FR2860004A1 - Nouveau vecteur adenoviral pour l'infection de cellules deficientes ou depourvues en recepteurs car - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet un vecteur adénoviral qui présente un tropisme pour les cellules CAR- et qui est destiné au transfert de gène ; ce vecteur adénoviral comporte dans au moins une région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside, un peptide hétérologue comportant le motif - (W/R)X1X2D -, ledit peptide étant de préférence capable de se lier au TGFβR, et étant de préférence un peptide immunosuppresseur de rétrovirus tel que par exemple le peptide CKS-17. L'invention porte également sur l'utilisation de ce vecteur adénoviral pour le traitement des cancers, de maladies musculaires, ou de la mucoviscidose.
Description
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L'invention a pour objet un vecteur adénoviral qui présente un tropisme pour les cellules CAR- et qui est destiné au transfert de gène ; ce vecteur adénoviral comporte dans au moins une région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside, un peptide hétérologue comportant le motif - (W/R)XIX2D -, ledit peptide étant de préférence capable de se lier au TGFpR, et étant de préférence un peptide immunosuppresseur de rétrovirus tel que par exemple le peptide CKS-17.
L'invention porte également sur l'utilisation de ce vecteur adénoviral pour le traitement des cancers, de maladies musculaires, ou de la mucoviscidose.
La thérapie génique, qui s'est développée vers la fin des années 1980 jusqu'au début des années 1990 en tant qu'alternative au traitement de maladies humaines graves et incurables, montre aujourd'hui son utilité dans un certain nombre d'essais cliniques ayant pour but de développer un traitement pour les maladies génétiques héréditaires ou acquises, telles que certains types de cancers, les maladies coronariennes et la mucoviscidose.
Toutefois, au cours de son développement en tant que véritable domaine technologique, la thérapie génique a révélé plusieurs limitations ou défauts liés à la nature même de l'idée sur laquelle elle est basée, c'est-à-dire, l'expression efficace d'un gène thérapeutique dans le tissu affecté par la maladie chez un patient.
Malgré de nombreux résultats encourageants, il est aujourd'hui indispensable de trouver de nouveaux moyens techniques d'administration efficaces de gènes thérapeutiques sur le site à traiter.
Il est nécessaire de trouver des systèmes d'administration de gènes thérapeutiques, en particulier des vecteurs, qui n'entraînent pas de réponse immunitaire significative de l'hôte. De manière idéale, le vecteur doit être capable d'administrer de manière spécifique le gène thérapeutique aux cellules cibles afin d'obtenir l'effet thérapeutique souhaité.
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Parmi les vecteurs de thérapie génique, on peut citer les vecteurs adénoviraux, largement utilisés dans les essais pré-cliniques et cliniques de traitement des cancers. Le récepteur CAR (récepteur commun au Coxsackievirus B3 et à l'adénovirus) est considéré comme le récepteur primaire de l'adénovirus, et donc des vecteurs adénoviraux. Cependant, l'efficacité de tels vecteurs reste limitée en raison de la faible expression du récepteur primaire (CAR) à la surface de nombreuses cellules cibles.
Les adénovirus (Ad) sont des virus à ADN double brin linéaire, non enveloppés, appartenant à la famille des Adenoviridae. Il existe plus d'une cinquantaine de sérotypes différents. Les sérotypes 2 et 5 (Ad2 et Ad5), responsables d'infections des voies respiratoires souvent bénignes chez l'homme, sont les mieux connus et constituent la base des vecteurs de thérapie génique (Russel et al., J. Gen. Virol.
2000, 81 : 2573-2604).
La particule adénovirale est composée d'un core et d'une capside (figure 1).
Le core est constitué d'une molécule d'ADN double brin linéaire de 36 kb, bordée par deux origines de réplication ou ITR (Inverse Terminal Repeat), et de quatre protéines : les polypeptides pV, pVII, pX et la preTerminal Protein (pTP) liée aux extrémités des ITRs par des liaisons covalentes.
La capside, de forme icosaédrique, est composée de 252 sous-unités ou capsomères. Les capsomères comprennent 240 hexons (sur les faces et les arêtes) et 12 pentons (sur les sommets). Les hexons, trimères du polypeptide pII, sont associés aux polypeptides pVI, pVIII et pIX, éléments indispensables à la cohésion de la capside. Les pentons sont composés d'une base (pentamère du polypeptide pIII), et d'une projection (trimère du polypeptide pIV) appelée fibre, à activité hémagglutinante. La fibre comprend une ancre, une tige (de longueur variable selon le sérotype), et une tête (extrémité C-terminale globulaire).
L'entrée de l'Ad dans une cellule cible se déroule en deux temps. Dans un premier temps, l'attachement du virus à la surface des cellules cibles s'effectue via une
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interaction forte entre la tête de la fibre (protéine de capside de l'Ad) et le récepteur primaire CAR. Ce récepteur est une protéine transmembranaire de 365 acides aminés (46 kDa) appartenant à la superfamille des immunoglobulines, qui joue un rôle dans l'adhésion intercellulaire. Il contient des domaines extracellulaire, transmembranaire et cytoplasmique, mais le domaine extracellulaire est suffisant pour l'attachement du virus. Après attachement de la fibre au CAR, la base du penton (protéine de capside de l'Ad) (par un motif RGD, Arg-Gly-Asp) interagit avec des récepteurs secondaires, les intégrines de la famille [alpha]v (avp3, [alpha]vss5 et [alpha]vss1) permettant ainsi l'endocytose de la particule virale dans des vésicules à manteau de clathrine. Après endocytose et échappement de l'endosome, la particule virale partiellement déshabillée migre vers le noyau en empruntant le réseau de microtubules intra-cytoplasmique (Russel et al., 2000). Récemment, des travaux ont également suggéré qu'un glycosaminoglycane, l'héparane sulfate, était suffisant pour l'attachement initial des Ad2 et Ad5 sur les cellules cibles (Dechecchi et al., J. Virol. 2001,75 : 8772- 8780). La fixation aux héparanes sulfates s'effectue par un motif KKTK (Lys-LysThr-Lys) situé dans le tiers inférieur de la fibre (figure 1).
Le faible taux de récepteur CAR exprimé à la surface des cellules cibles constitue donc une limite importante à l'utilisation de l'adénovirus comme vecteur de thérapie génique. En effet, différents types cellulaires, et notamment les cellules musculaires et les cellules épithéliales des voies aériennes, expriment très faiblement le récepteur CAR et ne sont, par conséquent, que peu transduites par l'Ad5. De même, de nombreuses cellules tumorales (tissus ovariens, reins, gliomes,...) sont réfractaires à l'infection par l'Ad en raison de l'absence, ou de la faible expression, du CAR (Li et al., Cancer Res. 1999,59 : 325-330). Ceci est d'autant plus problématique que ce sont les tumeurs les plus agressives (forte croissance tumorale) qui présentent ce déficit. Ceci peut en partie s'expliquer par une fonction, récemment décrite du récepteur CAR, de régulation du cycle cellulaire (Okegawa et al., Cancer Res. 2001,17 : 6592-600).
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Afin de pallier le manque d'expression du récepteur CAR à la surface de certains types cellulaires cibles, différentes stratégies ont été développées pour fournir aux vecteurs adénoviraux une voie d'entrée CAR'-indépendante (Krasnykh et al., Mol.
Ther. 2000, 1 :391-405).
Il est possible in vitro d'inhiber la fixation du virus à son récepteur primaire en incubant les cellules avec de la fibre ou du CAR soluble, ou encore avec des anticorps neutralisants. En se basant sur ces observations, des équipes ont développé des outils, CAR soluble (ou anticorps) fusionné à un ligand spécifique, qui interagissent avec la fibre et ciblent un récepteur membranaire. Cette approche permet de cibler de nouveaux récepteurs tout en neutralisant la voie d'entrée naturelle de l'Ad5, mais son utilisation nécessite la production de molécules bispécifiques, et que le complexe [virus-molécule bi-fonctionnelle] soit stable in vivo.
D'autres équipes ont préféré modifier par génie génétique la capside adénovirale (Krasnykh et al., 2000). Cette approche est possible car les structures tridimensionnelles des trois protéines majeures de capside (base et fibre du penton, et hexon) ont été identifiées, et l'on sait manipuler les génomes adénoviraux dans E. coli (recombinaison homologue).
La base du penton est un pentamère, dont chaque monomère contient un motif RGD (Arg-Gly-Asp) qui permet la fixation de l'adénovirus aux intégrines. Ce motif RGD, à l'apex de 2 hélices a, est retrouvé au sein d'une région hypervariable qui fait de 19 (Adl2) à 82 acides aminés (Ad2 et 5) selon les sérotypes. Cette région est donc un bon candidat à l'insertion des peptides hétérologues afin de modifier le tropisme de l'Ad.
La fibre du penton a une structure trimérique. Chaque monomère est composé d'une tige constituée d'une répétition (dont le nombre varie selon les sérotypes) d'un motif d'une quinzaine de résidus, et d'une tête en C-terminal. Cette tête du monomère de la fibre a une structure globulaire, formée de 10 feuillets ss, séparés
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par des boucles non structurées. Une seule de ces boucles, la boucle HI, ne participe pas au contact avec le récepteur CAR, et protubère à l'extérieur du virion ce qui permet d'insérer des peptides sans altérer la trimérisation de la fibre.
L'hexon, protéine majoritaire de la capside adénovirale, est également un trimère. Chaque monomère contient sept régions hypervariables (HVR1 à HVR7) situées au sein de boucles où se trouvent les déterminants spécifiques de chaque sérotype. Toutes ces régions HVR de l'hexon sont localisées dans sa partie externe haute ce qui suggère que des modifications peuvent y être réalisées sans en altérer le repliement tridimensionnel de la molécule.
Différentes équipes ont modifié génétiquement les protéines de la capside virale de façon à modifier le tropisme des adénovirus recombinants.
Le document Bouri et al, 1999 (Hum Gene Ther. 1999 Jul 1;10(10):1633-40) démontre qu'un adénovirus génétiquement modifié qui exprime une séquence de sept lysines à l'extrémité C-terminale de sa fibre transduit les cellules musculaires squelettiques avec une efficacité largement supérieure à celle d'un adénovirus de type 5 non modifié (résultat in vitro et in vivo).
Le document Su et al., 2001 (J Vasc Res. 2001 Sep-Oct;38(5):471-8) décrit un vecteur adénoviral codant pour une protéine de fibre chimérique lui permettant une meilleure transduction des cellules musculaires lisses.
De même, Mizuguchi et al., 2002 (Cancer Gene Ther. 2002 Mar ;9(3): décrit la construction d'un adénovirus comportant une fibre chimérique sur laquelle a été inséré un motif RGD. Ce virus a une capacité de transduction 25 fois supérieure à l'adénovirus non modifié (expérience in vivo sur un modèle de mélanome murin).
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Mizuguchi et al., 2001 (Gene Ther. 2001 8 : décrit un adénovirus recombinant contenant le peptide NGR inséré dans la fibre, capable d'infecter les cellules de gliome humaines.
La demande de brevet internationale publiée le 22/07/1999 sous le numéro WO 99/36545 (Genzyme) décrit des vecteurs adénoviraux codant pour une protéine de capside modifiée (hexon ou fibre) comprenant un ligand hétérologue qui facilite la liaison de l'adénovirus à la cellule cible.
La demande de brevet internationale publiée le 27/08/1999 sous le numéro WO 00/12738 (Aventis Pharma) décrit des vecteurs adénoviraux codant pour une protéine de capside modifiée (hexon ou fibre) comprenant un ligand hétérologue.
Notamment, des ligands sont insérés dans la boucle HVR5 de l'hexon.
De même, Vigne et al., 1999 (J. Virol 1999, 73 : 5156-5161) décrit la substitution de la région HVR5 de l'hexon d'Ad5 par une séquence hétérologue.
La demande de brevet internationale publiée le 05/06/1997 sous le numéro WO 97/20051(Genvec) décrit des protéines de capside adénovirales chimériques (fibre et hexon) comportant une séquence peptidique hétérologue.
Ces approches de modifications génétiques restent limitées par le très faible nombre de ligands peptidiques identifiés, capables de modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux.
Il serait donc souhaitable de trouver de nouveaux ligands capables de modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux pour cibler différents types cellulaires, notamment les cellules dépourvues ou déficientes en récepteurs CAR, telles que les cellules musculaires et les cellules tumorales.
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D'autre part, il serait souhaitable de trouver de nouveaux ligands qui soient capables de modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux et de diminuer la réponse immunitaire spécifique de l'hôte de manière simultanée.
En visant à contrôler les réponses immunitaires anti-adénovirus par l'insertion d'un peptide immunosuppresseur CKS-17 (Haraguchi et al, Cell Immunol. 1992 May ;141(2):388-97) d'origine rétrovirale dans les protéines majeures de capside d'adénovirus, les inventeurs ont découvert de manière tout à fait inattendue que les virus obtenus possèdent un nouveau tropisme : ces nouveaux virus sont capables d'infecter les cellules dépourvues ou déficientes en récepteurs CAR, tout en conservant leur tropisme pour les cellules riches en CAR. De plus, ces nouveaux virus, en sus de leur capacité à infecter ces différents types cellulaires, pourraient être moins immunogènes que leurs prédécesseurs, de par la nature immunosuppressive du peptide ligand CKS-17 inséré dans la capside du virus.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un vecteur adénoviral destiné à assurer l'expression d'une séquence d'ADN d'intérêt dans des cellules de mammifères, caractérisé en ce que ledit vecteur comporte dans au moins l'une des séquences d'ADN codant pour les régions à faible contrainte structurale de protéines de capside, au moins une séquence d'ADN codant pour un peptide hétérologue comportant le motif - (W/R)X1X2D -.
Dans la présente demande, les termes acide nucléique , polynucléotide , séquence d'ADN , séquence d'ARN sont utilisés de manière indifférente pour désigner une séquence nucléotidique.
De même, les termes protéine , peptide et polypeptide sont utilisés de manière indifférente pour désigner une séquence d'acides aminés.
On entend désigner par région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside codée par un vecteur adénoviral une région dont la séquence en acides aminés n'a pas d'incidence sur le repliement tri-dimensionnel de la protéine de
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capside ;la séquence d'ADN hétérologue de l'invention peut être insérée dans cette région à faible contrainte structurale sans déléter la séquence d'acides aminés de cette région, ou bien elle peut être insérée après que cette séquence de cette région à faible contrainte structurale ait été en partie ou entièrement délétée.
Dans la présente demande, la séquence du motif - (W/R)XiX2D - est SEQ ID N 3.
De préférence, le vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisé en ce que le peptide hétérologue est capable de se lier au récepteur du facteur de croissance des tumeurs (3 (TGFPR).
Il existe plusieurs types de récepteurs au TGFss. Les récepteurs de type 1 et II comportent un domaine transmembranaire, une région extracellulaire riche en cystéine, et un domaine intra-cytoplasmique. Le récepteur de type III possède un large domaine extracellulaire, mais n'a qu'un petit domaine cytoplasmique, il présente le TGFss au récepteur de type II, mais ne joue aucun rôle dans la signalisation. Lorsque le récepteur de type II lie le TFG8, un changement de conformation a lieu ce qui facilite le recrutement du récepteur de type 1 pour former un hétérodimère. Le récepteur de type II, via une activité serine thréonine kinase, phosphoryle et active le récepteur de type 1 initiant une cascade de transduction du signal, impliquant notamment la phosphorylation des SMAD 2 et 3, et aboutissant à des événements de régulation de la transcription nucléaire (Hata et al., Exp Cell Res. 2001 Mar 10;264(1):111-6).
Le récepteur de type II, principal responsable de la fixation des TGFss, présente une large distribution. Chez la souris, ce récepteur est fortement exprimé par les muscles squelettiques, les poumons, le c#ur et dans une moindre mesure par d'autres organes (Lawler et al., Development 1994,120:165-175). Chez l'homme, ce récepteur est décrit comme ubiquitaire, et les études ont principalement porté sur l'expression de ces récepteurs dans les tumeurs.
Ainsi, le peptide hétérologue tel que décrit dans la présente demande est de préférence capable de se lier au récepteur du TGFss de type II.
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Le TGFpR, de préférence le TGFpR de type II, auquel le peptide hétérologue tel que décrit dans la présente demande est capable de se lier peut être présent à la surface des cellules de mammifères, telles que des cellules murines ou humaines.
De manière encore préférée, le peptide hétérologue tel que décrit dans la présente demande est capable de se lier au TGFpR humain de type II de séquence SEQ ID N 2 ou de séquence identique à au moins 60,65, 70,75, 80,85, 90,95 ou 99 % à la séquence SEQ ID N 2.
L'homme du métier est capable d'identifier les peptides hétérologues de la présente demande qui sont capables de se lier au récepteur du TGFss.
Par exemple, lorsque le récepteur du TGFss est situé à la surface des cellules de mammifères, l'homme du métier déterminera si le peptide hétérologue de la présente demande est capable de se lier au récepteur du TGFss en considérant l'efficacité de transduction desdites cellules de mammifères par le vecteur adénoviral selon l'invention. Par exemple, lorsque le vecteur adénoviral de l'invention est utilisé pour transduire les cellules de mammifères déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR (cellules CAR-) in vitro ou in vivo, on considèrera que le vecteur adénoviral de l'invention est capable de transduire de manière efficace lesdites cellules lorsque l'efficacité de transduction in vitro ou in vivo est au minimum deux fois supérieure à celle obtenue lorsque les cellules CAR- sont transduites avec un vecteur adénoviral ne comprenant pas la séquence hétérologue décrite dans la présente demande (voir exemple 2, analyse du pouvoir infectieux des virus , tests d'infectivité des adénovirus recombinants pour le calcul de l'efficacité de transduction).
Comme autre exemple d'identification de la capacité de liaison des peptides hétérologues de la présente demande avec le récepteur du TGFss, on peut citer l'analyse sur membrane de nitrocellulose telle que décrite à l'exemple 2 ( analyse du pouvoir infectieux des virus , SLOT BLOT ).
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On entend désigner par vecteur adénoviral (Ad) dans la présente demande un vecteur dérivé d'un adénovirus ou d'un virus associé à l'adénovirus, tel que notamment l'AAV, qui est destiné à assurer l'expression d'une séquence d'ADN d'intérêt dans des cellules de mammifères.
Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur adénoviral selon l'invention est dérivé d'un virus adéno-associé (AAV). Le génome de l'AAV contient des cadres ouverts de lecture codant pour les protéines Rep (réplication) et Cap (capside). Les séquences nucléotidiques flanquantes des régions codantes de l'AAV sont des séquences de répétition inversées (ITR pour inverted terminal repeat), qui contiennent des séquences palindromiques capables de se replier pour former des structures en épingle à cheveux fonctionnant comme amorces lors de l'initiation de la réplication de l'ADN. En plus de leur rôle dans la réplication de l'ADN, les séquences ITR jouent un rôle dans l'intégration virale et l'encapsidation de l'acide nucléique viral dans les virions matures (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro.
Immunol. 158:97-129).
Les capsides AAV possèdent une symétrie icosaédrique et font environ 20 à 24 nm de diamètre. Elles sont composées de trois protéines virales (VP1 (87 Kd), VP2 (73 Kd) et VP3 (61Kd), Muzyczka, 1992). La protéine VP3 représente 90 % de la totalité des protéines du virion ; VP2 et VP1 sont présentes à environ 5 % chacune.
Le virus AAV possède deux modes d'infection d'une cellule hôte. En présence de virus Helper , l'AAV entre en cycle lytique, et le génome viral est transcrit, répliqué et encapsidé dans des particules virales nouvellement formées. En l'absence de la fonction virus Helper , l'AAV, le génome AAV s'intègre comme provirus dans une région spécifique du génome de la cellule hôte, par recombinaison entre les ITR d'AAV et des séquences de la cellule hôte. Le ciblage spécifique de l'ADN viral d'AAV se produit sur le bras long du chromosome 19 (Kotin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2211-2215 ; Samulski et al., (1991) EMBO J. 10 : 3941-3950). Cette caractéristique particulière
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de l'AAV réduit la possibilité de mutagénèse insertionnelle résultant de l'intégration au hasard de l'ADN viral dans la région codante d'un gène hôte.
La particule AAV utilise des récepteurs cellulaires pour se lier et pour infecter une cellule. Des récepteurs identifiés récemment comprennent le récepteur de l'héparane sulfate protéoglycane comme récepteur primaire, et soit le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), soit l'intégrine aV(35 comme récepteurs secondaires. Après s'être liée à la cellule, la particule virale suit un processus d'internalisation médiée par un récepteur dans des vésicules cellulaires d'endocytose revêtues de clathrine.
Le vecteur AAV possède des propriétés qui le rendent unique pour la thérapie génique ; par exemple, l'AAV n'est pas associé à des maladies connues et est en général non pathogène. De plus, l'AAV s'intègre dans le chromosome hôte de manière site-spécifique (See e. g., Kotin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2211-2215 and Samulski et al., (1991) EMBO J. 10 : 3941-3950).
Bien que les vecteurs viraux AAV soient appropriés pour l'administration de gènes à des cellules cibles, ils possèdent souvent un tropisme limité pour certains types cellulaires. A ce jour, des tentatives de modification du tropisme ont impliqué l'introduction d'un peptide ligand dans la capside. Par exemple, Girod et al. (1999) Nature Med. 5 : ont introduit un peptide de 14 acides aminés contenant le motif RGD dans une région de la capside d'AAV de sérotype 2 pour modifier le tropisme. D'autres ont ajouté au niveau de la terminaison N-ter de VP2 des fragments de chaînes simples de régions variables d'un anticorps monoclonal dirigé contre CD34 (Yang et al. (1998) Hum. Gene. Ther. 9 : La limitation majeure de ces approches est qu'elles nécessitent des étapes additionnelles de liaison à de grosses molécules telles que des ligands de récepteurs et des anticorps du virus. Ceci augmente la taille du virus aussi bien que le coût de production. De plus, les particules cibles n'ont pas une structure homogène, ce qui peut affecter l'efficacité du transfert de gène. Pour cela, il existe
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un besoin de générer des vecteurs viraux possédant un tropisme modifié efficace pour le transfert de gène.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le vecteur adénoviral selon l'invention est dérivé d'un adénovirus. Les adénovirus sont des virus à ADN d'eucaryotes qui peuvent être modifiés pour l'administration efficace d'un acide nucléique à divers types de cellules de mammifères. Il existe au moins 49 sérotypes parmi les souches humaines. Le vecteur Ad est de préférence un vecteur Ad2 ou un vecteur Ad5 humain, ou un adénovirus d'origine animale (demande internationale WO 94/26914, publiée le 06/04/99, Rhône Poulenc Rorer). Les adénovirus d'origine animale qui peuvent être utilisés dans la présente invention comprennent les adénovirus d'origine canine (souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800), par exemple), bovine, murine (par exemple Mavl, Beard et al, 1990, Vir. 75,81), ovine, porcine et aviaire.
Le vecteur adénoviral est de préférence défectif pour la réplication, c'est-à-dire qu'il n'est pas capable de se répliquer de manière autonome dans la cellule de mammifère. Pour cela, le génome adénoviral est modifié. La modification du génome viral peut comprendre, mais n'est pas limitée à, l'addition d'un segment d'ADN, le réarrangement d'un segment d'ADN, la délétion d'un segment d'ADN, la substitution d'un segment d'ADN, ou l'introduction d'ADN lésé. Un segment d'ADN peut être aussi petit qu'un nucléotide et aussi grand que 36 Kpb (c'est-àdire la taille approximative du génome adénoviral) ou, de manière alternative, peut correspondre à la quantité totale qui peut être empaquetée dans un virion Ad (c'est-à-dire environ 38 Kpb). Des modifications préférées du génome adénoviral sont comprises dans les régions El, E2, E3 ou E4. De manière similaire, un vecteur adénoviral peut être un cointégrat, c'est-à-dire la ligation de séquences adénovirales avec d'autres séquences, telles que des séquences d'autres virus ou de plasmides.
De telles modifications peuvent être réalisées au moyen des techniques de manipulation génétique ou par traitement avec des agents mutagènes. En général,
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le virus défectif pour la réplication conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires pour l'encapsidation des particules virales. Des virus défectifs, qui ne possèdent aucun gène viral ou presque, peuvent également être utilisés.
Les adénovirus recombinants défectifs pour la réplication qui sont utilisés dans la présente invention peuvent être préparés selon l'une quelconque des techniques connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre le génome adénoviral et un plasmide qui porte la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue est réalisée après cotransfection du génome adénoviral et du plasmide chez Escherichia coli. Le génome recombinant obtenu est transfecté dans la lignée cellulaire transcomplémentante qui doit de préférence être : (1) transformable par ces éléments, et (2) contenir les séquences de complémentation de la partie du génome délétée pour l'obtention d'adénovirus défectif pour la réplication, de préférence sous forme intégrée de manière à éviter les risques de recombinaison.
Comme exemples de lignées cellulaires transcomplémentantes qui peuvent être utilisées on peut citer, mais sans toutefois s'y limiter, la lignée cellulaire 293 de rein embryonnaire humain (Graham et al, J Gen Virol. 1977 Jul;36(l):59-74) qui contient la partie gauche du génome d'Ad5 intégrée dans son génome, la lignée PER. C6 (Fallaux et al, Hum Gene Ther. 1998 Sep 1;9(13):1909-17), et des lignées cellulaires qui sont capables de complémenter les fonctions El et E4.
Les techniques générales de préparation de vecteurs adénoviraux et de particules adénovirales pour la présente invention sont bien connues de l'homme de l'art, et sont largement décrites dans la littérature, comme par exemple dans Sambrook et al, Molecular cloning : A laboratory manual , deuxième édition, 1989, Spring Harbor Laboratoyry Press, New York ; Glover et al, DNA cloning : a practical approach , Vol. 1 et II, 1985, IRL Press, Oxford ; Nucleic acid hybridization , BD Haines, SJ Higgins (Eds), 1985, IRL Press; Hames & Higgins, Transcription and translation : a practical approach , 1984, IRL, Oxford ;
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"Current Protocols in Molecular Biology ", F. Ausubel et al (Eds), 1993, Wiley & Sons.
Le cycle adénoviral se compose d'une phase précoce et d'une phase tardive. Au cours de la phase précoce, la région E1A est transcrite et traduite ce qui active la transcription des régions E1B, E2, E3 et E4. La transcription de la région E2 permet la synthèse des protéines nécessaires à la réplication virale, tandis que les protéines de la région E4 permettent l'arrêt de la synthèse protéique cellulaire, et favorisent l'export des messagers viraux vers le cytoplasme. Enfin, les protéines de la région E3 mettent en place des systèmes de blocage contre les défenses immunitaires de l'organisme (Benihoud et al., Cur. Op. in Biotechnology 1999, 10 :255-260; Russel et al., 2000).
Au cours de la phase tardive, on observe l'activation d'un gène unique (LTU) sous le contrôle du promoteur MLP (Major Late Promotor). Le transcrit primaire obtenu génère, par épissage alternatif, et utilisation de sites de polyadénylation différentiels, 5 familles d'ARNm tardifs Ll à L5, codant pour les protéines de structure, d'assemblage et de maturation du virion (figure 2). Ces protéines néosynthétisées forment de nouveaux virions au sein desquels est encapsidé le génome adénoviral. Puis, les virions sont libérés par lyse de la membrane cellulaire (Russel et al., 2000).
Comme exemple de modification du génome adénoviral pour rendre le vecteur adénoviral déficient pour la réplication, on peut citer, mais sans s'y limiter, l'élimination de la région El, codant pour des facteurs de transcription essentiels à l'initiation du cycle viral. Cette délétion empêche donc le virus de se répliquer de façon autonome et permet d'insérer un transgène d'intérêt (jusqu'à 5,5kb) sans dépasser la taille critique d'encapsidation du génome viral (105% du génome, soit 38kb).
Une délétion supplémentaire dans la région E3, non indispensable au cycle viral, permet de porter la capacité de clonage à 7,5kb. Pour produire ces vecteurs
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AE1AE3 recombinants, il est nécessaire d'utiliser des lignées cellulaires (lignées 293 ou 911) transcomplémentant la région El (Benihoud et al., 1999 , Russel et al., 2000).
De tels vecteurs #E1#E3, qui peuvent être utilisés dans la présente invention, possèdent un certain nombre d'atouts. Ils infectent aussi bien des cellules quiescentes qu'en division. Ils peuvent être produits à des titres élevés, de l'ordre de 1011 à 1012 pfu.ml-1 (plaque forming unit : unité formant plage), permettant de réaliser des transferts de gènes in vivo. De plus, contrairement au génome des rétrovirus, le génome des vecteurs adénoviraux reste sous forme épisomale, réduisant le risque de mutagenèse insertionelle. Il faut noter, toutefois, que ceci conduit à une perte progressive de l'expression du transgène dans les tissus en division.
Ces vecteurs #E1#E3 sont cependant confrontés à plusieurs limites.
Premièrement, au cours de l'étape d'amplification dans la lignée de complémentation, il est possible d'observer l'émergence de particules virales capables de se répliquer (RCA, Replication Competent Adenovirus). Ces particules ont réintégré la région El dans leur génome, suite à une recombinaison homologue entre le génome viral et la région El de la cellule productrice. Elles sont potentiellement dangereuses pour les patients traités. Ce problème de contamination par les RCA est actuellement contrôlé en minimisant les homologies entre les vecteurs et la lignée de propagation (extension de la délétion Eldu génome adénoviral et/ou nouvelle lignée de propagation).
Un second inconvénient découle du fait que certaines cellules sont capables in vivo de fournir une activité dite "El-like" qui, en mimant la fonction de la région El, induit la transcription de la région E2 et entraîne la réplication du génome adénoviral. Cette activité El est responsable de la néosynthèse de protéines virales précoces et tardives potentiellement immunogènes chez l'hôte.
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Ces vecteurs sont également capables d'induire chez l'hôte une forte réponse immunitaire. On observe non seulement une réponse de type cellulaire (LT cytotoxiques et auxiliaires) qui élimine rapidement les cellules exprimant le transgène d'intérêt, mais aussi une réponse de type humorale (Ac neutralisants) qui rend inefficace toute réadministration ultérieure du vecteur.
L'ensemble de ces problèmes est en partie contrôlé par la délétion d'autres gènes précoces (E2 et E4), voire de tous les gènes adénoviraux (vecteurs helperdépendants, Benihoud et al., 1999 , Russel et al., 2000).
Le vecteur adénoviral peut par exemple comprendre une délétion dans les régions El et E4. De tels vecteurs sont décrits dans les demandes de brevet internationales WO 95/02697 (publiée le 26/01/1995, Rhône Poulenc Rorer) et WO 96/22378 (publiée le 03/10/2000, Rhône Poulenc Rorer).
On entend désigner par séquence d'ADN d'intérêt exprimée dans des cellules de mammifères dans la présente demande une séquence d'ADN qui, lorsqu'elle est soit transcrite, soit transcrite puis traduite, en une molécule d'intérêt qui peut être soit un ARN, tel que notamment un ribozyme, un ARN antisens ou un siRNA, ou une protéine, permet d'obtenir un changement phénotypique desdites cellules de mammifères.
Les siRNA, ou ARN interférents de petite taille, sont maintenant bien connus de l'homme de l'art et sont décrits dans la littérature (voir par exemple Shi Y., Trends Genet. 2003 Jan;19(l):9-12).
De préférence, le vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisé en ce que le peptide hétérologue est un peptide immunosuppresseur de rétrovirus.
On entend désigner par peptide immunosuppresseur de rétrovirus un peptide codé par le génome du rétrovirus qui exerce une action immunosuppressive, c'est-à-dire
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qui diminue ou supprime la réponse immunitaire de l'hôte, l'hôte pouvant être les cellules que le rétrovirus infecte.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que les résidus XI et X2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les résidus neutres A, V, L, I, G, S et T. De préférence, le résidu X1 est G et le résidu X2 est L.
Selon encore un autre mode de réalisation, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que le peptide hétérologue contient au plus 24 résidus aminoacides. De préférence, le peptide hétérologue contient entre 4 et 20 résidus aminoacides. De manière encore préférée, le peptide hétérologue contient entre 7 et 18 résidus amino-acides. De manière la plus préférée, le peptide hétérologue contient 17 résidus amino-acides.
De préférence, le vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisé en ce que le peptide immunosuppresseur de rétrovirus est le peptide CKS-17 de séquence SEQ ID N 1 ou tout peptide de séquence identique à au moins environ 60 % à ladite séquence SEQ ID N 1. De préférence, le peptide immunosuppresseur de rétrovirus est tout peptide de séquence identique à au moins environ 64,70, 76,82, 88,94 % à ladite séquence SEQ ID N 1.
Le peptide CKS-17 de séquence SEQ ID N 1 est un peptide synthétique homologue à une région hautement conservée de la protéine transmembranaire rétrovirale. Il exerce une action immunosuppressive qui se traduit par une inhibition de la production, in vitro, notamment d'interleukine 1, d'interleukine 2 et d'interféron y par les lymphocytes et les monocytes murins (Haraguchi et al, Cell Immunol. 1992 May ; La séquence d'ADN codant pour le peptide hétérologue selon l'invention peut être insérée dans au moins l'une des séquences du vecteur adénoviral codant pour une protéine de capside de l'adénovirus au niveau de régions à faible contrainte
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structurale, parmi lesquelles on peut citer, mais s'y limiter, les régions à faible contrainte structurale de l'hexon, de la fibre ou de la base du penton, de la protéine pVI, pVIII ou pIX.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la protéine de capside est choisie parmi l'hexon, la fibre ou la base du penton, la protéine pVI, pVIII ou pIX.
La séquence d'ADN codant pour le peptide hétérologue peut être comprise au moins dans l'une des séquences codant pour les régions à faible contrainte structurale de protéines de capside. De préférence, la séquence d'ADN codant pour le peptide hétérologue de l'invention est insérée dans une seule région à faible contrainte structurale. Elle peut également être insérée dans au moins deux régions à faible contrainte structurale différentes d'une même protéine de capside ou de deux protéines de capside différentes, voire plus.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside est délétée ou partiellement délétée, et la séquence d'ADN codant pour le peptide hétérologue est insérée dans le site de délétion.
En général, on déterminera si l'ADN codant pour la région à faible contrainte structurale doit être entièrement ou en partie délété notamment en fonction du peptide hétérologue de l'invention (taille et structure tridimensionnelle du peptide hétérologue) et de la région à faible contrainte structurale.
Comme exemple de région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside codée par le vecteur adénoviral, on peut citer, mais sans s'y limiter, une région hypervariable du penton qui fait de 19 (Adl2) à 82 acides aminés (Ad2 et Ad5) selon les sérotypes. Cette région contient un motif RGD à l'apex de deux hélices alpha.
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On peut également citer la boucle HI de la fibre, ou les sept régions hypervariables (HVR1 à HVR7) de l'hexon.
De préférence, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que lorsque la protéine de capside est l'hexon, la région à faible contrainte structurale est la région hypervariable 5 (HVR5). De manière encore plus préférée, l'ADN codant pour la région hypervariable 5 (HVR5) est entièrement délété.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur adénoviral est caractérisé en ce que lorsque la protéine de capside est la fibre, la région à faible contrainte structurale est la boucle HI. De préférence, la boucle HI est délétée ou partiellement délétée.
Selon un nouveau mode de réalisation, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que le peptide hétérologue comprend en outre au moins un adaptateur situé en N-ter ou en C-ter.
On entend désigner par adaptateur dans la présente demande un acide aminé ou une séquence d'acides aminés situé en N-ter ou en C-ter du peptide hétérologue qui permet d'obtenir un repliement tridimensionnel correct de la séquence aminoacide de la protéine de capside comportant dans au moins l'une de ses régions à faible contrainte structurale le peptide hétérologue selon l'invention.
Lorsque l'adaptateur est une séquence d'acides aminés, celle-ci peut comprendre 1 à 5 acides aminés, de préférence 3 acides aminés.
De préférence, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que le peptide hétérologue comprend un adaptateur situé en N-ter et un adaptateur situé en C-ter.
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Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, lorsque la région à faible contrainte structurale dans laquelle le peptide hétérologue de l'invention est inséré est la région HVR5 de l'hexon, les adaptateurs sont l'acide aminé G (Glycine) en N-ter du peptide hétérologue et les acides aminés LGG (Leucine-Glycine-Glycine) en C-ter du peptide hétérologue.
Selon un mode préféré de réalisation, le vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt est liée de manière opérationnelle à des séquences de contrôle de l'expression.
On entend désigner par séquences de contrôle de l'expression des séquences de contrôle de la transcription et de la traduction. De telles séquences sont bien connues et utilisées par l'homme de l'art. Ce sont des séquences ADN de régulation, telles que des promoteurs, des amplificateurs ( enhancers ), des terminateurs et autres, qui permettent l'expression d'une séquence d'ADN d'intérêt dans une cellule hôte. L'expression de la séquence d'ADN d'intérêt peut être effectuée sous le contrôle de n'importe quel promoteur/enhancer connu de l'homme de l'art, sous réserve que ces éléments de régulation soient fonctionnels dans la cellule cible choisie pour l'expression. Les promoteurs qui peuvent être utilisés pour le contrôle de l'expression du transgène comprennent, sans s'y limiter, le promoteur CMV, le promoteur SV40 (Benoist & Chambon, Nature.
1981 Mar 26 ;290(5804):304-10), promoteur RSV (Yamamoto et al, Cell. 1980 Dec ;22(3):787-97), le promoteur de l'herpès thymidine kinase (Wagner et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Mar;78(3):1441-5), les séquences de régulation du gène de la métallothionéine (Brinster et al, Nature. 1982 Mar 4;296(5852):39-42), et les régions de contrôle de la transcription animale qui ont une spécificité tissulaire, tels que la région contrôle du gène de l'élastase I, qui est active dans les cellules acineuses pancréatiques (Swift et al, Cell. 1984 Oct ;38(3):639-46), région contrôle du gène de l'insuline, qui est active dans les cellules pancréatiques Bêta (Hanahan et al, Nature 1985 May 9-15;315(6015):115-22), la région contrôle du gène de l'immunoglobuline, qui est active dans les cellules lymphoïdes (Grosschedl et al, Cell. 1984 Oct;38(3):647-58).
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L'expression "lié de manière opérationnelle à" signifie que la séquence d'ADN d'intérêt et les séquences de contrôle de l'expression sont en relation l'un par rapport à l'autre d'une manière qui leur permet de fonctionner de la manière souhaitée.
De préférence, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt code pour un facteur anti-angiogénique, la thymidine kinase, la protéine p53, un transgène impliqué dans une maladie musculaire, le gène codant pour le régulateur transmembranaire impliqué dans la mucoviscidose (gène CFTR). De préférence, le facteur anti-angiogénique est l'angiostatine ou tout autre fragment du plasminogène, l'endostatine, la canstatine, l'angiotensinogène ou tout autre fragment dérivé de l'angiotensinogène. Selon une autre préférence, le transgène impliqué dans une maladie musculaire code pour la dystrophine.
Lorsque la séquence d'ADN d'intérêt exprime une protéine, celle-ci peut également comprendre du côté N-ter une séquence signal de sécrétion de la protéine également exprimée par la séquence d'ADN d'intérêt.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la séquence d'ADN El du vecteur adénoviral est modifiée de façon à permettre la réplication dudit vecteur uniquement dans les cellules tumorales.
La modification peut consister par exemple en une substitution ou une délétion totale ou partielle de la séquence d'ADN El. Une telle modification de la séquence d'ADN El du vecteur ou du génome adénoviral est bien connue de l'homme de l'art, et est décrite notamment dans Barnes MN et al, Mol Cancer Ther. 2002 Apr;l(6):435-9. Review ; Lamfers ML et al, Cancer Res. 2002 Oct 15;62(20):5736-42). Il a été démontré que cette séquence est modifiée, les vecteurs adénoviraux obtenus sont capables d'infecter les cellules tumorales.
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Selon un autre mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce qu'il présente un tropisme pour les cellules déficientes ou dépourvues en récepteurs communs au Coxsackievirus B3 et à l'adénovirus (récepteurs CAR).
Dans la présente demande, on désignera comme cellules CAR- les cellules de mammifères dépourvues ou déficientes en récepteurs CAR. A l'inverse, les cellules qui ne sont pas dépourvues ou déficientes en récepteurs CAR seront désignées comme étant des cellules CAR+.
Comme exemples de cellules de mammifères dépourvues ou déficientes en récepteurs CAR (cellules CAR') on peut citer, sans toutefois s'y limiter, les cellules tumorales, telles que les cellules de gliome, de mélanome, de carcinome, de cancer du poumon, de l'utérus, du sein ou de l'ovaire, de tumeur de la prostate, ou les lymphocytes, les fibroblastes, les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules du muscle squelettique, du muscle lisse ou du myocarde.
Comme exemples de lignées de cellules de mammifères dépourvues ou déficientes en récepteurs CAR (cellules CAR-) on peut citer, sans toutefois s'y limiter, les lignées CHO, L929, PC-3, LLC, B16F10, RCC law, RCC Aury, U 118, RD, L6 et C2C12.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte en outre une ou plusieurs modifications, ce qui permet à la protéine de capside ainsi obtenue d'avoir une interaction diminuée ou éliminée avec au moins l'un des récepteurs primaires de l'adénovirus.
En effet, le vecteur adénoviral de l'invention, s'il est capable de se lier au TGFR situé à la surface des cellules de mammifères, conserve sa capacité à infecter les cellules CAR+.
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Dans la présente demande, on désignera comme récepteurs primaires de l'adénovirus les récepteurs avec lesquels l'adénovirus sauvage est capable d'interagir. De tels récepteurs sont en général présents à la surface des cellules de mammifères, mais ils peuvent également être présents en solution sous forme soluble recombinante. Comme exemples de récepteurs primaires de l'adénovirus on peut citer les récepteurs primaires essentiels tels que le récepteur CAR, les héparane sulfate et les intégrines.
La modification qui permet à la protéine de capside ainsi obtenue d'avoir une interaction diminuée ou éliminée avec au moins l'un des récepteurs primaires peut être de tous types dans la mesure où le vecteur adénoviral selon l'invention modifié de cette manière possède un tropisme préférentiel pour les cellules CAR et un tropisme faible ou nul pour les cellules CAR +.
La modification qui permet à la protéine de capside ainsi obtenue d'avoir une interaction diminuée ou éliminée avec au moins l'un des récepteurs primaires de l'adénovirus peut consister en l'ablation de la fibre adénovirale. La modification peut également consister à remplacer la partie C-terminale de la fibre par un ligand de ciblage comportant cependant un motif de trimérisation, afin de préserver l'intégrité de la capside virale.
La modification peut encore être basée sur la mutagenèse des résidus de la fibre impliqués dans les interactions avec le CAR.
De préférence, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la modification dans au moins l'une des séquences d'ADN codant pour les protéines de capside leur permet d'avoir une interaction diminuée ou éliminée avec au moins l'un des récepteurs primaires de l'adénovirus, est une délétion du motif RGD présent dans la base du penton.
Selon encore une autre préférence, la modification s'inspire de l'existence de différents sérotypes adénoviraux qui diffèrent par la taille de la fibre et leur
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capacité à lier ou non le CAR. Ainsi, on peut envisager de réduire la taille de la tige de la fibre Ad5, ou de remplacer la fibre par celle d'un autre sérotype qui ne lie pas le CAR (sous groupe B, Ad3) (Dechecchi et al., 2000,268 : 382-90). Par exemple, on peut pseudotyper un vecteur Ad5 par une fibre Ad3 (Vigne et al., Gene Ther. 2003, 10 :153-62).
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la modification consiste en la substitution de la séquence d'ADN codant pour la fibre adénovirale d'un sérotype donné par la séquence d'ADN codant pour une fibre adénovirale d'un autre sérotype. De préférence, on substitue la fibre Ad5 par la fibre Ad3.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce que la modification consiste en la substitution de la fibre Ad5 par la fibre Ad3 et en une délétion du motif RGD présent dans la base du penton.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode d'obtention de particules adénovirales infectieuses dans des cellules de production, ladite méthode comprenant une étape de transformation desdites cellules de production par le vecteur adénoviral selon la présente invention.
Les termes particule adénovirale , virion ou adénovirus sont utilisés de manière indifférente dans la présente demande.
On entend désigner par cellule de production dans la présente demande toute cellule qui permet d'obtenir des particules adénovirales infectieuses lorsqu'elle est transformée par le vecteur adénoviral de l'invention. Lorsque le vecteur adénoviral est défectif pour la réplication, les cellules de production de particules adénovirales infectieuses de la présente demande sont les cellules qui fournissent les fonctions de complémentation (protéines virales) qui sont absentes du vecteur
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adénoviral. De telles cellules, également appelées cellules de transcomplémentation, sont décrites plus haut.
L'invention a également pour objet les particules adénovirales infectieuses obtenues par la méthode d'obtention selon la présente invention.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral, comprenant l'insertion, dans au moins l'une des séquences d'ADN codant pour des régions à faible contrainte structurale de protéines de capside, d'au moins une séquence d'ADN codant pour un peptide hétérologue selon l'invention.
De préférence, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que l'étape d'insertion est précédée d'une étape de délétion de tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside.
De préférence, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que la protéine de capside est choisie parmi l'hexon, la fibre ou la base du penton, la protéine pVI, pVIII ou pIX.
De manière encore préférée, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que, lorsque la protéine de capside est l'hexon, la région à faible contrainte structurale est la région hypervariable 5 (HVR5).
De manière la plus préférée, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que la séquence d'ADN codant pour la région hypervariable 5 (HVR5) est délétée.
Selon un autre mode de réalisation, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que, lorsque la
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protéine de capside est la fibre, la région à faible contrainte structurale est la boucle HI.
Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que le peptide hétérologue selon l'invention comprend en outre au moins un adaptateur situé en N-ter ou en C-ter.
Selon un mode préféré de réalisation, la méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral selon la présente invention est caractérisée en ce que le peptide hétérologue tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6 comprend un adaptateur situé en N-ter et un adaptateur situé en C-ter.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode in vitro permettant l'expression préférentielle d'une séquence d'ADN d'intérêt dans une cellule cible de mammifère comprenant la mise en contact de ladite cellule avec des particules adénovirales infectieuses selon l'invention, ou avec le vecteur adénoviral selon l'invention ou obtenu selon la méthode de modification du tropisme selon l'invention.
De préférence, la méthode in vitro selon la présente invention est caractérisée en ce que la cellule cible de mammifère est déficiente ou dépourvue en récepteurs CAR.
De manière la plus préférée, la méthode in vitro selon la présente invention est caractérisée en ce que la cellule déficiente ou dépourvue en récepteurs CAR est issue d'une lignée cellulaire choisie parmi les lignées CHO, L929, PC-3, LLC, B 16F 10, RCC law, RCC Aury, U 118, RD, L6 et C2C12.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant un vecteur adénoviral selon la présente invention et un excipient pharmaceutique approprié.
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La composition pharmaceutique selon la présente invention peut être fabriquée selon divers procédés bien connus de l'homme de l'art, en fonction du mode d'administration ; ce mode d'administration comprend l'administration systémique et l'administration localisée (comme par exemple l'administration par aérosol, l'instillation, et l'administration orale). Pour l'administration systémique, on préfère l'injection, par exemple sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intrathécale, intracardiaque (telle que par exemple péricardique), intratumorale, intravaginale, intrapulmonaire, intranasale, intratrachéale, intravasculaire, intraartérielle, intracoronaire, ou intracérébroventriculaire. L'injection intramusculaire ou intratumorale constitue un mode préféré d'administration. L'administration peut être effectuée en une seule dose ou en dose répétée une ou plusieurs fois après un intervalle de temps déterminé.
La composition selon l'invention peut être fournie sous diverses formes, notamment sous forme liquide (par exemple aqueuse).
La composition selon l'invention comprend également un excipient pharmaceutique acceptable pour l'administration du vecteur adénoviral selon l'invention à un corps humain ou animal. L'excipient est de préférence approprié pour l'injection ou est un diluant non toxique pour l'organisme humain ou animal au dosage et à la concentration utilisés (voir par exemple Remington's Pharmaceutical Sciences, last Ed., Mack Publishing Co). Il est de préférence isotonique, hypotonique ou faiblement hypertonique, et possède une force relativement faible, telle que par exemple celle d'une solution de sucrose. De plus, il peut contenir n'importe quels liquides solvants appropriés, aqueux ou partiellement aqueux comprenant de l'eau stérile, apyrogène, un milieu de dispersion, une suspension d'enrobage, et leurs équivalents, ou des diluants (par exemple tampon Tris-HCI, acétate, phosphate), des émulsifiants, des solubilisants, des émulsifiants, ou des adjuvants. Le pH de la composition pharmaceutique est ajusté de manière appropriée. On peut citer par exemple, pour une composition
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injectable, les solutions salines isotoniques qui sont de préférence tamponnées au pH physiologique (tel que les solutions salines au tampon phosphate, au tampon Tris, le mannitol, le dextrose, le glycérol contenant ou ne contenant pas des protéines telles que la sérum albumine humaine). Comme exemples représentatifs de diluants on peut citer le tampon contenant du sucrose (par exemple 1M saccharose, 150 mM NaCI , ImM M9CI25 54 mg/L Tween 80,10 mM Tris pH 8. 5) et le tampon contenant du mannitol (par exemple 10 mg/ml mannitol, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris pH 7,2 et 150 mM NaCI).
De plus, la composition pharmaceutique selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs solutions stabilisantes telles que des lipides (lipides cationiques, liposomes) des inhibiteurs de nucléases, des hydrogels, de la hyaluronidase, de la collagénase, des polymères, des agents de chélation, de manière à prévenir la dégradation du vecteur adénoviral dans le corps humain ou animal et/ou pour améliorer l'administration à la cellule hôte. La composition peut encore comprendre des substances susceptibles de faciliter le transfert de gènes pour des applications spécifiques, telles qu'un complexe gel de polylysine et de lactose pour faciliter l'administration par la voie intraartérielle (Midoux et al., Nucleic Acid Res. 21 (1993), 871-878).
De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à cibler des cellules de mammifère déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation du vecteur adénoviral selon la présente invention pour la fabrication d'un médicament.
De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le médicament est destiné à cibler des cellules de mammifère déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR.
De préférence, le médicament est destiné à cibler les cellules CAR- qui présentent une anomalie par rapport aux mêmes cellules CAR- saines. L'anomalie peut consister en un phénotype différent de celui de la cellule CAR- saine, par exemple
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suite au disfonctionnement de l'expression d'un gène (surexpression, sousexpression, non expression...).
Une telle anomalie présente chez les cellules déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR (CAR-) peut être à l'origine d'une maladie.
De manière encore préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que les cellules de mammifère déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR sont des cellules tumorales, telles que des cellules de gliome, de mélanome, de carcinome, de cancer du poumon, de l'utérus, du sein ou de l'ovaire, de tumeur de la prostate, de tumeur de la vessie, ou des lymphocytes, des fibroblastes, des cellules épithéliales pulmonaires, des cellules du muscle squelettique, du muscle lisse ou du myocarde.
Le vecteur adénoviral selon l'invention, et le médicament qui en est dérivé, est destiné à prévenir ou à traiter toute maladie présente à la suite d'une anomalie des cellules CAR-, comme par exemple, mais sans s'y limiter, un cancer, une maladie pulmonaire, une maladie liée à un disfonctionnement du système immunitaire ou une maladie musculaire.
De manière la plus préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le médicament est destiné à prévenir ou à traiter un sujet atteint d'un cancer du sein, de l'utérus, de la prostate, du poumon, de la peau, de l'ovaire, d'un cancer colorectal, d'une leucémie, de la mucoviscidose ou d'une myopathie.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une protéine de capside adénovirale recombinante comprenant l'insertion dans au moins une région à faible contrainte structurale d'au moins un peptide hétérologue tel que défini dans la présente demande.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet une cellule de mammifère transformée par un vecteur adénoviral selon la présente invention.
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Selon un dernier aspect, l'invention a pour objet une méthode de traitement d'un sujet atteint d'une maladie présente à la suite d'une anomalie des cellules CAR', ladite méthode comprenant l'administration audit sujet du vecteur adénoviral selon l'invention, des particules adénovirales infectieuses selon l'invention ou de la composition pharmaceutique selon l'invention. De préférence, ladite maladie est un cancer du sein, de l'utérus, de la prostate, du poumon, de la peau, de l'ovaire, un cancer colorectal, une leucémie, la mucoviscidose ou une myopathie.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
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LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : de la capside adénovirale.
La partie droite, correspondant à l'agrandissement du penton, indique les zones d'interactions avec les récepteurs cellulaires.
Figure 2 : du génome adénoviral.
Les deux boîtes noires aux extrémités représentent les ITR. Les gènes précoces sont désignés par la lettre E pour Early, et le gène tardifpar la lettre L pour Late.
Figure 3 : de l'hexon d'un adénovirus recombinant par double recombinaison homologue chez E.coli.
Figure 4 : Analyse du pouvoir infectieux d'adénovirus recombinants pour la ss-galactosdiase, à capside sauvage (AE18) ou modifiée dans l'hexon (SE2) par insertion du peptide CKS-17.
Des cellules CAR+ (Hela) ou CAR- (L929) sont infectées à différentes MOI.
L'expression de la p-galactosidase dans les cellules transduites est évaluée par colorimétrie, après fixation des cellules, ou quantifiée sur lysats cellulaires par luminométrie (activité -Gal en RLU. g-1de protéines).
Figure 5 : Fixation spécifique du virus SE2 sur le TGFssRII.
Différentes concentrations de TGFpRII recombinant (1 g, 0,5 g et 0,25 g), et de CAR soluble (0,5 g), sont déposées sur membrane. La fixation spécifique des virus, SE2 ou AE18, est révélée par immunodétection à l'aide d'Ac anti-Ad.
Figure 6 : biochimique des récepteurs solubles.
Western blots de surnageants de Hela non infectées (N.I.) ou infectées par les Ad recombinants Ad/TGFRII-Fc (A) ou Ad/ CAR- Fc (B), suivi d'une immunodétection par des Ac anti-récepteur (TGFssRII ou CAR) ou anti-IgGl .
Figure 7 : Protéine TGFssRII-Fc purifiée.
Electrophorèse sur gel SDS-PAGE, suivie d'une coloration au bleu de Coomassie de la protéine TGFpRII-Fc purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne de protéine A.
Figure 8 : Capacité du virus SE2 [Hexon/CKS-17] à infecter des cellules tumorales de rein.
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La culture primaire Aury (RCC) est infectée à différentes MOI. L'expression de la P-galactosidase est évaluée, après fixation des cellules, par colorimétrie, ou quantifiée sur lysats cellulaires par luminométrie (RLU. g-1 de protéines).
Figure 9 : des récepteurs primaires à l'Ad5 et du TGFssRII à la surface de différentes lignées.
Le taux d'expression des récepteurs (Intégrines aV, [alpha]vss3, [alpha]vss5, TGFRII et CAR) est analysé, par cytométrie de flux, après marquage des cellules avec des Ac anti-récepteurs (CAR et Intégrines) couplés au FITC, ou du TGFss biotinylé (TGFpRII).
Figure 10: Capacité des Ad recombinants à capside modifiée (SE2) ou sauvage (AE18) à infecter des tumeurs in vivo.
Des tumeurs (cellules LLC) pré-établies sont injectées par 2.109 pV de virus SE2 [Hexon/CKS-17] ou de virus contrôle AE18 (capside sauvage). (A) L'expression de la P-galactosidase dans les cellules transduites est observée à J+3 p. i., au microscope (X50) sur coupes après immunodétection, ou (B) quantifiée (RLU. g- 1) à J+2 p. i., dans des lysats de tumeurs. Les points correspondent aux résultats individuels des tumeurs et les barres aux moyennes. (A) et (B) proviennent d'expériences indépendantes.
Figure 11 : Capacité du virus SE2 [Hexon/CKS-17] à infecter des lignées musculaires.
Des cellules L6 et C2C12 sont infectées à différentes MOI. L'expression de la ssgalactosidase dans les cellules transduites est évaluée, après fixation, par colorimétrie ou quantifiée sur lysats cellulaires par luminométrie (RLU. g-1).
Figure 12 : infectieux de différents Ad mutants recombinants pour le gène LacZ. Des cellules Hela et L929 sont infectées à différentes MOI par les virus [Hexon/CKS-17] AE95SE2 et SE2, et les virus contrôles AE95 et AE18.
L'expression de la P-galactosidase dans les cellules transduites est évaluée sur cellules entières par coloration X-gal.
Figure 13 : des protéines de capside permettant de rompre les interactions naturelles entre l'Ad5 et ses récepteurs.
Le virus SE2 [Hexon/CKS-17] à été modifié afin de déléter le motif RGD de la base du penton et/ou pseudotypé par la fibre Ad3.
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EXEMPLES EXEMPLE 1 : MATERIELS ADNc : Les ADNc du récepteur humain de type II au TGF-P et celui du récepteur CAR ont été fournis respectivement par le Dr X. -F. Wong (Duke University, USA) et le Dr E. Vigne (Aventis, Vitry).
Vecteurs : - Plasmide d'expression : SE 17 : ce plasmide, dérivé de pCEP4 (Invitrogen), possède la séquence ADNc codant la partie constante (Fc) des immunoglobulines murines de type IgG1, clonée sous contrôle du promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV) et du site de polyadénylation tardif du virus SV40. Ce vecteur est utilisé pour construire des récepteurs solubles.
- Vecteur navette : pCA350 : ce vecteur, développé dans le laboratoire, porte le gène de résistance à la kanamycine (KmR), un site de clonage multiple ainsi que la partie gauche (5') du génome de l'adénovirus humain de type 5 (Ad 5), de l'ITR 5' au gène pIX.
Dans cette séquence, la région El (position 382 à 3513 de l'Ad5) est éliminée pour permettre l'insertion d'une cassette d'expression. L'origine de réplication conditionnelle R6Ky restreint la réplication de ce plasmide aux bactéries E. coli exprimant le gène pir (pir+). pSE2 : ce plasmide contient les séquences 19244 à 19643 et 19686 à 20084 de l'Ad5 qui bordent la région hypervariable n 5 (HVR5) de l'hexon. Entre ces séquences est insérée la séquence du peptide rétroviral CKS-17. Ce plasmide
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navette comporte également l'origine de réplication colEl, le gène de résistance à la kanamycine (KmR) et le gène sacB, dont le produit métabolise le sucrose en un composé toxique pour E. coli (Vigne & al., 1999).
- Vecteur de recombinaison : pOSE1700 : ce vecteur contient le gène de résistance à la tétracycline (TétR), l'origine de réplication RK2 et la partie droite (3') du génome de l'Ad 5, de la séquence de la pIX à l'ITR 3' (Dr J.-J. Robert, Aventis). Il possède de plus une délétion de 2kb dans la région E3. La séquence pIX permet la recombinaison homologue entre le vecteur navette pCA350 et le vecteur pOSE1700. Ainsi, le génome de l'Ad5, délété des régions El et E3, avec le transgène d'intérêt inséré dans la région El est reconstruit. Ce nouveau plasmide est appelé pAd.
- Episomes adénoviraux : AE18c : épisome contenant le génome de l'Ad 5 AE1AE3, dans lequel le gène lacZ est cloné à la place de la région El sous contrôle du promoteur immediate early du cytomegalovirus (CMV) et du signal de polyadénylation tardif du virus SV40. Il contient un marqueur de résistance à la tétracycline (TetR) (Vigne et al, 1999).
SE2c : épisome identique à AE18, modifié par recombinaison homologue pour y insérer le peptide rétroviral CKS-17 dans la région HVR5 de l'hexon.
AE74c, DB6c et AE95c sont des épisomes adénoviraux dérivés d'AE18c. Ils contiennent respectivement une délétion du motif RGD de la base du penton, le remplacement de la fibre Ad5 par la fibre Ad3, ou ces deux modifications combinées (collaboration Dr E. Vigne, Aventis, Vitry).
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Adénovirus recombinants : AE18 et SE2 sont des virus AE1AE3 obtenus à partir des épisomes AE18c et SE2c. SE2 contient le peptide rétroviral CKS-17 inséré dans l'hexon. Les expériences présentées ci-après ont été réalisées à l'aide de différents stocks d'AE18 (2 stocks) et de SE2 (4 stocks).
Oligonucléotides : - Amplification du domaine extracellulaire des récepteurs : Les oligonucléotides encadrant les ADNc des récepteurs TGFpRII et CAR ont été synthétisés puis purifiés par HPLC (ESGS, Evry). Leur utilisation, dans des réactions de PCR, permet l'obtention de séquences codant pour le domaine extracellulaire des récepteurs.
""')::,\;;l'i.j':i Oligôriucléotïdés Spécifiques ";t:tT" -'**%" J 'Je ADNc produit
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<tb> SE50A <SEP> : <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 4 <SEP> TGFssRII
<tb> TGFssRII <SEP> Humain
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<tb> SES <SEP> 1 <SEP> A <SEP> : <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 6 <SEP> CAR
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<tb> SES <SEP> 1 <SEP> B <SEP> : <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 7 <SEP> Domaine <SEP> extra-cellulaue
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Ces oligonucléotides présentent en début de séquence, un site unique de restriction enzymatique (souligné) qui facilite le clonage du fragment amplifié dans le vecteur d'expression SE 17.
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Ces oligonucléotides présentent en début de séquence, un site unique de restriction enzymatique (souligné) qui facilite le clonage du fragment amplifié dans le vecteur d'expression SE 17.
- Séquençage ou analyse par PCR des vecteurs d'expression :
Oligonucléotide ' " ;':l,"':*IM Sêquêfiëê ùúclêoiî,(Jique "" * *"b "V.l Sé4uenceêibree #"""#*' i':1":-:J::::'i.<' ,..,, X) > >4., "',Yc:}:"'- :.,... ,,,f,lk;":A>, +>'" 10: 91 "' . 1
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<tb> CMVG1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 8 <SEP> Promoteur <SEP> CMV
<tb> SE17A <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 9 <SEP> Début <SEP> séquence <SEP> Fc <SEP> IgG
<tb> IgGAS1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 10 <SEP> Fc <SEP> IgG
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Les oligonucléotides SE50A, SE50B, SE51A et SE51B décrits précédemment, ont aussi été utilisés pour le séquençage.
- Criblage des génomes adénoviraux recombinants :
" li ônucléotiiie ;,;" " " Sèqúenêi1iucléotidiquè â ", ;, s== Séqüençe cÎotée o-s,.. ,'''". ,54;;,,;i;; <"" "SMt ,k.r. ,r zà'3.- ^te ~~:#a >'y.>o:%-t' ,,';,;ii.s& ' \/>< "
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<tb> Hex <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N 11 <SEP> hexon
<tb> SE2B <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 12 <SEP> CKS-17
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Souches bactériennes : XL1 blue : souche d'E. coli n'exprimant pas l'enzyme RecA de réparation de l'ADN (RecA-), utilisée pour le clonage de vecteurs d'expression, et l'amplification des plasmides navettes qui possèdent l'origine colEl.
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Souches bactériennes : XL1 blue : souche d'E. coli n'exprimant pas l'enzyme RecA de réparation de l'ADN (RecA-), utilisée pour le clonage de vecteurs d'expression, et l'amplification des plasmides navettes qui possèdent l'origine colEl.
Texl : E. coli recA-, exprimant la protéine pir (Pir+), qui permet la réplication des plasmides navettes qui possèdent l'origine R6Ky.
G4977: Ecoli recA+, n'exprimant pas polA (Pol I-), qui ne permet pas la réplication des plasmides possédant l'origine colEl. Elle est utilisée pour les étapes de recombinaison homologue lors de la construction des épisomes adénoviraux (pAd).
JM83 : Ecoli recA+, Pir', qui ne permet pas la réplication des plasmides possédant l'origine R6Ky. Elle est utilisée pour l'étape de recombinaison homologue lors de la construction des pAd.
Top 10 : E. coli recA-, utilisée pour amplifier les épisomes adénoviraux (pAd).
Lignées cellulaires : Des types cellulaires d'origines diverses ont été utilisés. Les cellules ont été cultivées en milieu RPMI 1640, Minimum Eagle Medium (MEM), Dubelcco's
<Desc/Clms Page number 37>
MEM (DMEM) ou F 12 (HAM) additionné de 10% de sérum de veau f#tal (LifeTechnologiesTM), ou selon les recommandations de l'ATCC ou de l'ECACC.
Cellules 293 (ATCC CRL-1573) : lignée issue de cellules de rein embryonnaire humain modifiées par l'insertion de fragments d'ADN (position 1 à 4344) de l'Ad 5. Elle est ainsi capable par transcomplémentation de fournir l'activité El nécessaire à l'amplification des adénovirus #E1#E3.
Cellules 911 : issue de rétinoblastes embryonnaires humains modifiés par transfection d'un fragment d'ADN contenant les régions 79 à 5789 du génome de l'Ad 5. Cette lignée est donc également capable de produire les protéines de la région El (Benihoud et al., 1996).
Cellules HeLa (ATCC CCL-2) : lignée issue d'une tumeur humaine du col de l'utérus utilisée pour la production de protéines recombinantes.
Les autres lignées cellulaires et cultures primaires utilisées dans les expériences sont décrites dans le tableau I.
<Desc/Clms Page number 38>
<tb>
<tb> Lignées <SEP> cellulaires <SEP> ATCC <SEP> ou <SEP> ECACC <SEP> Type <SEP> histologique <SEP> -^'Espèce
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<tb> L929 <SEP> CCL-1 <SEP> Fibroblaste <SEP> Souris
<tb> CHO <SEP> CCL-61 <SEP> Ovaire <SEP> Hamster
<tb> PC-3 <SEP> CRL-1435 <SEP> Prostate <SEP> Homme
<tb> LLC <SEP> CRL-1642 <SEP> Poumon <SEP> Souris
<tb> B16-F10 <SEP> CRL-6475 <SEP> Mélanome <SEP> Souris
<tb> RCC <SEP> Law
<tb> E. <SEP> Angevin, <SEP> IGR, <SEP> Villejuif <SEP> Tumeurs <SEP> rénales <SEP> Homme
<tb> Aury
<tb> U118 <SEP> HTB-15 <SEP> Gliome <SEP> Homme
<tb> RD <SEP> CCL-136 <SEP> Rhabdomyosarcome <SEP> Homme
<tb> L6 <SEP> CRL-1458 <SEP> Myoblaste <SEP> - <SEP> Muscle <SEP> squelettique <SEP> Rat
<tb> C2C12 <SEP> CRL-1772 <SEP> Myoblaste <SEP> - <SEP> Muscle <SEP> squelettique <SEP> Souris
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<tb> RCC <SEP> Law
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<tb> RD <SEP> CCL-136 <SEP> Rhabdomyosarcome <SEP> Homme
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<tb> C2C12 <SEP> CRL-1772 <SEP> Myoblaste <SEP> - <SEP> Muscle <SEP> squelettique <SEP> Souris
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Tableau I: Cultures primaires et lignées cellulaires Anticorps et Sérums : - Anticorps primaires :
<tb>
<tb> Anticorps <SEP> Spécificité <SEP> Origine <SEP> 'Isotype <SEP> Couplage <SEP> Référence
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L5 <SEP> particule <SEP> virale <SEP> Lapin <SEP> polyclonal <SEP> Néant <SEP> Vigne <SEP> et <SEP> al <SEP> 1999
<tb> 1070-05 <SEP> IgG1 <SEP> souris <SEP> Chèvre <SEP> Polyclonal <SEP> HRP <SEP> SouthernBiotech
<tb> AF-241-NA <SEP> TGFPRII <SEP> humain <SEP> Chèvre <SEP> IgG <SEP> Néant <SEP> R&D <SEP> Systems
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<tb> RmcB <SEP> CAR <SEP> humain <SEP> Souris <SEP> IgG <SEP> 1 <SEP> Néant <SEP> Upstate
<tb> biotechnology
<tb> AMF7 <SEP> Intégrines <SEP> av <SEP> humaines <SEP> Souris <SEP> IgGI <SEP> FITC <SEP> Beckman-Coulter
<tb> MAB <SEP> 1976F <SEP> Intégrines <SEP> av(33 <SEP> humaines <SEP> Souris <SEP> IgG1 <SEP> FITC <SEP> Chemicon
<tb> MAB1961F <SEP> Intégrines <SEP> [alpha]vss5 <SEP> humaines <SEP> Souris <SEP> IgG1 <SEP> FITC <SEP> Chemicon
<tb> 555748 <SEP> contrôle <SEP> Souris <SEP> IgG1 <SEP> FITC <SEP> Beckton-Dickinson
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<tb> se- <SEP> 103 <SEP> 13 <SEP> CAR <SEP> humain <SEP> Chèvre <SEP> IgG <SEP> Néant <SEP> Santa <SEP> Cruz <SEP>
<tb> RmcB <SEP> CAR <SEP> humain <SEP> Souris <SEP> IgG <SEP> 1 <SEP> Néant <SEP> Upstate
<tb> biotechnology
<tb> AMF7 <SEP> Intégrines <SEP> av <SEP> humaines <SEP> Souris <SEP> IgGI <SEP> FITC <SEP> Beckman-Coulter
<tb> MAB <SEP> 1976F <SEP> Intégrines <SEP> av(33 <SEP> humaines <SEP> Souris <SEP> IgG1 <SEP> FITC <SEP> Chemicon
<tb> MAB1961F <SEP> Intégrines <SEP> [alpha]vss5 <SEP> humaines <SEP> Souris <SEP> IgG1 <SEP> FITC <SEP> Chemicon
<tb> 555748 <SEP> contrôle <SEP> Souris <SEP> IgG1 <SEP> FITC <SEP> Beckton-Dickinson
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- Anticorps secondaires :
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<tb> Anticorps <SEP> Spécificité <SEP> Origine <SEP> Isotype <SEP> Couplage <SEP> @ <SEP> Référence
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M35201 <SEP> IgG+M <SEP> souris <SEP> Chèvre <SEP> F(ab')2 <SEP> FITC <SEP> CalTag
<tb> 605-703-002 <SEP> IgG <SEP> chèvre <SEP> Ane <SEP> IgG <SEP> HRP <SEP> Rockland
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Protéines recombinants:
<tb> 605-703-002 <SEP> IgG <SEP> chèvre <SEP> Ane <SEP> IgG <SEP> HRP <SEP> Rockland
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Protéines recombinants:
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<tb> Protéines <SEP> recombinantes <SEP> @ <SEP> Origine <SEP> Caractéristiques <SEP> Référence
<tb> CAR <SEP> domaine <SEP> extra <SEP> cellulaire <SEP> Recombinant <SEP> Humain <SEP> Dr <SEP> Curiel, <SEP> Alabama
<tb> TGFssRII <SEP> (241-R2) <SEP> Recombinant <SEP> Humain <SEP> R&D <SEP> Systems
<tb> TGFp-biotine <SEP> Recombinant <SEP> Humain <SEP> R&D <SEP> Systems
<tb>
TGF/?RII humain : protéine recombinante formée des 159 acides aminés du domaine extracellulaire du récepteur de type II au TGF-ss1 (Lin & al., 1992). La protéine contient 136 acides aminés, après clivage de 23 a. a. constituant le peptide signal (R&D systems).
<tb> Protéines <SEP> recombinantes <SEP> @ <SEP> Origine <SEP> Caractéristiques <SEP> Référence
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<tb> TGFssRII <SEP> (241-R2) <SEP> Recombinant <SEP> Humain <SEP> R&D <SEP> Systems
<tb> TGFp-biotine <SEP> Recombinant <SEP> Humain <SEP> R&D <SEP> Systems
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TGF/?RII humain : protéine recombinante formée des 159 acides aminés du domaine extracellulaire du récepteur de type II au TGF-ss1 (Lin & al., 1992). La protéine contient 136 acides aminés, après clivage de 23 a. a. constituant le peptide signal (R&D systems).
EXEMPLE 2 : METHODES Construction de plasmides navettes : - Construction de récepteurs solubles : TGFssRII-Fc et CAR-Fc : Construction des ADNc codant pour les antagonistes des récepteurs : Pour obtenir l'ADNc des antagonistes, les séquences correspondant aux domaines extra-cellulaires du TGFpRII, ou du récepteur CAR, ont été amplifiées à l'aide de différents oligonucléotides (0,5 M) (cf. tableau exemple 1, oligonucléotides , amplification du domaine extracellulaire des récepteurs ) par 30 cycles de PCR (dénaturation 94 C, appariement 60 C, élongation 72 C) avec 1U d'ADN polymérase (DyNAzyme EXT, Finnzymes) en présence de dNTP 0,2mM, MgCl2 l,5mM. L'appariement du 1er cycle de PCR est réalisé à 50 C. Ces PCR ont été
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réalisées à partir de plasmides contenant la séquence du TGFpRII complet ou celle du domaine extra cellulaire du CAR.
Un aliquot de l'amplification est analysé sur gel d'agarose, le reste de la préparation est débarrassé des dNTP (QIAquick PCR purification, Qiagen) et digéré par les enzymes de restriction adéquates pour libérer des extrémités compatibles avec le vecteur d'expression. Ces produits d'amplification digérés sont déposés sur gel d'agarose puis élués (QIAquick Gel Extraction, Qiagen) et quantifiés par électrophorèse sur gel d'agarose.
Linéarisation du plasmide : Le vecteur contenant la séquence Fc des IgG1 murines dans la cassette d'expression CMV-polyA, est linéarisé par les enzymes de restriction Bam HI et Xho 1 (1U/ g d'ADN). Le vecteur est ensuite déphosphorylé par la phosphatase intestinale de veau (CIP lOU/réaction) afin d'empêcher sa recircularisation et de favoriser la ligation avec le fragment de PCR digéré. Après électrophorèse sur gel d'agarose, la bande correspondant au vecteur linéarisé est découpée, pour éviter une contamination par du vecteur circulaire. L'ADN plasmidique est purifié (QIAquick Gel Extraction, Qiagen) puis analysé et quantifié après électrophorèse sur gel d'agarose.
Ligation et transformation : Pour la construction des récepteurs solubles, le fragment de PCR correspondant est ligué avec le plasmide SE17 linéarisé (AmpR), une nuit à 16 C avec une unité de la ligase à ADN du phage T4 (Biolabs) en présence d'ATP 10mM. Un aliquot des ligations est introduit dans des bactéries XLI-Blue par électroporation (25 F, 200Q, 12,5kv/cm2). Après une incubation d'une heure à 37 C sous agitation, permettant l'expression du marqueur de résistance à l'ampicilline, les bactéries sont étalées sur milieu Luria Bernati (LB) additionné d'ampicilline (LB-Ampi 20 g/ml) et incubées une nuit à 37 C.
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Criblage des transformants : Les colonies bactériennes obtenues sont amplifiées une nuit à 37 C sous agitation en milieu LB-Ampi (50ug/mL). L'ADN plasmidique est préparé à partir des cultures bactériennes par lyse alcaline suivie d'une purification sur colonne échangeuse d'ions fixant l'ADN (Kit Wizard Plus SV minipreps, Promega). Les plasmides obtenus sont analysés par digestion enzymatique (encadrement et orientation) pour vérifier l'insertion du fragment.
Production des plasmides d'expression : Pour chaque clonage, deux plasmides recombinants sont amplifiés en milieu LBAmpi une nuit à 37 C sous agitation. L'ADN est extrait par lyse alcaline suivie d'une purification sur colonne échangeuse d'ions (Kit Qiafilter Plasmid midi, Qiagen). La concentration et la pureté de la préparation sont déterminées par mesure de l'absorbance à 260nm et 280nm. Les plasmides recombinants sont vérifiés par digestion enzymatique puis par séquençage à l'aide d'oligonucléotides (ESGS, Evry).
Obtention du plasmide navette recombinant : Après digestion enzymatique par les enzymes Notl et Sali, la cassette d'expression [CMV-antagoniste-polyA] est isolée du plasmide d'expression (SE17 contenant le CAR-Fc ou le TGFpRII-Fc) sur gel d'agarose, puis éluée suivant le protocole QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Parallèlement, le vecteur navette pCA350 (KmR) est linéarisé entre l'ITR-# et la séquence pIX par les mêmes enzymes, puis déphosphorylé. Un aliquot de l'ADN correspondant à la cassette d'expression [CMV-produit de PCR-polyA] purifiée, est ligué avec le vecteur navette. La ligation est introduite par électroporation dans des bactéries Tex 1. Après une incubation d' 1 h à 37 C permettant l'expression de la résistance à la kanamycine,
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les bactéries sont étalées sur boîte LB-Kanamycine (LB-Km 50u.g/ml) et incubées à 37 C toute la nuit.
Le criblage des transformants et la préparation quantitative de l'ADN du plasmide navette s'effectuent de manière identique aux vecteurs d'expression, seul le milieu de sélection utilisé varie (LB-Km 50 g/ml). Quand les digestions enzymatiques ne permettent pas de discriminer les plasmides recombinants, une amplification par PCR (94 C, 50 C, 72 C) avec 1,25U de Taq DNA polymérase (Promega) en présence de dNTP 0,2mM, MgCl2 l,5mM et 0,5 M d'oligonucléotides (cf. tableau exemple 1, oligonucléotides , séquençage ou analyse par PCR des vecteurs d'expression ) est réalisée directement sur une colonie isolée ou sur l'ADN plasmidique. Les oligonucléotides utilisés encadrent le site de clonage et permettent ainsi d'identifier les clones ayant inséré la cassette d'expression dans l'orientation correspondant à sa transcription de l'ITR 5' vers pIX.
Construction des génomes adénoviraux recombinants (backbones) : Deux méthodes basées sur la recombinaison homologue permettent de construire, en les modifiant, des génomes adénoviraux. Une première méthode rapide utilise une simple recombinaison homologue mais ne permet de modifier que la partie 5' du génome Ad, qui contient le transgène (J.J. Robert, Aventis). La seconde méthode, plus longue, permet de modifier par double recombinaison homologue n'importe quelle séquence du génome Ad (J. Crouzet, Aventis).
- Préparation des bactéries compétentes contenant un épisome adénoviral : Pour la simple recombinaison homologue, le plasmide pOSE1700, tétracycline résistant, codant pour la partie droite (pIX à l'ITR 3') du génome de l'Ad 5 est introduit par choc thermique dans des bactéries JM83. Après une incubation d' 1 h à 37 C permettant l'expression de la résistance à la tétracycline, les bactéries sont étalées sur boîtes LB-Tét (12 g/ml) et incubées une nuit à 37 C. Une colonie isolée est amplifiée pour préparer des bactéries compétentes [JM83+pOSE1700].
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Pour la double recombinaison homologue, Les épisomes adénoviraux TetR (AE74, DB6 ou AE95) sont introduits par choc thermique dans des bactéries compétentes G4977. Après une heure d'incubation en milieu Luria Bemati (LB) sous agitation à 37 C permettant l'expression de la résistance à la tétracycline, les bactéries sont étalées sur LB-tétracycline (12ug/ml) et incubées une nuit à 37 C. Une colonie isolée (contenant l'épisome adénoviral) est amplifiée pour préparer des bactéries compétentes.
- Recombinaison homologue :
Dans la méthode de simple recombinaison homologue, le plasmide navette dérivé de pCA350 (KmR) est introduit par choc thermique dans les bactéries compétentes [JM83+pOSE1700]. Après lh d'incubation à 37 C permettant l'expression des marqueurs de résistance à la kanamycine et à la tétracycline, les bactéries sont amplifiées en milieu LB-Tet-Km (respectivement 12 g/ml et 50 g/ml) une nuit à 37 C sous agitation. On sélectionne ainsi les bactéries TétR KmRayant réalisé une recombinaison homologue (au niveau de la séquence codant pour la pIX) entre le génome du plasmide navette et le vecteur de recombinaison pOSE1700. Cet événement permet l'émergence d'un 3e plasmide, pAd, codant pour un génome adénoviral et contenant la cassette d'expression pour le transgène d'intérêt. Les vecteurs navettes non incorporés sont incapables de se répliquer dans la souche bactérienne choisie tandis que la kanamycine permet d'éliminer les bactéries [JM83+pOSE1700] non transformées. L'ADN des pAd est préparé, à partir des cultures bactériennes, par la technique de lyse alcaline suivie d'une extraction phénol-chloroforme, la taille des plasmides rendant peu efficace la purification sur colonne échangeuse d'ions.
Dans la méthode de simple recombinaison homologue, le plasmide navette dérivé de pCA350 (KmR) est introduit par choc thermique dans les bactéries compétentes [JM83+pOSE1700]. Après lh d'incubation à 37 C permettant l'expression des marqueurs de résistance à la kanamycine et à la tétracycline, les bactéries sont amplifiées en milieu LB-Tet-Km (respectivement 12 g/ml et 50 g/ml) une nuit à 37 C sous agitation. On sélectionne ainsi les bactéries TétR KmRayant réalisé une recombinaison homologue (au niveau de la séquence codant pour la pIX) entre le génome du plasmide navette et le vecteur de recombinaison pOSE1700. Cet événement permet l'émergence d'un 3e plasmide, pAd, codant pour un génome adénoviral et contenant la cassette d'expression pour le transgène d'intérêt. Les vecteurs navettes non incorporés sont incapables de se répliquer dans la souche bactérienne choisie tandis que la kanamycine permet d'éliminer les bactéries [JM83+pOSE1700] non transformées. L'ADN des pAd est préparé, à partir des cultures bactériennes, par la technique de lyse alcaline suivie d'une extraction phénol-chloroforme, la taille des plasmides rendant peu efficace la purification sur colonne échangeuse d'ions.
Dans la méthode de double recombinaison homologue, le plasmide navette pSE2, contenant le peptide CKS-17 dans l'hexon, est introduit par choc thermique dans des bactéries compétentes [G4977 + épisome adénoviral TetR]. Après une incubation d'une heure permettant l'expression des gènes de résistance aux
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antibiotiques, les bactéries sont étalées sur milieu LB-Tet-Km afin de sélectionner les bactéries TetR KmR contenant le co-intégrat (épisome adénoviral dans lequel le plasmide navette est inséré par recombinaison homologue) (cf. figure 3). Les plasmides non incorporés sont éliminés car ils ne se répliquent pas dans la souche bactérienne choisie et les bactéries [G4977 + épisome TetR] sont tuées par la kanamycine. Après amplification des colonies bactériennes, l'ADN épisomal est préparé par lyse alcaline, suivie d'une extraction phénol-chloroforme (la taille des épisomes rend peu efficace l'utilisation de colonnes échangeuse d'ions). L'intégration du plasmide dans l'épisome (étape de co-intégrat) est vérifiée par digestion enzymatique.
Les colonies contenant le co-intégrat sont mises en culture en milieu LB-Tet. Pour favoriser le second événement de recombinaison homologue, les bactéries sont étalées sur milieu LB-Tet contenant 5% sucrose qui permet de sélectionner les bactéries ayant éliminé le gène sacB après une nouvelle recombinaison homologue dans le co-intégrat au niveau de la région modifiée du génome. Le co-intégrat peut se résoudre de deux façons pour donner : - soit l'épisome adénoviral initial, - soit l'épisome adénoviral contenant la nouvelle séquence nucléotidique insérée dans le génome adénoviral (cf. figure 4).
L'identification des colonies possédant l'épisome recombinant est faite par amplification par PCR (94 C, 50 C, 72 C) avec 1,25 unités d'Extrapol Il (Eurobio) en présence de dNTP 0,2mM, MgCl2 l,5mM et 0,5uM d'oligonucléotides, directement à partir d'une colonie isolée.
Les épisomes recombinants sont extraits par lyse alcaline à partir de cultures de différents clones puis analysé par digestion enzymatique ou PCR.
- Amplification de l'épisome adénoviral recombinant : L'épisome adénoviral (pAd) recombinant est introduit dans des bactéries compétentes ToplO par électroporation (25F, 200Q, 12,5kv/cm2). Ces bactéries,
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étant déficientes pour la réparation par recombinaison homologue, permettent de propager de façon stable l'épisome adénoviral recombinant. Après une incubation d'une heure à 37 C sous agitation, durant laquelle les marqueurs de résistance à un antibiotique sont exprimés, les bactéries sont étalées sur milieu LB+antibiotique et incubées une nuit à 37 C. Après amplification de 2 colonies bactériennes, les épisomes recombinants (pAd) sont analysés par digestion enzymatique ou par PCR afin de confirmer leur structure.
Une colonie contenant le génome adénoviral recombinant est alors amplifiée dans 500ml de milieu ad hoc une nuit à 37 C sous agitation. L'ADN est extrait en trois étapes. Il est libéré de la bactérie par lyse alcaline, débarrassé du génome bactérien par traitement à l'exonucléase III et enfin purifié sur une colonne échangeuse d'ions (Large-Construct Kit, Qiagen). Sa concentration et sa pureté sont déterminées par mesure de l'absorbance à 260nm et 280nm. La structure du pAd est vérifiée par digestion enzymatique.
Obtention des adénovirus recombinants : - Transfection : Le génome adénoviral recombinant est libéré de l'épisome (pAd) par digestion enzymatique (Pac I) et purifié par une extraction phénol-chloroforme. Cet ADN (5 à 10 g) est introduit dans des cellules 293 par lipofection (Effectene, Qiagen) puis, après 24 heures, le milieu est changé. Quand les cellules s'arrondissent et se décollent (effet cytopathique dû au virus environ 8 jours après transfection), elles sont récoltées puis lysées par des cycles de congélation/décongélation permettant ainsi la libération du virus. Après centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, le surnageant contenant le virus est récupéré.
- Amplification et purification du virus : Le titre viral (exprimé en particules virales par mL, pV.ml-1) du surnageant de transfection est mesuré par HPLC (Blanche et al, 2000). Ce titre permet de définir
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le volume optimal nécessaire pour les différentes amplifications (Multiplicity Of Infection = MOI, 100 pV.cellule-1). Les virus sont amplifiés sur cellules 293 jusqu'à obtention d'un titre viral satisfaisant (1010 pV.ml-1). Puis, des cellules 293 (environ 5.108 à 70 % de confluence) sont infectées pour l'obtention d'un stock de virus. Les cellules sont récoltées 40 à 72 h après infection, centrifugées puis lysées par des cycles de congélation et décongélation. Une nouvelle centrifugation (4000 rpm) élimine les débris cellulaires, puis le surnageant contenant le virus est déposé sur un gradient de chlorure de césium (CsCI) tamponné à pH 7,4 (densité 1,25 et 1,4), puis ultracentrifugé à 18 C, 2 h à 35000 rpm. La bande de virus à l'interface des 2 densités est prélevée puis ultracentrifugée à 18 C, en CsCI (densité 1,34), 24 h à 35000 rpm. Ces étapes d'ultracentrifugation ont pour but de concentrer le virus et de le séparer des protéines et capsides vides non matures présentes dans le surnageant. Le virus est dessalé sur colonne Séphadex G-25M (Pharmacia Biotech) par élution au PBS. Du glycérol (7% final) est ajouté à la suspension de virus purifiés permettant sa conservation à -80 C.
- Titration : La quantification du nombre de particules virales est obtenue en HPLC (en pV.ml- 1) par rétention sélective sur une colonne échangeuse d'anions Q sepharose XL (Amersham Pharmacia), élution autour de 20mM NaCl et comparaison à une suspension virale étalon (Blanche & al., 2000). Parallèlement, la quantification du nombre de particules virales infectieuses est obtenue par mesure des pfu (unité formant plage). Des cellules 911 sont infectées avec différentes dilutions de virus et incubées 1 h à 37 C. Après avoir retiré la suspension, on ajoute une couche de mélange agarose 1% (FMC, Sea Plaque), milieu nutritif MEM 1X (Eurobio), glutamine 1% et SVF 2%. Les cellules sont nourries de la même façon tous les 3-4 jours. Après 14 jours, les plages de lyse sont dénombrées pour chaque dilution. Le titre viral en pfu.ml-1 est obtenu en rapportant ce nombre de plages au volume d'infection et au facteur de dilution.
Caractérisation biochimique des récepteurs solubles :
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- Détection des récepteurs solubles par western blot : Les antagonistes solubles sont produits après infection de 107 cellules HeLa par l'adénovirus recombinant correspondant, à la MOI de 1000 pV, en milieu DMEM 2% SVF. Après 24h d'infection, les cellules sont lavées au PBS et remises en culture en milieu dépourvu de sérum pendant 4 jours. Après centrifugation, le surnageant est chauffé 30min à 56 C pour inactiver les virus restants.
Les surnageants (antagonistes solubles) sont dilués dans du Laemmli lx, DTT 0,lmM pour être chauffés à 95 C. Après une électrophorèse (115mA, 110V) réalisée sur gel NuPage Bis-Tris 10% (Novex) en tampon MOPS (3-(Nmorpholino) propane sulfonic acid), les protéines (18 L de surnageant) sont transférées (150mA, 18V soit 3mA/cm2) sur une membrane de nitrocellulose (porosité 0,45uM, Schleicher & Schuell) durant lh30. La membrane est ensuite saturée en PBS 0,1% tween (PBST) -5% lait. Après plusieurs lavages en PBST, elle est incubée 1h en présence du premier anticorps dilué en PBST-2% lait. Suite à de nouveaux lavages, un anticorps secondaire, couplé à la péroxydase, est déposé en PBST-2% lait sur la membrane pendant lh. Après lavage, les anticorps fixés sont révélés par une exposition radiographique qui met en évidence l'émission de photons libérés par la transformation d'un substrat, le luminol, par la peroxydase (ECLTM, Amersham Pharmacia Biotech).
- Purification des récepteurs solubles : La purification des antagonistes solubles s'effectue à partir de surnageants de culture de cellules HeLa (environ 800 ml de culture en partant de 8.108 cellules) infectées par les adénovirus recombinants adéquats. Les protéines sont ensuite précipitées au sulfate d'ammonium (50%) une nuit à 4 C. Après une centrifugation de 20 min à 10000 rpm, le précipité est repris en PBS pour être dialysé contre du PBS, à 4 C. La solution dialysée est ensuite ajustée par du NaCl 3M final, acide borique lOmM (pH 8,9). Les surnageants sont déposés (débit 1 ml/min) sur colonne de Protéine A (Hi Trap rProtein A, Parmacia Biotech) qui retient les antagonistes solubles par interaction entre la protéine A et leur partie
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Fc. Après lavage (25ml) en tampon NaCl 3M, borate de sodium lOmM (pH 8,9), les protéines recombinantes sont récupérées, par fraction de 500 l, grâce à une élution acide (glycine 100mM, pH 5) qui sera ensuite neutralisée par 501 de Tris 1M, pH 8. Les protéines purifiées sont dialysées (Slide-A-Lyzer Dialysis Products, Pierce) contre du PBS et la quantité de protéine ( g.ml-1) présente dans le dialysat est mesurée par un test de Bradford. La pureté de la préparation est analysée sur gel Nu-Page Bis-tris 10% coloré au Bleu de Coomasie.
Analyse du pouvoir infectieux des virus : - SLOT BLOT : Différentes quantités de protéines sont déposées, dans 200 l de PBS, sur une membrane de nitrocellulose (HybondTM ECLTM, Amersham Pharmacia Biotech).
La membrane est ensuite saturée avec du PBS-lait 5%, à 4 C sur la nuit. Après deux lavages de la membrane avec du PBS-NP40 0,05%, la membrane est incubée 4 heures à température ambiante avec 20 ml de solution virale à 1010 pV.ml-1 en PBS, NP40 0,05%, lait 0,5%. Après lavage, la membrane est incubée, 2 heures à température ambiante, avec un Ac anti-Ad (sérum L5, exemple 1, anticorps et sérums , anticorps primaires ) au 1/2 000e en PBS-NP40 0,05%-lait 0,5%.
Après lavage, les Ac fixés sont révélés (cf. exemple 1, anticorps et sérums , anticorps secondaires ).
- Tests d'infectivité des adénovirus recombinants : Tous les tests sont réalisés en double, en utilisant à chaque fois deux stocks viraux différents pour chaque type de virus.
*Des plaques de culture 12 puits sont ensemencées avec de 3 à 10.104 cellules par puits dans 2 ml de milieu adéquat. Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence (105 à 106 cellules par puits) elles sont infectées à différentes MOI (102, 103, 104 pV.cellule-1) avec les différents adénovirus recombinants (portant le transgène lacZ), dans un volume de 400 l de milieu sans serum. Après 1h à 37 C
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sont ajoutés pour chaque puits 2 mL de milieu ad hoc complémenté par 10% de SVF. L'entrée du virus est évaluée après 24h d'infection.
- Détection colorimétrique : Le milieu d'infection est retiré et les cellules sont fixées (formaldéhyde 1%, glutaradéhyde 0,2%), puis rincées avec du PBS.
L'activité P-galactosidase est révélée par ajout du substrat X-gal (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-(3-D-galactoside 0,4mg/ml, ferrocyanide de potassium 4mM, ferricyanide de potassium 4mM, MgCl2 2 mM) durant une nuit à 37 C. Le lendemain, après lavage au PBS, le nombre de cellules transduites est évalué par l'observation macroscopique de la coloration bleue.
- Détection luminométrique : milieu d'infection est retiré et les cellules sont lavées au PBS puis solubilisées par lOOul de tampon de lyse (potassium phosphate 100 mM pH 7,8, triton 0,1%, DTT 0,2 mM, 1 cocktail d'anti-protéase (Roche) pour IOmL), 30 min à 4 C. Le lysat cellulaire est centrifugé, 5 min à 10000 rpm, afin de retirer les débris cellulaires. L'activité P-gal est mesurée pendant 5 secondes (en RLU = Relative Light Unit) sur un aliquot du lysat cellulaire (Luminescent beta-galactosidase détection Kit II, Clontech) (Luminomètre Lumat LB 9501, Berthold). La quantité de protéines totales présentes dans le lysat cellulaire est mesurée (en g) par un test de Bradford (Protein Assay, Bio-rad).
L'activité P-galactosidase est rapportée à la quantité de protéines totales présentes dans le lysat cellulaire (RLU. g)-1). Les mesures de la RLU et de la quantité de protéines, sont réalisées en double.
-FACS: Les cellules sont décollées à l'aide de PBS-EDTA. Les taux de récepteurs membranaires (CAR, Intégrines, Intégrines [alpha]vss3, Intégrines [alpha]vss5 et TGFpRII) sont déterminés sur les cellules (500,000) après incubation avec un Ac directement couplé au FITC, ou avec un Ac non couplé, durant 45 min à 4 C, puis avec l'anticorps IIr couplé au FITC (30 min, à 4 C). Le témoin négatif est effectué en marquant les cellules non traitées par un anticorps non-spécifique, ou, dans le cas
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d'un marquage indirect, en omettant le premier Ac (exemple 1, anticorps et sérums , anticorps primaires et anticorps secondaires ).
La mesure du taux de TGFRII membranaire s'effectue à l'aide du kit fluorokine (R&D), brièvement les cellules (100,000) sont incubées avec le TGF-l humain couplé à la biotine (60 min à 4 C), suivi d'une incubation avec de l'avidine couplée au FITC (30 min, à 4 C). Le témoin négatif est effectué en incubant les cellules avec une protéine irrelevante également couplée à la biotine.
Les lavages sont faits en PBS ou dans le tampon ad hoc. L'intensité de fluorescence est mesurée sur cellules fixées (PBS-Formaldéhyde 4%) ou non, à l'aide d'un cytofluoromètre (FacsCalibur#).
Transfert de gènes intra-tumoral : Des souris C57B16 (femelles, 8 à 10 semaines) sont d'abord injectées en sous cutané à 2.106 cellules LLC (dans 100 l de PBS). Lorsque les tumeurs atteignent une taille d'environ 5mm de diamètre (environ 15 jours), une injection intratumorale de virus est réalisée (4.1010 pV dans 50 l de PBS). Dans une première expérience, les souris sont sacrifiées 3 jours après l'administration virale. Les tumeurs sont prélevés et fixées en solution aqueuse de GlyoFixx(5%)-EtOH(10%).
Après inclusion en paraffine, les tumeurs sont coupées (5 m) et la P-galactosidase est révélée à l'aide d'un Ac de lapin anti-p-galactosidase (Cappel), suivi par une incubation avec un second Ac HRP (Power Vision, Microm). L'activité peroxydase est alors révélée par le DAB, puis les lames sont contre colorées à l'hematoxiline de Mayer. Dans une seconde expérience, les souris sont sacrifiées 2 jours après l'administration virale, puis les tumeurs sont prélevées et congelées à - 80 C. Elles sont ensuite homogénéisées par un ml de tampon de lyse (cf. exemple 2, analyse du pouvoir infectieux des virus , tests d'infectivité des adénovirus recombinants ) en utilisant le FastPrep TM System (Bio 101). Après centrifugation à 10000 rpm, 15 min à 4 C, l'activité P-Gal est mesurée par luminométrie dans les surnageants.
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EXEMPLE 3 : ANALYSE DES MECANISMES D'ENTREE DU VIRUS A CAPSIDE MODIFIEE, SE2[HEXON/CKS-17] Une nouvelle voie d'entrée CAR indépendante : Afin de contrôler que l'insertion du peptide CKS-17 dans l'hexon n'altère pas le pouvoir infectieux du virus SE2, nous avons réalisé des tests d'infectivité in vitro.
L'entrée des adénovirus dans une cellule étant principalement conditionnée par l'interaction de la fibre avec le récepteur cellulaire CAR, nous avons utilisé des cellules exprimant ce récepteur (HeLa). Les infections ont été réalisées à différentes multiplicités d'infection (MOI de 102, 103 et 104 pV.cellule-1). La quantité de cellules transduites est évaluée, à 24 heures p.i., par la mesure de l'expression du gène rapporteur lacZ porté par le génome adénoviral (coloration X-gal et/ou activité p-gal exprimée en RLU. g-1 de protéines).
La figure 4 montre que la quantité de cellules CAR+ transduites par le virus SE2 [hexon CKS-17] est comparable à celle observée pour le virus contrôle AE18 (hexon sauvage). L'analyse quantitative de l'activité p-gal, obtenue sur des lysats de cellules infectées, confirme les résultats des tests colorimétriques (figure 4). Par exemple, à la MOI de 103 pV.cellule-1, nous n'avons observé aucune différence significative entre l'activité de la -galactosidase dans les cellules infectées par le virus SE2 (6,5.105 RLU. g-1) par rapport à celle des cellules infectées par l'AE18 (7,4.105 RLU. g-1).
Au contraire, les tests d'infectivité réalisés sur cellules CAR négatives (L929, Vigne et al., 2003) montrent que le virus SE2 rentre efficacement à la MOI de 104 pV.cellules-1 contrairement au virus contrôle AE18 (coloration X-gal). De même, la mesure de l'activité P-gal indique que le virus SE2 entre dès la MOI de 103 pV.cellules-1, avec une entrée 20 fois plus efficace que celle du virus contrôle AE18, à 104 pV.cellules-1 (4,1.10' RLU. g-1 contre 2,0.104 RLU. g-1).
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Ces résultats indiquent que le virus SE2 conserve la capacité à infecter des cellules CAR+ et que l'insertion du peptide CKS-17 dans l'hexon ne modifie pas les interactions de la fibre avec le récepteur CAR. De plus, ils mettent en évidence que l'insertion du peptide CKS-17 dans l'hexon, dote le virus d'une nouvelle voie d'entrée CAR-indépendante.
Caractérisation de la nouvelle voie d'entrée : - Rôle du récepteur de type Il au TGFss: Dans un premier temps, nous avons analysé si le virus SE2 était capable de se lier au TGFpRII recombinant. Différentes concentrations de CAR et de TGFRII recombinant ont été immobilisées sur membranes de nitrocellulose avant incubation avec les virus AE18 et SE2. Les virus fixés ont été révélés par des Ac spécifiques anti-Ad.
Les résultats indiquent que les virus AE18 et SE2 interagissent bien avec le récepteur CAR (figure 5). De plus, le virus SE2, mais pas le contrôle AE18, est capable d'interagir avec le TGF(3RII immobilisé sur membrane (figure 5). Le marquage est spécifique puisque son intensité est proportionnelle à la quantité de TGFPRII déposée.
- Production de récepteurs solubles : Construction d'adénovirus recombinants : Pour prouver le rôle du récepteur de type II au TGFss dans la voie d'entrée mise en évidence, il est nécessaire de montrer qu'une compétition avec du TGFPRII inhibe efficacement l'infection de cellules CAR- (par exemple L929). Ceci implique de pouvoir disposer de protéines recombinantes solubles en quantité suffisante. Nous avons donc choisi de construire un adénovirus recombinant codant un TGFpRII soluble. Parallèlement, nous avons construit un adénovirus recombinant codant un CAR soluble pour neutraliser les fibres Ad5 du virus SE2, et tester sa capacité à rentrer de façon CAR--indépendante dans différents types cellulaires CAR+.
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Les séquences codant la partie extra-cellulaire du TGFpRII et du CAR humains ont été amplifiées par PCR et clonées en phase avec la partie constante (Fc) des IgGl murines. Les ADNc chimériques, sous contrôle du promoteur précoce immédiat CMV et du site de polyadénylation tardif du virus SV40, codent des protéines qui peuvent se dimériser par formation de ponts disulfures entre deux protéines de fusion au niveau des parties Fc. La présence de la partie Fc confère au domaine extra-cellulaire une plus grande stabilité (augmentation de la demi-vie).
Une fois confirmées par séquençage, les cassettes d'expression des plasmides (codant le TGFpRII-Fc et le CAR-Fc) ont été isolées et introduites dans un vecteur navette qui, après recombinaison homologue chez E. coli avec le plasmide portant la partie 3' du génome adénoviral, permet d'obtenir un génome adénoviral recombinant (AE1AE3) (cf. exemple 2, construction des génomes adénoviraux recombinants (backbones) ). Les génomes adénoviraux ont été transfectés dans des cellules complémentant la région El pour produire les virus correspondants. Ainsi, nous avons isolé les adénovirus recombinants Ad/TGFpRII-Fc et Ad/ CARFc. Ces deux virus ont été amplifiés pour obtenir des stocks viraux. Ces stocks ont été purifiés sur gradient de chlorure de césium, et titrés à la fois par mesure des particules virales totales (pV.ml-1 déterminées en HPLC), et par mesure des particules infectieuses (pfu.ml-1).
Caractérisation biochimique des récepteurs solubles : Afin de contrôler que les deux Ad recombinants construits codent des récepteurs de fusion, nous avons analysé l'expression de ces récepteurs, dans des surnageants de cellules HeLa infectées par ces Ad, par électrophorèse suivie d'un western blot révélé par un Ac dirigé contre la partie Fc des récepteurs solubles. Aucune protéine n'est détectée dans les surnageants de cellules HeLa non infectées. En revanche, les surnageants de culture de cellules infectées par les Ad recombinants, Ad/TGFpRII-Fc et Ad/ CAR- Fc, présentent une bande majoritaire de poids moléculaire (PM) respectif de 41,6 et 52 kDa (figure 6). Après deshybridation des
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membranes et révélation à l'aide d'Ac dirigés spécifiquement contre le domaine extra-cellulaire de chacun des récepteurs (TGF(3RII ou CAR), nous avons observé la présence d'une bande unique, de taille attendue, pour chaque type de surnageant (figure 6). La détection des récepteurs solubles, dans des surnageants de culture, à la fois par leur partie spécifique et leur partie commune Fc, indique que les protéines exprimées par les Ad/TGFssRII-Fc et Ad/ CAR- Fc sont des protéines fusion sécrétées.
Purification du TGFpRII-Fc et du CAR Fc : Les cellules HeLa ont été infectées par l'Ad/TGFpRII-Fc ou l'Ad/ CAR- Fc. Les surnageants récoltés, contenant la protéine TGFssRII-Fc en grande quantité, ont été précipités au sulfate d'ammonium, dialysés et purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne de protéine A. Une première expérience nous a permis d'obtenir Img de protéine recombinante purifiée à partir d'un litre de surnageant (figure 7). Le degré de pureté de la préparation de TGFpRII-Fc est visualisé sur gel SDS-PAGE après coloration au bleu de Coomassie. On observe sur le gel une bande supplémentaire autour de 90 kDa, il pourrait s'agir d'agrégats. La production de surnageants conditionnés, contenant le CAR'Fc est actuellement en cours. Ces protéines purifiées en quantité nous permettront d'inhiber, par compétition, les récepteurs cellulaires TGFpRII et/ou CAR dans les tests d'infectivité.
EXEMPLE 4 : CAPACITE DU VIRUS SE2 A INFECTER LES CELLULES TUMORALES : Transduction de cellules tumorales in vitro : Différentes lignées tumorales ont été infectées par le virus SE2 ou le virus contrôle AE18, et le transfert de gène a été évalué par coloration à l'X-gal. Après infection par le virus SE2, les lignées de mélanome (B 16F 10, souris), de gliome (U118, homme), de cancer du poumon (LLC, souris), de tumeur de la prostate
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(PC3, homme), et de cancer ovarien (CHO, hamster) présentent une coloration bleue plus importante que celle observée après infection par le virus contrôle AE18 (données non présentées). C'est également le cas d'une culture primaire (Aury) et d'une lignée (Law) issues de tumeurs de reins de patients (fournies par le Dr E. Angevin, IGR). Lorsque l'on mesure l'activité p-gal pour cette culture primaire (Aury), on observe qu'à la MOI de 103 pV.cellules-1, l'activité p-gal après infection par SE2 est de 2,5.106 RLU. g-1, alors que pour les cellules infectées par AE18 elle n'est que de 3,6.104 RLU. g-1. La valeur de l'activité ssgal est sous estimée à la MOI de 104 pV.cellules' pour le virus SE2, en raison de la saturation du luminomètre (*, figure 8).
L'ensemble des résultats obtenus par les tests d'infectivité est résumé dans le tableau II où est représenté, pour différentes MOI, l'index de transduction. Celuici est défini à une MOI donnée, comme le rapport de l'activité p-gal (RLU. g-1) observée pour SE2 sur celle engendrée par le virus AE18. Pour toutes les cellules tumorales, on observe un index de transduction supérieur à 4 (et jusqu'à 71,2 pour CHO), à l'exception de la tumeur LLC, dont l'index n'augmente qu'à la MOI de 104 pV.cellules-1.Ainsi, les cultures primaires de rein (Aury) sont transduites de façon particulièrement importante par le virus SE2 (index de transduction de 41,7 et 59,9 respectivement à 102 et 103 pV.cellules-1).
Parallèlement à ces tests de transduction, nous avons analysé, par cytométrie de flux, l'expression des récepteurs à l'Ad5 (CAR et intégrines) d'une part, et celle du TGFpRII d'autre part. Dans le cas des intégrines, les marquages ont été réalisés avec des Ac dirigés contre les intégrines de la famille av dans leur ensemble, ou contre les hétérodimères [alpha]vss3 ou [alpha]vss5. Ces hétérodimères, mais également [alpha]vss1, sont directement impliqués dans l'entrée par endocytose de la particule Ad5 (Russell, 2000, Benihoud étal, 1999).
Dans les cellules HeLa qui sont transduites efficacement par le virus contrôle AE18 à capside sauvage (figure 4), on observe une forte expression du CAR et des intégrines, en particulier [alpha]vss5, mais également du TGFpRII (figure 9). Dans la
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lignée PC3, le CAR est absent et l'expression des intégrines est très faible. Dans la lignée Law, on observe une expression moyenne du CAR et relativement faible des intégrines [alpha]vss3 et [alpha]vss5. Les deux lignées expriment en revanche, tout comme HeLa fortement le TGFpRII ce qui pourrait expliquer le fort index de transduction observé dans ces cellules (tableau II). Une étude systématique de l'expression des différents récepteurs, par cytométrie de flux, sur un plus large panel de cellules, en y incluant des cellules n'exprimant pas le TGFpRII, est nécessaire pour démontrer que l'efficacité de la transduction des cellules est corrélée à l'expression du TGFpRII.
<tb>
<tb>
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Lignées <SEP> cellulaires <SEP> Culture <SEP> primaire
<tb> MOI <SEP> PC3 <SEP> CHO <SEP> LLC <SEP> Law <SEP> Aury
<tb> (pV.cellule-1) <SEP> (prostate) <SEP> (ovaire) <SEP> (poumon) <SEP> (rein) <SEP> (rein)
<tb> 102 <SEP> 7,1 <SEP> 4,1 <SEP> 2,1 <SEP> 8,5 <SEP> 41,7
<tb> 103 <SEP> 5,8 <SEP> 71,2 <SEP> 2,7 <SEP> 12,2 <SEP> 59,9
<tb> 104 <SEP> 4,6 <SEP> 22,3 <SEP> 33,4 <SEP> 5,9 <SEP> * <SEP> saturation <SEP>
<tb>
<tb> MOI <SEP> PC3 <SEP> CHO <SEP> LLC <SEP> Law <SEP> Aury
<tb> (pV.cellule-1) <SEP> (prostate) <SEP> (ovaire) <SEP> (poumon) <SEP> (rein) <SEP> (rein)
<tb> 102 <SEP> 7,1 <SEP> 4,1 <SEP> 2,1 <SEP> 8,5 <SEP> 41,7
<tb> 103 <SEP> 5,8 <SEP> 71,2 <SEP> 2,7 <SEP> 12,2 <SEP> 59,9
<tb> 104 <SEP> 4,6 <SEP> 22,3 <SEP> 33,4 <SEP> 5,9 <SEP> * <SEP> saturation <SEP>
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Tableau II : Index de transduction de différentes cellules tumorales Transduction de cellules tumorales in vivo : Dans le but d'analyser la capacité du virus SE2 à transférer des gènes in vivo dans des tumeurs, nous avons pré-établi des tumeurs par injection sous-cutanée de cellules LLC, chez la souris. Le virus SE2, ou le virus contrôle AE18, ont été injectés dans les tumeurs lorsque celles-ci avaient une taille d'environ 5mm de diamètre (2.109 pV.tumeur-1). Dans une expérience, les animaux ont été sacrifiés 3 jours après infection des tumeurs, celles-ci ont été fixées, et la P-gal a été détectée par immunohistologie. Un plus grand nombre de cellules exprimant la P-gal est observé dans les coupes réalisées sur les tumeurs des animaux injectés par le virus SE2 que dans celle des animaux injectés par le contrôle AE18 (figure 10A). Dans une autre expérience, les animaux ont été sacrifiés à 2 jours p. i. et l'activité de la P-gal a été mesurée dans le lysat de ces tumeurs. L'expression de la P-gal est plus élevée dans le groupe infecté par le virus SE2 que dans celui infecté par le
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contrôle AE18. En effet, la moyenne du groupe SE2 (3,5 3.104 RLU. g-1) est environ trois fois supérieure à celle du groupe AE18 (1,3 0,7.104 RLU. g-1) (figure 10B).
Ces résultats montrent que l'insertion de CKS-17 dans l'hexon permet d'assurer un meilleur transfert de gène dans des tumeurs in vivo. Il sera particulièrement intéressant de tester le transfert de gène dans un type tumoral présentant un plus fort indice de transduction (par exemple les cellules Aury, index = 59,9 à 103 pV. cellules-1).
EXEMPLE 5 : CAPACITE DU VIRUS SE2 A INFECTER DES LIGNEES DE CELLULES MUSCULAIRES : Les cellules musculaires sont particulièrement difficiles à infecter par les Ad, en raison de leur faible expression du CAR, nous avons donc analysé si le virus SE2 rentrait de façon plus efficace dans ces cellules que le virus contrôle AE18. Dans les myoblastes L6 (rat) ou C2C12 (souris), l'expression de la P-gal après infection par le virus SE2 est supérieure, à toutes les MOI, à celle observée pour le virus contrôle AE18 (figure 11). A la MOI de 104 pV.cellules-1, le virus SE2 génère une activité p-gal, respectivement 52 et 81 fois, supérieure à celle du virus contrôle AE18 (figure 11). L'expression de la P-gal a également été mesurée dans le rhabdomyosarcome RD (homme). Elle est en moyenne 4 fois supérieure à celle induite par le virus contrôle quelle que soit la MOI (données non présentées). Ces résultats soulignent l'intérêt d'étudier, dans un modèle murin, la capacité du virus SE2 à transférer des gènes dans les muscles.
L'ensemble des tests que nous avons réalisés met en évidence que le virus SE2 infecte de façon très efficace d'une part des cellules musculaires et, d'autre part, de nombreuses lignées et cultures primaires tumorales.
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EXEMPLE 6 : ABLATION DU TROPISME NATUREL DE L'AD5 : Nous avons montré sur des cellules CAR' que le virus SE2 est doté d'une nouvelle voie d'entrée, cependant ce virus reste capable d'interagir avec ses récepteurs naturels (CAR, héparanes sulfates et intégrines). Afin de pouvoir étudier in vivo l'intérêt de la nouvelle voie d'entrée, il est nécessaire d'empêcher la séquestration du virus dans des organes riches en CAR (par exemple le foie), en abolissant les interactions natives de l'Ad5 avec ses récepteurs naturels.
Construction des génomes adénoviraux : Pour casser les interactions de la capside de l'Ad5 avec ses récepteurs, CAR mais aussi les héparanes sulfates, la fibre Ad5 peut être remplacée par celle de l'Ad3 qui reconnaît un récepteur non identifié, et n'interagit pas avec les héparanes sulfates (figure 1, Dechecchi et al., 2000). Pour cela, nous avons modifié, par recombinaison homologue chez E. coli, les génomes d'Ad recombinants pour LacZ, délétés dans la base du penton, du motif RGD de liaison aux intégrines (AE74), pseudotypés par la fibre Ad3 (DB6) ou combinant ces deux mutations (AE95) (Vigne & al., 2003 10 :153-62), en y insérant dans l'hexon la séquence du peptide CKS-17 (figure 13).
Après construction chez E. coli, les génomes adénoviraux modifiés (AE74SE2, DB6SE2 et AE95SE2), et leurs contrôles respectifs non modifiés (AE74, DB6 et AE95), ont été transfectés dans des cellules complémentant la région El pour produire les virus correspondants. Les virus sont tous détectés en HPLC dans les surnageants de transfection ou d'amplification, ce qui montre que toutes les constructions sont infectieuses. Les virus AE95[Fibre Ad3-ARGD] et AE95SE2[Fibre Ad3-ARGD-Hexon/CKS-17] ont été amplifiés pour obtenir des stocks viraux purifiés. AE95 et AE95SE2 sont produits à des titres comparables aux virus contrôles AE18 et SE2. Les stocks des autres virus sont en cours de production.
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Caractérisation du pouvoir infectieux des Ad mutants : Des tests d'infection ont été réalisés avec les virus à capside modifiée par insertion dans l'hexon du motif CKS-17 (AE95SE2 et SE2), et leur contrôle (AE95 et AE18), et révélés par coloration X-gal. Dans les cellules HeLa (CAR+, Intégrines+, cf. figure 10) on observe une même efficacité de transfert du gène LacZ (coloration bleue) pour les virus AE18et SE2, quelle que soit la MOI (figure 12).
En revanche, l'entrée de l'AE95 (fibre Ad3) est bien réduite par rapport à l'AE18 (fibre Ad5 sauvage). Malgré cela, à l'instar des virus AE18 et SE2, le virus AE95SE2 est capable d'entrer dans ces cellules de façon efficace (figure 12).
Les cellules L929 (CAR-, Intégrines+), sont peu infectées par les virus AE18 et AE95, mais la présence du motif CKS-17 dans la capside du virus AE95SE2 lui confère un important pouvoir infectieux, similaire à celui du virus SE2 (figure 12).
Ces résultats indiquent que le motif CKS-17 dans l'hexon est capable de fournir à un virus délété pour ses interactions avec les récepteurs primaires de l'Ad5 (CAR, héparanes sulfates et intégrines) une nouvelle voie d'entrée. Comme le virus AE95SE2 ne possède plus le motif de liaison aux intégrines, ces résultats démontrent que la nouvelle voie d'entrée par le TGFssRII est indépendante des intégrines.
EXEMPLE 7 : CONCLUSIONS & PERSPECTIVES : Les travaux présentés ont porté sur l'étude d'un adénovirus recombinant (SE2), à capside modifiée par insertion dans l'hexon du motif peptidique CKS-17, d'origine rétrovirale. Notre objectif a été d'identifier les cellules cibles potentielles de ce virus reciblé et de supprimer les interactions de ce virus avec les récepteurs naturels de l'Ad5.
Dans un premier temps, nous avons observé que le virus SE2 portant la mutation [Hexon/CKS-17] reste capable d'infecter des cellules CAR+ (HeLa) mais transduit de façon plus efficace que le virus contrôle (AE18 à capside sauvage) des cellules
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n'exprimant pas ce récepteur. Ceci démontre l'existence d'une nouvelle voie d'entrée. Cette voie semble impliquer le TGFpRII puisque ce vecteur se fixe sur du TGF(3RII recombinant. Pour prouver le rôle du TGF(3RII dans la nouvelle voie d'entrée, nous avons construit un Ad recombinant codant un TGFpRII soluble (TGFpRII-Fc). Ce vecteur a permis la purification d'une protéine fusion en grande quantité (à partir de surnageants de cellules infectées) indispensable à la réalisation de tests de compétition pour inhiber la nouvelle voie d'entrée. Le rôle du TGFpRII pourra être également démontré en évaluant la susceptibilité de cellules, surexprimant (transfectants) ou sous-exprimant (ARN interférant) le TGFpRII, à être transduites par le virus SE2 [Hexon/CKS-17].
Parallèlement, nous avons étudié la capacité du virus à transduire in vitro des types cellulaires d'origines histologiques et d'espèces différentes. Ces tests montrent que le virus SE2, comparativement au virus à capside sauvage AE18, est particulièrement efficace pour infecter des cellules musculaires d'une part (jusqu'à 81 fois plus), et des cellules tumorales d'autre part (jusqu'à 70 fois plus). Par cytométrie de flux, nous avons montré que deux tumeurs différentes, beaucoup plus fortement transduites par le virus SE2 que par le virus contrôle AE18, n'expriment pas le récepteur CAR, et faiblement les intégrines, mais expriment du TGFpRII. Cette étude doit être élargie afin de corréler le gain d'infectiosité du virus SE2 au taux de TGFpRII membranaire des cellules, en y incluant notamment des cellules n'exprimant pas le TGFpRII.
Nous avons montré que l'insertion de CKS17 dans l'hexon rend le virus capable de mieux transduire que le virus contrôle des cellules de tumeurs pré-établies chez la souris. Il faut remarquer que ces résultats ont été obtenus avec la tumeur LLC qui ne présente un index de transduction élevé qu'à la MOI de 104 pV.cellule-1.
Or, nous avons montré que certains types de tumeurs (Aury par exemple) peuvent présenter un index de transduction plus élevée à des MOI inférieures. Ces tumeurs seront de bons candidats pour les expériences in vivo.
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Le virus SE2 [Hexon/CKS-17] est doté d'une nouvelle voie d'entrée, mais reste capable d'infecter des cellules par la voie naturelle du CAR. Afin de contrôler le tropisme de ce virus, nous avons cassé les interactions de ce virus avec les récepteurs naturels de l'Ad5 (CAR et héparanes sulfate et/ou intégrines) en pseudotypant ce virus avec une fibre Ad3 incapable d'interagir avec le récepteur CAR et les héparanes sulfate et/ou en délétant le motif RGD, de la base du penton, responsable de la fixation aux intégrines. Les virus portant à la fois ces mutations et le motif CKS-17 dans l'hexon ont été produits. Les tests d'infection réalisés montrent que le virus AE95SE2 [Fibre Ad3-ARGD-Hexon/CKS-17] conserve la nouvelle voie d'entrée, ce qui démontre que l'endocytose de ce virus est indépendante des intégrines.
Claims (40)
- Revendications 1. Vecteur adénoviral destiné à assurer l'expression d'une séquence d'ADN d'intérêt dans des cellules de mammifères, caractérisé en ce que ledit vecteur comporte dans au moins l'une des séquences d'ADN codant pour les régions à faible contrainte structurale de protéines de capside, au moins une séquence d'ADN codant pour un peptide hétérologue comportant le motif- (W/R)X1X2D -.
- 2. Vecteur adénoviral selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide hétérologue est capable de se lier au récepteur du facteur de croissance des tumeurs (TGFpR).
- 3. Vecteur adénoviral selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le peptide hétérologue est un peptide immunosuppresseur de rétrovirus.
- 4. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les résidus X1 et X2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les résidus neutres A, V, L, I, G, S et T.
- 5. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le résidu X1 est G et le résidu X2 est L.
- 6. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le peptide hétérologue contient au plus 24 résidus aminoacides.
- 7. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le peptide immunosuppresseur de rétrovirus est le peptide CKS-17 de séquence SEQ ID N 1 ou tout peptide de séquence identique à au moins 60 % à ladite séquence SEQ ID N 1.<Desc/Clms Page number 63>
- 8. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine de capside est choisie parmi l'hexon, la fibre ou la base du penton, la protéine pVI, pVIII ou pIX.
- 9. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside est délétée ou partiellement délétée, et la séquence d'ADN codant pour le peptide hétérologue est insérée dans le site de délétion.
- 10. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lorsque la protéine de capside est l'hexon, la région à faible contrainte structurale est la région hypervariable 5 (HVR5).
- 11. Vecteur adénoviral selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la région hypervariable 5 (HVR5) est délétée.
- 12. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que lorsque la protéine de capside est la fibre, la région à faible contrainte structurale est la boucle HI.
- 13. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le peptide hétérologue comprend en outre au moins un adaptateur situé en N-ter ou en C-ter.
- 14. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le peptide hétérologue comprend un adaptateur situé en N-ter et un adaptateur situé en C-ter.
- 15. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt est liée de manière opérationnelle à des séquences de contrôle de l'expression.<Desc/Clms Page number 64>
- 16. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt code pour un facteur antiangiogénique, la thymidine kinase, la protéine p53, un transgène impliqué dans une maladie musculaire, le gène codant pour le régulateur transmembranaire impliqué dans la mucoviscidose (gène CFTR).
- 17. Vecteur adénoviral selon la revendication 16, caractérisé en ce que le facteur anti-angiogénique est l'angiostatine ou tout autre fragment du plasminogène, l'endostatine, la canstatine, l'angiotensinogène ou tout autre fragment dérivé de l'angiotensinogène.
- 18. Vecteur adénoviral selon la revendication 15, caractérisé en ce que le transgène impliqué dans une maladie musculaire code pour la dystrophine.
- 19. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la séquence d'ADN El du vecteur adénoviral est modifiée de façon à permettre la réplication dudit vecteur uniquement dans les cellules tumorales.
- 20. Vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il présente un tropisme pour les cellules de mammifères déficientes ou dépourvues en récepteurs communs au Coxsackievirus B3 et à l'adénovirus (récepteurs CAR).
- 21. Méthode d'obtention in vitro de particules adénovirales infectieuses dans des cellules de production, ladite méthode comprenant une étape de transformation desdites cellules de production par le vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
- 22. Particules adénovirales infectieuses obtenues par la méthode selon la revendication 21.<Desc/Clms Page number 65>
- 23. Méthode de modification du tropisme d'un vecteur adénoviral, comprenant l'insertion, dans au moins l'une des séquences d'ADN codant pour des régions à faible contrainte structurale de protéines de capside, d'au moins une séquence d'ADN codant pour un peptide hétérologue tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7.
- 24. Méthode selon la revendication 23, caractérisée en ce que l'étape d'insertion est précédée d'une étape de délétion de tout ou partie de la séquence d'ADN codant pour la région à faible contrainte structurale d'une protéine de capside.
- 25. Méthode selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce que la protéine de capside est choisie parmi l'hexon, la fibre ou la base du penton, la protéine pVI, pVIII ou pIX.
- 26. Méthode selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisée en ce que lorsque la protéine de capside est l'hexon, la région à faible contrainte structurale est la région hypervariable 5 (HVR5).
- 27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 23 à 26, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la région hypervariable 5 (HVR5) est délétée.
- 28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 23 à 27, caractérisée en ce que lorsque la protéine de capside est la fibre, la région à faible contrainte structurale est la boucle HI.
- 29. Méthode selon l'une quelconque des revendications 23 à 28, caractérisée en ce que le peptide hétérologue tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprend en outre au moins un adaptateur situé en N-ter ou en C-ter.<Desc/Clms Page number 66>
- 30. Méthode selon l'une quelconque des revendications 23 à 29, caractérisée en ce que le peptide hétérologue tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprend un adaptateur situé en N-ter et un adaptateur situé en C-ter.
- 31. Méthode in vitro permettant l'expression préférentielle d'une séquence d'ADN d'intérêt dans une cellule cible de mammifère comprenant la mise en contact de ladite cellule avec des particules adénovirales infectieuses selon la revendication 22, ou avec le vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou obtenu selon l'une quelconque des revendications 23 à 30.
- 32. Méthode selon la revendication 31, caractérisée en ce que la cellule cible de mammifère est déficiente ou dépourvue en récepteurs CAR.
- 33. Méthode selon la revendication 32, caractérisée en ce que la cellule déficiente ou dépourvue en récepteurs CAR est issue d'une lignée cellulaire choisie parmi les lignées CHO, L929, PC-3, LLC, B 16F 10, RCC law, RCC Aury, U118, RD, L6 et C2C12.
- 34. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 et un excipient pharmaceutique approprié.
- 35. Composition pharmaceutique selon la revendication 34 destinée à cibler des cellules de mammifère déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR.
- 36. Utilisation du vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 pour la fabrication d'un médicament.<Desc/Clms Page number 67>
- 37. Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que le médicament est destiné à cibler des cellules de mammifère déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR.
- 38. Utilisation selon la revendication 37, caractérisée en ce que les cellules de mammifère déficientes ou dépourvues en récepteurs CAR sont des cellules tumorales, telles que des cellules de gliome, de mélanome, de carcinome, de cancer du poumon, de l'utérus, du sein ou de l'ovaire, de tumeur de la prostate, de tumeur de la vessie, ou des lymphocytes, des fibroblastes, des cellules épithéliales pulmonaires, des cellules du muscle squelettique, du muscle lisse ou du myocarde.
- 39. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 38, caractérisée en ce que le médicament est destiné à prévenir ou à traiter un sujet atteint d'un cancer du sein, de l'utérus, de la prostate, du poumon, de la peau, de l'ovaire, d'un cancer colorectal, d'une leucémie, de la mucoviscidose ou d'une myopathie.
- 40. Cellule de mammifère transformée par un vecteur adénoviral selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
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