JP4961706B2 - Ｈｌａクラスｉｉ拘束性新規癌抗原ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、ＨＬＡ分子によりＴ細胞と結合し、これに提示される腫瘍関連遺伝子産物の断片、具体的にはそのペプチド、このようなペプチドをコードする核酸分子、ならびに関連抗体およびＴ細胞などに関する。これらは、医薬、とりわけ腫瘍の診断および治療において有用である。

哺乳類免疫系が外来または異質物質を認識し、それと反応する過程は複雑である。系の重要な一面はＴ細胞応答であり、これは、ＣＤ４またはＣＤ８細胞表面タンパク質に対して陽性である成熟Ｔ細胞を一部包含する。Ｔ細胞は、ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）または主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれるペプチドおよび分子の他の細胞上の細胞表面複合体を介して他の細胞を認識し、それと相互作用し得る。ペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によりプロセシングされる大型分子に由来する。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体との相互作用は制限され、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の複合体に対する特異的Ｔ細胞を要する。特異的Ｔ細胞が存在しない場合には、その相手複合体が存在する場合でもＴ細胞応答は認められない。同様に、特定の複合体が存在しないが、しかしＴ細胞は存在する場合、応答は認められない。

外来抗原に対するＴ細胞応答は、細胞溶解性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の両方を含む。ＣＤ８＋細胞傷害性または細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、活性時にＨＬＡクラスＩ分子（例えばＨＬＡ−Ａ２，ＨＬＡ−Ａ２４等）により提示される適切な抗原を提示する細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、それらの表面のＨＬＡクラスＩＩ分子（例えば，ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４，ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７，ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９等）により適切な抗原を提示するマクロファージおよび抗原提示Ｂ細胞を刺激するためにサイトカインを分泌するＴ細胞である。

Ｔ細胞が異質物質を認識するメカニズムは、癌にも関係があるとされてきた。例えば、自家黒色腫に対して向けられる多数の細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）クローンが記載されている。いくつかの場合、これらのクローンにより認識される抗原が特性化されている。これらの遺伝子の発現産物はペプチドにプロセシングされ、次にこれが細胞表面に提示される。これは、特異的ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解をもたらし得る。

特定のＨＬＡ分子に関する特定のペプチドの既知の特異性が示された場合は、あるＨＬＡ分子を結合するが、他のものは結合しない特定のペプチドを予測し得る。これは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するため、重要である。その結果、特定のＨＬＡ分子に対する相手であるとの特定のペプチドの同定は診断的および療法的問題を有するが、これらは特定のＨＬＡ表現型を有する個体に関して当てはまるに過ぎない。

抗腫瘍免疫におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）の重要性は、これらの細胞が協同的およびエフェクター機能に役立つだけでなく、免疫記憶を保持するのにも重要である動物モデルにおいて実証されている（非特許文献１により再検討されている）。

近年、発症頻度の高い偏平上皮癌においてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の癌抗原タンパク質（ＳＡＲＴ２）が存在し、宿主ＣＴＬによって認識される癌抗原ペプチドの存在が報告された（例えば非特許文献２、特許文献１参照。）。扁平上皮癌はヒトの癌で最も多く認められる癌の一つであり、特に食道癌や肺癌での偏平上皮癌は現在の化学療法や放射線治療に比較的抵抗性を示すことが知られている。現在、癌抗原を攻撃するＣＴＬを活性化する腫瘍抗原ペプチド等を用いた特異的免疫療法の開発が期待される。
特開平１１−３１８４５５号公報 トパリアン（Topalian），「カレント・オピニオン・イムノロジー（Current opinion in immunology）」、１９９４年、第６巻、ｐ７４１−７４５ ナカオ（Nakao）、外１２名、「ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of immunology）」、２０００年、第１６４巻、ｐ．２５６５−２５７４

近年、癌抗原を攻撃するＣＴＬを活性化する腫瘍抗原ペプチド等を用いた特異的免疫療法が注目されているが、臨床試験において十分な治療効果が得られないとの報告がなされている。そのため、ヘルパーＴ細胞を増殖させることのできるペプチドの発見が極めて重要とされている。

本発明の課題は、偏平上皮癌等の幅広い腫瘍に応用でき、または応用可能な腫瘍が限られていても腫瘍の患者のうち多くの人に応用でき、またはその腫瘍の治療や診断を補完しつつ各種腫瘍に応用できる癌療法の一助となるペプチド等を提供することにある。

本発明は、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状の治療または診断に用いられ得る。

本発明において、ＳＡＲＴ２遺伝子は、ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチドである腫瘍拒絶抗原をコードするということが示された。このペプチドは、抗原提示細胞により提示されると、Ｔ細胞の活性化および増殖を有効に誘導する。

本発明は、ＨＬＡ分子を結合する単離ＳＡＲＴ２ペプチドおよびこのようなペプチドの機能的変異体を提供するが、機能的変異体は、ＳＡＲＴ２ペプチド配列の１または数個のアミノ酸付加、置換または欠失を含む。本発明は、このようなペプチドをコードする単離核酸分子、それらの核酸分子を含有する発現ベクター、それらの核酸分子でトランスフェクトされる宿主細胞、ならびにそれらのペプチドおよびペプチドとＨＬＡ分子の複合体に対する抗体も提供する。ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を認識するＴ細胞も提供される。上記の分子および上記の細胞を含有する医薬組成物、診断剤、予防剤、治療剤も付加的に提供される。さらに本ペプチドを認識するＴ細胞が反応するすべてのペプチドも提供される。

具体的には、本発明は以下の構成からなる。
［１］以下の（ａ）または（ｂ）のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチド。
（ａ）配列番号４，６または８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号４，６または８で表されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を有するペプチド。
［２］（１）配列番号３、配列番号５または配列番号７で表されるポリヌクレオチド分子および（２）［１］に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド分子からなる群より選択されるポリヌクレオチド分子。
［３］［１］に記載のペプチドを認識する白血球。
［４］［１］に記載のペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
［５］［１］に記載のペプチドを有効成分として含む腫瘍の治療剤。
［６］［１］に記載のペプチドを含む癌細胞増殖抑制剤。
［７］ＨＬＡクラスＩＩ分子と［１］に記載のペプチドとの複合体に選択的に結合する、単離ＣＤ４陽性Ｔ細胞。
［８］癌細胞を傷害する能力を有する［７］に記載の単離ＣＤ４陽性Ｔ細胞。
［９］ＨＬＡクラスＩＩ分子と［１］に記載のペプチドとの複合体を含む、単離抗原提示細胞。

本発明は、ＨＬＡ分子により提示される単離ＳＡＲＴ２ペプチドであって、Ｔ細胞の増殖および活性化を刺激するペプチドを提供する。本発明の一態様は、配列番号４，６または８のアミノ酸配列を含む単離ペプチドである。クラスＩにより提示されるペプチドならびにクラスＩＩにより提示される抗原性ペプチドの使用は、療法的抗腫瘍予防接種の効力を改善し得る。このような効果は、配列番号４，６または８のペプチドの変異体または誘導体であっても同様に発揮され、配列番号４，６または８のアミノ酸配列中１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチドであっても同様な効力をもち得る。また、本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび／または本発明のペプチドを認識する白血球および／または抗体は、腫瘍の診断、予防、治療に有用である。さらには、ＨＬＡクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体に結合する単離性ＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはＨＬＡクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体を含む単離性抗原提示細胞も腫瘍の診断、予防、治療に有用である。さらに、ＨＬＡクラスＩＩ分子により提示される抗原についての知見は、腫瘍抗原または腫瘍抗原遺伝子を組み込んだ組換え体ウイルスにより免疫感作された癌患者の免疫応答の評価のために有用である。

ＳＡＲＴ２がプロセシングされてＨＬＡに結合できる形態となったペプチドは、特にＨＬＡクラスＩＩに結合するものが好ましく、任意の長さまたは配列のものであり得る、と当業者に理解されるであろう。

以下の実施例で実証されるように、ＳＡＲＴ２タンパク質は、適切にプロセシングされ、ＨＬＡクラスＩＩ分子により提示され、そしてＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するのに有効である。ＳＡＲＴ２由来のペプチド、例えば配列番号４，６または８のペプチドは、一端または両端に付加された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸を有し得る。このようなペプチドの抗原性部分は、ＨＬＡ、特にＨＬＡクラスＩＩによる提示のために生理学的条件下で切り取られる。ＨＬＡクラスＩＩペプチド長は約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸の間で変動し得るということも当業界で周知である（エンゲルハード（Engelhard）、アニューアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Annual review of immunology）、１９９４年１２巻、ｐ．１８１−２０１）ことから、本発明のペプチドとして、配列番号４，６または８のアミノ酸配列（もしくは配列番号４，６または８のアミノ酸配列の一部分）を含有する約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。繰込み組のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが同定されており、この場合、ペプチドは、コア配列を共有するが、しかしアミノおよび／またはカルボキシル末端に異なるアミノ酸を有する。本明細書中に開示されたペプチドより少ないアミノ酸を有するＳＡＲＴ２のペプチドも、本発明に含まれる。したがって、付加的ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドならびにＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと相同のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、本明細書中に記載した手法にしたがって当業者により同定され得る。

実施例に記載された手法は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを同定するために利用され得る。したがって、細胞をＳＡＲＴ２ポリペプチドに接触させることにより、または当該ＳＡＲＴ２タンパク質の発現を指図する核酸分子を細胞に導入することにより、例えば抗原提示細胞、例えば正常血液ドナーの樹状細胞に組換え体ＳＡＲＴ２タンパク質（またはその断片）を装入し得る。次に、抗原提示細胞を用いて、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを認識する特定のＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化および増殖をin vitroで誘導し得る。次に、例えばＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化および増殖を刺激するために用いられるＳＡＲＴ２タンパク質のペプチド断片で細胞を刺激することにより、実施例に記載したように、ペプチドの配列が確定され得る。あるいは、ＳＡＲＴ２タンパク質由来のペプチドを抗原提示細胞に装入し得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを選択するためのコンピューターソフトウェアも利用可能である。ＨＬＡクラスＩＩ分子はペプチドが結合することのできるポケット構造を有しており、ＨＬＡクラスＩＩのサブタイプにより化学的な性質あるいは構造の大きさが異なる。これらのポケット構造をプロファイルすることで、その構造に相互作用できるペプチドを推測することが可能である。例えばＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム；（ステゥーニオロ（Sturniolo）、外１０名、「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature biotechnology）、１９９９年、第１７巻、ｐ．５５５−５６１，マニシ（Manici）、外１０名、「ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデシン（The Journal of experimental medicine）」、１９９９年、第１８９巻、ｐ．８７１−８７６」、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズム（ラメンセー著（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ），外４名，「イムノジェネティクス（Immunogenetics）」、１９９９年、第５０巻、ｐ．２１３−２１９）、ＰｒｏＰｒｅｄアルゴリズム（シン（Singh）,外１名、「バイオインフォマティクス（Bioinformatics）」、２００１年、第１７巻、ｐ．１２３６−１２３７）あるいはＲＡＮＫＰＥＰアルゴリズム（レイチェ（Ｒｅｃｈｅ），外２名，「ヒューマン・イムノロジー（Human immunology）」、２００２年、第６３巻、ｐ．７０１−７０９）が利用可能である。このように選択されたペプチドは、特定のＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導するために、ならびにペプチドの同定のために、本明細書中に記載した検定中で用いられ得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合のためのペプチドを選択および試験するさらに別の方法は、当業界で周知である。

上記のように、本発明でいう、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体を包含する。本明細書中で用いる場合、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの「変異体」または「誘導体」とは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの一次アミノ酸配列に対して１つまたはそれ以上の修飾を含有し、本明細書中に開示されたＨＬＡクラスＩＩおよびＴ細胞受容体結合特性を保持するペプチドである。ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド機能的変異体を作製する修飾は、例えば、１）ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの特性、例えば発現系でのペプチド安定性またはＨＬＡ−ペプチド結合のようなタンパク質−タンパク質結合の安定性を強化するために、２）ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに対する新規の活性または特性、例えばＣＴＬを誘導するＣＴＬエピトープ等の抗原性エピトープの付加または検出可能部分の付加を提供するために、あるいは３）同一または類似のＴ細胞刺激特性を生じる異なるアミノ酸配列を提供するためになされ得る。ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに対する修飾は、ペプチドをコードする核酸に対してなされることができ、その例としては、欠失、点突然変異、切頭化、アミノ酸置換およびアミノ酸の付加が挙げられる。あるいは、修飾は、例えば開裂、リンカー分子の付加、検出可能部分（例えばビオチン）の付加、脂肪酸の付加、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換等により、ポリペプチドに対して直接なされ得る。変異体は、無作為ペプチドあるいは１つまたはそれ以上の位置に置換を含むＳＡＲＴ１ペプチドの配列を基礎にしたペプチドであり得るペプチドのライブラリーからも選択され得る。例えば、ペプチドライブラリーは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合されたＳＡＲＴ２のヘルパーエピトープペプチドの複合体との競合検定に用いられ得る（例えば、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを装入された樹状細胞）。ＨＬＡクラスＩＩ分子とのＳＡＲＴ２ペプチドの結合に関して競合するペプチドは、シーケンシングされ、他の検定に用いられて（例えばＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖）、ＳＡＲＴ２ペプチド機能的変異体としての適合性を確定され得る。他の機能的変異体としては、ペプチド模倣化合物が挙げられる。ペプチド模倣物は、ＨＬＡクラスＩＩ結合のために調製されＣＤ４陽性Ｔ細胞の刺激に関して試験され得る。

ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアミノ酸配列は、天然または非天然起源であり得る。即ち、それらは、天然ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド分子を含み得るか、あるいはアミノ酸配列が、提示される場合にヘルパーＴ細胞を刺激する能力を保持し、ＨＬＡクラスＩＩ分子との結合の特性を保持する限り、修飾化配列を含み得る。例えば、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、この情況においては、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドおよび非関連アミノ酸配列、標識化ペプチド、ＳＡＲＴ２発現癌を有する患者から単離されたペプチド、ＳＡＲＴ２を発現する培養細胞から単離されたペプチド、非ペプチド分子に結合されたペプチド、ならびに配列番号４，６または８を含むその他の分子を含む融合タンパク質であり得る。

次に、ＨＬＡクラスＩＩ結合分子との変異体ペプチドの結合、およびＴ細胞の刺激が、標準手法により確定される。例えば、下記で例示されるように、変異体ペプチドは、ＳＡＲＴ２ペプチドを結合するＨＬＡクラスＩＩ分子を含有する抗原提示細胞と接触されて、変異体ペプチドと抗原提示細胞との複合体を形成し得る。次にこの複合体は、ＨＬＡクラスＩＩ結合分子により提示されるＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを認識するＴ細胞と接触され得る。Ｔ細胞は、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状を有する患者から得られる。Ｔ細胞による変異体ペプチドの認識は、ＴＮＦまたはＩＦＮγ産生のようなＴ細胞刺激の指標を測定することにより確定され得る。同様の手法は、他のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの同定および特性化のために実行され得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合分子との変異体ペプチドの結合、およびＨＬＡクラスＩＩ結合分子により提示される変異体ペプチドによるＴ細胞の刺激は、変異体ペプチドが機能的変異体であることを示す。本方法は、機能的変異体によるＴ細胞の刺激の有効性の鑑定として、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによるＴ細胞の刺激および機能的変異体によるＴ細胞の刺激を比較する過程も包含し得る。機能的変異体をＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと比較することにより、Ｔ細胞刺激特性の増大を示すペプチドが調製され得る。

上記の方法のいずれかにより調製されるＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの変異体をシーケンシングして、必要な場合には、アミノ酸配列を確定し、したがって、このような変異体をコードするヌクレオチド配列を推定し得る。

さらに本発明の一部は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列、ならびに上記のヌクレオチド配列からなる核酸分子とハイブリダイズする他の核酸配列である。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法を編集する参考文献、例えばサムブルック（Sambrook）著、「モレキュラー・クローニング ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、第１−３巻に見出され得る。

本発明のポリヌクレオチド分子には「本発明のポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子」も包含される。ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えば前述のMolecular Cloningに記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０.１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。用いられ得る条件、試薬等があるが、当業者はこのような条件に通じており、従ってこの条件に限定されない。

しかしながら、本発明のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする核酸の相同体および対立遺伝子の明瞭な同定を可能にする方法で当業者は条件を操作し得ることを理解されたい。当業者は、その後ルーチンに単離されるこのような分子の発現に関する細胞およびライブラリーのスクリーニングとその後の関連核酸分子の単離およびシーケンシングのための方法にも周知している。

概して、相同体および対立遺伝子は、典型的にはそれぞれＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアミノ酸配列またはこのようなペプチドをコードする核酸と少なくとも９０％のアミノ酸同一性および／または少なくとも７５％のヌクレオチド同一性を共有する。いくつかの場合には、相同体および対立遺伝子は、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有し、そしてさらにその他の場合には、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有する。上記の核酸の相補体も本発明に包含される。

ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする核酸に関するスクリーニングでは、^３２Ｐプローブと一緒に上記の条件を用いて、核酸ハイブリダイゼーション、例えばサザンブロットまたはノーザンブロットが実施され得る。ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードするＤＮＡが最後に移された膜を洗浄後、放射能シグナルを検出するために、その膜はＸ線フィルムに対して配置される。

本発明は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの同一アミノ酸残基をコードする代替的コドンを含む核酸配列の使用も包含する。例えば、本明細書中に開示されているように、ペプチドＱＬＮＬＫＮＶＱＲＮＬＩＬＬＨＰＱＬＬＬＬＶＤＱＩＨＬ（配列番号４）は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドである。ロイシン残基（配列番号４の第２番目のアミノ酸）は、コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＵ，ＣＵＣ，ＣＵＡおよびＣＵＧによりコードされ得る。６つのコドンは各々、ロイシン残基をコードするという目的に関して等価である。したがって、ロイシンコードヌクレオチドトリプレットのいずれかを用いて、in vitroまたはin vivoでタンパク質合成装置を指図して、ロイシン残基を組み入れ得る、ということは当業者には明らかであろう。同様に、配列番号４のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、以下のものが挙げられる：ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＡＡおよびＡＡＧ（リシンコドン）；ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧおよびＧＵＵ（バリンコドン）；ＧＡＡおよびＧＡＧ（グルタミンコドン）；ＵＵＣおよびＵＵＵ（フェニルアラニンコドン）ならびにＵＡＣおよびＵＡＵ（チロシンコドン）。その他のアミノ酸残基は、ポリヌクレオチド配列により同様にコードされ得る。したがって本発明は、遺伝子コードの縮重のためにコドン配列中のネイティブＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドコード核酸とは異なる縮重核酸を包含する。

本発明は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む修飾核酸分子も提供する。好ましい実施形態では、これらの修飾核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、非修飾核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能、例えば抗原性、酵素活性、受容体結合、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子によるペプチドの結合による複合体の形成等を保持する。ある種の実施形態では、修飾核酸分子は、修飾ポリペプチド、好ましくは本明細書中に別記されているような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。修飾核酸分子は、非修飾核酸分子に構造的に関連があり、好ましい実施形態では、修飾および非修飾核酸分子が当業者に既知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするよう十分に構造的に非修飾核酸分子と関連する。

例えば、単一アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする修飾核酸分子が調製され得る。これらの核酸分子は各々、本明細書中に記載したような遺伝子コードの縮重に対応するヌクレオチド変化と相容れない１、２または３つのヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする修飾核酸分子が調製され得るが、これらは例えば２〜６のヌクレオチド変化を有する。例えばアミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６等をコードするコドンのヌクレオチドの置換を含めたこれらと同様の多数の修飾核酸分子が当業者により容易に意図される。上記の例では、２つのアミノ酸の各組合せは、修飾核酸分子の組に、ならびにアミノ酸置換をコードするすべてのヌクレオチド置換に含まれる。当業者に容易に意図されるように、さらなる置換（即ち、３またはそれ以上）、付加または欠失（例えば、停止コドンまたはスプライス部位（単数または複数）の導入による）を有するポリペプチドをコードする付加的核酸分子も調製され得るし、本発明に包含される。上記の核酸またはポリペプチドはいずれも、本明細書中に開示された核酸および／またはポリペプチドに対する構造的関連または活性の保持に関して、ルーチン実験により試験され得る。

本発明のポリヌクレオチド分子はＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとることができ、ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが包含される。また、ＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖の場合はセンス鎖またはアンチセンス鎖の両者が包含され得る。

ＳＡＲＴ２のポリペプチド、例えばＳＡＲＴ２またはそれらに由来するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの理想的な形態は、少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは２つ以上のＨＬＡ型に結合することが可能で、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖させることのできる性質を持つことである。例えば、実施例で示すように本発明のペプチドは２つのＨＬＡ型に結合することが可能で、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖させることのできる性質を持つ。

本発明は、発現ベクター中での、ならびに原核生物（例えば大腸菌）または真核生物（例えば樹状細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系、細胞内寄生原虫発現系、乳酸菌発現系および昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）である宿主細胞および細胞株をトランスフェクトするための本配列の使用を包含することも理解されたい。発現ベクターは、関連配列、即ち上記のものがプロモーターと操作可能的に結合されることを必要とする。ヒトＨＬＡ分子はＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを提示することが見出されているので、発現ベクターは、ＨＬＡ分子をコードする核酸配列も含み得る（他のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに関しては、異なるＨＬＡ分子が用いられ得る）。ベクターが両コード配列を含有する情況では、それは正常ではいずれか一方を発現しない細胞をトランスフェクトするために用いられ得る。

本明細書中で用いる場合、「ベクター」とは、異なる遺伝子環境間の輸送のための、または宿主細胞中での発現のための制限および結紮により所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれかであり得る。ベクターは、典型的にはＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、プラスミド、ファジミドおよびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞中で自律的に複製可能であるかまたはゲノム中に組み込まれ得るクローニングベクター、ならびに新規の組換えベクターが宿主細胞中で複製するその能力を保持するようにベクターが決定可能様式で切断され、そして所望のＤＮＡ配列が結紮され得る１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によりさらに特性化されるクローニングベクターである。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数を増大する場合は多数回起こり得るし、あるいは宿主が有糸分裂により繁殖する前には宿主当たり１回だけ起こり得る。ファージの場合は、複製は、溶菌期中は能動的に起こり、溶原期中は受動的に起こり得る。発現ベクターは、調節配列に操作可能的に連結され、そしてＲＮＡ転写体として発現され得るように、所望のＤＮＡ配列が制限および結紮により挿入され得るベクターである。

ベクターは、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされていたか、またはされていなかった細胞の同定に用いるのに適した１つまたはそれ以上のマーカー配列をさらに含有し得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質またはその他の化合物に対する耐性または感受性を増大または低減するタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当業界で既知の標準検定により検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、ならびに形質転換化またはトランスフェクト化した細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に視覚的に作用する遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。好ましいベクターは、それらが操作可能的に連結されるＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の自律的複製および発現が可能なベクターである。

好ましくは、発現ベクターは、タンパク質またはペプチドが発現される細胞のエンドソームに対してＳＡＲＴ２のポリペプチド、例えばＳＡＲＴ２またはそれらに由来するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを標的化する配列を含有する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡクラスＩＩ分子との他の分子の結合を妨害する不変鎖（Ｉｉ）を含有する。この不変鎖はエンドソーム中で切断され、それによりＨＬＡクラスＩＩ分子によるペプチドの結合を可能にする。したがって、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドおよびその前駆体（例えばＳＡＲＴ２タンパク質）はエンドソームに対して標的化され、それによりＨＬＡクラスＩＩ分子と結合するＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを強化することが好ましい。エンドソームに分子を向けるためのターゲッティングシグナルは当業界で既知であり、これらのシグナルは、エンドソームターゲッティングシグナルを含有する融合タンパク質が産生されるよう、発現ベクター中に組み入れられ得るのが便利である。サンダーソン（San derson）（「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイデッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、１９９５年、第９２巻、ｐ．７２１７−７２２１）、ウ（Wu）（「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイデッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、１９９６年、第９２巻、ｐ．１１６７１−１１６７５）およびトムソン（Thomson）（「ジャーナル・オブ・バイロロジー（Journal of virology）、１９９８年、第７２巻、ｐ．２２４６−２２５２）は、エンドソームターゲッティングシグナル（不変鎖Ｉｉおよびリソソーム関連膜タンパク質ＬＡＭＰ−１を含む）ならびにエンドソームおよび／またはリソソーム細胞区画に抗原を向ける場合のそれらの使用を記載している。

本明細書中で用いる場合、コード配列および調節配列は、調節配列の影響または制御下にコード配列の発現または転写を置くような方法でそれらが共有結合される場合、「操作可能的に」連結されるといわれる。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されるのが望ましい場合、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写を生じ、二つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を生じない、（２）コード配列の転写を指図するプロモーター領域の能力を妨げない、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写体の能力を妨げないならば、二つのＤＮＡ配列は操作可能的に連結されるといわれる。したがって、結果的に生じる転写体が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るようにプロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写を実行可能であった場合には、プロモーター領域はコード配列と操作可能的に連結される。

遺伝子発現に必要とされる調節配列の的確な性質は、種または細胞型間で変わり得るが、しかし概して、必要な場合には、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写化および５’非翻訳化配列を含む。特に、このような５’非転写化調節配列は、操作可能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、望ましい場合には、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含み得る。本発明のベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を任意に含み得る。適切なベクターの選定および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内である。

発現のための必要な素子をすべて含有する発現ベクターは市販されており、当業者に既知である（例えば、サムブルック（Sambrook）著、「モレキュラー・クローニング ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、第１−３巻を参照）。細胞は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）の細胞への導入により遺伝子工学処理される。その異種ＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）は、宿主細胞中での異種ＤＮＡの発現を可能にするために転写性素子の操作可能制御下に置かれる。本明細書中に記載されているように、このような発現構築物は、エンドソームターゲッティングシグナル、好ましくはヒト不変鎖またはそのターゲッティング断片をコードするヌクレオチド配列も任意に含有する。

哺乳類細胞中でのｍＲＮＡ発現のための好ましい系は、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子（安定トランスフェクト化細胞株の選択を促す）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列のような選択可能マーカーを含有するｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad, CAから入手可能）のような系である。さらに、霊長類またはイヌ細胞株中での発現に適しているのは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含有し、多コピー染色体外素子としてのプラスミドの保持を促すｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）である。別の発現ベクターは、in vitroでの転写を効率的に刺激するポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含有するｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドである。本プラスミドは、ミジズマ（Mishizuma）ら（「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic acids research）」、１９９０年、第１８巻、ｐ．５３２２）により記載されており、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えばデモウリン（Demoulin）ら（「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）、１９９６年、第１６巻、ｐ．４７１０−４７１６」により開示されている。さらに別の好ましい発現ベクターは、スタンフォード-ペリカウデット（Stratford-Perricaudet）らにより記載されたアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパク質を欠いている（「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インバスティゲーション（The Journal of clinical investigation）」、１９９２年、第９０巻、ｐ．６２６−６３０）。Adeno.Ｐ１Ａ組換え体としてのアデノウイルスの使用は、Ｐ１Ａに対する免疫感作のためのマウスにおける皮内注射において、ワーニアー（Warnier）らにより開示されている（「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（International journal of cancer）」、１９９６年、第６７巻、ｐ．３０３−３１０）。

「障害」または「症状」という用語が本明細書中で用いられる場合、それは、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが発現される任意の病理学的症状を指す。このような障害としては、癌、例えばグリオーマを含む脳腫瘍、頭、首、肺，子宮または食道の扁平上皮癌、メラノーマ，肺または子宮の腺癌，腎癌が挙げられる。

開示に基づいたいくつかの療法的アプローチは、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド提示細胞に対する対象の免疫系による応答の誘導において前提とされる。このようなアプローチの１つは、組織での表現型の異常細胞を有する対象への、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子の複合体を認識する白血球、好ましくは本発明のペプチドに特異的な自家ＣＤ４陽性Ｔ細胞の投与である。このようなＣＤ４陽性Ｔ細胞をin vitroで開発することは当業者の技術の範囲内である。一般に、対象から採取される細胞の試料、例えば血球は、複合体を提示し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を惹起し得る細胞と接触されて、増殖する。標的細胞は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を保有する抗原提示細胞、例えば樹状細胞またはＢ細胞であり得る。標的細胞は、細胞の試料がまず分類されてＣＤ４陽性Ｔ細胞集団を単離する場合、ＣＯＳ細胞のようなトランスフェクト体でもあり得る。上記の四量体技術は分類のために用いられ得る。これらのトランスフェクト体はそれらの表面の所望の複合体を提示し、問題のＣＤ４陽性Ｔ細胞と組合されると、その増殖を刺激する。ＣＯＳ細胞は、他の適切な宿主細胞と同様に、広範に利用可能である。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の特異的産生は、下記に記載される。クローン拡張性自家ＣＤ４陽性Ｔ細胞が次に対象に投与される。次にＣＤ４陽性Ｔ細胞は対象の免疫応答を刺激し、それにより所望の療法的目標を達成する。

上記の療法は、対象の異常細胞の少なくともいくつかが関連ＨＬＡ／ペプチド複合体を提示するものと仮定する。これは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞の同定方法、ならびに関連配列、この場合にはＳＡＲＴ２配列のＤＮＡを発現する細胞の同定方法を当業界が非常に熟知しているので、非常に容易に確定され得る。上記の療法は、本発明による利用可能な療法の唯一の形態というわけではない。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、多数のアプローチを用いてin vivoでも惹起され得る。一アプローチは、複合体を発現する非増殖性細胞の使用である。このアプローチに用いられる細胞は、複合体を正常に発現する細胞、例えば樹状細胞、あるいは複合体の提示に必要な遺伝子の一方または両方でトランスフェクトされた細胞であり得る。同様に、当該遺伝子の一方または両方を保有するベクターが用いられ得る。ウイルスまたは細菌ベクターが特に好ましい。例えば、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする核酸は、ある種の組織または細胞型におけるＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現を指図するプロモーターおよびエンハンサー配列と操作可能的に連結され得る。核酸は、発現ベクター中に組み入れられ得る。発現ベクターは、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードするもののような外因性核酸の挿入を可能にするよう構築されるか、または修飾された非修飾細胞外染色体核酸、プラスミドまたはウイルスゲノムであり得る。ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする核酸は、レトロウイルスゲノム中にも挿入され、それにより標的組織または細胞型のゲノムへの核酸の組込みを促し得る。これらの系では、当該遺伝子は微生物、例えばワクシニアウイルス、概してポックスウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたは細菌ＢＣＧ、ならびに事実上、宿主細胞を「感染」させる物質により保有される。結果として生じる細胞は、当該複合体を提示し、自家ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識され、次にこれが増殖する。

同様の作用は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをアジュバントと組合せて、in vivoでのＨＬＡクラスＩＩ提示細胞中への組み入れを促すことにより達成され得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合部分より大きい場合、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドはＨＬＡ分子のペプチド相手を産生するのに必要な場合にプロセシングされ得る。一般に、対象は、有効量のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの皮内注射を受けることができる。当業界での免疫感作プロトコール標準に従って、初期用量と、その後の追加免疫用量を投与することができる。

上記の組成物またはプロトコールのいずれかは、細胞溶解性Ｔ細胞応答の誘導のためのＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドも含み得る。例えば、下記で実証されるように、ＳＡＲＴ２タンパク質は細胞中でプロセシングされて、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ応答の両方を生じ得る。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を結合するＳＡＲＴ２ペプチド（またはこのようなペプチドをコードする核酸）を投与することにより、免疫応答改善がＴヘルパー細胞およびＴキラー細胞の両方を誘導することにより提供され得る。

さらに、非ＳＡＲＴ２腫瘍関連ペプチドも、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩにより免疫応答を増大するために投与され得る。癌細胞が１つより多い腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは十分に確立されている。特定の対象が付加的腫瘍関連遺伝子を発現するか否かを当業者が確定し、次に上記のＳＡＲＴ２組成物および治療剤および予防剤中にこのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含むことは、ルーチン実験の範囲内である。

本発明は、本明細書中に記載されているように、多数の用途を有し、そのいくつかが本明細書中に記載されている。以下の用途はＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに関して記載されるが、しかし他の構造的または機能的に関連するＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに等しく適用可能である。第一に、本発明は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現を特徴とする疾患を当業者が診断するのを可能にする。これらの方法は、生物学的試料中でのＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、またはＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子の複合体の発現を確定する過程を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子の複合体の発現は、ペプチドまたは複合体に関する結合相手、例えば抗体を用いて検定することにより確定され得る。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体に対する抗体は、例えば、レイル（Lane）ら著、「アンティボディーズ；ア・ラボラトリー・マニュアル（Antibodies; A Laboratory Manual）、第１版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harber Laboratory Press）、１９８９年」などに記載の方法により、本発明のペプチドを用いて適切な方法で適切な動物を免疫することにより、腫瘍抗原タンパク質を認識する抗体、あるいはその活性を中和する抗体を容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、免疫学的診断法、医薬等が挙げられる。

本発明のペプチドおよび／又は本発明のポリヌクレオチド分子および／又は本発明のペプチドに反応する白血球および／又は本発明のペプチドに対する抗体を有効成分とする医薬組成物は、ＳＡＲＴ２を発現している癌細胞に反応し、その増殖を抑制させることで、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状を治療するという効果も期待できるであろう。これら医薬組成物はＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状が発症する前に投与されることで、その症状、例えば腫瘍、に対する予防剤となりうる。また、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状が発症する後にこれら医薬組成物を投与することで、その症状、例えば腫瘍、に対する治療剤となりうる。さらに、本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド分子、本発明のペプチドに反応する白血球、本発明のペプチドに対する抗体をを適宜選択した２種類以上を組み合わせて使用することで、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状を治療する効果を高めるという効果も期待できるであろう。

治療剤および予防剤も、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドまたはその前駆体をコードする裸ＤＮＡまたはＲＮＡを包含するが、これらはin vitroで産生され、注射、粒子衝撃、鼻腔吸入およびその他の方法により投与され得る。「裸核酸」型の治療剤および予防剤は、裸核酸によりコードされるペプチドに特異的なＣＴＬの生成を含めた免疫学的応答を惹起することが実証されている。治療剤および予防剤は、ウイルス、リポソームまたはその他の粒子、例えば薬剤送達に有用なポリマー粒子中に充填された核酸も含む。

免疫感作プロトコールの一部として、免疫応答を増強する物質が、癌の治療剤および予防剤の核酸またはペプチド構成成分とともに投与され得る。このような免疫応答増強化合物は、アジュバントまたはサイトカインとして分類され得る。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。特定の例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。好ましくは、ペプチドは、ＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合されて投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。

対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコールに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８およびＦlt3-Ligandが挙げられる。

投与される場合、本発明の治療用組成物は、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。

本発明はさらに、本発明の腫瘍抗原に関するペプチドもしくはその変異体・誘導体を含有する医薬を提供する。本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドは、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与したりすることができる。また、剤型としては、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッド（脂質）を結合させた製剤などが用いられる。また、腫瘍抗原ペプチドをパルスした樹状細胞やマイクロファージなどの抗原提示細胞や本発明の腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡを導入した細胞を投与する方法も考えられる。この場合に導入するＤＮＡあるいはＲＮＡの望ましい形態として、本発明のペプチドを含む様々なヘルパーエピトープあるいはＣＴＬエピトープである腫瘍抗原ペプチドもしくは腫瘍抗原をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡを一つ、もしくはそれ以上を細胞に導入するか、これらＤＮＡあるいはＲＮＡを一つ、もしくはそれ以上を連結させて細胞に導入する方法が考えられる。また、前述したＤＮＡあるいはＲＮＡの代わりにペプチド、ポリペプチドあるいはタンパク質を細胞に導入することも考えられる。

本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子もしくはその化学的修飾体を含有する医薬に関する。本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含有する「医薬」は、例えば、本発明のＤＮＡを腫瘍患者等に投与することで腫瘍を治療または予防することができる。本発明のＤＮＡを投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス、１９９４年４月、ｐ．２０−４５、月刊薬事、１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。

ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。

その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。

これらの本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を有するプラスミドも本発明の範囲に含まれる。

本発明の腫瘍抗原ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。In vivo方法がより好ましい。

In vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。

製剤中の本発明のＤＮＡ含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常本発明のＤＮＡとして、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を用いて、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御することができる。この方法によって腫瘍抗原タンパク質の生産量を減らすことで、自己免疫疾患を治療または予防することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬も本発明に包含される。

アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミドに組み込む場合、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入する方法としては例えば、実験医学、１９９４年、第１２巻に述べられている方法が挙げられ、リポソームや組換えウイルスなどを利用した方法が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現プラスミドは通常の発現ベクターを用いてプロモーターの後ろに逆向きに、すなわち本発明の遺伝子が３'から５'の向きに転写されるように、本発明の遺伝子をつなぐだけで簡単に作製できる。

このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するプラスミドも本発明に包含される。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体をそのまま投与する場合、安定化剤、緩衝液、溶媒などと混合して製剤された後、投与時には抗生物質、抗炎症剤、麻酔薬などと同時に用いることもできる。こうして作製された製剤は様々な方法で投与可能である。投与は連日または数日から数週間おきになされるのが好ましい。また、この様な頻回の投与を避けるために徐放性のミニペレット製剤を作製し患部近くに埋め込むことも可能である。あるいはオスモチックポンプなどを用いて患者に連続的に徐々に投与することも可能である。通常投与量は作用部位における濃度が0.1nM-10μMになるように調製する。

このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を含有する医薬も本発明に包含される。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体に対する抗体を腫瘍の治療に用いることも可能である。例えば、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状を発症した患者に本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体に対する抗体を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導することができる。本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体に対する抗体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体、あるいは本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体に対する抗体、あるいは本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体で誘導したＴ細胞、例えば単離性ＣＤ４陽性Ｔ細胞、および樹状細胞などの単離抗原提示細胞における癌に対する治療効果は動物モデルを用いて検証することもできる。例えば、免疫不全マウス（ヌードマウス、スキッドマウス等）あるいはヒトＨＬＡトランスジェニックマウスに腫瘍細胞を移植する前あるいは移植後、有効量でかつ最適の投与方法でペプチド、抗体あるいは細胞を投与することで、癌に対する治療効果を判定できるが、これに限定されるわけではない。この場合の本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体、あるいは本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体に対する抗体の投与量としては、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましいし、細胞の投与量としては、通常1〜1000000000個、好ましくは1000000〜1000000000個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

本発明の治療用組成物を用いて免疫応答を刺激するのが望ましい場合、これは、血清中の抗体力価の増大、細胞傷害性リンパ球のクローン性拡張またはいくつかのその他の望ましい免疫学的応答を引き起こす体液性抗体応答の刺激を包含し得る。投与方式によって、１ナノグラム／キログラム〜１００ミリグラム／キログラムの範囲の免疫原の用量が有効であると考えられる。好ましい範囲は、５００ナノグラム〜５００マイクログラム／キログラムであると思われる。絶対量は、種々の要因、例えば投与のために選定される物質、投与が１回投与であるか多数回投与であるか、ならびに個々の患者パラメーター、例えば年齢、健康状態、サイズ、体重および疾患の段階によるであろう。これらの要因は当業者には周知であり、ルーチン実験で取り扱われ得る。

また、本発明のペプチドを有効成分として含む腫瘍の診断剤を提供することもできる。つまり、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状を免疫学的に診断することも可能である。免疫学的診断法は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。例えば、本発明の腫瘍抗原ペプチドもしくはその変異体・誘導体を固相化し、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状をもつ患者由来の血清もしくは血漿を反応させることで、患者血清もしくは血漿中のＳＡＲＴ２に対する抗体価を測定することが可能である。

これらの単離ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、かかるペプチドを含むタンパク質、あるいはペプチドおよびＨＬＡクラスＩＩ分子の複合体は、アジュバントのような物質と組合されて、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現を特徴とする障害を治療するのに有用な治療剤および予防剤を生成し得る。さらに、この治療剤および予防剤は、それらの表面にＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド／ＨＬＡ複合体を提示する細胞、例えば樹状細胞、Ｂ細胞、非増殖性トランスフェクト体等から調製され得る。治療剤および予防剤として細胞が用いられるすべての場合に、これらは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するのに必要な構成成分の一方または両方に関するコード配列でトランスフェクトされた細胞、あるいはトランスフェクションを必要とせずにすでに両分子を発現している細胞であり得る。例えば、自己抗原提示細胞は、患者から単離され、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子の会合中でＳＡＲＴ２エピトープを提示する細胞を得るよう処理され得る。これらの細胞は、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性細胞応答の両方を刺激することが可能である。樹状細胞は、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープでも装入され得る。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体をワクチンとして接種することは、腫瘍の予防方法および予防用組成物を提供することができる。例えば、腫瘍抗原ペプチドもしくはその変異体・誘導体を接種しておき、腫瘍抗原に対する抗体の作用を期待する液性免疫、例えば抗体依存性細胞傷害、もしくは腫瘍抗原に対するＴ細胞の作用を期待する細胞性免疫の誘導を促すことで、腫瘍の発生を予防することができる。

本発明は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現を特徴とする障害を有する対象を当業者が治療するための治療剤又は治療方法の提供を可能にする。治療は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子の複合を対象中で高濃度化する因子を治療剤として投与する過程、およびこのような複合体に特異的であるＣＤ４陽性Ｔ細胞を治療剤として投与する過程を包含する。上記の治療に有用な因子としては、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドおよびその機能的変異体、このようなＳＡＲＴ２ペプチドを含むエンドソーム標的化融合タンパク質、このようなタンパク質およびペプチドを発現する核酸（核酸を含有するウイルスを含む）、このようなペプチドおよびＨＬＡクラスＩＩ結合分子の複合体、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドおよびＨＬＡクラスＩＩ結合分子の複合体を保有する抗原提示細胞、例えば樹状細胞、Ｂ細胞、非増殖性トランスフェクト体等が挙げられる。本発明は、当業者が、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞に関してＴ細胞の集団を選択的に高濃度化することも可能にする。ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの単離は、ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする核酸を単離するのも可能にする。核酸は、in vivoで、あるいは原核生物または真核生物宿主細胞中でＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを生成するために用いられ得る。熟練従事者に周知の種々の方法を用いて、単離ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを得ることができる。例えば、発現ベクターを細胞中に導入して、ペプチドの産生を生じ得る。別の方法では、ｍＲＮＡ転写体が微量注射され、そうでなければ細胞中に導入されて、コード化ポリペプチドの産生を生じ得る。細胞無含有抽出物、例えば網状赤血球溶解物系におけるｍＲＮＡの翻訳も、ペプチドを産生するために用いられ得る。本発明のＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含むペプチドは、in vitroでも合成され得る。当業者は、単離ＳＡＲＴ２のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを生成するために、既知のペプチド単離方法にも容易に従い得る。これらの例としては、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。

製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

本発明の調製物は、有効量で投与される。有効量とは、単独でまたはさらなる用量とともに、所望の応答を刺激する製剤調製物の量である。癌を治療する場合、望ましい応答は、癌の進行の抑制である。これは、疾患の進行を一時的に遅くすることのみを包含し得るが、しかしさらに好ましくは、永続的に疾患の進行を停止させることを包含する。免疫応答を誘導する場合には、望ましい応答は、用いられるＳＡＲＴ２免疫原（単数または複数）に特異的である抗体またはＴ細胞の増大である。これらの望ましい応答は、ルーチン法により監視され得るし、あるいは本明細書中で考察される本発明の診断方法により監視され得る。

本発明のポリヌクレオチドには、本発明のペプチド配列を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅できるプライマーが含まれている。該プライマーは、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状をもつ患者からの組織、血液などからＲＮＡ、ｃＤＮＡを調整し、ＰＣＲ法により診断をすることに用いることができる。さらに、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状をもつ患者からの組織、血液などからＲＮＡを調整し、本発明のポリヌクレオチドをプローブに用いたノーザンブロット法によって腫瘍の診断が可能となる。また、本発明のポリヌクレオチド分子を用いたＤＮＡチップは、ＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状をもつ患者からの組織、血液などから調整したｃＤＮＡを材料にした腫瘍の診断を可能とする。これらは、本発明のポリヌクレオチド分子を有効成分として含む腫瘍の診断剤の一態様であるが、本発明のポリヌクレオチド分子を有効成分とする腫瘍の診断剤はこのような態様に限定されない。

さらに、本発明のペプチドに対する抗体はＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状に対する診断剤を提供することができる。例えば、本発明のペプチドに対する抗体を有効成分として含む腫瘍の診断剤をＳＡＲＴ２の発現を特徴とする症状をもつ患者由来の組織と反応させ、ＳＡＲＴ２の発現を検出することが可能である。腫瘍組織においてＳＡＲＴ２は顕著に発現していることから、前記方法により腫瘍の診断を行うことが可能である。

本明細書中に記載した治療のいずれかにより生成されるか、または強化される免疫応答は、当業界で既知の種々の方法によりモニタリングされ得る。例えば、所定の抗原に特異的なＴ細胞の存在は、抗原性ペプチドを提示する可溶性蛍光原性ＭＨＣ分子四量体によるＴ細胞受容体の直接標識により検出され得る（ダンバー（Dunbar）、外５名、「カレント・バイオロジー（Current biology）」、１９９８年、第８巻、ｐ．４１３−４１６）。要するに、β２−ミクログロブリンおよびクラスＩ分子を結合するペプチド抗原の存在下で、可溶性ＭＨＣクラスＩ分子がin vitroで折り畳まれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体は精製され、ビオチンで標識される。ビオチニル化ペプチド−ＭＨＣ複合体を標識化アビジン（例えば、フィコエリスリン）と４：１のモル比で混合することにより、四量体が形成される。四量体は次に、末梢血またはリンパ節のようなＣＴＬの供給源と接触させられる。四量体は、ペプチド抗原／ＭＨＣクラスＩ複合体を認識するＣＴＬを結合する。四量体により結合された細胞は、蛍光活性化細胞分類により分類されて、反応性ＣＴＬを単離し得る。単離ＣＴＬは次に、本明細書中に記載したような使用のためにin vitroで拡張され得る。四量体としてのＭＨＣクラスＩＩ分子の使用は、近年、クラウフォード（Crawford）ら（「イムニティー（Immunity）」、１９９８年、第８巻、ｐ．６７５−６８２）により実証された。多量体性可溶性ＭＨＣクラスＩＩ分子は、共有的に結合されたペプチドと複合化された。クラスＩＩ四量体は、適切化特異性および親和性で特異的Ｔ細胞と結合することが示された。したがって、四量体を用いて、予防接種プロトコールに対するＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性細胞応答の両方をモニタリングすることができる。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体を投与する場合、in vitroで培養した樹状細胞にパルスすることで効果を上げることができる。

すなわち、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）により樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。さらに好ましくは、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導後、Ｔ細胞を樹状細胞と相互作用させて増殖させ、投与することである。

用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やCD4陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ_２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜8週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体によりin vitroで培養された樹状細胞およびＴ細胞の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常1〜1000000000個、好ましくは1000000〜1000000000個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

本発明のペプチドもしくはその変異体・誘導体はin vivo投与においても、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。

樹状細胞増殖因子Flt3-Ligandあるいはその代替物を有効量投与し、腫瘍関連ペプチドあるいはそのペプチド配列をコードするｍＲＮＡおよびＲＮＡを投与する。この時、好ましくは樹状細胞を活性化するアジュバントとして有効量のImiguimodあるいはCpG等、さらに好ましくはIL-2とジフテリア毒素由来の融合タンパク質であるOntak等を投与してCD25陽性細胞を除くことで癌の治療に望ましい応答を誘導できる。

実施例１：ＳＡＲＴ２由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ヒトＳＡＲＴ２タンパク質のアミノ酸配列の情報をＧｅｎＢａｎｋから得た。ＣＤ４陽性Ｔ細胞抗原エピトープ予測のため、SYFPEITHI アルゴリズム, ProPredアルゴリズム、およびRANKPEPアルゴリズムの３つのコンピューター予測プログラムを用いてヒトＳＡＲＴ２タンパク質のアミノ酸配列を解析し、３種類のペプチドを選択した（配列番号４：SART2 548-574、配列番号６：SART2 915-940、配列番号８：SART2 532-556）。

（２）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／０９陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／１５陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４／１５陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する相間を収穫し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies, Inc., Grand Island, NY）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。

一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。

（３）調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０mｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞ずつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０^６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞ずつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。

実施例２：ＨＬＡ−ＤＲＢ１陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するＳＡＲＴ２由来ヘルパーエピトープの決定
（１）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性細胞を用いて、上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、本発明のペプチドである配列番号４，６または８に示すペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが確認された。本Ｔ細胞の配列番号４，６または８に示すペプチドに対する特異性を調べるために、それぞれのペプチドでパルスされた樹状細胞（１０mｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養）５×１０^４個に対して、４〜６回繰返し各ペプチドで刺激された５×１０^３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７２時間培養した。なお、培養開始から４８時間後にそれぞれの培養液に１mＣｉずつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。また、４８時間培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていない樹状細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号４，６または８に示すペプチドをパルスした樹状細胞を用いた穴の培養上清において顕著なＩＦＮ−γ産生が確認された。（図１）。さらに、図２に示すように、配列番号４，６または８に示すペプチドの刺激によってＴ細胞が増殖していることが確認された。従って、配列番号４，６または８に示すペプチドは特異的にＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。

（２）次に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性Ｔ細胞を増殖刺激させる能力を有する本ペプチドが、ＳＡＲＴ２タンパク質が抗原提示細胞内でナチュラルにプロセスされてＨＬＡ−ＤＲ上に提示されるエピトープであるかどうかについて検討した。図３に示すようにＲＴ−ＰＣＲ法により、グリオーマ細胞株、Ｔ９８ＧにおいてＳＡＲＴ２の発現を確認した。Ｔ９８Ｇのライセートを未成熟樹状細胞に添加して消化させ、樹状細胞を成熟化させた後、配列番号４，６または８に示すペプチドで刺激されたＴ細胞が本樹状細胞によって刺激されるかを調べた。１．５×１０^６個のＴ９８Ｇ細胞のペレットを液体窒素および湯浴を用いて７回凍結融解を繰り返し、細胞ライセートを作製した。一方、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／０９陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／１５陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４／１５陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation mediumに重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する相間を収穫し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、ＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２時間付着させ、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を作製した。作製した各細胞ライセートを５×１０^５個の未成熟樹状細胞に添加し、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で２日間培養した。また同時に、未成熟樹状細胞に配列番号４，６または８に示すペプチドを添加したもの、および未成熟樹状細胞にＰＢＭＣの細胞ライセート（１．５×１０^６個の細胞ペレットから作製）を添加したものをそれぞれ作製し、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。培養後の各樹状細胞をＸ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄後、１０％ヒトＡＢ血清を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、９６穴プレート１穴当りにそれぞれ３．３×１０^４個ずつ添加した。これらに５×１０^４個の配列番号４，６または８に示すペプチドで刺激されたＴ細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７２時間培養した。なお、培養開始から４８時間後にそれぞれの培養液に１mＣｉずつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、配列番号４に示すペプチドＳＡＲＴ２ 548-574で刺激されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／15陽性Ｔ細胞は，Ｔ９８Ｇ細胞のライセートを添加した樹状細胞の刺激によって増殖（図４、図５、図６）、配列番号６に示すペプチドＳＡＲＴ２ 915-940で刺激されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／０９陽性Ｔ細胞は，Ｔ９８Ｇ細胞のライセートを添加した樹状細胞の刺激によって増殖（図７、図８）、そして配列番号８に示すペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で刺激されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４／１５陽性Ｔ細胞は，Ｔ９８Ｇ細胞のライセートを添加した樹状細胞の刺激によって増殖していることが確認された（図９、図１０）。さらに、これらの反応は抗ＨＬＡ−ＤＲ中和抗体の添加によって阻害されていることから、配列番号４，６または８に示すペプチドが、ＳＡＲＴ２タンパク質が抗原提示細胞内でナチュラルにプロセスされてＨＬＡ−ＤＲ上に提示されるエピトープであることが明らかになった。

実施例３：ＳＡＲＴ２由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞のキラー活性
配列番号８に示すペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で刺激されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇ細胞を傷害するかどうかについて調べた。Ｔ９８Ｇ細胞に1000U/mlのIFN-gと10mg/mlの配列番号８に示すペプチドＳＡＲＴ２ 532-556を加え、３７℃で一晩培養した。その後、２×１０^５個のＴ９８Ｇ細胞に対し、５０μＣｉのクロミウムを加えて３７℃で４時間培養した。冷リン酸塩緩衝液中で２回（またはそれ以上）洗浄し、得られたＴ９８Ｇ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むRPMI培地に懸濁しターゲット細胞として調整した。また、４〜６回繰返し配列番号８に示すペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で刺激された８×１０^４個、２×１０^４個、５×１０^３個のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性Ｔ細胞を１×１０^３個のターゲット細胞と混合し、３７℃で４時間培養した。培養後、培養上清をガラス濾紙上に回収し、培養上清へのクロミウムの放出量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。対照実験として、クロミウムを加えていない１×１０^４個のＴ９８Ｇ細胞（コールドターゲット細胞）を、４〜６回繰返し配列番号８に示すペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で刺激された８×１０^４個、２×１０^４個、５×１０^３個のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性Ｔ細胞と１×１０^３個のターゲット細胞とで混合し、３７℃で４時間培養した。培養後、培養上清をガラス濾紙上に回収し、培養上清へのクロミウムの放出量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。図１１に示すように、配列番号８に示すペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で刺激されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性Ｔ細胞は癌細胞であるＴ９８Ｇ細胞を傷害するキラー活性を有していることが明らかとなり、コールドターゲット細胞存在下ではこの活性が低下することから癌細胞特異的なキラー活性であることが判明した。

本発明の他の態様は当業者には明らかであり、ここに繰り返す必要はない。本明細書中に引用した参考文献は各々、それらの記載内容全体が参照により本明細書中に援用される。

ＳＡＲＴ２由来の配列番号４，６または８に示すペプチドに特異的なＴ細胞からのＩＦＮ−γの産生を示す図である。 ＳＡＲＴ２由来の配列番号４，６または８に示すペプチドに特異的なＴ細胞の増殖を示す図である。 腫瘍抗原ＳＡＲＴ２がグリオーマ細胞株Ｔ９８Ｇ細胞に発現していることを示す図である。ｂｐはＤＮＡの塩基数を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 548-574で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドを認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、ＰＢＭＣ LysateはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性のＰＢＭＣライセートを示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 548-574で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ拘束的に認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、ＰＢＭＣ LysateはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性のＰＢＭＣライセート、aHLA-DRはHLA-DRに対する阻害抗体を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 548-574で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／１５陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ拘束的に認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／１５陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、aHLA-DRはHLA-DRに対する阻害抗体を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 915-940で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ拘束的に認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、ＰＢＭＣ LysateはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性のＰＢＭＣライセート、aHLA-DRはHLA-DRに対する阻害抗体を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 915-940で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／０９陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ拘束的に認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／０９陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、ＰＢＭＣ LysateはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／０９陽性のＰＢＭＣライセート、aHLA-DRはHLA-DRに対する阻害抗体を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ拘束的に認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、ＰＢＭＣ LysateはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性のＰＢＭＣライセート、aHLA-DRはHLA-DRに対する阻害抗体を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４／１５陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株が、樹状細胞によって腫瘍細胞からナチュラルにプロセスされた本ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ拘束的に認識することを示す図である。ＤＣはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４／１５陽性の樹状細胞、Ｔ９８Ｇ LysateはＴ９８Ｇ細胞の細胞ライセート、ＰＢＭＣ LysateはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４／１５陽性のＰＢＭＣライセート、aHLA-DRはHLA-DRに対する阻害抗体を示す。 ＳＡＲＴ２由来のペプチドＳＡＲＴ２ 532-556で誘導されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９／１４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞株がＴ９８Ｇ細胞に対して傷害活性を有することを示す図である。

Claims (9)

1. 以下の（ａ）または（ｂ）のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチド。
   （ａ）配列番号４，６または８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
   （ｂ）配列番号４，６または８で表されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を有するペプチド。
2. （１）配列番号３、配列番号５または配列番号７で表されるポリヌクレオチド分子および（２）請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド分子からなる群より選択されるポリヌクレオチド分子。
3. 請求項１に記載のペプチドを認識する白血球。
4. 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
5. 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む腫瘍の治療剤。
6. 請求項１に記載のペプチドを含む癌細胞増殖抑制剤。
7. ＨＬＡクラスＩＩ分子と請求項１に記載のペプチドとの複合体に選択的に結合する、単離ＣＤ４陽性Ｔ細胞。
8. 癌細胞を傷害する能力を有する請求項７に記載の単離ＣＤ４陽性Ｔ細胞。
9. ＨＬＡクラスＩＩ分子と請求項１に記載のペプチドとの複合体を含む、単離抗原提示細胞。