，而仅有非常小的一部分表达在包涵体中(附图2的泳道2、泳道4)。由此可见，本发明的融合蛋白能够在大肠杆菌中正确折叠，表达有活性的可溶性融合蛋白。

VI.本发明的疫苗组合物

术语“疫苗组合物”、“疫苗”或相似术语可互换使用，指这样的药剂，其适于刺激/诱导/提高个体的免疫系统，以缓解当前的疾病或者保护免于或降低当前或将来的HPV感染，例如降低肿瘤细胞增殖或存活、降低HPV在个体中的复制或传播，或者可检测地减少HPV相关疾病的症状、延长个体的存活率。

本发明的疫苗组合物包含能够诱发保护性免疫反应的有效量的本发明的融合蛋白和可药用载体，例如，赋形剂和/或佐剂。

合适的可药用载体的非限制性实例描述于E.W.Martin的Remington’sPharmaceutical Sciences。

赋形剂的一些实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。本发明的疫苗组合物可以含有pH缓冲剂、润湿剂、乳化剂或稳定剂。

尽管佐剂可以纳入本发明的疫苗组合物中，但是本发明的疫苗组合物不需要必然地包含佐剂。

通常，本发明的疫苗组合物中的佐剂活性包括但不限于(定量或定性)增强该组合物中免疫原性组分(例如，本发明的融合多肽)诱导的免疫应答的能力。这可以减少为产生免疫应答所要求的免疫原性组分的剂量或水平和/或减少为产生所需免疫应答所要求的免疫接种次数或频率。

任何合适的佐剂可以纳入本发明的疫苗组合物中。例如，可以利用基于铝的佐剂。基于铝的合适佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝及其组合。欧洲专利号1216053和美国专利号6,372,223中描述了可以利用的基于铝的佐剂的其他具体例子。其他合适的佐剂包括弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；Merck佐剂65(Merckand Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子方式或阴离子方式衍生化的多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂质A和Quil A；水包油乳液，包括在欧洲专利号0399843、美国专利号7,029,678和PCT公开号WO2007/006939中描述的那些佐剂；和/或额外的细胞因子，如GM-CSF或白介素-2、-7或-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、单磷酰脂质A(MPL)、霍乱毒素(CT)或其构成亚基、热不稳定肠毒素(LT)或其构成亚基、toll样受体(TLR)激动剂，如脂多糖(LPS)及其衍生物(例如，单磷酰脂质A和3-去乙酰化单磷酰脂质A)、黄病毒NS1和胞壁酰二肽(MDP)、CpG寡核苷酸(参见如US 6194388)、聚肌苷酸:聚胞苷酸复合体(Kadowaki等,2001,J.Immunol.166,2291-2295)。

优选地，本发明的疫苗组合物中所使用的佐剂为包含不同TLR激动剂的组合。进一步优选地，本发明的疫苗组合物中所使用的佐剂为聚肌苷酸-聚胞苷酸、CpG佐剂，且还含有稳定剂。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物中的稳定剂是0.01％Tween80和0.5％海藻糖的组合。

在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物还包含突变的HPV16 E7蛋白和/或至少1种选自其他高危型HPV的突变E6和/或突变E7蛋白，所述其他高危型HPV选自其他嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的HPV。

优选地，本发明的疫苗组合物包含本发明的融合蛋白以及至少1种选自HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、70、及73的突变E6和/或突变E7蛋白，所述蛋白的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。

进一步优选地，本发明的疫苗组合物包含本发明的融合蛋白以及至少1种选自HPV16、18、31、33、35、39、45、52及58的突变E6和/或突变E7蛋白，所述蛋白的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。

进一步优选地，本发明的疫苗组合物包含本发明的融合蛋白以及至少1种选自HPV16、18、52及58的突变E6和/或突变E7蛋白，所述蛋白的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。

进一步优选地，本发明的疫苗组合物包含本发明的融合蛋白以及至少1种选自HPV16、18及58的突变E6和/或突变E7蛋白，所述蛋白的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。

特别优选地，本发明的疫苗组合物包含本发明的融合蛋白以及至少1种选自HPV16、18的突变E6和/或突变E7蛋白，所述蛋白的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。

当施用本发明的疫苗组合物至个体时，能够产生针对天然HPV16 E6蛋白的体液免疫应答和细胞免疫应答，从而允许诱导针对肿瘤的预防性和治疗性免疫。

实施例6的结果表明，本发明的疫苗组合物免疫后能够产生中和抗体，中和并阻断天然HPV16 E6蛋白的活性。

实施例7的结果表明，本发明的疫苗组合物免疫后允许特异性识别天然E6蛋白的CD4+和CD8+T细胞的增殖，这种细胞增殖伴随着γ-IFN细胞因子的过量产生。

VII.本发明的融合蛋白或疫苗组合物的用途

本发明还涉及本发明的融合蛋白或疫苗组合物的用途，用于制备治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病的药物，优选地，所述药物能够诱导体液免疫和细胞免疫。

在一个实施方案中，与HPV感染相关的疾病是人乳头瘤病毒导致的癌症，如宫颈癌。

另外，本发明的融合蛋白或疫苗组合物能够用于制备针对HPV的抗体，优选地，单克隆抗体。

具体实施方式

下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。

除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。

实施例1：HPV16 E6变体的构建及表达分析

构建了三种HPV16 E6变体，分别为变体16E6-C4(将野生型HPV16 E6的第37、40、70、73位的氨基酸残基C突变为S，获得SEQ ID NO：9所示的序列)、变体16E6-C7(将野生型HPV16 E6的第37、40、70、73、143、146、147位的氨基酸残基C突变为S)、变体16E6-C13(将野生型HPV16 E6的全部氨基酸残基C突变为S)。将编码所述三种HPV16 E6变体的核苷酸序列分别连接入商业化表达载体pET42a(Novagen公司生产)中，然后转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。将经转化的大肠杆菌细胞分别接种至3ml的LB培养基中，37℃培养过夜。取0.2ml培养过夜的大肠杆菌，接种至ZYM5052自动诱导培养基中，25℃培养24小时。3000rpm离心10min，收集大肠杆菌细胞。上述自动诱导表达的方法是现有技术中已知的方法，参见例如中国专利号CN101235362B。

将自大肠杆菌发酵液1ml离心收集的细胞重悬于500μl PBS溶液中，超声破碎法破碎细胞(宁波新芝超声破碎仪，2#探头，300W功率，总时间10min，超声5s，间隔7s)，12000rpm离心10min，分别收获裂解上清液和沉淀物。

对收获的裂解上清液，采用夹心ELISA法检测三种HPV16 E6变体在大肠杆菌中的可溶性表达量。夹心ELISA法是现有技术中已知的方法，参见例如中国专利公开号CN104513826A。

具体而言，使用本发明人制备的HPV16E6单克隆抗体(采用野生型16E6蛋白免疫小鼠，分离脾淋巴细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经ELISA筛选获得)包被96孔酶标板，80ng/孔，4℃孵育过夜；使用5％牛血清白蛋白(BSA)-PBST室温封闭2h，再用PBST洗板3次。用PBS将裂解上清进行连续2倍稀释，并且将HPV16E6标准品(为本发明人制备的野生型16E6蛋白纯品)也进行梯度稀释，浓度从2μg/ml-0.0625μg/ml，分别加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的兔抗HPV16E6多克隆抗体(采用野生型16E6蛋白免疫兔获得)，每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μlOPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算裂解上清中野生型HPV16E6蛋白、三种HPV16 E6变体的浓度。结果如表1所示。

表1 野生型HPV16 E6蛋白和变体HPV16 E6蛋白的可溶性表达量分析

由表1的结果可见，变体16E6-C4最有利于在大肠杆菌中可溶性表达，推测变体16E6-C7、变体16E6-C13中可能是半胱氨酸突变太多反而影响了突变蛋白的整体结构，不利于可溶性表达。

实施例2：HPV16 E6变体的小鼠免疫和抗体滴度测定

取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，分别用PBS、变体16E6-C4、变体16E6-C7、变体16E6-C13和野生型16E6通过肌肉注射免疫小鼠。各蛋白的免疫剂量为20μg/次，于第0、2、4周免疫，共免疫3次。在第3次免疫后2周尾静脉采血，分离小鼠血清。通过间接ELISA法对免疫血清中的HPV16E6特异性抗体的滴度进行检测。

结果如图1所示。由图1可见，变体16E6-C4、变体16E6-C7、变体16E6-C13和野生型16E6免疫小鼠后均可诱发HPV16 E6特异性抗体，其中变体16E6-C4、变体16E6-C7诱发的抗体滴度与野生型16E6相当，16E6-C13诱发的抗体滴度显著低于野生型16E6，表明HPV16 E6中4个或7个半胱氨酸突变不影响HPV16 E6的免疫活性。

结合实施例1的可溶性表达情况，选择变体16E6-C4作为本发明融合蛋白的一个组分。

实施例3：包含变体16E6-C4的融合蛋白编码核苷酸序列的产生及表达载体构建

构建了以下融合蛋白：融合蛋白f16E6R1、融合蛋白f16E6R2；融合蛋白16E6fR1(SEQ ID NO:4)、融合蛋白16E6fR2(SEQ ID NO:5)；以及融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f。融合蛋白f16E6R1、融合蛋白f16E6R2是在变体16E6-C4(SEQ ID NO:9)的N端融合三聚化序列(SEQ ID NO:1)、C端融合免疫刺激序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)、且在变体16E6-C4的C端与免疫刺激序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)的N端有1个拷贝的GGGS接头序列；融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f是在变体16E6-C4(SEQ ID NO:9)的C端顺序融合免疫刺激序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)和三聚化序列(SEQ ID NO:1)、且在免疫刺激序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)的N端和C端各有1个拷贝的GGGS接头序列。

编码融合蛋白f16E6R1、融合蛋白f16E6R2；融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2；以及融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f的核苷酸序列由上海生工生物工程技术服务有限公司进行全基因合成，经NdeI/HindIII酶切位点有效连接入商业化表达载体pET42a(Novagen公司生产)中。由此，获得了分别包含所述融合蛋白的核苷酸序列的表达载体(下文中，分别命名为pET42a-f16E6R1、pET42a-f16E6R2；pET42a-16E6fR1、pET42a-16E6fR2；以及pET42a-16E6R1f、pET42a-16E6R2f)。类似地，作为对照，获得包含野生型HPV16 E6基因的表达载体(下文中命名为pET42a-16E6)。

实施例4：包含变体16E6-C4的融合蛋白在大肠杆菌细胞中的表达

将实施例3获得的表达载体分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，获得分别包含所述表达载体的大肠杆菌细胞。然后，将包含各表达载体的大肠杆菌细胞分别接种至3ml的LB培养基中，37℃培养过夜。取0.2ml培养过夜的大肠杆菌，接种至ZYM5052自动诱导培养基中，25℃培养24小时。3000rpm离心10min，收集大肠杆菌细胞。上述自动诱导表达的方法是现有技术中已知的方法，参见例如中国专利号CN101235362B。

实施例5：包含变体16E6-C4的融合蛋白的表达鉴定

取实施例4中的分别表达野生型HPV16E6蛋白、融合蛋白f16E6R1、融合蛋白f16E6R2；融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2；以及融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f的大肠杆菌发酵液各1ml，离心收集细胞后，重悬于500μl PBS溶液中，超声破碎法破碎细胞(宁波新芝超声破碎仪，2#探头，300W功率，总时间10min，超声5s，间隔7s)，12000rpm离心10min，分别收获裂解上清液和沉淀物。各融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。结果如下表2所示。

表2 野生型HPV16 E6蛋白和各融合蛋白的可溶性表达量分析

由表2可见，融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2；以及融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f能够较好地在大肠杆菌中可溶性表达。在融合蛋白的N端是三聚化序列时，不利于融合蛋白的可溶性表达。随后，选择融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2；以及融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f进行小鼠免疫。

另外，对于获得的裂解上清液和沉淀物还进行了Western印迹鉴定。具体地，分别向裂解上清液和沉淀物加入6×上样缓冲液(Loading Buffer)，95℃变性8分钟，分别取10μl进行Western印迹鉴定。

结果如图2所示。由图2可见，野生型HPV16E6蛋白、融合蛋白HPV16E6fR1和融合蛋白HPV16E6fR2均可被大肠杆菌细胞表达，其中融合蛋白HPV16E6fR1和融合蛋白HPV16E6fR2的大小约21.8kDa，以可溶性表达为主；野生型HPV16E6蛋白大小约17.4kDa，以包涵体表达为主。Western印迹鉴定的方法是现有技术中已知的方法，参见例如中国专利号CN101148661B。

实施例6：融合蛋白的小鼠免疫和抗体滴度测定

取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，分别用PBS、融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2、融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f和野生型16E6通过肌肉注射免疫小鼠。各蛋白的免疫剂量为20μg/次，于第0、2、4周免疫，共免疫3次。在第3次免疫后2周尾静脉采血，分离小鼠血清。通过间接ELISA法对免疫血清中的HPV16E6特异性抗体的滴度进行检测。

结果如图3所示。由图3可见，融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2、融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f和野生型16E6免疫小鼠后均可诱发HPV16 E6特异性抗体，其中融合蛋白16E6R1f、融合蛋白16E6R2f诱发的抗体滴度与野生型16E6相当，融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2诱发的抗体滴度可达10³以上，显著高于野生型16E6，这表明融合蛋白从N端至C端为变体16E6-C4、三聚化结构域和免疫刺激序列的排列能够显著地提高HPV16 E6的免疫活性。

实施例7：融合蛋白联合佐剂免疫小鼠及特异性抗体滴度测定

取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，分别用融合蛋白16E6fR2联合聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)(InvivoGen公司，货号tlrl-pic)及CpG1018(由上海生工公司合成)免疫小鼠，具体分组及免疫剂量如表3所示。皮下注射，于第0，2，4周免疫，共3次。第3次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。

表3 实验小鼠分组及剂量

组名	疫苗成分及剂量(/次)
		无佐剂组	融合蛋白16E6fR2 20μg
联合poly I:C组	融合蛋白16E6fR2 20μg，poly I:C 25μg
		联合CpG1018组	融合蛋白16E6fR2 20μg，CpG1018 25μg
联合poly I:C+CpG1018组	融合蛋白16E6fR2 20μg，poly I:C 25μg，CpG1018 25μg
		PBS对照组	PBS 100μl

使用间接ELISA法对免疫血清的HPV16E6特异性抗体滴度进行检测，结果如图4所示，仅联合使用poly I:C佐剂或CpG佐剂，对融合蛋白16E6fR2诱发的特异性抗体水平有增强效果，但联合使用poly I:C佐剂和CpG佐剂，则可更显著地提高融合蛋白16E6fR2诱发的特异性抗体水平，且与仅联合使用poly I:C佐剂或CpG佐剂相比，抗体水平亦有明显提高。表明poly I:C佐剂及CpG佐剂复合佐剂可显著提高融合蛋白16E6fR2的免疫活性，具有应用前景(使用SPSS软件，单因素方差分析(One-way ANOVA))。

实施例8：融合蛋白联合佐剂在小鼠体内诱发特异性细胞免疫反应的测定

取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组4只，分别用野生型16E6、融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2联合聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)及CpG1018免疫小鼠，具体分组及免疫剂量如表3所示。皮下注射，于第0，2，4周免疫，共3次。第3次免疫后10天，取小鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞。

表4 佐剂实验小鼠分组及剂量

组名	疫苗成分及剂量(/次)
		野生型16E6	野生型16E6 20μg，poly I:C 25μg，CpG1018 25μg
融合蛋白16E6fR1	融合蛋白16E6fR1 20μg，poly I:C 25μg，CpG1018 25μg
		融合蛋白16E6fR2	融合蛋白16E6fR2 20μg，poly I:C 25μg，CpG1018 25μg
佐剂对照组	poly I:C 25μg，CpG1018 25μg

使用ELISPOT法对各组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的HPV16E6特异性T细胞进行检测，结果如图5所示。

由图5可见，野生型16E6、融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2联合佐剂免疫小鼠可诱发HPV 16E6特异性细胞免疫反应，但融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2诱发的细胞免疫反应水平均显著高于野生型16E6。表明2种改造的融合蛋白16E6fR1、融合蛋白16E6fR2诱发特异性细胞免疫反应的能力均优于野生型16E6，具有应用前景(使用SPSS软件，单因素方差分析分析)。

以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

序列表

<110> 长沙诺盟生物医药有限公司

<120> 包含突变的HPV16 E6蛋白的融合蛋白和疫苗组合物

<130>

<160> 9

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T4噬菌体fibritin蛋白质中的折叠子三聚化结构域

<400> 1

Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val

1 5 10 15

Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有免疫刺激活性的氨基酸序列

<400> 2

Gly Leu Gln Gln Val Leu Leu

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有免疫刺激活性的氨基酸序列

<400> 3

Ala Pro Pro His Ala Leu Ser

1 5

<210> 4

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白16E6fR1的氨基酸序列

<400> 4

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Ser Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly Ser

145 150 155 160

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

165 170 175

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Gly Ser Gly

180 185 190

Leu Gln Gln Val Leu Leu

195

<210> 5

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白16E6fR2的氨基酸序列

<400> 5

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Ser Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly Ser

145 150 155 160

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

165 170 175

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Gly Ser Ala

180 185 190

Pro Pro His Ala Leu Ser

195

<210> 6

<211> 474

<212> DNA

<213> 野生型HPV16 E6

<400> 6

atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60

cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120

aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180

tatagagatg ggaatcctta tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240

agtgagtata ggcattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300

aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360

gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420

ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctg 474

<210> 7

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白16E6fR1的核苷酸序列

<400> 7

atgcaccaaa agcgtaccgc tatgtttcag gacccgcaag aacgccctcg caagttgcca 60

cagctgtgta ccgaactcca aactacgatc cacgatatca ttctggagag tgtgtatagc 120

aaacagcagt tgctgcgccg cgaagtatac gattttgctt ttcgtgatct ttgtattgtc 180

tatcgcgatg gtaacccgta tgccgtaagc gataagagtt tgaaatttta ctctaagatt 240

agtgagtacc ggcattattg ctattcctta tatgggacca cacttgaaca gcaatacaat 300

aagccgttgt gtgatttact tatccgctgc atcaattgtc agaaaccact ctgcccggag 360

gagaaacagc gtcatttaga caagaaacag cggttccaca acattcgtgg tcgctggact 420

ggccggtgta tgtcctgttg ccggtccagt cgtacacggc gcgaaactca acttggttct 480

gggtatattc cggaggcgcc acgggatggt caagcatacg ttcgtaagga tggcgagtgg 540

gttctgcttt caacattcct cggtggtggt tcagggttac agcaggtctt gctt 594

<210> 8

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白16E6fR2的核苷酸序列

<400> 8

atgcaccaaa aacgtacagc aatgtttcag gatccacagg agcgtccacg caaactgcca 60

caattgtgta ctgagcttca aactacgatt cacgacatca ttttggaatc agtttattct 120

aagcaacaat tgcttcggcg cgaggtgtac gactttgcat tccgtgatct gtgcattgtc 180

tatcgggatg ggaatccata cgcagttagt gacaaatccc tcaagttcta ttcgaagatt 240

tccgaatacc ggcactactg ttactccctt tatggtacaa cattagagca acaatacaac 300

aagccattgt gtgacctctt gattcgctgt atcaactgtc agaagccttt atgcccggag 360

gaaaagcaac gtcatctgga taagaaacaa cgcttccata atattcgtgg gcggtggaca 420

ggccggtgta tgtcatgctg tcgtagcagt cgtacgcggc gcgaaacaca actcggttca 480

ggctatatcc cagaagcccc acgtgacggt caggcctatg ttcgtaaaga tggggagtgg 540

gtgcttcttt ccaccttcct cggcgggggt tcagcgccac ctcacgctct gtca 594

<210> 9

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变HPV16 E6蛋白

<400> 9

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Ser Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

145 150 155

Claims

1.一种融合蛋白，其从N端至C端包含突变的HPV16 E6蛋白、三聚化结构域和具有免疫刺激活性的氨基酸序列，所述突变的HPV16 E6蛋白与野生型HPV16 E6蛋白相比，去除了野生型HPV16 E6蛋白内部具有的诱导细胞恶性转化的位点。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述突变的HPV16 E6蛋白是将野生型HPV16E6蛋白的第37位、40位、70位及73位的半胱氨酸(C)置换为另一天然存在的氨基酸残基，其中，所述野生型HPV16 E6蛋白的氨基酸残基的编号是参照NCBI登录号ACK57857.1进行的，例如，所述野生型HPV16 E6蛋白具有NCBI登录号ACK57857.1的序列，例如，所述另一天然存在的氨基酸残基是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述三聚化结构域位于突变的HPV16 E6蛋白C端，例如，所述所述三聚化结构域具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述具有免疫刺激活性的氨基酸序列位于三聚化结构域C端，例如，所述具有免疫刺激活性的氨基酸序列如SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:3所示。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

6.一种多核苷酸，其编码权利要求1－5中任一项所述的融合蛋白。

7.一种载体，其包含权利要求6所述的多核苷酸，优选地，所述载体为原核表达载体。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的多核苷酸或权利要求7所述的载体，优选地，所述宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。

9.一种疫苗组合物，其包含权利要求1－4中任一项所述的融合蛋白和可药用载体，例如，赋形剂和/或佐剂，优选地，所述佐剂为铝佐剂、油包水乳剂、水包油乳剂、TLR刺激剂或这些佐剂的组合物，更优选地，所述佐剂为TLR刺激剂，例如，所述佐剂为聚肌苷酸-聚胞苷酸及CpG寡聚核苷酸的组合物。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其还包含突变的HPV16 E7蛋白和/或至少1种选自其他高危型HPV的突变E6和/或突变E7蛋白。

11.根据权利要求1－5中任一项所述的融合蛋白的用途或根据权利要求9或10所述的疫苗组合物的用途，用于制备治疗和/或预防与HPV感染相关的疾病的药物，优选地，所述药物能够诱导体液免疫和细胞免疫，例如，所述与HPV感染相关的疾病是宫颈癌。

12.根据权利要求1－5中任一项所述的融合蛋白的用途或根据权利要求9或10所述的疫苗组合物的用途，用于制备针对HPV的抗体，优选地，单克隆抗体。