JP2000507229A

JP2000507229A - ヒト腫瘍遺伝子治療用組換えアデノウイルスベクター

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Publication number: JP2000507229A
Application number: JP9532334A
Authority: JP
Inventors: ブーン，フアルール; ドユフール，マリ―テレーズ; アダダ，エデイ; リユルカン，クリストフ; ペリコデ，ミシエル; ユイツテン―オベゲスキエール，カトリヌ; バルニール，ガイ
Original assignee: ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー; ルードウイツグ・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2000-06-13
Also published as: NO984052D0; ATE309382T1; DE69734574D1; NO984052L; EP0889969B1; US20030082150A1; CN1218512A; WO1997034009A1; AU2164197A; ES2252779T3; FR2746110A1; DK0889969T3; KR19990087718A; HUP9902150A3; CZ295967B6; FR2746110B1; CA2248612A1; AU732288B2; IL126152A0; CZ291598A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子治療によるヒト腫瘍の治療方法に関する。本発明は特に、ヒト腫瘍の特異的抗原をコードする配列をもつ欠損組換えウイルスと、ヒト腫瘍の予防又は治療処置及び特異的ＣＴＬのｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ生成のためのその使用に関する。本発明は、これらのウイルスを特に注射可能な形態で含む医薬組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腫瘍遺伝子治療用組換えアデノウイルスベクター本発明は遺伝子治療によるヒト腫瘍の治療方法に関する。本発明は特に、ヒト腫瘍の特異的抗原をコードする配列をもつ欠損組換えウイルスと、ヒト腫瘍の子防又は治療処置及び特異的ＣＴＬのｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ生成のためのその使用に関する。本発明は更に、これらのウイルスを特に注射可能な形態で含む医薬組成物にも関する。遺伝子治療は患部細胞又は臓器に遺伝情報を導入することにより欠陥又は異常を治療するものである。この情報は臓器から抽出した細胞にｉｎｖｉｔｒｏ導入した後、生物に再注入してもよいし、標的組織に直接ｉｎｖｉｖｏ導入してもよい。負に荷電しているので、高分子であるＤＮＡがリン脂質細胞膜を自然に通過するのは難しい。そこで、遺伝子導入を可能にするために、ウイルスベクターや、天然又は合成の化学及び／又は生化学ベクターを含む種々のベクターが使用されている。化学及び／又は生化学ベクターは例えばカチオン（リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン等）であり、ＤＮＡと沈殿を形成することにより作用し、この沈殿は「貧食作用」によって細胞に取り込まれる。ＤＮＡを内包し、細胞膜と融合するリポソームも用いられている。合成遺伝子導入ベクターは一般にカチオン脂質又はポリマーであり、ＤＮＡと複合体を形成し、表面に正電荷をもつ粒子を形成する。これらの粒子は細胞膜の負電荷と相互作用し、細胞膜を通過することができる。このようなベクターの例としてはジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））又はＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））を挙げることができる。ＤＮＡを凝縮させるポリカチオン部分から構成されるキメラタンパク質も開発されており、ポリカチオン部分は膜レセプターに結合するリガンドと結合し、こうして形成された複合体はエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる。このように、導入遺伝子のｉｎｖｉｖｏ生体利用性を改善するために組織又は所定の細胞集団に「ターゲティング」することは理論的に可能である（Ｂｅｈｒ，１９９３，ＣｏｔｔｅｎとＷａｇｎｅｒ，１９９３参照）。遺伝子導入用ベクターとして潜在的に利用可能なウイルスとしては、特にレトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス及びアデノウイルスを挙げることができる。これらのウイルスはいずれも種々の細胞型に感染させるために使用されている。遺伝子治療アプローチは神経系障害、心臓血管病又は癌を含む種々の疾病の治療を目的として発展した。特に癌の分野については、種々のアプローチが従来技術で提案されている。例えばインターロイキン２の存在下の培養又はインターロイキン２の遺伝子のトランスフェクションによりｅｘｖｉｖｏ活性化したリンパ球の使用が報告されている。精製した単球−マクロファージをインターフェロンによりｅｘｖｉｖｏ活性化して腫瘍破壊能を増加した後、患者に再注入するという養子免疫治療の研究も行われている（Ａｎｄｒｅｓｓｅｎら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０（１９９０）７４５０）。遺伝子改変したマクロファージを使用する可能性も記載されている（ＷＯ９５／０６１２０）。また、癌細胞の死滅を直接又は間接的に誘導することが可能な毒性遺伝子の導入に基づく別種のアプローチもある。この種のアプローチは例えばチミジンキナーゼ遺伝子で報告されており、アデノウイルスベクター（ＰＣＴ／ＦＲ９４／０１２８４；ＰＣＴ／ＦＲ９４／０１２８５）や、レトロウイルスベクター産生細胞の移植（Ｃａｒｕｓｏら，ＰＮＡＳ９０（１９９３）７０２４）によりｉｎｖｉｖｏ導入されている。例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子等の他の遺伝子も使用されている。本発明は新規癌治療法に関する。特に、ヒト腫瘍、特にメラノーマの治療を目的とする。本発明の方法はメラノーマ等のヒト腫瘍の特異的抗原として、（ｉ）この種の癌の発生に対する免疫防御と、（ｉｉ）これらの抗原を提示する細胞に特異的な細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）集団の増殖と、免疫系による対応腫瘍細胞の破壊を誘導することが可能な抗原のｉｎｖｉｖｏ導入及び発現に基づく。免疫系は特に、ウイルス感染に対する防御を確保する機能をもつ。この機能は細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により行われる。ＣＴＬは高特異性と高効率という２つの顕著な特徴がある。ＣＴＬはその表面でウイルス抗原を認識後に感染細胞を破壊する。該当抗原は主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ)分子に結合したペプチドの形態をとる。腫瘍の範囲については、これらの悪性細胞が抗ウイルス応答の範囲におけると同様にＣＴＬにより媒介される免疫応答を誘導できるペプチド−ＭＨＣ−Ｉ分子複合体を提示することがマウスで最初に確認された。これらのペプチドは特に、腫瘍細胞で選択的に突然変異又は活性化した遺伝子によりコードされるタンパク質に由来する。これらのタンパク質は腫瘍特異的抗原と呼ばれる。より最近では、ＣＴＬにより認識される分化抗原がヒト腫瘍で特性決定されている。本発明はヒト腫瘍の新規治療法に関する。本発明は特に、ヒト腫瘍又はメラノーマの特異的抗原をｉｎｖｉｖｏ導入及び発現させることが可能なウイルス起源のベクターの開発に基づく。本発明はより詳細には、欠損組換えアデノウイルスがこの種の抗原に対する免疫を誘導することができ、これらの抗原、特に該抗原をもつ腫瘍細胞に対するリンパ球応答をｉｎｖｉｖｏで獲得できるという事実をマウスモデルで立証したことに基づく。従って、本発明によるこの方法は、これらの遺伝子の導入により、ヒト腫瘍の進展を阻止することによって特に有効にその進行に作用することができ、根絶に導くことができる。従って、本発明の第１の目的は腫瘍特異的タンパク質又はペプチド、より特定的にはメラノーマの特異的抗原の全部又は一部をコードする核酸をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルスにある。好ましくは、抗原はヒトメラノーマの特異的抗原である。より特定的には、ＭＨＣ−Ｉ分子と結合してＣＴＬに提示される部分を含むヒトメラノーマの特異的抗原のフラグメントである。ヒト腫瘍の特異的抗原はＴｈｉｅｒｒｙＢｏｏｎら（米国特許第５，３４２，７７４号、米国特許第５，４０５，９４０号、ＷＯ９２／２０３５６、ＷＯ９４／２３０３１、ＷＯ９４／２１１２６）により記載されている。これらの抗原はＭＡＧＥと呼ばれ、腫瘍細胞、主にヒト腫瘍で選択的に発現される。種々のヒトＭＡＧＥ遺伝子が報告されており、特にＭＡＧＥ− １、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−７、ＭＡＧＥ−８、ＭＡＧＥ−９、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−１２遺伝子を挙げることができる。同類のマウス遺伝子の例として、Ｓ−ＭＡGE−１及びＳ−ＭＡＧＥ−２遺伝子も挙げることができる。他の類縁遺伝子ファミリーの例として、特にＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＲＡＧＥ遺伝子も挙げることができる。好適実施態様によると、本発明はＭａｇｅ−１、Ｍａｇｅ− ３、Ｂａｇｅ、Ｇａｇｅ及びＲａｇｅタンパク質から選択されるタンパク質又は該タンパク質に由来するペプチドをコードする核酸をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルスに関する。これらの抗原は、大半が非腫瘍体細胞には全く検出されないという意味で実際に高選択性である。Ｍａｇｅ−１抗原と対応遺伝子の配列は特にＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４（１９９１）１６４４に記載されている。Ｍａｇｅ−１及びＭａｇｅ−３をコードするｃＤＮＡの配列は例えばＧａｕｇｌｅｒら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９（１９９４）９２１）に記載されている。上述のように、本発明の１好適実施態様はＭＨＣ−Ｉ分子と結合してＣＴＬに提示される部分を含むＭａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、Ｂａｇｅ又はＧａｇｅタンパク質のペプチドをコードする核酸をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルスである。Ｍａｇｅ、Ｂａｇｅ及びＧａｇｅ遺伝子は実際に大きい寸法のタンパク質をコードしている。これらのタンパク質は細胞で酵素消化により分解され、ペプチドを生成する。その後、これらのペプチドは細胞の表面に提示され、ＭＨＣ−Ｉ分子と結合してＣＴＬにより認識される（図２参照）。より好ましくは、本発明はＣＴＬに提示される部分を含むＭａｇｅ−１又はＭａｇｅ−３タンパク質のペプチドをコードする核酸をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルスに関する。特定実施態様によると、本発明は配列番号１の配列をそのゲノムに挿入した組換えアデノウイルスに関する。この配列はＨＬＡ．Ａ１分子により細胞障害性Ｔリンパ球に提示されるＭａｇｅ−１のノナペプチド（２７ｂｐ）をコードする配列を含む。より好ましくは、配列番号１の配列の残基５５〜８２に含まれる配列である。別の特定実施態様によると、本発明は配列番号２の配列をそのゲノムに挿入した組換えアデノウイルスに関する。この配列はＨＬＡ．Ａ１分子により細胞障害性Ｔリンパ球に提示されるＭａｇｅ−３のノナペプチド（２７ｂｐ）をコードする配列を含む。別の実施態様によると、本発明はＤＢＡ／２マウスの肥満細胞腫ｐ８１５のＰ１Ａ遺伝子の特異的ペプチドをコードする核酸（配列番号３）をそのゲノムに挿入した組換えアデノウイルスに関する。上述のように、本発明のアデノウイルスはこれらの抗原ベクターの有効なｉｎｖｉｖｏ導入及び発現を可能にする。従って、本発明のアデノウイルスはこれらの抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球の出現を非常に顕著にｉｎｖｉｖｏ刺激することができ、前記細胞障害性Ｔリンパ球はこの抗原をその表面に提示する全細胞を選択的に破壊する。従って、本発明のウイルスはＭａｇｅ抗原をその表面に提示する細胞をもつ癌の治療を目的とした医薬組成物の製造に利用できる。このような組成物を製造するためには、患者の腫瘍（一般にメラノーマの）細胞を取り出して分析し、（ｉ）例えばＲＴ−ＰＣＲによりＭａｇｅ遺伝子の発現を測定し、（ｉｉ）場合により、このＭａｇｅ抗原を型別するのが好ましい。対応抗原の全部又は一部をコードする核酸を含むアデノウイルスを構築し、投与に使用する。本発明のウイルスは所与の腫瘍抗原に特異的な細胞障害性Ｔ細胞集団を生成するためにｉｎｖｉｔｒｏ（又はｅｘｖｉｖｏ）で使用することもできる。このためには、細胞集団を本発明のウイルスに感染させた後、ＣＴＬ細胞の前駆体と接触させる。その後、抗原に特異的なＣＴＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏ選択し、増幅後、対応する腫瘍を特異的に破壊するための医薬として使用することができる。本発明のウイルスに感染させる細胞集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むと有利である。特にマクロファージ（ＷＯ９５／０６１２０）やＢ細胞を挙げることができる。本発明のアデノウイルスにおいて、挿入核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のフラグメントでもよいし、例えばｃＤＮＡに１個以上のイントロンを挿入したハイブリッド構築物でもよい。合成又は半合成配列でもよい。上述のように、挿入核酸はＭａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、Ｂａｇｅ及びＧａｇｅから選択される任意のタンパク質又はこのタンパク質に由来するペプチドをコードする核酸である。本発明の意味では、このタンパク質に由来するペプチドなる用語は、核酸がタンパク質のフラグメントのみをコードできることを意味し、このフラグメントはＣＴＬを生成できなければならない。従って、本発明によるフラグメントは特異的ＣＴＬにより認識される少なくとも１個の抗原決定基をもつ。これらのフラグメントは当業者に公知の任意技術、特に生物活性に応じて変異体を選択することが可能な遺伝子及び／又は化学的及び／又は酵素的改変あるいは発現クローニングにより獲得できる。遺伝子改変は抑圧、欠失、突然変異等を含む。挿入核酸はｃＤＮＡ又はｇＤＮＡが好ましい。一般に、挿入核酸は感染細胞における抗原又は抗原フラグメントの発現を可能にする配列も含む。このような配列としては、これらの配列が感染細胞で機能して該当遺伝子の発現に天然に関与する配列を挙げることができる。（他のタンパク質又は合成タンパク質の発現に関与する）別の起源の配列（異種配列と呼ぶ）でもよい。特に、遺伝子の転写を特異的又は非特異的及び誘導的又は非誘導的に刺激又は抑圧する真核細胞もしくはウイルス遺伝子又は誘導配列のプロモーターが挙げられる。例えば、感染させたい細胞のゲノム又はウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、特にＥ１Ａ遺伝子のプロモーター、アデノウイルスのＭＬＰ、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ−ＲＳＶ、ＳＲα等を挙げることができる。真核プロモーターとしては、ユビキチンプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、 αアクチン、チューブリン等）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）、治療遺伝子プロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子型等）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞のαアクチンのプロモーター、肝特異的プロモーター；ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩ、ヒトアルブミン等）又は刺激に応答するプロモーター（ステロイドホルモンのレセプター、レチノイン酸のレセプター等）も挙げることができる。更に、活性化配列、調節配列等を付加してこれらの発現配列を修飾してもよい。また、挿入核酸が発現配列を含まないときには、このような配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入すればよい。本発明によるウイルスは欠損ウイルスであり、即ち標的細胞で自律的に複製することができない。従って、一般に本発明の範囲で使用される欠損ウイルスのゲノムは、感染細胞における前記ウイルスの複製に必要な配列を少なくとも欠失している。これらの領域は（全部又は一部を）除去してもよいし、非機能的にしてもよいし、他の配列、特に挿入配列で置換してもよい。但し、欠損ウイルスはウイルス粒子のパッケージングに必要なそのゲノムの配列を保存していることが好ましい。本発明によるウイルスは種々の血清型のアデノウイルスから得ることができる。構造と性質が少しずつ異なる種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲では２もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（国際出願公開第ＷＯ９４／２６９１４号参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲で使用可能な動物起源のアデノウイルスのとしては、イヌ、ウシ、マウス（例えばＭａｖ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヤギ、ブタ、トリ又はサル（例えばＳＡＶ）起源のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）］である。本発明の範囲ではヒトもしくはイヌ起源のアデノウイルス又は混合アデノウイルスを使用するのが好ましい。好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスはＩＴＲとパッケージングを可能にする配列と目的核酸を含む。更に好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、少なくともＥ１領域は非機能的である。該当ウイルス遺伝子は当業者に公知の任意の方法、特に完全抑圧、置換、部分欠失、又は該当遺伝子に１個以上の塩基を付加することにより非機能的にすることができる。このような改変は、例えば遺伝子工学技術又は突然変異誘発物質で処理することによりｉｎｖｉｔｒｏ（単離したＤＮＡで）又はｉｎｓｉｔｕで得られる。特にＥ３（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（ＷＯ９５／０２６９７）等の他の領域も改変してもよい。好適実施態様によると、本発明によるアデノウイルスはＥ１及びＥ４領域に欠失を含む。別の好適実施態様によると、Ｅ１領域に欠失を含み、このレベルにＥ４領域と核酸を挿入する（ＦＲ９４１３３５５参照）。Ｅ１領域における欠失はヌクレオチド４５４〜３３２８（ＰｖｕＩＩ−ＢｇＩＩＩフラグメント）又は３８２〜３４４６（ＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメント）の範囲が有利である。Ｅ４領域における欠失は少なくともＯＲＦ３及びＯＲＦ４フレームを含むと有利である。目的核酸はアデノウイルスのゲノムの種々の領域に挿入することができる。アデノウイルスのゲノムは約３６ｋｂの寸法の直鎖状２本鎖ＤＮＡから構成される。ゲノムは特に各末端の逆方向反復領域（ＩＴＲ）と、パッケージング配列（Ｐｓｉ）と、初期遺伝子と、後期遺伝子を含む（図１参照）。主要な初期遺伝子はＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域に含まれる。このうち、Ｅ１領域に含まれる遺伝子はウイルス増殖に必要である。主要な後期遺伝子はＬ１〜Ｌ５領域に含まれる。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは完全に配列決定されており、データベース（特にＧｅｎｅｂａｎｋＭ７３２６０参照）で検索可能である。同様に他のアデノウイルスのゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２等）も一部又は完全に配列決定されている。目的核酸は欠損組換えウイルスの産生に必須でない領域に挿入するのが好ましい。例えば、ウイルスに欠失しており、産生系により相補されるＥ１領域、組換えウイルスの産生に必須ではないＥ３領域（その不活化はトランス相補すべきでない）、あるいはＥ４領域のレベルに挿入するのが好ましい。Ｅ４に挿入する場合には、ヘルパープラスミド又はウイルスの同時トランスフェクションによるか、あるいは適当な系を介して産生時にＥ４機能を相補することが必要である。当然、他の部位を使用してもよい。特に、ゲノムのヌクレオチド配列がわかると、当業者は目的核酸を挿入できる領域を決定できる。本発明による欠損組換えアデノウイルスは当業者に公知の任意の技術により作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５，ヨーロッパ特許第１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯＪ．３（１９８４）２９１７）。一般に、アデノウイルスはコンピテントパッケージング細胞系に組換えウイルスのＤＮＡをトランスフェクトすることにより作製される。トランスフェクションは組換えウイルスのゲノムの全体をもつ構築物を利用できる場合には単純トランスフェクションでもよいが、多くの場合には、組換えウイルスゲノムの種々の部分を付加する数個のＤＮＡフラグメントの同時トランスフェクションである。同時トランスフェクションの場合、プロセスは組換えウイルスのＤＮＡを生成するためにパッケージング細胞系で種々の構築物を相同組換えする１段階以上を含む。ウイルスの産生に使用する種々のフラグメントは種々の方法で作製することができる。最も一般に使用される方法は、ウイルスＤＮＡを単離後、慣用分子生物学法によりｉｎｖｉｔｒｏ改変（消化、連結等）する方法である。その後、得られた構築物を精製し、パッケージング系にトランスフェクトするために使用する。組換えウイルスのゲノムの一部をもつプラスミドを使用し、ゲノムの欠失部分を付加するウイルスと同時トランスフェクトする方法もある。あるいは、原核プラスミドを利用してトランスフェクションに使用可能なウイルスＤＮＡを作製してもよい（Ｂｅｔｔら，ＰＮＡＳ９１（１９９４）８８０２；ＦＲ９５０１６３２）。使用する細胞系は、好ましくは（ｉ）前記要素により形質転換可能であり、（ｉｉ）組換えの危険を避けるために好ましくは組込み形態で欠損アデノウイルスのゲノムの部分を相補することが可能な配列を含んでいるべきである。細胞系の例としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノムに組込んだヒト胎児腎細胞２９３系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）や、特に国際出願公開第ＷＯ９４／２６９１４号及びＷＯ９５／０２６９７号に記載されているようなＥ１及びＥ４機能を相補することが可能な細胞系を挙げることができる。その後、増殖したアデノウイルスを実施例に記載するように慣用分子生物学技術により回収及び精製する。本発明は更に、１種以上の上記のような欠損組換えアデノウイルスを含む任意医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気管内、腹腔内等の経路で投与するように配合することができる。本発明は更に、上記のような欠損組換えアデノウイルスに感染させた細胞を含む任意医薬組成物にも関する。本発明の組成物は上記のような欠損組換えアデノウイルスに感染させた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むものが有利である。特定例としては、マクロファージやＢリンパ球を挙げることができる。本発明は更に、上記のような欠損組換えアデノウイルスに感染させた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で前駆細胞を培養することにより製造される腫瘍抗原に特異的な細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む組成物にも関する。本発明の医薬組成物は注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことが好ましい。キャリヤーとしては特に、滅菌等張塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成し得る乾燥（特に凍結乾燥）組成物が挙げられる。注射に使用するウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、発現させるべき遺伝子又は必要な治療期間に応じて調整できる。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは、１０４〜１０１４ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕの用量で配合及び投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に１５日後の感染細胞プラーク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。該当抗原に応じて、本発明のアデノウイルスは特にヒト腫瘍（Ｍａｇｅ−１〜Ｍａｇｅ−１２、Ｇａｇｅ、Ｂａｇｅ及びＲａｇｅ抗原）、肉腫（Ｍａｇｅ−１抗原）を含む癌の治療又は予防に使用することかできる。以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、以下の実施例は例示であり、発明を限定するものではない。図面の説明図１：アデノウイルスＡｄ５の遺伝子地図。図２：ｍａｇｅ抗原の発現及びプロセッシング。図３：プラスミドｐＡｄ．ＳＲα−ＭＡＧＥの構築。図４：ａｄ−Ｐ１Ａ又は対照によるＤＢＡ／２マウスの免疫プロトコール１。図５：ａｄ−Ｐ１Ａ又は対照によるＤＢＡ／２マウスの免疫プロトコール２。表１：本発明によるＡｄ−Ｍａｇｅに感染させた細胞のＣＴＬによる特異的溶解の立証。表２：本発明によるＡｄ−Ｍａｇｅに感染させた細胞がＣＴＬクローンによるＴＮＦの産生を刺激する能力の立証。表３：Ａｄ−Ｐ１Ａ（表３Ａ）又は対照アデノウイルスＡｄ−βＧａ１（表３Ｂ）をプロトコール１に従って注射したＤＢＡ／２マウスの免疫試験結果。表４：Ａｄ−Ｐ１Ａ（表４Ａ）又は対照アデノウイルスＡｄ−βＧａ１（表４Ｂ）をプロトコール２に従って注射したＤＢＡ／２マウスの免疫試験結果。一般クローニング、分子生物学技術プラスミドＤＮＡの塩化セシウム−臭化エチジウム勾配遠心分離、制限酵素消化、ゲル電気泳動、大腸菌での形質転換、核酸の沈殿等の慣用分子生物学法は文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。酵素はＮｅｗ−ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。連結のために、ＤＮＡフラグメントを０．８〜１．５％アガロースゲル上でその寸法に応じて分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１，ＬａＪｏｌｌａＣＡ）により精製し、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼの存在下に５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍＭＤＴＴ，２ｍＭＡＴＰ中で１４℃で一晩インキュベートする。ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）による増幅もＭａｎｉａｔｉｓら，１９８９に従い、次の条件下で実施した。 −ＭｇＣｌ₂濃度を８ｍＭにした。 −変性温度９５℃、ハイブリダイゼーション温度５５℃、延長温度７２℃。このサイクルをＰＥ９６００Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＮｏｒｗａｌｋＣＯ）で２５回繰り返した。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成器ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍモデル３９４（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）を製造業者の指示に従って使用し、シアノエチル基でβ位を保護したホスホラミダイトの化学（Ｓｉｎｈａら，１９８４，Ｇｉｌｅｓ１９８５）により合成する。配列決定は蛍光プライマーを使用することによりチェーンターミネーター法により２本鎖鋳型で実施した。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）製自動配列決定キットＴａｑＤｙｅＰｒｉｍｅｒＫｉｔを製造業者の指示に従って使用した。実施例１：Ｐ１Ａ抗原のフラグメントをコードする欠損組換えアデノウイルスの構築本実施例はＰ１Ａ抗原のフラグメントをコードする本発明による欠損組換えアデノウイルスの構築に関する。より詳細には、アデノウイルスは配列番号３の配列をもつ。構築したアデノウイルスはＥ１及びＥ３領域に欠失をもち、Ｅ１領域の欠失のレベルに目的核酸を挿入した血清型５のアデノウイルスである。Ｅ１領域のレベルに挿入した核酸はより詳細には下記成分を含む。 −ＳＲαプロモーター。ＳＲαプロモーターはＳＶ４０の初期複製起点と、ＨＴＬＶ１のＬＴＲの一部（Ｒ領域とＵ５の一部に対応）と、ＳＶ４０のスプライス部位１６Ｓを含む（Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１９８８）４６６）。 −４４ｂｐのＰ１Ａミニ遺伝子（配列番号３）。 −ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位。この核酸は、プラスミドｐｃＤ−ＳＲαのＥｃｏＲＩ部位にＰ１Ａミニ遺伝子をクローニングしたものに対応するプラスミドｐｃＤ−ＳＲα−Ｐ１Ａから抽出した。得られたインサートをその後、ＲＳＶのＬＴＲとＬａｃＺ遺伝子を含むフラグメントの代わりに、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ−βＧａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）にクローニングした。次に、こうして得られたプラスミドｐＡｄ−ＳＲα−Ｐ１Ａを使用して組換えアデノウイルスを作製した。このために、リン酸カルシウムの存在下に２９３系の細胞にプラスミドｐＡｄ−ＳＲα−Ｐ１Ａ５μｇと突然変異アデノウイルスｄｌ３２４のＤＮＡ５μｇを同時トランスフェクトした。生成した組換えアデノウイルスを次にクロマトグラフィー精製により選択した。単離後、組換えアデノウイルスを２９３細胞系で増幅し、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌの力価をもつ非精製組換えアデノウイルスを含む培養上清を得る。次に公知技術（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）に従って塩化セシウム勾配遠心分離によりウイルス粒子を精製する。制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してウイルスＤＮＡを分析すると、ゲノム中にインサートの存在が判明する。アデノウイルスは１０％グリセロール中で−８０℃で保存することができる。実施例２：Ｍａｇｅ−１抗原のフラグメントをコードする欠損組換えアデノウイルスの構築本実施例はＭａｇｅ−１抗原のフラグメントをコードする本発明による欠損組換えアデノウイルスの構築に関する。より詳細には、アデノウイルスはＭａｇｅ −１の抗原ノナペプチドをもつフラグメントをコードする配列番号１の配列をもつ。構築したアデノウイルスはＥ１及びＥ３領域に欠失をもち、Ｅ１領域の欠失レベルに目的核酸を挿入した血清型５のアデノウイルスである。Ｅ１領域のレベルに挿入した核酸はより詳細には下記成分を含む。 −ＳＲαプロモーター。ＳＲαプロモーターはＳＶ４０の初期複製起点と、ＨＴＬＶ１のＬＴＲの一部（ＲドメインとＵ５の一部に対応）と、ＳＶ４０のスプライス部位１６Ｓを含む（Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１９８８）４６６）。 −１１６ｂｐのＭＡＧＥ−１ミニ遺伝子（配列番号１）。このフラグメントは完全Ｍａｇｅ−１遺伝子からＰＣＲにより得た。このフラグメントは１５位ＡＴＧと、１２１位終止コドンと、Ｍａｇｅ−１遺伝子のエキソン３の一部を含む。このフラグメントはＨＬＡ．Ａ１分子により細胞障害性Ｔリンパ球に提示されるノナペプチド（２７ｂｐ）に対応する配列を含む（図２参照）。 −ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位。この核酸は、プラスミドｐｃＤ−ＳＲαのＥｃｏＲＩ部位にＭａｇｅ−１ミニ遺伝子をクローニングしたものに対応するプラスミドｐｃＤ−ＳＲα−ＭＡＧＥ −１から抽出した。得られたインサートをその後、ＲＳＶのＬＴＲとＬａｃＺ遺伝子を含むフラグメントの代わりに、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ−βＧａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）にクローニングした（図３）。次に、こうして得られたプラスミドｐＡｄ−ＳＲα−ＭＡＧＥ−１を使用して組換えアデノウイルスを作製した。このために、リン酸カルシウムの存在下に２９３系の細胞にプラスミドｐＡｄ−ＳＲα−ＭＡＧＥ−１と突然変異アデノウイルスｄｌ３２４のＤＮＡを同時トランスフェクトした。生成した組換えアデノウイルスを次にクロマトグラテイー精製により選択した。単離後、組換えアデノウイルスを２９３細胞系で増幅し、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌの力価をもつ非精製組換えアデノウイルスを含む培養上清を得る。次に公知技術（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）に従って塩化セシウム勾配遠心分離によりウイルス粒子を精製する。制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してウイルスＤＮＡを分析すると、ゲノム中にインサートの存在が判明する。アデノウイルスは１０％グリセロール中で−８０℃で保存することができる。実施例３：Ｍａｇｅ−３抗原のフラグメントをコードする欠損組換えアデノウイルスの構築本実施例はＭａｇｅ−３抗原のフラグメントをコードする本発明による欠損組換えアデノウイルスの構築に関する。より詳細には、アデノウイルスはＭａｇｅ−３の抗原ノナペプチドをもつフラグメントをコードする配列番号２の配列をもつ。構築したアデノウイルスはＥ１及びＥ３領域に欠失をもち、Ｅ１領域の欠失レベルに目的核酸を挿入した血清型５のアデノウイルスである。Ｅ１領域のレベルに挿入した核酸はより詳細には下記成分を含む。 −ＳＲαプロモーター。ＳＲαプロモーターはＳＶ４０の初期複製起点と、ＨＴＬＶ１のＬＴＲの一部（Ｒ領域とＵ５の一部に対応）と、ＳＶ４０のスプライス部位１６Ｓを含む（Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１９８８）４６６）。 −４４ｂｐのＭＡＧＥ−３ミニ遺伝子（配列番号２）。このフラグメントは完全Ｍａｇｅ−３遺伝子からＰＣＲにより得た。このフラグメントは１２位ＡＴＧと、４４位終止コドンと、ＨＬＡ．Ａ１分子により細胞障害性Ｔリンパ球に提示されるノナペプチド（２７ｂｐ）に対応する配列を含む（図２参照）。 −ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位。この核酸は、プラスミドｐｃＤ−ＳＲαのＥｃｏＲＩ部位にＭａｇｅ−３ミニ遺伝子をクローニングしたものに対応するプラスミドｐｃＤ−ＳＲα−ＭＡＧＥ −３から抽出した。得られたインサートをその後、ＲＳＶのＬＴＲとＬａｃＺ遺伝子を含むフラグメントの代わりにプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ−βＧａｌにクローニングした（図３）。次に、こうして得られたプラスミドｐＡｄ−ＳＲα−ＭＡＧＥ−３を使用して組換えアデノウイルスを作製した。このために、リン酸カルシウムの存在下に２９３系の細胞にプラスミドｐＡｄ−ＳＲα−ＭＡＧＥ−３と突然変異アデノウイルスｄｌ３２４のＤＮＡを同時トランスフェクトした。生成した組換えアデノウイルスを次にクロマトグラフィー精製により選択した。単離後、組換えアデノウイルスを２９３細胞系で増幅し、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌの力価をもつ非精製組換えアデノウイルスを含む培養上清を得る。次に公知技術（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）に従って塩化セシウム勾配遠心分離によりウイルス粒子を精製する。制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してウイルスＤＮＡを分析すると、ゲノム中にインサートの存在が判明する。アデノウイルスは１０％グリセロール中で−８０℃で保存することができる。実施例４：本発明のアデノウイルスの機能的特性決定本実施例は、本発明によるウイルスが、分解により標的細胞の表面に抗原ペプチドの発現を誘導するタンパク質をコードする目的遺伝子の発現を誘導できることを立証する。Ａｄ−Ｍａｇｅに感染させた細胞（４．１．）で特異的溶解（４．２．）とＴＮＦ産生の刺激（４．３．）の測定によりＭＡＧＥ−１ミニ遺伝子の発現とペプチドの提示を試験した。４．１．細胞系感染させた細胞は次の通りである。 −Ｃ１Ｒ．Ａ１：ＥＢＶ（Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｎ．，Ｓａｌｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．及びＣｒｅｓｓｗｅｌｌ，Ｐ．：ＮＫｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｖａｒｉｅｓｉｎｖｅｒｓｅｌｙｗｉｔｈｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｃｌａｓｓＩＨＬＡａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１６７５−１６５９，１９８７）で形質転換し、プラスミドｐＨＥＢＯにクローニングしたＨＬＡ．Ａ１遺伝子をトランスフェクトしたＢリンパ球系。 −ＧｅｒｌＩＩＩ１３Ｅ^-Ｆ^-：ＭＡＧＥ−１抗原の欠失について免疫選択したヒトメラノーマＨＬＡ．Ａ１細胞（表１及び２ではＧｅｒｌａｃｈＥと称する）。従って、これらの２種の細胞系はＨＬＡ．Ａ１分子を発現するが、ＭＡＧＥ− １抗原は発現しない。４．２．特異的溶解の測定本実施例は抗原に特異的なＣＴＲのクローンによる細胞の特異的溶解の存在を立証する（放射性クロムの塩析試験）。このために、４．１．に記載した細胞をアデノウイルスＡｄ−Ｍａｇｅｌ（実施例２）又は対照アデノウイルス（Ａｄ− βＧａｌ）に感染多重度５００ｐｆｕ／細胞で感染させた。感染細胞を次にクロム５１で標識後、エフェクター細胞／ターゲット細胞（Ｅ／Ｔ）比を変えながら細胞１０００個／ウェルの割合で特異的ＣＴＬ（クローン８２：３０）と共に４時間インキュベートした。その後、溶解百分率を測定した。得られた結果を表１に示す。これらの結果は、本発明によるウイルスに感染させた細胞が対照アデノウイルスに感染させた細胞よりも特異的ＣＴＬによる溶解に対して著しく高い感受性を示すことを明白に示す。これらの細胞は更に、Ｍａｇｅ−１抗原を直接トランスフェクトした細胞よりも著しく高い感受性を示し、本発明のベクターの治療効率を裏付ける。従って、これらの結果は本発明のウイルスが特異的ＣＴＬによる溶解に対する高い感受性を細胞に付与できることを明白に示す。４．３．ＴＮＦ産生の刺激本実施例では、ＧｅｒｌＩＩＩ１３Ｅ^-Ｆ^-細胞が同一ＣＴＬクローンによるＴＮＦ産生を刺激する能力を評価した。このために、ＧｅｒｌＩＩＩ１３Ｅ^-Ｆ^-細胞をアデノウイルスＡｄ−Ｍａｇｅ１（実施例２）又は対照アデノウイルス（Ａｄ−βＧａｌ）に感染多重度５０又は１００ｐｆｕ／細胞で感染させた後、クローンＣＴＬと共にインキユベートした。２４時間後に、ＴＮＦ感受性株（ＷＥＨＩ−１６４−１３株）に対する細胞毒性を測定することにより、上清中に存在するＴＮＦの量を測定した。比色試験（ＭＴＴ）により細胞生存率を測定した。結果を光学密度、次いでＴＮＦの量（ｐｇ／ｍｌ）で表す。Ｃ１Ｒ．Ａ１細胞は天然にＴＮＦを分泌するので、この試験はＣ１Ｒ．Ａ１細胞では実施しなかった。対照細胞ＧｅｒｌａｃｈＥ⁺はＭａｇｅ−１とＨＬＡ−Ａ１を発現するメラノーマ細胞である。得られた結果を表２に示す。これらの結果は、本発明によるウイルスに感染させた細胞がＣＴＬによるＴＮＦ産生を誘導することを明白に示し、本発明のウイルスの生物学的及び治療的性質を明白に裏付ける。実施例５：本発明のＰ１Ａウイルスのｉｎｖｉｖｏ活性実施例４は、本発明によるアデノウイルスに感染させた細胞がＴＮＦ試験で十分に認識され、放射性クロムの遊離試験で特異的ＣＴＬにより溶解することをｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで立証した。本実施例は、本発明によるアデノウイルスが特異的ＣＴＬ応答を発生できることをｉｎｖｉｖｏで立証する。より詳細には、本実施例はＤＢＡ／２マウスにウイルス粒子１０⁹個（ｐｆｕ）を１週置きに２回注射すると、その一部で強い特異的ＣＴＬ応答を発生することを立証する。２系列の実験を実施した。これらの２系列の工程図を図４及び５に示す。第１系列の実験（図４参照）では、ウイルス粒子の半量を腹腔内投与し、残りの半量を皮下投与した（４部位）。第２系列の実験（図５参照）では、ウイルス粒子を皮下、腹腔内、鼻腔内及び気管内注射により投与した。これらの２系列の実験は以下のプロトコールに従って実施した。マウスをアデノウイルスの２度目の注射から１５日後に殺した。その後、これらのマウスの脾細胞を放射線照射Ｌ１２１０Ａ＋細胞（肥満細胞腫Ｐ８１５のＰ１Ａ遺伝子をトランスフェクトした同系白血病）によりＰ８１５Ａ抗原の存在下に８日間置いた。この混合リンパ球−腫瘍培養（ＭＬＴＣ）の終わりに、Ｐ８１５Ａ抗原に対するリンパ球が増殖し、キラーＴリンパ球に分化した。次に、キラーＴリンパ球を放射性クロムで標識した細胞の存在下に置く。標識細胞としては、Ａ抗原をもつＰ８１５マウス肥満細胞腫のアザグアニン耐性変異株であるＰ５１１細胞と、Ａ抗原を欠失したこの同一肥満細胞腫の変異株であるＰＩ．２０４細胞を用いる。後者は陰性対照として使用する。非特異的反応の全可能性を排除するために、放射性クロムで標識した標的細胞も、Ｐ８１５のＡ抗原を除いてＭＬＴＣで刺激性の細胞の抗原を表面にもつ同系細胞（Ｌ１２１０）の存在下に置く。第１系列の実験で得られた結果を特異的溶解百分率として表し、表３Ａ及び３Ｂに示す。第２系列の実験で得られた結果を特異的溶解百分率として表し、表４Ａ及び４Ｂに示す。どちらの場合も、結果はマウス毎にエフェクター／ターゲット比に比例する溶解レベルを示す（２回の平均）。アデノウイルスの注射部位に関係なくＣＴＬが得られた（表４Ａ＋Ｂ）。これらの結果は、本発明のアデノウイルスが腫瘍抗原をもつ細胞に対して免疫をｉｎｖｉｖｏ誘導できることを明白に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ドユフール，マリ―テレーズフランス国、エフ―75005・パリ、リユ・ゲ・リユサツク、17 (72)発明者アダダ，エデイフランス国、エフ―94140・アルフオールビル、リユ・ジユール―ゲド、１ (72)発明者リユルカン，クリストフベルギー国、ベー―1950・クラーイネム、リユ・ジユール―アダン、59 (72)発明者ペリコデ，ミシエルフランス国、エフ―28320・エクロヌ、リユ・ドウ・シヤルトル、31 (72)発明者ユイツテン―オベゲスキエール，カトリヌベルギー国、ベー―1325、シヨモン―ジストウ、シユマン・ドウ・ラ・コキエール、１ (72)発明者バルニール，ガイベルギー国、ベー―1630・リンケベーク、ホーレケンスウエヒ・59

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫防御と免疫系による対応腫瘍細胞の破壊を誘導することができ、腫瘍特異的タンパク質又はペプチドをコードする核酸をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルス。２．ヒト腫瘍特異的タンパク質又はペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の欠損組換えアデノウイルス。３．そのゲノムに挿入された核酸がメラノーマの特異的抗原の全部又は一部をコードすることを特徴とする請求項１又は２に記載の欠損組換えアデノウイルス。４．核酸が、ＭＨＣ−１の分子と結合してＣＴＬに提示される部分を含むヒトメラノーマの特異的抗原のフラグメントをコードする核酸であることを特徴とする請求項３に記載のアデノウイルス。５．核酸がＭａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、Ｂａｇｅ、Ｒａｇｅ及びＧａｇｅタンパク質から選択されるタンパク質又は該タンパク質に由来するペプチドをコードすることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。６．ＣＴＬに提示される部分を含むＭａｇｅ−１又はＭａｇｅ−３タンパク質のペプチドをコードする核酸をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルス。７．配列番号１の配列をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルス。８．配列番号１の配列の残基５５〜８２に含まれる配列をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルス。９．配列番号２の配列をそのゲノムに挿入した欠損組換えアデノウイルス。１０．ヒト血清型Ａｄ２及びＡｄ５から選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。１１．イヌ血清型から選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。１２．Ｅ１領域に欠失を含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。１３．更にＥ４領域にも欠失を含むことを特徴とする請求項１１に記載のアデノウイルス。１４．核酸がＥ１又はＥ３又はＥ４領域に挿入されることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。１５．請求項１から１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアデノウイルスを含む医薬組成物。１６．ヒト腫瘍に特異的な細胞障害性リンパ球のｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ産生のための請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスの使用。１７．請求項１から１４のいずれか一項に記載の欠損組換えアデノウイルスに感染させた細胞を含む組成物。１８．請求項１から１４のいずれか一項に記載の欠損組換えアデノウイルスに感染させた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むことを特徴とする請求項１７に記載の組成物。１９．請求項１から１４のいずれか一項に記載のウイルスに感染させた細胞集団とＣＴＬ細胞の前駆体を接触させることを特徴とする腫瘍抗原の特異的細胞障害性Ｔ細胞の製造方法。