JP2003509035A

JP2003509035A - ポリエピトープポリペプチドをコードする核酸

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Publication number: JP2003509035A
Application number: JP2001523039A
Authority: JP
Inventors: マリーリンヒドリー; ロバートシー．アーバン; ローマンエム．シックス
Original assignee: ザイコスインク．
Priority date: 1999-09-16
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2003-03-11
Also published as: EP1214097B3; EP2100620A1; WO2001019408A9; DE60042556D1; EP1214097A4; CA2384987A1; PT1214097E; AU7589100A; CY1109699T1; DK1214097T3; EP1214097B1; WO2001019408A1; ES2330078T3; EP1214097B9; EP1214097A1; AU785319B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、1種以上のタンパク質に由来する複数のエピトープを含むポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸を提供する。ポリエピトープポリペプチドは、病原性物質または腫瘍の治療において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、一般に、ワクチンに関し、詳細には、核酸ワクチンに関する。

【０００２】背景技術パピローマウィルスは、約9,000塩基対の環状2本鎖ゲノムの非エンベロープDN
Aウィルスである。75種類を越えるHPV型がDNAレベルで種類分けされており、こ
れらは組織向性に基づいて広義的にファミリーに分類することができる。

【０００３】組織学的、分子的および疫学的証拠が、いくつかのHPV株が頚部形成異常およ
び頚部癌に関与していることを示している。中程度および重症の頚部上皮内癌(C
IN)の殆どが、これらの病変の組織学的に異常な上皮に主に検出されるHPV DNAを
含有するという見解を多数の研究が裏付けている。持続的HPV感染は頚部癌発生
の主要な危険因子であると考えられている。HPV DNAは、細胞変性効果を示す細
胞内でエピソーム形態で容易に見いだされるが、HPV DNAは重症度の高い前癌病
変および癌の殆どに関連する細胞の染色体中に組み込まれている。約23種類のHP
V型が通常肛門性器スクリーニングプログラムで見いだされるが、わずかに10〜1
5種類だけが進行性疾病に関与しているにすぎない。16型および18型が頚部異形
成および頚部癌に関連して通常見いだされる。

【０００４】パピローマウィルスは9つのオープンリーディングフレームを含有する。形質
転換特性を有するHPV遺伝子はオープンリーディングフレームE6およびE7にマッ
ピングされている。実質的な生化学的研究は、HPV E6タンパク質がタンパク質p5
3を不活性化し、一方でE7タンパク質が網膜芽腫(Rb)タンパク質機能を妨害する
ことを証明している。p53およびRbは、細胞分割阻害物質として作用する腫瘍抑
制タンパク質であるので、E6およびE7によるそれらの不活性化は細胞を細胞周期
のS期に移行させる。E6およびE7の発現はいくつかの初代細胞系統を不死化する
のに十分であり、E6またはE7機能の遮断は形質転換状態を元に戻すことが示され
ている。

【０００５】発明の開示本発明は、1つ以上の抗体結合エピトープまたはクラスIもしくはクラスII MHC
結合エピトープを各々含有するポリペプチドセグメントが、縦に連結されること
で、エピトープを放出するように細胞内でタンパク質分解処理されるポリエピト
ープポリペプチドを形成することができるという発見に一部基づいている。これ
らのハイブリッドポリペプチドは、特に抗原提示細胞(APC)中で核酸から発現さ
れる場合に、免疫応答を刺激するのに有用である。

【０００６】一局面において、本発明は、各セグメントが少なくとも11アミノ酸長である第
一、第二および第三のセグメントを任意の順序で含むことができるハイブリッド
ポリペプチドをコードする核酸を特徴とする。本明細書において使用する「セグ
メント」とは、(a)天然型タンパク質の部分（すなわち、全長に満たない断片）
配列に対応し、および(b)1つ以上のエピトープを含有するアミノ酸配列である。
明確にするために、「セグメント」という用語は、本明細書において、ハイブリ
ッドポリペプチドの一部を示すために使用されるが、「部分」という用語は天然
型タンパク質の対応する一部を示すために使用される。「エピトープ」とは、MH
CクラスIもしくはクラスII分子の結合溝または抗体の抗原結合領域に結合するペ
プチドを意味する。メチオニンコドンは、好ましくは、翻訳を容易にするために
、本発明のこの配列または任意の他のコード配列の5'側末端に含まれる。加えて
、ハイブリッドポリペプチドは、以下に詳細に記載するように、標的シグナル配
列をコードすることができる。

【０００７】本発明のハイブリッドポリペプチドにおけるセグメントとエピトープとの関係
を図1に模式的に示す。例示するハイブリッドポリペプチドは、各セグメントが
別個に天然型タンパク質の部分に相当するセグメント1、2、3および4を含む。セ
グメント1は細胞内でタンパク質分解処理されて、エピトープa、bおよびcを産生
することができる。同様に、セグメント2はタンパク質分解処理されて、エピト
ープd、eおよびfを産生することができ、セグメント3は処理されてエピトープg
、h、i、jおよびkを産生することができ、セグメント4は、処理の結果、エピト
ープl、m、nおよびoを産生する。以下に規定するように、隣合うセグメントは隣
接していてもまたはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分
離されていてもよい。

【０００８】一態様において、本発明のハイブリッドポリペプチドの第一のセグメントは、
(1)病原体の天然型タンパク質または(2)天然型腫瘍抗原（集合的に「天然型タン
パク質」と呼ぶ）の部分アミノ酸配列を有し、少なくとも11アミノ酸長であり、
少なくとも2つのエピトープを含有する。第二のセグメントは同じかまたは異な
る天然型タンパク質の第二の部分アミノ酸配列を有し、少なくとも11アミノ酸長
であり、第一のセグメントのエピトープとは異なる少なくとも2つのエピトープ
を含む。第三のセグメントは同じかまたは異なる天然型タンパク質の第三の部分
のアミノ酸配列を有し、少なくとも11アミノ酸長であり、第一および第二のセグ
メントのエピトープとは異なる少なくとも2つのエピトープを含む。第一、第二
および第三の部分が同じ天然型タンパク質由来である場合には、それらはそのタ
ンパク質中で隣接しておらず、3つ全ての部分の合計が天然型タンパク質の全長
の配列の70%未満を構成することができる。または、第一、第二および第三の部
分が2つまたは3つの異なる天然型タンパク質の部分であってもよい（例えば、2
つまたは3つの異なる腫瘍抗原、またはHPVなどの1つ、2つまたは3つの異なる病
原体の2つまたは3つの異なる天然型タンパク質）。ポリペプチドは、必要に応じ
て、追加のセグメントを含んでもよく、例えば、ポリペプチドが、他のセグメン
トが由来するタンパク質と同じであっても、異なっていてもよい、病原体の天然
型タンパク質および/または天然型腫瘍抗原の部分である、少なくとも4個、5個
、10個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、75個、90個または100個
以上ものセグメントを含んでもよい。これらの各セグメントは少なくとも11アミ
ノ酸長であってもよく、各々は第一、第二および第三のセグメントのエピトープ
とは異なる少なくとも1つのエピトープ（好ましくは2つ以上）をそれぞれ含有す
る。ハイブリッドポリペプチドのセグメントの少なくとも1つ（好ましくは少な
くとも2つまたは3つ）は例えば3、4、5、6、7または10以上ものエピトープ、特
にクラスIもしくはクラスIIMHC結合エピトープを含有してもよい。セグメントの
2つ、3つまたはそれ以上はハイブリッドポリペプチド内で隣接していてもよく、
すなわち、それらは間にスペーサーを置くことなく末端と末端とで接続される。
または、任意の2つの隣り合うセグメントはスペーサーアミノ酸またはスペーサ
ーペプチドによって連結されてもよい。

【０００９】ハイブリッドポリペプチドが細胞に導入されると、構成エピトープの少なくと
もいくつかにタンパク質分解処理される。ポリペプチド内でセグメントから産生
されるエピトープの少なくともいくつかは細胞内に存在するMHCクラスIまたはMH
CクラスIIに結合することができるが、エピトープのいくつかは他の細胞にのみ
存在するMHCクラスIまたはクラスII分子に特異的であってもよい。または、エピ
トープは、B細胞表面の抗体受容体に結合する結果抗体媒介性免疫応答を誘発す
るB細胞エピトープであってもよい。

【００１０】ハイブリッドポリペプチド内の所定のセグメントは、少なくとも1つのエピト
ープ、例えば2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のエピトープを産生するのに十
分に長ければ、任意の規定の長さである必要はなく、少なくとも11アミノ酸長で
ある。例えば、所定のセグメントは少なくとも12アミノ酸、例えば少なくとも13
アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、40
アミノ酸または50アミノ酸の鎖長を有することができる。所定のセグメントは、
セグメントの任意の11アミノ酸（またはそれ以上）の連続が天然型タンパク質の
部分中に全く同じ順序で見いだされる場合には、特定の天然型タンパク質に相当
する。HPV株16のE6およびE7タンパク質はそれぞれ158アミノ酸長および98アミノ
酸長であり、HPV株18のE6およびE7タンパク質はそれぞれ158アミノ酸長および10
5アミノ酸長である。セグメントは、好ましくは、100アミノ酸長より少なく（HP
V株16E7タンパク質の95アミノ酸より少ない）であり、さらに好ましくは70アミ
ノ酸長より少ないまたは50アミノ酸長より少ない（例えば、20〜50アミノ酸）で
ある。一態様において、それは15アミノ酸長より少ない。ポリエピトープポリペ
プチド内のセグメントはポリペプチド内で任意の順序に整列されてもよい。ハイ
ブリッドポリペプチドは、好ましくは、HPV株16または18由来の全長で無傷のE6
または全長で無傷のE7タンパク質の配列と同じ配列を含有しない。これらのタン
パク質の配列は、1999年12月7日に概説されているように、ウェブサイト(ftp://
ftp-t10.lanl.gov/pub/papilloma/SWISS-PROT-files/Human-papilloma/HPV16.sw
p)および(ftp://ftp-t10.lanl.gov/pub/papilloma/SWISS-PROT-files/Human-pap
illoma/HPV18.swp)で見つけることができる。

【００１１】セグメントは任意の腫瘍抗原または病原体の天然型抗原タンパク質由来であっ
てもよい。本明細書において使用する「病原体」とは哺乳類に疾病を引き起こす
ウィルスまたは微生物を意味する。「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞内で発現される
が、腫瘍細胞の非腫瘍相同物である細胞上では発現しないか、わずかな程度で発
現されるタンパク質またはエピトープを意味する。このような腫瘍抗原は、腫瘍
細胞を正常な細胞と識別するマーカーとして働くことが多い。腫瘍抗原は、例え
ば、Her2/neu遺伝子、前立腺特異的抗原遺伝子、T細胞に認識されるメラノーマ
抗原(MART)遺伝子およびメラノーマ抗原遺伝子(MAGE)によってコードされるタン
パク質などの、表1に掲載する腫瘍抗原の1つ以上であってもよい。病原体由来の
タンパク質の例には、細胞に慢性的に感染するヒトパピローマウィルス(HPV)、
ヒト免疫不全ウィルス(HIV)、単純性疱疹ウイルス(HSV)、B型肝炎ウィルス(HBV)
またはC型肝炎ウィルス(HCV)などのウィルス；ミコバクテリア、ヘリコバクター
ピロリ(Helicobakuter pylori)のようなヘリコバクター(Helicobacter spp)、も
しくはクラミジア(Chlamydia spp.)などの細菌；真菌；またはプラスモディウム
(Plasmodium)種などの寄生性真核生物のゲノムから天然に発現されるタンパク質
を含む。

【００１２】本発明のポリエピトープポリペプチドにいずれかが含まれてもよい、適切なタ
ンパク質のクラスI結合エピトープの代表的なリストは表2に含まれる。

【００１３】ハイブリッドポリペプチドはHPVタンパク質由来の第一のエピトープと、第一
のエピトープに重複せず、同じかまたは異なるHPVタンパク質に由来する第二の
エピトープを含有することができる。（「異なるHPVタンパク質」は、第一のタ
ンパク質が由来するHPV株以外で異なるHPV株由来の第一のタンパク質の同一では
ない相同物を含むことができる。）第一のエピトープは第一の主要組織適合性抗
原複合体(MHC)クラスIアロタイプに結合し、第二のエピトープは、第一のMHCク
ラスIアロタイプと異なる第二のMHCクラスIアロタイプに結合する。

【００１４】ハイブリッドポリペプチドは、異なるタンパク質由来のタンパク質断片または
必要に応じてスペーサーアミノ酸またはスペーサー配列が接続し、必要に応じて
メチオニン残基または標的シグナル（以下参照）に連結される、1つのタンパク
質の隣接していない断片から作製されるので、このハイブリッドポリペプチドの
配列は天然型タンパク質または天然型タンパク質の断片のアミノ酸配列と同じで
ない。エピトープの1つ以上は、例えばHPV E6またはE7タンパク質由来であって
もよく、タンパク質は例えばHPV株16型、18型、31型、33型、43型または45型由
来であってもよい。従って、ハイブリッドポリペプチドは、例えば各HPV株16E6
およびE7タンパク質由来の1つ以上のセグメントおよび/または各HPV株18E6およ
びE7タンパク質由来の1つ以上のセグメントを含んでもよい。ハイブリッドポリ
ペプチドは少なくとも33アミノ酸長であり、例えば、少なくとも34アミノ酸、35
アミノ酸、40アミノ酸、44アミノ酸、45アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、10
0アミノ酸、150アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸または300アミノ酸の鎖長
であってもよい。

【００１５】ハイブリッドポリペプチドのエピトープが結合するMHCクラスIアロタイプは任
意のヒトクラスIアロタイプ、例えばHLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11および/
またはHLA-A24であってもよい。所定のエピトープは乱交雑であってもよく、す
なわち、2つ以上のアロタイプに結合してもよい。

【００１６】ハイブリッドポリペプチドは、HPVタンパク質の第三のエピトープを含んでも
よい。本発明のエピトープは、第一および/または第二のエピトープと同じかま
たは異なるHPVタンパク質に由来してもよく、第一および第二のMHCクラスIアロ
タイプとは異なる第三のMHCクラスIアロタイプに結合する。それは、当然のこと
ながら、第三のMHCクラスIアロタイプ以外に第一および/または第二のMHCクラス
Iアロタイプに結合してもよい。ハイブリッドポリペプチドは、1つ以上のHPVタ
ンパク質由来の例えば、少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個
、25個、35個、40個、50個、60個、80個または100個以上ものMHCクラスIアロタ
イプ結合エピトープを含んでもよい。これらのエピトープのいくつかは重複して
もよい。

【００１７】

【表１】腫瘍抗原

【００１８】

【表２】クラスI関連腫瘍および病原体エピトープ

【００１９】特に明記しない限り、本発明のハイブリッドポリペプチドのいずれかのエピト
ープはある程度重複してもよく、例えば第一のエピトープは第三のエピトープと
重複してもよく（すなわち、少なくとも1つのアミノ酸残基、および1つを除いた
全ての残基までを共有する）、または重複しなくてもよい。

【００２０】ポリペプチドは、必要に応じて、標的シグナルを含んでもよい。標的シグナル
は、接続するペプチドの細胞内輸送または分泌を指示するペプチドである。標的
シグナルは、その部位で機能する限り、シグナル配列のようなアミノ末端、また
はカルボキシ末端またはハイブリッドポリペプチド内にあってもよい。

【００２１】標的シグナルは認識される任意のシグナル配列、例えばアデノウィルスE3タン
パク質由来のシグナル配列であってもよい。好ましい標的シグナルは、HLA-DRα
のシグナルペプチド：（配列番号：63）である。

【００２２】標的シグナルは、エピトープから標的配列の切断を、例えばシグナルペプチダ
ーゼによる促進するために、標的シグナルと隣り合うセグメントとの間の接続部
にアミノ酸置換を導入するよう、必要に応じて改変されてもよい。

【００２３】ハイブリッドポリペプチド内のセグメントのいずれかはスペーサーアミノ酸ス
ペーサー配列によって他と分離されてもよい。

【００２４】本発明の核酸は、第一のHPVタンパク質由来である第一のエピトープと、第一
のHPVタンパク質とは異なる第二のHPVタンパク質由来である第二のエピトープと
を含むハイブリッドポリペプチドをコードすることができる。第二のHPVタンパ
ク質は第一のHPVタンパク質内では生じない第二のエピトープの配列を提供し、
すなわち、題意著のエピトープと第二のエピトープは必ず異なるタンパク質由来
である。異なるタンパク質はHPVの同じかまたは異なる株、例えば16型および18
型に由来してもよい。ハイブリッドポリペプチドは、当然のことながら、同じか
もしくは異なるHPVタンパク質に由来する追加のエピトープ、または他の病原体
もしくは腫瘍抗原に由する追加のエピトープを含んでもよい。

【００２５】１つのHPVタンパク質由来の複数（例えば、少なくとも2個、3個、4個、5個、6
個、7個、8個、9個、10個、15個、20個または30個）のMHCクラスI結合エピトー
プを含むハイブリッドポリペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内である。
ハイブリッドポリペプチド全体の配列は、例えば遺伝子工学的な技法によって実
施される配列の挿入、内部欠損または置換によって天然型HPVタンパク質または
天然型HPVタンパク質の断片の配列と同じではない。

【００２６】核酸は、HPV株16E6タンパク質由来の複数のHLA結合エピトープ、HPV株16E7タ
ンパク質由来の複数のHLA結合エピトープ、HPV株18E6タンパク質由来の複数のHL
A結合エピトープおよびHPV株18E7タンパク質由来の複数のHLA結合エピトープを
含むハイブリッドポリペプチドをコードすることができる。複数のエピトープは
各々HLA-A1結合エピトープ、HLA-A2結合エピトープ、HLA-A3結合エピトープ、HL
A-A11結合エピトープおよびHLA-A24結合エピトープからなる群から選択されるエ
ピトープを含むことができ、好ましくはこの群から選択される少なくとも2つま
たは3つを含むことができる。複数のエピトープの各々のメンバーは他の複数の
エピトープの各々のメンバーとは異なる。複数のエピトープの各々は少なくとも
2つのHLA-A1結合エピトープ、少なくとも2つのHLA-A2結合エピトープ、少なくと
も2つのHLA-A3結合エピトープ、少なくとも2つのHLA-A11結合エピトープおよび/
または少なくとも2つのHLA-A24結合エピトープを含むことができる。所定の複数
個が2つ以上のセグメントに分布することができる。

【００２７】本発明はまた、図5のペプチドセグメントの任意の1つ以上を含むハイブリッド
ポリペプチド（配列番号：157）をコードする核酸を含む。従って、ポリペプチ
ドはセグメント：の1つ以上を含むことができる。セグメントは処理されて多数のエピトープを産
生することができる。ハイブリッドポリペプチドは、図5のペプチドセグメント
の1つ以上および追加のHPV E6またはE7配列を含んでもよい。最も好ましくは、
セグメントは100アミノ酸、70アミノ酸、50アミノ酸、40アミノ酸、30アミノ酸
または20アミノ酸より少ない。ハイブリッドポリペプチドは、好ましくは、HPV
株16または18由来の全長で無傷のE6タンパク質または全長で無傷のE7タンパク質
の配列と同じ配列を含有しない。

【００２８】 HPVなどのウィルス、細菌または寄生性真核生物のような感染体の1つ以上のタ
ンパク質の重複しない少なくとも3つのセグメントを含むハイブリッドポリペプ
チドをコードする核酸も本発明において特徴づけられている。各セグメントは、
HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A24アロタイプの1つ以上に結合す
る少なくとも3つのエピトープを含み、これらのアロタイプの少なくとも3つ、好
ましくは4つ、または5つ全てがハイブリッドポリペプチドのエピトープに結合す
る態様もある。ハイブリッドポリペプチド全体の配列は天然型タンパク質の配列
と同じではない。ハイブリッドポリペプチド全体の配列はいかなる天然型タンパ
ク質の断片の配列とも同じではなく、すなわち、ポリペプチドは天然型タンパク
質の単なる切断以外の何らかによって、天然型タンパク質の配列とは異ならなけ
ればならない。

【００２９】上記の核酸はプラスミド、細菌ベクターまたはウィルスベクターの形態で提供
することができる。核酸がインビボにおいて使用される場合には、上記の核酸を
含有するプラスミドベクターを使用することが好ましい。ベクターは、好ましく
は、関心のある細胞中で発現することができる1つ以上の調節配列（プロモータ
ーを含んでもよい）を含有する発現ベクターである。調節配列は、ハイブリッド
ポリペプチドを発現させるように、ハイブリッドポリペプチドをコードする配列
に機能的に結合される。

【００３０】プラスミド、細菌またはウィルスベクターが一時的または安定的に導入されて
いる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）細胞も本発明の範囲
内である。細胞は、例えばB細胞、樹状細胞(DC)、ランゲルハンス細胞、または
他の抗原提示細胞(APC)であってもよい。細胞は培養しても、またはハイブリッ
ドポリペプチドをコードする、例えばプラスミドのような核酸からハイブリッド
ポリペプチドを発現させることができる条件下において維持してもよい。

【００３１】本明細書において使用する「単離DNA」は、(1)全長の配列がいずれの天然型DN
A内にもないDNA、および(2)全長の配列が天然型DNA内にあるが、その配列が天然
に存在する生物のゲノム内ではその配列に隣接する遺伝子がないDNA、を含む。
従って、用語は、ベクター、自己複製するプラスミドもしくはウィルス、または
原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAを含む。それは
また、cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製される断片
または制限断片などの単独の分子も含む。

【００３２】本発明はさらに、上記の核酸によってコードされるハイブリッドポリペプチド
を含む。本明細書に記載するハイブリッドポリペプチドは、必要に応じて、アミ
ノ末端メチオニン残基を含んでもよい。本明細書に記載するハイブリッドポリペ
プチドはまた、必要に応じて、最後のエピトープコード配列の3'側末端に直接配
置されるGLAG(または他のモノクローナル抗体決定因子)または抗体認識部位（例
えば、mycまたはhisタグ）を含んでもよい。図2または表3に引用するアミノ酸配
列の1つ以上を単独で、縦に一列に並んでまたは重複して含むことができる上記
のセグメントもハイブリッドポリペプチドに含まれる。セグメントの少なくとも
いくつかは1つ以上の天然型タンパク質の部分に相当する。セグメントはスペー
サーアミノ酸またはスペーサーペプチドによって分離されてもよい。

【００３３】本明細書に記載するハイブリッドポリペプチドは実質的に純粋なポリペプチド
であってもよい。「実質的に純粋なポリペプチド」は、(1)全長の配列がいずれ
の天然型ポリペプチドの配列とも同じではないポリペプチド、(2)天然型ポリペ
プチドの配列を有するが、ポリペプチドが天然に存在する生物的状況（例えば、
細胞）内に天然にポリペプチドを随伴するような成分（タンパク質および他の天
然型有機分子）から分離されているポリペプチド、を含む。典型的には、ポリペ
プチドは、製剤中のタンパク質の少なくとも重量パーセントで60%を構成する場
合には実質的に純粋である。好ましくは、製剤中のタンパク質の少なくとも重量
パーセントで75%、さらに好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも
99%がポリペプチドである。

【００３４】核酸（例えば、ウィルス、細菌ベクターまたはプラスミドベクター）またはハ
イブリッドポリペプチドは、必要に応じて、ポリマー基質も含む微小粒子の形態
で提供することができる。好ましい態様において、ポリマー基質は、本質的に、
ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)またはポリ乳酸ポリグリコール酸共重合
体(PLGA)のコポリマーからなる。微小粒子は、好ましくは、直径が例えば0.02〜
20ミクロンであるかまたは約11ミクロン未満である。複数の微小粒子は、好まし
くは、平均径が約0.02〜20ミクロン、約11ミクロン未満、または約5ミクロン未
満である。

【００３５】または、本明細書に記載する核酸およびハイブリッドポリペプチドはリポソー
ムもしくは免疫刺激複合体(ISCOMS)に組み入れられても、または天然型ポリマー
、合成ポリマー、バイオポリマー、陽イオン脂質、縮合剤、デンドリマー、他の
生体材料、オイル含有アジュバント、およびQS21またはサポニンなどの他のアジ
ュバントと共に送達してもよい。または、本明細書に記載する核酸およびハイブ
リッドポリペプチドは当技術分野で周知の任意の他の好適な送達基剤を使用して
投与しても、または（水溶液以外の）送達基剤を使用しないで、例えば「裸のDN
A」で送達してもよい。

【００３６】本発明はまた、上記の核酸またはポリペプチド、薬学的に許容される担体、お
よび必要に応じて上記の送達基剤の1つを含有する治療用組成物を含む。

【００３７】上記の核酸またはハイブリッドポリペプチドを哺乳類に投与することによって
、哺乳類の免疫応答（例えば、抗体応答またはMHCクラスI媒介性もしくはクラス
II-媒介性免疫応答を含む、細胞性免疫応答）を誘発する方法も提供される。好
ましくは、哺乳類は、ポリエピトープポリペプチドから誘導されるエピトープに
結合する少なくとも1つのMHCクラスIアロタイプまたはIIアロタイプを産生する
。哺乳類は、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウ
マ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マウス、ラット、モルモットまたはハムスターであっ
てもよい。

【００３８】エピトープの少なくとも1つがHPVエピトープである場合には、本発明の方法に
適当な被験者には、例えば、外長性コンジローマ、扁平コンジローマのようなコ
ンジローマ、頚部癌、他のHPV関連癌疾病または状態、呼吸器乳頭腫、結膜乳頭
腫、生殖管または肛門管HPV感染または頚部形成異常に罹患しているかまたはそ
の危険にさらされているヒトが含まれる。核酸もしくはハイブリッドポリペプチ
ドまたはこれらの組成物の1つ以上を含有する送達基剤は哺乳類の膣、鼻腔、下
気道、眼球のような粘膜組織に直接投与しても、または胃腸管（例えば、直腸、
頚部または皮膚）組織に適用してもよい。または、核酸もしくはハイブリッドポ
リペプチド、またはこれを含有する送達基剤は、全身に、例えば、静脈内、筋肉
内、皮内、経口、皮下、動脈内、腹腔内またはクモ膜下に投与してもよい。

【００３９】「スペーサーアミノ酸」とは、本発明のポリペプチドの隣り合う2つのセグメ
ント（順番に「A」および「B」）の間に挿入される1つの残基を意味し、この場
合、残基は、AおよびBが由来するそれぞれの全長のタンパク質（それぞれ、「X
」および「Y」）のAのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸とは異なり、Bのアミ
ノ末端に隣接するアミノ酸とも異なる。このように、スペーサーアミノ酸は、本
発明のポリペプチドのX-由来A配列とY-由来B配列の不連続点となる。典型的には
、アミノ酸は20の天然型アミノ酸、例えばAla、Leu、IleまたはGlyの1つであり
、一般に、(1)タンパク質XのAのカルボキシ末端に天然に隣接するアミノ酸、お
よび(2)タンパク質YのBのアミノ末端に天然に隣接するアミノ酸を除く、いかな
るアミノ酸であってもよい。

【００４０】「スペーサー配列」とは、本発明のポリペプチドの例えば「A」と「B」のよう
の隣り合う2つのセグメントの間に挿入される2つ以上のアミノ酸の配列を意味す
る。スペーサーの配列は、AおよびBが由来するそれぞれの全長のタンパク質（「
X」および「Y」）のAのカルボキシ末端とBのアミノ末端とに隣接する配列とは異
なる。このように、スペーサー配列は、本発明のポリペプチドにおけるX-由来A
配列とY-由来B配列の不連続点となる。

【００４１】スペーサー配列の例には、Ala Ala、Ala Leu、Leu Leu、Leu Ala、Leu Ile、A
la Ala Ala、Ala Gly Leu、Phe Ile Ile等が挙げられる。一般に、スペーサー配
列は非極性アミノ酸を含むが、特に3残基より長いスペーサー配列では、Glu、Gl
n、Ser、HisおよびAsnなどの極性残基が存在してもよい。各スペーサー配列の総
鎖長の上限および性質だけは、ポリペプチドおよび/または核酸の合成の容易さ
、タンパク質分解処理および操作性の検討から得る。約4または5残基より長いス
ペーサー配列を使用することは一般に不必要で、おそらく望ましくないが、スペ
ーサーは、例えば6残基、8残基、10残基、15残基、20残基、30残基または50残基
までであってもよい。当然のことながら、スペーサーは50残基より長くてもよい
。

【００４２】スペーサーアミノ酸およびスペーサー配列は、エピトープを放出する処理を促
進するのに有用である。スペーサーは、典型的には、細胞内で所定のセグメント
のエピトープ間の任意の配列のタンパク質分解処理によってポリペプチドから除
去される。これは、MHC分子または（細胞から分泌されると）抗体に結合するた
めに、エピトープを無傷のままにしておく。スペーサーアミノ酸またはスペーサ
ー配列の一部が、不完全な処理によりエピトープに付着したままになることがあ
る。これは、一般に、MHC分子への結合にほとんどまたは全く影響を与えない。

【００４３】本発明の利点は、病原体または腫瘍抗原のタンパク質の一部の配列だけを有す
るポリペプチド由来のMHCクラスIまたはクラスII結合エピトープの送達が可能に
するということである。従って、ウィルスタンパク質による抗原提示の妨害また
は特定のウィルスタンパク質もしくは腫瘍抗原の過剰発現に見られる有害な影響
に関連する問題は回避される。

【００４４】本発明の別の利点は、核酸配列または核酸配列を含有する送達基剤は関連する
免疫応答、例えば、マクロファージ、NK細胞およびT細胞からのIL-12およびγ-
インターフェロン(IFN)の放出を促進することができるということである。例え
ば、DNAを含有するマイクロスフェアの食作用は、一般に、ヒトAPCによるTNFお
よびIFN分泌を促進することができる。

【００４５】本発明のさらに別の利点は、本明細書に記載するポリエピトープポリペプチド
内にエピトープを寄せ集めることで、少なくとも1つのエピトープが種々のHLAア
ロタイプの各々によって提示される可能性を高めるということである。これによ
り、1つのハイブリッドポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を使
用して、HLA遺伝子座が多型である患者集団を免疫することができる。ハイブリ
ッドポリペプチドは、同じ病原体の2つ以上の株を含む特定の病原体に特異的で
あっても、または2つ以上の病原体由来のエピトープを含有してもよい。または
あるいはさらに、ハイブリッドポリペプチドは特定の腫瘍抗原に特異的であって
も、または2つ以上の腫瘍抗原由来のエピトープを含有してもよい。

【００４６】特に明記しない限り、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全
て、本発明が属する分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。好
適な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載するものと類似または
等価な方法および材料も本発明を実施または試験する際に使用することができる
。本明細書に記述する全ての文献、特許出願、特許および他の参照文献はその全
体の内容が組み入れられる。訴訟の場合には、定義を含む本発明の明細書が統制
する。加えて、材料、方法および実施例は例示的にすぎず、限定する意図のもの
ではない。

【００４７】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかになる。

【００４８】詳細な説明本発明は、各セグメントが1種以上のMHCクラスIまたはII拘束性エピトープ、
またはその両方を含んでいるような、複数の免疫原性セグメントを含むポリエピ
トープポリペプチドをコードしている核酸を提供する。本発明の核酸およびポリ
ペプチドは、多様なMHCアロタイプを有する個体集団における病原体、腫瘍また
は自己免疫疾患に対する予防的または治療的免疫応答の惹起もしくは増強に有用
である。加えて本発明の核酸およびポリペプチドは、インビトロＴ細胞刺激アッ
セイ法における陽性対照として、および細胞内でのエピトープのプロセシングを
理解するための手段としても有用である。

【００４９】ポリエピトープポリペプチド内に存在する1個以上のセグメントは、複数の個
別のエピトープへプロセシングされ、典型的には細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)免疫応
答に関連しているMHCクラスI結合エピトープ、または典型的にはヘルパーＴ細胞
免疫応答に関連しているMHCクラスII結合エピトープのいずれかを形成すること
ができる。別のエピトープは、エピトープ特異的抗体の産生を刺激するＢ細胞エ
ピトープであることができる。

【００５０】本発明に含まれるのは、HPVに関連した感染症、特にいぼに関連した感染症、
頸部または肛門の形成異常、頸部癌、および他のHPV関連癌の予防または治療に
有用な、ポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸である。例えば、本
発明のポリペプチドおよび核酸は、HPVに感染していることがわかっている対象
、HPV感染が疑わしい対象、またはおそらくHPVに感染し始めた対象において、ワ
クチンとして予防的または治療的に使用することができる。他の適した対象は、
HPVに関連した状態の症状を示している、またはおそらくこれを発症しているも
のを含む。免疫原性ポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードしてい
る核酸も、例えばボーエン様丘疹、肛門形成異常、気道または結膜の乳頭腫、頸
部形成異常、頸部癌、外陰部癌、または前立腺癌のような、HPV株16の感染症に
関連した状態の、予防または治療のためのワクチンとして有用であることができ
る。これらは更に、他のHPV株に関連した状態、特にHIV株6型、11型、18型、31
型、33型、35型、および45型に関連した状態の治療に使用することができる。こ
れらの状態は、例えば、外長性コンジローマ(HPV株6型および11型)、扁平コンジ
ローマ、特に頸部(HPV株6型、11型、16型、18型、および31型)、巨大コンジロー
マ(HPV株6型および11型)、頸部癌(HPV株18型、31型、および33型、加えてHPV株1
6型)、気道および結膜の乳頭腫(HPV株6型および11型)、および生殖管HPV感染症(
HPV株6型、11型、16型、18型、31型、33型および35型)を含む。

【００５１】 HPVタンパク質由来のMHC結合エピトープの同定効果的細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)反応を生じるエピトープについて、これは抗原
提示細胞(APC)上のMHC分子に結合しなければならず、かつ得られる受容体リガン
ド複合体は、CTL上に発現されたＴ細胞受容体により認識されなければならない
。特異的MHC対立遺伝子に結合するエピトープは、最初に例えばHPV E6またはE7
などのHPVタンパク質のような、関心のあるタンパク質由来の一連の重複するペ
プチドセグメントを合成し、かつ当技術分野において認められた結合試験におい
て、該ペプチドを、MHC対立遺伝子に結合することがわかっている放射性標識し
たペプチドを用い試験することにより同定することができる。被験ペプチドが、
例えば、放射性標識した被験ペプチド(すなわちこれはエピトープである)との競
合により測定されるような、MHC対立遺伝子への特異的結合を示しているならば
、このエピトープは、追加のエピトープ(重複または隣接している)と組合わせて
、セグメントを作成または定義することができる。

【００５２】あるいは、エピトープは、放射標識したβ2-ミクログロブリンおよび被験ペプ
チドの存在下における可溶性MHC分子のリフォールディングにより同定すること
ができる。この完全な複合体は、リフォールディングされかつ正確なサイズの受
容体を作成するであろう。β2-ミクログロブリンは、該複合体から、被験ペプチ
ドの結合親和性と直接相関する測定可能な速度で解離する(Garbocziら、Proc. N
at. Acad. Sci. USA、89:3429〜33(1992)；Parkerら、J. Biol. Chem.、267:545
1-5459(1992)；および、Parkerら、J. Immunol.、149:1896〜1904(1992))。この
種のデータの分析は、所定の被験ペプチドのHLA-A2受容体に関する解離時間を推
定するアルゴリズムをもたらす(Parkerら、J. Immunol.、152:163-175(1994))。
速い解離は低い親和性に相関し、かつ遅い解離は高い親和性に相関している。こ
のアルゴリズムは拡大され、かつエピトープのHLA-A、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3
、HLA-A11およびHLA-A24アロタイプの結合親和性の推定に利用することができる
。このアルゴリズムは、ウェブサイト(http://wwwbimas.dcrt.nih.gov/molbio/h
la_bind/index.html)に見ることができる。列記された5種のHLA-A受容体のひと
つに結合することが当技術分野において公知であるHPV16E6およびE7エピトープ
の大半は、このアルゴリズムにより、2時間より長いβ2-ミクログロブリン解離
時間を生じると推定される。

【００５３】エピトープ結合は同じく、HPV16E6およびE7由来の以前に同定されたエピトー
プを用いて決定することができる(Kastら、J. Immunol.、152:3904〜12(1994))
。HPV18E6由来およびE7由来のエピトープのような、その他のHPV推定エピトープ
に関する追加の結合試験は、前述のプロトコールのひとつを用い、5種のHLA-Aア
ロタイプの各々に関連する結合アッセイ法においてHPV18E6およびE7タンパク質
由来の重複する8量体、9量体、または10量体を用いて行われる。

【００５４】あるいは、エピトープは、本明細書に参照として組入れられている、米国特許
第5,827,516号、および米国特許出願第09/372,380号に開示された技法を用い、M
HCクラスIまたはクラスII結合ペプチドを同定することにより同定することがで
きる。

【００５５】エピトープのＴ細胞アッセイ法先に説明されたMHC分子にインビトロで結合するエピトープは、インビトロ免
疫感作アッセイ法において、ヒトＴ細胞反応刺激時のそれらの有効性について分
析することができる。このアッセイ法は、HPVタンパク質に由来するいくつかの
ものを含む、ヒトおよびマウスのＴ細胞反応性エピトープを同定するために先に
使用されている(Alexanderら、Amer. J. Obstet. and Gynecol、175:1586〜1593
(1996)；Tarpeyら、Immunology、81:222〜27(1994))。これらのアッセイ法は更
に、免疫治療のための非常に多数の特異的CTLを作成するために使用することも
できる(Tsaiら、Crit. Rev. Immunol.、18:65〜75(1998))。信頼性を確かにする
ためには、被験ペプチドでパルスされた樹状細胞(DC)存在下で、Ｔ細胞刺激の第
一ラウンドを行うことが望ましい。更にこの刺激時のIL-10の混入(inclusion)に
より、該細胞培養時に時折生じることがある非特異的反応を抑制することができ
る。次にＴ細胞活性化が、γ-IFN分泌を測定するELISAアッセイ法を用いるか、
もしくは、3色分析によりγ-IFNを含有するCD8+、CD16-細胞の増加を決定するFA
CSを使用することにより試験される。あるいは、Ｔ細胞活性化は、⁵¹Cr放出CTL
アッセイ法または四量体ベースのアッセイ法を用いて測定することができる。

【００５６】所定のアロタイプを伴う個体のあらゆるものが特定のエピトープには反応しな
い可能性がある。例えば、その細胞がHLA-A2アロタイプを生じるひとつの個体は
、所定のエピトープに反応することができるのに対し、第二のこのような個体は
反応できないことがある。この示差的反応性の理由のひとつは、HPVに感染して
いるこれらの個体が、自然の個体よりも、前駆体Ｔ細胞のより高い頻度をあらか
じめ有することがあるからである。別の理由は、これら2種の個体間のＴ細胞レ
パートリーの差異に関連しているであろう。この困難さを克服するために、各HL
Aアロタイプについて、2名のドナー、および更に好ましくは3名のドナー由来の
Ｔ細胞を試験することができる。より一般的な対立遺伝子(すなわち、HLA-A2お
よびHLA-A3)については、最大4名のドナーが試験されることが好ましい。

【００５７】各エピトープは最初に、1名のドナー由来の細胞で試験される。第一のドナー
細胞を用いてエピトープがＴ細胞反応を刺激しないならば、再度第二のドナー由
来の細胞で試験し、次に第三のドナーで試験する。2または3回試行した後にエピ
トープがＴ細胞反応性を示さないならば、本発明のポリペプチドにおいて提示さ
れることは好ましくない。

【００５８】抗原のインビトロ提示が実施される別法は、分析を高めることができる。DCに
よる最初のＴ細胞刺激は、典型的にはインビトロ免疫感作の一部である。免疫感
作を増強するために、DCが各刺激ラウンド毎に添加され、例えば先に作出されか
つその後凍結されたDCを使用することにより、適当な抗原提示およびＴ細胞刺激
を確実にする。白血球パック(leukopak)または血液検体を、高度に落屑性の上皮
内病変(HSIL)または頸部癌の個体から得ることができる。これらの個体は、イン
ビボで感作され(初回抗原刺激)、かつ自身の血中に増大した数のＴ細胞を有する
。

【００５９】あるいは、本明細書およびシッツ（Chicz）らの論文(J. Exp. Med.、178:27〜
47(1993))、および米国特許第5,827,516号に開示されているように、このエピト
ープは、それらのHLA分子への結合親和性のみを基にした構築物、又は自然にプ
ロセシングされたペプチドの分析を基に同定された構築物中への封入について選
択することができる。

【００６０】 HPV株16E6および株16E7タンパク質において発見された配列を基にしたハイブ
リッドポリペプチド(配列番号：126)のアミノ酸配列を、図2に示す。このハイブ
リッドポリペプチドは、E6タンパク質断片(アミノ酸7〜26位(配列番号：64)、44
〜67位(配列番号：65)、および79〜101位(配列番号：66))およびE7タンパク質(
アミノ酸7〜25位(配列番号：67)、44〜57位(配列番号：68)、および82〜98位(配
列番号：69))の断片の融合により作出される。このハイブリッドポリペプチドへ
の網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質の結合を妨げるためには、E7タンパク質のアミノ
酸26位および27位が含まれないことである。加えて、アミノ酸24位のシステイン
は、セリン残基に転換される。先に定義されたような用法において、これは、そ
のセリン残基を、25残基と共に、E7タンパク質残基7〜23位および4〜57位に各々
相当するセグメント間の「スぺーサー配列」としている。

【００６１】 HPV株18E6および株18E7タンパク質において認められた配列を基にした第二の
ハイブリッドポリペプチド(配列番号：159)のアミノ酸配列を、図4に示す。この
ハイブリッドポリペプチドは、E6タンパク質(アミノ酸9〜50位(配列番号：152)
および84〜110位(配列番号：153))、およびE7タンパク質(アミノ酸5〜23位(配列
番号：154)、59〜72位(配列番号：155)、および85〜101位(配列番号：156))の断
片の融合により作出される。

【００６２】 HPV株16および18のE6およびE7タンパク質中に認められた配列を基にした第三
のハイブリッドポリペプチド(配列番号：157)のアミノ酸配列を、図5に示す。こ
のハイブリッドポリペプチドは、HPV株16E6タンパク質(アミノ酸7〜26位(配列番
号：64)、44〜67位(配列番号：65)、および79〜101位(配列番号：66))、HPV株16
E7タンパク質(アミノ酸7〜25位(配列番号：67)、44〜57位(配列番号：68)、およ
び82〜98位(配列番号：69))、およびHPV株18E6タンパク質(アミノ酸9〜50位(配
列番号：152)および84〜110位(配列番号：153))、およびHPV株18E7タンパク質(
アミノ酸5〜23位(配列番号：154)、59〜72位(配列番号：155)、および85〜10位(
配列番号：156))の断片の融合により作出される。前述のように、配列番号：126
のハイブリッドポリペプチドに関して、Rbタンパク質に結合するポリペプチドを
作出するであろうHPV株16E7タンパク質のアミノ酸は除外される。更に、配列番
号：126中に存在するものと同じ挿入されたスペーサー配列は、各々、残基7〜23
位および44〜57位に相当するセグメント間に位置する。

【００６３】本明細書に記したハイブリッドポリペプチドのいずれかひとつは、任意に開始
メチオニン、リーダー配列、またはいずれかの標的配列(例えば、膜貫通ドメイ
ン)を含むことができる。「標的（targeting）配列」および「輸送(trafficking
)配列」という用語は、本明細書において区別なく使用される。例えば、第三の
ハイブリッドポリペプチドがそのアミノ末端に付加されたメチオニンを有するな
らば、これは配列番号：158のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号：161のヌクレ
オチド配列によりコードされている。更に第三のハイブリッドポリペプチドが、
そのアミノ末端にHLA-DRαリーダー配列を有するならば、これは配列番号：160
のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号：162のヌクレオチド配列を有する核酸に
よりコードされている。

【００６４】表3は、HPV株16E6およびE7並びにHPV株18E6およびE7ポリペプチド由来のその
他のMHC結合エピトープの一覧である。これらのエピトープのいずれかを、本発
明のハイブリッドポリエピトープに組込むことができる。

【００６５】

【表３】 HPV E6およびE7 MHC結合エピトープ

【００６６】複数のHPVエピトープを含むポリペプチドをコードしている核酸前述のように同定されたエピトープを含むポリエピトープポリペプチドをコー
ドしている核酸は、例えば重複PCRまたはオリゴヌクレオチドの連結のような、
標準の技術を用いて作出することができる。コドンは、細菌または哺乳類システ
ムにおけるポリエピトープポリペプチドの産生を最適化するために、構築物内に
含まれるように選択されることが好ましい。

【００６７】コードされたポリエピトープポリペプチド中の様々なセグメント、例えば異な
るタンパク質由来の、または同じタンパク質の非隣接領域由来のセグメントなど
は、これらのセグメントの接合部のアミノ酸配列が公知のヒトタンパク質と偶然
の類似性を示すかどうかを決定するために、例えば、BLASTプログラムのような
配列解析プログラムを用いてチェックすることができる。相同性が存在する場合
、このポリペプチドは、相同領域を除去するために、ポリペプチド内のエピトー
プの順番を変更するように、デザインし直すことができる。特定のエピトープそ
れ自身が公知のヒトタンパク質の一部と75％以上同じであるならば、これはポリ
エピトープポリペプチド内に含まれないことが好ましい。

【００６８】自然のタンパク質における個々のセグメントの間のアミノ酸配列の一部(すな
わち少なくとも1個の残基)が欠失していたとしても、所定のポリエピトープポリ
ペプチド内のセグメントの順番は、自然のタンパク質においてセグメントが出現
する順番に対応することができる。あるいは、セグメントの順番は、天然のタン
パク質とは異なってもよい。天然のアラインメントがヒトタンパク質との相同の
領域を有するポリペプチドを生じるならば、後者の配置が好ましい。

【００６９】 HPV由来のエピトープについて、核酸構築物は、HPV E7タンパク質中の公知の
網膜芽細胞腫タンパク質(Rb)結合部位を含むエピトープをコードしていないこと
が好ましい。この構築物は、例えばHPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、およびHPV18E7
タンパク質の各々に由来する2〜5個のセグメントを含むポリペプチドをコードし
ており、ここで各セグメントは、HLA対立遺伝子であるHLA-A1、HLA-A2、HLA-A3
、HLA-A11およびHLA-A24の1個以上に結合するエピトープを含んでいる。これは
、ポリエピトープポリペプチド中の約60〜100個のエピトープに関して、1個のHL
A対立遺伝子につき約12〜20個のエピトープに相当している。

【００７０】調節エレメントは、ポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸の発現
を促進するために、この構築物に含むことができる。これらのエレメントは、ヒ
トまたは他の哺乳類細胞中の発現を増強する配列、例えばプロモーター、コード
配列の5'および／または3'側のRNA安定化配列、イントロン(コードされた配列の
内側または隣接するいずれかの位置に配置することができる)、およびポリ(A)付
加部位に加え、複製起点および原核生物および／または真核生物宿主において構
築物が複製および選択され得るための1個以上の選択マーカーをコードしている
遺伝子を含む。T7ポリメラーゼプロモーターまたは他の種類のプロモーター(例
えば、筋特異的プロモーターのような組織特異的プロモーター、またはAPC特異
的プロモーターのような細胞特異的プロモーター)は、任意にコード配列の5'末
端に存在し、かつFLAGまたは他のmAb決定基をコードしている配列は、任意に最
後のエピトープコード配列のすぐ3'側に存在する。この構築物は更に、コザック
配列のような、転写および翻訳シグナルも含むことができる。

【００７１】この構築物は更に、ポリエピトープポリペプチドを望ましい細胞内区画へと向
ける標的シグナルをコードしている配列を含むことができ、この標的シグナルは
、ポリエピトープポリペプチドに連結されている。標的シグナルは、該ポリエピ
トープポリペプチドを、小胞体(ER)、ゴルジ体、核、リソソーム、クラスIIペプ
チドローディング区画、またはエンドソームに向けることができ、かつシグナル
ペプチド(翻訳時にタンパク質をERへと向けるアミノ末端配列)、 (配列番号：111)のようなER残留ペプチド、のようなリソソーム標的ペプチド、並びにK、R、D、E、F、I、VおよびLから選択
された4個の残基が片側に隣接したQを有するその他のペンタペプチドを含む。更
にポリペプチドの膜への挿入を指示する標的シグナル(例えば膜貫通配列)が含ま
れる。膜挿入配列を含むポリペプチドは、細胞質尾部を伴うまたは伴わないかの
いずれかで構築することができる。

【００７２】 ER標的配列の例は、HLA-DRαリーダー配列 (配列番号：63)である。この標的配列は、この特定化された25個の残基配列の一
部(例えば少なくとも10個のアミノ酸残基)のみを含むことができるが、但しこの
部分はポリペプチドのERへの標的化を引き起すのに十分でなければならない。

【００７３】核局在化配列は、ヌクレオプラスミン-およびSV4O-様核標的シグナルを含み、
これはChelskyら、Mol. Cell Biol.、9:2487(1989)；Robbins、Cell、64:615(19
91)；および、Dingwallら、TIBS、16:478(1991)に記されている。一部の核局在
化配列は、を含む。

【００７４】場合によっては、標的シグナルのアミノ酸配列を、シグナルペプチダーゼまた
は他のタンパク質分解剤による切断を促進するように修飾することが望ましい。
シグナルペプチダーゼの認識配列は、Von Heijne、Nucleic Acids Research、14
:4683(1986)に記されている。フォンヘイン（von Heijne）の-3、-1ルールを用
いて、標的シグナルが存在する場合、シグナルペプチダーゼによる切断が成功す
る可能性を増大する配列を選択することができる。

【００７５】本明細書に記したポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸は、任意
に翻訳を促進するためにそのポリペプチドのアミノ末端にメチオニン残基をコー
ドしてもよい。

【００７６】望ましいならば、スペーサーアミノ酸またはスペーサー配列は、セグメントの
各対の間に挿入することができる。アラニンスペーサーは、単独のDNA構築物に
コードされた複数の個々のエピトープをうまく分離するために使用されている(T
oesら、Proc. Nat Acad. Sci. (USA)、94:14660〜65(1997))。

【００７７】単独のタンパク質由来のエピトープ含有セグメントは、該タンパク質中に出現
するように見える順番(すなわち、アミノ末端からカルボキシ末端まで)で出現す
ることができる。あるいは、所定のタンパク質由来のセグメントは、自然のタン
パク質において出現する順番以外の順番で整列することができ、かつ1種以上の
他のタンパク質由来のセグメントと共にグループを造るか、または混合すること
ができる。この構築物は、単独のポリエピトープポリペプチド、または各々異な
るプロモーター、例えばデュアルプロモーターベクターの制御下にある、複数の
ポリエピトープポリペプチドをコードすることができる。デュアルプロモーター
ベクターは、2個の比較的短いポリエピトープポリペプチドを、所定のベクター
により産生されたエピトープ数を減らすことなく、単独のより長いもの(version
)と置き換えることができる。更に、最初のポリエピトープポリペプチドの配列
およびおそらくはそのプロセシングを変更することなく、新たなエピトープを追
加することも可能である。

【００７８】ポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸は、患者の抗原提示細胞(A
PC)中での発現を可能にするようないずれかのベクター内で使用することができ
る。このベクターは好ましくは、非組込みウイルスベクターであるか、またはプ
ラスミドまたは細菌ベクターのような非ウイルスベクターである。適当なベクタ
ーの例は、PCR産物の直接かつ迅速なクローニングを可能にする、peDNA哺乳類発
現ベクターファミリー(Invitrogen社)である。このベクターは、追加のエピトー
プ、例えばHPV株16および株18のHPV E6およびE7タンパク質由来のMHCクラスI HL
A-A1、HLA-2、HLA-3、HLA-11、およびHLA-24拘束性エピトープなどを含むように
修飾することができる。

【００７９】このポリペプチドがプロセシングされかつ予想されるエピトープがHLAにより
提示されるかどうかを決定するために、インビトロＴ細胞刺激アッセイ法を、
ポリエピトープポリペプチドコード配列を含む組換えワクシニアウイルスで感染
した自己PBLまたはEBV形質転換細胞を用いて行うことができる。これらの標的細
胞は、PBLを組換えワクシニアと感染多重度3〜10pfu/細胞で、37℃で2時間イン
キュベーションすることにより作出することができる。感染後、細胞はペレット
化され、洗浄され、かつインビトロ刺激アッセイ法における標的として使用され
る。異なるHLAアロタイプを持つ1名以上の個体に由来した刺激されたＴ細胞を、
標的細胞と共にインキュベーションし、かつ標的細胞のＴ細胞刺激能を、例えば
γ-インターフェロンの発現または分泌により測定する。

【００８０】あるいは、ポリエピトープポリペプチド由来のエピトーププロセシングを、ヒ
ト細胞から精製されたプロテアソームを用いて試験することができる(Theobald
ら、J. Exp. Med.、188:1017(1998)；Kisselevら、J. Biol. Chem.、289:3363(1
999)；および、Nussbaumら、Proc. Nat. Acad. Sci. (USA)、95:12404(1998))。

【００８１】前述のＴ細胞アッセイ法に加え、トランスジェニック動物を利用するアッセイ
法を用いて、インビボにおいて送達された場合の該構築物の機能(例えば、エピ
トープは正確にプロセシングされかつ提示される)を検証することができる。HLA
-A2拘束性提示を測定するためには、哺乳類発現ベクター(例えばプラスミド)内
のポリエピトープ構築物を、マイクロスフェア内に封入し、かつHLA-A2トランス
ジェニックマウスへと筋肉内または皮下注射などの経路により導入する。あるい
はこの構築物は、例えば組換えワクシニアウイルス中でまたは裸のDNAとしてな
ど、マイクロスフェア送達担体を伴わずに投与することができる。その後Ｔ細胞
応答がインビトロにおいて試験される(Hedleyら、Nature Med.、4:365〜68(1998
))。標的細胞は、試験されるA2エピトープでパルスされたT2A2細胞(HLA-A2をコ
ードしているDNAでトランスフェクションされたT2細胞)またはEL4A2細胞(HLA-A2
をコードしているDNAでトランスフェクションされたEL4細胞)および本発明の核
酸が導入されているT2A2細胞である。平行試験は、非ペプチドまたは無関係のペ
プチドでパルスされたT2A2細胞を用いて行われる。この方法では、本発明の核酸
の投与後にインビボにおいてプロセシングおよび提示されるHLA-A2エピトープが
同定される。陽性の結果は、ポリエピトープポリペプチドのプロセシングが予想
通り生じたことを示唆している。

【００８２】ポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸に加え、ポリエピトープポ
リペプチドそれ自身を、腫瘍または病原体(例えばHPV)感染症、もしくはこのよ
うな感染症に関連した状態の予防または治療のための医薬品の製造において使用
することができる。

【００８３】エピトープおよび免疫原性エピトープをコードしている核酸の送達当技術分野で認められた様々な送達システムを用いて、ポリエピトープポリペ
プチド、またはポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸を、適当な細
胞に送達することができる。抗原性MHCクラスI拘束エピトープのDNA送達の利点
は、このエピトープは、標的細胞それ自身の内部で産生され、そこでの免疫原性
エピトープが結合するクラスI MHC分子との相互作用が、速度論的に好ましいこ
とである。これは、エピトープは、細胞表面上へのMHC分子の提示前にMHC分子と
結合するように、抗原性エピトープをMHC分子に細胞内で特異的には指示しない
標準のワクチンプロトコールとは対照的である。

【００８４】ポリエピトープポリペプチドおよびポリエピトープポリペプチドをコードして
いる核酸は、生理食塩水のような薬学的に許容できる担体内で、または希釈剤を
伴うまたは伴わないコロイド状懸濁剤として、もしくは散剤として送達すること
ができる。これらは、「裸である」かまたは送達担体と会合することができ、か
つ当技術分野において公知の送達システム、例えば脂質、リポソーム、マイクロ
スフェア、微小粒子またはマイクロカプセル、金粒子、ISCOMS、ナノ粒子、ポリ
マー、凝集剤、多糖、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、QS21、吸収増強
物質、アジュバント、または脂肪酸などを用いて送達することができる。適当な
微小粒子の例は以下に説明する。

【００８５】ポリエピトープポリペプチド、またはポリエピトープポリペプチドをコードし
ている核酸は、例えばDonnellyらの論文(J. Imm. Methods、176:145(1994))およ
びVitielloらの論文(J. Clin. Invest.、95:341(1995))に記されたような常法を
用いて投与することができ、かつ例えば経口、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜
下、皮内、腹腔内、鼻腔内、肺内、眼内、膣内、直腸内または皮下のような、当
技術分野において公知の方法のいずれかで対象に送達することができる。これら
は、消化管または気道に、例えば微小粒子を含有する液剤または散剤の吸引によ
り導入することができる。投与は局所的(例えば、頸部、皮膚、または他のHPV感
染部位)または全身性であることができる。

【００８６】 1回投与につき体重1kgあたりポリペプチド約0.1〜100μmol、またはDNA約1〜2
000μgの用量が投与されると予想される。患者が成人である場合、ワクチン投与
計画は、微小粒子内で送達される場合プラスミドDNAの10〜1000μgの筋肉内、静
脈内、経口または皮下などへの投与、もしくは、筋肉内または皮内に3〜6回反復
して送達された裸のプラスミドDNAの約10〜2500μg、例えば100〜2000、または5
00〜1000μgを含むことができる。当然医療分野において周知であるように、所
定の患者についての用量は、患者のサイズ、全身の健康状態、性別、体表面積、
年齢、投与される具体的化合物、投与回数および経路、並びに他の同時に投与さ
れる薬物を含む、多くの要因によって決まる。適正用量の決定も通常の薬理学者
の能力の範囲内である。

【００８７】他の標準送達法、例えば粒子銃導入またはエクスビボ処置なども使用すること
ができる。エクスビボ処置において、樹状細胞、末梢血単核細胞、または骨髄細
胞のような抗原提示細胞(APC)は、患者または適当なドナーから入手することが
でき、かつエクスビボにおいて免疫原性組成物により活性化され、かつ次に患者
に移植または再注入される。

【００８８】腫瘍または感染症、例えばHPV感染症またはHPV感染症に関連した状態を治療す
るために、ポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸、またはポリエピ
トープポリペプチドそれ自身は、単独で、または当技術分野において公知の他の
治療、例えば化学療法的投薬計画、放射線療法および手術などと組合わせて投与
することができる。加えて、本発明のポリペプチドおよび核酸は、当技術分野に
おいて周知のように、例えばアジュバントまたはサイトカイン(またはサイトカ
インをコードしている核酸)との同時投与のように、免疫応答を増強するために
設計された他の治療と共に投与することができる。

【００８９】マイクロスフェア送達ある好ましい送達法において、ポリエピトープポリペプチドをコードしている
核酸、またはポリエピトープポリペプチドそれら自身は、マイクロスフェアを用
いて送達される。米国特許第5,783,567号に開示されたものを含むマイクロスフ
ェアは、DNA、RNA、またはポリペプチドのような巨大分子の細胞への送達のため
の担体として使用することができる。マイクロスフェアは、ポリマー基質中に包
埋されたまたはポリマーの中空シェルに封入された巨大分子を含んでいる。固形
マイクロスフェアも、例えば本明細書に参照として組入れられている国際公開公
報第95/24929号に開示されているように、形成することができる。本明細書にお
いて使用される用語「マイクロスフェア」とは、マイクロ分子およびマイクロカ
プセルを含む。マイクロスフェアは、例えば、非分解状態で封入されたDNAを維
持することにより、巨大分子の完全性を維持するように作用する。適当なサイズ
またはサイズの組合せのマイクロスフェアは、巨大分子のパルスされた送達のた
め、および特異的部位でもしくは特異的標的細胞集団への送達のために使用する
こともできる。

【００９０】ポリマー基質は、生分解性ポリマー、例えばポリ-ラクチド-コ-グリコリド(PL
G)、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ
カプロラクトン、ポリホスファゼン、タンパク質性ポリマー、ポリペプチド、ポ
リエステル、または天然のポリマー、例えばデンプン、アルギン酸塩、キトサン
およびゼラチンなどであることができる。

【００９１】マイクロスフェアは更に、1種以上の安定化化合物 (例えば、炭水化物、カチ
オン性化合物、プルロニック（plutonic）、例えばplutonic-F68(商標）(Sigma-
Aldrich社、セントルイス、MO)、脂質、またはDNA凝集剤)を含有することができ
る。安定化化合物は、マイクロスフェア形成の途中またはインビボ送達後のいず
れかの時点で、核酸を保護する(例えば、超コイル化したそれを維持するかまた
はそれが崩壊するのを防ぐ)ように作用する化合物である。この安定化化合物は
、高分子送達システムから遅れて放出された後、DNAと会合し続ける。

【００９２】安定化化合物の例は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)、エチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)、またはTRISおよびEDTAの組合せ(TE)を含む。他の安定
化化合物は、デキストロース、スクロース、ラクトース、デキストラン、トレハ
ロース、シクロデキストリン、デキストラン硫酸、カチオン性ペプチド、プルロ
ニック、例えばplutonic F-68(商標)(Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO)、お
よびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどの脂質がある。安定化剤
を含有するマイクロスフェアの調製は、米国特許出願第09/266,463号に開示され
ている。

【００９３】脂質は、カチオン性脂質、アニオン性脂質(PEG-DSPE、タウロコール酸または
ホスファチジルイノシトール)、または双性イオン性脂質のような、帯電した脂
質であることができ、もしくは非帯電であって良い。脂質の例は、セチルトリメ
チルアンモニウムおよびリン脂質、例えばホスファチジルコリンを含む。マイク
ロスフェアは、例えばそれらの脂質がレシチン脂質調製物中に存在するような、
1種以上の脂質を含むことができ、かつ1種以上の前述の安定剤化合物を含むこと
もできる。

【００９４】マイクロスフェアを使用し、DNA分子の対象の食細胞への送達を最大にするこ
とができる。あるいは、生分解性マイクロスフェアは、組織に注射または移植す
ることができ、そこでこれらは沈着物(deposit)を形成する。この沈着物は破壊
されるので、核酸が時間をかけて徐々に放出され、かつ遊離DNAとして近隣細胞(
APCを含む)に取り込まれる。

【００９５】他の物質を使用する送達ポリエピトープポリペプチド、またはそれらをコードしている核酸は、当技術
分野において周知の技術を用い、脂質、デンドリマー、またはリポソームのよう
な、他の物質を用いて対象に投与することもできる。例えば免疫原性ポリペプチ
ドまたは免疫原性エピトープをコードしている核酸のいずれかを保持しているリ
ポソームは、インビボにおいてCTL反応を誘起することがわかっている(Reddyら
、J. Immunol.、148:1585(1992)；Collinsら、J. Immunol.、148:3336〜3341(19
92)；Friesら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、89:358(1992)；Nabelら、Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA)、89:5157(1992))。

【００９６】更に本発明のポリペプチドおよび核酸は、コレステロールおよびQuil A(サポ
ニン)混合時に自発的に形成されるか、またはサポニン単独から形成される、負
に帯電した籠様(cage-like)形状のサイズが30〜4Onmの免疫刺激複合体(ISCOMS)
を使用し、投与することができる。本発明のポリペプチドおよび核酸は、ISCOM
と複合され、その後投与されるか、もしくは、個別に投与される。

【００９７】感染防御免疫が、抗原の送達担体としてISCOMを使用し、トキソプラズマ症お
よびエプスタイン・バーウイルス誘導腫瘍を含む、感染症の様々な実験モデルに
おいて作出されている(Mowatら、Immunology Today、12:383〜385(1991))。ISCO
M内に封入された1μgと低い抗原用量が、クラスI媒介したCTL応答を形成するこ
とがわかっており、ここで精製された完全なHIV-I-IIIB gp 160エンベロープ糖
タンパク質またはインフルエンザ赤血球凝集素のいずれかが抗原である(Takahas
hiら、Nature、344:873〜875(1990))。

【００９８】免疫応答の測定ポリエピトープポリペプチド、またはこれらをコードしている核酸の宿主哺乳
類における免疫応答を誘起する能力は、当技術分野において周知の免疫応答測定
法を用いてアッセイすることができる。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の生成は、標
準の⁵¹Cr放出アッセイ法において、細胞内サイトカイン発現または分泌を測定す
ることにより、またはMHCテトラマーを使用することにより、明らかにすること
ができる。ELISA法またはELISPOT法のような標準アッセイ法を用いて、Ｔ細胞活
性化に寄与するサイトカインプロフィールを測定することができる。Ｔ細胞増殖
は、³H-チミジン取込みのようなアッセイ法または当技術分野において公知の他
のアッセイ法を用いて測定することができる。Ｂ細胞応答は、ELISA法のような
当技術分野において認められたアッセイ法を用いて測定することができる。

【００９９】免疫原性エピトープおよび免疫原性エピトープをコードしている核酸の病原体
関連病変に対する、または一般にウイルスもしくは他の病原体レベルに対する作
用を評価するために、他の方法論、例えばデジタル画像処理および細胞学的、膣
鏡および組織学的評価も使用することができる。

【０１００】本発明の実践の実施例を以下に記す。これらはいかなる意味においても本発明
の特許請求の範囲を制限するために構成されたのではない。

【０１０１】実施例1. HPV由来のMHCクラスI結合エピトープの同定 HLA対立遺伝子を、単独のHLA-Aアロタイプを発現している細胞株から単離した
。各細胞株10〜20L(約1〜2 x 10¹⁰細胞)を、回転ボトルに入れた完全RPMI-1640
培地(10％FCS、HEPES、Pen/Strep、必須アミノ酸、グルタミン)において培養し
、かつ細胞を遠心により収集した(10〜15gm湿質量細胞/10L培養物)。細胞を10mM
Tris、1mM DTT、0.1mM PMSF中で30分間溶解することにより、膜調製物を作成し
た。細片をペレット化し、その後透明化した溶解液を、溶解緩衝液中でホモジナ
イズし、かつ再度ペレット化した。このペレットを、4％NP-40を含有する緩衝液
中でホモジナイズし、かつ超遠心した。界面活性剤に可溶性の物質を用いて、HL
Aを精製した。

【０１０２】可溶化した膜調製物を、予め洗浄したカラム(クロマトグラフィーマトリック
スおよび正常なマウス血清マトリックス)にポンプ注入し、その後タンパク質/リ
ガンド含有溶離液を、1本または一連の特異的イムノアフィニティカラム(複数)
に対し流した。汎(pan)抗クラスI mAb W6/32を含むイムノアフィニティカラムを
用い、クラスI分子を単独アロタイプ発現細胞株から単離した。あるいは、BB7.2
のようなアロタイプ特異的mAbを用いて、単独のHLAアロタイプ(HLA-A2)を、複数
のアロタイプを発現している細胞溶解液から抽出した。mAbを高い強度で、大き
い貫通孔(throughpore)還流吸着剤(親水性定常相で被覆および架橋され、かつプ
ロテインAに共有結合された)への結合を用いて、迅速な流量(最大20ml/分)を可
能にする。その後イムノアフィニティカラムを、大量に洗浄し、かつタンパク質
/リガンド複合体を、イムノアフィニティ支持体から、50mMカーボネート/0.1％D
OC/0.05％NaN₃、pH11.5を用い溶離した。

【０１０３】クロマトグラフィー手順を、タンパク質/リガンド含有溶離液をその並びの次
のカラムに溶出するような、一連の自動開閉式バルブと組合わせて、HLA分子の
マルチ-様式高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離を行った。各カラム溶離液
は、複数のUV波長、圧力およびpHでモニタリングした。

【０１０４】次に精製したHLA対立遺伝子を、エピトープ結合競合アッセイ法において使用
した。推定エピトープとの結合を、先に説明されたHLA結合エピトープとの結合
と比較した。公知のエピトープおよびそれら各々のアロタイプの例は以下を含む
： (配列番号：117)、HLA-A1； (配列番号：118)、HLA-A2； (配列番号：119)、HLA-A3； (配列番号：120)、HLA-A11；および、 (配列番号：121)、HLA-A24。一般的アッセイ法の条件は以下である：クラスIタ
ンパク質は、0.05％NP-4O/PBS中で、〜5nM放射標識した標準エピトープおよび被
験インヒビターエピトープと、1μMヒトβ2ミクログロブリン、およびプロテア
ーゼインヒビター混合物(最終濃度1mM PMSF、1.3mM 1,10フェナントロリン、73
μMペプスタチン、8mM EDTAおよび200μM N-α-p-トシル-L-リシンクロロメチル
ケトン)の存在下、23℃で48時間インキュベーションした。各HLAアロタイプの最
終濃度は、以下に説明した実験により決定した。インヒビターペプチドの濃度は
、1nM〜100μMの濃度範囲で滴定した。

【０１０５】遊離および結合したペプチドは、TSK 2000(商標)SECカラムおよび0.5％NP-40/
PBSを用い、HPLCサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。溶離液を放射
能についてモニタリングし、かつ提供したペプチド総量に対するHLAに結合した
ペプチドの画分を、回収された総ペプチドに対する無効用量のペプチドの比から
算出した。次の結合アッセイ法において使用されるHLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HL
A-A11およびHLA-A24の最終濃度は、放射標識した標準ペプチドの結合効率を基に
実験的に決定しなければならない。阻害試験に必要なタンパク質濃度は、典型的
には10〜40nMの範囲である。各アロタイプを、スクリーニング開始時のHLA分子
のタンパク質濃度1nMから1μMの段階希釈を行うことにより、放射標識したペプ
チドの結合について試験した。

【０１０６】可能性のあるペプチドエピトープのヒト白血球抗原(HLA)受容体への結合親和
力は、競合結合アッセイ法を用いて試験することができる(Setteら、Molecular
Immunology、31:813〜822(1994))。このアッセイ法は、(1)精製されたHLA受容体
、(2)当該のHLA受容体に結合し、かつペプチドの結合能を妨害することなく放射
性ヨウ素125で標識され得る位置にチロシンアミノ酸を含むような、合成ペプチ
ド、(3)精製されたβ-2-ミクログロブリン(β₂m)、および(4)試験される合成ペ
プチドエピトープを必要とする。至適実験用HLA受容体濃度は、総標識ペプチド(
5nMに固定)の少なくとも10％の結合を達成するのに必要な各結合アッセイ法にお
けるHLA受容体の量の滴定により確立した(同じくβ₂m濃度は1μMに固定した)。
これらの3種のパラメータ(受容体濃度、β₂m、および放射標識したペプチド濃度
)を一定に保ち、非標識の被験ペプチドの滴定を行った。各結合反応は、室温で3
0〜80時間インキュベーションし、ペプチド交換した。ペプチド交換の定量は、
サイズ排除クロマトグラフィー法による、過剰な遊離ペプチドおよびβ₂mからの
放射標識したペプチド/受容体複合体の結合した画分の分離により決定した。放
射性同位体検出器に連結したHPLCシステムを用い、HLA受容体に結合した放射標
識ペプチドの割合を定量することができる。その後非標識被験ペプチドの標識し
たペプチドの結合を阻害する能力を、その濃度の関数としてプロットした。被験
ペプチドの親和力は、放射標識ペプチドの総結合の50％を阻害するのに必要な被
験ペプチドの濃度として示した(いわゆるIC50値)。

【０１０７】ヒトパピローマウイルス(HPV)株16および18のE6およびE7タンパク質由来のい
くつかのペプチドを、この種のアッセイ法を用い、高親和性、HLA結合ペプチド
として同定した。これらの実験において、HLA受容体A1およびA11は、各々、HLA-
A^*0101およびHLA-A^*1101遺伝子でトランスフェクションしたヒト細胞から精製し
た(Gorgaら、J. Biol. Chem.、262:16087〜16094(1987))。HLA受容体A3およびA2
4の場合、E. coliから作成されかつリフォールディングされた、組換えHLA受容
体(HLA-A^*0301およびHLA-A^*2402)を使用した(Garbocziら、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA、89:3429〜3433(1992))。実験条件および集めたデータの例を表4に示す
。

【０１０８】

【表４】

【０１０９】望ましいならば、前述の予測結合アルゴリズムを用い、各対立遺伝子の解離時
間に従い推定エピトープに優先順位をつけることができ、最長の解離時間を有す
るエピトープが最初に試験される。優性HLA-A対立遺伝子の各々について妥当な
親和力(すなわち＜500nM)を有する5〜10個のエピトープを同定した後、試験を中
断した。500nM未満の結合親和力を伴うエピトープが認められない場合は、各タ
ンパク質からの5〜10個の最良の結合物を、継続分析のために選択することがで
きる。

【０１１０】例えばパーカー（Parker）らの方法(J. Immunol.、149:1896〜1904(1992)；J.
Immunol.、149:2580〜3587(1992)；J. Biol. Chem.、267:5451〜5459(1992))お
よびガーボシ（Garboczi）らの方法(PNAS、89:3429〜3433(1992))に従っても、
ペプチド同定することができる。

【０１１１】実施例2. MHCクラスI拘束性エピトープのインビトロ提示の検出健常志願者由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、HIV、HBVおよびHCV血清反応陰性
であることをスクリーニングした白血球除去産物のFicoll-Paque（商標）(Pharm
acia社、ピスカタウェイ、NJ)密度遠心分離により精製した。前述のように樹状
細胞(DC)を、単球が豊富なPBMC画分の組織培養において作成した(Tsaiら、Crit.
Rev. Immunol.、18:65〜75(1998)；Wilsonら、J. Immunol.、162:3070〜78(199
9))。フラスコ中の血清非含有RPMI 1640培地(Gibco-BRL社)中に10⁷ PBMC/mlを播
種し、かつ37℃で1.5〜2.0時間インキュベーションした。非接着細胞を穏やかに
洗浄して除去し、かつDC前駆体を含むプラスチック-接着性単球を、50ng/ml GM-
CSFおよび1000U/ml IL-4(両方ともR&D Systems社、ミネアポリス、MN)が存在す
る完全培地において6〜7日間培養した。完全培地は、5％プールしたヒトAB型血
清(C-6 Diagnostics社、メクオン、WI)、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプト
マイシン、2-ME(Gibco-BRL社、ガイサーバルグ、MD)およびHEPES(JRH Bioscienc
es社、レネキサ、KS)を推奨濃度で補充したRPMI 1640からなる。

【０１１２】非接着性細胞を遠心分離により収集し、かつAPCとして使用するために直接調
製するかまたは凍結保存した。形態観察、およびサイトフルオロメトリーで調べ
たCD3/CD16陰性、MHCクラスI^hi、MHCクラスII^hi、CD86陽性表現型の発現により
、細胞がDCであることを決定した。

【０１１３】 0日目に、5x10⁵非接着性PBLを、2.5x10⁴放射線照射したエピトープパルスした
DCと共に播種した。このDCは、48ウェルプレート中に、10ng/ml IL-7を補充した
10％健常ヒトAB型血清を含む完全RPMI-1640の0.5mlと共に入れた。DCを、CO₂イ
ンキュベーター内で、PBLと共に37℃でインキュベーションした。24時間後、10n
g/ml IL-10を添加した。7日目に、自己PBLを解凍し、放射線照射した。1個のウ
ェルあたり1x10⁶個の細胞を、48ウェルプレートに播種し、かつ2時間接着させた
。エピトープを添加し、かつ細胞を2時間パルスした。細胞を1回洗浄し、かつ反
応物(responder)を接着刺激剤を含むウェルに移した。24時間後、10ng/ml IL-10
を添加した。9日目に20U/ml IL-2を添加し、かつ11日目に100U/ml IL-2を添加し
た。細胞は15日目に同じ方法で再刺激した。22日目に、各個別の培養物の1〜2個
のウェル中の細胞を収集し、かつ計測した。反応物は、投入の16日目以降に細胞
数が1.5〜3倍増加した細胞である。総培養物収量は、一般に少なくとも2x10⁶個
の細胞でなければならない。

【０１１４】標的として使用される細胞を収集し、かつ培地中で6.67x10⁵細胞/mlに調節し
た。細胞2mlに、各々適当なエピトープ50μg/ml(例えば、Flu M1、Test #1、Tes
t #2、Test #3、Test #4)をパルスした。エフェクターを収集し、かつ培地中に1
x10⁶個細胞/mlとなるよう再懸濁した。丸底96ウェルプレートの各ウェルに100μ
lを播種した。各標的細胞の各々150μlを、適当なエフェクター細胞を含むウェ
ルに、総容量250μl/ウェルとなるよう分割した。プレートを、加湿したCO₂イン
キュベーター内で、37℃で24時間インキュベーションした。

【０１１５】エンドゲン（ENDOGEN）社(ウォバーン、MA)のヒトIFNγELISAキットを用い、I
FNγ分泌を測定した。このアッセイ法は、製造業者の指示に従って行い、かつ上
清を2つ組で試験した。IFN-γ標準1000pg/ml、400pg/ml、160pg/ml、64pg/ml、2
5.6pg/ml、および0pg/mlを、2つ組で試験した。アッセイプレートは、Molecular
Devices Kinetic Microplate Readerで計測し、かつ結果をVmax Plate Reader/
SOFTMAXTM(登録商標)ソフトウェアで解析した。

【０１１６】Ｔ細胞アッセイ法においてHPV16および18E6およびE7エピトープを試験する場
合には、T2A2細胞が、標的として適していた(HPV 2.4-Cペプチド(配列番号：61)
は、この方法で試験されるHLA-A2結合HPVエピトープの例として含まれる。)。し
かし、他のアロタイプを試験する場合(例えば、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11および
HLA-A24)、T2A2細胞は適当なAPCではなく、かつFluM1エピトープは適当な陽性対
照エピトープではない。適当な標的は、自己EBV形質転換細胞またはPBLである。
これらの他のアロタイプについて想起される適当な対照は以下を含む：HLA-A1、
Flu NP 44〜52位；HLA-A3、Flu NP 265〜273位；HLA-A11、EBNA3 603〜611位お
よびEBNA4 416〜424位；HLA-A24、EBV LMP 419〜427位。適当なインビトロ免疫
感作対照は、HLA-A1、MAGE-1 61〜69位；HLA-A2、HBVpol 455〜463位；HLA-A3、
P. falciparum LSA-1 94〜102位；HLA-A11、HIV gag 325〜333位；および、HLA-
A24、HTV gp4l 584〜591位である。

【０１１７】実施例3. ペプチドパルスした自己樹状細胞を用いるインビトロにおける一次(pr
imary)ペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球の作成 CTL反応のインビトロ生成における様々なHPV由来のペプチドの有効性を、限定
されたHLAアロタイプを有するドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)と同時培養し
たペプチドパルスした樹状細胞(DC)により決定した。被験ペプチドは、下記のHP
Vタンパク質アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを含んだ：H
PV株16E7 89〜97位(配列番号：96)；HPV株16E6 92〜101位(配列番号：77)；HPV
株18E7 59〜67位(配列番号：122)；HPV株18E6 13〜21位(配列番号：124)、およ
びHPV株18E6 97〜106位(配列番号：125)。

【０１１８】一次Ｔ細胞反応は、公表されたプロトコールの変法を用いて開始した(Tsaiら
、Crit. Rev. Immunol.、18:65〜75(1998)；Wilsonら、J. Immunol.、162:3070
〜78(1999))。末梢血単核細胞(PBMC)は、ヒト免疫不全ウイルスおよびB型肝炎ウ
イルスについて血清反応陰性であることがスクリーニングされたHLA-A限定され
た健常ドナーから得た白血球除去産物から精製した。樹状細胞(DC)は、3μg/ml
β2ミクログロブリンを補充したリン酸緩衝生理食塩水中、20μg/mlペプチドで2
0℃で2時間パルスし、かつ使用前に放射線照射した(3000rad)。2x10⁵ペプチドパ
ルスしかつ洗浄したDCを、2x10⁶自己非接着性PBMCと、24ウェル培養プレートに
おいて、10ng/ml IL-7の存在下で同時培養した。1日後、培養物に10ng/ml IL-10
を補充した。7日目および14日目に、前述のように20μg/mlペプチドでパルスし
た自己放射線照射した単球上に非接着PBMC反応物を移すことにより、個々の培養
物を再刺激した。再刺激サイクル後1および2日目に、各々、10ng/ml IL-10およ
び100U/ml IL-2を添加した。

【０１１９】 PBMC培養物の免疫反応性を、免疫感作しているペプチドまたは同じ標的化され
たHLAクラスI分子に特異的に結合した無関係の抗原性ペプチドでパルスした抗原
提示細胞とのインキュベーション後、21日目のペプチド感作した培養物からの特
異的IFN-γ分泌の誘起能により評価した。10⁵個のエフェクター細胞を、10⁵個の
自己放射線照射したペプチドパルスしたPBMCと共に、200μ1の完全培地中で37℃
で24時間インキュベーションした。これらの培養物からの上清を、市販のELISA
アッセイ法を用いて、IFN-γ分泌について測定した。結果を表5に示す。データ
は、ピコグラムのIFN-γ/mlとして示した。PBMC培養物による特異的反応性は、
任意に少なくとも20pg/mlアッセイ培養物と定義され、かつ被験ペプチドパルス
した刺激細胞対無関係のペプチドパルスした刺激細胞に対して反応したIFN-γ分
泌の差は1.5倍以上であった。FluM1 58〜66位およびEBNA4 416〜424位CTLペプチ
ドエピトープは、各々、A2およびA11の無関係な対照として使用した。

【０１２０】

【表５】ペプチドパルスした樹状細胞を用いる一次ペプチド特異的細胞傷害性
Ｔリンパ球のインビトロ誘導

【０１２１】実施例4. ポリエピトープポリペプチドをコードしている核酸の作成一旦候補エピトープが同定されると、関心のあるエピトープをコードしている
DNA断片が作成される。このエピトープをコードしている配列は、重複PCR法また
はオリゴヌクレオチドの連結により作成される。この構築物は、プロモーター、
コザック配列、開始ATG、終結コドン、イントロンおよびポリアデニル化配列を
含む調節エレメントを含む。

【０１２２】 T7ポリメラーゼプロモーターも、このコード配列の5'末端に存在し、かつFLAG
mAb(または他のもの)決定基をコードしている配列は、最初のエピトープコード
配列のすぐ5'側または最後のエピトープコード配列の3'側に存在することができ
る。標的シグナル(例えば、リーダーペプチドまたは小胞標的配列を添加したエ
ンドソーム(endosomal)/クラスII)を伴うまたは伴わない構築物が作成される。
フォンヘイン（von Heijne）の-3、-1ルール(Nuc. Acids Res.、14:4683〜4690(
1986))に従い、このリーダーが存在する場合の、シグナルペプチダーゼによる切
断がうまくいく可能性が確実になる。

【０１２３】このPCR断片を、PCR産物の直接かつ迅速なクローニングを可能にするTAベクタ
ー(Invitrogen社)にクローニングする。この構築物を配列決定し、もしミスが組
込まれていたならば、よりストリンジェントな条件またはさもなければ最適化さ
れた条件下で、PCRを繰り返す。次にこのPCRクローン、あるいはオリゴヌクレオ
チドの連結により作成されたDNAを、p3KまたはpcDNA(Invitrogen社)のような哺
乳類の発現ベクターにクローニングする。加えてこの断片を、組換えワクシニア
ウイルスを作出するため(下記参照)にワクシニアベクター(pSC11など)に、およ
びポリエピトープポリペプチド酵母のGST融合タンパク質の発現を可能にする細
菌発現ベクター(pGEX-5x(Pharmacia社)など)またはバキュロウイルス発現ベクタ
ーにクローニングする。In vitro転写/翻訳(Promega社のT7 TNT組合せ転写/翻訳
キット)を、製造業者の指示に従い行う。翻訳されたタンパク質は、SDS-PAGE法
およびオートラジオグラフィー法で分析した場合、予想されたサイズのポリペプ
チドが作成されたことを示した。

【０１２４】実施例5. ポリエピトープタンパク質からプロセシングされたエピトープの同定実施例2に記されたＴ細胞刺激アッセイ法を用い、どのエピトープが該構築物
によりコードされたポリエピトープポリペプチドからプロセシングされたかを決
定した。該構築物にコードされた各エピトープによりインビトロで刺激されたPB
Lから生成したエフェクターを、適当な標的と共にインキュベーションした時のI
FNγ分泌について試験した。標的は、ポリエピトープポリペプチドをコードして
いる(リーダーを伴うまたは伴わない)組換えワクシニアウイルスで感染された自
己PBL細胞またはEBV形質転換細胞であることができる。このポリエピトープポリ
ペプチドのプロセシングは、Ｔ細胞エピトープを遊離し、これはその後標的細胞
の表面に提示される。

【０１２５】組換えワクシニアは、ポリエピトープポリペプチドをコードしている構築物の
pSC11ベクター(Chakrabartiら、Mol. Cell. Biol.、5:3403〜09(1985))のSmaI部
位への挿入、その後の当技術分野において公知の方法による組換えワクシニアの
作成の標準の方法で作出した。

【０１２６】コードされたポリエピトープポリペプチドがプロセシングされかつ予想される
エピトープがHLA分子により提示されるかどうかを決定するために、インビトロ
刺激アッセイ法を、標的がポリペプチドコード配列を含む組換えワクシニアウイ
ルスにより感染した自己EBV形質転換APCである以外は、実施例2に記したように
行った。図3に示した実験において、ドナー由来のEBV形質転換APCは、被験ペプ
チド16E7 44-52をコードしている組換えワクシニアウイルスで、感染多重度5pfu
で感染した。対照細胞は、野生型ワクシニアウイルスで感染した。これらの細胞
を、ウイルスと、⁵¹Crの存在下で2.5時間インキュベーションした。洗浄後、ワ
クシニア感染した標的細胞を、先に16E7 44-52で活性化した自己Ｔ細胞と5時間
接触した。上清への⁵¹Cr放出を、エフェクター細胞による標的細胞溶解の測定値
と見なした。図3に示したように、被験ペプチドをコードしているワクシニアベ
クターに感染した標的細胞は、エフェクター細胞により対照標的細胞よりもより
効率的に溶解され、このことは、ペプチドが細胞内で発現され、かつ効果的に細
胞のHLA分子により提示されることを示唆している。

【０１２７】標的は、組換えウイルスで感染した自己PBL、または単独のHLAを発現しかつポ
リエピトープポリペプチドをコードしているp3kまたはpcDNA構築物(または他の
哺乳類の発現ベクター)でトランスフェクションされた7221細胞を挿入すること
ができる。

【０１２８】 HLA-A2トランスジェニック動物を用いて、インビボで送達された場合に、該構
築物がHLA-A2エピトープを作成するように機能することを証明することができる
。哺乳類発現ベクター中のポリエピトープポリペプチドコード構築物は、マイク
ロスフェア中に封入される。これは、HLA-A2トランスジェニックマウスに注入さ
れ、かつ引き続きＴ細胞反応が先に記されたように試験される(Hedleyら、Natur
e Med.、4:365〜68(1998))。あるいは、この発現ベクターは、裸のDNAとして送
達することができる。標的細胞は、試験されるHLA-A2結合エピトープでパルスさ
れたHLA-2発現細胞(例えば、T2A2またはEL4-A2細胞)、またはポリエピトープを
コードしているワクシニアベクターで感染した類似細胞である。この方法におい
て、構築物の投与後インビボにおいてプロセシングされかつ提示されたHLA-A2エ
ピトープが同定される。陽性の結果は、マウスの内在性マウスMHC分子により提
示されたエピトープと、導入遺伝子由来のHLA-A2分子により提示されたものの間
を識別することはできないが、ポリエピトープポリペプチドのプロセシングが予
想されたように生じたことを示している。その一部はHLA-A2に結合し、かつ少な
くともその一部は内因性マウスMHC分子に結合することが知られている、多くのH
PV由来のエピトープを含むポリエピトープポリペプチドをコードしているプラス
ミドによる遺伝子導入マウスの免疫感作は、一方はマウスのMHC分子に結合する
ことがわかっているものを含む2種のエピトープに対する免疫応答を生じること
が示されている。

【０１２９】実施例6. DNA免疫感作したHLA-A2トランスジェニックマウスにおいて作成された
CTL反応 CTL反応は、マイクロスフェア封入したポリエピトープポリペプチドをコード
しているDNAで免疫感作されたマウスにおいて測定した。免疫感作に使用したDNA
は、HPV Dra 16/18(ヌクレオチド配列は配列番号：162、配列番号：160のポリペ
プチドをコードしている)と称される。このDNAで免疫感作したマウスにおいて作
成されたエフェクター細胞を、ポリエピトープポリペプチドをコードしているワ
クシニアウイルスで感染した標的細胞の存在に対するそれらの反応性についてイ
ンビトロにおいて試験した。2種のポリエピトープ構築物を標的細胞において個
別に評価した：(1)HPV Dra 16/18(アミノ酸配列は配列番号：160；ヌクレオチド
配列は配列番号：162)；および(2)HPV 16/18(アミノ酸配列は配列番号：158；ヌ
クレオチド配列は配列番号：161)。

【０１３０】トランスジェニックHLA-A^*0201/H-2K^b株のマウス6匹(CS7BL/6 x B10.D2)は、
スクリップス臨床研究所（Research Institute of Scripps Clinic）の繁殖コロ
ニーを起源としており、かつ清潔な換気条件下で飼育した。HLA-A^*0201/H-2K^bト
ランスジェニックマウスの後肢に、p3KHPVDra 16/18DNA封入されたPEG-DSPEマイ
クロスフェア30μgを筋肉内注射した。このマウスを30および48日目に、p3KHPVD
ra 16/18DNA封入されたPEG-DSPEマイクロスフェア50μgで追加免疫処置した。

【０１３１】 64日目に、マウスを屠殺し、かつそれらの脾を摘出した。単細胞懸濁液を調製
し、細胞をプールし、赤血球を溶解し、かつイムノアフィニティカラム(R&D Sys
tems社、ミネアポリス、MN)を用いCD3+豊富な細胞集団を得た。脾細胞を、イン
ビトロにおいて、RPMI 1610(JRH Biosciences社、レネキサ、KS)中100μMペプチ
ドと共に37℃で2時間プレインキュベーションした、3日齢の(three day old)同
系の放射線照射したリポ多糖(LPS)刺激したＢ芽細胞(比1:1)で、再刺激した。こ
のインビトロ増殖に使用したペプチドは以下である：(1)HPV16E648-56 (ペプチ
ド124；；配列番号：163)；および(2)HPV16E786-93(ペプチド272；；配列番号：61)。ペプチドは、100％ DMSO中に20mg/mlで溶解し、かつ使用時ま
で-20℃で保存した。6-ウェルプレートの各ウェルにおいて、10⁵エフェクターを
、10％ウシ胎仔血清(JRH Biosciences社、レネキサ、KS)、抗生物質(50IU/mlペ
ニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン)、HEPES(JRH Biosciences社、レネ
キサ、KS)、30μM 2-ME(Gibco-BRL社、ゲティスバーグ、MD)を補充したRPMI 161
0中に、最終ペプチド濃度10μMで播種した。65日目に、10IU/mlのmIL-2を添加し
た。71日目にエフェクターを収集し、かつペプチド特異反応について、下記のよ
うなELISPOTアッセイ法におけるIFN-γ放出の測定によりアッセイした。

【０１３２】これらの実験に使用した標的細胞株は、EL4 HLA-A2/H-2K^b細胞株であり、これ
は、EL4細胞(C57BL/6胸腺腫、H-2^b)の、キメラ構築物HLA-A2.1(α₁およびα₂ド
メイン)/H-2K^b(α₃ドメイン)を含有するpSV2プラスミドによるトランスフェクシ
ョン、およびネオマイシン耐性遺伝子を含むpSV2 neoプラスミドによる同時トラ
ンスフェクションにより作出した。

【０１３３】 2種の組換えワクシニアベクター(rVac)であるVac HPV Dra 16/18およびVac HP
V 16/18は、pSC11HPV Dra 16/18またはpSC11HPV 16/18構築物のいずれかの野生
型ワクシニアウイルス(TC-adapted Western Reserve株；ATCC #VR1354)のチミジ
ンキナーゼ遺伝子への挿入により作成した。得られる組換えウイルスは、TK^-表
現型を伴う宿主細胞(143B、ATCC CRL-8303)において、BrdU (チミジンキナーゼ
活性の失活)およびX-gal(pSC11 LacZ活性)による二重選択を使用するスクリーニ
ングを3サイクル受けた。感染した標的(EL4 HLA-A2/H-2K^b細胞)は、感染多重度1
0のrVacで37℃6時間で作成した。

【０１３４】市販のマウスIFN-γ ELISPOTキット(R&D Systems社、ミネアポリス、MN)を製
造業者の示すプロトコールに従って使用した。96-ウェル疎水性ポリフッ化ビニ
リデン(PVDF)膜が裏側のプレートの各ウェルに、抗IFN-γモノクローナル抗体(m
Ab)を予備吸着し、かつ10％RPMIで20分間ブロックした。次におよそ10⁴〜10⁵個
のエフェクターを、10⁵個の標的(EL4 HLA-A2/H-2K^b細胞で感染したワクシニア)
と5％CO₂中で37℃で18〜20時間混合した。次に、各ウェルを4回洗浄し、かつ一
晩4℃でビオチン化した非競合抗IFN-γmAbと共にインキュベーションした。その
後ウェルを3回洗浄し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼと共に室温
で2時間インキュベーションし、再度3回洗浄し、かつBCIP/NBTと共に30分間顕在
化(develop)し、かつ蒸留水で十分に洗浄した。IFN-γ分泌細胞(スポット)は、
ツェルネットコンサルティング（Zellnet Consulting）社(ニューヨーク、NY)の
KS ELISPOTソフトウェア4.2により、自動ELISPOTリーダーシステム(Carl Zeiss
社、ソーンウッド、NY)上で列挙した。

【０１３５】図6に示したように、マウスをHPVポリエピトープ構築物をコードしているDNA
による免疫感作したところ、ペプチド特異的CTLを誘起した。データは、IFN-γ⁺ スポットの測定値として表し、かつCD3+細胞100万個あたりの抗原特異的反応と
して示した。

【０１３６】実施例7. ポリエピトープポリペプチドをコードしているDNAで処理したマウスか
らの新鮮な脾細胞におけるCTL反応トランスジェニックHLA-A^*02O1/H-2K^bマウス(実施例6に記したもの)を、順次
下記に晒した：(1)マイクロスフェア封入したポリエピトープポリペプチドをコ
ードしているDNAの注入；および、(2)ポリエピトープポリペプチドをコードして
いるワクシニアウイルスによる感染。実施例6に記したIFN-γ ELISPOTアッセイ
法を用い、新鮮な未増殖の脾細胞におけるDNAコードしたCTLエピトープについて
T細胞特異性を検出しかつ列記した。

【０１３７】処置法は以下のようである(表6参照)。10週齢のマウスに、DNA100μgを含有す
るPEG/DSPEマイクロスフェアを注射した。マイクロスフェア注射の26日後、マウ
スを、同じポリエピトープポリペプチドをコードしているワクシニアウイルスの
1x10⁷pfuを腹腔内注射することにより感染した。

【０１３８】

【表６】ワクチンスケジュールおよび免疫感作計画

【０１３９】ワクシニア追加免疫の9日後、脾を摘出し、CD3⁺ T細胞を濃縮し(T細胞濃縮カ
ラム；R&D Systems社、ミネアポリス、MN)、かつペプチド特異的IFN-γ放出を、
マウスのIFN-γ ELISPOT (R&D Systems社、ミネアポリス、MN)を用いて検出した
。各抗原性処理に関して、2.5x10⁵個のＴ濃縮した脾細胞のウェル5個を、未処理
または限定したクラスIペプチドエピトープで予めパルスしたかのいずれかの2x1
0⁵ 個EL4-A2/K^b刺激細胞と共に同時にインキュベーションした。対照として、脾
細胞も、刺激剤とともにインキュベーションした：(1)2Omoiのワクシニア野生型
ウイルスで感染；または、(2)25μg Con A/mlで処置。プレートは、10％CO₂中で
37℃で48時間インキュベーションし、かつその後IFN-γ検出を顕在化した。HPV
特異的IFN-γ反応を、スポット形成細胞(SFC)数/1x10⁶投入T濃縮した脾細胞とし
て報告した。(SFCの絶対数は表7に記した)。IFN-γ分泌のバックグラウンド速度
は、無関係のペプチドでパルスした刺激細胞と共にインキュベーションしたSEC/
1x10⁶投入T濃縮した脾細胞として定義した。(HLA-A2拘束性Plasinodium falcipa
rum cp36エピトープ；ロット番号#322)。HPVペプチド特異的反応は、バックグラ
ウンドの2倍である場合は陽性であるとみなした。cp36特異的SFC/1x10⁶個細胞の
頻度は、0群、1群、および2群について、各々、0、0、および12であった。

【０１４０】

【表７】新たに単離した脾細胞におけるIFN-γ反応

【０１４１】他の態様本発明は、発明の詳細な説明に関連して説明しているが、前記説明は、例証の
みを意図し、添付された特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を
制限することを意図するものではない。他の局面、利点、および変更は、特許請
求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各セグメントが複数のエピトープを含むような、4個のセ
グメントを含むポリエピトープポリペプチドの概略図である。

【図２】図２は、HPV株16E6タンパク質およびE7タンパク質由来のセグメン
トのアミノ酸配列を含む、ポリエピトープポリペプチドの概略図である。

【図３】図３は、ペプチドHPV16E7 44-52で刺激されたヒトＴ細胞を、野生
型ワクシニアベクター(開環)またはHPV16E6/E7ポリエピトープポリペプチドの一
部としてHPV16E7 44-52をコードしているワクシニアベクターのいずれかで感染
されたHLA-A1/A3を発現している標的に対して試験したインビトロアッセイ法の
結果を示す図である。

【図４】図４は、HPV株18E6およびHPV株18E7由来のセグメントのアミノ酸配
列を含むポリエピトープポリペプチドの概略図である。

【図５】図５は、HPV株16およびHPV株18のE6タンパク質およびE7タンパク質
由来のセグメントのアミノ酸配列を含むポリエピトープポリペプチドの概略図で
ある。

【図６】図６は、DNA免疫感作されたマウス由来のＴ細胞が、ペプチド124ま
たはペプチド272への曝露によりインビトロにおいて増殖され、かつ引き続き野
生型ワクシニアベクター、HPV Dra 16/18をコードしているワクシニアベクター
、またはHPV 16/18をコードしているワクシニアベクターで感染された標的細胞
に対して試験したインビトロアッセイ法の結果を示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月７日（２００２．１０．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Zycos Inc. <120> NUCLEIC ACIDS ENCODING POLYEPITOPE POLYPEPTIDES <140> JP 2001-523039 <141> 2000-09-18 <150> US 60/169,846 <151> 1999-12-09 <150> US 60/154,665 <151> 1999-09-16 <160> 163 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Thr Val Ala 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val 1 5 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 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Papilloma virus <400> 75 Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 76 Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 77 Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys 1 5 10 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 78 Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 1 5 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 79 Tyr Cys Tyr Ser Ile Tyr Gly Thr Thr Leu 1 5 10 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 80 Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 81 Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 82 Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 83 Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 84 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Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 100 105 110 Cys Ser Gln Lys Pro 115 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 127 Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys 1 5 10 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 128 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 129 Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 1 5 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 130 Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val 1 5 10 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 131 Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 132 Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 133 Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 1 5 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 134 Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu 1 5 10 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 135 Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu 1 5 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 136 Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe 1 5 10 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 137 Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys 1 5 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 138 Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys 1 5 10 <210> 139 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 139 Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 140 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 141 Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu 1 5 <210> 142 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 142 Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu 1 5 10 <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 143 His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val 1 5 10 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 144 Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu 1 5 <210> 145 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 145 Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu 1 5 10 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 146 Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val 1 5 10 <210> 147 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 147 Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala 1 5 10 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 148 Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile 1 5 10 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 149 Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 150 Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys 1 5 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 151 Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu 1 5 10 <210> 152 <211> 42 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 152 Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser 1 5 10 15 Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu 20 25 30 Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys 35 40 <210> 153 <211> 27 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 153 Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys 20 25 <210> 154 <211> 19 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 154 Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu 1 5 10 15 Ile Pro Val <210> 155 <211> 14 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 155 His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile 1 5 10 <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 156 Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp 1 5 10 15 Cys <210> 157 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial fusion sequence <400> 157 Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu 1 5 10 15 Cys Thr Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 20 25 30 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Lys Ile Ser Glu 35 40 45 Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln 50 55 60 Tyr Asn Lys Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr 65 70 75 80 Thr Asp Leu Tyr Ser Tyr Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn 85 90 95 Ile Val Thr Phe Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 100 105 110 Cys Ser Gln Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys 130 135 140 Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Ser 145 150 155 160 Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn 165 170 175 Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Lys Ala Thr Leu Gln Asp 180 185 190 Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val His Thr Met 195 200 205 Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Ala Phe Gln Gln Leu 210 215 220 Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys 225 230 235 <210> 158 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial fusion sequence <400> 158 Met Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe 20 25 30 Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Lys Ile Ser 35 40 45 Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln 50 55 60 Gln Tyr Asn Lys Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Thr Thr Asp Leu Tyr Ser Tyr Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr 85 90 95 Asn Ile Val Thr Phe Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro 100 105 110 Ile Cys Ser Gln Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys 115 120 125 Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr 130 135 140 Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys 145 150 155 160 Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr 165 170 175 Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Lys Ala Thr Leu Gln 180 185 190 Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val His Thr 195 200 205 Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Ala Phe Gln Gln 210 215 220 Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys 225 230 235 <210> 159 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial fusion sequence <400> 159 Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser 1 5 10 15 Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu 20 25 30 Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Ser Val Tyr Gly Asp Thr 35 40 45 Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys 50 55 60 Leu Arg Cys Gln Lys Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu 65 70 75 80 Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys 85 90 95 Lys Cys Glu Ala Arg Ile Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu 100 105 110 Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys 115 <210> 160 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial fusion sequence <400> 160 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val 1 5 10 15 Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln 20 25 30 Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Leu Leu Arg 35 40 45 Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg 50 55 60 Asp Gly Asn Pro Tyr Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Thr Leu His Glu 85 90 95 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Ser Tyr Gln 100 105 110 Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Leu Leu Met 115 120 125 Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Arg Arg 130 135 140 Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln 145 150 155 160 Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr 165 170 175 Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu 180 185 190 Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg 195 200 205 Cys Gln Lys Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro 210 215 220 Gln Asn Glu Ile Pro Val His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys 225 230 235 240 Glu Ala Arg Ile Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe 245 250 255 Val Cys Pro Trp Cys 260 <210> 161 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial fusion sequence <400> 161 atggctatgt tccaggaccc acaggaacgc ccacgcaaac tgccacagct gtgcaccgag 6
0 ctcctcctgc gccgcgaggt gtatgacttc gcttttcgcg acctgtgcat cgtctaccgc 12
0 gatggcaacc catataagat ctccgagtac cgccactact gctattccct gtatggcacc 18
0 accctggagc agcagtacaa caagaccctg cacgagtaca tgctggatct gcagccagag 24
0 accaccgatc tgtactccta tcaggctgag ccagatcgcg ctcactataa catcgtgacc 30
0 ttcctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgcccaatct 34
0 <210> 162 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial fusion sequence <400> 162 atggctatct ccggcgtgcc agtgctgggc ttcttcatca tcgctgtgct gatgtccgct 6
0 caggagtcct gggctgctat gttccaggac ccacaggaac gcccacgcaa actgccacag 12
0 ctgtgcaccg agctcctcct gcgccgcgag gtgtatgact tcgcttttcg cgacctgtgc 18
0 atcgtctacc gcgatggcaa cccatataag atctccgagt accgccacta ctgctattcc 24
0 ctgtatggca ccaccctgga gcagcagtac aacaagaccc tgcacgagta catgctggat 30
0 ctgcagccag agaccaccga tctgtactcc tatcaggctg agccagatcg cgctcactat 36
0 aacatcgtga ccttcctgct gatgggcacc ctgggcatcg tgtgcccaat ctgctcccag 42
0 aagccccggc gaccctacaa gctacctgat ctgtgcacgg aactgaacac ttcactgcaa 48
0 gacatagaaa taacctgtgt atattgcaag acagtattgg aacttacaga ggtatttgaa 54
0 tttgcattta aatctgtgta tggagacaca ttggaaaaac taactaacac tgggttatac 60
0 aatttattaa taaggtgcct gcggtgccag aaaaaggcaa cattgcaaga cattgtattg 66
0 catttagagc cccaaaatga aattccggtt cacacaatgt tgtgtatgtg ttgtaagtgt 72
0 gaagccagaa ttgcattcca gcagctgttt ctgaacaccc tgtcctttgt gtgtccgtgg 78
0 tgttaa 78
6 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Human Papilloma virus <400> 163 Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp 1 5

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/106 Ａ６１Ｋ 39/118 39/118 39/23 39/23 39/245 39/245 39/29 39/29 47/34 47/34 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ０７Ｋ 14/82 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号０９／４５８，１７３ (32)優先日平成11年12月９日(1999．12．9) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１６９，８４６ (32)優先日平成11年12月９日(1999．12．9) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シックスローマンエム．アメリカ合衆国マサチューセッツ州ベルモントカテージストリート４Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 BA36 CA02 DA02 EA02 HA17 4C076 AA19 AA61 BB15 BB16 BB21 BB29 BB30 4C085 AA03 AA38 BA09 BA45 BA69 BA79 BA87 BA89 EE06 FF24 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA02 CA41 DA86 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シグナル配列と3つのセグメントを含むハイブリッドポリペ
プチドであって、3つのセグメントは隣接しているかまたはスペーサーアミノ酸
もしくはスペーサーペプチドで分離されており、 (a)第一のセグメントは、天然型腫瘍抗原または病原体の天然型タンパク質の
第一の部分アミノ酸配列を有し、少なくとも11アミノ酸長であり、2つのエピト
ープを含み、 (b)第二のセグメントは、天然型腫瘍抗原または病原体の天然型タンパク質の
第二の部分アミノ酸配列を有し、少なくとも11アミノ酸長であり、(a)のエピト
ープとは異なる2つのエピトープを含み、 (c)第三のセグメントは、天然型腫瘍抗原または病原体の天然型タンパク質の
第三の部分アミノ酸配列を有し、少なくとも11アミノ酸長であり、(a)および(b)
のエピトープとは異なる2つのエピトープを含み、 (i)第一、第二および第三の部分は、同じ天然型タンパク質の隣接していない部
分であり、3つの部分全ての合計が天然型タンパク質の配列の70%未満を構成する
か、または (ii)第一、第二および第三の部分は、3つの異なる天然型腫瘍抗原または1つ以上
の病原体の天然型タンパク質の部分である、ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２】少なくとも1つのセグメントが3つのエピトープを含む、請求
項1に記載の核酸。
【請求項３】少なくとも1つのセグメントが4つのエピトープを含む、請求
項1に記載の核酸。
【請求項４】少なくとも3つのエピトープがMHCクラスI結合エピトープで
ある、請求項1に記載の核酸。
【請求項５】 (d)天然型腫瘍抗原または病原体の天然型タンパク質の第四
の部分アミノ酸配列を有し、鎖長が少なくとも11アミノ酸で、(a)、(b)および(c
)のエピトープとは異なる2つのエピトープを含む第四のセグメントをさらに含む、請求項1に記載の核酸。
【請求項６】第四のセグメントが、(a)の天然型タンパク質の部分とは異
なる天然型タンパク質の部分アミノ酸配列を有する、請求項5に記載の核酸。
【請求項７】少なくとも1つのセグメントは15アミノ酸長未満である、請
求項1に記載の核酸。
【請求項８】少なくとも1つのセグメントが、ヒトパピローマウィルス(HP
V)タンパク質の部分配列を有する、請求項1に記載の核酸。
【請求項９】天然型タンパク質がそれぞれHPVタンパク質である、請求項1
に記載の核酸。
【請求項１０】少なくとも2つのセグメントが隣接している、請求項1に記
載の核酸。
【請求項１１】 3つのセグメントが隣接している、請求項1に記載の核酸。
【請求項１２】第一のセグメントと第二のセグメントがスペーサーアミノ
酸またはスペーサーペプチドによって分離され、第二のセグメントと第三のセグ
メントがスペーサーアミノ酸またはスペーサーペプチドによって分離されている
、請求項1に記載の核酸。
【請求項１３】第一のセグメントと第二のセグメントがスペーサーアミノ
酸によって分離され、第二のセグメントと第三のセグメントがスペーサーアミノ
酸によって分離されている、請求項1に記載の核酸。
【請求項１４】第一のセグメントと第二のセグメントが、スペーサーアミ
ノ酸であるアラニンによって分離され、第二のセグメントと第三のセグメントが
スペーサーアミノ酸であるアラニンによって分離されている、請求項1に記載の
核酸。
【請求項１５】天然型タンパク質がそれぞれHPVタンパク質である、請求
項12に記載の核酸。
【請求項１６】天然型タンパク質がそれぞれHPVタンパク質である、請求
項13に記載の核酸。
【請求項１７】天然型タンパク質がそれぞれHPVタンパク質である、請求
項14に記載の核酸。
【請求項１８】ハイブリッドポリペプチドがHPVタンパク質由来の第一の
エピトープと、第一のエピトープに重複せず、かつ同じHPVタンパク質または異
なるHPVタンパク質由来の第二のエピトープとを含み、第一のエピトープが第一
の主要組織適合性抗原複合体(MHC)クラスIアロタイプに結合し、第二のエピトー
プが第一のMHCクラスIアロタイプとは異なる第二のMHCクラスIアロタイプに結合
する、請求項8に記載の核酸。
【請求項１９】少なくとも1つの部分がHPV E6タンパク質またはHPV E7タ
ンパク質由来である、請求項18に記載の核酸。
【請求項２０】少なくとも1つの部分がHPV株16タンパク質またはHPV株18
タンパク質由来である、請求項18に記載の核酸。
【請求項２１】少なくとも1つの部分がHPV株16またはHPV株18起源のHPV E
6タンパク質またはE7タンパク質由来である、請求項18に記載の核酸。
【請求項２２】第一のMHCクラスIアロタイプが、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3
、HLA-A11およびHLA-A24からなる群より選択される、請求項18に記載の核酸。
【請求項２３】第二のMHCクラスIアロタイプが、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3
、HLA-A11およびHLA-A24からなる群より選択される、請求項22に記載の核酸。
【請求項２４】ハイブリッドポリペプチドがHPVタンパク質由来の第三の
エピトープをさらに含み、第三のエピトープが第一および第二のMHCクラスIアロ
タイプとは異なる第三のMHCクラスIアロタイプに結合する、請求項18に記載の核
酸。
【請求項２５】ハイブリッドポリペプチドが、1つ以上のHPVタンパク質由
来のMHCクラスIアロタイプ結合エピトープを10個含む、請求項18に記載の核酸。
【請求項２６】ハイブリッドポリペプチドが、1つ以上のHPVタンパク質由
来のMHCクラスIアロタイプ結合エピトープを40個含む、請求項18に記載の核酸。
【請求項２７】ハイブリッドポリペプチドが、1つ以上のHPVタンパク質由
来のMHCクラスIアロタイプ結合エピトープを60個含む、請求項18に記載の核酸。
【請求項２８】第一のエピトープが第三のエピトープに重複する、請求項
24に記載の核酸。
【請求項２９】シグナル配列と第一のセグメントがスペーサーアミノ酸ま
たはスペーサーペプチドによって分離されている、請求項1に記載の核酸。
【請求項３０】ハイブリッドポリペプチドが1つのHPVタンパク質由来のMH
CクラスI結合エピトープを10個含む、請求項1に記載の核酸。
【請求項３１】 (a)HPV株16E6タンパク質由来の第一の複数のHLA結合エピ
トープと、 (b)HPV株16E7タンパク質由来の第二の複数のHLA結合エピトープとを含み、 HLA結合エピトープがそれぞれ、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A2
4からなる群より選択される1つ以上のアロタイプに結合する、請求項1に記載の
核酸。
【請求項３２】 (a)HPV株18E6タンパク質由来の第一の複数のHLA結合エピト
ープと、 (b)HPV株18E7タンパク質由来の第二の複数のHLA結合エピトープとを含み、 HLA結合エピトープがそれぞれ、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A2
4からなる群より選択される1つ以上のアロタイプに結合する、請求項1に記載の
核酸。
【請求項３３】 (a)HPV株16E6タンパク質またはHPV株16E7タンパク質由来
の第一の複数のHLA結合エピトープと、 (b)HPV株18E6タンパク質またはHPV株18E7タンパク質由来の第二の複数のHLA結合
エピトープとを含み、 HLA結合エピトープがそれぞれ、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A2
4からなる群より選択される1つ以上のアロタイプに結合する、請求項1に記載の
核酸。
【請求項３４】 (a)HPV株16E6タンパク質由来の第一の複数のHLA結合エピ
トープと、 (b)HPV株16E7タンパク質由来の第二の複数のHLA結合エピトープと、 (c)HPV株18E6タンパク質由来の第三の複数のHLA結合エピトープと、 (d)HPV株18E7タンパク質由来の第四の複数のHLA結合エピトープを含み、 HLA結合エピトープがそれぞれ、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A2
4からなる群より選択される1つ以上のアロタイプに結合する、請求項1に記載の
核酸。
【請求項３５】各複数のエピトープが、1つ以上のアロタイプにそれぞれ
結合するエピトープを少なくとも5つ含む、請求項31に記載の核酸。
【請求項３６】各複数のエピトープが、1つ以上のアロタイプにそれぞれ
結合するエピトープを少なくとも15個含む、請求項31に記載の核酸。
【請求項３７】シグナル配列と3つのセグメントを含むハイブリッドポリ
ペプチドであって、3つのセグメントは隣接しているかまたはスペーサーアミノ
酸もしくはスペーサーペプチドで分離されており、 (a)第一のセグメントは天然型HPVタンパク質の第一の部分アミノ酸配列を有し
、少なくとも11アミノ酸長であり、2つのエピトープを含み、 (b)第二のセグメントは天然型HPVタンパク質の第二の部分アミノ酸配列を有し
、少なくとも11アミノ酸長であり、(a)のエピトープとは異なる2つのエピトープ
を含み、 (c)第三のセグメントは天然型HPVタンパク質の第三の部分アミノ酸配列を有し
、少なくとも11アミノ酸長であり、(a)および(b)のエピトープとは異なる2つの
エピトープを含み、 (i)第一、第二および第三の部分は、同じ天然型HPVタンパク質の隣接していない
部分であり、3つ全ての部分の合計が天然型タンパク質の配列の70%未満を構成す
るか、または (ii)第一、第二および第三の部分は、2つまたは3つの異なる天然型HPVタンパク
質の部分である、ハイブリッドポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３８】少なくとも1つのセグメントが3つのエピトープを含む、請
求項37に記載の核酸。
【請求項３９】少なくとも1つのセグメントが5つのエピトープを含む、請
求項37に記載の核酸。
【請求項４０】少なくとも3つのエピトープがMHCクラスI結合エピトープ
である、請求項37に記載の核酸。
【請求項４１】 (d)天然型HPVタンパク質の第四の部分アミノ酸配列を有し
、少なくとも11アミノ酸長であり、(a)、(b)および(c)のエピトープとは異なる2
つのエピトープを含む、第四のセグメントをさらに含む、請求項37に記載の核酸。
【請求項４２】 HPV株16E6の以下のセグメント：の少なくとも1つ、および HPV株16E7の以下のセグメント：の少なくとも1つの配列を含むが、 HPV株16由来の全長で無傷のE6タンパク質または全長で無傷のE7タンパク質の配
列と同一の配列を含まない、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA。
【請求項４３】ハイブリッドポリペプチドがセグメントの少なくとも3つ
を含む、請求項42に記載のDNA。
【請求項４４】ハイブリッドポリペプチドが6つのセグメント全てを含む
、請求項42に記載のDNA。
【請求項４５】 HPV株16E6タンパク質およびHPV株16E7タンパク質の以下の
セグメント：の少なくとも1つの配列を含むが、 HPV株16由来の全長で無傷のE6タンパク質または全長で無傷のE7タンパク質の配
列と同一の配列を含まない、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA。
【請求項４６】 HPV株18E6の以下のセグメント：の少なくとも1つ、ならびに HPV株18E7の以下のセグメント：の少なくとも1つの配列を含むが、 HPV株18由来の全長で無傷のE6タンパク質または全長で無傷のE7タンパク質の配
列と同一の配列を含まない、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA。
【請求項４７】 HPV株16E6の以下のセグメント：の少なくとも1つ、 HPV株16E7の以下のセグメント：の少なくとも1つ、 HPV株18E6の以下のセグメント：の少なくとも1つ、ならびに HPV株18E7の以下のセグメント：の少なくとも1つの配列を含む、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA。
【請求項４８】ハイブリッドポリペプチドが少なくとも5つのセグメント
を含む、請求項47に記載のDNA。
【請求項４９】ハイブリッドポリペプチドが11個のセグメント全てを含む
、請求項47に記載のDNA。
【請求項５０】ハイブリッドポリペプチドが標的シグナルをさらに含む、
請求項49に記載のDNA。
【請求項５１】標的シグナルがHLA-DRαリーダー配列(配列番号：63)を含
む、請求項50に記載のDNA。
【請求項５２】 HPV E6およびE7タンパク質の以下のセグメント：の少なくとも1つの配列を含むが、 HPV株16またはHPV株18由来の全長で無傷のE6タンパク質または全長で無傷のE7タ
ンパク質の配列と同一の配列を含まない、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA。
【請求項５３】請求項1に記載の核酸を含むプラスミドまたはウィルスベ
クター。
【請求項５４】請求項1に記載の核酸によってコードされるハイブリッド
ポリペプチド。
【請求項５５】ポリマー基質または殻（shell）、および請求項1に記載の
核酸を含むマイクロスフェア。
【請求項５６】ポリマー基質または殻が、本質的にポリ-コ-グリコール酸
(PLGA)のポリマーからなる、請求項55に記載のマイクロスフェア。
【請求項５７】請求項1に記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含む
治療用組成物。
【請求項５８】アジュバントをさらに含む、請求項57に記載の治療用組成
物。
【請求項５９】請求項1に記載の核酸を含むリポソーム。
【請求項６０】請求項1に記載の核酸を哺乳類に投与する段階を含む、哺
乳類の免疫応答を誘発する方法。
【請求項６１】哺乳類がヒトである、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】病原体がHPVであり、ヒトが、外長性コンジローマ、扁平
コンジローマ、頚部癌（cervical cancer）、呼吸器乳頭腫、結膜乳頭腫、生殖
管HPV感染、頚部形成異常、高重症度扁平上皮内病変および肛門HPV感染からなる
群より選択される状態に罹患しているかまたはその危険にさらされている、請求
項61に記載の方法。
【請求項６３】核酸を哺乳類の粘膜組織に直接投与する、請求項60に記載
の方法。
【請求項６４】粘膜組織が膣または肛門組織である、請求項63に記載の方
法。
【請求項６５】核酸を皮下または筋肉内に投与する、請求項60に記載の方
法。
【請求項６６】請求項55に記載のマイクロスフェアを哺乳類に投与する段
階を含む、哺乳類の免疫応答を誘発する方法。
【請求項６７】第一、第二および第三の部分が、Her2/neu遺伝子、前立腺
特異的抗原(PSA)遺伝子、T細胞によって認識されるメラノーマ抗原(MART)遺伝子
およびメラノーマ抗原遺伝子(MAGE)からなる群より選択される遺伝子から発現さ
れる1つ以上の腫瘍抗原の部分である、請求項1に記載の核酸。
【請求項６８】第一、第二および第三の部分が、細胞に感染する1つ以上
のウィルスの1つ以上の天然型タンパク質の部分である、請求項1に記載の核酸。
【請求項６９】第一、第二および第三の部分が、HPV、ヒト免疫不全ウイ
ルス(HIV)、単純疱疹ウイルス(HSV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(
HCV)、ミコバクテリア、ヘリコバクター(Helicobacter spp.)、クラミジア(Chla
mydia spp.)および細胞に感染する寄生性真核生物からなる群より選択される1つ
以上の病原体の1つ以上の天然型タンパク質の部分である、請求項1に記載の核酸
。