JP2007530004A - 疾患を処置するためのサブグループbアデノウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書中で記載される本発明は、ヒトサブグループBアデノウイルスを使用して疾患を処置する分野に関する。
条件により複製するウイルスは、抗癌剤の有望な新たなクラスを表す。癌細胞において選択的に複製して、そしてその癌細胞を殺傷する、ヒトアデノウイルス5型(Ad5)の誘導体が開発されている。このようなウイルスの基本型であるONYX−015(サブグループCアデノウイルス)は、再発性の頭頚部癌を有する患者、ならびに肝転移性疾患を有する患者についての、いくつかの第I相臨床試験および第II相臨床試験において有望な結果を示した。
本発明の特徴は、組換え腫瘍溶解性ヒトサブグループBアデノウイルスの記載である。
本特許の全体にわたって引用される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許/特許出願が具体的にかつ別々に、その全体が参照として援用されるように示される場合と同程度まで、参照として援用される。本発明の実施は、他で特に示されない限り、慣用的な微生物学、免疫学、ウイルス学、分子生物学、および当該分野の範囲内である組換えDNA技術を使用する。これらの技術は、文献に完全に説明される。例えば、以下を参照のこと:Maniatisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻および第II巻(D.Glover(編));Oligonucleotide Synthesis(N.Gait(編)(1984));Nucleic Acid Hybridization(B.HamesおよびS.Higgins(編)(1985));Transcription and Translation(B.HamesおよびS.Higgins(編)(1984));Animal Cell Culture(R.Freshney(編)(1986));Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning (1984),Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2.sup.nd Edition);第I巻,第II巻および第III巻(1989)。また、以下も参照のこと: Hermiston,T.ら,Methods in Molecular Medicine:Adenovirus Methods and Protocols,W.S.M.Wold(編),Humana Press,1999。
他で特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語の全ては、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中で記載される方法および材料と類似または等価であるいずれの方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。
アデノウイルスサブグループBゲノム/コード領域:ヒトサブグループBアデノウイルスゲノムは、American Type Culture Collection(ATCC)から入手され得る。好ましくは、サブグループB3型および34型由来のそのウイルスは、A549細胞ならびに標準的な感染技術および増殖技術を含む、当該分野において周知の物質および方法を使用して、増殖され得る。Hermiston,T.ら、Methods in Molecular Medicine:Adenovirus Methods and Protocols,W.S.M.Wold、編、Humana Press,1999。ウイルスは、塩化セシウム勾配バンディング遠心分離を含むいくつかの技術によって精製され得る。例えば、米国特許第5,837,520号および米国特許第6,008,036号を参照のこと。
組み換え体:1つの実施形態において、本発明は、E1領域、特にE1B領域、および/またはE3領域を含む、ヒトサブグループBアデノウイルスのヌクレオチド配列の一部または全てを欠失させる方法を特定し、提供する。所望の場合、外来遺伝子またはそのフラグメントをコードする異種または相同性のヌクレオチド配列は、ヒトアデノウイルス組み換え体を生成するために、挿入され得る。「欠失部分の」ヌクレオチド配列によって、E1Bおよび/またはE3領域の一部のヌクレオチド配列を欠失させるための従来の遺伝子工学技術を使用することが意味される。
ヒトサブグループBアデノウイルス3型およびヒトサブグループBアデノウイルス34型(以下、それぞれ、Ad3またはAd 34としても言及される)を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手した。上記ウイルスを、A549細胞(これもまたATCCから入手可能)において、標準的感染技術および標準的増殖技術を利用して増殖させた。両方のウイルスを、塩化セシウム勾配バンド形成遠心分離(cesium chloride gradient banding centrifugation)によって精製した。
(プラスミド構築)
pGEM(Promega Corp.)に基づくベクターを、改変し、そして該当するヌクレオチド配列をクローニング、サブクローニングするために使用した。プラスミド構築は、固有のNheI制限酵素認識部位が、Ad34ゲノムの左端から6.5KBにあるという事実に基づいた。プラスミド構築は、HindIIIを用いたAd34ゲノム(15μg)の消化で開始した。2.2Kbおよび3.4Kbの大きさの、2つのフラグメントを、1%アガロースゲル上で単離し、Bio 101 Gene Clean Kitを使用して精製した。上記2.2Kbのフラグメントを、事前にHindIIIを用いて消化したpGEM−7Z(Promega)にライゲーションした。上記構築物を、正しいフラグメントおよび正しい方向性のために、制限酵素マッピングによって評価した。この構築物を2.2/pGEM−7Zと呼称した。次に、上記2.2/pGEM7Z構築物における上記NheI部位に近い上記HindIII部位を、NheIおよびClaIを用いて消化し、その後、Klenowを用いて埋め込み、そして再ライゲーションすることによって除去した。第1の上記Ad34ゲノムの1.4Kbは、PCRプライマーP04 Fwd (5’CATGAGCTCGCGGCCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGA−3’)およびAd34−1370B(5’GGCTTAAGCTTCACAGGAA−3’)、1ngのゲノムテンプレートDNAおよびPfu DNA ポリメラーゼ(Stratagene)を使用するPCR(米国特許第4,683,202号)によって生成した。PCR産物を、QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)を使用して精製し、SacIおよびHindIIIを用いて消化し、1%アガロースゲル上で単離し、そしてBio 101 Gene Clean Kitを用いて精製した。精製された1.4Kbのフラグメントを、1.4/2.2/pGEM−7Z構築物を作製するために、SacIおよびHindIIIを用いて消化した2.2/pGEM−7Zにライゲーションした。3.4Kbのフラグメントを、事前にHindIIIを用いて消化したpGEM−9Z(Promega)中にライゲーションした。上記構築物を、正しいフラグメントおよび正しい方向性について、制限酵素マッピングによって評価した。
サブグループBアデノウイルス34型(Ad34)(ATCC)TP DNAを、S.Miyakeら、(PNAS 1996)に記載されるように作製した。Ad34ΔE1B55Kウイルスを構築するために、上記SV2−5構築物を、NotIおよびNheI(8.5μg)を用いて消化し、1%アガロースゲル上で単離し、そしてQIAquick PCR Gel Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。その後、このフラグメントの5μgを、室温で一晩、NheIを用いて、37℃で6時間消化した0.25μgのAD34−TP DNAにライゲーションした。上記ライゲーション混合物を、60mmディッシュにおいて、2% FBS培地を補充したDMEM中のHEK293細胞内に、製造業者のプロトコルに従って、Mammalian Transfection Kit(Stratagene)を使用してトランスフェクトした。上記トランスフェクトを、37℃/3%CO2で一晩、24時間インキュベートした。トランスフェクトを、24時間後に、上記培地を除去し、そしてその培地を2% FBS、2% L−グルタミン(Glutameine)、1% PSを補充したDMEMで置換することによって停止し、その後、37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。上記細胞を、2% FBS、2% L−グルタミン、1% NEAA、1% PSおよび1.5% SeaPlaqueアガロースを含むDMEM感染培地でオーバーレイし(overlay)、そして新鮮なオーバーレイ培地を2〜3日ごとに供給した。プラークを単離し、HEK293細胞上で増殖し、そしてウイルスDNAを、製造業者の推奨に従って、QIAamp DNA Blood Kit(QIAGEN)を使用して単離した。ウイルスを、E1B55K欠失領域について、以下のプライマー:SVfwd05(5’−GGAAGACCTTAGAAAGACTAGGC−3’)およびP03Rev(5’−TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT−3’)を使用して、PCRによってスクリーニングした。PCRを、Faststart DNA ポリメラーゼ(Roche)を使用して、以下のサイクル条件:94℃で5分間を1サイクル、94℃で30秒間、55℃で30秒間、そして72℃で30秒間〜90秒間を25〜30サイクル、そして72℃で7分間を1サイクル、そして最後に4℃で無期限の下で行った。陽性プラークを、293/E4細胞(Microbix Biosystems Inc.)上で4ラウンド精製した。全てのウイルス単離物を、E1B55K欠失配列およびAd34野生型E1B55Kの内部配列について、以下のプライマー:3.4fwd03(5’−GGGATGAAGTTTCTGTATTGC−3’)および3.4rev12(5’−GTCACATCTACACACACCGG−3’)を用いて、PCRによってスクリーニングした。
Claims (17)
- 細胞集団における新形成細胞を除去するための方法であって、以下の工程:
感染条件の下で(1)機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、組換え複製欠損サブグループBアデノウイルスと、(2)ウイルス性腫瘍タンパク質と結合複合体を形成する該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を含有する非新形成細胞、および該機能的腫瘍抑制遺伝子産物を欠く新形成細胞を含む細胞集団とを接触させることによって、感染された細胞集団を生成させる工程
を包含する、方法。 - 前記腫瘍抑制物質が、p53、またはpRbである、請求項1に記載の方法。
- 前記ウイルス性腫瘍タンパク質が、アデノウイルスE1bポリペプチドまたはアデノウイルスE1Aポリペプチドを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記サブグループBアデノウイルスが、3型または34型からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 患者の癌を処置する方法であって、該患者に、機能的腫瘍抑制遺伝子産物に結合可能な発現されたアデノウイルス性腫瘍タンパク質を欠く、組換え複製欠損サブグループBアデノウイルスを投与する工程を包含する、方法。
- 前記サブグループBアデノウイルスが、3型または34型からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記アデノウイルス性腫瘍タンパク質が、E1bポリペプチドまたはE1Aポリペプチドを含む、請求項6に記載の方法。
- 図1に示されるヌクレオチド配列を含む、組換えヒトアデノウイルスサブグループB 3型。
- ストリンジェント条件の下で図1に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列。
- 図2に示されるヌクレオチド配列を含む、組換えヒトアデノウイルスサブグループB 34型。
- ストリンジェント条件の下で図2に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列。
- pRbまたはp53にそれぞれ結合する腫瘍タンパク質をコードするE1A領域および/またはE1B領域における変異を含み、該変異が、pRbまたはp53のそれぞれに対する該腫瘍タンパク質の結合を減少または排除する変異である、請求項8に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループB 3型。
- 前記変異が、欠失変異または点変異である、請求項12に記載の組換えヒトアデノウイルス。
- pRbまたはp53にそれぞれ結合する腫瘍タンパク質をコードするE1A領域および/またはE1B領域における変異を含み、該変異が、pRbまたはp53のそれぞれに対する該腫瘍タンパク質の結合を、減少または排除する変異である、請求項10に記載の組換えヒトアデノウイルスサブグループB 34型。
- 前記変異が、欠失変異または点変異である、請求項14に記載の組換えヒトアデノウイルス。
- E1B 55Kタンパク質をコードする領域を含む、図1または図2に示されるヌクレオチド配列、またはストリンジェント条件下で該配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列。
- 図1または図2に示されるヌクレオチド配列によってコードされるE1B 55Kタンパク質、またはストリンジェント条件の下で該配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質。
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