JPH10504702A

JPH10504702A - 免疫原製剤

Info

Publication number: JPH10504702A
Application number: JP8500539A
Authority: JP
Inventors: アランロバートマイケルタウンセンド，
Original assignee: アイシスイノヴェイションリミテッド
Priority date: 1994-06-01
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 1998-05-12
Also published as: EP0762891A1; WO1995032731A3; GB9410922D0; AU2623795A; WO1995032731A2

Abstract

(57)【要約】ポリペプチドの一部または全部、または該ポリペプチドの一部または全部をコードするヌクレオチド配列のいずれかを含み、前記ポリペプチドが、遺伝子配列からの翻訳を、第１の読みとり枠から、突然変異の下流側の第２または第３のいずれかの読みとり枠にシフトさせる遺伝子配列における突然変異の結果生成される突然変異タンパク質と本質的に相同であり、前記ポリペプチドの一部または全部が、突然変異タンパク質に対する免疫反応を誘発することができる製剤が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】免疫原製剤本発明は、免疫原製剤の調製に係る材料及び方法に関する。悪性細胞内の抗原が、腫瘍特異的な細胞媒介性免疫を誘発するためのワクチンとして使用されることが示唆されており（Pardoll，D.W.，Nature，369，357-35 8(1994)）、研究は、細菌（Papadopoulos，S.B.，et al.，N．Engl．J．Med.，3 30，1185-1191(1994)）、胎児、及び組織特異性の抗原（Pardoll，D.W.，1994, 上記）、及び点突然変異を含む種々の抗原源に集中している。本願は、抗原がフレームシフト突然変異によって生じ、それが非反復(unique) タンパク質のセグメントを生じることを新たに教示する。フレームシフト突然変異の配列中の非反復タンパク質の新たなセグメントから導かれる抗原は、腫瘍特異的抗原またはフレームシフトに伴う他の疾患状態に特異的な抗原の、予め認識されない源となる。今日までの研究は、細胞内タンパク質のペプチドフラグメント、例えば、ウイルス性のタンパク質ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子を伴って体細胞表面に表現されることを示している。この機構は、抗原提示であると知られている。ウイルスまたはホストタンパク質は、シトゾル中のフリーなリボソームで製造されると考えられている。これらのタンパク質は、タンパク質分解酵素によって断片化され、このペプチドフラグメントは、シグナル非依存型機構(signal independent mechanism)によってホスト細胞のコンパートメント（おそらく小胞体）に輸送され、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。この複合体は細胞表面に輸送され、細胞表面でペプチドが循環している細胞毒性リンパ球に提示される。この機構が、感染の初期での免疫系による細胞内ウイルス性抗原の検出を可能にする。これは、移植後の無関係器官の拒否反応にも有効である。この機構は、細胞内感染薬を扱うために発達してきたが、この機構は、免疫系を監視するために、非感染細胞における細胞のタンパク質の頻繁な表現に対しても有効である。上記に関する総説は、Townsend，A.，"Presentation of Viral Antigens to the Immune System" Les Cahiers de la Foundation Louis Jeantet de Medecine 1 992 No．7 を参照されたい。ペプチドフラグメントを持つＭＨＣ分子の複合体のアセンブリにおいて、ウイルス性ペプチドが、ＭＨＣ複合体のアセンブリと安定化を補助することが知られている（Townsend，A.，et al.,（1989）Nature，Vol 340，No．6233 pp443-448 Elvin，J.，et al.,（1993）J．Immunol Methods，158，p161-171）。ＭＨＣ分子のペプチドと複合体を形成する能力は、抗原から決定される免疫原となりうる配列を同定するために利用されている。免疫原ペプチド配列は、予め病原に感染した患者の細胞によって認識され、そこからペプチド配列が導かれる。この試みは、ＭＨＣを持つＨＩＶ−１ｇａｇからのペプチドの結合によって実験された（Elvin，J.，et al，1993，上記）。ある種の疾患状態（例えば癌）では、正常な（即ち、健常な）細胞が突然変異する。細胞の通常のバージョン(version)は、対応する通常のタンパク質をコードする特別な遺伝子配列を含んでいる。しかし、突然変異は、通常の遺伝子配列から１つまたはそれ以上の塩基が欠失、あるいは、通常の遺伝子配列に１つまたはそれ以上の塩基が付加される。その結果、読みとり枠（リーディングフレーム）のシフトが起こる。通常は、これらの種類のフレームシフト現象は、端を切り取ったタンパク質を導くが、これは、第２及び第３の読みとり枠が停止コドン配列を含むからである。しかし、フレームシフト突然変異と最も近い下流側の停止コドンとの間では、フレームシフト現象により、対応する通常のタンパク質の配列と異なるタンパク質配列をもたらす。本願は、フレームシフト現象によって得られる突然変異タンパク質、及び／または、これらの突然変異タンパク質のポリペプチド／ペプチドフラグメントを教示するが、これらは、哺乳類の身体では通常表現されないので抗原として作用する。上述したように、細胞のタンパク質は頻繁にサンプリングされ、消化され、そして、消化によって得られたペプチドフラグメントは、循環しているリンパ球による検査のために細胞表面にＭＨＣ分子との複合体として表現される。タンパク質が個体にとって通常であれば、ポリペプチド／ペプチドフラグメントは個体のリンパ球によって個体に在来であると認識され、リンパ球に媒介された攻撃は生じない。しかし、本願は、突然変異タンパク質がフレームシフト突然変異の結果である場合、突然変異タンパク質自体、及び少なくともそれから導かれるペプチド／ポリペプチドフラグメントのいくつかは、その個体にとって新規なものであることを教示する。これらの新たなフラグメントが、循環しているリンパ球に対して、ＭＨＣとの組合せでもって提示された場合は、それらは外来物と見なされ、リンパ球は、それらに対する免疫反応を媒介する。この反応は、外来組織移植片の拒否反応に類似しているであろう。従って、本願は、翻訳が第２または第３の読みとり枠にシフトする遺伝子突然変異から生じた突然変異タンパク質、及び、そのような突然変異タンパク質から導かれるペプチド／ポリペプチドフラグメントは、突然変異タンパク質に対する免疫反応を誘発する製剤の活性成分としての価値があることを教示する。よって、新たなポリペプチド及びペプチドは、ワクチン製剤における価値を有する。多くの結腸癌は、フレームシフト遺伝子突然変異に関連していることがわかっている（Fearon，et al.，Cell，Vol．61．p759-767，(1990); Nishino，I.，et al.，Science，253，665-669，(1991); Miyoshi，Y.，et al.，Hum．Molec．Ge net.，1，229-233，(1992)）。フレームシフト突然変異は、胃癌及び膵臓癌（Ho rii，A.，et al.，Cancer Res.，62，6696-6698,（1992）及び Horii，A.，et a l.，Cancer Res.，52，3232-3233，(1992)）、及び、他の悪性腫瘍（Harris，C. C.，et al.，N．Engl．J．Med.，329，1318-1327，(1993)）でも生じている。特に、染色体５ｑ２１からの腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子は、結腸直腸の腫瘍形成に寄与することが示唆されている。ＡＰＣ遺伝子は、異常に大きな（３００ｋＤａ）タンパク質をコードすることが見出され、この遺伝子は配列及び予想されるアミノ酸配列が開示されている（Kinzler，et al.，Science， Vol．253，p661，(1991)）。体細胞突然変異は、結腸直腸腫瘍の患者に起こるとされている（Miyoshi，et al.，1992，上記）。Miyoshi等は、４３例の結腸癌の詳細な症例を提示している。本願発明者は、これらの症例を分析した。約半数の突然変異は、変異した部位の遺伝子に、未成熟な停止コドンを形成している。この結果、ＡＰＣタンパク質の端を切り取ったバージョンは、今日まで、実質的に免疫学的興味を引かなかった。しかし、突然変異の残りの半数（２１）（小さな塩基の欠失または挿入）は、フレームシフトをもたらし、停止コドンまでの突然変異の下流側の突然変異タンパク質配列の翻訳が達成される。これらの場合におけるフレームシフト突然変異は、平均長さ１６．１残基の、５６アミノ酸までの新たな配列を生ずる。１６アミノ酸残基またはそれ以上の予想される新たな配列を持つ１１の場合について、下記の表１に列記した。新たな読みとり枠のいくつかは、共通のＭＨＣクラスＩ分子に結合しているように見える配列領域を含んでいる（Falk，K./ et al.，Nature，351，290-294，(1991)）。 Townsend，A.，et al.，Cell，62，285-295，1990，に記載されているように、下線を施した配列は、ＨＬＡＡ２のアセンブリを安定化することが見出され、太字で示した配列は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＴＬに制限されたＫ^dを誘発する。本願発明者らは、上記の表１に下線を施した配列が、インビトロでＨＬＡＡ２クラスＩ分子のアセンブリを誘発する能力を有することを確認した。よって、本願は、任意のリボソームが停止コドンに達するまで、新たなペプチド／ポリペプチド配列が、実際にフレームシフト突然変異と停止コドンとの間で翻訳されること、及び、この新たな配列及びそこからのポリペプチド及びペプチドが、疾患（例えば腫瘍）特異的抗原となり、細胞表面にＭＨＣとの組合せで表現されると外来物と見なされることを教示する。これらの新たなポリペプチド及びペプチド配列が、フレームシフトを伴う疾患に対して特異的な唯一の抗原であるとすると、これらの唯一の抗原の配列の一部又は全部を含むペプチド／ポリペプチドは、疾患、例えば結腸癌に伴う突然変異細胞タンパク質に対する免疫反応を誘発するための、個体の治療に用いることができる。従って、ＡＰＣ遺伝子の第２及び第３の読みとり枠の全ての翻訳生成物は、潜在的に、治療及び予防ワクチンとなる可能性を有する。よって、本発明は、タンパク質及びそのポリペプチド及びペプチドフラグメントを提供するが、このタンパク質は、翻訳を遺伝子突然変異の下流側の第２または第３の読みとり枠にシフトさせる疾患状態を伴う遺伝子突然変異の結果生成された対応する突然変異タンパク質を本質的に有し、このタンパク質及びそのポリペプチド及びペプチド及び突然変異タンパク質は抗原である。このような突然変異タンパク質は、染色体５ｑ２１の腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子によってコードされてもよい。突然変異タンパク質は、ＡＰＣ遺伝子のコドン１４１８及び１４７２の間にある第２の読みとり枠によってコードされてもよい。突然変異タンパク質は、ＡＰＣ遺伝子のコドン１４７２及び１５０６の間にある第２の読みとり枠によってコードされてもよい。ペプチドは、次の配列から選択されてもよい。ＫＹＬＫＩＫＨＬＬＱＬＫＰＳＥＫＹＬＩＬＹＹＩＬＰＲＫＫＶＬＱＭＤＦＬＶまた、本発明は、上述のタンパク質及びそのポリペプチド及びペプチドフラグメント及び突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。また、本発明は、伝達、発現、及びワクチンベクター等のベクターに導入したこれらのヌクレオチド配列を提供する。ワクチンベクターは、ワクシニアウイルスに基づくものでも、あるいは他の有用なウィルス性ベクター及びＴｙ粒子に基づくものでもよい。また、本発明は、これらのヌクレオチドまたはベクターを含む組み換えホスト細胞も提供する。また、本発明は、１つまたはそれ以上の抗原性を向上させる部位と組み合わせた前記タンパク質及びポリペプチド及びペプチドフラグメントも提供する。また、本発明は、（ｉ）上述のタンパク質またはそのポリペプチド／ペプチドフラグメント、（ｉｉ）上述のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）上述のベクターのいずれかを含む製薬組成物も提供する。特に、この製薬組成物は、上述のヌクレオチド配列を含むウイルス（ワクシニアウイルス等）に基づくベクターを含む治療用ワクチンであってもよい。さもなくば、この製薬組成物は、上述のヌクレオチド配列を含むＴｙ粒子に基づくベクターを含む治療用ワクチンであってもよい。これらのワクチンは、例えば、二次的な癌の進行を防止するような予防用であってもよい。また本発明は、これらの製剤／ワクチンを用いた、フレームシフト突然変異を伴う患者の疾患状態の治療方法も提供する。また本発明は、上述の突然変異タンパク質及びそのポリペプチド及びペプチドフラグメントの同定方法も提供する。この方法は、以下の過程からなる。（ｉ）翻訳を突然変異の下流側の第２または第３の読み取り枠にシフトさせる少なくとも１つの遺伝子突然変異を伴う疾患に罹患した個体から導かれた組織サンプルからＤＮＡを抽出し、（ｉｉ）切片における突然変異の予想に基づいて増幅すべきＤＮＡ切片を選択し、（ｉｉｉ）選択したＤＮＡ切片を増幅し、（ｉｖ）増幅したＤＮＡの一部または全部を配列し、第１の読み取り枠の対応するヌクレオチド配列に比較してＭＨＣ分子と結合しやすいと思われる第２または第３の読み取り枠のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を選択し、（ｖ）過程（ｉｖ）で選択したヌクレオチド配列にコードされたポリペプチド／ペプチド配列の免疫原性を試験する。あるいは、この方法は以下の過程からなってもよい。（ａ）翻訳を突然変異の下流側の第２または第３の読み取り枠にシフトさせる少なくとも１つの遺伝子突然変異を伴う疾患に罹患した個体から導かれた組織サンプルからＤＮＡを抽出し、（ｂ）切片における突然変異の予想に基づいて増幅すべきＤＮＡ切片を選択し、（ｃ）選択したＤＮＡ切片を増幅し、（ｄ）選択したＤＮＡ切片を含む発現ベクターを製造して、適当なホスト細胞を形質転換して前記選択したＤなを発現させ、（ｅ）発現生成物の、前記個体から導かれたＭＨＣ分子の結合性及び安定性を試験し、（ｆ）前記ＭＨＣ分子に結合し安定化した発現生成物の免疫原性を試験する。これら２つの方法は組み合わせてもよい。即ち、前記の過程（ｉｖ）において選択したＭＨＣ分子と結合やすいと思われる第２または第３の読み取り枠のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部または全部を、過程（ｃ）の発現ベクターに導入して発現させてもよい。発現生成物は、過程（ｅ）及び（ｆ）のように試験される。全てのタンパク質／ポリペプチド／ペプチドの治療的利用性は、標準的な方法によって試験できる。同様に、そのような試験の結果、治療的利用性を有すると考えられる全てのタンパク質／ポリペプチド／ペプチドは、製剤及びワクチンに処方することができ、さらに、インビトロ及びインビボ（動物及びヒトでの研究）で、この分野で従来から使用され周知の技術及び方法に従って試験することができる。上記に概観を述べたこの新しい思想は、以下に実施例を挙げて説明するが、こでは、第２及び第３の読み取り枠へのフレームシフトを生ずる突然変異の結果として、ＡＰＣ遺伝子から導かれた突然変異ポリペプチド／ペプチドのみを挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。添付した図面を参照する。図１ａ：コドン１４１８から１４７２の間の第２の読み取り枠においてＡＰＣ配列をコードするワクシニアで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスからの細胞毒性Ｔ細胞を、インビトロで５日間、ペプチド配列ＫＹＬＫＩＫＨＬＬで刺激した後に得た。標的細胞は、予めＨＬＡ遺伝子Ｈ−２Ｄｂを移入したＬ細胞（ＬＤｂと呼ぶ）である。これらの細胞は、Ｃｒ５１でラベルし、図中に示した処理にさらした。次いで、これらを、エフェクター細胞毒性Ｔ細胞と図中に示した比率（Ｅ／Ｔ比率）で混合した。殺傷の数を、Townsend，et al.，Cell，Vol．44，959-968 , 1986 に記載されたように、％特異的溶解として測定した。ＡＰＣの第２の読み取り枠コドン１４１８−１４７２をコードするワクシニアによる感染は、ＨＬＡ分子Ｋ^dした（Ｋ^dｖａｃ）をコードするワクシニアウイルスでともに感染させただけの後に、Ｔ細胞によって殺傷された。図１ｂ：結腸癌細胞列を標的細胞として同様の実験を行った。この細胞列は、ＬｏＶｏと呼ばれる（Brodsky，et al.，Immunol．Rev．47，3-61，1979）。この細胞列は、ベータ−２ミクログロブリンの発現を欠くので、この細胞にＨＬＡ分子を表現させるため、ベータ−２ミクログロブリンを発現するワクシニアウイルスを追加した（Yewdell，et al.，J．Immunol.，152，1163-1170，1994）。標的細胞は、ｉ）標的細胞がベータ−２ミクログロブリンワクシニア、及びＫ^dワクシニア及びＡＰＣの第２の読み取り枠コドン１４１８−１４７２をコードするワクシニアに感染するか、ｉｉ）ベータ−２ミクログロブリンワクシニア及びＫ^d ワクシニアに感染し、次いでペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬにさらされたときにのみ、細胞毒性Ｔ細胞に認識されることに注意すべきである。図２：配列ＱＬＫＰＳＥＫＹＬ及びＫＶＬＱＭＤＦＬＶによるＨＬＡＡ２への結合の証拠。実験は、本文を参照して行った。レーン１は、ペプチドが無い場合に検出されたＡ２のバックグラウンドレベルを示す。レーン２は、インフルエンザマトリクスタンパク質から導かれた周知の結合ペプチドを２０μＭ添加したとき見られる増加である。レーン３−１８は、ＡＰＣの第２及び第３の読み取り枠から導かれたタンパク質の組を２０μＭを添加した。配列ＱＬＫＰＳＥＫＹＬ（レーン１１）、及びＫＶＬＱＭＤＦＬＶ（レーン１８）は、結合を示す検出されるＡ２のレベルが顕著に増加した。図３：配列ＩＬＹＹＩＬＰＲＫによるＨＬＡＡ３への結合の証拠。実験は、図２で記載したように行った。レーン１は、ペプチド無しでモノクローナル抗体ＧＡＰＡ３によって検出されたＡ３のレベルを示す。レーン２及び３は、ペプチド配列ＩＬＹＹＩＬＰＲＫを、５０μＭ（レーン２）または５μＭ（レーン３）添加した後の顕著な増加を示す。レーン４は、ポジティブな対照として、ＨＩＶｎｅｆに特異的な細胞毒性Ｔ細胞に制限されたヒトＡ３によって認識差れることが知られている周知のＨＬＡＡ３結合ペプチドを含んでいる。レーン７及び８では、図２においてＨＬＡＡ２に結合させるために示した配列ＱＬＫＰＳＥＫＹＬが、ＨＬＡＡ３に結合しなかったことに注意すべきである。図４は、ウェスタンブロットを示す。レーン１：直腸癌細胞列ＳＷ４８０からのポジティブな対照抽出物（Smith，et al.，PNAS，90，2846-2850，1993 に記載）であって、組み換えワクシニアウィルスから導かれた突然変異ＡＰＣタンパク質の組み換え体の予想されるサイズに近い約１４７ｋＤの突然変異ＡＰＣタンパク質を発現する。レーン２−４：全長の突然変異ＡＰＣ遺伝子（７１３１ＶＡＣ）をコードする組み換えワクシニアウィルスの３つの異なるサブクローン（７１３１ｃ３ＶＡＣ、７１３１ｃ２ＶＡＣ、７１３１ｃ１ＶＡＣ）で感染した（１０⁶細胞中２０ｐ．ｆ．ｕ、１．５時間、回収に４時間）ＬＫ細胞（５× １０⁵細胞／レーン）からの抽出物。レーン５：組み換えワクシニアウィルス７１３１ＶＡＣによって行ったのと類似の突然変異を伴う患者から導かれたリンパ芽球細胞からのポジティブな対照。図５（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）は、Ｃｒ⁵¹放出アッセイの結果を示す。（ａ）及び（ｂ）では、標的細胞は、マウスのＫ^dクラスＩ分子をコードする遺伝子で形質転換されたマウスの全てのＬ細胞（ＬＫｄ細胞）である。ＬＫｄＵｎは、マウスの任意のＡＰＣ遺伝子を持つワクシニアウィルスで感染していないＬＫｄ細胞である。ＬＫｄＭ−５３−ＱＶＡＣは、ＫＹＬＫＩＫＨＬＬエピトープを含む５３アミノ酸フラグメントをコードする組かワクシニアウィルスで感染したＬＫｄ細胞である。７１７１／３ＶＡＣは、腫瘍７１３１からの全長突然変異ＡＰＣタンパク質をコードし、ＫＹＬＫＩＫＨＬＬエピトープを含む組み換えワクシニアウィルスで感染したＬＫｄ細胞である。ＮＰ１４７−５５は、ネガティブな対照としての、インフルエンザ核タンパク質からのアミノ酸１４７から１５５を発現するペプチドで処理したＬＫｄ細胞である。Ｋ−９−Ｌは、腫瘍７１３１でフレームシフトしたＡＰＣタンパク質配列に存在するペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬで処理したＬＫｄ細胞である。（ａ）において、細胞毒性Ｔ細胞はマウスのものであり、９残基ペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬによって生じた。（ｂ）において、細胞毒性Ｔ細胞は、マウスのものであり、インフルエンザウィルスの配列ＮＰ１４７−１５５で生じた。（ｃ）及び（ｄ）では、（インフルエンザウィルスのＫＹＬＫＩＫＨＬＬ及びＮＰ１４７−１５８に対する）２つの細胞毒性Ｔリンパ球の組を、Ｋｄではなく組織適合性分子Ｄｂを移入したＬ細胞に対して試験した。第１部ＡＰＣ遺伝子における変異は、コドン１２５０−１５５０間で優勢であることが研究(Myoshiら、上掲)により示された（しかしながら、多くの免疫学的に重要なフレームシフトが、ＡＰＣ遺伝子の他の場所でも起こり、これらもここに記載するようにして実験してもよい）。コドン１２５０−１５５０の変異の優位性により、腫瘍サンプル由来のこれらのコドン間のＡＰＣＤＮＡ配列のポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）増幅によって、変異を簡単にスクリーニングすることができる。使用可能な免疫原性配列を同定するために行われる例示として、本出願人は、（１）一つの塩基の欠失もしくは２つの塩基の挿入によって生じるコドン１４１８−１４７２間の第２の読み取り枠、および（２）一つの塩基の欠失もしくは２つの塩基の挿入によって生じるコドン１４７２−１５０６間の第２の読み取り枠に読むフレームシフトを研究することを選択した。ここで用いた全ての番号付けは、Miyoshiら，1992、上掲に用いられたＡＰＣ配列の番号付けに従うものである。ＤＮＡを、標準的な技術に基づいて、腫瘍サンプルから抽出した（例えば、Sa mbrook，Fritsth，Maniatis（1989）Cold Spring Harbour Laboratory Pressに記載されている）。腫瘍抽出物に対し、コドン１４１８−１４７２およびコドン１４７２−１５０６のヌクレオチド配列を、以下のオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤを用いて標準的な手順でＰＣＲによって増幅した。プライマーＡとＢは、コドン１４１８−１４７２間のヌクレオチド配列を増幅するために用いられ、プライマーＣとＤは、コドン１４７２−１５０６間のヌクレオチド配列を増幅するために用いられた。ＰＣＲを、Stratagene P.F.U.を用いて行った。以下の成分、すなわち（１）腫瘍由来の鋳型ＤＮＡ（滴定されたもの）；（２）４μＭストック溶液の１０μｌのオリゴＡおよびＢ、またはＣおよびＤ；（３）１０μｌの×１０ Stratagene P.F.U.バッファー；（４）５ｍＭストック溶液の５μｌＧＡＴＣ混合物；（５）終体積を１００μｌとする量のＨ₂ Ｏを混合した。この混合物を５分間９５℃で熱し、次いで８０℃まで冷却した。次に、５ユニットのStratagene P.F.U.を加えた。ＰＣＲは、９２℃で５分間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間から構成されるサイクルを３５サイクル行った。このオリゴヌクレオチドを、読み枠の開始位置のＮｃｏＩ制限部位と読み枠の終末のＢｇｌII制限部位内に含まれるＡＴＧ開始コドンを具備するように設計した。増幅されたヌクレオチド配列をＢｇｌIIとＮｃｏＩで切断し、ワクシニア発現ベクターＰＳＣ１１３ＯＲ．２にクローン化した。ＰＳＣ１１３ＯＲ．２は、以下に示すようにＳｍａＩ部位にオリゴヌクレオチドを挿入することにより、ベクターｐＳＣ１１（Chakrabarti，S.ら，Molec．Cell Biol．Vol.5，No.12，1985, p.3402）から誘導された。ＳｍａＩ部位に挿入されたオリゴヌクレオチドは、ＡＴＧ開始部位の上流に、クローン化された読み取り枠を発現させるコザック配列(a kozac sequence)を備えている。コドン１４１８−１４７２間およびコドン１４７２−１５０６間の増幅されたヌクレオチド配列を配列決定し、２位にＹ残基および９位にＬ残基をコードするヌクレオチド配列に基づいて（Falkら，Nature，351，290-296，1991）、マウスＫ^dクラスＩ分子に結合しそうな推定されるアミノ酸配列をコードすることを調べた。マウスＫ^dクラスＩ分子に結合しそうな推定されるポリペプチド配列をコードし、かつ、第２フレームの（正常型との比較から調べられる）ヌクレオチド配列を、免疫原性についてさらに調べた。第２読み取り枠の１４１８−１４７２の読み取り枠をコードし、マウスＫ^dクラスＩ分子に結合する配列を含むと推定されるヌクレオチド配列を、標準的な方法（例えば、Townsendら，J．Exp．Med.，Vol.168，1211-1224，1988）でワクシニアウイルスＴＫ遺伝子に挿入した。挿入配列を有する１０⁷プラーク形成単位（p.f.u）の組み換えワクシニアウイルスで、マウスを静脈（i.v.）に免疫した。少なくとも１０日後、脾臓細胞を除去した。もし、ポリペプチドが適切な免疫原性を備え、そのためワクチンとして使用可能であれば、特定のポリペプチドに特異的なレセプターを備えたＴ細胞集団を誘発しうる。特異的なレセプターを備えたＴ細胞は、脾臓中に低濃度（１００００細胞中に約１つの細胞）で存在するので、この特異的なＴ細胞集団は、Ba stin，J.ら，J．Exp．Med．Vol．165，1508-1523，1987に記載された方法を用いて、９残基のペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬ（残基１４５１−１４５９）にインビトロでさらすことによって増大された。５−７日後、生育Ｔ細胞を、特異的な障害性について標準的なＣＲ⁵¹放出アッセイで試験し、ＩＬ−２含有媒体中で再度刺激(restimulated)および生育させ（Bastinら，1987,上掲に記載）、後に試験した。Ｃｒ⁵¹放出アッセイでは、Ｃｒ⁵¹を放出する標的細胞は、例えば、適切な読み取り枠をコードする組み換えワクシニアウイルスに感染したマウスＬ細胞（Town sendら，Cell，Vol.44，959-968，1986）か、同様に感染したヒト結腸癌から誘導された細胞列かもしれない。標的細胞に適切なＭＨＣ分子を発現するには、このＭＨＣ分子をコードする遺伝子が移入されるか（Townsendら，1986,上掲）、このＭＨＣ分子をコードする別のワクシニアウイルスに感染されるのかもしれない（Yewdellら，J．Immunol．Vol.152，p.1163-1170，1994）。図１に示されたように、この結果は、以下のことを示唆する。１．第２の読み取り枠の、マウスＫ^dクラスＩ分子に結合すると予想される、推定されたポリペプチド配列をコードするヒト結腸癌ヌクレオチド配列を含む組み換えワクシニアウイルスで免疫されたマウスは、特にマウスＭＨＣクラスＩＫ^d 分子も標的細胞に発現されている場合に、ポリペプチド配列に曝された（例えば、ペプチドをコードする組み換えワクシニアウイルスの感染による）、標的細胞を認識する細胞毒性Ｔ細胞を備えていた。２．また、この細胞毒性Ｔ細胞は、完全開放読み取り枠（１４１８−１４７２）をコードするワクシニアウイルスと、マウスＭＨＣＫ^d分子をコードするワクシニアウイルスに共感染(coinfected)した両方のタイプの標的細胞も認識した。これは、（ａ）コドン１４１８−１４７２間の第２の読み取り枠がＢａｌｂ／ｃマウスに対して免疫原性があること、（ｂ）エピトープ１４５１−１４５９がより長いフラグメント１４１８−１４７２内から提示されうることを証明する。これらの結果は、ＡＰＣ遺伝子等のある遺伝子の、第２および第３の読み取り枠によってコードされたタンパク質およびそのポリペプチド／ペプチドフラグメントが、哺乳類に免疫原性を示しうるという出願人の教示を裏付けるものである。マウスＡＰＣの配列はヒトＡＰＣ配列に密接に関連するが、この結果は、マウスが、ヒトＡＰＣの第２および第３の読み取り枠にコードされたタンパク質に免疫学的に寛容ではないことも証明する。第２部第１部に記載されている実験は、挿入配列として第２読み取り枠の１４１８− １４７２の読み取り枠(open reading frame)を備え、かつマウスＫｄクラスＩ分子を結合する配列を含むと考えられる、組換えワクシニアウイルスを利用するものであった。パート２の実験は、挿入配列として全長の変異ＡＰＣ遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスを利用するものである。始めの目的は、変異ＡＰＣタンパク質の全長が、細胞内に予想されるように分解されて、フレームシフト変異の下流のヌクレオチド配列にコードされたポリペプチドに由来する一群のペプチドフラグメントを産生することを証明することであった。この証明には、変異ＡＰＣコード配列の全長を構成する必要があった。以下には、腫瘍７１３１の変異配列を含むフラグメントをＰＣＲ増幅するために用いられるオリゴヌクレオチドＥおよびＦの配列が示されており、Ｐｓｐ１４０６１制限部位を備えた増幅されたフラグメントの完全配列が示され、さらに、２つの挿入塩基が、コドン１４３８に太字（ＡＡ）で示されている。重要な点は、ＡＰＣ遺伝子に独特な制限酵素部位Ｐｓｐ１４０６１を増幅配列中に含むことである。この部位は、サンブルーク(Sambrook)ら、１９８９年、上掲、に記載された通常の技術を用いて、正常遺伝子の正常な左側断片（５’フラグメント）と腫瘍サンプルから増幅された右側変異フラグメント（３’フラグメント）とを連結(recombine)するために用いることができる。完全な変異ｃＤＮＡは、通常の工程で組み換えワクシニアを作製するために、ｐＳＣ６５にサブクローニングすべくＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断することができる。ＤＮＡは、標準的な技術（Sambrookら、１９８９年、上掲）に基づいて、腫瘍サンプル（７１３１と称する）から抽出した。腫瘍７１３１は、ＡＰＣ遺伝子のコドン１４３８に２つの塩基対が挿入されている。エキソン１５の内部から短い変異フラグメントを以下のようにしてクローン化した。このフラグメントを含むヌクレオチド配列を、腫瘍７１３１のＰＳＰ１４０６１制限酵素部位から変異読み枠Ａ-５３-Ｑの終末までの変異フラグメントを増幅し、かつ完全な変異ＡＰＣ遺伝子と正常型のＢａｍＨＩＰｓｐ１４０６１断片とを再構成するために、以下のオリゴヌクレオチドＥとＦとを用いた標準的な方法に基づくＰＣＲによって増幅した。以下には、オリゴＥおよびＦを用いて増幅されたＰｓｐ１４０６１部位に交差する配列が示されている。この産物は９５５塩基対である。ＰＣＲを、Stratagene P.F.U.を用いた最適な滴定で行った。以下の成分、すなわち（１）腫瘍由来の鋳型ＤＮＡ（滴定されたもの）；（２）４μＭストック溶液の１０μｌのオリゴＥおよびＦ；（３）１０μｌの×１０ Stratagene P.F. U.バッファー；（４）５ｍＭストック溶液の５μｌＧＡＴＣ混合物；（５）終体積を１００μｌとする量のＨ₂Ｏを混合した。この混合物を５分間９５℃で熱し、次いで８０℃まで冷却した。次に、５ユニットのStratagene P.F.U.を加えた。ＰＣＲは、９２℃で５分間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間から構成されるサイクルを３５サイクル行った。増幅されたフラグメントを、正常型のＡＰＣｃＤＮＡの全長と結合して、ワクシニア発現ベクターＰＳＣ６５（米国ワシントンのナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスのDr.Mossから与えられたもので、このベクターは、使用可能なベクターであるＰＳＣ１１３０Ｒ．２と類似している）にクローニングし、パート１に記載されているように配列決定した。変異ＡＰＣｃＤＮＡの全長をコードする組み換えワクシニアを、パート１に記載されているように調製した。Ｌ細胞を、組み換えワクシニア（サブクローン７１３１ｃ３ＶＡＣ、７１３１ｃ２ＶＡＣおよび７１３１ｃ１ＶＡＣ）で感染させ（１０⁶細胞中に２０p.f .u；１．５時間；発現に４時間）、発現されたタンパク質の大きさを、Smithら，PNAS 90，2846-2850(1995)によって記載されているようにタンパク質の未変性Ｎ末端領域と反応するＦＥ９抗体（Oncogene Science Inc.，106 Charles Lindb ergh Blvd，Uniondale，NY 11553-3649，USA）を用いたウエスタンブロット解析（５×１０⁵細胞／レーン）で決定した。組み換えワクシニアは、予定された大きさの変異ＡＰＣタンパク質を発現することが証明され、そのブロットは図４に示されている。レーン１は、組み換えワクシニアから誘導される変異ＡＰＣタンパク質（約１６５ｋＤ）の予想される大きさの組み換え形態と大きさの点で近接した、約１４７ｋＤの変異ＡＰＣタンパク質を発現する結腸癌細胞列ＳＷ４８０（Smithら，PNAS 1993、上掲に記載）のポジティブ対照抽出物である。レーン２−４は、ワクシニアの３つの異なるサブクローン（７１３１ｃ３ＶＡＣ、７１３１ｃ２ＶＡＣおよび７１３１ｃ１ＶＡＣ）に感染したＬ細胞からの抽出物である。主なバンドは、ＳＷ４８０バンドのわずか上まで展開され、組み換えワクシニアに保有されている変異と類似した変異を有する患者のリンパ芽球細胞列から誘導された別のポジティブ対照であるＳＭ５０１からのレーン５におけるバンドに大きさの点で近接していることがわかる。この結果は、組み換えワクシニアが変異ＡＰＣ遺伝子の全長を保有すること、および予想された大きさの変異ＡＰＣポリペプチドを発現しうることを確認するものである。また、レーン２−４は、１４７ｋＤより小さい分子量（ｍｗｓ）を備え、かつＦＥ９抗体と反応する一群のタンパク質を示すバンドも示している。これらは、おそらくＬ細胞における変異ＡＰＣ遺伝子の全長の分解から生じたものであろう。変異形態のＡＰＣタンパク質の全長の分解、および細胞毒性Ｔリンパ球に認識されるための前記フラグメントの提示を調査するために行った。図５（ａ）に示されているように、細胞毒性Ｔリンパ球は、第１部で同定された９残基ペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬ（１４５１−１４５９残基）を挿入物として備えた組み換えワクシニアウイルスを用いて、上述のように免疫したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生じた。９残基ペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬは、最も共通性のあるフレームシフト抗原（腫瘍７１３１に存在）から誘導され、Ｋ^dクラスＩ分子と組み合わせてマウス細胞毒性Ｔリンパ球に認識される。これらの細胞毒性Ｔリンパ球を、（i）マウスＫ^dクラスＩ分子をコードする遺伝子で形質転換されているが、いずれの変異ＡＰＣ遺伝子を保有するワクシニアウイルスにも感染していないマウスＬ細胞であるＬＫｄＵｎ；（ii）マウスＫ^dクラスＩ分子をコードする遺伝子、および、ポジティブ対照としてＫＹＬＫＩＫＨＬＬエピトープを含む５３アミノ酸のフリンジメント(fringement)をコードする組み換えワクシニアウイルスで形質転換されたマウスＬ細胞であるＬＫｄＭ-５３-ＱＶＡＣ；（i ii）マウスＫ^dクラスＩ分子をコードする遺伝子、および、腫瘍７１３１の変異ＡＰＣタンパク質の全長をコードし、かつＫＹＬＫＩＫＨＬＬエピトープを含む組み換えワクシニアウイルスで形質転換されたマウスＬ細胞である７１３１／３ＶＡＣ；（iv）マウスＫ^dクラスＩ分子をコードする遺伝子で形質転換され、かつ、ネガティブ対照としてインフルエンザ核タンパク質のアミノ酸１４７−１５５を提示するペプチドで処理されたマウスＬ細胞であるＮＰ１４７−１５５；および（v ）マウスＫ^dクラスＩ分子をコードする遺伝子で形質転換され、かつ、腫瘍７１３１のフレームシフトしたＡＰＣタンパク質配列に存在するペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬで処理したマウスＬ細胞であるＫ-９-Ｌを、標的細胞として用いた標準的なＣＲ⁵¹放出アッセイ(CR⁵¹release array)で試験した。この図は、腫瘍７１３１の変異ＡＰＣ遺伝子の全長をコードする組み換えワクシニアウイルスに感染した細胞が、９残基のペプチドＫＹＬＫＩＫＨＬＬに特異的な細胞毒性Ｔリンパ球によって認識されたことをことを示している。図５（ｂ）では、同じ組の標的細胞を、インフルエンザウイルスの配列ＮＰ１４７−１５５で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスに生じた細胞毒性Ｔリンパ球を用いて試験した。腫瘍７１３１の変異ＡＰＣ遺伝子の全長をコードする組み換えワクシニアウイルスに感染した細胞は、ＡＰＣフレームシフト抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球によってのみ認識され、マウスＫ^dクラスＩ分子と結合した別の抗原を認識する別の細胞毒性Ｔリンパ球によっては認識されないことを示している。図５（ｃ）および図５（ｄ）では、二組の細胞毒性Ｔリンパ球（（ｃ）ではＫＹＬＫＩＫＨＬＬ、（ｄ）ではインフルエンザウイルスのＮＰ−１４７−１５５に対する）を、Ｋｄに代えて組織適合分子Ｄｂを移入したＬ細胞に対して試験した。結果は、細胞毒性Ｔリンパ球が、正しい組織適合分子が存在する場合にのみその抗原を認識することを示している。結果として、図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に与えられた上記結果を示した実験は、自然に生じる腫瘍（Townsendら Nature 371，662(1994)）に見出される最も共通性の高いクラスの変異を示す腫瘍７１３１に見出された変異形態のＡＰＣタンパク質の全長が、細胞の内部で分解され、細胞表面で細胞毒性Ｔリンパ球によって認識される形態にフレームシフト配列内からペプチドエピトープＫＹＬＫＩＫＨＬＬを生じることを証明した。第３部ワクチンの調製と関連して、免疫原性を備えたＡＰＣ読み取り枠内の特定のエピトープを同定することは有益であり、そのエピトープは、ワクチンの調製において、単独あるいは別の配列と組み合わせて使用することができる。Falkら（Na ture 361，290-296，1991）は、ある同じ特徴（例えば、２位のＹおよび９位のＬ）を備えたペプチドは、その特定の特徴を持たない配列よりも高い確率で特定のＭＨＣ分子に結合することを立証した。本出願人等は、Falkらによって定義された配列が、ヒトＭＨＣクラスＩ分子と低い親和性で結合するのか、あるいは高い親和性で結合するのかを証明した（Elvin，J.ら，1993，上掲）。ペプチドが高い親和性で結合しているのか、あるいは低い親和性で結合しているのかを調べるために、ペプチドが結合時のＭＨＣ分子の構造を安定化するという観察に基づいて、ＭＨＣ分子の結合のアッセイを開発した（Townsend，Al.ら，Nature Vol. 340，No．6233 p443 1989）。このアッセイは、例えばマラリアのエピトープを定義付けるために用いられた（Hillら，Nature Vol.360，434，1992）。本出願人等は、このアッセイを、フレームシフトから得られたＡＰＣ遺伝子の新規の読み取り枠に適用して、共通のヒトＭＨＣ分子Ａ２およびＡ３を結合するいくつかのペプチドを同定した。図２および図３は、Ａ２分子を結合する配列ＱＬＫＰＳＥＫＹＬ（コドン１４４５−１４５３、第２読み取り枠）、およびＡ３分子を結合する配列ＫＶＬＱＭＤＦＬＶ（第２読み取り枠内のコドン１４９４− １５０２）、ＩＬＹＹＩＬＰＲＫ（コドン１４８６−１４９５、第２読み取り枠）の証拠を提供する。さらに、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫原性を有するコドン１４１８−１４７２間の第２読み取り枠配列も、結腸癌が特に流行している日本で最も一般的な対立遺伝子であるＭＨＣＡ２４分子を結合するのに適した配列モチーフ（２位のＹおよび９位のＬ）を含んでいる。最後に、フレームシフトによる新しい読み取り枠から誘導された特定の配列が、ヒトにおいて免疫原性を示すことを確かめるために、被験者を、ＡＰＣ等の遺伝子の第２および第３の読み取り枠にコードされるペプチドを含むかあるいはインビトロで発現することが可能なプロトタイプワクチンで免疫してもよい。効率的にＣＴＬを刺激するヒトに使用するためのワクチンの調製に関して、本出願人は、標準的な手順および方法論に基づいて、組み換えワクシニアウイルスまたは他の同等のウイルス性ベクター、組み換えＴｙ粒子、およびＣＴＬを刺激するために必要とされる種々のアジュバントを含む調製物の有益性を調べるつもりである。このような試みは、（ａ）ワクチンの免疫原性を確認し；かつ（ｂ）新規のエピトープを同定するという目的のためである。患者におけるさらなる研究は、以下の２種類である：（ａ）Ｔ細胞浸潤が監視できる第二の堆積物を持つ腫瘍中で良く決定されたエピトープを用いたヒトへのワクチン投与；および（ｂ）フレームシフトタンパク質を利用したフレームシフトの患者へのワクチン投与。この種の試みは、ダブルブラインド(double-blinded)で行われ、かつ将来性があり、このワクチンは、存在する一次的な腫瘍の外科的処置の後に、アジュバント治療として投与される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチドの一部または全部、または該ポリペプチドの一部または全部をコードするヌクレオチド配列のいずれかを含み、前記ポリペプチドが、遺伝子配列からの翻訳を、第１の読みとり枠から、突然変異の下流側の第２または第３のいずれかの読みとり枠にシフトさせる遺伝子配列における突然変異の結果生成される突然変異タンパク質と本質的に相同であり、前記ポリペプチドの一部または全部が、突然変異タンパク質に対する免疫反応を誘発することができる製剤。２．前記遺伝子配列の突然変異が、癌(cancer)を伴う請求項１記載の製剤。３．前記癌が、癌腫(carcinoma)である請求項２記載の製剤。４．前記癌腫が、胃腸の癌腫である請求項３記載の製剤。５．前記遺伝子配列が、染色体Ｓｑ２１の腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の遺伝子配列である請求項１から４のいずれかに記載の製剤。６．突然変異が、ＡＰＣ遺伝子のコドン１４１８から１４７２の間である請求項５記載の製剤。７．突然変異が、ＡＰＣ遺伝子のコドン１４７２から１５０６の間である請求項５記載の製剤。８．ＫＹＬＫＩＫＨＬＬ、ＱＬＫＰＳＥＫＹＬ、ＩＬＹＹＩＬＰＲＫ、ＫＶＬＱＭＤＦＬＶ、から選択されるペプチド配列、または、これらをコードするヌクレオチド配列を含む請求項５記載の製剤。９．ワクチンとして調製された請求項１から８のいずれかに記載の製剤。１０．前記ワクチンが、アジュバントを含む請求項９記載の製剤。１１．前記ワクチンが、ウィルス性ベクターを含む請求項９または１０記載の製剤。１２．前記ウィルス性ベクターが、痘ウィルスに基づくものである請求項１１記載の製剤。１３．前記痘ウィルスが、ワクシニアウィルスである請求項１２記載の製剤。１４．前記ワクチンが、組み換えＴｙ粒子を含む請求項９または１０記載の製剤。１５．前記ワクチンが、治療的ワクチンである請求項９から１４のいずれかに記載の製剤。１６．前記ワクチンが、予防的ワクチンである請求項９から１４のいずれかに記載の製剤。１７．前記免疫反応が、細胞媒介性である請求項１から１６のいずれかに記載の製剤。１８．請求項１で定義したポリペプチドの一部または全部をコードするヌクレオチド配列。１９．請求項１８記載のヌクレオチド配列を含む伝達、発現、またはワクチンベクター。２０．請求項１９記載のベクターを含むホスト細胞。２１．遺伝子配列からの翻訳を、第１の読みとり枠から、突然変異の下流側の第２または第３のいずれかの読みとり枠にシフトさせる遺伝子配列における突然変異の結果生成される突然変異タンパク質と本質的に相同であるポリペプチドであって、該ポリペプチドの一部または全部が、突然変異タンパク質に対する免疫反応を誘発することができるポリペプチドの一部または全部、または該ポリペプチドの一部または全部をコードするヌクレオチド配列の、フレームシフト突然変異を伴う哺乳類患者の疾患状態を治療または予防する医薬の調製における使用。２２．請求項１から１７のいずれかに記載の製剤を投与することからなる突然変異タンパク質に対する免疫反応を誘発する方法。