CA2269864A1 - Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible de genes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant une expression ciblée et inductible de gènes. Elle décrit en particulier de nouveaux promoteurs hybrides et leur utilisation pour l'expression de gènes dans les cellules hépatiques, in vitro, ex vivo ou in vivo.

Description

NOUVELLES CONSTRUCTIONS ET VECTEURS POUR L'EXPRESSION
CIBLEE ET INDUCTIBLE DE GENES
. La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en particuler le domaine de la régulation de l'expression de gènes. Elle décrit notamment de nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant une expression ciblée et inductibe de gènes. La présente invention est utilisable dans de nombreux domaines, et en particulier pour la production de protéines recombinantes, pour la création de modèles animaux transgéniques, pour la création de lignées cellulaires, pour la mise au point de tests de criblage, ou encore en thérapie génique et cellulaire.
La possibilité de contrôler et de diriger l'expression de gènes constitue un enjeu très important dans le développement des biotechnologies. In vitro, elle permet d'améliorer les conditions de production de protéines recombinantes, en découplant par exernpie la phase de croissance cellulaire et la phase de production. Toujours in vitro) elle permet encore de créer des lignées cellulaires capables de produire certaines molécules à des périodes choisies. Ainsi, il est envisageable de construire des lignées cellulaires produisant, de manière régulée, des protéines transcomplementant des génomes viraux défectifs. Toujours in vitro, un système d'expression régulé permet la mise au point de tests de criblages de molécules agissant sur le controle de l'expression de gènes. Le controle de l'expression de gènes est également très important pour des approches thérapeutiques ex vivo ou in vivo, dans lesquelles la possibilité de controler sélectivement la production d'une molécule thérapeutique est essentielle. En effet, selon les applications, selon le gène à transférer, il est important de pouvoir cibler certains tissus ou certaines parties seulement d'un organisme afin de concentrer l'effet thérapeutique et de limiter la dissémination et les effets secondaires.
' Ce ciblage peut être réalisé en utilisant des vecteurs présentant une spécificité cellulaire donnée. Une autre approche consiste à utiliser des signaux d'expression spécifiques de certains types cellulaires. A cet égard, des promoteurs dits spécifiques ont été décrits dans la littérature, tels que le promoteur des gènes codant pour la pyruvate kinase, la villine, la GFAP, le promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras. le promoteur

2 de l'actine a des cellules du muscle lisse, ou le promoteur du gène de l'albumine humaine par exemple. Cependant, si ces promoteurs présentent une certaine spécificité tissulaire, ils ne sont pas régulables et de ce fait, offrent des possibilités de controle limitées. D'autres systèmes, plus complexes,ont été décrits dans la littérature. Ainsi) la demande W096/01313 décrit un système d'expression de gènes régulé par la tétracycline. De même, Wang et al. (PNAS 91 (1994) 8180) ont décrit un système d'expression de gènes régulé par le RU486. Evans et al. Ont quant à eux décrit un système basé sur le récepteur à f'ecdysone, hormone d'insecte l0 (PNAS 93 (1996) 3346). Cependant, ces différents systèmes, bien qu'inductibles, ne présentent pas de spécificité tissulaire. De ce fait, ils ne permettent pas à eux seuls de cibler l'expression au niveau d'organes ou de tissus désirés, mais simplement d'induire ou de réprimer l'expression de manière ubiquitaire. De plus, le système tétracycline présente un niveau de régulation relativement faible, inférieur à un facteur cinq. Par ailleurs, ces systèmes fonctionnent avec des molécules hybrides et nécessitent la cotransfection de 2 constructions au moins. En outre, ils mettent en oeuvre des éléments hétérologues et risquent donc de générer des réactions immunitaires.
L'invention décrit maintenant de nouvelles constructions permettant l'expression ciblée et régulée de gènes. L'invention décrit en particulier des vecteurs recombinants permettant une expression de gènes inductible et hépatospécifique. L'invention décrit également de nouvelles constructions promotrices ayant des niveaux de régulation améliorés. La présente invention offre ainsi un moyen particulièrement performant pour le ciblage de l'expression de gènes dans des cellules hépatiques, in vivo ou in vitro) et pour la régulation de cette expression.
La présente demande repose en particulier sur l'utilisation du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine All. L'apolipoprotéine All (apoAll) est l'un des constituants protéiques majeurs des lipoprotéines de hautes densité (HDL). L'apoAll est synthétisée majoritairement dans le foie, bien que des résultats contradictoires suggèrent une synthèse égaiement au niveau de l'intestin. Le gène humain de l'apoAll a été cloné et séquencé
(Tsao et al., J.BioI.Chem 260 (1985) 15222). La région promotrice s'étend sur WO 98/21349 PCT/FR97/01992 '

3 environ 1 kb en amont du codon d'initiation de la transcription. Elle comporte des éléments régulateurs localisés au niveau des nucléotides -903 à -680, ainsi que des sites multiples additionnels situés au niveau de la région intermédiaire (nucléotides -573 à -255) et proximale (-126 à -33).
L'expression optimale est obtenue lorsque des facteurs nucléaires sont liés aux éléments régulateurs proximaux et distaux du promoteur.
La séquence du promoteur du gène humain de l'apoAll, du résidu -911 à +29 est représentée sur la séquence SEQ ID n° 1.
II a été observé des mécanismes de régulation du promoteur apoAll contradictoires chez l'homme et chez les rongeurs. Dans un cas, une stimulation par les fibrates a été observée, dans l'autre, une inhibition. Les fibrates, souvent utilisés comme agents hypolipidémiques, appartiennent à la famille chimique des proliférateurs de peroxisome, dans la mesure où ils induisent une hépatomegalie liée à la prolifération des peroxisomes chez les rongeurs. Leur action est médiée -par des récepteurs activés (PPAR
"Peroxisome Proliferator Activated Receptor"), un groupe de 4 récepteurs nucléaires distincts (a, ~, y, 8). Les PPAR appartiennent à la superfamille des récepteurs hormonaux nucléaires qui se lient à des éléments de réponse spécifiques désignés PPRE ("Peroxisome Proliferator Response Element"}.
?0 Des PPRE ont été identifiés dans de nombreux gènes codant pour des enzymes impliquées dans la voie de ~-oxydation, qui se sont avérés être inductibles par les fibrates.
La demanderesse a maintenant mis au point un système d'expression de gènes hépatospécifique et inductible par les fibrates, ''S utilisables in vitro et in vivo. Plus particulièrement, la demanderesse a construit pour la première fois un vecteur ayant un tropisme pour le foie permettant l'expression de gènes de maniére sélective dans le foie ou les cellules hépatiques, et de manière inductible par les fibrates. La demanderesse a également construit de nouveaux promoteurs dérivés du 30 promoteur du gène de l'apoAll humain, ayant des propriétés d'inductibilité
et de force améliorées.
Un premier objet de l'invention réside dans un vecteur recombinant pour l'expression inductible et hépatospécifique d'une molécule caractérisé

WO 98/21349 PCT/FR97/01992 '

4 en ce qu'il comprend, une cassette d'expression constituée d'un acide nucléique codant pour ladite molécule placé sous controle du promoteur du gène de l'apolipoprotéine All humain.
Selon une variante particulièrement préférée le vecteur recombinant est un vecteur viral dérivé des adénovirus, comprenant, inséré dans son génome, ladite cassette d'expression.
De manière particulièrement remarquable, la demanderesse a en effet montré qu'un tel adénovirus permettait d'exprimer un gène spécifiquement dans le foie, que cette expression était fortement inductible in vivo par les fibrates, et que les niveaux d'expression obtenus étaient comparables à ceux décrits antérieurement avec les promoteurs constitutifs les plus forts.
Le caractère hépatospécifique des virus de l'invention signifie que ces virus permettent l'expression d'un gène de manière très sélective dans les cellules hépatiques, in vitro, ex vivo ou in vivo. Une expression non-spécifique faible dans d'autres tissus ou types cellulaires peut être tolérée, dès lors qu'une expression très majoritaire est observée dans les cellules hépatiques (de préférence plus de 80% des cellules exprimant le transgène sont des cellules hépatiques. Encore plus préférentiellement, plus de 90%).
En particulier, contrairement aux indications contradictoires relevées dans l'art antérieur, !e virus selon l'invention n'induit aucune expression détectable dans l'intestin et offre donc une sélectivité particulièrement élevée. Ceci est très important pour des approches de transfert et d'expression de gènes toxiques, pour lesquelles un niveau de sélectivité très élevé est nécessaire.
Par ailleurs, comme indiqué précédemment, les sytèmes inductibles décrits dans l'art antérieur présentent une inductibilité moyenne, d'un facteur cinq environ. Les résultats présentés dans les exemples démontrent que l'adénovirus de l'invention est inductible d'un facteur dix environ. Le niveau d'inductibilité est également très important pour obtenir un contrôle de la quantité de molécules délivrées in vivo. Ceci est particulièrement sensible dans le cas de molécules immunogènes ou susceptibles de générer des réponses inflammatoires. Ceci est également particulièrement intéressant pour l'expression de molécules dont l'efficacité biologique implique des concentrations élevées. D'autre part, une autre caractéristique particulièrement remarquable du vecteur de l'invention réside dans les niveaux d'expression élevés obtenus. En effet, les systèmes inductibles présentent généralement en contrepartie, des niveaux d'expression moyens voire faibles. De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a

5 montré que le système de l'invention permet d'obtenir des niveaux d'expression in vivo comparables à ceux décrits pour les promoteurs constitutifs les plus forts. Le système de l'invention combine donc pour la première fois des propriétés remarquables de sélectivité, d'inductibilité, et de force.
L'un des aspects de l'invention réside donc dans l'utilisation du promoteur du gène humain de l'apoAll. Un autre aspect de l'invention réside dans ia construction de vecteurs dérivés des adénovirus. Les vecteurs selon l'invention combinent des propriétés remarquables de transfert de gènes, d'inocuité, de spécificité tissulaire, d'inductibilité et de force.
Avantageusement, le promoteur utilisé dans les virus de l'invention comprend les éléments régulateurs du promoteur du gène de l'apoAll. Plus particulièrement, ces éléments sont localisés au niveau des nucléotides -903 à -680; -573 à -255; et -126 à -33 du gène humain de l'apoAll. A cet égard, selon une variante particulière, le promoteur comprend les résidus -911 à
+29 du gène de l'apoAll (séquence SEQ ID n° 1 ).
II est entendu que des formes plus courtes ou plus longues du promoteur peuvent être utilisées. Ainsi, du coté 3', ü est important que le promoteur comprenne le site d'initiation de la transcription du gène de l'apoAl I (numéroté +1 sur SEQ ID n° 1 ). En revanche, il est préférable que ce ?5 promoteur ne contienne pas le premier intron du gène de l'apoAll, qui commence au nucléotide +38. Ainsi, avantageusement, le fragment utilisé
possède une extrémité 3' comprise entre les résidus +5 et +35, plus préférentiellement +10 et +30 du gène apoAll. Pour ce qui est de l'extrémité
5', il est préférable, pour obtenir des niveaux importants d'expression dans le foie, de conserver au moins en partie le site de liaison des facteurs hépatiques. Ce site est localisé au niveau des nucléotides -903 à -680. De ce fait, avantageusement, ie fragment utilisé possède une extrémité 5' localisée en amont du nucléotide -903. Cette extrémité peut être localisée par exemple dans la région -950 à -910. Par ailleurs, pour des raisons de capacité de

6 clonage, il est avantageux d'utiliser une région promotrice de taille réduite.
De ce fait, on préfère utiliser un fragment dont l'extrémité 5' est localisée dans la région -925 à -910.
Selon une variante avantageuse de l'invention, le promoteur comporte les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -680 (ou -903 à -720) et -126 à -33, mais pas les éléments intermédiaires localisés au niveau des nucléotides -573 à -255. En particulier, le promoteur utilisé
comprend avantageusement une délétion dans la région comprise entre les résidus -710 et -150. A titre d'exemple spécifique, le promoteur peut être avantageusement constitué d'un variant de la séquence SEQ ID n° 1 obtenu par délétion des résidus 708-210. De manière encore plus préférentielle, le promoteur utilisé comprend une délétion dans ia région comprise entre les résidus -670 et -210. A titre d'exemple spécifique, le promoteur peut être avantageusement constitué d'un variant de la séquence SEQ ID n° 1 obtenu par délétion des résidus; 653-210.
Les résultats présentés dans les exemples montrent en effet que ce type de construction présente une force élevée et une inductibilité par les fibrates supérieure au promoteur natif de l'apoAll, dans un contexte adénoviral. Ces constructions sont donc avantageuses sur le plan des propriétés régulatrices, comme sur le plan de la capacité de clonage du vecteur, puisque la région promotrice est réduite.
Selon un autre mode de réalisation, les adénovirus selon l'invention comprennent comme promoteur un variant du promoteur du gène de l'apolipoprotéine All comprenant une répétition de motifs J. La multiplication de la région J permet de manière avantageuse d'augmenter également le caractère inductible par les fibrates du promoteur. La région J est constituée de la séquence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID n° 2, soulignée sur SEQ -ID n°1 ). Elle est localisée dans le promoteur All au niveau des nucléotides -734 à -716 du promoteur. La demanderesse a maintenant construit des virus recombinants comportant des promoteurs modifiés au niveau de ia région J. Ces virus présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour ie transfert et l'expression de gènes, in vitro comme in vivo.

7 Préférentiellement, le promoteur comprend de 2 à 5 motifs J. Encore plus préférentiellement, il comprend 3 motifs J. Pour la construction de ces . variants, la répétition de motifs J peut être positionnée en 5' du promoteur, en 3' du promoteur, ou insérée dans la séquence du promoteur, de préférence au niveau de la séquence J native. Par ailleurs, la multiplication de motifs J
peut avantageusement être combinée avec une délétion telle que décrite cl-avant. Ceci permet d'obtenir un promoteur ayant des propriétés encore améliorées en terme de puissance et de contrôle de l'expression de gènes.
Ces différentes constructions peuvent être réalisées selon tes techniques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Ainsi, en partant de la séquence SES ID n° 1, l'homme du métier peut effectuer différentes délétions en sélectionnant des enzymes de restriction appropriées. Les délétions peuvent également être réalisées par mutagénèse dirigée ou par PCR. D'autre part, les régions J peuvent être synthétisées artificiellement au moyen de synthétiseurs de nucléotides, puis insérées dans ou fusionnées au promoteur par PCR ou par clivage et ligation au moyen d'enzymes appropriées. Ces différentes approches sont illustrées dans les exemples.
Comme indiqué ci-avant, les capacités remarquables des vecteurs de l'invention découlent du promoteur utilisé) comme du choix du vecteur. La mise en évidence de la fonctionnalité des promoteurs dans un contexte adénoviral in vivo a en effet permis la réalisation de ces vecteurs très pertormants.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ. II en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adénovirus y recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Adl2). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 WO 98/21349 PCT/FR97/01992 '

8 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence.
Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions E1, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci) les gènes contenus dans la région E1 notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L1 à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquencé
et est accessible sur base de données avoir notamment Genebank M73260).
De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs recombinants, différentes t 5 constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans ia cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région E1, essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991 ) 195 ; Gosh-Choudhury et al.) Gene 50 (1986) 161 ). Par ailleurs) pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été
proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à
l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans

9 PCT/FR97/01992 lesquels les régions E1 et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152, W095/02697, W096/22378). En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (W096/10088).
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de !'invention, l'adénovirus recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De maniëre plus préférentielle, il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou AdS.
Avantageusement, l'adénovirus recombinant utilisé dans ie cadre de t o l'invention comprend une délétion dans la région E 1 de son génome. Encore plus particulièrement, il comprend une délétion des régions E1 a et E1 b. A
titre d'exemple précis, on peut citer des délétions affectant les nucléotides 454-3328; 382-3446 ou 357-4020 (par référence au génome de l'Ad5).
Selon une variante préférentielle, l'adénovirus recombinant utilisé
dans le cadre de l'invention comprend en outre une délétion dans la région E4 de son génome. Plus particulièrement, la délétion dans la région E4 affecte l'ensemble des phases ouvertes. On peut citer à titre d'exemple précis les délétions 33466-35535 ou 33093-35535. D'autres types de délétions dans la région E4 sont décrites dans les demandes W095/02697 et W096/22378, incorporées à la présente par référence.
La cassette d'expression peut être insérée en différents sites du génome recombinant. Elle peut être insérée au niveau de la région E1, E3 ou E4) en remplacement des séquences délétées ou en surplus. Elle peut égelement être insérée en tout autre site, en dehors des séquences nécessaires en cis à la production des virus (séquences ITR et séquence d'encapsidation).
Les adénovirus recombinants sont produits dans une (ignée d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs dés fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. L'une de ces lignées est par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été
intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région E1, incluant E1 a et E1 b, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine piVa2.
5 Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région E1, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région E1, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette lignée est également capable de produire, à température permissive (32°C}, des stocks de virus comportant en outre ia mutation

10 thermosensible. D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région E1 ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites.
En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions E1 et E4 (Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559 ; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322 ;
Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les régions E1 et E2 (W094/28152, W095/02697, W095/27071 ).
Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Pour la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit peut être le génome viral recombinant complet, eventuellement construit dans une batterie (W096/25506) ou dans une levure (W095/03400), transfecté dans les cellules. II peut ëgalement s'agir d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN viral peut aussi ëtre introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome vira! recombinant par recombinaison homologue entre les différents fragments.

Après la lyse des cellules) les particules virales recombinantes sont isolées par centrifugation en gradient de chlorure de césium. Une méthode alternative a été décrite dans la demande FR96:08164 incorporée à la présente par référence.
Le vecteur recombinant ayant un tropisme pour le foie peut également être construit à partir d'un vecteur non viral de type plasmidique, en particulier tel que décrit dans les demandes W096/26270 et PCT/FR96/01414.
Comme indiqué ci-avant, les vecteurs de l'invention permettent la production régulée, à haut niveau, et hépatospécifique, de molécules d'intérêt. La molécule d'intérêt est avantageusement une molécule thérapeutique. II peut s'agir d'une protéine ou d'un acide nucléique (ARNt, ARN antisens, etc).
De manière particulièrement préférée, la molécule thérapeutique est une protéine sécrétée dans la circulation. On peut citer à titre d'exemple les enzymes, les dérivés sanguins) les hormones, les lymphokines interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse) les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS, etc; les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (W094/25073), la dystrophine ou une minidystrophine (W093/06223)) les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rap1 A, DCC, k-rev, etc (W094/24297), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII) IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc, W094/29446).
Pour assurer la sécrétion de la protéine, la cassette d'expression comprend avantageusement une séquence signal appropriée. II peut en particulier s'agir de la séquence signal naturelle de la protéine sécrétée, si celle-ci est fonctionnelle dans une cellule hépatique. II peut également s'agir de toute séquence hétérologue appropriée. A titre d'exemple, on peut citer la séquence signal de l'apolipoprotéine AI. En outre, la cassette comporte généralement une région située en 3' qui spécifie un signal de terminaison de la transcription et de polyadénylation. On utilise par exemple le site polyA
du virus SV40. II est entendu que le choix de ces signaux entre dans les compétences générales de l'homme du métier.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable.
II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un hydrogel.
Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été
décrits dans la demande W093/08845. Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont ?0 commerciaux. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à
exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 108 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans ia littérature.

En raison de leur caractère hépatospécifique) les vecteurs ' (notamment adénovirus) selon l'invention sont également utilisables pour la création de modèles animaux de pathologies hépatiques.
Par ailleurs, l'invention concerne également toute cellule modifiée par un vecteur (notamment un adénovirus) tel que décrit ci-avant. Ces cellules peuvent être utilisées pour la production de protéines recombinantes in vitro.
Elles peuvent également être destinées à une implantation dans un organisme, selon la méthodologie décrite dans la demande W095/14785.
Ces cellules sont préférentiellement des cellules hépatiques.
l0 La présente invention a encore pour objet un procédé de production de protéines recombinantes comprenant l'infection ou la transfection d'une population cellulaire avec un vecteur, un adénovirus recombinant ou le génome viral correspondant comprenant une cassette d'expression codant pour une protéine désirée, la culture de ladite population cellulaire recombinante, et la récupération de ladite protéine produite.
Avantageusement, pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on utilise des cellules d'origine hépatique. II peut s'agir de lignées établies ou de cultures primaires.
L'invention concerne également de nouveaux variants du promoteur '?0 du gène de l'apolipoprotéine All humain ayant des caractéristiques d'expression améliorées. Ces variants selon l'invention comprennent en particulier une répétition de motifs J tels que décrits précédemment. En outre, ces variants comprennent avantageusement une délétion dans la région comprise entre les résidus -710 et -150 du promoteur natif.
?5 L'invention concerne également des promoteurs hépatospécifiques et inductibles dérivés du promoteur du gène de l'apolipoprotéine All humain comprenant une région régulatrice composée d'un ou plusieurs motifs J du promoteur de l'apolipoprotéine All et une région promotrice hépatospécifique issue d'un autre promoteur.
30 Avantageusement, la région promotrice hépatospécifique est issue d'un promoteur hépatospécifique autre que le promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine All. Préférentiellement, elle est composée d'un promoteur choisi choisi parmi le promoteur de la sérum albumine, le promoteur de l'apoüpoprotéine AI, le promoteur de l'apolipoprotéine Cs, le promoteur de l'apolipoprotéine 8100, le promoteur de la chaise gamma du fibrinogène (JBC 270 (1995) 28350)) le promoteur du gène de la phénylalanine hydroxylase humaine (PNAS 93 (1996) 728), le promoteur du gène de l'AMBP (NAR 23 (1995) 395), le promoteur du gène du facteur X (JBC 271 (1996) 2323), le promoteur du cytochrome P450 1 A1 (PNAS 92 (1995) 1 i 926), le promoteur du virus de l'hépatite B (BioLChem. 377 (1996) 187) ou encore le promoteur de l'a-antitrypsine. La région promoteur utilisée est préférentiellement constituée de la région nécessaire et suffisante pour l'expression hépatique (promoteur minimum). Cette région comprend l0 généralement fa boite TATA, et peut être préparée selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme indiqué dans les références citées. Ainsi, tes 209 premières paires de bases du promoteur du gène du facteur X sont suffisantes pour-conférer l'expression hépatique (JBC précité).
De même, des fragments -20 à -23; -54 à -57 et -66 à -77 du promoteur de la chaise gamma du fibrinogène constituent un promoteur minimal permettant une expression hépatospécifique. Ces régions peuvent être jointes aux régions J (de préférence 1 à 5) selon la méthodologie décrite ci-avant et illustrée dans les exemples, pour générer des promoteurs hépatospécifiques et inductibles. En outre, ces promoteurs peuvent porter des séquences additionnelles de régulation de type "enhanceur", permettant d'améliorer les niveaux d'expression.
La région promotrice hépatospécifique peut également être composée d'un promoteur ubiquitaire couplé à un élément enhanceur conférant une expression hépatospécifique.
A cet égard, l'élément enhanceur conférant le caractère hépatospécifique peut ëtre choisi parmi l'enhancer des apolipoproteines E/C-I
(J. Biol. Chem., 268 (1993) 8221-8229 et J. Biol. Chem, 270 (1995) 22577-22585), l'enhancer de l'albumine (Gene therapy, 3 (1996) 802-810)) l'enhancer de la transthyretine (Mol. Cell Biol. 15 (1995) 1364-1376), l'enhanceur du virus de l'hépatite B (BioI.Chem. 377 (1996} 187) ou encore des enhancers artificiels contenant des sites HNF (hepatic nuclear factors), sites de liaison aux recepteurs orphelins, membres des recepteurs aux hormones steroidiennes (Humas Bene therapy, 7 {1996) 159-171 ).

IS
Le promoteur ubiquitaire peut être tout promoteur non spécifique d'un tissu. II peut s'agir en particulier d'un promoteur viral ou d'un promoteur domestique {"housekeeping"). Parmi les promoteurs viraux, on peut citer plus particulièrement le promoteur SV40 (Mol Cell Biol 1982; 2:1044-1051 ); RSV
LTR, Rous sarcoma virus long terminal repeat (PNAS USA, 1982; 79:6777-6781); CMV-IE, human cytomegalovirus (Gene 1986; 45:101-105); MoMLV
LTR, Moloney murine leukemia virus (Gene Therapy 1996; 3:806-810} et le promoteur du gène HSV-TK, Thymidine Kinase (Nucleic Acid Res 1980;
8:5949-5964). Parmi les promoteurs domestiques, on peut citer le promoteur des gènes Human EF-1 alpha, elongation factor (Gene 1993, 134:307-308), Beta Actine de poulet (Nucleic Acids Res 1983; 11: 8287-8301 ), POL II
promoteur, ARN polymerase II de souris (Mol Cell Biol 1987; 7: 2012-2018):
PGK, Phosphoglycerate Kinase (Gene 1987; 61: 291-298); Histone H4 (Mol Cell Biol 1985; 5:380-398), HMG, Hydroxymethylglutaryl CoA:reductase humain (Mol Cell Biol 1987; 7: 1881-1893), HK2, Hexokinase II de rat (J. Biol.
Chem. 1995; 270:16918-16925) et PRP, Prion (Virus genes 1992; 6: 343-356). Tout autre promoteur ubiquitaire connu de l'homme du métier peut également être utilisé.
La région promotrice hépatospécifique peut ëtre obtenue en couplant selon les techniques classiques de biologie moléculaire tout ou une partie fonctionnelle d'un promoteur ubiquitaire avec l'élément enhanceur ci-dessus.
En particulier, les oligonucleotides correspondants aux sites J contenant les bases -737 à -715 du promoteur de l'apoA-II humaine peuvent etre clonés dans les sites BamHl/Gglll de pIC20H (Gene 1984; 32:481-485}, digérés par Hindlll, et sous clonés en 5' du promoteur ubiquitaire choisi, par exemple du promoteur de la Thymidine Kinase (TK) dans le plasmide pBLCAT4 (Nucl Acid Res 1987; 15: 5490), pour générer un vecteur contenant fes sites J et un promoteur ubiquitaire devant un gène d'intérêt. L'enhancer hépatique peut être ajouté soit en 5' du promoteur ou en 3' du site de polyadenylation.
Ces variants sont particulièrement avantageux car combinent les propriétés de force d'expression, de spécificité tissulaire, et d'inductibilité.
Ces différents variants peuvent être utilisés pour l'expression de gènes d'intérêt, in vitro et in vivo comme indiqué ci-avant et illustré dans les exemples.

L'invention concerne également des vecteurs recombinants comportant une cassette d'expression composée d'un gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur tel que décrit ci-avant.
L'invention concerne également une composition comprenant un vecteur recombinant tel que décrit ci-avant et un activateur de PPAR, en vue d'une utilisation simultanée ou étalée dans le temps.
Le vecteur recombinant est avantageusement un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, et l'activateur de PPAR est avantageusement un activateur de PPARa.
Parmi les activateurs de PPARa, on peut utiliser plus particulièrement les fibrates ainsi que tout composé augmentant l'expression de facteurs de transcription se fixant sur les sites J.
A titre d'exemples préférés de fib~ates, on peut citer par exemple l'acide fibrique et ses analogues tels que notamment le gemfibrozil (Atherosclerosis 114( 1 ) ( 1995) 61 ), le bezafibrate ( Hepatology 21 ( 1995) 1025), le ciprofibrate (BCE&M 9(4) (1995) 825), le clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301 ), le fénofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinicat Communications, 1995), le clinofibrate (Kidney International. 44(6) (1993) 1352), l'acide pirinixique (Wy-14,643) ou l'acide 5,8,11,14-eicosatetranoique (ETYA). Ces différents composés sont compatibles avec une utilisation biologique et/ou pharmacologique in vitro ou in vivo.
A titre d'exemples de composés augmentant l'expression de facteurs de transcription se fixant sur les sites J, on peut citer notamment les rétinoïdes, qui activent l'expression de RXR et HFN4.
Par ailleurs, les compositions selon l'invention peuvent comporter plusieurs activateurs de PPAR en association, et en particulier un fibrate ou un analogue de fibrate associé à un rétinoïde.
Comme indiqué ci-avant, le vecteur et l'activateur peuvent être utilisés simultanément ou de manière espacée dans le temps. En outre) ils peuvent être conditionnés de manière séparée. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le vecteur et l'activateur sont conditionnés séparément et utilisés de manière espacée dans le temps. En particulier, le vecteur est avantageusement utilisé en premier, puis, dans un second temps, l'activateur de PPAR. Le terme utilisé désigne la mise en contact dudit vecteur ou activateur avec les cellules, in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro ou ex vivo, la ( mise en contact peut être effectuée par incubation d'une population cellulaire telle que mentionnée plus haut avec ie vecteur (par exemple de 0,01 à 1000 ug de vecteur pour i Os cellules, ou de virus à une Multiplicité d'Infection (MOI) de 0,1 à 1000), suivie d'une incubation avec l'activateur (généralement, dans une gamme de concentration comprise entre 10-3 mM et 10 mM, de préférence entre 10 uM et 500 NM). In vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques ou pour l'expression hépatospécifique de gènes d'intérêt, la mise en contact comprend généralement l'administration du vecteur (dans les conditions décrites ci-avant) suivie de l'administration de l'activateur. A cet égard, l'activateur peut être administré par voie orale, par exemple dans la nourriture (pour les animaux en particulier) ou sous forme de gélules (pour l'homme). Les doses journalières administrées aux animaux sont de l'ordre de 0,01 à 1 % (poids/poids), de préférence de 0,2 à 0,5 (poids/poids). Une dose journalière typique chez ia souris par exemple est de 50 mg. Une dose journalière typique de fénobibrate chez l'homme varie entre 100 et 300 mg) de préférence autour de 200mg, qui correspond à une concentration plasmatique de 15 Ng/ml environ (Vidai, 1996). En outre, des administrations/incubations répétées de vecteur et/ou d'activateur peuvent être effectuées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Lé4ende des figures Fi ure 1 : Structure du promoteur apoAll et des formes délétées.
Fi ure 2 : Stratégie de duplication de la région J.
Figure 3 : Structure des promoteurs apoAll comportant une duplication de la région J en 5', éventuellement combinée à des délétions internes.
Fi ure 4 : Str'ucture des promoteurs apoAll comportant une duplication de la région J en interne, éventuellement combinée à des délétions internes.

WO 98/21349 PCT/FR97/01992 ' Fi ure 5 : Représentation de l'adénovirus recombinant.
Fi ure 6 : Inductibilité et force de l'adénovirus recombinant in vivo.
Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecuiar Cloning, a Laboratory Manual".
Cold Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds)) "Current Protocols in Molecular Bioiogy", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoi/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coii (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynuciéotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Tayior et al. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR ~olymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 {1987) 335-350j peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par ia méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467j en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples Exemple 1 : Clonage du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine All.
Cet exemple décrit le clonage-du promoteur gu gène humain de l'apoAll. II
est entendu que toute autre technique peut être utilisée pour reclouer ce promoteur. Par ailleurs, il est également possible, à partir des fragments clonés, de préparer selon les techniques de biologie moléculaire classiques des versions plus courtes en 5' et/ou en 3'.
1.1. Clonage d'un fragment -911/+29 Le promoteur de l'apoplipoproteine Af I humaine a été cloné par PCR à partir d'ADN génomique humain. Des amorces ATC GAA GCT TCT GAT ATC TAT
TTA ACT GAT (SEG~ ID n°3) et CGT CTC TGT CCT TGG TGT CTG GAT
CCA TCG (SEQ ID n°4) qui introduisent, pour la première, un site Hindlll en 5' du promoteur, et pour la seconde, un site BamHl en 3', ont permis de cloner le promoteur de la position -911 à la position +29. La séquence du promoteur a été confirmée par séquençage (SEQ ID n° 1 ) et le fragment Hindlll-BamHl introduit dans le vecteur pBLCAT5 pour vérification de l'activité
transcriptionnelle.
1.2. Clonage d'un fragment -911 /+160 Un fragment comportant le promoteur apoAl I des résidus -911 /+160 a également été obtenu à partir de la banque génomique, puis cloné dans le vecteur pBLCATS.
Exemple 2 : Construction de variants du Promoteur All 2.1. Création de formes tronquées Cet exemple décrit la construction de variants du promoteur apoAll comportant une délétion interne, dans la région comprise entre les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -720, et -126 à -33.
5 Ces variants ont été construits à partir des fragments -911 /+29 et -911 /+160 décrits dans l'exemple 1.
A partir des vecteurs pBLCATS comportant le promoteur complet sous forme d'un fragment -91 1/+29 ou -911/+160, la région -210 à +29 ou -210 à +160 a été obtenue par PCR en utilisant comme amorce un oligonucléotide -210/-10 198 de séquence 5'-GACTCTAGATGTACCCCCTTA-3' (SEQ ID n°5) et un oligonucléotide interne au gène CAT. Le fragment obtenu a été cloné dans un plasmide pBLCATS pour générer les plasmides -210/+160A11-CAT et 210/+29A11-CAT. La région distale -911 à -653 (N-I) a été obtenue par digestion du fragment -911 à +29 au moyen de l'enzyme alul, puis clonage 15 du fragment obtenu dans les plasmides -210/+160A11-CAT et -210/+29A11-CAT. La région distale -911 à -708 (N-J) a été obtenue par PCR en utilisant comme amorce un oligonucléotide -708/-722 de séquence 5'-GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG-3' (SEQ ID n°6). Le fragment obtenu a ensuite été cloné dans les plasmides -210/+160A11-CAT et -210/+29A11-CAT.
?0 La structure des promoteurs est représentée sur la figure 1.
2.2. Dualication du site J
Cet exempte décrit ta construction de variants du Promoteur All dans lesquels la région J a été répétée.
Les deux oligonucléotides suivants, correspondant au site J. ont été
synthétisés en utilisant un synthétiseur d'ADN.
Oligo 1: 5'-gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa-3' (SEQ ID n°7) Oligo 2: 5'-gatctCTACCAGGGTAAAGGTTGAag-3' (SECS ID n°8) Ces oligonucléotides reconstituent, à l'extrémité 3') un site BamHl et à
l'extrémité 5', un site Bglll. Ces oligonucléotides ont été hybridés ensemble et le fragment obtenu a été cloné aux sites BamHl-Bglll dans le vecteur pIC20H

(Figure 2). Les plasmides pIC20H-J résultant ont été analysés pour déterminer le nombre de copies de sites J insérés, ainsi que leur orientation respective.
Les plasmides suivants ont été sélectionnés - un plasmide portant une seule copie du site J, - un plasmide portant 2 copies du site J dans la mëme orientation, - un plasmide portant 2 copies du site J, en orientation inverse.
Pour construire les variants du promoteur apoAll comportant des motifs J
répétés en 5', les inserts contenus dans les plasmides ci-dessus ont été
excisés sous forme de fragments Hindlll et clonés en 5' du promoteur apoAll {exemple 1 ) ou des variants décrits dans l'exemple 2.1, au niveau d'un site Hindlll. La structure des promoteurs résultants est donnée sur la figure 3.
Pour construire les variants du promoteur apoAll comportant des motifs J
! 5 répétés en interne, les inserts contenus dans les plasmides ci-dessus ont été
excisés sous forme de fragments de restriction appropriés, puis clonés dans le promoteur apoAll {exemple 1 ) ou dans les variants décrits dans l'exemple 2.1, au niveau d'un site correspondant situé entre la région J native et la région de régulation -126-33 du promoteur natif. La structure des promoteurs résultants est donnée sur la figure 4.
Le nombre de copies de la région J dans la construction finale est déterminé
par le choix du plasmide.
Exemple 3 : Etude de la fonctionalité des variants du promoteur apoAll.
La fonctionaiité des promoteurs a été étudiée par transfection dans une lignée cellulaire hépatique, les cellules HepG2. Une expérience contrôle a été
effectuée dans une lignée cellulaire non-hépatique, les cellules Hela.
Les transfections dans les cellules HepG2 ont été réalisées à 50-60% de confluence par la méthode de précipitation au phosphate de calcium. Les cellules ont été co-transfectées par un mélange de plasmides comprenant - le plasmide test - un plasmide d'expression du PPARa (PBK-CMV-PPARa) ou le plasmide correspondant vide (PBK-CMV), et, - 0,5 pg d'un plasmide d'expression de la (i-Gal (CMV-(i-Gal) comme controle de l'efficacité de transfection.
Toutes les transfections ont été réalisées avec la même quantité d'ADN total.
4 h après la transfection, les cellules sont lavées dans un tampon PBS, puis incubées 24 heures avec le fibrate (Wy-14643, 1 NM). L'activité CAT est ensuite déterminée selon la méthode de Gorman et al (MoI.CeILBioI. 2 (1982) 1044). Les résultats sont ensuite rapportés à l'efficacité de transfection telle que mesurée par l'expression de la ~-Gal.
Les résultats obtenus pour deux séries d'expérience sont présentés dans les Tableaux 1 et 2 ci-après.

Tableau 1 : Activité des Promoteurs sur cellules hépatiques Promoteur Vecteur ActivateurActivit CAT Correction -Gal hA-II PBK-CMV 2,52 5,52 PBK-CMV W 5,37 11,75 mPPARa 12,44 27,22 mPPARa W 12,04 26,34 hA-!I J3 PBK-CMV 4,17 9,13 PBK-CMV W 7,80 17,06 mPPARa 15,67 34,29 mPPARa W 24,96 54,61 hA-I I N-1 PBK-CMV 1,31 2,86 PBK-CMV W 2,46 5,38 mPPARa 3,58 7,83 mPPARa W 14,77 32,31 hA-II N-I PBK-CMV 1,32 2,89 PBK-CMV W 2,95 6,45 mPPARa 7,81 17,10 mPPARa W 17,51 38,32 hA-II N-J PBK-CMV 0,37 0,80 PBK-CMV W 0,41 0,90 mPPARa 0,44 0,97 mPPARa W 1,11 2,42 hA-I! N-J PBK-CMV 0,46 1,00 PBK-CMV W 0,77 1,69 mPPARa 4,04 8,83 mPPARa W 13,06 28,59 WO 98!21349 PCT/FR97/01992 Tableau 2 : Activité des Promoteurs sur cellules hépatiques Promoteur Vecteur ActivateurActivit CAT Correction -Gal hA-II PBK-CMV 5,03 2,12 PBK-CMV W 6,68 3,41 mPPARa 49,77 16,99 mPPARa W 60,86 32,20 hA-II J3 PBK-CMV 5,80 2,16 PBK-CMV W 8,17 3,50 mPPARa 69,71 17,08 mPPARa W 81,20 21,15 hA-I I N-I PBK-CMV 2,91 1,25 PBK-CMV W 1,35 0,67 mPPARa 20,85 3,88 mPPARa W 32,34 8,86 hA-II N-I PBK-CMV 2,20 1,19 PBK-CMV W 3,01 1,68 mPPARa 57,07 11,65 mPPARa W 75,39 17,53 hA-I I N-J PBK-CMV 2,02 1,50 PBK-CMV W 0,56 0,37 mPPARa 1,65 0,49 mPPARa W 2,91 1,26 hA-II N-J PBK-CMV 1,04 0,64 PBK-CMV W 0,55 0,60 mPPARa , 21,40 3,87 mPPARa W 30,56 9,95 WO 98/21349 PCT/F'R97/01992 -Ces résultats font apparaitre clairement que la duplication du motif J
dans le promoteur n'altère pas ia force du promoteur) et augmente très significativement son inductibilité par les fibrates.
5 Par ailleurs, dans une expérience contrôle réalisée dans les cellules Hela, aucune inductibilité par les fibrates ou par le PPAR n'a été observée.
Ceci démontre que les promoteurs selon l'invention conservent leur spécificité tissulaire.
10 Ces résultats démontrent donc que les promoteurs selon l'invention sont forts, hautement inductibles, et specifiques des cellules hépatiques. En outre, les promoteûrs phA-II N-I(J3); phA-II' N-I(J3); phA-II N-J(J3); phA-II' N-J(J3); phA-II N-I(J3i); phA-II' N-I(J3i); phA-11 N-J(J3i) et phA-II' N-J(J3i) possèdent l'avantage d'être de petite taille, comparés au promoteur apoAll 15 natif. Ceci permet donc avantageusement, dans un vecteur de transfert et/ou d'expression de gènes, d'avoir une capacité de clonage supérieure.
Exemple 4 . Construction d'adénovirus inductibles et hépatospécifiques.
Cet exemple décrit la construction d'adénovirus inductibles et hépatospécifiques, et donnant des niveaux d'expression très élevés. Ces adénovirus sont utiles pour l'expression de gènes in vitro, ex vivo ou in vivo.
Les adénovirus décrits ont été construits à partir du sérotype AdS. II est entendu que tout autre sérotype peut être utilisé, et notamment les sérotypes Ad2) Ad7, Adl2 et CAV2. Les adénovirus ont été construits par recombinaison homologue, dans une lignée de packaging) entre un vecteur navette apportant partie gauche du génome viral et l'ADN d'un adénovirus linéarisé, apportant la partie droite du génome viral.
4.1. Construction des vecteurs navette Le vecteur navette construit porte une cassette d'expression constituée d'un promoteur apoAll et d'un acide nucléique codant pour une molécule sécrétée : l'apolipoprotéine AI (apoAl). Ce vecteur apporte en outre la partie gauche WO 98/21349 PCT/F1t97/01992 du génome viral, c'est-à-dire l'ITR gauche et un région permettant la recombinaison.
Les vecteurs navette servant à la construction de l'adénovirus ont été
construits à partir d'un plasmide pC05 (W096I22378), d'un plasmide pIC20H-Alb-U-AI-SV40 qui contient le premier intron de l'apoAl et l' ADNc de l'apoAl sous controle d'un promoteur de l'albumine de Rat, et d'un plasmide pBLAIICAT5 qui contient un promoteur apoAll tel que décrit dans l'exemple 1 ou un variant selon l'exemple 2.
a) Constuction de pIC20H-Alb-U-Al-SV40 Les deux amorces GCG GC~GCT TCG AGC AGA CAT GAT AA (SEQ ID
n°9) et CGA TCT CAA GGG CAT CGG TCG ACG G (SEQ ID n°10) ont permis l'amplification des séquences de polyadénylation de SV40 dans l'orientation tardive: L'amorce 5' introduit un site Notl en amont de cette sequence et l'amorce 3' introduit un demi site Nrul. Le fragment PCR obtenu est traité par la klenow pour obtenir des bout francs et cloné dans le vecteur pIC20H clivé par Smal et Nrul, dans l'orientation qui régénère un site Nrul.
Le plasmide resultant est appelé pIC20H-SV40.
La construction pXL2336 contenant un minigene de l'apolipoprotein AI a été
decrite précedemment (W094/25073). Un fragment PCR est amplifié à partir de pXL2336 grace aux amorces GGG ATC CGC TGG CTG CTT AGA GAC
TGC (SEQ ID n°11 ) et GGC GGC CGC CGG GAA GGG GGG CGG CGG
(SEQ ID n°12) qui introduisent respectivement un site BamHl en amont du premier exon de l'ApoAl et un site Notl en aval de la séquence codante de l'ApoAl.
Le fragment PCR est cloné dans pCRll (Invitrogen) et sa séquence vérifiée.
Le fragment BamHl/Notl contenant l'ADNc et le premier intron de l'apoA-I est ensuite cloné aux mëmes sites du plasmide pIC20H-SV40 pour générer le plasmide pIC20H-AI-SV40.
Les oligonucléotides CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAG
AAT AAA CGC TCA ACT GTG GC (SEQ ID n°13) et CGT GGC CAC AGT
TGA GCG TTT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG ,aAC AAG CA (SEQ ID

n°14) sont ensuite hybridés entre eux et clonés au site Dsal de pIC20H-AI-SV40 de façon à ce que le site Pmll créé lors de ce clonage soit du coté de l'intron et que le site Dsal soit régénéré à l'autre extrémité. Ces oligonucléotides permettent d'introduire un fragment de la partie 5' non traduite de l'ARN messager de la f3 Globine. Le plasmide obtenu est appellé
pIC20H-U-AI-SV40.
Enfin, le fragment Hindlll/Bglll du promoteur de l'albumine de Rat décrit par F. Troche et al (MoI.CeLBiol, 1989, 4759-4766) traité par ia Klenow a été
cloné dans l'orientation adéquate dans le plasmide pIC20H-U-AI-SV40 cuvé
par BamHl et traité également par la klenow pour générer le plasmide pIC20H-Alb-U-AI-SV40.
b) Construction des vecteurs navette i 5 Les oligonucléotides CGT GGC AGG CAG CAG GAC GCA CCT CCT TCT
CGC AGT CTC TAA GCA GCC TTC GAA GCA TG (SEQ ID n°15) et CTT
CGA AGG CTG CTT AGA GAC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT
GCC TGC CA (SEO ID n°16) sont hybridés entre eux ce qui crée une extrémité cohesive Sphl et une extrémité cohésive Hpall. Ce fragment est introduit dans une ligation trois partenaires avec un fragment Hpall/Dralll (476/1518) du plasmide pIC20HAlb-U-AI-SV40 contenant le cDNA de l'ApoAl et un fragment Dralll/Sphl (1518/239) du mëme plasmide. Le plasmide résultant est appellé pXL2699. Cette construction crée un site BstBl compatible avec Clal en amont du fragment ADNc + intron de l'apoAl. Le fragment BstBl / Sall de pXL2699, contenant l'ADNc de l'ApoAl) est cloné
dans le plasmide pC05 clivé par Clal et Sall. Le plasmide résultant est appelé pC05-U-AI-SV40.
Le promoteur apoAll sélectionné (promoteur complet ou variants) est excisé
du plasmide pBLAIICAT5 correspondant sous forme d'un fragment Hindlll-BamHI) cloné après traitement à la Klenov au site EcoRV du plasmide pC05-U-AI-SV40 pour générer les vecteurs navette pXLPromAll/AI. Les vecteurs suivants sont ainsi obtenus 3~

Vecteur Navette Version du Promoteur XLAI I/AI -911 /+29 XLhAII/Al -911 /+160 XLAII J3 /AI -911/+29, 3motifs J en 5' XLAIIN-I/AI -911 /-653;-210/+29 XLAI IN-I J3 /AI -911 /-653;-210/+29; 3motifs J en 5' XLAIIN-J/AI -911 /-708;-210/+29 XLAIIN-J J3 /AI -911 /-708;-210/+29; 3motifs J en 5' Ces vecteurs sont validés pour l'expression de l'apoAl humaine par transfection transitoire dans les lignées 293 ou Cosl. II est entendu que l'acide nucléique codant pour l'apoiipoprotéine AI humaine peut ëtre aisément remplacée dans les vecteurs navette par tout autre acide nucléique codant pour une molécule d'intérêt.
4.2. Construction des adénovirus Les adénovirus ont été produits par recombinaison homologue, après co-transfection, dans les cellules appropriées, de deux fragments d'ADN, l'un apportant ia partie gauche du génome du virus recombinant (vecteur navette décrit dans l'exemple 4.1., possédant une délétion dans la région E1 ), l'autre apportant la partie droite du génome du virus recombinant (possédant éventuellement une délétion dans la région E4 et/ou E3).
a) Construction d'adénovirus défectifs pour la région E1 L'adénovirus Ad-All/Af a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'ADN du virus Ad-RSV-~iGal et le vecteur navette pXL All/AI, selon le protocole suivant : le vecteur navette pXL All/AI linéarisé par BstXl et l'ADN
du virus Ad-RSV-~3Gal linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants générés ont ensuite été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN
de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce WO 98/21349 PCT/F'It97/01992 qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456), ou par chromatographie (FR96 08164).
L'adénovirus Ad-All/AI peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol. La structure du génome recombinant est présentée sur la figure 5.
La même stratégie est suivie pour construire les adénovirus portant les différentes formes de promoteurs All, en partant des vecteurs navettes décrits dans l'exemple 4.1.
b) Construction d'adénovirus défectifs pour les régions E1 et E4 Les cellules IGRP2 (Yeh et al., J. Virol 70 (1996) 559), capables de transcomplémenter les fonctions E1 et E4 de l'adénovirus, sont IS cotransfectées par 5 mg du vecteur navette digéré par BstXi , et 10 mg de l'ADN du virus apportant la délétion fonctionnelle de la région E4 (par exemple Ad2d1808) Ad5d11004, Ad5d11007 ou Ad5d11014) digéré par l'enzyme CIa1. Après apparition de l'effet cytopathique, les virus sont purifiés par au moins deux cycles consécutifs d'étalement en solide pour la formation ?0 de plages sur IGRP2. Les plages correspondant à l'infection du virus recherché (analyse de l'ADN démontrant la double délétion E 1 et E4) sont alors amplifiées par des cycles d'infection consécutives. Des stocks à titre élevés sont préparés par purification sur gradient de chlorure de césium. Les virus sont conservés à -80°C selon les techniques classiques de l'homme de 25 l'art.
Exemple 5 : Activité in vivo des adénovirus recombinants Cet exempte décrit les propriétés fonctionnelles des adénovirus de 30 l'invention, après administration in vivo.
5 x 109 pfu des virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40 et Ad(RSV-ApoAl-bGH) ont été injectés respectivement à 8 et 3 souris C57b16. Quatre des souris injectées avec le Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) on été nourries avec du fenofibrate à la dose de 0,5% (p/p) mélangée à leur alimentation. Les concentrations plasmatiques en apoA-I humaine et HDL-cholesterol ont été
mesurées chaque semaine. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 6.
5 Les niveaux d'apoA-I plasmatique sont inférieurs au seuil de détection (10 mg/dl) pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40), 81 ~0.17 mg/dl pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) traitées au fénofibrate et 84~15 mgldl pour les souris injectées aves ie virus Ad{RSV-ApoAl-bGH) ce qui montre une induction d'au moins 8 fois du 10 promoteur de l'apoA-II dans ces conditions.
Le niveau de HDL-cholesterol n'est pas modifié pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) (52-2 mg/dl) : niveau identique à des animaux non traités. En revanche, le niveau de HDL-cholestérol est augmenté au jour 7 jusqu'à 88~14 mg/dl et 121~22 mg/dl pour 15 respectivement pour les souris injectées aves le virus Ad(RSV-ApoAl-bGH) et les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAl-SV40) traitées au fénofibrate (figure 6).
Ces résultats démontrent in vivo le caractère fort, inductible et 20 hépatospécifique des promoteurs de l'invention dans un contexte adénoviral.
Combinées aux propriétés remarquables de transfert de gènes des adénovirus, les vecteurs de l'invention présentent des performances très avantageuses pour le transfert et l'expression de gènes.

2269864.seq (1) INFORMATIONS GENERAL:ES:
(i) DEPOSANT:
LISTE DE SEQUENCES
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER
( B ) RUE : 2 0 , A ;Tenue Raymond Aron ( C) VILLE : ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92160 (ii) TITRE DE L'INVEIJTION: Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblée et inductible de gènes (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16 (iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE:
(A) DESTINATAIRE: Robic (B) RUE: 55 St-Jacques (C) VILE: Montréal (D) PROVINCE : QC
(E) PAYS: CANADA
(F) CODE POSTAL: H2Y 3X2 (G) TELFsPHONE: 514-987-6242 (H) TELECOPI:E: 514-845-7874 (v) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette 3.5" / 1.44 MO
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTE;ME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGIC'.IEL: Texte ASCII
(vi) DONNÉES RELATIVES Ä LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: 2,269,864 (B) DATE DE DÉPÖT: 06-NOV-97 (vii) DONNÉES RELATIVES Ä LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/01992 (B) DATE DE DÉPÖT: 06-NOV-97 (A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 96/13691 (B) DATE DE DEPOT: 08-NOV-1996 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUE~; DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 940 paires de bases (B) TYPE: nuclé.otide (C) NOMBRE DE E.RINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire 2269864.seq (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
( ix) CARACTERISTIQUE:3 (C) AUTRES INFORMATIONS:
Note: /SÉ~quence du promoteur apoAII humain (-911 à +29) (xi) DESCRIPTION DE hA SEQUENCE: SEQ ID NO: l:
AGCTTCTGAT ATCTATTTAA CTCiATTTCAC CCAAATGCTT TGAACCTGGG AATGTACCTC 60 TCCCCCTCCC CCACCCCCAA CAC~GAGTGAG ACAAGGGCCA GGGCTATTGC CCCTGCTGAC 120 TCAATATTGG CTAATCACTG CC~.,AGAACTG ATAAGGTGAT CAAATGACCA GGTGCCTTCA 180 ACCTTTACCC TGGTAGAAGC CTC:TTATTCA CCTCTTTTCC TGCCAGAGCC CTCCATTGGG 240 AGGGGACGGG CGGAAGCTGT TT7.'CTGAATT TGTTTTACTG GGGGTAGGGT ATGTTCAGTG 300 ATCAGCATCC AGGTCATTCT GGC~CTCTCCT GTTTTCTCCC CGTCTCATTA CACATTAACT 360 CAA.A.AACGGA CAAGATCATT TAC'.ACTTGCC CTCTTACCCG ACCCTCATTC CCCTAACCCC 420 CATAGCCCTC AACCCTGTCC CTC~ATTTCAA TTCCTTTCTC CTTTCTTCTG CTCCCCAATA 480 GAATAAAGAC ACCATGAGCT TTC".CATGGTA TGATGGGTTG ATGGTATTCC ATGGGTTGAT 600 GGACCTCAGA TCTCAAAAGA ATCiAACCTCA AATATACCTG AAGTGTACCC CCTTAGCCTC 720 CACTAAGAGC TGTACCCCCT GCC'TCTCACC CCATCACCAT GAGTCTTCCA TGTGCTTGTC 780 CTCTCCTCCC CCATTTCTCC AAC'.TTGTTTA TCCTCACATA ATCCCTGCCC CACTGGGCCC 840 ATCCATAGTC CCTGTCACCT GAC'AGGGGGT GGGTAAACAG ACAGGTATAT AGCCCCTTCC 900 TCTCCAGCCA GGGCAGGCAC AGP,CACCAAG GACAGAGACG 940 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nuclE=otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURAT:LON: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CI)S
( B ) EMPLACEMEN~~' : 1 . . 19 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Ser Thr Phe Thr Leu Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ..0 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE~: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..30 (xi) DESCRIPTION DE L~A SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Ile Glu Ala Ser Asp Ile Tyr Leu Thr Asp (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nuclc~otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..30 (xi) DESCRIPTION DE I~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGT CTC TGT CCT TGG TGT C:TG GAT CCA TCG 30 Arg Leu Cys Pro Trp Cys Leu Asp Pro Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
( i ) CARACTERISTIQUE~'> DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE; : ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
( B ) EMPLACEMENT' : 1 . . 21 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:5:

Asp Ser Arg Cys Thr Pro Leu (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nuclÉ~otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURAT:LON: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
( B ) EMPLACEMENT' : 1 . . 2 4 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GGA AGC TGC AGA GGC TTC 7.'AC CAcJ 24 Gly Ser Cys Arg Gly Phe Tyr Gln (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: nuclÉ:otide (C) NOMBRE DE EiRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE;: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NC>N
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..26 (xi) DESCRIPTION DE L~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GAT CCT TCA ACC TTT ACC C'TG GTA GA 26 Asp Pro Ser Thr Phe Thr Leu Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nuclé otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURAT:CON: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE : AI)Nc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..26 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GAT CTC TAC CAG GGT AAA C~GT TGAAG 26 Asp Leu Tyr Gln Gly Lys CTly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
( i ) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE F3RINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE; : ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..26 (xi) DESCRIPTION DE I~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
GCG GCC GCT TCG AGC AGA C'.AT GAT AA 26 Ala Ala Ala Ser Ser Arg His Asp (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUEB; DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURAT:CON: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..25 (xi) DESCRIPTION DE I~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CGA TCT CAA GGG CAT CGG 7.'CG ACG G 25 Arg Ser Gln Gly His Arg ~~er Thr (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
( i ) CARACTERISTIQUE~3 DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE;: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..27 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
GGG ATC CGC TGG CTG CTT P,GA GAC TGC 27 Gly Ile Arg Trp Leu Leu F,rg Asp Cys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nuclé otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURAT:CON: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE::
(A) NOM/CLE : CDS
( B ) EMPLACEMEN7:' : 1 . . 2'7 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
GGC GGC CGC CGG GAA GGG C~GG C.."GG CGG 2 7 Gly Gly Arg Arg Glu Gly Gly Arg Arg (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
( i ) CARACTERISTIQUE~3 DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: ~~0 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE; : ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CL>S
(B) EMPLACEMENT:1..50 (xi) DESCRIPTION DE L~A SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

His Val Leu Val Leu Phe F,la Glu Ala Gln Asn Lys Arg Ser Thr Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUE~; DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ç0 paires de bases 2269864.seq (B) TYPE: nuclé otide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:;
(A) NOM/CLE : CDS
( B ) EMPLACEMEN7.' : 1 . . 5 0 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CGT GGC CAC AGT TGA GCG 7.'TT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG AAC AAG CA 50 Arg Gly His Ser Xaa Ala Phe Ile Leu Ser Phe Cys Lys Lys Asn Lys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ~>9 paires de bases (B) TYPE: nuclÉ°otide (C) NOMBRE DE E4RINS : simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE;: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:1..59 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

Arg Gly Arg Gln Gln Asp p.la Pro Pro Ser Arg Ser Leu Xaa Ala Ala Phe Glu Ala (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:

2269864.seq ( i ) CARACTERISTIQUE~3 DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 53 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE E3RINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULF~ : ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..53 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
CTT CGA AGG CTG CTT AGA C~AC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT GCC 48 Leu Arg Arg Leu Leu Arg Asp Cys Glu Lys Glu Val Arg Pro Ala Ala Cys

Claims (44)

REVENDICATIONS

1. vecteur recombinant pour l'expression inductible et hépatospécifique d'une molécule caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression constituée d'un acide nucléique codant pour ladite molécule placé sous contrôle du promoteur du gène de l'apolipoprotéine All humain.

2. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur comprend les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -680; -573 à -255 et -126 à -33 du promoteur du gène de l'apolipoprotéine All humain

3. Vecteur recombinant selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'extrémité 3' du promoteur est comprise entre les résidus +5 et +35, plus préférentiellement +10 et +30 du gène apoAll.

4. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'extrémité 5 du promoteur est comprise entre les résidus -950 à -905 de préférence -925 à -910 du gène apoall.

5. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur comprend la séquence SEQ ID N° 1 (résidus -~~~ à +29)

6. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1, 3 ou 4 caractérisé en ce que le promoteur comprend les éléments de régulation localisé au niveau des nucléotides -903 à
-680, ou -903 à -720 et -1~~ à -33 du promoteur du gène de l'apolipoprotéine all humain, mais pas les éléments intermédiaires localisés au niveau des nucléotides -573 à -

7. Vecteur recombinant selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur comprend une délétion dans la région comprises entre les résidus -670 et -210 de préférence une délétion des résidus -6~~~210

8. Vecteur recombinant selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur comprend une délétion dans la région comprise entre les résidus -710 et -150.

9. Vecteur recombinant selon la revendication 8 caractérisé en ce que le promoteur comprend une délétion des résidus -708-210

10. Vecteur recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé
en ce que le promoteur comprend un répétition de motifs J. ledit motif J étant défini dans les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2.

11. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que le promoteur comprend de 2 à 5 motifs J

12. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la répétition de motifs J est positionée en 5' du promoteur

13. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la répétition de motifs J est positionnée en 3' du promoteur

14. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la répétition de motifs J est insérée dans la séquence du promoteur.

15.Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que le promoteur comprend une région régulatrice composée de plusieurs motifs J et une région promotrice hépatospécifique.

16. Vecteur recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce que la région promotrice hépatospécifique est composée d'un promoteur hépatospécifique choisi parmi le promoteur de la sérum albumine, le promoteur de l'apolipoprotéine AI. le promoteur de l'apolipoprotéine C5, le promoteur de l'apolipoprotéine B100, le promoteur de la chaîne gamma du tibrinogène, le promoteur du gène de la phénytalamine hydroxylase humaine, le promoteur du gène de l'AMBP, le promoteur du gène du facteur X et le promoteur de l'a-antitrypsine,

17. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendication 1 à 16 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant.

18. Adénovirus recombinant selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion dans la région B1 de son génome

19. Adénovirus recombinant selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion des régions Ela et Elb

20. Adénovirus recombinant selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion dans la région E4 de son génome

21. Adénovirus recombinant selon la revendication 20 caractérisé en ce que la délétion dans la région E4 affecte l'ensemble des phases ouvertes.

22. Adénovirus recombinant selon les revendication 18 a caractérise en ce que la cassette d'expression est insérée au niveau de la region E1. en remplacement des séquences delétées

23. Adénovirus recombinant selon les revendications 18 a 19 caractérise en ce que la cassette d'expression est insérée au niveau de la region E4. en remplacement des séquences delétées

24. Adénovirus recombinant selon les revendication 18 a 21 caractérise en ce que la cassette d'expression est insérée au niveau de la région E3.

25. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que molecule est une protéine thérapeutique.

26. Vecteur recombinant selon la revendication 25 caractérisé en ce que la molécule thérapeutique est une protéine secrétée dans la circulation.

27. Vecteur recombinant selon la revendication 25 caractérisé en ce la protéine thérapeutique est choisie parmi les hormones, les lyphokines, les facteurs de criossance, les neurotransmetteurs ou leurs precurseur ou enzymes de synchése, les facteurs trophiques, les apoliprotéines, les suppresseurs de tumeurs et les facteurs impliques dans la coagulation

28. vecteur adenoviral comprenant une cassette d;expression constitue d'une acide nucléique codant pour une molecule d'intéret placé sous controle du promoteur du gene de l'apolipoproteme All humain

29. Variant du promoteur du gene de l'aponpoprotein All humam comprenant une repétition de motifs J, ledit motif J, étant défin dans les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2

30. Variant selon la revendication 29 caractérise en ce qu'il comprend de 2 à
5 motifs J

31. Variant selon la revendication 29 ou 30 caractérisé en ce que les motifs J
additionnels sont positionnes en 5' du promoteur

32. Variant selon l'une des revendications 29 à 31 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion dans la region comprise entre les residus -710 et-150 du promoteur natif

33. Variant du promoteur du géne de l'apo~~poprotéine All humain caractérisé
en ce qu'il comprend une région régulatrice composée de plusieurs motifs 1 du promoteur de l'apolipoproteine All ledit motif J ~ant defini dans les séquences SEQ ID
N° 1 ou SEQ ID N°
2. et une region promotrice hépatospécifique issue d'un autre promoteur

34. Vanant selon la revendication ~3 caractérisé en ce la région promotrice hepatospecifique est composée d'une promoteur hépatospécifique autre que le promoteur du gene de l'apolipoproteine All humain.

35 Variant selon la revendication 33 caractérisé en ce la région promotrice hépathospécifique est composé d'un promoteur ~~~~~ couplé a un élément enhanceur conférant une expression hépathospécifique.

36 Cellule modifiée par un secteur selon l'une des revendications 1 à 28

37 Composition pharmaceutique comprenant un adénovirus selon la revendication 17 d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable

38 Procédé de production d'une protéine recombinante désirée comprenant -l'infection ou la transfection d'une population cellulaire avec un vecteur recombinant selon la revendication 1 ou un génome viral comprenant une cassette d'expression codant pour ladite protéine désirée.
-la culture de la dite population cellulaire recombinante, et, -la récupération de ladite protéine produite

39. Utilisation d'un adénovirus selon la revendication 17 pour préparer un model animal non-humain transgenique

40 Composition comprenant un vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 28 et un activateur de PPAR (Perosisome Proliferator Activated Receptor). en vue d'une utilisation simultanée ou étalée dans le temps

41 Composition selon la revendication 40 caractérisée en ce que le vecteur est un adénovirus recombinant selon la revendication 17

42 Composition selon la revendication 40 ou 41 caractérisée en ce que l'actuateur de PPAR
est un actuateur de PPARa

43 Composition selon la revendication 42 caractérisée en ce que l'activateur de PPARa est choisi parmi les fibrates et les composés augmentant l'expression de facteur de transcription se fixant sur les sites J.

44. Composition selon la revendication 43 caractérisée en ce que le fibrate est choisi parmi l'acide fibrique, le gemfibrozi, le bezafibrate, le ciprofibrate, le elefibrate, le fenofibrate et le chinofibrate