JP2001503279A

JP2001503279A - ターゲットを定めて遺伝子を誘導発現させるための新規な構築物及びベクター

Info

Publication number: JP2001503279A
Application number: JP52223498A
Authority: JP
Inventors: マーフデイ，アブデライム; ブノワ，パトリツク; ブラネレク，デイデイエ; デネフル，パトリス; ドユベルジエ，ニコラ; ベルトウ，ロランス; オベルクス，ジヨアン; スタル，バール
Original assignee: ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2001-03-13
Also published as: ZA9710114B; FR2755699B1; HUP9904235A3; CZ163399A3; WO1998021349A1; EP0946740A1; BR9713981A; SK61499A3; AU5057898A; NO992153L; FR2755699A1; IL129593A0; KR20000053163A; US20020144302A1; NO992153D0; CA2269864A1; HUP9904235A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ターゲットを定めて遺伝子を誘導発現するための新規な構築物及び新規なペクターに関する。本発明は特に、新規なハイブリッドプロモーター、及び、試験管内、生体外または生体内の肝細胞中で遺伝子を発現させるためのその使用を記載している。

Description

【発明の詳細な説明】ターゲットを定めて遺伝子を誘導発現させるための新規な構築物及びベクター本発明は、生物学の分野、特に遺伝子発現の調節の分野に関する。より特定的には本発明は、ターゲットを定めて遺伝子を誘導発現させるための新規な構築物及び新規なベクターに関する。本発明は多くの分野、特に、組換えタンパク質の産生、トランスジェニック動物モデルの作製、細胞系の作製、スクリーニング試験の実施、または、細胞遺伝子治療の分野で有用である。遺伝子発現を調節及び管理できる手段を開発することは、生物工学が発達するための極めて重要な課題である。この課題を解決できれば、例えば細胞の増殖期と産生期とを分離することによって組換えタンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ（試験管内）産生条件を改善することができる。また、ある種の分子を選択された期間に産生し得る細胞系を同じくｉｎｖｉｔｒｏで作製することができる。例えば、欠陥ウイルスゲノムをトランスに相補するタンパク質を調節的に産生する細胞系の構築を計画することができる。調節された発現系は同じくｉｎｖｉｔｒｏで、遺伝子発現のコントロール作用をもつ分子のスクリーニング試験に使用できる。遺伝子発現のコントロールはまた、ｅｘｖｉｖｏ（生体外）またはｉｎｖｉｖｏ（生体内）の治療方法が治療用分子の産生の選択的コントロールを必要とする場合にも極めて重要である。実際に、用途次第及び導入すべき遺伝子次第では、治療効果を集中させ治療効果の拡散及び副作用を抑制するために生物のある種の組織または部分だけをターゲッティングする能力が重要である。このようなターゲッティングを実現するために、所与の細胞特異性をもつベクターを使用してもよい。ある種の細胞型については、細胞型に特異的な発現シグナルを利用してもよい。この観点から、例えばピルビン酸キナーゼ、ビリン、ＧＦＡＰをコードする遺伝子のプロモーター、腸の脂肪酸結合タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞のαアクチンのプロモーター、または、ヒトアルブミン遺伝子のプロモーターのようないわゆる特異的プロモーターが文献に記載されている。しかしながら、これらのプロモーターは、ある程度の組織特異性を有しているとしても、調節可能でないためコントロール能力が限られている。より複雑な別の系も文献に記載されている。例えば、国際特許出願ＷＯ９６／０１３１３は、テトラサイクリンによって調節される遺伝子発現系を記載している。また、Ｗａｎｇら（ＰＮＡＳ９１（１９９４）８１８０）は、ＲＵ４８６によって調節される遺伝子発現系を記載した。Ｅｖａｎｓら（ＰＮＡＳ９３（１９９６）３３４６）は、昆虫ホルモンであるエクジソンのレセプターに基づく系を記載した。しかしながら、これらの種々の系は、誘導可能ではあるが、組織特異性を有していない。そのため、これらの系は単独では遺伝子発現を所望の器官または組織にターゲッティングすることはできない。これらの系は発現を遍在的に誘導または抑制できるだけである。尚、テトラサイクリン系は、係数５末満の比較的低い調節レベルを有している。更に、これらの系はハイブリッド分子と共に機能し、少なくとも２つの構築物のコトランスフェクションを必要とする。その上、これらの系はヘテロロガス要素を使用しており、従って免疫反応を生じさせる危険がある。本発明はここに、ターゲットを定めて遺伝子を調節的に発現し得る新規な構築物を記載する。より特定的には本発明は、遺伝子を肝特異的に誘導発現し得る組換えベクターを記載する。本発明はまた、改善された調節レベルを有している新規なプロモーター構築物を記載する。従って本発明は、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子発現を肝細胞にターゲッティングするため及びこの発現を調節するために特に有効な手段を提供する。本出願は特に、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの使用に基づく。アポリポタンパク質ＡＩＩ（ａｐｏＡＩＩ）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要タンパク質成分の１つである。ａｐｏＡＩＩは主として肝臓で合成されるが、腸で合成されることを示唆する別の結果も得られている。ヒトのａｐｏＡＩＩの遺伝子はクローニングされ配列決定されている（Ｔｓａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６０（１９８５）１５２２２）。プロモーター領域は転写開始コドンの上流に約１ｋｂの長さで伸びている。プロモーター領域は、ヌクレオチド−９０３から−６８０までの処に局在する調節要素と、中間領域（ヌクレオチド−５７３から−２５５まで）及び近位領域（−１２６から−３３まで）の処に位置する多数の追加部位とを含む。核因子がプロモーターの近位及び遠位の調節要素に結合したときに最適発現が得られる。 −９１１から＋２９までの残基から成るヒトのａｐｏＡＩＩの遺伝子のプロモーターの配列を配列１によって示す。ａｐｏＡＩＩのプロモーターの調節メカニズムがヒト及び齧歯類で異なっていることは観察されていた。このプロモーターは、前者においてはフィブラートによって刺激され、後者においては阻害された。フィブラートは抗高脂血症薬としてしばしば使用される薬剤であり、化学的にはペルオキシソーム増殖物質のファミリーに属しており、齧歯類に対してはペルオキシソームの増殖に関連した肝腫脹を誘発する。フィブラートの作用は、活性化されたレセプター（ＰＰＡＲ：ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｆｉｒａｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ（ペルオキシソーム増殖物質活性化レセプター））によって介在される。該レセプターは異なる４つの核レセプター（α、β、γ、δ）のグループから成る。ＰＰＡＲは、ＰＰＲＥ（ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｆｉｒａｔｏｒＲｅｓｐｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔ（ペルオキシソーム増殖物質応答要素））と命名された特異的応答要素に結合するホルモン性核レセプターのスーパーファミリーに属している。ＰＰＲＥはβ酸化経路に関与する酵素をコードする多数の遺伝子中で同定されており、これらの酵素はフィブラートによって誘導され得ることが判明している。出願人はここに、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの双方で使用でき、フィブラートによって誘導され得る肝特異的な遺伝子発現系を開発した。より特定的には出願人は、肝向性を有しており、フィブラートによって誘導され、肝臓または肝細胞中で選択的に遺伝子を発現させ得るベクターを初めて構築した。出願人はまた、ヒトａｐｏＡＩＩの遺伝子のプロモーターに由来し、誘導性及び性能などの特性が改良された新規なプロモーターを構築した。本発明の第一の目的は、分子を肝特異的に誘導発現させる組換えベクターを提供することである。本発明のベクターの特徴は、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのコントロール下に配置された分子をコードする核酸から成る発現カセットを含むことである。特に好ましい実施態様によれば、組換えベクターは、ゲノムに挿入された発現カセットを含むアデノウイルスに由来のウイルスベクターである。このようなアデノウイルスが肝特異的に遺伝子を発現させ得ること、この発現がフィブラートによってｉｎｖｉｖｏで強力に誘導され得ること、及び、得られた発現レベルは最も強力な構成的プロモーターによってこれまでに記載された発現レベルと同等であることを出願人が実際に証明したことに特に注目されたい。本発明のウイルスが肝特異性を有するという表現は、これらのウイルスがｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏの肝細胞中で極めて選択的に遺伝子を発現し得ることを意味する。大多数の発現が肝細胞で観察される（好ましくはトランスジーンを発現する細胞の８０％以上、より好ましくは９０％以上が肝細胞である）ので、他の細胞組織または細胞型における非特異的発現も多少は許容できる。特に、矛盾するような結果が観察されることもあった従来技術と違って、本発明のウイルスは、腸内では検出可能な発現を全く誘導しないので、顕著に高い選択性を示す。これは毒性遺伝子を導入し発現させる方法にとって極めて重要である。このような毒性遺伝子に対しては極めて高いレベルの選択性が要求されるからである。更に、前述のように、従来技術に記載された誘導系は係数約５の平均誘導レベルを有している。実施例で得られた結果は、本発明のアデノウイルスが係数約１０の誘導レベルを有することを示す。誘導レベルは、ｉｎｖｉｖｏでデリバリーされる分子の量をコントロールするためにも極めて重要である。免疫原性の分子または炎症性応答を生じ易い分子の場合には分子の量の影響が大きいからである。また、生物学的効果を得るために高い濃度が必要であるような分子を発現させる場合にも分子の量をコントロールすることが極めて重要である。更に、本発明のベクターの極めて優れた別の特徴は高い発現レベルが得られることである。これは、誘導系の欠点が中程度または低い発現レベルしか得られないことにあるという定説を覆すものである。出願人は、最も強力な構成的プロモーターによってこれまでに記録されたレベルと同等のｉｎｖｉｖｏ発現レベルが本発明の系によって得られるという予想外の有利な結果を証明した。従って本発明の系は、選択性、誘導性及び性能のすべてにおいて卓越した特性を与えることに成功した初めての系である。本発明の特徴の１つは、ヒトのａｐｏＡＩＩの遺伝子のプロモーターを使用することにある。本発明の別の特徴は、アデノウイルス由来のベクターを構築することにある。本発明のベクターは、遺伝子導入、遺伝子接種、組織特異性、誘導性及び性能のすべてにおいて卓越した特性を有している。好ましくは、本発明のウイルス中で使用されるプロモーターはａｐｏＡＩＩの遺伝子のプロモーターの調節要素を含む。より特定的には、これらの要素はヒトのａｐｏＡＩＩの遺伝子の−９０３から−６８０まで、−５７３から−２５５まで、及び、−１２６から−３３までの処に局在している。特にこの点に関する変形実施態様によれば、プロモーターはａｐｏＡＩＩの遺伝子の残基−９１１から＋２９まで（配列１）を含む。勿論、もっと短い形態またはもっと長い形態のプロモーターも使用できる。例えば、プロモーターが３’側にａｐｏＡＩＩの遺伝子の転写開始部位（配列１の＋１）を含むことが重要である。逆に、このプロモーターはヌクレオチド＋３８を起点とするａｐｏＡＩＩの遺伝子の第一イントロンを含まないのが好ましい。従って好ましくは、使用されるフラグメントが、ａｐｏＡＩＩの遺伝子の残基＋５と＋３５との間、より好ましくは＋１０と＋３０との間に存在する３’末端を有している。５’末端に関して考察すると、肝臓で高い発現レベルを得るためには肝性因子の結合部位の少なくとも一部分が保存されているのが好ましい。肝性因子の結合部位はヌクレオチド−９０３から− ６８０までの処に局在する。従って、使用されるフラグメントがヌクレオチド− ９０３の上流に局在する５’末端を有しているのが好ましい。この末端は例えば、−９５０から−９１０までの領域に局在し得る。また、クローニング容量のためには、小さいサイズのプロモーター領域を使用するのが有利である。従って、 −９２５から−９１０までの領域に局在する５’末端を有するフラグメントを使用するのが好ましい。本発明の有利な変形実施態様によれば、プロモーターは、ヌクレオチド−９０３から−６８０まで（または−９０３から−７２０まで）及び−１２６から−３３までの処に局在する調節要素を含んでいるが、ヌクレオチド−５７３から−２５５までの処に局在する中間要素を含んでいない。特に好ましくは、使用されるプロモーターが残基−７１０と−１５０との間の領域に欠失を含む。特定例を挙げると、有利なプロモーターは、残基−７０８から−２１０までの欠失によって得られた配列１の変異体から成る。更に好ましくは、使用されるプロモーターは、残基−６７０と−２１０との間の領域に欠失を含む。特定例を挙げると、有利なプロモーターは、残基６５３から２１０までの欠失によって得られた配列１の変異体から成る。実施例で得られた結果は、アデノウイルスを使用した本発明の構築物が性能においてもフィブラートによる誘導性においてもａｐｏＡＩＩの天然型プロモーターよりも優れていることを実際に示す。従ってこれらの構築物は、調節特性の面でも有利であり、また、プロモーター領域が短いのでベクターのクローニング容量の面でも有利である。別の実施態様によれば、本発明のアデノウイルスは、モチーフＪの反復を含むアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの変異体をプロモーターとして含んでいる。領域Ｊの増加は、フィブラートによるプロモーターの誘導性を増進させ得るという利点も有している。領域Ｊは、配列ＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧ（配列１で下線を付けた配列２）から成る。領域Ｊは、ＡＩＩのプロモーター中のヌクレオチド−７３４から−７１６までの処に局在している。出願人はここに、領域Ｊの処で修飾されたプロモーターを含む組換えウイルスを構築した。これらのウイルスはｉｎｖｉｔｒｏでもｉｎｖｉｖｏでも同様に遺伝子の導入及び発現に特に有利な特性を有している。好ましくは、プロモーターは２〜５個のモチーフＪを含む。より好ましくは、プロモーターは３個のモチーフを含む。これらの変異体を構築するために、モチーフＪの反復をプロモーターの５’またはプロモーターの３’ に配置してもよく、あるいは、プロモーターの配列中の好ましくは天然型配列Ｊの処に挿入してもよい。更に、モチーフＪの増加を前述のような欠失と共存させるのが有利である。これによって、遺伝子発現の性能及び調節に関してより改良された特性をもつプロモーターが得られる。これらの種々の構築物は当業者に公知の分子生物学の技術に従って作製され得る。当業者は例えば、配列１を出発物質とし、適当な制限酵素を選択することによって種々の欠失を生じさせ得る。あるいは、誘発突然変異によってまたはＰＣＲによる突然変異誘発によって欠失を生じさせてもよい。また、ヌクレオチドシンセサイザーを用いて領域Ｊを人工的に合成し、ＰＣＲによってまたは適当な制限酵素による開裂及び結合によってプロモーターに挿入または融合させてもよい。これらの種々の方法は実施例で説明する。上述のように、本発明のベクターの卓越した能力は、使用されるプロモーター及びベクターの選択に由来する。アデノウイルスを使用したプロモーターのｉｎｖｉｖｏ機能が証明されたので、このような高性能ベクターの作製が可能になった。アデノウイルスは、約３６ｋｂ（キロ塩基）のサイズの直鎖状二重鎖ＤＮＡをもつウイルスである。アデノウイルスの種々の血清型が存在し、それらの構造及び特性は多少の違いを有しているが、ほぼ同様の遺伝子編制を有している。特に組換えアデノウイルスはヒト由来でも動物由来でもよい。ヒト由来のアデノウイルスとしては、グループＣに分類されるアデノウイルス、特にアデノウイルス２型（Ａｄ２）、５型（Ａｄ５）、７型（Ａｄ７）または１２型（Ａｄ１２）が好ましい。動物由来の種々のアデノウイルスのうちでは特に、イヌ由来のアデノウイルス、特にアデノウイルスＣＡＶ２の全部の菌株〔例えばマンハッタン株またはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣＶＲ−８００）〕が好ましい。その他の動物由来のアデノウイルスは、参照によって本発明に含まれる国際特許出願ＷＯ９４／２６９１４に詳細に引用されている。アデノウイルスのゲノムは特に、各末端の逆方向反復配列（ＩＴＲ）と、キャプシド形成配列（Ｐｓｉ）と、初期遺伝子と、後期遺伝子とを含む。主要な初期遺伝子は領域Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４に含まれている。これらの遺伝子のうちの領域Ｅ１に含まれている遺伝子がウイルス増殖に特に必要である。主要な後期遺伝子は領域Ｌ１〜Ｌ５に含まれている。アデノウイルスＡｄ５のゲノムはその完全配列が解読されており、データベースでアクセスできる（特にＧｅｎｅｂａｎｋＭ７３２６０参照）。また、他のアデノウイルス（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２など）でもゲノムの配列が部分的にまたは完全に解読されている。アデノウイルスを組換えベクターとして使用するために、種々の治療用遺伝子を組込んだ種々のアデノウイルス構築物が作製されている。これらの構築物の各々は、感染細胞中で複製できないようにアデノウイルスを修飾したものである。例えば、ウイルス複製に必須の領域Ｅ１が欠失し、この領域の処にヘテロロガスＤＮＡ配列が挿入された構築物が従来技術に記載されている（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ５０（１９８６）１６１）。更に、ベクターの特性を改良するために、アデノウイルスのゲノムに別の欠失または修飾を生じさせることが提案された。例えば突然変異体ｔｓ１２５は、７２ｋＤａのＤＮＡ結合性タンパク質（ＤＢＰ）を失活させるような熱変性し易い点突然変異が導入されたものである（ＶａｎｄｅｒＶｌｉｅｔら，１９７５）。別のベクターは、ウイルスの複製及び／または増殖に必須の別の領域、即ち領域Ｅ４の欠失を含む。領域Ｅ４は、後期遺伝子の発現の調節、後期核ＲＮＡの安定、宿主細胞のタンパク質の発現の減衰、ウイルスＤＮＡの複製の効率に関与するからである。従って、領域Ｅ１及びＥ４が欠失したアデノウイルスベクターでは、転写のバックグラウンドノイズ及びウイルス遺伝子の発現が極めて低減されている。このようなベクターは例えば国際特許出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８に記載されている。更に、ＩＶａ２遺伝子の処に修飾を有するベクターも記載されている（ＷＯ９６／１００８８）。本発明の好ましい実施態様では、組換えアデノウイルスはグループＣのヒトアデノウイルスである。より好ましくは、アデノウイルスＡｄ２またはＡｄ５である。本発明で使用される組換えアデノウイルスはそのゲノムの領域Ｅ１に欠失を含むのが有利である。より特定的には、領域Ｅ１ａ及びＥ１ｂの欠失を含む。具体的な例としては、（Ａｄ５のゲノムに関して）ヌクレオチド４５４−３３２８；３８２−３４４６または３５７−４０２０に関する欠失がある。好ましい変形実施態様によれば、本発明で使用される組換えアデノウイルスは更に、そのゲノムのＥ４領域に欠失を含む。特に領域Ｅ４の欠失は読取り枠全体に影響を及ぼす。具体的な例としては、３３４６６−３５５３５または３３０９３−３５５３５の欠失がある。領域Ｅ４の別の種類の欠失は国際特許出願ＷＯ９５／０２６９７及びＷＯ９６／２２３７８に記載されている。これらの特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。発現カセットは組換えゲノムの種々の部位に挿入できる。発現カセットは欠失配列に置換または付加して領域Ｅ１、Ｅ３またはＥ４の処に挿入できる。発現カセットはまた、ウイルスの産生に必要なシス配列（ＩＴＲ配列及びキャプシド形成配列）以外の任意の別の部位に挿入できる。組換えアデノウイルスは、キャプシド形成細胞系、即ち、組換えアデノウイルスのゲノムに欠損している１つまたは複数の機能をトランスに相補し得る細胞系で産生され得る。これらの細胞系の１つは例えば、アデノウイルスのゲノムの一部を組込んだ２９３細胞系である。より詳細には、２９３細胞系は、左側ＩＴＲと、キャプシド形成領域と、領域Ｅ１ａとＥ１ｂとから成る領域Ｅ１と、タンパク質ｐＩＸをコードする領域と、タンパク質ｐＩＶａ２をコードする領域と、から成るアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左端（約１１〜１２％）を含むヒトの腎胚細胞系である。この細胞系は、領域Ｅ１に関する欠陥組換えアデノウイルス、即ち、領域Ｅ１の全部または一部が欠失した組換えアデノウイルスをトランスに相補し、高い力価をもつウイルス株を産生し得る。この細胞系はまた、熱変性し易い突然変異Ｅ２を更に含むウイルス株を許容温度（３２℃）で産生し得る。領域Ｅ１を相補し得る別の細胞系も記載されており、特に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に基づく細胞系（ＷＯ９４／２８１５２）またはヒト網膜芽細胞に基づく細胞系（Ｈｕｎ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）が記載されている。更に、アデノウイルスの複数の機能をトランスに相補し得る細胞系も記載されている。特定例としては、領域Ｅ１及びＥ４を相補する細胞系（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５５９；ＣａｎｃｅｒＧｅｎ．Ｔｈｅｒ．２（１９９５）３２２；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｇｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）、領域Ｅ１及びＥ２を相補する細胞系（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）などがある。組換えアデノウイルスは通常は、ウイルスＤＮＡをキャプシド形成細胞系に導入し、次いで約２日または３日後に（アデノウイルスのサイクル速度が２４〜３６時間なので）細胞を溶解させることによって産生される。方法を実施するために導入されるウイルスＤＮＡは、任意に細菌（ＷＯ９６／２５５０６）または酵母（ＷＯ９５／０３４００）中で構築されて細胞にトランスフェクトされた完全組換えウイルスゲノムでもよい。また、キャプシド形成細胞系を感染させるために使用された組換えウイルスでもよい。また、組換えウイルスゲノムの一部分と相同ゾーンとを各々が含む複数のフラグメントの形態でウイルスＤＮＡを導入し、キャプシド形成細胞に導入後の種々のフラグメント間の相同組換えによって組換えウイルスゲノムを復元してもよい。細胞の溶解後、組換えウイルス粒子を塩化セシウム勾配遠心によって単離する。代替し得る方法は参照によって本発明に含まれるフランス特許出願ＦＲ９６／０８１６４に記載されている。肝向性を有する組換えベクターはまた、特に国際特許出願ＷＯ９６／２６２７０及びＰＣＴ／ＦＲ９６／０１４１４に記載されているようなプラスミド型の非ウイルスベクターから構築され得る。上述のように、本発明のベクターは、有益な分子を高レベルで肝特異的に調節産生し得る。有益な分子は好ましくは治療用分子である。分子はタンパク質または核酸（ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど）である。特に好ましくは、治療用分子は血流中に分泌されるタンパク質である。その例としては、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経伝達物質またはその前駆体または合成酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５など、アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（ＷＯ９４／２５０７３）、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（ＷＯ９３／０６２２３）、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＷＯ９４／２４２９７）、血液凝固に関与する因子：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子などをコードする遺伝子、あるいは、天然または人造の免疫グロブリンの全部または一部（Ｆａｂ、ＳｃＦｖなど、ＷＯ９４／２９４４６）がある。タンパク質の分泌を確実にするためには、発現カセットが適当なシグナル配列を含むのが有利である。特に、分泌されたタンパク質の天然シグナル配列が肝細胞中で機能するならば、このシグナル配列が有利である。また、適当なヘテロロガス配列でもよい。例えば、アポリポタンパク質ＡＩのシグナル配列を使用し得る。更に、カセットは一般に転写終了及びポリアデニル化のシグナルを示す特定領域を３’に含んでいる。例えば、ＳＶ４０ウイルスのポリＡ部位が使用される。勿論、当業者はその平均的な専門知識の範囲内でこれらのシグナルを選択し得る。本発明はまた、上述のようなベクターを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、外用、経口、非経口、鼻孔内、静注、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路で投与される製剤の形態に調製できる。好ましくは医薬組成物は、医薬として許容される注射剤用ビヒクルを含有している。ビヒクルは特に、等張性の無菌の生理的塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、または、これらの塩の混合物）でもよく、または、必要に応じて滅菌水もしくは生理的血清を添加して注射可能な溶質を復元し得る乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でもよい。その他の賦形剤として例えばヒドロゲルを使用し得る。このヒドロゲルは、細胞障害性でない生体親和性の任意の（ホモまたはヘテロ）ポリマーから調製できる。このようなポリマーは例えば国際特許出願ＷＯ９３／０８８４５に記載されている。記載のポリマーの幾つか、特にエチレンオキシド及び／またはプロピレンオキシドから得られたポリマーは市販されている。注射剤として使用されるウイルスの用量は種々のパラメーター、特に、使用される投与形態、関連する疾病、発現させる遺伝子、あるいは、所望の治療期間などに応じて決定される。一般には、本発明の組換えアデノウイルスを１０４〜１０１４ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕで含む形態に製剤して投与する。ｐｆｕ（“プラーク形成単位”）なる用語は、アデノウイルス溶液の感染能に相当し、適当な細胞培養物を感染させ通常は１５日後に感染細胞のプラークの数を測定することによって決定する。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の決定方法は文献に詳細に記載されている。本発明のベクター（特にアデノウイルス）はまた、肝特異性を有するので肝臓病の動物モデルの作製にも利用できる。更に本発明はまた、上述のようなベクター（特にアデノウイルス）によって修飾されたすべての細胞に関する。これらの細胞は組換えタンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ産生に使用し得る。これらの細胞はまた、国際特許出願ＷＯ９５／１４７８５に記載の方法に従って生物の体内に移植され得る。これらの細胞は好ましくは肝細胞である。本発明の目的は更に、組換えタンパク質の産生方法を提供することである。方法は、所望のタンパク質をコードする発現カセットを含むベクター、組換えアデノウイルスまたは対応するウイルスゲノムを細胞集団に感染させるかまたはトランスフェクションする段階と、この組換え細胞集団を培養する段階と、産生されたタンパク質を回収する段階とから成る。本発明方法を実施するためには、肝起原の細胞を使用するのが有利である。これは樹立細胞系でもよくまたは一次培養物でもよい。本発明はまた、改良された発現特性を有するヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの新規な変異体に関する。本発明のこれらの変異体は特に前述のようなモチーフＪの反復を含む。これらの変異体は更に、天然型プロモーターの残基−７１０から−１５０までの領域に欠失を有するのが有利である。本発明はまた、アポリポタンパク質ＡＩＩのプロモーターの１つまたは複数のモチーフＪから成る調節領域と別のプロモーターに由来の肝特異的プロモーター領域とを含むヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターに由来の肝特異的誘導プロモーターに関する。好ましくは、肝特異的プロモーター領域はヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターとは異なる肝特異的プロモーターに由来する。好ましくはこのプロモーター領域は、血清アルブミンのプロモーター、アポリポタンパク質ＡＩのプロモーター、アポリポタンパク質Ｃｓのプロモーター、アポリポタンパク質Ｂ１００のプロモーター、フィブリノーゲンのガンマ鎖のプロモーター（ＪＢＣ２７０（１９９５）２８３５０）、ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼの遺伝子のプロモーター（ＰＮＡＳ９３（１９９６）７２８）、ＡＭＢＰの遺伝子のプロモーター（ＮＡＲ２３（１９９５）３９５）、Ｘ因子の遺伝子のプロモーター（ＪＢＣ２７１（１９９６）２３２３）、シトクロムＰ４５０１Ａ１のプロモーター（ＰＮＡＳ９２（１９９５）１１９２６）、Ｂ型肝炎のウイルスのプロモーター（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７（１９９６）１８７）またはα−抗トリプシンのプロモーターから選択されたプロモーターから成る。使用されるプロモーター領域は好ましくは、肝性発現に必要十分な領域（最小プロモーター）から成る。この領域は一般に、ＴＡＴＡホックスを含み、引用の参考文献に示されているような慣用の分子生物学の技術で調製される。例えば、Ｘ因子の遺伝子のプロモーターの最初の２０９個の塩基対は肝性発現を与えるために十分である（ＪＢＣ、前出）。また、フィブリノーゲンのガンマ鎖のプロモーターの−２０から −２３まで、−５４から−５７まで、及び、−６６から−７７までのフラグメントは、肝特異的発現を可能にする最小プロモーターを構成する。これらの領域を前述の方法に従って実施例に示したように領域Ｊ（好ましくは１〜５）に接合させることによって肝特異的誘導プロモーターを作製し得る。これらのプロモーターは更に、発現レベルを向上させる“エンハンサー”型の調節配列を追加の配列として含み得る。肝特異的プロモーター領域はまた、エンハンサー要素に結合して肝特異的発現を与える遍在性プロモーターから構成されてもよい。この場合、肝特異性を与えるエンハンサー要素は、アポリポタンパク質Ｅ／Ｃ −１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１９９３）８２２１−８２２９及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）２２５７７−２２５８５）、アルブミンのエンハンサー（Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，３（１９９６）８０２−８１０）、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎｅ）のエンハンサー（Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５（１９９５）１３６４−１３７６）、Ｂ型肝炎ウイルスのエンハンサー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７（１９９６）１８７）から選択されるか、または、ＨＮＦ（肝性核因子）部位、孤立レセプターへの結合部位、ステロイドホルモンに対するレセプター成分（Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，７（１９９６）１５９−１７１）などを含む人工エンハンサーから選択され得る。遍在性プロモーターは組織特異的でない任意のプロモーターである。特に、ウイルスプロモーターまたはドメスティック（“ハウスキーピング”）プロモーターがある。ウイルスプロモーターとしては特に、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ１９８２；２：１０４４−１０５１）；ラウス肉腫ウイルスＲＳＶのＬＴＲ（ＰＮＡＳＵＳＡ１９８２；７９：６７７７−６７８１）；ヒトサイトメガロウイルスのＣＭＶ−ＩＥ（Ｇｅｎｅ１９８６；４５：１０１−１０５）；モロニーマウス白血病ウイルスＭｏＭＬＶのＬＴＲ（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９９６；３：８０６−８１０）及びチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ＴＫのプロモーター（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ１９８０；８：５９４９−５９６４）がある。ドメスティツクプロモーターとしては、ヒトの延長因子ＥＦ−１アルファ遺伝子のプロモーター（Ｇｅｎｅ１９９３，１３４：３０７−３０８）、ニワトリのベータアクチン（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９８３；１１：８２８７−８３０１）、マウスのＲＮＡポリメラーゼ１１のＰＯＬＩＩプロモーター（ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１９８７；７：２０１２−２０１８）、ホスホグリセレートキナーゼＰＧＫ（Ｇｅｎｅ１９８７；６１：２９１−２９８）、ヒストンＨ４（ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１９８５；５：３８０−３９８）、ヒトのヒドロキシメチルグルタリルＨＭＧのＣｏＡ：レダクターゼ（ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１９８７；７：１８８１−１８９３）、ラットのヘキソキナーゼＩＩ、ＨＫ２（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６９１８−１６９２５）及びプリオンＰＲＰ(Ｖｉｒｕｓｇｅｎｅｓ１９９２；６：３４３−３５６)がある。当業者に公知の他の任意の遍在性プロモーターも使用できる。肝特異的プロモーター領域は分子生物学で慣用の技術に従って遍在性プロモーターの全部またはその機能部分を上記のエンハンサー要素に結合させることによって得られる。特に、ヒトａｐｏＡＩＩのプロモーターの−７３７から−７１５までの塩基を含む部位Ｊに対応するオリゴヌクレオチドを、ｐＩＣ２０ＨのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローニングし（Ｇｅｎｅ１９８４；３２：４８１− ４８５）、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、選択された遍在性プロモーター、例えばプラスミドｐＢＬＣＡＴ４（ＮｕｃｌＡｃｉｄＲｅｓ１９８７；１５：５４９０）中のチミジンキナーゼ（ＴＫ）のプロモーターの５’にサブクローニングして、有益な遺伝子の上流に部位Ｊと遍在性プロモーターとを含むベクターを作製し得る。肝性エンハンサーをプロモーターの５’またはポリアデニル化部位の３’に付加してもよい。これらの変異体は発現性能、組織特異性及び誘導性などの特性をすべて有しており、従って極めて有利である。これらの種々の変異体は前述及び実施例に後述するように有益な遺伝子のｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ発現のために使用できる。本発明はまた、上記のようなプロモーターのコントロール下の有益な遺伝子から成る発現カセットを含む組換えベタターに関する。本発明はまた、同時的または時差的に使用するための上記のような組換えベクターとＰＰＡＲのアクチベーターとから成る組成物に関する。組換えベクターは好ましくは土記のような組換えアデノウイルスを含み、ＰＰＡＲのアクチベーターは好ましくはＰＰＡＲαのアクチベーターである。特に好ましく使用されるＰＰＡＲαのアクチベーターは、フィブラート、及び、部位Ｊに結合している転写因子の発現を増進させる任意の化合物である。好ましいフィブラートとしては例えば、フィブリン酸とその類似体、特にジェムフィブロジル（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１１４（１）（１９９５）６１）、ベザフィブラート（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２１（１９９５）１０２５）、シプロフィブラート（ＢＣＥ＆Ｍ９（４）（１９９５）８２５）、クロフィブラート（ＤｒｕｇＳａｆｅｔｙ１１（１９９４）３０１）、フェノフィブラート（ＦｅｎｏｆｉｂｒａｔｅＭｏｎｏｇｒａｐｈ，ＯｘｆｏｒｄＣｌｉｎｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９５）、クリノフィブラート（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．４４（６）（１９９３）１３５２）、ピリニキシン酸（Ｗｙ−１４，６４３）、または、５，８，１１，１４ −エイコサテトラエン酸（ＥＴＹＡ）がある。これらの種々の化合物はｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏの生物学的及び／または薬理学的使用に適合する。部位Ｊに結合している転写因子の発現を増進させる化合物としては例えば、ＲＸＲ及びＨＦＮ４の発現を活性化するレチノイドがある。更に、本発明の組成物は複数のＰＰＡＲアクチベーターを併存させて含むことができ、特にフィブラートまたはフィブラート類似体とレチノイドとを併存させて含み得る。上述のように、ベクター及びアクチベーターは同時使用されてもよくまたは時差使用されてもよい。更に、これらは別々に包装されてもよい。好ましい実施態様によれば、ベクターとアクチベーターとを別々に包装し時差的に使用する。特に好ましくは、ベクターを先に使用し、ＰＰＡＲのアクチベーターを後で使用する。使用という用語は、ベクターまたはアタチベーターをｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏの細胞に接触させることを意味する。ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏの接触では、上記のような細胞集団をベクターと共に（例えば１０６細胞あたり０．０１〜１，０００μｇのベクター、即ち０．１〜１，０００のウイルス感染多重度（ＭＯＩ））でインキュベートし、次いでアクチベーター（通常は１０−３ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜５００μＭの濃度範囲）と共にインキュベートする。例えばトランスジェニック動物を作製するためまたは有益な遺伝子を肝特異的に発現させるために行うｉｎｖｉｖｏの接触では一般に、ベクターの投与（上記の条件下）及びアクチベーターの投与を順次に行う。この場合のアクチベーターは例えば餌に混入させるか（特に動物の場合）またはゼラチンカプセルの形態で（ヒトの場合）経口投与し得る。動物に対する１日あたりの投与用量は約０．０１〜１％（重量／重量）、好ましくは０．２〜０．５％（重量／重量）である。例えばマウスに対する典型的な１日あたりの投与用量は５０ｍｇである。ヒトに対するフェノフィブラートの典型的な１日あたりの投与用量は１００〜３００ｍｇ、好ましくは約２００ｍｇであり、この用量は約１５μｇ／ｍｌの血漿濃度に相当する（Ｖｉｄａｌ，１９９６）。更に、ベクター及び／またはアクチベーターの投与／インキュベーションを繰返して行ってもよい。本発明を以下の実施例に基づいてより詳細に説明する。これらの実施例が本発明の非限定的な代表例であることは理解されよう。図面の簡単な説明図１は、ａｐｏＡＩＩのプロモーター及び欠失形態の構造を示す。図２は、領域Ｊの複製方法を示す。図３は、５’に領域Ｊの複製を有しておりかつ任意に内部欠失を有しているａｐｏＡＩＩのプロモーターの構造を示す。図４は、内部に領域Ｊの複製を有しておりかつ任意に内部欠失を有しているａｐｏＩＩのプロモーターの構造を示す。図５は、組換えアデノウイルスを表す。図６は、組換えアデノウイルスのｉｎｖｉｖｏの誘導性及び性能を表す。分子生物学の汎用技術プラスミドＤＮＡの分取的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロースケルまたはアクリルアミドゲル上の電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール／クロロホルム抽出、塩培地中のＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノールによる沈殿、大周菌の形質転換、などの分子生物学で慣用の方法は当業者に公知であり、文献にも詳細に記載されている〔ＭａｎｉａｔｉｓＴ.ら,“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ,ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ,Ｎ.Ｙ.,１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ. Ｍ.ら(ｅｄｓ．)，“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７〕。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣの系統のプラスミド及びＭ１３シリーズのファージは市販されている（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。結合のためには、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル電気泳動によってＤＮＡフラグメントをサイズに基づいて分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈殿させ、次いで製造業者の指示通りに用いたＴ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートする。大脳菌のＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示通りに用いて５’突出末端を埋め戻す。製造業者の指示通りに用いたＴ４ファージのＤＮＡポリメラーゼの存在下で３’突出末端を破壊する。ヌクレアーゼＳ１による調節処理によって５’突出末端を破壊する。合成オリゴデオキシヌクレオチドによるｉｎｖｉｔｒｏの突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒら〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４〕によって開発された方法に従って行う。いわゆるＰＣＲ法〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．＆ＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０〕によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、“ＤＮＡサーマルサイクラー”（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を製造業者の指示通りに使用して行う。ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒ−ｓｈａｍによって販売されているキットを使用し、Ｓａｎｇｅｒらによって開発された方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７〕によって行う。実施例実施例１：ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのクローニングこの実施例は、ヒトａｐｏＡＩＩの遺伝子のプロモーターのクローニングを記載する。勿論、このプロモーターをリクローニングするために任意の他の技術を使用してもよい。更に、クローニングしたフラグメントから慣用の分子生物学の技術によってもっと短い５’及び／または３ ’の変形を作製することも可能である。１．１．−９１１／＋２９のフラグメントのクローニングヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩのプロモーターをヒトのゲノムＤＮＡからＰＣＲによってクローニングした。先ずプロモーターの５’にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し次いで３’にＢａｍＨＩ部位を導入するプライマーＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴ（配列３）及びＣＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧ（配列４）は、−９１１位から＋２９位までのプロモーターをクローニングすることが可能であった。プロモーターの配列を配列決定によって確認し（配列１）、転写活性を確認するためにＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをベクターｐＢＬＣＡＴ５に導入する。１．２．−９１１／＋１６０のフラグメントのクローニングまた、ａｐｏＡＩＩの残基−９１１／＋１６０のプロモーターを含むフラグメントをゲノムバンクから入手し、ベクターｐＢＬＣＡＴ５にクローニングした。実施例２：ＡＩＩのプロモーターの変異体の構築２．１．切断形態の作製この実施例は、ヌクレオチド−９０３から−７２０まで及び−１２６から−３３までの処に局在する調節要素の領域に内部欠失を含むａｐｏＡＩＩのプロモーターの変異体の構築を記載する。これらの変異体を実施例１に記載のフラグメント−９１１／＋２９及び−９１１／＋１６０から構築した。フラグメント−９１１／＋２９または−９１１／＋１６５の形態の完全プロモーターを含むベクターｐＢＬＣＡＴ５を出発物質とし、配列５’−ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＣＴＴＡ−３’（配列５）の−２１０／−１９８のオリゴヌクレオチド及びＣＡＴ遺伝子の内部オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって−２１０から＋２９までまたは−２１０から−１６０までの領域が得られた。得られたフラグメントをプラスミドｐＢＬＣＡＴ５にクローニングして、プラスミド−２１０／＋１６０ＡＩＩ−ＣＡＴ及び−２１０／＋２９ＡＩＩ−ＣＡＴを作製した。−９１１から−６５３までの遠位領域（Ｎ−１）は、−９１１から＋２９までのフラグメントを酵素ａｌｕＩで消化することによって得られた。次に、得られたフラグメントをプラスミド−２１０／＋１６０ＡＩＩ−ＣＡＴ及び−２１０／＋２９ＡＩＩ−ＣＡＴにクローニングした。−９１１から−７０８までの遠位領域（Ｎ−Ｊ）は、配列５’−ＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＧ−３’（配列６）のオリゴヌクレオチド−７０８／−７２２をプライマーとして用いたＰＣＲによって得られた。次に、得られたフラグメントをプラスミド−２１０／＋１６０ＡＩＩ−ＣＡＴ及び−２１０／＋２９ＡＩＩ−ＣＡＴにクローニングした。プロモーターの構造を図１に示す。２．２．部位Ｊの複製この実施例は、領域Ｊが反復されたＡＩＩのプロモーターの変異体の構築を記載する。部位Ｊに対応する以下の２つのオリゴヌタレオチドをＤＮＡシンセサイザーを使用して合成した：オリゴ１：５’−ｇａｔｃｃｔＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧａ−３ ’（配列７）；及びオリゴ２：５’−ｇａｔｃｔＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＧＡａｇ−３’（配列８）。これらのオリゴヌクレオチドは３’末端のＢａｍＨＩ部位及び５’末端のＢｇｌＩＩ部位を再生する。これらのオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズし、得られたフラグメントをベクターｐＩＣ２０ＨのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした（図２）。得られたプラスミドｐＩＣ２０Ｈ−Ｊを分析し、挿入された部位Ｊのコピー数及び夫々の方向を判定した。以下のプラスミド： −部位Ｊの単一コピーを含むプラスミド； −同じ方向の部位Ｊの２つのコピーを含むプラスミド；及び −逆方向の部位Ｊの２つのコピーを含むプラスミド：を選択した。。５’に反復モチーフＪを含むａｐｏＡＩＩのプロモーターの変異体を構築するために、上記のプラスミドに含まれているインサートをＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態で切出し、ａｐｏＡＩＩのプロモーターまたは実施例２．１．に記載の変異体の５’のＨｉｎｄＩＩ部位の処にクローニングした。得られたプロモーターの構造を図３に示す。反復モチーフＪを内部に含むａｐｏＡＴＩのプロモーターの変異体を構築するために、上記プラスミドに含まれているインサートを適当な制限フラグメントの形態で切出し、次いでａｐｏＡＩＩのプロモーター（実施例１）または実施例２．１．に記載の変異体中の、天然型プロモーターの天然型Ｊ領域と−１２６−３３の調節領域との間の対応する部位の処にクローニングした。得られたプロモーターの構造を図４に示す。最終構築物中の領域Ｊのコピー数をプラスミドの選択によって決定する。実施例３：ａｏＡＩＩのプロモーターの変異体の機能試験肝細胞系としてＨｅｐＧ２細胞を用いたトランスフェクションによってプロモーターの機能試験を実施した。非肝細胞系としてＨｅｌａ細胞を用いて対照実験を行った。ＨｅｐＧ２細胞に対するトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法によって５０〜６０％の集密度で行った。 −被験プラスミドと、 −ＰＰＡＲα発現プラスミド（ＰＢＫ−ＣＭＶ−ＰＰＡＲα）または対応するブランクプラスミド（ＰＢＫ−ＣＭＶ）と、 −トランスフェクション効率の対照となる０．５μｇのβ−ｇａｌ発現プラスミド（ＣＭＶ−β−Ｇａｌ）と、から成るプラスミド混合物で細胞をコトランスフェクトした。どのトランスフェクションでもＤＮＡの総量を同量にした。トランスフェクションの４時間後、細胞をＰＢＳバッファで洗浄し、次いでフィブラート（Ｗｙ− １４６４３、１μＭ）と共に２４時間インキュベートする。次いで、Ｇｏｒｍａｎらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９８２）１０４４）に従ってＣＡＴ活性を測定する。次いで結果を、β−Ｇａｌの発現によって測定されたトランスフェクション効率に対する比として表す。２組の実験で得られた結果を以下の表１及び２に示す。表１：肝細胞に対するプロモーターの活性表２：肝細胞に対するプロモーターの活性これらの結果は、プロモーター内部のモチーフＪの複製がプロモーターの性能を変化させないこと、及び、フィブラートによるプロモーターの誘導を極めて有意に増進させることをはっきりと示す。更に、Ｈｅｌａ細胞で行った対照実験では、フィブラート及びＰＰＡＲによる誘導は全く観察されなかった。このことは、本発明のプロモーターがその組織特異性を保存していることを示す。従って、これらの結果は、本発明のプロモーターが高性能であり、高度に誘導性であり、肝細胞特異的であることを示す。更に、プロモーターｐｈＡ−ＩＩＮ−Ｉ（Ｊ３）；ｐｈＡ−ＩＩ’Ｎ−Ｉ（Ｊ３）；ｐｈＡ−ＩＩＮ−Ｊ（Ｊ３）；ｐｈＡ−ＩＩ’Ｎ−Ｊ（Ｊ３）；ｐｈＡ −ＩＩＮ−Ｉ（Ｊ３ｉ）；ｐｈＡ−ＩＩ’Ｎ−Ｉ（Ｊ３ｉ）；ｐｈＡ−ＩＩＮ−Ｊ（Ｊ３ｉ）及びｐｈＡ−ＩＩ’Ｎ−Ｊ（Ｊ３ｉ）は天然型のａｐｏＡＩＩのプロモーターに比較してサイズが小さいという利点を有している。このため、遺伝子の導入及び／または発現に用いられるベクター中のクローニング容量が大きいという利点が得られる。実施例４：肝特異的誘導アデノウイルスの構築この実施例は、極めて高い発現レベルを与える肝特異的誘導アデノウイルスの構築を記載する。これらのアデノウイルスは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏの遺伝子発現に有用である。記載のアデノウイルスを血清型Ａｄ５から構築した。勿論他の任意の血清型を使用でき、特に血清型Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２及びＣＡＶ２を使用できる。ウイルスゲノムの左側部分を含むシャトルベクターとウイルスゲノムの右側部分を含む直鎖化アデノウイルスＤＮＡとの相同組換えをパッケージング細胞系中で行わせることによってアデノウイルスを構築した。４．１．シャトルベクターの構築構築されたシャトルベクターは、ａｐｏＡＩＩのプロモーターと分泌分子：アポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡＩ）をコードする核酸とから成る発現カセットを含む。このベクターは更に、ウイルスゲノムの左側部分、即ち、左側ＩＴＲと組換え可能領域とを含む。アデノウイルスの構築に使用できるシャトルベクターは、プラスミドｐＣＯ５（ＷＯ９６／２２３７８）と、ａｐｏＡＩのイントロンとａｐｏＡＩのｃＤＮＡとをラットのアルブミンのプロモーターのコントロール下に含むプラスミドｐＩＣ２０Ｈ−Ａｌｂ−Ｕ−ＡＩ−ＳＶ４０と、実施例１に記載のようなａｐｏＡＩＩのプロモーターまたは実施例２に記載の変異体を含むプラスミドｐＢＬＡＩＩＣＡＴ５とから構築した。（ａ）ｐＩＣ２０Ｈ−Ａｌｂ−Ｕ−ＡＩ−ＳＶ４０の構築２つのプライマーＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡ（配列９）及びＣＧＡＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧ（配列１０）は、ＳＶ４０のポリアデニル化配列を後期方向で増幅し得る。プライマー５’はこの配列の上流にＮｏｔＩ部位を導入し、プライマー３’はＮｒｕＩ部位の半分を導入する。得られたＰＣＲフラグメントをクレノウで処理して平滑末端を作製し、ＳｍａＩ及びＮｒｕＩで開裂しておいたベクターｐＩＣ２０ＨにＮｒｕＩ部位を再生する方向でクローニングする。得られたプラスミドをｐＩＣ２０Ｈ−ＳＶ４０と命名する。アポリポタンパク質ＡＩのミニジーンを含む構築物ｐＸＬ２３３６は既に記載されていた（ＷＯ９４／２５０７３）。ＰＣＲフラグメントをｐＸＬ２３３６からプライマ−ＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣ（配列１１）及びＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧ（配列１２）を用いて増幅する。これらのプライマー配列はそれそれ、ＡｐｏＡＩの第一エキソンの上流にＢａｍＨＩ、ＡｐｏＡＩのコーディング配列の下流にＮｏｔＩ部位を導入する。ＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その配列を確認する。ａｐｏＡＩのｃＤＮＡ及び第一イントロンを含むＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩフラグメントを次に、プラスミドｐＩＣ２０Ｈ−ＳＶ４０の同じ部位にクローニングして、プラスミドｐＩＣ２０Ｈ−ＡＩ−ＳＶ４０を作製する。次に、オリゴヌクレオチドＣＡＣＧＴＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣ（配列１３）とＣＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡ（配列１４）とを互いにハイブリタイズさせ、ｐＩＣ２０Ｈ− ＡＩ−ＳＶ４０のＤｓａＩ部位にクローニングし、このクローニングによって作製されたＰｍｌＩ部位がイントロン側に存在し、ＤｓａＩ部位が他端で再生されるようにする。これらのオリゴヌクレオチドは、βグロビンのメッセンジャ−ＲＮＡの５’非翻訳部分のフラグメントを導入し得る。得られたプラスミドをｐＩＣ２０Ｈ−Ｕ−ＡＩ−ＳＶ４０と命名する。最後に、Ｆ．Ｔｒｏｎｃｈｅら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ，１９８９，４７５９−４７６６）によって記載されたラットのアルブミンのプロモーターをクレノウで処理することによって得られたＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＢａｍＨＩで開裂し同じくクレノウで処理したプラスミドｐＩＣ２０Ｈ−Ｕ −ＡＩ−ＳＶ４０に適正な方向でクローニングすることによってプラスミドｐＩＣ２０Ｈ−Ａｌｂ−Ｕ−ＡＴ−ＳＶ４０を作製した。（ｂ）シャトルベタターの構築オリゴヌクレオチドＣＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧ(配列１５)及びＣＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＧＣＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＡ（配列１６）を互いにハイブリダイズさせ、ＳｐｈＩ付着末端とＨｐａＩＩ付着末端とを形成する。このフラグメントを、ＡｐｏＡＩのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＣ２０ＨＡｌｂ−Ｕ−ＡＩ−ＳＶ４０のフラグメントＨｐａＩＩ／ＤｒａＩＩ（４７６／１５１８）及び同じプラスミドのフラグメントＤｒａＩＩＩ／ＳｐｈＩ（１５１８／２３９）と共に３成分結合させる。得られたプラスミドをｐＸＬ２６９９と命名する。この構築によって、ａｐｏＡＩのｃＤＮＡ＋イントロンから成るフラグメントの上流にＣｌａＩと適合するＢＳｔＢＩ部位が形成される。ＡｐｏＡＩのｃＤＮＡを含むｐＸＬ２６９９のフラグメントＢｓｔＢＩ／ＳａｌＩを、ＣｌａＩとＳａｌＩとによって開裂したプラスミドｐＣＯ５にクローニングする。得られたプラスミドをｐＣＯ５−Ｕ−ＡＩ−ＳＶ４０と命名する。選択されたａｐｏＡＩＩのプロモーター（完全プロモーターまたは変異体）を対応するプラスミドｐＢＬＡＩＩＣＡＴ５からＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの形態で切出し、クレノウ処理後にプラスミドｐＣＯ５−Ｕ−ＡＩ−ＳＶ４０のＥｃｏＲＶ部位にクローニングして、シャトルベクターｐＸＬＰｒｏｍＡＩＩ／ＡＩを作製する。この結果として以下のベクターが得られる。シャトルベクタープロモーターの種類これらのベクターを２９３細胞系またはＣｏｓｌ細胞系に一過性トランスフェクションすることによってヒトａｐｏＡＩの発現を確認する。勿論、シャトルベクター中のヒトのアポリポタンパク質ＡＩをコードする核酸を有益な分子をコードする他の任意の核酸で容易に置換し得る。４．２．アデノウイルスの構築一方のフラグメント（領域Ｅ１に欠失を有している実施例４．１．に記載のシャトルベクター）が組換えウイルスのゲノムの左側部分を含み、他方のフラグメント（任意に領域Ｅ４及び／またはＥ３に欠失を有している）が組換えウイルスのゲノムの右側部分を含む２つのＤＮＡフラグメントを適当な細胞中でコトランスフェクションし、その後の相同組換えによってアデノウイルスを作製した。（ａ）領域Ｅ１に欠失をもつ欠陥アデノウイルスの構築ウイルスＡｄ−ＲＳＶ−βＧａｌのＤＮＡとシャトルベクターｐＸＬＡＩＩ／ＡＩとのｉｎｖｉｖｏ相同組換えを以下のプロトコルで行ってアデノウイルスＡｄ−ＡＩＩ／ＡＩを作製した。ＢｓｔＸＩによって直鎖化したシャトルベクターｐＸＬＡＩＩ／ＡＩと酵素ＣｌａＩによって直鎖化したウイルスＡｄ−ＲＳＶ−βＧａｌのＤＮＡとを、リン酸カルシウムの存在下で２９３細胞系にコトランスフェクトし、相同組換えを惹起した。得られた組換えアデノウイルスを次に、プラーク精製によって選択した。単離後、組換えアデノウイルスのＤＮＡを２９３細胞系中で増幅させると、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌの力価をもつ未精製の組換え欠陥アデノウイルスを含む培養上清が得られる。ウイルス粒子を次に公知の技術（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）に従って塩化セシウム勾配遠心またはクロマトグラフィー（ＦＲ９６０８１６４）によって精製する。アデノウイルスＡｄ−ＡＩＩ／ＡＴは２０％のグリセロール中で−８０℃で保存できる。組換えゲノムの構造を図５に示す。同じ方法を使用し、実施例４．１．に記載のシャトルベクターを出発材料として種々の形態のプロモーターＡＩＴを担持するアデノウイルスを構築できる。（ｂ）領域Ｅ１及びＥ４に欠失をもつ欠陥アデノウイルスの構築アデノウイルスのＥ１及びＥ４の機能をトランスに相補し得るＩＧＲＰ２細胞（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５５９）に、ＢＳｔＸ１で消化した５ｍｇのシャトルベクターと、酵素ＣｌａＩで消化した領域Ｅ４の機能的欠失を含むウイルス（例えばＡｄ２ｄｌ８０８、Ａｄ５ｄｌ１００４、Ａｄ５ｄｌ１００７またはＡｄ５ｄｌ１０１４）の１０ｍｇのＤＮＡとをコトランスフェクトする。細胞変性効果の出現後、ＩＧＲＰ２細胞上でプラークを形成させるために、固形培地で少なくとも２回の連続する平板培養サイクルを行ってウイルスを精製する。所望のウイルスの感染（Ｅ１及びＥ４の双方の欠失を示すＤＮＡの分析）に対応するプラークを連続感染サイクルで増幅する。塩化セシウム勾配で精製することによって高力価の原液を調製する。当業者に公知の慣用の技術によってウイルスを−８０℃で保存する。実施例５：組換えアデノウイルスのｉｎｖｉｖｏ活性この実施例は、ｉｎｖｉｖｏ投与後の本発明のアデノウイルスの機能的特性を記載する。５×１０９ｐｆｕのウイルスＡｄ（ＡｐｏＡＩＩｐｒｏｍ−ＡｐｏＡＩ−ＳＶ４０）及びＡｄ（ＲＳＶ−ＡｐｏＡＩ−ｂＧＨ）をそれぞれ８匹及び３匹のマウスＣ５７ｂｌ６に注射した。ウイルスＡｄ（ＡｐｏＡＩＩｐｒｏｍ−ＡｐｏＡＩ −ＳＶ４０）を注射したマウスのうちの４匹に対しては、フェノフィブラートを０．５％（重量／重量）の割合で餌に混合して投与した。ヒトａｐｏＡＩ及びＨＤＬ−コレステロールの血漿濃度を毎週測定した。得られた結果を図６に示す。ウイルスＡｄ（ＡｐｏＡＩＩｐｒｏｍ−ＡｐｏＡＩ−ＳＶ４０）を注射したマウスではａｐｏＡＩの血漿レベルは検出閾値（１０ｍｇ／ｄｌ）を下回っていた。しかしながら、ウイルスＡｄ（ＡｐｏＡＩＩｐｒｏｍ−ＡｐｏＡＩ−ＳＶ４０）を注射しフェノフィブラートで処理したマウスではａｐｏＡＩの血漿レベルが８１±０．１７ｍｇ／ｄｌであり、ウイルスＡｄ（ＲＳＶ−ＡｐｏＡＩ−ｂＧＨ）を注射したマウスでは８４±１５ｍｇ／ｄｌであった。これらの結果は、これらの条件下でａｐｏＡＩＩのプロモーターの誘導が少なくとも８倍になったことを示す。ＨＤＬ−コレステロールのレベルは、ウイルスＡｄ（ＡｐｏＡＩＩｐｒｏｍ− ＡｐｏＡＩ−ＳＶ４０）を注射したマウスでは変化していなかった（５２±２ｍｇ／ｄｌ）。このレベルは非処理動物と同じレベルである。これに反して、ウイルスＡｄ（ＲＳＶ−ＡｐｏＡＩ−ｂＧＨ）を注射したマウス及びウイルスＡｄ（ＡｐｏＡＩＩｐｒｏｍ−ＡｐｏＡＩ−ＳＶ４０）を注射しフェノフイブラートで処理したマウスではそれぞれ、７日後のＨＤＬ−コレステロールのレベルが８８ ±１４ｍｇ／ｄｌ及び１２１±２２ｍｇ／ｄｌまで増加した（図６）。これらの結果は、アデノウイルスを使用した本発明のプロモーターがｉｎｖｉｖｏで卓越した性能、誘導性、肝特異性などの特性を示すことを証明する。これらの特性にアデノウイルスの優れた遺伝子導入性が付加されるので、本発明のベクターは遺伝子を導入及び発現するために極めて有利な性能を有している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月１５日（１９９８．１２．１５）【補正内容】請求の範囲１．分子を肝特異的に誘導発現させるための組換えベクターであって、ヒトのアポリポタンパタ質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのコントロール下に配置された分子をコードする核酸から成る発現カセットを含むことを特徴とする組換えベクター。２．プロモーターが、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−９０３から−６８０まで、−５７３から−２５５まで、及び、 −１２６から−３３までの処に局在する調節要素を含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えベクター。３．プロモーターの３’末端が、ａｐｏＡＩＩ遺伝子の残基＋５と＋３５との間、より好ましくは＋１０と＋３０との間に存在することを特徴とする請求項１または２に記載の組換えベクター。４．プロモーターの５’末端が、ａｐｏＡＩＩ遺伝子の残基−９５０から−９０５までの範囲、好ましくは−９２５から−９１０までの範囲に存在することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の組換えベクター。５．プロモーターが配列１（残基−９１１から＋２９まで）を含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えベタター。６．プロモーターが、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−９０３から−６８０まで、または−９０３から−７２０まで、及び、−１２６から−３３までの処に局在する調節要素を含んでいるが、ヌクレオチド−５７３から−２５５までの処に局在する中間要素を含んでいないことを特徴とする請求項１、３または４に記載の組換えベクター。７．プロモーターが、残基−６７０と−２１０との間の領域に欠失、好ましくは残基−６５３から−２１０までの欠失を含むことを特徴とする請求項６に記載の組換えベタター。８．プロモーターが、残基−７１０と−１５０との間の領域に欠失を含むことを特徴とする請求項６に記載の組換えベクター。９．プロモーターが、残基−７０８から−２１０までの欠失を含むことを特徴とする請求項８に記載の組換えベクター。１０．プロモーターが、モチーフＪの反復を含み、前記モチーフＪが配列１または配列２に定義されていることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の組換えベクター。１１．プロモーターが、２〜５個のモチーフＪを含むことを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１２．モチーフＪの反復がプロモーターの５’に配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１３．モチーフＪの反復かプロモーターの３’に配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１４．モチーフＪの反復かプロモーターの配列中に挿入されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１５．プロモーターが、１つまたは複数のモチーフＪと肝特異的プロモーター領域とから成る調節領域を含むことを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１６．肝特異的プロモーター領域が、血清アルブミンのプロモーター、アポリポタンパク質ＡＩのプロモーター、アポリポタンパク質Ｃｓのプロモーター、アポリポタンパク質Ｂ１００のプロモーター、フィブリノーゲンのガンマ鎖のプロモーター、ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼの遺伝子のプロモーター、ＡＭＢＰの遺伝子のプロモーター、Ｘ因子の遺伝子のプロモーター及びα−抗トリプシンのプロモーターから選択された肝特異的プロモーターから成ることを特徴とする請求項１５に記載の組換えベクター。１７．組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項１から１６のいずれか一項に記載の組換えベクター。１８．そのゲノムの領域Ｅ１に欠失を含むことを特徴とする請求項１７に記載の組換えアデノウイルス。１９．領域Ｅ１ａ及びＥ１ｂの欠失を含むことを特徴とする請求項１８に記載の組換えアデノウイルス。２０．更に、そのゲノムの領域Ｅ４に欠失を含むことを特徴とする請求項１８に記載の組換えアデノウイルス。２１．領域Ｅ４内の欠失が読取り枠全体に影響を及ぼすことを特徴とする請求項２０に記載の組換えアデノウイルス。２２．発現カセットが欠失配列に置換して領域Ｅ１の処に挿入されていることを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。２３．発現カセットが欠失配列に置換して領域Ｅ４の処に挿入されていることを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。２４．発現カセットが領域Ｅ３の処に挿入されていることを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。２５．分子が治療用タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の組換えベクター。２６．治療用分子が血流中に分泌されるタンパタ質であることを特徴とする請求項２５に記載の組換えベクター。２７．治療用タンパタ質が、ホルモン、リンホカイン、成長因子、神経伝達物質またはその前駆体または合成酵素、栄養因子、アポリポタンパク質、腫瘍抑制因子、血液凝固に関与する因子から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の組換えベクター。２８．ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのコントロール下に配置された有益分子をコードする核酸から成る発現カセットを含むアデノウイルスベクター。２９．配列１または配列２に定義されたモチーフＪの反復を含むヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの変異体。３０．２〜５個のモチーフＪを含むことを特徴とする請求項２９に記載の変異体。３１．追加のモチーフＪがプロモーターの５’に配置されていることを特徴とする請求項２９または３０に記載の変異体。３２．更に、天然型プロモーターの残基−７１０と−１５０との間の領域に欠失を有することを特徴とする請求項２９から３１のいずれか一項に記載の変異体。３３．アポリポタンパク質ＡＩＩのプロモーターの１つまたは複数のモチーフＪと別のプロモーターに由来の肝特異的プロモーター領域とから成る調節領域を含み、前記モチーフＪが配列１または配列２に定義されていることを特徴とするヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの変異体。３４．肝特異的プロモーター領域がヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターとは異なる肝特異的プロモーターから成ることを特徴とする請求項３３に記載の変異体。３５．肝特異的プロモーター領域が肝特異的発現を与えるエンハンサー要素に結合した遍在性プロモーターから成ることを特徴とする請求項３３に記載の変異体。３６．請求項１から２８のいずれか一項に記載のベクターによって修飾された細胞。３７．請求項１７に記載のアデノウイルスと医薬として許容されるビヒクルとから成る医薬組成物。３８．所望のタンパク質をコードする発現カセットを含む請求項１に記載の組換えベクターまたはウイルスゲノムを細胞集団に感染またはトランスフェクションする段階と、前記組換え細胞集団を培養する段階と、産生された前記タンパク質を回収する段階とから成る所望の組換えタンパク質の産生方法。３９．ヒト以外のトランスジェニック動物モデルを作製するための請求項１７に記載のアデノウイルスの使用。４０．同時使用または時差使用するための、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組換えベクターとＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖物質活性化レセプター）のアクチベーターとを含む組成物。４１．ベクターが請求項１７に記載の組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。４２．ＰＰＡＲのアクチベーターがＰＰＡＲαのアクチベーターであることを特徴とする請求項４０または４１に記載の組成物。４３．ＰＰＡＲαのアクチベーターが、フィブラート及び部位Ｊに結合している転写因子の発現を増進させる化合物から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の組成物。４４．フィブラートが、フィブリン酸、ジェムフィブロジル、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、クリノフィブラートから選択されることを特徴とする請求項４３に記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ブラネレク，デイデイエフランス国、エフ―94210・ラ・バレンヌ・サン―イレール、アブニユ・ドウ・セバストポル、39 (72)発明者デネフル，パトリスフランス国、エフ―94100・サン・モー、アブニユ・デ・フユズイエ・ドウ・シヤトーブリアン、45 (72)発明者ドユベルジエ，ニコラフランス国、エフ―75010・パリ、リユ・マルテル、１ (72)発明者ベルトウ，ロランスフランス国、エフ―75013・パリ、アレ・ドユ・パルク・ドウ・シヨワズイ、５ (72)発明者オベルクス，ジヨアンフランス国、エフ―59178・ミロンゴス、ルート・ドウ・アスノン、60 (72)発明者スタル，バールベルギー国、ベー―7972・クボカン、リユ・ジ・ボテイエ、41

Claims

【特許請求の範囲】１．分子を肝特異的に誘導発現させるための組換えベクターであって、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのコントロール下に配置された分子をコードする核酸から成る発現カセットを含むことを特徴とする組換えベクター。２．プロモーターが、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−９０３から−６８０まで、−５７３から−２５５まで、及び、 −１２６から−３３までの処に局在する調節要素を含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えベクター。３．プロモーターの３’末端が、ａｐｏＡＩＩ遺伝子の残基＋５と＋３５との間、より好ましくは＋１０と＋３０との間に存在することを特徴とする請求項１または２に記載の組換えベクター。４．プロモーターの５’末端が、ａｐｏＡＩＩ遺伝子の残基−９５０から−９０５までの範囲、好ましくは−９２５から−９１０までの範囲に存在することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の組換えベクター。５．プロモーターが配列１（残基−９１１から＋２９まで）を含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えベクター。６．プロモーターが、ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−９０３から−６８０まで、または−９０３から−７２０まで、及び、−１２６から−３３までの処に局在する調節要素を含んでいるが、ヌクレオチド−５７３から−２５５までの処に局在する中間要素を含んでいないことを特徴とする請求項１、３または４に記載の組換えベクター。７．プロモーターが、残基−６７０と−２１０との間の領域に欠失、好ましくは残基−６５３から−２１０までの欠失を含むことを特徴とする請求項６に記載の組換えベクター。８．プロモーターが、残基−７１０と−１５０との間の領域に欠失を含むことを特徴とする請求項６に記載の組換えベクター。９．プロモーターが、残基−７０８から−２１０までの欠失を含むことを特徴とする請求項８に記載の組換えベクター。１０．プロモーターが、モチーフＪの反復を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の組換えベクター。１１．プロモーターが、２〜５個のモチーフＪを含むことを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１２．モチーフＪの反復がプロモーターの５’に配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１３．モチーフＪの反復がプロモーターの３’に配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１４．モチーフＪの反復がプロモーターの配列中に挿入されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１５．プロモーターが、１つまたは複数のモチーフＪと肝特異的プロモーター領域とから成る調節領域を含むことを特徴とする請求項１０に記載の組換えベクター。１６．肝特異的プロモーター領域が、血清アルブミンのプロモーター、アポリポタンパク質ＡＩのプロモーター、アポリポタンパク質Ｃｓのプロモーター、アポリポタンパク質Ｂ１００のプロモーター、フィブリノーゲンのガンマ鎖のプロモーター、ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼの遺伝子のプロモーター、ＡＭＢＰの遺伝子のプロモーター、Ｘ因子の遺伝子のプロモーター及びα−抗トリプシンのプロモーターから選択された肝特異的プロモーターから成ることを特徴とする請求項１５に記載の組換えベクター。１７．組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項１から１６のいずれか一項に記載の組換えベクター。１８．そのゲノムの領域Ｅ１に欠失を含むことを特徴とする請求項１７に記載の組換えアデノウイルス。１９．領域Ｅ１ａ及びＥ１ｂの欠失を含むことを特徴とする請求項１８に記載の組換えアデノウイルス。２０．更に、そのゲノムの領域Ｅ４に欠失を含むことを特徴とする請求項１８に記載の組換えアデノウイルス。２１．領域Ｅ４内の欠失が読取り枠全体に影響を及ぼすことを特徴とする請求項２０に記載の組換えアデノウイルス。２２．発現カセットが欠失配列に置換して領域Ｅ１の処に挿入されていることを特徴とする請求項１８から２１のいすれか一項に記載の組換えアデノウイルス。２３．発現カセットが欠失配列に置換して領域Ｅ４の処に挿入されていることを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。２４．発現カセットが領域Ｅ３の処に挿入されていることを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。２５．分子が治療用タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の組換えベクター。２６．治療用分子が血流中に分泌されるタンパク質であることを特徴とする請求項２５に記載の組換えベクター。２７．治療用タンパク質が、ホルモン、リンホカイン、成長因子、神経伝達物質またはその前駆体または合成酵素、栄養因子、アポリポタンパク質、腫瘍抑制因子、血液凝固に関与する因子から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の組換えベクター。２８．ヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターのコントロール下に配置された有益分子をコードする核酸から成る発現カセットを含むアデノウイルスベクター。２９．モチーフＪの反復を含むヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの変異体。３０．２〜５個のモチーフＪを含むことを特徴とする請求項２９に記載の変異体。３１．追加のモチーフＪがプロモーターの５’に配置されていることを特徴とする請求項２９または３０に記載の変異体。３２．更に、天然型プロモーターの残基−７１０と−１５０との間の領域に欠失を有することを特徴とする請求項２９から３１のいずれか一項に記載の変異体。３３．アポリポタンパク質ＡＩＩのプロモーターの１つまたは複数のモチーフＪと別のプロモーターに由来の肝特異的プロモーター領域とから成る調節領域を含むことを特徴とするヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターの変異体。３４．肝特異的プロモーター領域がヒトのアポリポタンパク質ＡＩＩの遺伝子のプロモーターとは異なる肝特異的プロモーターから成ることを特徴とする請求項３３に記載の変異体。３５．肝特異的プロモーター領域が肝特異的発現を与えるエンハンサー要素に結合した遍在性プロモーターから成ることを特徴とする請求項３３に記載の変異体。３６．請求項１から２８のいずれか一項に記載のベクターによって修飾された細胞。３７．請求項１７に記載のアデノウイルスと医薬として許容されるビヒクルとから成る医薬組成物。３８．所望のタンパク質をコードする発現カセットを含む請求項１に記載の組換えベクターまたはウイルスゲノムを細胞集団に感染またはトランスフェクションする段階と、前記組換え細胞集団を培養する段階と、産生された前記タンパク質を回収する段階とから成る所望の組換えタンパク質の産生方法。３９．ヒト以外のトランスジェニック動物モデルを作製するための請求項１７に記載のアデノウイルスの使用。４０．同時使用または時差使用するための、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組換えベクターとＰＰＡＲのアクチベーターとを含む組成物。４１．ベクターが請求項１７に記載の組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。４２．ＰＰＡＲのアクチベーターがＰＰＡＲαのアクチベーターであることを特徴とする請求項４０または４１に記載の組成物。４３．ＰＰＡＲαのアクチベーターが、フィブラート及び部位Ｊに結合している転写因子の発現を増進させる化合物から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の組成物。４４．フィブラートが、フィブリン酸、ジェムフィブロジル、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、クリノフィブラートから選択されることを特徴とする請求項４３に記載の組成物。