WO2001016344A1 - Fibre adenovirale modifiee et utilisations - Google Patents

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WO2001016344A1
WO2001016344A1 PCT/FR2000/002377 FR0002377W WO0116344A1 WO 2001016344 A1 WO2001016344 A1 WO 2001016344A1 FR 0002377 W FR0002377 W FR 0002377W WO 0116344 A1 WO0116344 A1 WO 0116344A1
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adenoviral
adenovirus
residues
ligand
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PCT/FR2000/002377
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Mark Johan Van Raaij
Stephen Cusack
Valérie LEGRAND
Philippe Leissner
Majid Mehtali
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Transgene S.A.
European Molecular Biology Laboratory (Embl)
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Definitions

  • the present invention relates in particular to an adenoviral fiber, mutated in the regions involved in the recognition and the binding to the natural cellular receptor of adenoviruses. It also relates to adenoviral particles carrying on their surface such a fiber, possibly combined with a ligand which gives said particles a modified, even targeted, host specificity.
  • the invention is of particular interest in the context of the development of vectors usable in the context of gene therapy. Adenoviral vectors are widely used in many gene therapy applications. Highlighted in many animal species, they are not very pathogenic, non-integrative and replicate in both dividing and quiescent cells.
  • the adenoviral genome consists of a linear, double-stranded DNA molecule of approximately 36kb containing two inverted repeat regions (designated ITR for Inverted Terminal Repeat) surrounding the genes coding for viral proteins.
  • the early genes are distributed in 4 regions dispersed in the adenoviral genome (E1 to E4; E for early in English), comprising 6 transcriptional units provided with their own promoters.
  • the late genes (L1 to L5; L for late in English) partially cover the early transcription units and are, for the most part, transcribed from the major late promoter MLP (for Major Late Promoter).
  • Adenoviruses have been the subject of numerous studies and numerous scientific teams have developed adenoviral vectors defective for replication, that is to say whose genome has been manipulated so that these adenoviral vectors are incapable of dividing or proliferating. in the cells they infect.
  • the defective adenoviral vectors are in particular obtained by deletion of at least the E1 region (for examples of defective adenoviral vectors, see in particular patent applications WO9428152 and WO 9412649).
  • patent application WO 95/21259 describes a method for introducing a nucleic acid into a cell based on the combination of adenoviral particles and nucleic acid, more particularly naked nucleic acid. This method is mainly based on the ability of the adenoviral particle to transport molecules to the cell nucleus after endocytosis. Curiel et al. (1992 Hum. Gene Ther., 3: 147-154) and Wagner et al. (1992, Proc. Natl. Acad.
  • the infectious cycle of adenoviruses is based on two essential stages.
  • the early phase precedes the initiation of replication and makes it possible to produce the early proteins regulating the replication and transcription of viral DNA.
  • the replication of the genome is followed by the late phase during which the structural proteins which constitute the basis of the viral particles are synthesized. New virions are assembled in the nucleus.
  • the viral proteins assemble so as to form empty capsids of icosahedral structure in which the newly formed genome is packaged.
  • the released adenoviruses can infect other permissive cells.
  • the fiber and the penton base of the adenoviral particle present on the surface of the capsids play a critical role in the cellular attachment of virions and their internalization (Wickham et al., 1993, Cell, 73, 309 - 319).
  • the adenovirus binds to a cellular receptor (CAR) present on the surface of permissive cells via the fiber in its trimeric form (Philipson et al., 1968, J. Virol. 2, 1064 -1075; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673).
  • CAR cellular receptor
  • the viral particle is then internalized by endocytosis thanks to the binding of the penton base to the cellular integrins ⁇ v ⁇ 3 and ⁇ v ⁇ 5 (Mathias et al., 1994, J. Virol. 68, 6811-6814).
  • the adenoviral fiber is made up of three distinct domains (Chroboczek et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200): (a) at its N-terminal end is the tail, the sequence of which is very conserved from one adenoviral serotype to another. It interacts with the penton base and ensures the anchoring of the molecule in the capsid;
  • (b) in the center is the rod. It is a stick structure composed of a certain number of leaf repetitions, the number of which varies according to the serotypes considered;
  • adenoviral particles for which the native fiber has been modified so as to modify their natural tropism and change the binding specificity of this fiber so that it recognizes a different cellular receptor.
  • WO94 / 10323 describes adenoviral particles of type 5 (Ad5), the fiber of which has been mutated so as to understand the sequence of an antibody fragment specific for a given antigen (of type scFv) inserted at the end of the one of the 22 repeating units of the rod. These mutants have a modified specificity for infection of adenoviral particles and are capable of binding to cells presenting the target antigen.
  • US 5,543,328 describes a chimeric adenoviral fiber in which the head domain is replaced by the sequence of tumor necrosis factor (TNF), or that of the ApoE peptide, so as to redirect the binding of the modified adenoviral particles to the cells expressing the TNF cell receptor or LDL (low density lipoprotein) receptor, respectively, present on the surface of liver cells.
  • TNF tumor necrosis factor
  • LDL low density lipoprotein
  • WO95 / 26412 describes a fiber modified by the incorporation of a ligand at the C-terminal end.
  • WO96 / 26281 describes a chimeric fiber obtained by replacing part of the native fiber and, in particular of the head, by the equivalent part of an adenoviral fiber of another serotype and, optionally, by insertion at the end C-terminal of an RGD peptide specific for vitronectin.
  • French patent application FR2758821 (97 01 005) has demonstrated the role of the antigens of the major class I histocompatibility complex and of the fibronectin modules III as primary receptor and co-factor, respectively. adenoviruses.
  • Tomko et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci 94, 3352-3356) Bergelson et al.
  • Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270) determined the three-dimensional crystallographic structure of the adenoviral head.
  • Each monomer comprises 8 antiparallel ⁇ sheets designated A to D and G to J and 6 major loops of 8 to 55 residues.
  • the CD loop connects sheet C to sheet D.
  • the minor sheets E and F are considered to be part of the loop DG located between sheets D and G.
  • table 1 indicates the location of these structures in the amino acid sequence of the Ad ⁇ fiber as shown in sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO: 1), the +1 representing the initiating Met residue.
  • the sheets form an ordered and compact structure while the loops are more flexible.
  • the four sheets ⁇ A, B, C and J constitute the sheets V directed towards the viral particle.
  • the other four (D, G, H and I) form the R sheets, supposed to face the cell receptor.
  • the V sheets seem to play an important role in the trimerization of the structure while the R sheets are involved in the interaction with the receptor.
  • the present invention provides new adenoviral fiber mutants which in particular allow viral particles to be obtained which have the following properties: (i) the adenoviral particle comprising said mutated fiber does not substantially bind to natural cellular receptors, it that is to say that the host specificity of these adenoviral particles carrying the mutated fiber is reduced, or even inhibited, compared to the host specificity of the adenoviral particles carrying the wild fiber, ie not mutated; (ii) when the adenoviral particle comprising said mutated fiber further comprises a specific ligand of an anti-ligand, it is possible to confer on said modified particle a new tropism towards one or more specific cell types carrying on their surface said anti- ligand compared to the non-mutated adenoviral particle.
  • the mutated fiber does not bind substantially to the natural cellular receptors
  • the fiber is modified so as to reduce or abolish its capacity of binding to the natural cellular receptor.
  • Such a property can be verified by the study of the infectivity or of the cellular bond of the corresponding adenoviral particles by applying the techniques of the art, and in particular by competition experiments of infection of the virus carrying the modified fiber carried out in presence of a competitor made up of all or part of the wild adenoviral fiber (for more details on this measurement technique, see the Experimental Part of this application).
  • a mutated fiber does not bind substantially to natural cell receptors" when the percentage of residual infection, measured by a competition experiment as disclosed in the Examples which follow, is between approximately 0 and 60%, preferably between 0 and 40% and very preferably between 0 and 20%.
  • the trimerization and penton-base binding properties of the mutated adenoviral fiber are not affected. These properties are easily verified according to the technique implemented in the Examples which follow.
  • the present invention has in particular the advantage of proposing new products whose properties make it possible to reduce the therapeutic amounts of adenovirus to be administered and to target the infection of the vector at the level of the cells to be treated.
  • This specificity is particularly essential when using an adenoviral vector capable of expressing a cytotoxic gene in order to avoid the propagation of the cytotoxic effect to healthy and non-targeted cells.
  • teachings of the present invention allow the development of other targeting systems intended for the development of methods of treatment by administration of viral or non-viral recombinant vectors.
  • the present invention relates to the fiber of a modified adenovirus comprising at least one mutation at one or more residues included in the region of said fiber extending from sheet A to sheet B, and including the loop AB . More particularly, the mutations are preferably carried out at the level of one or more residues included in the AB loop.
  • nucleic acid sequence is meant a fragment of DNA and / or RNA and / or PNA, double strand or single strand, linear or circular, natural isolated or synthetic, designating a precise sequence of nucleotides , modified or not, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid without limitation of size. According to a preferred embodiment, it is a nucleic acid chosen from the group consisting of cDNA (complementary DNA); genomic DNA; plasmid DNA; an RNA; a viral genome.
  • part of an amino acid sequence is meant an amino acid sequence comprising at least 6 consecutive amino acids, preferably 10, more preferably 15, even more preferably 20, most preferred 30, and / or having the same biological activity as the sequence of which said part is derived, in particular the ability to recognize and bind to target cells of the virus.
  • part of a nucleic sequence is meant a nucleic sequence comprising at least 18 consecutive nucleotides, preferably 30, more preferably 45, even more preferably 60, most preferably 90, and / or coding for an amino acid sequence having the same biological activity as the amino acid sequence encoded by the nucleic sequence from which said part is derived.
  • the fiber according to the present invention can derive from an adenovirus of human, canine, avian, bovine, murine, ovine, porcine or simian origin or even be hybrid and comprise fragments of various origins, including fragments of origin heterologous, ie not derived from adenoviral fiber or derived from non-adenoviral fibers.
  • Concerning human adenoviruses it is preferred to use those of serotype C and, in particular, adenoviruses of type 2 or 5 (Ad2 or Ad5).
  • Ad2 fiber contains 580 amino acids (aa), the sequence of which is disclosed in Hérissé et al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042, incorporated by reference into the present application).
  • Ad5 was determined by Chroboczek and Jacrot (1987, Virology 161, 549-554, incorporated by reference) and has 582 amino acids (see sequence identifier 1; SEQ ID NO: 1). In order to simplify the presentation of the present application, only the positions relating to Ad5 are indicated. However, it is within the capacity of those skilled in the art to identify the equivalent positions of the various sheets and loops on the basis of the sequences of adenoviral fibers of other origins. When the fiber of the present invention is of animal origin, use is preferably made of bovine adenoviruses and, in particular, those of the BAV-3 strain.
  • the fiber of the present invention may, in addition to the modifications described in the present invention, present other modifications with respect to the native sequence, provided that they do not affect the characteristics of the fibers proposed in the application.
  • GenBank references for the adenoviral fiber sequences of the human serotype 2 (# AAA92223), 3 (# CAA26029), 5 (# M18369), 31 (# CAA54050 or 41 (# X17016).
  • GenBank publications or references cited above are incorporated by reference into the present application in their entirety.
  • the invention also relates to a modified fiber according to the present invention which also contains other mutations such as for example those described in patent application WO 98/44121.
  • such a fiber according to the invention is characterized in that it further comprises one or more mutations in: a) CD, DG, GH, Hl and / or IJ loops and / or b) C sheets , D, G, H, I and / or J.
  • mutant denotes a deletion, a substitution or even an addition of one or more residues or a combination of these possibilities.
  • the adenoviral fiber according to the invention derives from a fiber of a type 5 adenovirus (Ad5) comprising all or part of the sequence as shown in the sequence identifier n ° 1 (SEQ ID NO: 1) and is characterized in that it is modified by mutation of one or more residues of the region comprised between residues 400 and 428, more particularly comprised between residues 404 and 418 and preferably comprised between residues 404 and 408 of SEQ ID NO: 1.
  • Ad5 type 5 adenovirus
  • the invention relates to a fiber of an adenovirus type 5 characterized in that the mutated residue is selected from threonine residues in position 404, alanine in position 406 and serine in position 408. Due to their spatial location in native fiber, these residues are capable of recognizing and / or interacting directly or indirectly with the natural cellular receptor of the adenovirus concerned.
  • the mutation carried out is a substitution of at least one amino acid.
  • the following examples of fiber of a type 5 adenovirus may be cited for which: the serine residue in position 408 is substituted by a residue having at least two carboxyl groups, and in particular by a residue selected from the group consisting of aspartic acid and glutamic acid, and / or the threonine residue in position 404 is substituted by a glycine residue and / or the alanine residue at position 406 is substituted by a lysine residue.
  • the fiber of the present invention can also be modified by deletion.
  • the eliminated region can concern all or part of the exposed area and, in particular of the AB loop.
  • the deleted residues can be replaced by residues of a loop and / or an equivalent sheet derived from a fiber of a second adenovirus capable of interacting with a cellular receptor different from that recognized by the first adenovirus.
  • This makes it possible to maintain the structure of the fiber according to the invention while giving it a host specificity corresponding to that of the second adenovirus.
  • the infection of types 2 and 5 adenoviruses is different from that of types 3 and 7 adenoviruses.
  • residues deleted from an Ad ⁇ or Ad2 fiber deleted from at least 3 consecutive residues among those specified above can be substituted by residues from an equivalent region of the Ad3 or Ad7 fiber to reduce the ability of said fiber to bind the Ad ⁇ receptor and give it a new specificity towards the receptor Ad3 or Ad7 cell.
  • the present invention also relates to a fiber of an adenovirus having a substantially reduced capacity for binding to the natural cellular receptor as presented above and nevertheless capable of trimerizing. Such a property is notably determined by the technique described in the experimental part of the application.
  • the fiber according to the invention also comprises a ligand.
  • ligand defines any entity capable of recognizing and binding, preferably with a high affinity, a cellular anti-ligand different from the natural cellular receptor for adenoviral fiber, not mutated. This anti-ligand can be expressed or exposed to the surface of the cell that it is desired to target (cell surface marker, receptor, antigenic peptide presented by histocompatibility antigens, etc.), naturally or following a modification of said target intended to make it express or exhibit such an anti-ligand on its surface.
  • a ligand can be an antibody or an antibody fragment, a lipid, a glycolipid, a hormone, a polypeptide, a polymer (PEG, polylysine, PEI, ...) or even a sugar.
  • the term antibody notably denotes monoclonal antibodies, antibody fragments (such as for example Fab) and single chain antibodies (scFv). These names and abbreviations are conventional in the field of immunology.
  • the ligand can be an antibody fragment against fusine, the CD4 receptor or against an exposed viral protein (envelope glycoprotein ) or also the part of the TAT protein of the HIV virus extending from residues 37 to 72 (Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668).
  • a tumor cell In the case of a tumor cell, the choice will be made on a ligand recognizing a specific tumor antigen (for example the protein MUC-1 in the case of breast cancer, certain epitopes of the E6 or E7 proteins of the HPV papilloma virus) or overexpressed (IL-2 receptor overexpressed in certain lymphoid tumors). If it is desired to target T cells, a T cell receptor ligand can be used. In addition, transferrin is a good candidate for liver targeting.
  • the ligands which can be used in the context of the invention are widely described in the literature and can be cloned by standard techniques. It is also possible to synthesize them chemically and couple them to the fiber according to the invention.
  • the coupling of galactosyl residues should confer hepatic specificity due to the interaction with the asialoglycoprotein receptors.
  • the preferred embodiment consists in inserting the ligand at the C-terminal end of the fiber according to the invention or in replacing the deleted residues when at least one of the modifications is a deletion of at least 3 consecutive residues.
  • Another subject of the invention relates to a peptide fragment characterized in that it comprises the region extending from sheet A to sheet B and including the loop AB of a modified fiber as described above.
  • a peptide fragment has in particular the following properties:
  • (i) further comprises a specific ligand of an anti-ligand, it is possible to confer on said modified particle a new tropism towards one or more specific cell types carrying on their surface said anti-ligand compared to the adenoviral particle does not including such a mutated fiber.
  • the invention relates more specifically to such a peptide fragment characterized in that it is the sequence extending from residue 388 to residue 592 of a fiber of an adenovirus type 5 (Ad5) comprising all or part of the sequence as shown in sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO: 1) and comprising at least one mutation at one or more residues in the region between residues 400 and 428.
  • Ad5 adenovirus type 5
  • the present invention also relates to an adenoviral particle which comprises on its surface a mutated fiber according to the invention, and optionally a ligand as defined above.
  • this adenoviral particle is devoid of native functional fiber.
  • the mutated fiber of the invention can be expressed by the adenoviral genome itself, in particular when said adenoviral particle contains such a genome, or brought in trans by a complementation cell line, such as those defined below.
  • the adenoviral particle of the invention is as presented above and is characterized in that said ligand is inserted into a protein of the adenoviral capsid other than the fiber, in particular hexon or penton .
  • said adenoviral particle of the invention is "empty", that is to say that it does not contain nucleic acid.
  • the use of such viral particles is in particular illustrated in the document WO95 / 21259 cited above.
  • this adenoviral particle contains an adenoviral genome, one will preferentially speak of adenoviral virus (or adenovirus) and in the particular case according to which said genome is further modified, one will more specifically speak of recombinant adenoviral virus (or recombinant adenovirus).
  • adenoviral virus or adenovirus
  • recombinant adenoviral virus or recombinant adenovirus
  • said ligand can be chemically coupled to said adenoviral particle.
  • the variant is preferred according to which the sequences coding for the ligand are inserted within the adenoviral genome, and preferably, within the sequences coding for the fiber modified according to the invention, and more specifically in phase in order to preserve the framework of reading.
  • the insertion can take place anywhere.
  • the preferred insertion site is upstream of the stop codon at the C-terminus or in place of the deleted residues. It is also conceivable to introduce the ligand sequences within other adenoviral sequences, in particular those coding for another capsid protein, such as hexon or penton.
  • the invention relates to a recombinant adenovirus defective for replication, that is to say incapable of autonomous replication in a host cell.
  • the deficiency is obtained by mutation or deletion of one or more essential viral genes and, in particular, of all or part of the E1 region in the adenoviral genome. Deletions within the E3 region can be considered to increase the cloning capacities. However, it may be advantageous to conserve the sequences coding for the protein gp19k (Gooding and Wood, 1990, Critical Reviews of Immunology 10, 53-71) in order to modulate the immune responses of the host.
  • the genome of an adenovirus according to the invention can also comprise additional deletions or mutations affecting other regions, in particular the E2, E4 and / or L1-L5 regions (see for example WO94 / 28152 or WO 9412649 or Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339 describing the heat-sensitive mutation of the DBP gene of E2).
  • a recombinant adenovirus of the invention comprises one or more gene (s) of interest placed under the control of the elements necessary for its (their) expression in a host cell.
  • the gene in question can be of any origin, genomic, cDNA (complementary DNA) or hybrid (minigene lacking one or more introns). It can be obtained by conventional molecular biology techniques or by chemical synthesis. It can code for an antisense RNA, a ribozyme or an mRNA which will then be translated into the polypeptide of interest. This can be cytoplasmic, membrane or be secreted by the host cell.
  • polypeptide may be all or part of a polypeptide as found in nature, a chimeric polypeptide originating from the fusion of sequences of various origins, or a polypeptide mutated with respect to the native sequence exhibiting improved and / or modified biological properties.
  • cytokines or lymphokines interferons ⁇ , ⁇ and ⁇ , interieukins and in particular IL-2, IL-6, IL-10 or IL-12, tumor necrotizing factors (TNF), colony stimulating factors (GM-CSF, C-CSF, M-CSF ...); cellular or nuclear receptors, in particular those recognized by pathogenic organisms (viruses, bacteria, or parasites) and, preferably, by the VI H virus or their ligands; proteins involved in a genetic disease (factor VII, factor VIII, factor IX, dystrophin or minidystrophin, insulin, CFTR protein ( Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), growth hormones (hGH); - enzymes (urease, renin, thrombin ....); enzyme inhibitors ( ⁇ 1-antitrypsin, antithrombin III, viral protease inhibitors
  • proteins of the major histocompatibility complex of classes I or II or regulatory proteins acting on the expression of the corresponding genes proteins of the major histocompatibility complex of classes I or II or regulatory proteins acting on the expression of the corresponding genes; - polypeptides capable of inhibiting a viral, bacterial or parasitic infection or its development (antigenic polypeptides having immunogenic properties, antigenic epitopes, antibodies, transdominant variants capable of inhibiting the action of a native protein by competition ...); - toxins (thymidine kinase from herpes simplex virus 1 (TK-HSV-1), ricin, cholera toxin, diphtheria) or immunotoxins; and markers ( ⁇ -galactosidase, luciferase .).
  • TK-HSV-1 herpes simplex virus 1
  • ricin ricin
  • cholera toxin diphtheria
  • markers ⁇ -galactosidase, luciferase .
  • a recombinant adenovirus according to the invention can, in addition, comprise a selection gene making it possible to select or identify the infected cells.
  • neo genes coding for neomycin phosphotransferase which confer resistance to the antibiotic G418, dhfr (Dihydrofolate Reductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transferase), pac (Puromycin Acetyl-Transferase) or gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase) ).
  • the selection genes are known to those skilled in the art.
  • elements necessary for the expression of a gene of interest in a host cell is meant all of the elements allowing its transcription into RNA and the translation of an mRNA into protein.
  • the promoter is of particular importance. In the context of the present invention, it can be derived from any gene of eukaryotic or even viral origin and can be constitutive or regulable. Furthermore, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, to make a constitutive promoter regulable or vice versa, to introduce a restriction site.
  • the gene to be expressed may be the natural promoter of the gene to be expressed. Mention may be made, by way of examples, of the viral promoters CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), of the TK gene of the HSV-1 virus, early of the SV40 virus (Si ian Virus 40), adenoviral MLP or even the eukaryotic promoters of the murine or human PGK (Phospho Glycerate kinase) genes, ⁇ 1-antitrypsin (liver-specific), immunoglobulins (lymphocyte-specific).
  • CMV Cytomegalovirus
  • RSV Ra Sarcoma Virus
  • TK TK gene of the HSV-1 virus
  • adenoviral MLP early of the SV40 virus
  • PGK Phospho Glycerate kinase
  • a gene of interest in use in the present invention may also comprise additional elements necessary for expression (intronic sequence, signal sequence, nuclear localization sequence, transcription terminator sequence, site of initiation of the IRES or other translation ...) or its maintenance in the host cell. Such elements are known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a DNA fragment coding for a fiber or a peptide fragment according to the invention, as well as to an expression vector for such a fiber or such a fragment.
  • Any type of vector can be used for this purpose, whether of plasmid or viral origin, integrative or not. Such vectors are commercially available or described in the literature. Likewise, those skilled in the art are able to adapt the regulatory elements necessary for the expression of the DNA fragment according to the invention.
  • said vector will be an adenoviral vector capable of producing, under appropriate culture conditions, adenoviral particles according to the invention, namely adenoviruses or recombinant adenoviruses as described above.
  • the invention also relates to a process for the preparation of adenoviral particles according to the invention according to which:
  • the adenoviral genome encoding a modified fiber according to the invention is transfected into an appropriate cell line, for example line 293;
  • transfected cell line is cultivated under conditions suitable for allowing the production of said adenovirus or of said recombinant adenovirus, and
  • the empty particles are recovered by purifying the cell lysate on a density gradient, in particular a cesium chloride gradient for example.
  • the invention also relates to a method for preparing an adenovirus or a recombinant adenovirus according to the invention, according to which: - the genome of said adenovirus, recombinant or not, defective for replication or not, is transfected in a cell line cultivating said transfected cell line under suitable conditions to allow the production of said adenovirus or said recombinant adenovirus (one can also say, adenoviral particles), and said adenovirus or said recombinant adenovirus is recovered from the culture of said transfected cell line and, optionally, said adenovirus is purified.
  • cell line depends, where appropriate, on the deficient functions of the adenovirus according to the invention.
  • a complementation line capable of providing the defective function (s) in trans will be used.
  • Lines 293 (ATCC CRL1573) or PERC6 (ECACC 96022940) are particularly suitable for complementing the E1 function (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72 or WO 97/00326, respectively).
  • E1 and E2 or E4 For a double deficiency E1 and E2 or E4, one can use a line among those described in the French patent application FR2737222 (96 04413).
  • auxiliary virus to complement the defective adenovirus according to the invention in any host cell or else a mixed system using complementation cell and auxiliary virus in which the elements are dependent on each other.
  • the means of propagation of a defective adenovirus are known to a person skilled in the art who can refer, for example, to Graham and Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, p 190-128; Ed E.J. Murey, The Human Press Inc.).
  • the adenoviral genome is preferably reconstituted in vitro in Escherichia coli (E. coli) by ligation or even homologous recombination (see for example French application FR2727689 (94 14470)).
  • the purification methods are described in the state of the art. Mention may be made of the density gradient centrifugation technique. According to an alternative process, it is also possible to construct "empty" adenoviral particles artificially by the association of the carboxy or amino-terminal ends of proteins, peptides or glycoproteins of the adenoviral capsid with lipids. Such modified lipids, incorporating in particular the peptide fragments of the invention, can then be incorporated into a liposome. Such a technique has been described by Tikchonenko et al., 1988, Gene, 63, 321-330 in the case of liposomes carrying on their surface glycoproteins of the influenza virus.
  • the present invention also relates to a cell line comprising either in the form integrated into the genome or in the form of an episome a DNA fragment coding for a fiber according to the invention placed under the control of the elements allowing its expression.
  • Said line can be derived from a complementation cell of one or more adenoviral functions selected from those encoded by the regions E1, E2, E4 and L1-L5. It preferably derives from line 293 or from line PERC6.
  • Such a line can be useful for the preparation of an adenovirus, in particular a recombinant one, the genome of which lacks all or part of the sequences coding for the fiber (so as to produce a non-functional fiber or not to produce fiber).
  • the invention further relates to a method for producing adenoviral particles containing an adenoviral genome devoid of all or part of the sequences coding for a fiber, characterized in that: said genome is transfected into a cell line presented below. above, said transfected cell line is cultured under conditions suitable for allowing the production of said adenoviral particle, and said adenoviral particle is recovered in the culture of said transfected cell line and, optionally, said adenoviral particle is purified.
  • the present invention also covers a host cell which can be infected with an adenovirus according to the invention or which can be obtained by a method according to the invention. It is advantageously a mammalian cell and, in particular, a human cell. It can be primary or tumor and of any origin, for example hematopoietic (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ...), muscle, nasal, pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • hematopoietic totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage
  • muscle nasal, pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • the subject of the invention is also a composition
  • a composition comprising, as therapeutic or prophylactic agent, a host cell, an adenoviral particle or an adenovirus, in particular a recombinant one, according to the invention or capable of being obtained by a method according to the invention. , in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition according to the invention is, in particular, intended for the preventive or curative treatment of diseases such as genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or Duchenne, Becker's myopathy ...), cancers, such as those induced by oncogenes or viruses, viral diseases, such as hepatitis B or C and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome resulting from HIV infection), and diseases recurrent viral infections, such as viral infections caused by the herpes virus.
  • diseases such as genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or Duchenne, Becker's myopathy )
  • cancers such as those induced by oncogenes or viruses
  • viral diseases such as hepatitis B or C and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome resulting from HIV infection)
  • diseases recurrent viral infections such as viral infections caused by the herpes virus.
  • a composition according to the invention can be produced in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of the therapeutic or prophylactic agent is combined with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is non-toxic to the patient. It may be a solution for injection, an isotonic solution, the pH of which is compatible with use in vivo, a solution of dextrose, glycerol, mannitol, etc.
  • a composition according to the invention can be administered by the local, systemic or aerosol, in particular intragastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intratumoral, intrapulmonary, intranasal or intratracheal. The administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate route of administration and dosage vary depending on various parameters, for example, the individual or disease to be treated or the gene (s) of interest to be transferred.
  • the viral particles according to the invention can be formulated in doses of between 10 4 and 10 14 pfu (units forming plaques), advantageously 10 5 and 10 13 pfu and, preferably, 10 6 and 10 12 pfu .
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable adjuvant or excipient.
  • composition according to the invention can also be formulated in the form of a solid, semi-solid preparation, in particular in the form of a gas, a tablet, a capsule, a powder, a capsule, a granule, a cream, a solution, a suppository, an aerosol, depending on the route of administration selected.
  • the composition can be formulated with conventional pharmaceutical carriers known to those skilled in the art.
  • These supports include in particular a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, sucrose, gum arabic or the like.
  • a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, sucrose, gum arabic or the like.
  • a preparation of capsules can also be obtained by mixing the composition with a diluent and by pouring the mixture obtained into soft or hard capsules.
  • a preparation in the form of a syrup or elixir may contain the composition together with a sweetener, an antiseptic, as well as a flavoring agent and an appropriate color.
  • the water-dispersible powders or granules may contain the composition in admixture with dispersing agents or wetting agents, or suspending agents, as well as with flavor correctors or sweeteners.
  • Suppositories are used for rectal administration which are prepared with binders that melt at rectal temperature, for example cocoa butter or polyethylene glycols.
  • composition can also be formulated in the form of microcapsules, optionally with one or more additive supports.
  • present invention also relates to a composition characterized in that it further comprises at least one compound selected from a naked nucleic acid or a nucleic acid combined with at least one cationic compound.
  • the adenoviral particles according to the invention can also be complexed with synthetic or natural compounds.
  • Such adenoviral particles and their use are for example described in O'Riordan et al., 1999, Human Gene Therapy, 10, 1349-1358 or in patent application WO98 / 44143. The content of these documents is incorporated by reference into the present request.
  • the present invention relates to the use of a peptide fragment, of an adenoviral particle, of an adenovirus or of a host cell according to the invention or of an adenovirus capable of being obtained by a process. according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment of the human or animal body.
  • the medicament can be administered directly in vivo (for example by intravenous injection, in an accessible tumor, in the lungs by aerosol ).
  • the invention also extends to a treatment method in which a therapeutically effective amount of an adenovirus or a host cell according to the invention is administered to a patient in need of such treatment.
  • the NM522 strain (Stratagene) is suitable for the propagation of phage vectors M 13.
  • the amplification techniques by PCR are known to the skilled person (see for example PCR Protocols-A guide to methods and applications, 1990, published by Innis , Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc).
  • the technique used consists of filling the protruding 5 ′ ends with the large fragment of DNA polymerase I from E. coli (Klenow).
  • the Ad5 nucleotide sequences are those used in the Genebank database under the reference M73260.
  • the cells are transfected according to standard techniques well known to those skilled in the art. Mention may be made of the calcium phosphate technique (Maniatis et al., Supra), but any other protocol can also be used, such as the DEAE dextran technique, electroporation, methods based on osmotic shock, microinjection or methods based on the use of cationic lipids. As for the growing conditions, they are classic.
  • EXAMPLE 1 Construction of an adenovirus with a host tropism towards cells expressing the GRP receptor (for gastrin releasing peptide in English).
  • the plasmid pTG6593 is derived from p poly II (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-
  • the latter is subjected to a directed mutagenesis using the oligonucleotide oTG7000 (SEQ ID NO: 2) (Sculptor kit, in vitro mutagenesis, Amersham) in order to introduce an adapter coding for a spacer arm of 12 amino acids of PSASASASAPGS sequence.
  • the mutated vector thus obtained, M13TG6527 is subjected to a second mutagenesis making it possible to introduce the sequence coding for the 10 residues of the GRP peptide (GNHWAVGHLM; Michael et al., 1995, Gene Ther. 2, 660-668).
  • the oligonucleotide oTG7001 (SEQ ID NO: 3) is used for this purpose.
  • the Hin ⁇ ⁇ - Sma ⁇ fragment is isolated from the mutated phage M13TG6528 and introduced by the homologous recombination technique (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805- 4810) into the plasmid pTG6590 carrying the genome fragment adenoviral Ad5 extending from nt 27081 to 35935 and linearized by Mun ⁇ (nt 32825).
  • the Spel-Scal fragment (carrying nt 27082 to 35935 of the Ad5 genome modified by introduction of the spacer arm and of the GRP peptide) is isolated from the preceding vector designated pTG8599 then is exchanged for the equivalent fragment of pTG6591 previously digested with these same enzymes.
  • pTG6591 comprises the wild adenoviral sequences of positions 21562 to 35935.
  • pTG4600 from which the BstEW fragment is isolated (nt 24843 to 35233).
  • the vector pTG4601 is generated.
  • a cassette allowing the expression of the LacZ gene is introduced in place of the adenoviral region E1 by homologous recombination between the plasmid pTG4601 linearized by C / al and a BsrG ⁇ -Pst ⁇ fragment comprising the LacZ gene coding for ⁇ -galactosidase under control of the MLP promoter of Ad2 and the polyadenylation signal of the SV40 virus.
  • This fragment is isolated from the vector pTG8526 containing the 5 ′ end of the viral genomic DNA (nt 1 to 6241) in which the E1 region (nt 459 to 3328) is replaced by the LacZ expression cassette. Its construction is within the reach of the skilled person.
  • the final vector is designated pTG4628.
  • AdTG4601 and AdTG4628 are obtained by transfection of the adenoviral fragments released from the plasmid sequences by Pacl digestion in line 293.
  • AdTG4601 carries the complete Ad5 genome in which the fiber gene comprises at its 3 ′ end an arm spacer followed by the GRP peptide.
  • the recombinant virus AdTG4628 further carries the expression cassette for the LacZ reporter gene under the control of the adenoviral promoter MLP.
  • the presence of the GRP peptide at the adenoviral fiber makes it possible to target the cells expressing on their surface the GRP receptor.
  • the expression of the messengers coding for the latter is studied in 293 cells and in Swiss-3T3 murine cells (Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7620) by Northem-blot .
  • a mixture of 2 DNA fragments complementary to the sequence coding for the GRP receptor, labeled by conventional techniques with the 32 P isotope is used.
  • the fragments are produced by reverse PCR from Total cellular RNA using the oligonucleotides oTG10776 (SEQ ID NO: 4) and oTG10781 (SEQ ID NO: 5) (Battey et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 395-399; Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18771-18779).
  • the intensity of the mRNA detected is much greater in the case of Swiss-3T3 cells than in 293 cells, indicating the overexpression of the GRP receptor by the murine line.
  • the competitor consists of the head of the Ad ⁇ fiber produced in E. coli, the properties of which have been shown to bind to the adenoviral cellular receptor (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246).
  • the monolayer cells are previously incubated for 30 min in the presence of PBS or of increasing concentrations of recombinant Ad5 head (0.1 to 100 ⁇ g / ml) in DMEM medium (Gibco BRL) supplemented with 2% fetal calf serum ( FCS).
  • the AdTG4628 virus the fiber of which contains the GRP peptide
  • the recombinant AdLacZ virus (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630) which carries a native fiber gene is used as a control and under the same experimental conditions.
  • the cells are then fixed and the expression of the LacZ gene evaluated (Sanes et al., 1986, EMBO J. 5, 3133-3142).
  • the number of blue cells is representative of the effectiveness of the viral infection.
  • Competitive inhibition results in a reduction in the number of stained cells compared to an uninfected control (PBS).
  • EXAMPLE 2 Construction of an adenovirus exhibiting a tropism towards tumor cells expressing mucins
  • EXAMPLE 3 Construction of an adenovirus exhibiting a tropism towards tumor cells expressing integrins ⁇ j ⁇ ⁇
  • OTG 11991 SEQ ID N ° 13 Mutagenesis with m3TG6527 to give M13TG13265.
  • EXAMPLE 4 Construction of an adenovirus having a host tropism towards cells expressing the EGF receptor (Epidermal Growth Factor in English).
  • This example describes a fiber carrying the EGF sequences at its C-terminal end.
  • the oligonucleotides oTG11065 SEQ ID are used.
  • 0TGHO68 allow the generation of an Xho ⁇ -Sma ⁇ fragment (ranging stop codon to nt 33093) from M13TG6527.
  • the complementary EGF DNA obtained from ATCC (# 59957), is amplified in the form of an Xho ⁇ - Xba ⁇ fragment using the oligonucleotides oTG 11069 (SEQ ID NO: 10) and oTG 11070 (SEQ ID NO: 11).
  • the 3 fragments digested with the appropriate enzymes are then religated to give an H / nc / III-SmaI fragment containing the EGF fused at the C-terminal end of the fiber.
  • the same homologous recombination procedure as that described in Example 1 is applied to place this fragment in its genomic context.
  • the cloning steps can be simplified by introducing a single BstB ⁇ site in the region targeted by conventional mutagenesis techniques.
  • the homologous recombination between pTG4609 linearized with BstB ⁇ and the preceding H / ncflll-SmaI fragment generates the plasmid pTG4225 carrying the wild-type E1 region.
  • Its equivalent carrying the LacZ expression cassette pTG4226 is obtained by homologous recombination with pTG4213 digested with ⁇ s.BI.
  • the AdTG4225 and AdTG4226 viruses can be produced conventionally by transfection of an appropriate cell line, for example overexpressing the EGF receptor.
  • murine fibroblast cells NR6 and NR6-hEGFR cells expressing the human EGF receptor can be used. Competitions with the recombinant Ad ⁇ head or with EGF make it possible to evaluate the intervention of natural cellular receptors and EGF to mediate virus infection.
  • the mutation of the AB region (amino acid 404-418) of the adenoviral fiber was undertaken in order to eliminate the ability of the fiber to bind its natural receptor and the addition of a ligand will modify the tropism of the corresponding adenoviruses. . - Replacement in the AB loop of the serine in position 408 by the glutamic acid residue of serotype 3 using the oligo oTG12499 (SEQ ID NO 14);
  • Mutagenesis can be carried out on the vector M13TG6526 or M13TG6528.
  • the first carries the wild H / ⁇ c / III-SmaI fragment and the second this same fragment modified by the insertion of GRP sequences.
  • the plasmids carrying the adenoviral genome can be reconstituted as described previously for the plasmids pTG4225 (wild E1) and pTG4226 (LacZ in place of the E1 region) (by homologous recombination with the plasmid pTG4609 or else pTG4213).
  • Viruses are generated by transfection of cells 293, 293 expressing wild fiber (Legrand et al., 1999; J.
  • Virol., 73, 907-919 or else cells overexpressing the ligand-binding receptor concerned.
  • Such cells can be generated by transfection of the corresponding complementary DNA.
  • Cells which do not naturally express the natural cellular receptor for adenoviruses are preferably used, for example the Daudi line (ATCC CCL213).
  • the viruses purified after amplification in 293 cells are deposited on 10% acrylamide gel under denaturing conditions (PAGE-SDS).
  • the different proteins are detected by staining with silver nitrate.
  • the fiber is specifically revealed by performing a western blot using a serum directed against the head of the Ad ⁇ fiber (Henry et al., 1994, supra).
  • An intense signal at the expected size indicates that the viruses incorporate stoichiometric amounts of the protein of interest. Since only trimeric fiber is capable of binding the base penton (Novelli and Boulanger, 1991, supra) and to be incorporated into the particle, detection of the protein in the above experiment indicates that the modified fiber is still capable of forming trimers.
  • the use of the modified fiber to allow the entry of the corresponding mutated virus can be studied by carrying out the competition experiments using a recombinant head as described above in Example 1B.
  • An effective infection in the presence of saturated concentrations of the wild peptide indicates an infection independent of the binding to natural primary receptors. This suggests a greatly reduced affinity of the modified fiber for its receptors.
  • EXAMPLE 6 Insertion of the ligand into a capsid protein other than the fiber in combination with one of the modifications of the aforementioned fiber.
  • This example describes the insertion of the EGF ligand into the hexon capsid protein.
  • the corresponding adenovirus has lost its capacity for attachment to the natural cellular receptor.
  • Its genome may for example include a modified fiber gene or be devoid of at least part of the fiber sequences.
  • a transfer plasmid is constructed for homologous recombination covering the region of the Ad ⁇ genome coding for hexon (nt 18842-21700).
  • the Ad ⁇ H / ndlll-X ⁇ ol fragment (nt 18836-24816) is cloned into pBSK + (Stratagene) digested with these same enzymes to give the plasmid pTG4224.
  • the sequences encoding the EGF peptide are introduced into the hypervariable loop L1 of the hexon by creation of chimeric fragments by PCR: hexon (nt19043-19647) -X / .al-EGF-BstGI-hexon (nt19699-20312).
  • the fragment nt19043 to 19647 is obtained by PCR amplification from the plasmid pTG3602 with the oligonucleotides oTG11102 (SEQ ID NO: 17) and oTG11103 (SEQ ID NO: 18).
  • the nt19699 to 20312 fragment is amplified from the same DNA with the oligonucleotides oTG11104 (SEQ ID NO: 19) and oTG11105 (SEQ ID NO: 20).
  • EGF is cloned from the cDNA using the oligonucleotides oTG11106 (SEQ ID NO: 21) and OTG11107 (SEQ ID NO: 22) making it possible to put the coding sequence of EGF in phase with hexon .
  • the PCR products are digested with the appropriate enzymes and then religated.
  • the chimeric fragment can then be inserted by homologous recombination into the plasmid pTG4224 linearized with Nde ⁇ (nt 19549), to give pTG4229.
  • the sequences coding for the modified hexon can be obtained by Hinu ⁇ - Xho ⁇ digestion and replaced in their genomic context by homologous recombination.
  • We can use the vector pTG3602, pTG4607, pTG4629 linearized by Sgfl or a vector carrying the adenoviral genome deleted from the fiber sequences (like pTG4607 described below) or expressing a modified fiber.
  • the adenoviral genome incapable of producing a functional native fiber is obtained by a deletion touching the initiating codon but not extending to the other adenoviral ORFs.
  • the procedure is as follows: the 5 'adenoviral fragment of the deletion (nt 30564 to 31041) is amplified by PCR using the primers OTG7171 and oTG7275 (SEQ ID NO: 23 and 24). Amplification of the 3 ′ fragment (nt 31129 to 33099) uses the primers oTG7276 and OTG7049 (SEQ ID NO: 25 and 26).
  • the PCR fragments are digested with Xho ⁇ and ligated before being introduced by homologous recombination into the vector pTG6591 linearized by ⁇ / c / el, to give pTG4602. Then the BstEW fragment isolated from the latter is subjected to homologous recombination with the vector pTG3602 digested with Spel. We obtain pTG4607.
  • the vector pTG4629 is equivalent to pTG4607, but also carries the LacZ expression cassette in place of E1.
  • the corresponding viruses can be obtained after transfection of cells 293, 293 expressing wild fiber (Legrand et al., 1999, supra) or cells overexpressing the EGF receptor.
  • the study of the specificity of infection can be carried out as described previously using the EGF as a competitor.

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Abstract

La présente invention a pour objet une fibre d'un adénovirus modifée comprenant au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus compris dans la région de ladite fibre s'étendant du feuillet A au feuillet B et incluant la boucle AB.

Description

FIBRE ADENOVIRALE MODIFIEE ET UTILISATIONS.
La présente invention a notamment pour objet une fibre adénovirale, mutée dans les régions impliquées dans la reconnaissance et la liaison au récepteur cellulaire naturel des adénovirus. Elle concerne également les particules adénovirales portant à leur surface une telle fibre, éventuellement combinée à un ligand qui confère auxdites particules une spécificité d'hôte modifiée, voire ciblée. L'invention présente un intérêt tout particulier dans le cadre de la mise au point de vecteurs utilisables dans le cadre de la thérapie génique. Les vecteurs adénoviraux sont largement utilisés dans de nombreuses applications de thérapie génique. Mis en évidence dans de nombreuses espèces animales, ils sont peu pathogènes, non-intégratifs et se répliquent aussi bien dans les cellules en division que quiescentes. En outre, ils présentent un large spectre d'hôte et sont capables d'infecter un très grand nombre de types cellulaires tels que par exemple les cellules épithéliales, endothéliales, les myocytes, les hépatocytes, les cellules nerveuses et les synoviocytes (Bramson et al., 1995, Curr. Op. Biotech. 6, 590- 595).
Le génome adénoviral est constitué d'une molécule d'ADN linéaire, bicaténaire et d'environ 36kb contenant deux régions répétées, inversées (désignées ITR pour Inverted Terminal Repeat) encadrant les gènes codant pour les protéines virales. Les gènes précoces sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome adénoviral (E1 à E4 ; E pour early en anglais), comportant 6 unités transcriptionnelles munies de leurs propres promoteurs. Les gènes tardifs (L1 à L5 ; L pour late en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais).
Les adénovirus ont fait l'objet de nombreuses études et de nombreuses équipes scientifiques ont développé des vecteurs adénoviraux défectifs pour la réplication, c'est à dire dont le génome a été manipulé de sorte que ces vecteurs adénoviraux soient incapables de se diviser ou de proliférer dans les cellules qu'ils infectent. Les vecteurs adénoviraux défectifs sont notamment obtenus par délétion d'au moins la région E1 (pour des exemples de vecteurs adénoviraux défectifs, voir notamment les demandes de brevet WO9428152 et WO 9412649).
Plus récemment, d'autres utilisations des particules adénovirales ont été décrites, notamment dans le cadre de la mise en œuvre de protocoles de thérapie génique. Ainsi, la demande de brevet WO 95/21259 décrit une méthode pour introduire un acide nucléique dans une cellule reposant sur la combinaison de particules adénovirales et d'acide nucléique, plus particulièrement d'acide nucléique nu. Cette méthode repose principalement sur la capacité de la particule adénovirale à transporter des molécules jusqu'au noyau cellulaire après endocytose. Curiel et al. (1992 Hum. Gène Ther., 3: 147-154) et Wagner et al.( 1992, Proc. Natl. Acad. ScL, 89: 6099-6103) ont eux-aussi montré que l'association de plasmide avec des particules adénovirales inactivées permet la lyse de l'endosome avant fusion avec les lysosomes et donc l'échappement du plasmide à la dégradation. Cette astuce permet d'augmenter l'efficacité de transfection du plasmide de 100 à 1000 fois in vitro. De façon préférée, afin que la transfection cellulaire soit indépendante du processus adénoviral et passe bien par l'utilisation d'un iigand choisi pour permettre un ciblage de la transfection, un anticorps neutralisant l'infection adénovirale peut être ajouté au complexe (Michael et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 6866-6869). Les contenus de ces publications et demandes de brevet sont incorporés par référence dans la présente demande, dans leur intégralité.
Le cycle infectieux des adénovirus repose sur deux étapes essentielles. La phase précoce précède l'initiation de la réplication et permet de produire les protéines précoces régulant la réplication et la transcription de l'ADN viral. La réplication du génome est suivie de la phase tardive au cours de laquelle sont synthétisées les protéines structurales qui constituent la base des particules virales. L'assemblage des nouveaux virions s'effectue dans le noyau. Dans un premier temps, les protéines virales s'assemblent de manière à former des capsides vides de structure icosaédrique dans lesquelles le génome néo formé est encapsidé. Les adénovirus libérés sont susceptibles d'infecter d'autres cellules permissives.
Au cours de l'infection, la fibre et le penton base de la particule adénovirale présents à la surface des capsides jouent un rôle critique dans l'attachement cellulaire des virions et leur internalisation (Wickham et al., 1993, Cell, 73, 309- 319). En premier lieu, l'adénovirus se lie à un récepteur cellulaire (le CAR) présent à la surface des cellules permissives par l'intermédiaire de la fibre sous sa forme trimérique (Philipson et al., 1968, J. Virol. 2, 1064-1075 ; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673). La particule virale est ensuite internalisée par endocytose grâce à la liaison du penton base aux intégrines cellulaires αvβ3 et αvβ5 (Mathias et al., 1994, J. Virol. 68, 6811-6814). La fibre adénovirale est composée de trois domaines distincts (Chroboczek et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200) : (a) à son extrémité N-terminale, se situe la queue, dont la séquence est très conservée d'un sérotype adénoviral à l'autre. Elle interagit avec le penton base et assure l'ancrage de la molécule dans la capside ;
(b) au centre, se situe la tige. Il s'agit d'une structure en bâtonnet composée d'un certain nombre de répétitions de feuillets, dont le nombre varie selon les sérotypes considérés ;
(c) à son extrémité C-terminale, se situe la tête qui présente une structure globulaire sphérique renfermant les signaux de trimérisation (Hong et Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078 ; Novelli et Boulanger, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303 ; Novelli et Boulanger, 1991 , Virology
185, 365-376) et est responsable de la liaison aux cellules permissives (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246 ; Louis et al., 1994, J. Virol. 68, 4104-4106).
Plusieurs équipes ont déjà décrit des particules adénovirales pour lesquelles la fibre native a été modifiée de manière à modifier leur tropisme naturel et changer la spécificité de liaison de cette fibre de manière à ce qu'elle reconnaisse un récepteur cellulaire différent.
WO94/10323 décrit des particules adénovirales de type 5 (Ad5) dont la fibre a été mutée de manière à comprendre la séquence d'un fragment d'anticorps spécifique d'un antigène donné (de type scFv) inséré à la fin de l'une des 22 unités répétitives de la tige. Ces mutants ont une spécificité d'infection des particules adénovirales modifiée et sont capables de de fixer à des cellules présentant l'antigène cible.
US 5,543,328 décrit une fibre adénovirale chimère dans laquelle le domaine de la tête est remplacé par la séquence du facteur de nécrose des tumeurs (TNF), ou celle du peptide ApoE, de manière à rediriger la fixation des particules adénovirales modifiées vers les cellules exprimant le récepteur cellulaire du TNF ou le récepteur LDL (low density lipoprotein) , respectivement, présent à la surface des cellules hépatiques.
WO95/26412 décrit une fibre modifiée par l'incorporation d'un ligand à l'extrémité C-terminale.
WO96/26281 décrit une fibre chimère obtenue par remplacement d'une partie de la fibre native et, en particulier de la tête, par la partie équivalente d'une fibre adénovirale d'un autre sérotype et, éventuellement, par insertion à l'extrémité C- terminale d'un peptide RGD spécifique de la vitronectine. En outre, la demande de brevet français FR2758821 (97 01005) a mis en évidence le rôle des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et des modules III de la fibronectine à titre, respectivement, de récepteur primaire et de co-facteur des adénovirus. De manière identique, Tomko et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci 94, 3352-3356) , Bergelson et al. ( 1997, Science 275, 1320-1323) et Roelvink et al. ( 1998, J. Virol. 72, 7909-7915) ont décrit un autre récepteur de la fibre de différents sérotypes d'adénovirus. Il s'agit d'une molécule de surface de 46 kDa, le CAR (Coxsackie and Adénovirus Receptor).
Enfin, Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270) ont déterminé la structure crystallographique tridimensionnelle de la tête adénovirale. Chaque monomère comporte 8 feuillets β antiparallèles désignés A à D et G à J et 6 boucles majeures de 8 à 55 résidus. Par exemple, la boucle CD relie le feuillet C au feuillet D. On indique que les feuillets mineurs E et F sont considérés comme faisant partie de la boucle DG située entre les feuillets D et G. A titre indicatif, le tableau 1 indique la localisation de ces structures dans la séquence en acides aminés de la fibre d'Adδ telle que montrée à l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO: 1), le +1 représentant le résidu Met initiateur. D'une manière générale, les feuillets forment une structure ordonnée et compacte alors que les boucles sont plus flexibles. Ces termes sont classiques dans le domaine de la biochimie des protéines et sont définis dans les ouvrages de base (voir par exemple Stryer, Biochemistry, 2ième édition, Chap 2, p 11 à 39, Ed Freeman et Compagny, San Francisco).
Tableau 1
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Les quatre feuillets β A, B, C et J constituent les feuillets V dirigés vers la particule virale. Les quatre autres (D, G, H et I) forment les feuillets R, supposés faire face au récepteur cellulaire. Les feuillets V semblent jouer un rôle important dans la trimérisation de la structure alors que les feuillets R seraient impliqués dans l'interaction avec le récepteur.
La présente invention propose de nouveaux mutants de la fibre adénovirale qui permettent notamment l'obtention de particules virales qui présentent les propiétés suivantes : (i) la particule adénovirale comprenant ladite fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels, c'est à dire que la spécificité d'hôte de ces particules adénovirales portant la fibre mutée est réduite, voir inhibée, par comparaison à la spécificité d'hôte des particules adénovirales portant la fibre sauvage, c'est à dire non mutée ; (ii) lorsque la particule adénovirale comprenant ladite fibre mutée comprend en outre un ligand spécifique d'un anti-ligand, il est possible de conférer à ladite particule modifiée un nouveau tropisme envers un ou plusieurs types cellulaires spécifiques portant à leur surface ledit anti-ligand par comparaison à la particule adénovirale non mutée. Par "la fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels" on entend indiquer que la fibre est modifiée de manière à réduire ou abolir sa capacité de liaison au récepteur cellulaire naturel. Une telle propriété peut être vérifiée par l'étude de l'infectivité ou de la liaison cellulaire des particules adénovirales correspondantes en appliquant les techniques de l'art, et notamment par des expériences de compétition d'infection du virus portant la fibre modifiée réalisées en présence d'un compétiteur constitué par tout ou partie de la fibre adénovirale sauvage (pour plus de détail relatif à cette technique de mesure, voir la Partie Expérimentale de la présente demande). La perte de la spécificité naturelle peut être également évaluée par des études d'attachement cellulaire réalisées en présence de virus marqués (par exemple à la 3H thymidine selon la technique de Roelvink et al., 1996, J. Virol. 70, 7614-7621) ou par des études d'infectivité de cellules permissives ou exprimant la molécule de surface ciblée par le ligand (voir les exemples qui suivent). Avantageusement, "une fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels" lorsque le pourcentage d'infection résiduelle, mesurée par une expérience de compétition telle que divulguée dans les Exemples qui suivent , est compris entre environ 0 et 60%, de manière préférée entre 0 et 40% et de façon tout à fait préférée entre 0 et 20 %. En outre, selon un mode de réalisation avantageux, les propriétés de trimérisation et de liaison au penton-base de la fibre adénovirale mutée ne sont pas affectées. Ces propriétés sont aisément vérifiées selon la technique mise en œuvre dans les Exemples qui suivent.
La présente invention présente notamment l'avantage de proposer de nouveaux produits dont les propriétés permettent de diminuer les quantités thérapeutiques d'adénovirus à administrer et de cibler l'infection du vecteur au niveau des cellules à traiter. Cette spécificité est particulièrement indispensable lorsque l'on met en oeuvre un vecteur adénoviral capable d'exprimer un gène cytotoxique afin d'éviter la propagation de l'effet cytotoxique aux cellules saines et non ciblées. En outre, les enseignements de la présente invention permettent le développement d'autres systèmes de ciblage destinés aux développement de méthodes de traitement par administration de vecteurs recombinants viraux ou non viraux.
En premier lieu, la présente invention concerne la fibre d'un adénovirus modifiée comprenant au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus compris dans la région de ladite fibre s'étendant du feuillet A au feuillet B, et incluant la boucle AB. Plus particulièrement, les mutations sont préférentiellement effectuées au niveau d'un ou de plusieurs résidus compris dans la boucle AB.
Au sens de l'invention, "résidus" et "amino acides" sont des synonymes. Les termes "feuillets" et "boucles" sont définis selon Xia et al. 1994, Structure 2, 1259- 1270.
Par «séquence d'acide nucléique», on entend désigner un fragment d'ADN et/ou d'ARN et/ou PNA, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un acide nucléique choisi parmi le groupe consistant en un cADN (ADN complémentaire) ; un ADN génomique ; un ADN plasmidique ; un ARN ; un génome viral.
Par « partie » d'une séquence d'acides aminés, on entend une séquence d'acides aminés comprenant au minimun 6 acides aminés consécutifs, de préférence 10, de manière plus préférée 15, de manière encore plus préférée 20, de manière la plus préférée 30, et/ou possédant la même activité biologique que la séquence dont ladite partie est dérivée, notamment la capacité de reconnaître et de se lier aux cellules cibles du virus.
Par « partie » d'une séquence nucléique, on entend une séquence nucléique comprenant au minimun 18 nucléotides consécutifs, de préférence 30, de manière plus préférée 45, de manière encore plus préférée 60, de manière la plus préférée 90, et/ou codant pour une séquence d'acides aminés possédant la même activité biologique que la séquence d'acides aminées codée par la séquence nucléique dont ladite partie est dérivée.
La fibre selon la présente invention peut dériver d'un adénovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou simienne ou encore être hybride et comprendre des fragments d'origines diverses, y compris des fragments d'origine hétérologue, c'est à dire non issus de fibre adénovirale ou issus de fibres non-adénovirales. Concernant les adénovirus humains, on préfère utiliser ceux de sérotype C et, notamment, les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad2 ou Ad5). La fibre d'Ad2 comporte 580 acides aminés (aa) dont la séquence est divulguée dans Hérissé et al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042, incorporé par référence à la présente demande). Celle d'Ad5 a été déterminée par Chroboczek et Jacrot (1987, Virology 161, 549-554, incorporé par référence) et présente 582 acides aminés (voir identificateur de séquence 1 ; SEQ ID NO: 1). Afin de simplifier l'exposé de la présente demande, seules les positions relatives à Ad5 sont indiquées. Toutefois, il est à la portée de l'homme du métier d'identifier les positions équivalentes des différents feuillets et boucles sur la base des séquences de fibres adénovirales d'autres origines. Lorsque la fibre de la présente invention est d'origine animale, on a de préférence recours aux adénovirus bovins et, en particulier, ceux de la souche BAV-3. Ces derniers ont fait l'objet de nombreuses études et la séquence de la fibre est divulguée dans la demande internationale WO95/16048, dont le contenu est incorporé par référence. Bien entendu, la fibre de la présente invention peut, outre les modifications décrites dans la présente invention, présenter d'autres modifications par rapport à la séquence native pour autant qu'elles n'affectent pas les caractéristiques des fibres proposées dans la demande. En outre, il est à la portée de l'homme du métier d'identifier les séquences de fibres adénovirales disponibles sur les bases de données telles que, par exemple, GenBank et d'identifier les positions équivalentes des différents feuillets et boucles tels que décrits plus avant. A titre informatif, citons par exemple les références GenBank pour les séquences de la fibre adénovirales du sérotype humain 2 (# AAA92223), 3 (# CAA26029), 5 (#M18369), 31 (#CAA54050 ou 41 (#X17016). Les contenus des publications ou des références GenBank citées ci- dessus sont incorporés par référence à la présente demande dans leur intégralité. L'invention concerne également une fibre modifiée selon la présente invention qui renferme en outre d'autres mutations telles que par exemple celles décrites dans la demande de brevet WO 98/44121. Plus particulièrement, une telle fibre selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une ou plusieurs mutations au niveau : a) des boucles CD, DG, GH, Hl et/ou IJ et/ou b) des feuillets C, D, G, H, I et/ou J.
Au sens de la présente invention, "mutation" désigne une délétion, une substitution ou encore une addition d'un ou plusieurs résidus ou une combinaison de ces possibilités.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la fibre adénovirale selon l'invention dérive d'une fibre d'un adénovirus de type 5 (Ad5) comprenant tout ou partie de la séquence telle que montrée à l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO: 1) et se caractérise en ce qu'elle est modifiée par mutation d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 400 et 428, plus particulièrement comprise entre les résidus 404 et 418 et préférentiellement comprise entre les résidus 404 et 408 de la SEQ ID NO: 1. De manière tout à fait préférée, une telle fibre adénovirale présente les propriétés (i) et (ii) exposées plus haut.
De manière préférée, l'invention concerne une fibre d'un adénovirus de type 5 caractérisée en ce que le résidu muté est sélectionné parmi les résidus thréonine en position 404, alanine en position 406 et serine en position 408. Du fait de leur localisation spatiale dans la fibre native, ces résidus sont susceptibles de reconnaître et/ou interagir directement ou indirectement avec le récepteur cellulaire naturel de l'adénovirus concerné.
Selon un cas particulier de l'invention, la mutation réalisée est une substitution d'au moins un acide aminé. On peut citer à ce titre les exemples suivants de fibre d'un adénovirus de type 5 pour lesquels : le résidu serine en position 408 est substitué par un résidu présentant au moins deux groupements carboxyle, et notamment par un résidu sélectionné dans le groupe consistant en l'acide aspartique et l'acide glutamique, et/ou le résidu thréonine en position 404 est substitué par un résidu glycine et /ou le résidu alanine en position 406 est substitué par un résidu lysine.
Il est également possible d'introduire plusieurs substitutions au sein de la région ciblée de la fibre notamment au niveau des acides aminés formant un coude, de préférence de type αα. Conformément à l'invention, il est préférable de ne pas modifier de façon drastique la structure tridimensionnelle de la fibre adénovirale ; ainsi, les acides aminés formant un coude seront remplacés par des résidus formant une structure similaire tels que ceux cités dans Xia et al. 1994.
La fibre de la présente invention peut également être modifiée par délétion. La région éliminée peut concerner tout ou partie du domaine exposé et, notamment de la boucle AB.
Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque l'une au moins des modifications est une délétion d'au moins 3 résidus consécutifs d'une boucle et/ou d'un feuillet, les résidus délétés peuvent être remplacés par des résidus d'une boucle et/ ou d'un feuillet équivalent dérivé d'une fibre d'un second adénovirus susceptible d'interagir avec un récepteur cellulaire différent de celui reconnu par le premier adénovirus. Ceci permet de maintenir la structure de la fibre selon l'invention tout en lui conférant une spécificité d'hôte correspondant à celle du second adénovirus. Comme indiqué dans Xia et al. (1994) l'infection des adénovirus de types 2 et 5 est différente de celle des adénovirus de types 3 et 7. Ainsi, les résidus délétés d'une fibre d'Adδ ou d'Ad2 délétée d'au moins 3 résidus consécutifs parmi ceux spécifiés ci-dessus peuvent être substitués par les résidus issus d'une région équivalente de la fibre d'Ad3 ou d'Ad7 pour réduire la capacité de ladite fibre à lier le récepteur d'Adδ et lui conférer une nouvelle spécificité envers le récepteur cellulaire d'Ad3 ou d'Ad7.
La présente invention concerne également une fibre d'un adénovirus présentant une capacité de liaison au récepteur cellulaire naturel substantiellement réduite telle que présentée ci-dessus et néanmoins capable de trimériser. Une telle propriété est notamment déterminée par la technique décrite dans la partie expérimentale de la demande.
Selon un mode de réalisation également avantageux, la fibre selon l'invention comprend en outre un ligand. Au sens de la présente invention, le terme ligand définit toute entité capable de reconnaître et se lier, de préférence avec une forte affinité, un anti-ligand cellulaire différent du récepteur cellulaire naturel de la fibre adénovirale, non mutée. Cet anti-ligand peut être exprimée ou exposée à la surface de la cellule que l'on désire cibler (marqueur de surface cellulaire, récepteur, peptide antigénique présenté par les antigènes d'histocompatibilité...), de façon naturelle ou suite à une modification de ladite cible visant à lui faire exprimer ou exposer un tel anti-ligand à sa surface. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un ligand peut être un anticorps ou un fragment d'anticorps, un lipide, un glycolipide, une hormone, un polypeptide, un polymère (PEG, polylysine, PEI, ...) ou encore un sucre. Le terme anticorps désigne notamment les anticorps monoclonaux, les fragments d'anticorps (tels que par exemple le Fab) et les anticorps simple chaîne (scFv). Ces dénominations et abréviations sont conventionnelles dans le domaine de l'immunologie.
Dans le cadre de la présente invention, il peut être intéressant de cibler plus particulièrement une cellule tumorale, une cellule infectée, un type cellulaire particulier ou une catégorie de cellules portant un marqueur de surface spécifique. Par exemple, si la cellule hôte à cibler est une cellule infectée par le virus HIV (Human Immunodeficiency Virus), le ligand peut être un fragment d'anticorps contre la fusine, le récepteur CD4 ou contre une protéine virale exposée (glycoprotéine d'enveloppe) ou encore la partie de la protéine TAT du virus HIV s'étendant des résidus 37 à 72 (Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668). S'agissant d'une cellule tumorale, le choix se portera sur un ligand reconnaissant un antigène spécifique de tumeur (par exemple la protéine MUC-1 dans le cas du cancer du sein, certains épitopes des protéines E6 ou E7 du papilloma virus HPV) ou surexprimé (récepteur à l'IL-2 surexprimé dans certaines tumeurs lymphoïdes). Si l'on désire cibler les lymphocytes T, on peut employer un ligand du récepteur de cellule T. Par ailleurs, la transferrine est un bon candidat pour un ciblage hépatique. D'une manière générale, les ligands qui peuvent être utilisés dans le contexte de l'invention sont largement décrits dans la littérature et peuvent être clones par les techniques standards. Il est également possible de les synthétiser par voie chimique et les coupler à la fibre selon l'invention. A cet égard, le couplage de résidus galactosyl devrait conférer une spécificité hépatique en raison de l'interaction avec les récepteurs aux asialoglycoprotéines. Mais le mode de réalisation préféré consiste à insérer le ligand à l'extrémité C-terminale de la fibre selon l'invention ou en remplacement des résidus délétés lorsque l'une au moins des modifications est une délétion d'au moins 3 résidus consécutifs.
Un autre objet de l'invention concerne un fragment peptidique caractérisé en ce qu'il comprend la région s'étendant du feuillet A au feuillet B et incluant la boucle AB d'une fibre modifiée telle que décrite ci-dessus. Un tel fragment peptidique possède notamment les propiétés suivantes :
(i) lorsque ce fragment peptidique est incorporé en lieu et place d'une région s'étendant du feuillet A au feuillet B et incluant la boucle AB d'une fibre adénovirale hétérologue donnée, la particule adénovirale comprenant ladite fibre mutée ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels
(ii) lorsque la particule adénovirale comprenant ladite fibre mutée selon
(i) comprend en outre un ligand spécifique d'un anti-ligand, il est possible de conférer à ladite particule modifiée un nouveau tropisme envers un ou plusieurs types cellulaires spécifiques portant à leur surface ledit anti-ligand par comparaison à la particule adénovirale ne comprenant pas une telle fibre mutée.
L'invention concerne plus spécifiquement un tel fragment peptidique caractérisé en ce qu'il s'agit de la séquence s'étendant du résidu 388 au résidu 592 d'une fibre d'un adénovirus de type 5 (Ad5) comprenant tout ou partie de la séquence telle que montrée à l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO: 1) et comprenant au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 400 et 428.
La présente invention concerne également une particule adénovirale qui comprend à sa surface une fibre mutée selon l'invention, et éventuellement un ligand tel que défini ci-dessus. Selon un cas préférée, cette particule adénovirale est dépourvue de fibre native fonctionnelle. La fibre mutée de l'invention peut être exprimée par le génome adénoviral lui-même, notamment lorsque ladite particule adénovirale renferme un tel génome, ou apportée en trans par une lignée cellulaire de complémentation, telle que celles définies ci-après. Selon un mode de réalisation particulier, la particule adénovirale de l'invention est telle que présentée ci-dessus et est caractérisée en ce que ledit ligand est inséré dans une protéine de la capside adénovirale autre que la fibre, notamment l'hexon ou le penton.
Selon un cas particulier de l'invention, ladite particule adénovirale de l'invention est "vide", c'est à dire qu'elle ne renferme pas d'acide nucléique. L'utilisation de telles particules virales est notamment illustrée dans le document WO95/21259 cité plus avant. Lorsqu'au contraire cette particule adénovirale renferme un génome adénoviral, on parlera préférentiellement de virus adénoviral (ou adénovirus) et dans le cas particulier selon lequel ledit génome est en outre modifié, on parlera plus spécialement de virus adénoviral recombinant (ou adénovirus recombinant). De tels cas sont décrits plus en détail ci-après. L'invention concerne donc également de tels adénovirus et adénovirus recombinants.
Selon l'invention, ledit ligand peut être couplé de manière chimique à ladite particule adénovirale. Toutefois, on préfère la variante selon laquelle les séquences codant pour le ligand sont insérées au sein du génome adénoviral, et préférentiellement, au sein des séquences codant pour la fibre modifiée selon l'invention, et plus spécifiquement en phase afin de préserver le cadre de lecture. L'insertion peut avoir lieu à un endroit quelconque. Néanmoins, le site d'insertion préféré est en amont du codon stop à l'extrémité C-terminale ou à la place des résidus délétés. Il est également envisageable d'introduire les séquences du ligand au sein d'autres séquences adénovirales, notamment celles codant pour une autre protéine de capside, comme l'hexon ou le penton.
Avantageusement, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif pour la réplication, c'est à dire incapable de réplication autonome dans une cellule hôte. La déficience est obtenue par mutation ou délétion d'un ou plusieurs gènes viraux essentiels et, notamment, de tout ou partie de la région E1 dans le génome adénoviral. Des délétions au sein de la région E3 peuvent être envisagées pour accroître les capacités de clonage. Cependant, il peut être avantageux de conserver les séquences codant pour la protéine gp19k (Gooding et Wood, 1990, Critical Reviews of Immunology 10, 53-71) afin de moduler les réponses immunitaires de l'hôte. Bien entendu, le génome d'un adénovirus selon l'invention peut également comprendre des délétions ou mutations supplémentaires affectant d'autres régions, notamment les régions E2, E4 et/ou L1-L5 (voir par exemple WO94/28152 ou WO 9412649 ou Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339 décrivant la mutation thermosensible du gène DBP de E2).
Selon un mode de réalisation préféré, un adénovirus recombinant de l'invention comprend un ou plusieurs gène(s) d'intérêt placé(s) sous le contrôle des éléments nécessaires à son (leur) expression dans une cellule hôte. Le gène en question peut être d'une origine quelconque, génomique, ADNc (ADN complémentaire) ou hybride (minigène dépourvu d'un ou plusieurs introns). Il peut être obtenu par les techniques conventionnelles de biologie moléculaire ou par synthèse chimique. Il peut coder pour un ARN anti-sens, un ribozyme ou un ARNm qui sera ensuite traduit en polypeptide d'intérêt. Celui-ci peut être cytoplasmique, membranaire ou être sécrété par la cellule hôte. Par ailleurs, il peut s'agir de tout ou partie d'un polypeptide tel que trouvé dans la nature, d'un polypeptide chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses, ou d'un polypeptide muté par rapport à la séquence native présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées.
Dans le cadre de la présente invention, il peut être avantageux d'utiliser les gènes codant pour les polypeptides suivants : - cytokines ou lymphokines (interférons α, β et γ, interieukines et notamment l'IL-2, l'IL-6, l'IL-10 ou l'IL-12, facteurs nécrosant des tumeurs (TNF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...) ; récepteurs cellulaires ou nucléaires, notamment ceux reconnus par des organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence, par le virus VI H ou leurs ligands ; protéines impliquées dans une maladie génétique (facteur VII, facteur VIII, facteur IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormones de croissance (hGH) ; - enzymes (uréase, rénine, thrombine....) ; inhibiteurs d'enzymes (α1-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de protéases virales...) ; polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins partiellement l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division cellulaire ou des signaux de transduction, produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple p53 ou Rb, protéines stimulant le système immunitaire....) ; protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou protéines régulatrices agissant sur l'expression des gènes correspondants ; - polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des propriétés immunogènes, épitopes antigéniques, anticorps, variants transdominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par compétition...) ; - toxines (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique ) ou immunotoxines ; et marqueurs (β-galactosidase, luciférase....). Il est à signaler que cette liste n'est pas limitative et que d'autres gènes peuvent également être employés.
Par ailleurs, un adénovirus recombinant selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules infectées. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une résistance à l'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme du métier.
Par éléments nécessaires à l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule hôte, on entend l'ensemble des éléments permettant sa transcription en ARN et la traduction d'un ARNm en protéine. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Dans le cadre de la présente invention, il peut dériver d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction
Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène à exprimer. On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs viraux CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), du gène TK du virus HSV-1, précoce du virus SV40 (Si ian Virus 40), adénoviral MLP ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, α1-antitrypsine (foie- spécifique), immunoglobulines (lymphocyte-spécifique). Bien entendu, un gène d'intérêt en usage dans la présente invention peut en outre comprendre des éléments additionnels nécessaires à l'expression (séquence intronique, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatrice de la transcription, site d'initiation de la traduction de type IRES ou autre....) ou encore à sa maintenance dans la cellule hôte. De tels éléments sont connus de l'homme du métier.
La présente invention a également trait à un fragment d'ADN codant pour une fibre ou un fragment peptidique selon l'invention, ainsi qu'à un vecteur d'expression d'une telle fibre ou d'un tel fragment. Tout type de vecteur peut être employé à cet effet, qu'il soit d'origine plasmidique ou virale, intégratif ou non. De tels vecteurs sont disponibles commercialement ou décrits dans la littérature. De même, l'homme du métier est capable d'adapter les éléments de régulation nécessaires à l'expression du fragment d'ADN selon l'invention. Selon un cas particulier de l'invention, undit vecteur sera un vecteur adénoviral capable de produire dans des conditions appropriées de culture des particules adénovirales selon l'invention, à savoir des adénovirus ou des adénovirus recombinants tels que décrits précédemment.
L'invention concerne également un procédé de préparation de particules adénovirales selon l'invention selon lequel :
- on transfecte le génome adénoviral codant pour une fibre modifiée selon l'invention dans une lignée cellulaire appropriée, par exemple la lignée 293 ;
- on cultive cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production dudit adénovirus ou dudit adénovirus recombinant, et
- on récupère les particules vides en purifiant le lysat cellulaire sur un gradiant de densité, notamment un gradiant de chlorure de césium par exemple.
Les particules vides sédimentent par exemple à 1,3 g/ml de chlorure de césium tandis que les adénovirus (particules renfermant le génome Ad) recombinants sédimentent pour leur part à 1 ,34 g/ml (D'Hallivin, 1995, Cur. Top. Microbiol. Immunol, 199, 47-66). Selon un autre procédé, il est possible d'obtenir des particules vides après transfection d'un génome adénoviral portant une séquence d'encapsidation modifiée et renfermant en outre un fragment d'ADN codant pour une fibre modifiée selon l'invention dans des cellules appropriées. La modification de la région d'encapsidation permet de réduire, voir éliminer, le phénomène d'encapsidation du génome adénoviral dans les particules (Gràble et Hearing, 1992, J. Virol. 66, 723- 731). Les étapes de production qui suivent la culture sont identiques à celles précédemment décrites.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un adénovirus ou d'un adénovirus recombinant selon l'invention, selon lequel : - on transfecte le génome dudit adénovirus, recombinant ou non, défectif pour la réplication ou non, dans une lignée cellulaire appropriée, on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production dudit adénovirus ou dudit adénovirus recombinant (on peut également dire, particules adénovirales), et on récupère ledit adénovirus ou ledit adénovirus recombinant dans la culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, on purifie ledit adénovirus.
Le choix de la lignée cellulaire dépend le cas échéant des fonctions déficientes de l'adénovirus selon l'invention. On utilisera notamment une lignée de complémentation capable de fournir en trans la ou les fonction(s) défectueuse(s). Les lignées 293 (ATCC CRL1573) ou PERC6 (ECACC 96022940) conviennent tout particulièrement pour complémenter la fonction E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72 ou WO 97/00326, respectivement). Pour une double déficience E1 et E2 ou E4, on peut employer une lignée parmi celles décrites dans la demande de brevet français FR2737222 (96 04413). On peut également mettre en œuvre un virus auxilliaire pour complémenter l'adénovirus défectif selon l'invention dans une cellule hôte quelconque ou encore un système mixte utilisant cellule de complémentation et virus auxilliaire dans lequel les éléments sont dépendants les uns des autres. Les moyens de propagation d'un adénovirus défectif sont connus de l'homme du métier qui peut se référer par exemple à Graham et Prevec, 1991 , Methods in Molecular Biology, vol 7, p 190-128 ; Ed E.J. Murey, The Human Press Inc.). Le génome adénoviral est de préférence reconstitué in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou encore recombinaison homologue (voir par exemple la demande française FR2727689 (94 14470)). Les procédés de purification sont décrits dans l'état de la technique. On peut citer la technique de centrifugation sur gradient de densité. Selon un procédé alternatif, il est également possible de construire des particules adénovirales "vides" de manière artificielle par l'association des extrémités carboxy ou amino-terminales de protéines, peptides ou glycoprotéines de la capside adénovirale à des lipides. De tels lipides modifiés, incorporants notamment les fragments peptidiques de l'invention, peuvent ensuite être incorporés dans un liposome. Une telle technique a été décrite par Tikchonenko et al., 1988, Gène, 63, 321-330 dans le cas de liposomes portant à leur surface des glycoprotéines du virus influenza.
La présente invention concerne également une lignée cellulaire comprenant soit sous forme intégrée dans le génome ou sous forme d'épisome un fragment d'ADN codant pour une fibre selon l'invention placé sous le contrôle des éléments permettant son expression. Ladite lignée peut dériver d'une cellule de complémentation d'une ou plusieurs fonctions adénovirales sélectionnées parmi celles codées par les régions E1 , E2, E4 et L1-L5. Elle dérive de préférence de la lignée 293 ou de la lignée PERC6. Une telle lignée peut être utile à la préparation d'un adénovirus, notamment recombinant, dont le génome est dépourvu de tout ou partie des séquences codant pour la fibre (de manière à produire une fibre non fonctionnelle ou à ne pas produire de fibre).
C'est pourquoi, l'invention concerne en outre un procédé pour produire des particules adénovirales renfermant un génome adénoviral dépourvu de tout ou partie des séquences codant pour une fibre, caractérisé en ce que : on transfecte ledit génome dans une lignée cellulaire présentée ci- dessus, on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule adénovirale , et on récupère ladite particule adénovirale dans la culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, on purifie ladite particule adénovirale.
La présente invention couvre également une cellule hôte infectable par un adénovirus selon l'invention ou susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention. Il s'agit avantageusement d'une cellule de mammifère et, notamment, d'une cellule humaine. Elle peut être primaire ou tumorale et d'une origine quelconque, par exemple hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage ...), musculaire, nasale, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.
L'invention a également pour objet une composition comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, une cellule hôte, une particule adénovirale ou un adénovirus, notamment recombinant, selon l'invention ou susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. La composition selon l'invention est, en particulier, destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que les maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, diabète ou myopathie de Duchenne, de Becker...), les cancers, comme ceux induits par des oncogènes ou des virus, les maladies virales, comme l'hépatite B ou C et le SIDA (syndrome de l'immunodéficience acquise résultant de l'infection par le VIH), et les maladies virales récurrentes, comme les infections virales provoquées par le virus de l'herpès.
Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Un tel support est non toxique pour le patient. Il peut s'agir de solution injectable, de solution isotonique, dont le pH est compatible avec un usage in vivo, de solution de dextrose, de glycérol, de mannitol, .... Une composition selon l'invention peut être administrée par voie locale, systémique ou par aérosol, en particulier par voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale, intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer. En particulier, les particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 1013 ufp et, de préférence, 106 et 1012 ufp. La formulation peut également inclure un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
La composition selon l'invention peut en outre être formulée sous la forme d'une préparation solide, semi-solide, en particulier sous forme de gaz, de tablette, capsule, poudre, gélule, granule, crème, solution, suppositoire, aérosol, en fonction de la voie d'administration sélectionnée. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention, la composition peut être formulée avec des supports pharmaceutiques classiques, connus de l'homme du métier.
Ces supports comprennent en particulier un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, le saccharose, la gomme arabique ou analogues.
On peut également obtenir une préparation de gélules en mélangeant la composition avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir la composition conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir la composition en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs du goût ou des édulcorants. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols.
La composition peut être formulée également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs. La présente invention a également pour objet une composition caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé sélectionné parmi un acide nucléique nu ou un acide nucléique combiné à au moins un composé cationique.
En vue de leur utilisation in vivo, les particules adénovirales selon l'invention peuvent en outre être complexées à des composés synthétiques ou naturels. De telles particules adénovirales ainsi que leur utilisation sont par exemple décrites dans O'Riordan et al., 1999, Human Gène Therapy, 10, 1349-1358 ou dans la demande de brevet W098/44143. Le contenu de ces documents est incorporé par référence dans la présente demande.
Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation d'un fragment peptidique, d'une particule adénovirale, d'un adénovirus ou d'une cellule hôte selon l'invention ou d'un adénovirus susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient.
L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité therapeutiquement efficace d'un adénovirus ou d'une cellule hôte selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer les différents objets de la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif. Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont réalisées de préférence dans la souche E. coli 5K (Hubacek et Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127) ou BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). On utilise préférentiellement cette dernière souche pour les étapes de recombinaison homologue. La souche NM522 (Stratagène) convient à la propagation des vecteurs phagiques M 13. Les techniques d'amplification par PCR sont connues de l'homme du métier (voir par exemple PCR Protocols-A guide to methods and applications, 1990, édité par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Académie Press Inc). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Les séquences nucléotidiques Ad5 sont celles utilisées dans la banque de donnée Genebank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer la technique au phosphate de calcium (Maniatis et al., supra), mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran, l'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de lipides cationiques. Quant aux conditions de culture, elles sont classiques. Dans les exemples qui suivent, on a recours à la lignée humaine 293 (ATCC CRL1573) et aux lignées murines Swiss 3T3 (ATCC CCL92), NR6 (Wells et al., 1990, Science 247: 962-964) et NR6-hEGFR (Schneider et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 333-336). Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent également être utilisées.
EXEMPLE 1 : Construction d'un adénovirus présentant un tropisme d'hôte envers les cellules exprimant le récepteur du GRP (pour gastrin releasing peptide en anglais).
A. Insertion des séquences codant pour le ligand GRP (fibre-GRP).
Le plasmide pTG6593 dérive du p poly II (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-
201) par introduction du gène complet codant pour la fibre d'Adδ sous la forme d'un fragment EcoRI-Smal (nucléotides (nt) 30049 à 33093). Le fragment W/πdlll- Smal (nt 31994-33093) est isolé et clone dans M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gène 26, 91-99) digéré par ces mêmes enzymes, pour donner M13TG6526. Ce dernier est soumis à une mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide oTG7000 (SEQ ID NO: 2) (kit Sculptor, in vitro mutagenesis, Amersham) afin d'introduire un adaptateur codant pour un bras espaceur de 12 acides aminés de séquence PSASASASAPGS. Le vecteur muté ainsi obtenu, M13TG6527, est soumis à une seconde mutagénèse permettant d'introduire la séquence codant pour les 10 résidus du peptide GRP (GNHWAVGHLM ; Michael et al., 1995, Gène Ther. 2, 660-668). On utilise à cet effet l'oligonucléotide oTG7001 (SEQ ID NO: 3). Le fragment Hinό\\\-Sma\ est isolé du phage muté M13TG6528 et introduit par la technique de recombinaison homologue (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805- 4810) dans le plasmide pTG6590 portant le fragment de génome adénoviral Ad5 s'étendant des nt 27081 à 35935 et linéarisé par Mun\ (nt 32825). Le fragment Spel-Scal (portant les nt 27082 à 35935 du génome Ad5 modifiés par introduction du bras espaceur et du peptide GRP) est isolé du vecteur précédent désigné pTG8599 puis est échangé contre le fragment équivalent de pTG6591 préalablement digéré par ces mêmes enzymes. A titre indicatif, pTG6591 comprend les séquences adénovirales sauvages des positions 21562 à 35935. On obtient pTG4600 dont on isole le fragment BstEW (nt 24843 à 35233). Après recombinaison homologue avec le plasmide pTG3602 qui comprend le génome Ad5 (décrit plus en détail dans la demande internationale WO96/17070), on génère le vecteur pTG4601.
Une cassette permettant l'expression du gène LacZ est introduite à la place de la région adénovirale E1 par recombinaison homologue entre le plasmide pTG4601 linéarisé par C/al et un fragment BsrG\-Pst\ comprenant le gène LacZ codant pour la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur MLP d'Ad2 et le signal de polyadénylation du virus SV40. Ce fragment est isolé du vecteur pTG8526 contenant l'extrémité 5' de l'ADN génomique viral (nt 1 à 6241) dans lequel la région E1 (nt 459 à 3328) est remplacée par la cassette d'expression LacZ. Sa construction est à la portée de l'homme du métier. Le vecteur final est désigné pTG4628.
Les virus correspondants AdTG4601 et AdTG4628 sont obtenus par transfection des fragments adénoviraux libérés des séquences plasmidiques par digestion Pacl dans la lignée 293. A titre indicatif, AdTG4601 porte le génome Ad5 complet dans lequel le gène de la fibre comprend en son extrémité 3' un bras espaceur suivi du peptide GRP. Le virus recombinant AdTG4628 porte en outre la cassette d'expression du gène rapporteur LacZ sous le contrôle du promoteur adénoviral MLP.
B. Etude du tropisme du virus portant la fibre-GRP.
La présence du peptide GRP au niveau de la fibre adénovirale permet de cibler les cellules exprimant à leur surface le récepteur au GRP. L'expression des messagers codant pour ce dernier est étudiée dans les cellules 293 et dans les cellules murines Swiss-3T3 (Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7620) par Northem-blot. On utilise à titre de sonde un mélange de 2 fragments d'ADN complémentaires à la séquence codant pour le récepteur au GRP marqués par les techniques conventionnelles à l'isotope 32P. A titre indicatif, les fragments sont produits par PCR réverse à partir des ARN cellulaires totaux à l'aide des oligonucléotides oTG10776 (SEQ ID NO: 4) et oTG10781(SEQ ID NO: 5) (Battey et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 395-399 ; Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18771-18779). L'intensité des ARNm détectés est beaucoup plus importante dans le cas des cellules Swiss-3T3 que dans les cellules 293, indiquant la surexpression du récepteur GRP par la lignée murine.
Des expériences de compétition sont réalisées sur les 2 types de cellules. Le compétiteur est constitué par la tête de la fibre d'Adδ produite dans E.coli dont les propriétés de liaison au récepteur cellulaire adénoviral ont été montrées (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246). Les cellules en monocouche sont préalablement incubées pendant 30 min en présence de PBS ou de concentrations croissantes de tête Ad5 recombinante (0,1 à 100 μg/ml) dans du milieu DMEM (Gibco BRL) complémenté avec du sérum de veau foetal 2% (FCS). Puis, le virus AdTG4628 dont la fibre contient le peptide GRP est ajouté à une multiplicité d'infection de 0,001 unité infectieuse/cellule pour 24h à 37°C. On utilise à titre de contrôle et selon les mêmes conditions expérimentales, le virus recombinant AdLacZ (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630) qui porte un gène de la fibre natif. Les cellules sont ensuite fixées et l'expression du gène LacZ évaluée (Sanes et al., 1986, EMBO J. 5, 3133-3142). Le nombre de cellules bleues est représentatif de l'efficacité de l'infection virale. Une inhibition par compétition se traduit par une réduction du nombre de cellules colorées par rapport à un témoin non infecté (PBS).
L'addition de tête Ad5 recombinante à une concentration de 100 μg/ml inhibe fortement l'infection des cellules 293 par les virus AdLacZ et AdTG4628 (taux d'inhibition de 95 et 98%). Ceci suggère que la présence du compétiteur empêche l'interaction de la fibre adénovirale avec son récepteur cellulaire naturel. Par contre, les deux virus ont un comportement différent sur les cellules Swiss-3T3. L'infection du virus AdTG4628 en présence de 100 μg/ml de compétiteur n'est que partiellement inhibée alors que, dans les mêmes conditions expérimentales, celle du virus AdLacZ ayant la fibre native est totalement inhibée. Ces résultats suggèrent que l'infection des cellules Swiss-3T3 par l'AdTG4628 est en partie médiée par un récepteur indépendant, probablement le récepteur au GRP que ces cellules surexpriment. En conclusion, l'addition du ligand GRP à l'extrémité C- terminale de la fibre favorise l'infection des cellules exprimant le récepteur au GRP d'une manière indépendante de l'interaction fibre-récepteur cellulaire naturel
EXEMPLE 2: Construction d'un adénovirus présentant un tropisme envers les cellules tumorales exprimant des mucines
Construction: Insertion du peptide EPPT, tel que décrit dans le brevet US 5,591 ,593, en C-term de la fibre. Cette modification confère une liaison à mucines surexprimées sur cellules tumorales.
OTG1 1992: SEQ ID ° 12 mutagénèse avec m13TG6527 pour donner m13TG6572. Recombinaison homologue avec pTG4213 pour donner pTG4278.
EXEMPLE 3 : Construction d'un adénovirus présentant un tropisme envers les cellules tumorales exprimant des intégrines αjβ^
Construction: Insertion du peptide LDV, comme décrit dans le brevet US 5,628,979, en C-term de la fibre. Cette modification confère une liaison à intégrines α4βι surexprimées sur cellules tumorales.
OTG 11991 : SEQ ID N° 13 Mutagénèse avec m3TG6527 pour donner M13TG13265.
EXEMPLE 4 : Construction d'un adénovirus présentant un tropisme d'hôte envers les cellules exprimant le récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor en anglais).
Cet exemple décrit une fibre portant les séquences EGF à son extrémité C- terminale. Pour cela, on met en oeuvre les oligonucleotides oTG11065 (SEQ ID
NO: 6) et oTG11066 (SEQ ID NO: 7) pour amplifier un fragment Hind\\\-Xba\ à partir du plasmide M13TG6527. Les oligonucleotides oTG11067 (SEQ ID NO: 8) et
0TGHO68 (SEQ ID NO: 9) permettent de générer un fragment Xho\-Sma\ (allant du codon stop jusqu'au nt 33093) à partir de M13TG6527. L'ADN complémentaire de l'EGF, obtenu de l'ATCC (#59957), est amplifié sous forme d'un fragment Xho\- Xba\ à l'aide des oligonucleotides oTG 11069 (SEQ ID NO: 10) et oTG 11070 (SEQ ID NO: 11). Les 3 fragments digérés par les enzymes adéquates sont ensuite religués pour donner un fragment H/nc/lll-Smal contenant l'EGF fusionné à l'extrémité C-terminale de la fibre. On applique la même procédure de recombinaison homologue que celle décrite à l'exemple 1 pour replacer ce fragment dans son contexte génomique.
Cependant, on peut simplifier les étapes de clonage en introduisant un site unique BstB\ dans la région ciblée par les techniques classiques de mutagénèse. On obtient pTG4609 . La recombinaison homologue entre pTG4609 linéarisé par BstB\ et le fragment H/ncflll-Smal précédant génère le plasmide pTG4225 portant la région E1 sauvage. Son équivalent portant la cassette d'expression LacZ pTG4226 est obtenu par recombinaison homologue avec le pTG4213 digéré par βs.BI. Les virus AdTG4225 et AdTG4226 peuvent être produits classiquement par transfection d'une lignée cellulaire appropriée par exemple surexprimant le récepteur de l'EGF.
Pour tester la spécificité d'infection de ces virus, on peut utiliser les cellules fibroblastiques murines NR6 et les cellules NR6-hEGFR exprimant le récepteur de l'EGF humain. Des compétitions avec la tête d'Adδ recombinante ou avec l'EGF permettent d'évaluer l'intervention des récepteurs cellulaires naturels et EGF pour médier l'infection des virus.
EXEMPLE 5 : Modifications de la tête de la fibre pour éliminer la liaison au récepteur cellulaire naturel. A. Modifications des séquences de la fibre
La mutation de la région AB (amino acide 404-418) de la fibre adénovirale a été entreprise afin d'éliminer la capacité de la fibre à lier son récepteur naturel et l'addition d'un ligand permettra de modifier le tropisme des adénovirus correspondants. - le remplacement dans la boucle AB de la serine en position 408 par le résidu acide glutamique du sérotype 3 à l'aide de l'oligo oTG12499 (SEQ ID NO 14);
- le remplacement dans la boucle AB de l'Alanine en position 406 par le résidu lysine du sérotype 3 à l'aide de l'oligo oTG12498 (SEQ ID NO 15); - le remplacement dans la boucle AB de la thréonine en position 404 par le résidu glycine du sérotype 3 à l'aide de l'oligo oTG12740 (SEQ ID NO 16).
Les mutagénèses peuvent être réalisées sur le vecteur M13TG6526 ou M13TG6528. Le premier porte le fragment H/πc/lll-Smal sauvage et le second ce même fragment modifié par l'insertion des séquences GRP. Les plasmides portant le génome adénoviral peuvent être reconstitués comme décrit auparavant pour les plasmides pTG4225 (E1 sauvage) et pTG4226 (LacZ à la place de la région E1) (par recombinaison homologue avec le plasmide pTG4609 ou bien pTG4213). Les virus sont générés par transfection des cellules 293, 293 exprimant la fibre sauvage (Legrand et al., 1999; J. Virol., 73, 907-919) ou bien de cellules surexprimant le récepteur liant le ligand concerné. De telles cellules peuvent être générées par transfection de l'ADN complémentaire correspondant. On utilise de préférence des cellules qui n'expriment pas naturellement le récepteur cellulaire naturel des adénovirus, par exemple la lignée Daudi (ATCC CCL213).
Figure imgf000026_0001
B. Etude de l'incorporation de la fibre modifiée dans la particule virale et de son utilisation dans l'entrée de l'adénovirus correpondant.
Pour s'assurer que les virus mutés portent bien dans leur capside les protéines fibres modifiées, les virus purifiés après amplification dans les cellules 293 sont déposés sur gel d'acrylamide 10% en conditions dénaturantes (PAGE- SDS). Les différentes protéines sont détectées par coloration au nitrate d'argent. Da manière alternative, la fibre est révélée spécifiquement en réalisant un western- blot à l'aide d'un sérum dirigé contre la tête de la fibre d'Adδ ( Henry et al., 1994, supra). Un signal intense à la taille attendue indique que les virus incorporent des quantités stoechiométriques de la protéine d'intérêt. Etant donné que seule la fibre trimérique est capable de lier le penton base (Novelli et Boulanger, 1991, supra) et d'être incorporée dans la particule, la détection de la protéine dans l'expérience ci- dessus indique que la fibre modifiée est toujours capable de former des trimères.
L'utilisation de la fibre modifiée pour permettre l'entrée du virus muté correspondant peut être étudiée en réalisant les expériences de compétition à l'aide de tête recombinante comme décrit ci-dessus dans l'exemple 1B. Une infection efficace en présence de concentrations saturantes du peptide sauvage indique une infection indépendante de la liaison aux récepteurs primaires naturels. Ceci suggère une affinité fortement réduite de la fibre modifiée pour ses récepteurs. EXEMPLE 6 : Insertion du ligand dans une protéine de capside autre gue la fibre en association avec une des modifications de la fibre précitées.
Cet exemple décrit l'insertion du ligand EGF dans la protéine de capside hexon. Bien entendu, il est préférable que l'adénovirus correspondant ait perdu sa capacité d'attachement au récepteur cellulaire naturel. Son génome peut par exemple inclure un gène de la fibre modifié ou être dépourvu d'une partie au moins des séquences de la fibre.
On construit un plasmide de transfert pour la recombinaison homologue couvrant la région du génome d'Adδ codant pour l'hexon (nt 18842-21700). Le fragment d'Adδ H/ndlll-XΛol (nt 18836-24816) est clone dans pBSK+ (Stratagène) digéré par ces mêmes enzymes pour donner le plasmide pTG4224. Les séquences codant pour le peptide EGF sont introduites dans la boucle hypervariable L1 de l'hexon par création de fragments chimériques par PCR : hexon (nt19043-19647)-X/.al-EGF-BstGI-hexon (nt19699-20312). Le fragment nt19043 à 19647 est obtenu par amplification PCR à partir du plasmide pTG3602 avec les oligonucleotides oTG11102 (SEQ ID NO: 17) et oTG11103 (SEQ ID NO: 18). Le fragment nt19699 à 20312 est amplifié à partir du même ADN avec les oligonucleotides oTG11104 (SEQ ID NO: 19) et oTG11105 (SEQ ID NO: 20). L'EGF est clone à partir de l'ADNc à l'aide des oligonucleotides oTG11106 (SEQ ID NO: 21) et OTG11107 (SEQ ID NO: 22) permettant de mettre la séquence codante de l'EGF en phase avec l'hexon. Les produits PCR sont digérés par les enzymes adéquates puis religués. Le fragment chimérique peut alors être inséré par recombinaison homologue dans le plasmide pTG4224 linéarisé par Nde\ (nt 19549), pour donner pTG4229. Les séquences codant pour l'hexon modifié peuvent être obtenues par digestion Hinû\\\-Xho\ et replacées dans leur contexte génomique par recombinaison homologue. On peut utiliser le vecteur pTG3602, pTG4607, pTG4629 linéarisé par Sgfl ou un vecteur portant le génome adénoviral délété des séquences de la fibre (comme pTG4607 décrit ci-dessous) ou exprimant une fibre modifiée.
Le génome adénoviral incapable de produire une fibre native fonctionnelle est obtenu par une délétion touchant le codon initiateur mais ne s'étendant pas aux autres ORFs adénoviraux. On procède de la façon suivante: le fragment adénoviral en 5' de la délétion (nt 30564 à 31041) est amplifié par PCR à l'aide des amorces OTG7171 et oTG7275 (SEQ ID NO: 23 et 24). L'amplification du fragment en 3' (nt 31129 à 33099) met en oeuvre les amorces oTG7276 et OTG7049 (SEQ ID NO: 25 et 26). Les fragments PCR sont digérés par Xho\ et mis en ligation avant d'être introduits par recombinaison homologue dans le vecteur pTG6591 linéarisé par Λ/c/el, pour donner pTG4602. Puis le fragment BstEW isolé de ce dernier est soumis à une recombinaison homologue avec le vecteur pTG3602 digéré par Spel. On obtient pTG4607. Le vecteur pTG4629 est équivalent à pTG4607, mais porte en outre la cassette d'expression LacZ à la place de E1.
Les virus correspondants peuvent être obtenus après transfection de cellules 293, 293 exprimant la fibre sauvage (Legrand et al., 1999, supra) ou de cellules surexprimant le récepteur de l'EGF. L'étude de la spécificité d'infection pourra être réalisée comme décrit auparavant en utilisant l'EGF en tant que compétiteur.

Claims

Revendications
1. Fibre d'un adénovirus modifiée comprenant au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus compris dans la région de ladite fibre s'étendant du feuillet A au feuillet B et incluant la boucle AB.
2. Fibre d'un adénovirus selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus compris dans la boucle AB.
3. Fibre d'un adénovirus selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle permet, lorsqu'elle est comprise dans une particule virale, d'obtenir une dite particule virale présentant les propriétés suivantes :
(i) ladite particule adénovirale ne se fixe pas de manière substantielle aux récepteurs cellulaires naturels ;
(ii) lorsque ladite particule adénovirale comprend en outre un ligand spécifique d'un anti-ligand, ladite particule modifiée a un nouveau tropisme envers un ou plusieurs types cellulaires spécifiques portant à leur surface ledit anti-ligand.
4. Fibre d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle dérive d'une fibre d'un adénovirus de type 5 (Ad5) comprenant tout ou partie de la séquence telle que montrée à l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO: 1) et en ce qu'elle comprend au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 400 et 428
5. Fibre d'un adénovirus de type 5 selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 404 et 418 de la SEQ ID NO: 1 .
6. Fibre d'un adénovirus de type 5 selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une mutation au niveau d'un ou plusieurs résidus de la région comprise entre les résidus 404 et 408 de la SEQ ID NO: 1.
7. Fibre d'un adénovirus de type 5 selon la revendication 6, caractérisée en ce ledit résidu est sélectionné parmi les résidus thréonine en position 404, alanine en position 406 et serine en position 408.
8. Fibre d'un adénovirus de type 5 selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend une substitution du résidu serine en position 408 par un résidu amino acide présentant au moins deux groupements carboxyle.
9. Fibre d'un adénovirus de type 5 selon la revendication 8, caractérisée en ledit résidu est sélectionné dans le groupe consistant en l'acide aspartique et l'acide glutamique.
10. Fibre d'un adénovirus de type 5 selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend une substitution du résidu thréonine en position 404 par un résidu glycine et/ou une substitution du résidu alanine en position 406 par un résidu lysine.
11. Fibre d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'une au moins des mutations est une délétion d'au moins 3 résidus consécutifs d'une boucle et/ou d'un feuillet de ladite région.
12. Fibre d'un adénovirus selon la revendication 11 , caractérisée en ce que lesdits résidus délétés sont remplacés par des résidus d'une boucle et/ou d'un feuillet équivalent dérivé d'une fibre d'un second adénovirus de type hétérologue, suceptible d'interagir avec un récepteur cellulaire différent dudit premier adénovirus.
13. Fibre d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une ou plusieurs mutations au niveau :
(i) des boucles CD, DG, GH, Hl et ou IJ et/ou (ii) des feuillets C, D, G, H, I et/ou J.
14. Fibre d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ligand capable de reconnaître un anti-ligand cellulaire différent du récepteur cellulaire naturel de la fibre non mutée.
15. Fibre d'un adénovirus selon la revendication 14, caractérisée en ce que le ligand est sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps ou un fragment d'anticorps, un peptide, un lipide, un glycolipide, une hormone, un polymère ou un sucre.
16. Fibre d'un adénovirus selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le ligand est inséré à l'extrémité C-terminale de la fibre.
17. Fibre d'un adénovirus selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le ligand est inséré en remplacement de résidus délétés.
18. Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il comprend la région s'étendant du feuillet A au feuillet B et incluant la boucle AB d'une fibre selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
19. Fragment peptidique selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit de la séquence s'étendant du résidu 388 au résidu 592 d'une fibre selon l'une quelconque des revendications 4 à 17.
20. Fragment d'ADN ou vecteur d'expression codant pour une fibre d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 17 ou un fragment peptidique selon l'une des revendications 18 ou 19.
21. Lignée cellulaire caractérisée en ce qu'elle comprend soit sous forme intégrée dans le génome ou sous forme d'épisome un fragment d'ADN selon la revendication 20 placé sous le contrôle des éléments permettant son expression dans ladite lignée cellulaire.
22. Lignée cellulaire selon la revendication 21 , caractérisée en ce qu'elle est en outre capable de complémenter un adénovirus déficient pour une ou plusieurs fonctions sélectionnées parmi les fonctions codées par les régions E1 , E2, E4 et L1-L5.
23. Lignée cellulaire selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce qu'elle est produite à partir de la lignée 293.
24. Lignée cellulaire selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce qu'elle est produite à partir de la lignée PERC6.
25. Particule adénovirale caractérisée en ce qu'elle est dépourvue d'une fibre native fonctionnelle et qu'elle comprend une fibre selon l'une des revendications 1 à 17.
26. Particule adénovirale caractérisée en ce qu'elle est dépourvue d'une fibre native fonctionnelle et qu'elle comprend une fibre selon l'une des revendications 1 à 17 et un ligand capable de reconnaître un anti-ligand cellulaire différent du récepteur cellulaire naturel de ladite particule.
27. Particule adénovirale selon la revendication 26, caractérisée en ce que ledit ligand est inséré dans une protéine de la capside adénovirale autre que la fibre, notamment l'hexon ou le penton.
28. Particule adénovirale selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisée en ce qu'elle est vide.
29. Particule adénovirale selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisée en ce qu'elle renferme un génome adénoviral.
30. Particule adénovirale selon la revendication 29, caractérisée en ce que ledit génome adénoviral est un génome adénoviral recombinant défectif pour la réplication.
31. Procédé pour produire une particule adénovirale selon la revendication 29, caractérisé en ce que :
(i) on transfecte undit génome adénoviral recombinant défectif pour la réplication dans une lignée cellulaire appropriée,
(ii) on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule adénovirale, et
(iii) on récupère ledit adénovirus de ladite culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, on purifie ladite particule adénovirale.
32. Procédé pour produire une particule adénovirale renfermant un génome adénoviral dépourvu de tout ou partie des séquences codant pour une fibre, caractérisé en ce que : on transfecte ledit génome dans une lignée cellulaire selon l'une des revendications 21 à 24, on cultive ladite lignée cellulaire transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule adénovirale , et on récupère ladite particule adénovirale dans la culture de ladite lignée cellulaire transfectée et, éventuellement, on purifie ladite particule adénovirale.
33. Composition comprenant une particule adénovirale selon l'une des revendications 25 à 30 ou susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 31 ou 32 en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
34. Composition selon la revendication 33 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé sélectionné parmi un acide nucléique nu ou un acide nucléique combiné à au moins un composé canonique.
35. Utilisation d'une particule adénovirale selon l'une des revendications 25 à 30 ou susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 31 ou 32 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal.
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