WO1998021349A1 - Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible de genes - Google Patents

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WO1998021349A1
WO1998021349A1 PCT/FR1997/001992 FR9701992W WO9821349A1 WO 1998021349 A1 WO1998021349 A1 WO 1998021349A1 FR 9701992 W FR9701992 W FR 9701992W WO 9821349 A1 WO9821349 A1 WO 9821349A1
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region
recombinant vector
gene
recombinant
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PCT/FR1997/001992
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Abderrahim Mahfoudi
Patrick Benoit
Didier Branellec
Patrice Denefle
Nicolas Duverger
Laurence Berthou
Johan Auwerx
Bart Staels
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Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to the field of biology, and in particular to the field of regulation of gene expression. It describes in particular new constructions and new vectors allowing a targeted and inducible expression of genes.
  • the present invention can be used in many fields, and in particular for the production of recombinant proteins, for the creation of transgenic animal models, for the creation of cell lines, for the development of screening tests, or even in gene therapy. and cellular.
  • the ability to control and direct gene expression is a very important issue in the development of biotechnology. In vitro, it improves the conditions for the production of recombinant proteins, for example by decoupling the cell growth phase and the production phase. Still in vitro, it also makes it possible to create cell lines capable of producing certain molecules at selected times. Thus, it is conceivable to construct cell lines producing, in a regulated manner, proteins transcomplementing defective viral genomes. Still in vitro, a regulated expression system allows the development of screening tests for molecules acting on the control of gene expression. The control of gene expression is also very important for ex vivo or in vivo therapeutic approaches, in which the possibility of selectively controlling the production of a therapeutic molecule is essential. In fact, depending on the applications, depending on the gene to be transferred, it is important to be able to target certain tissues or only certain parts of an organism in order to concentrate the therapeutic effect and limit dissemination and side effects.
  • This targeting can be carried out using vectors having a specific cell specificity.
  • Another approach is to use expression signals specific for certain cell types.
  • specific promoters have been described in the literature, such as the promoter of the genes coding for pyruvate kinase, villin, GFAP, the promoter of the intestinal fatty acid binding protein, the promoter ⁇ -actin from smooth muscle cells, or the promoter of the human albumin gene for example.
  • these promoters have a certain tissue specificity, they are not regulable and therefore offer limited possibilities of control.
  • application WO96 / 01313 describes a gene expression system regulated by tetracyc ne.
  • the invention now describes new constructs allowing targeted and regulated expression of genes
  • the invention describes in particular recombinant vectors allowing expression of inducible and hepatospecific genes
  • the invention also describes new promoter constructs having improved regulatory levels La
  • the present invention thus provides a particularly efficient means for targeting the expression of genes in hepatic cells, in vivo or in vitro, and for regulating this expression.
  • apoAII apolipoprotein Ail Apolipoprotein Ail
  • HDL high density lipoproteins
  • ApoAII is mainly synthesized in the liver, although contradictory results suggest a synthesis also in the intestine
  • the human apoAII gene has been cloned and sequenced (Tsao et al, J Biol Chem 260 (1985) 15222)
  • the promoter region extends sure approximately 1 kb upstream of the transcription initiation codon.
  • nucleotide -903 to -680 level includes regulatory elements located at the nucleotide -903 to -680 level, as well as additional multiple sites located at the intermediate (nucleotide -573 to -255) and proximal (-126 to -33) region.
  • Optimal expression is obtained when nuclear factors are linked to the proximal and distal regulatory elements of the promoter.
  • sequence of the promoter of the human apoAII gene from residue - 911 to +29 is shown in the sequence SEQ ID No. 1.
  • Fibrates often used as hypolipidemic agents, belong to the chemical family of peroxisome proliferators, insofar as they induce hepatomegaly linked to the proliferation of peroxisomes in rodents Their action is mediated by activated receptors (PPAR "Peroxisome Proliferator Activated Receptor"), a group of 4 nuclear receptors distinct ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ).
  • PPAR Peroxisome Proliferator Activated Receptor
  • PPARs belong to the nuclear hormone receptor superfamily which binds to specific response elements called PPRE ("Peroxisome Proliferator Response Element")
  • PPREs have been identified in many genes coding for enzymes involved in the ⁇ -oxidation pathway , which have been shown to be inducible by fibrates
  • the applicant has now developed a system of expression of hepatospecific genes inducible by fibrates, usable in vitro and in vivo. More particularly, the applicant has constructed for the first time a vector having a tropism for the liver allowing expression of genes selectively in the liver or liver cells, and inducibly by fibrates. The Applicant has also constructed new promoters derived from the promoter of the human apoAII gene, having improved inducibility and strength properties
  • a first object of the invention resides in a recombinant vector for the inducible and hepatospecific expression of a characterized molecule in that it comprises, an expression cassette consisting of a nucleic acid encoding said molecule placed under the control of the promoter of the gene for human apolipoprotein Ail.
  • the recombinant vector is a viral vector derived from adenoviruses, comprising, inserted into its genome, said expression cassette.
  • the hepatospecific nature of the viruses of the invention means that these viruses allow the expression of a gene very selectively in hepatic cells, in vitro, ex vivo or in vivo. Low non-specific expression in other tissues or cell types can be tolerated, as long as a majority expression is observed in liver cells (preferably more than 80% of cells expressing the transgene are liver cells. more preferably, more than 90%)
  • the virus according to the invention does not induce any detectable expression in the intestine and therefore offers a particularly high selectivity. This is very important for toxic gene transfer and expression approaches, for which a very high level of selectivity is necessary.
  • the inducible systems described in the prior art have a medium inducibility, a factor of about five.
  • the results presented in the examples demonstrate that the adenovirus of the invention is inducible by a factor of about ten.
  • the level of inducibility is also very important for obtaining control over the quantity of molecules delivered in vivo. This is particularly sensitive in the case of immunogenic molecules or molecules capable of generating inflammatory responses. This is also particularly interesting for the expression of molecules whose biological efficiency involves high concentrations.
  • Another characteristic The particularly remarkable vector of the invention resides in the high levels of expression obtained.
  • inducible systems generally have, on the other hand, medium or even low levels of expression.
  • the system of the invention makes it possible to obtain expression levels in vivo comparable to those described for the strongest constitutive promoters.
  • the system of the invention therefore combines for the first time remarkable properties of selectivity, inducibility, and strength.
  • One of the aspects of the invention therefore resides in the use of the promoter of the human apoAII gene.
  • Another aspect of the invention lies in the construction of vectors derived from adenoviruses.
  • the vectors according to the invention combine remarkable properties of gene transfer, safety, tissue specificity, inducibility and strength.
  • the promoter used in the viruses of the invention comprises the regulatory elements of the promoter of the apoAII gene.
  • the promoter comprises the residues -91 1 to +29 of the apoAII gene (sequence SEQ ID ⁇ ° 1).
  • the promoter can be used.
  • the promoter understands the site of initiation of the transcription of the apoAII gene (numbered +1 on SEQ ID No. 1).
  • this promoter does not contain the first intron of the apoAII gene, which begins at nucleotide +38.
  • the fragment used has a 3 ′ end comprised between the residues +5 and +35, more preferably +10 and +30 of the apoAII gene.
  • the 5 'end it is preferable, in order to obtain high levels of expression in the liver, to retain at least part of the hepatic factor binding site.
  • This site is located at nucleotides -903 to -680. Therefore, advantageously, the fragment used has a 5 ′ end located upstream of the nucleotide -903. This end can be located for example in the region -950 to -910. Furthermore, for reasons of capacity cloning, it is advantageous to use a promoter region of reduced size. Therefore, it is preferred to use a fragment whose 5 'end is located in the region -925 to -910.
  • the promoter comprises the regulatory elements located at the nucleotides -903 to -680 (or - 903 to -720) and -126 to -33, but not the intermediate elements located at the nucleotides -573 to -255.
  • the promoter used advantageously comprises a deletion in the region between the residues -710 and -150.
  • the promoter can advantageously consist of a variant of the sequence SEQ ID No. 1 obtained by deletion of residues 708-210.
  • the promoter used comprises a deletion in the region between the residues -670 and -210.
  • the promoter can advantageously consist of a variant of the sequence SEQ ID No. 1 obtained by deletion of the residues; 653-210.
  • the adenoviruses according to the invention comprise as promoter a variant of the promoter of the apolipoprotein Ail gene comprising a repetition of J motifs. Multiplication of the J region advantageously also makes it possible to increase the character inducible by promoter fibrates.
  • Region J consists of the sequence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID No. 2, underlined on SEQ ID No. 1) It is localized in the Ail promoter at the level of nucleotides -734 to -716 of the promoter.
  • the Applicant has now constructed recombinant viruses comprising promoters modified at the level of the J region. These viruses have particularly advantageous properties for the transfer and expression of genes, in vitro and in vivo.
  • the promoter comprises from 2 to 5 J units. Even more preferably, it comprises 3 J units.
  • the repetition of J units can be positioned 5 ′ of the promoter, 3 ′ of the promoter, or inserted into the promoter sequence, preferably at the level of the native J sequence.
  • the multiplication of patterns J can advantageously be combined with a deletion as described above. This makes it possible to obtain a promoter having properties which are further improved in terms of power and of gene expression control.
  • the remarkable capacities of the vectors of the invention derive from the promoter used, as from the choice of the vector.
  • the demonstration of the functionality of the promoters in an adenoviral context in vivo has indeed made it possible to produce these very vectors. efficient.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses around 36 (kilobases) kb in size. There are different serotypes, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. More particularly, the recombinant adenoviruses can be of human or animal origin. As regards adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classified in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 (Ad12).
  • adenoviruses of animal origin mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of the adenovirus CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 / 26914 incorporated herein by reference.
  • the adenovirus genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes.
  • ITR inverted sequence
  • Psi encapsidation sequence
  • the main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the E1 region in particular are necessary for viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad12, etc.) have also been sequenced.
  • adenovirus For their use as recombinant vectors, various constructs derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different therapeutic genes. In each of these constructions, the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell. Thus, the constructions described in the prior art are deleted adenoviruses from the E1 region, essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus.
  • thermosensitive point mutation was introduced into the mutant ts125, making it possible to inactivate the DNA binding protein of 72kDa (DBP) (Van der Vliet et al., 1975).
  • DBP 72kDa
  • Other vectors include a deletion of another region essential for viral replication and / or spread, the E4 region.
  • the E4 region is in fact involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of late nuclear RNA, in the extinction of the expression of proteins of the host cell and in the efficiency of replication of l 'Viral DNA.
  • Adenoviral vectors in which the E1 and E4 regions are deleted therefore have very reduced transcription background and expression of viral genes.
  • the recombinant adenovirus is a human adenovirus of group C. More preferably, it is an adenovirus Ad2 or Ad5.
  • the recombinant adenovirus used in the context of the invention comprises a deletion in the E1 region of its genome. Even more particularly, it comprises a deletion of the regions E1 a and E1 b. As a specific example, mention may be made of deletions affecting the nucleotides
  • the recombinant adenovirus used in the context of the invention further comprises a deletion in the E4 region of its genome. More particularly, the deletion in the E4 region affects all of the open phases. As a specific example, the deletions 33466-35535 or 33093-35535 can be cited. Other types of deletions in the E4 region are described in applications WO95 / 02697 and WO96 / 22378, incorporated herein by reference.
  • the expression cassette can be inserted at different sites of the recombinant genome. It can be inserted at the E1, E3 or E4 region, replacing the deleted or surplus sequences. It can also be inserted at any other site, apart from the sequences necessary in cis for the production of viruses (ITR sequences and packaging sequence).
  • Recombinant adenoviruses are produced in an packaging line, that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome.
  • a packaging line that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome.
  • One of these lines is for example the line 293 in which a part of the adenovirus genome has been integrated. More specifically, line 293 is a cell line human embryonic kidney containing the left end (approximately 11 -12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the encapsidation region, the E1 region, including E1 a and E1 b , the region coding for the protein pIX and part of the region coding for the protein plVa2.
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and of producing viral stocks having high titers.
  • This line is also capable of producing, at permissive temperature (32 ° C.), stocks of virus further comprising the thermosensitive E2 mutation.
  • Other cell lines capable of complementing the E1 region have been described, based in particular on human lung carcinoma cells A549 (WO94 / 28152) or on human retinoblasts (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Furthermore, lines capable of transcomplementing several functions of the adenovirus have also been described.
  • Recombinant adenoviruses are usually produced by the introduction of viral DNA into the packaging line, followed by lysis of the cells after approximately 2 or 3 days (the kinetics of the adenoviral cycle being 24 to 36 hours).
  • the viral DNA introduced may be the complete recombinant viral genome, optionally constructed in a bacterium (WO96 / 25506) or in a yeast (WO95 / 03400), transfected in the cells. It can also be a recombinant virus used to infect the packaging line.
  • the viral DNA can also be introduced in the form of fragments each carrying a part of the recombinant viral genome and a zone of homology making it possible, after introduction into the packaging cell, to reconstitute the recombinant viral genome by homologous recombination between the different fragments .
  • the recombinant viral particles are isolated by centrifugation in a cesium chloride gradient.
  • the recombinant vector having a tropism for the liver can also be constructed from a non-viral vector of the plasmid type, in particular as described in applications WO96 / 26270 and PCT / FR96 / 01414.
  • the vectors of the invention allow the regulated, high-level and hepatospecific production of molecules of interest.
  • the molecule of interest is advantageously a therapeutic molecule. It can be a protein or a nucleic acid (tRNA,
  • the therapeutic molecule is a protein secreted into the circulation.
  • a protein secreted into the circulation By way of example, mention may be made of enzymes, blood derivatives, hormones, interleukin lymphokines, interferons, TNF, etc. (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their synthetic precursors or enzymes, trophic factors : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteins: ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc.
  • the expression cassette advantageously comprises an appropriate signal sequence. It may in particular be the natural signal sequence of the secreted protein, if it is functional in a hepatic cell. It can also be any suitable heterologous sequence. By way of example, mention may be made of the signal sequence of apolipoprotein A1.
  • the cassette generally comprises a region situated at 3 ′ which specifies a signal for termination of transcription and for polyadenylation. We use for example the polyA site of SV40 virus. It is understood that the choice of these signals falls within the general competence of a person skilled in the art.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a vector as described above.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation may in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • Other excipients can be used such as for example a hydrogel. This hydrogel can be prepared from any biocompatible and non-cytotoxic polymer (homo or hetero). Such polymers have for example been described in application WO93 / 08845.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 1 4 pfu, and preferably 10 ⁇ to 10 1 0 pfu.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of an adenovirus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells.
  • the vectors in particular adenovirus
  • the vectors can also be used for the creation of animal models of hepatic pathologies.
  • the invention also relates to any cell modified by a vector (in particular an adenovirus) as described above.
  • a vector in particular an adenovirus
  • These cells can be used for the production of recombinant proteins in vitro. They can also be intended for implantation in an organism, according to the methodology described in application WO95 / 14785. These cells are preferably liver cells.
  • the subject of the present invention is also a process for the production of recombinant proteins comprising the infection or the transfection of a cell population with a vector, a recombinant adenovirus or the corresponding viral genome comprising an expression cassette coding for a desired protein, culturing said recombinant cell population, and recovering said protein produced.
  • cells of hepatic origin are used. These can be established lines or primary cultures.
  • the invention also relates to novel variants of the human apolipoprotein Ail gene promoter having improved expression characteristics.
  • These variants according to the invention comprise in particular a repetition of J motifs as described above.
  • these variants advantageously comprise a deletion in the region between the residues -710 and -150 of the native promoter.
  • the invention also relates to hepatospecific and inducible promoters derived from the promoter of the human apolipoprotein Ail gene comprising a regulatory region composed of one or more J motifs of the apolipoprotein Ail promoter and a hepatospecific promoter region derived from another promoter.
  • the hepatospecific promoter region is derived from a hepatospecific promoter other than the promoter of the human gene for apolipoprotein Ail.
  • it is composed of a promoter chosen chosen from the promoter of serum albumin, the promoter of apolipoprotein A1, the promoter of apolipoprotein Cs.
  • the promoter region used preferably consists of the region necessary and sufficient for hepatic expression (minimum promoter).
  • This region generally includes the TATA box, and can be prepared according to conventional molecular biology techniques, as indicated in the cited references.
  • the first 209 base pairs of the promoter of the factor X gene are sufficient to confer hepatic expression (JBC cited above).
  • fragments -20 to -23; -54 to -57 and -66 to -77 of the fibrinogen gamma chain promoter constitute a minimal promoter allowing hepatospecific expression.
  • regions J preferably 1 to 5
  • these promoters can carry additional regulatory sequences of the "enhancer" type, making it possible to improve the levels of expression.
  • the hepatospecific promoter region can also be composed of a ubiquitous promoter coupled to an enhancer element conferring hepatospecific expression.
  • the enhancer element conferring the hepatospecific character can be chosen from the enhancer of apolipoproteins E / Cl (J. Biol. Chem., 268 (1993) 8221 -8229 and J. Biol. Chem, 270 (1995) 22577-2255), the albumin enhancer (Gene therapy, 3 (1996) 802-810), the transthyretin enhancer (Mol. Cell Biol. 15 (1995) 1364-1376), the enhancer of hepatitis B virus (Biol. Chem.
  • the ubiquitous promoter can be any nonspecific promoter of a tissue. It may in particular be a viral promoter or a domestic promoter ("housekeeping").
  • the viral promoters there may be mentioned more particularly the SV40 promoter (Mol Cell Biol 1982; 2: 1044-1051); RSV LTR, Rous sarcoma virus long terminal repeat (PNAS USA, 1982; 79: 6777-6781); CMV-IE, human cytomegalovirus (Gene 1986; 45: 101-105); MoMLV LTR, Moloney murine leukemia virus (Gene Therapy 1996; 3: 806-810) and the promoter of the HSV-TK gene, Thymidine Kinase (Nucleic Acid Res 1980; 8: 5949-5964).
  • SV40 promoter Mol Cell Biol 1982; 2: 1044-1051
  • RSV LTR Rous sarcoma virus long terminal repeat
  • CMV-IE human cytomegalovirus
  • MoMLV LTR Moloney murine leukemia virus
  • Thymidine Kinase Nucleic Acid Res 1980; 8: 5949-5964.
  • the promoter of the Human EF-1 alpha genes (Gene 1993, 134: 307-308), Chicken Beta Actin (Nucleic Acids Res 1983; 11: 8287-8301), POL II promoter, mouse RNA polymerase II (Mol Cell Biol 1987; 7: 2012-2018); PGK, Phosphoglycerate Kinase (Gene 1987; 61: 291-298); Histone H4 (Mol Cell Biol 1985; 5: 380-398), HMG, Hydroxymethylglutaryl CoA: human reductase (Mol Cell Biol 1987; 7: 1881 -1893), HK2, Hexokinase II of rats (J. Biol. Chem. 1995; 270: 16918-16925) and PRP, Prion (Virus genes 1992; 6: 343-356). Any other ubiquitous promoter known to those skilled in the art can also be used.
  • the hepatospecific promoter region can be obtained by coupling, according to conventional molecular biology techniques, all or a functional part of a ubiquitous promoter with the above enhancer element.
  • the oligonucleotides corresponding to the J sites containing the bases -737 to -715 of the human apoA-ll promoter can be cloned into the BamHI / GglII sites of plC20H (Gene 1984; 32: 481 -485), digested with HindIII, and subclones 5 ′ of the ubiquitous promoter chosen, for example of the promoter of Thymidine Kinase (TK) in the plasmid pBLCAT4 (Nucl Acid Res 1987; 15: 5490), to generate a vector containing the J sites and a promoter ubiquitous in front of a gene of interest.
  • TK Thymidine Kinase
  • the hepatic enhancer can be added either 5 'to the promoter or 3' to the polyadenylation site. These variants are particularly advantageous because they combine the properties of expression force, tissue specificity, and inducibility. These different variants can be used for the expression of genes of interest, in vitro and in vivo as indicated above and illustrated in the examples.
  • the invention also relates to recombinant vectors comprising an expression cassette composed of a gene of interest under the control of a promoter as described above.
  • the invention also relates to a composition comprising a recombinant vector as described above and a PPAR activator, for simultaneous or spread over time use.
  • the recombinant vector is advantageously a recombinant adenovirus as defined above, and the activator of PPAR is advantageously an activator of PPAR ⁇ .
  • the activators of PPAR ⁇ it is possible to use more particularly fibrates as well as any compound increasing the expression of transcription factors which bind to the J sites.
  • fib r ates As preferred examples of fib r ates, mention may be made, for example, of fibric acid and its analogs such as in particular gemfibrozil (Atherosclerosis 114 (1) (1995) 61), bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025) , ciprofibrate (BCE & M 9 (4) (1995) 825), clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301), fenofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), clinofibrate (Kidney International. 44 (6) (1993) 1352), pirinixic acid (Wy-14,643) or 5,8,1 1, 14-eicosatetranoic acid (ETYA).
  • gemfibrozil Artherosclerosis 114 (1) (1995) 61
  • bezafibrate Hepatology 21 (1995) 1025)
  • ciprofibrate BCE & M 9 (4) (1995) 825
  • compositions according to the invention may comprise several activators of PPAR in combination, and in particular a fibrate or a fibrate analog associated with a retinoid.
  • the vector and the activator can be used simultaneously or spaced over time.
  • they can be packaged separately.
  • the vector and the activator are packaged separately and used spaced over time.
  • the vector is advantageously used first, then, in a second step, the activator from PPAR.
  • the term used designates bringing said vector or activator into contact with cells, in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the contact can be carried out by incubation of a cell population as mentioned above with the vector (for example from 0.01 to 1000 ⁇ g of vector per 10 6 cells, or of virus at a Multiplicity of Infection (MOI) from 0.1 to 1000), followed by incubation with the activator (generally, in a concentration range between 10 ⁇ 3 mM and 10 mM, preferably between 10 ⁇ M and 500 ⁇ M ).
  • the activator generally comprises the administration of the vector (under the conditions described above) followed by the administration of the activator.
  • the activator can be administered orally, for example in food (for animals in particular) or in the form of capsules (for humans).
  • the daily doses administered to animals are of the order of 0.01 to 1% (weight / weight), preferably 0.2 to 0.5% (weight / weight).
  • a typical daily dose in mice for example is 50 mg.
  • a typical daily dose of fenobibrate in humans varies between 100 and 300 mg, preferably around 200 mg, which corresponds to a plasma concentration of approximately 15 ⁇ g / ml (Vidal, 1996).
  • repeated administrations / incubations of vector and / or activator can be performed.
  • Figure 1 Structure of the apoAII promoter and deleted forms.
  • Figure 2 Region J duplication strategy.
  • Figure 3 Structure of apoAII promoters including region 5 'J duplication, possibly combined with internal deletions.
  • Figure 4 Structure of the apoAII promoters comprising a duplication of the J region internally, possibly combined with internal deletions.
  • Figure 5 Representation of the recombinant adenovirus.
  • Figure 6 Inducibility and strength of the recombinant adenovirus in vivo.
  • the pBR322, pUC and phage plasmids of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Bioiabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Bioiabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Bioiabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease S1.
  • PCR Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki RK et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis KB and Faloona FA, Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]
  • DNA thermal cycler Perkin Elmer Cetus
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Cloning of the promoter of the human apolipoprotein Ail gene.
  • This example describes the cloning of the promoter gu human apoAII II gene It is understood that any other technique can be used to recloner this promoter. Furthermore, it is also possible, from the cloned fragments, to prepare shorter conventional 5 ′ and / or 3 ′ versions according to conventional molecular biology techniques.
  • the promoter of human apophpoprotein Ail was cloned by PCR from human genomic DNA Primers ATC GAA GCT TCT GAT ATC TAT TTA ACT GAT (SEQ ID No. 3) and CGT CTC TGT CCT TGG TGT CTG GAT CCA TCG (SEQ ID No. 4) which introduce, for the first, a HindIII site 5 'to the promoter, and for the second, a BamHI site at 3', made it possible to clone the promoter from the position -911 to the position + 29
  • the promoter sequence was confirmed by sequencing (SEQ ID No. 1) and the HindIII-BamHI fragment introduced into the vector pBLCAT ⁇ for verification of the transcriptional activity
  • a fragment comprising the apoAII promoter of residues -91 1 / + 160 was also obtained from the genomic library, then cloned into the vector pBLCAT ⁇ .
  • This example describes the construction of variants of the apoAII promoter comprising an internal deletion, in the region between the regulatory elements located at the nucleotides -903 to -720, and -126 to -33. These variants were constructed from the fragments -911 / + 29 and -911 / + 160 described in example 1.
  • the region -210 to +29 or -210 to +160 was obtained by PCR using as primer a oligonucleotide -210 / - 198 of sequence 5'-GACTCTAGATGTACCCCCTTA-3 '(SEQ ID No. 5) and an oligonucleotide internal to the CAT gene.
  • the fragment obtained was cloned into a plasmid pBLCAT5 to generate the plasmids -210 / + 160AII-CAT and - 210 / + 29AII-CAT.
  • the distal region -91 1 to -653 (Nl) was obtained by digestion of the fragment -911 to +29 using the enzyme alul, then cloning of the fragment obtained in the plasmids -210 / + 160AII-CAT and -210 / + 29AII- CAT.
  • the distal region -911 to -708 (N-J) was obtained by PCR using as an primer an oligonucleotide -708 / -722 of sequence 5'- GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG-3 '(SEQ ID No. 6). The fragment obtained was then cloned into plasmids -210 / + 160AII-CAT and -210 / + 29AII-CAT.
  • This example describes the construction of Ail Promoter variants in which the J region has been repeated.
  • oligonucleotides corresponding to site J. were synthesized using a DNA synthesizer.
  • Oligo 1 5'-gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa-3 '(SEQ ID No. 7)
  • Oligo 2 5'-gatctCTACCAGGGTAAAGGTTGAag-3' (SEQ ID No. 8)
  • oligonucleotides reconstitute, at the 3 'end, a BamHI site and at the 5' end, a BglII site. These oligonucleotides were hybridized together and the fragment obtained was cloned at the BamHI-BglII sites in the vector plC20H ( Figure 2). The resulting plC20H-J plasmids were analyzed to determine the number of copies of J sites inserted, as well as their respective orientation.
  • the inserts contained in the above plasmids were excised in the form of HindIII fragments and clones in 5 ′ of the apoAII promoter (Example 1) or variants described in Example 2.1, at a HindIII site.
  • the structure of the resulting promoters is given in FIG. 3.
  • the inserts contained in the above plasmids were excised in the form of appropriate restriction fragments, then cloned into the apoAII promoter (Example 1) or into the variants described in Example 2.1, at a corresponding site located between the native J region and the regulatory region -126-33 of the native promoter.
  • the structure of the resulting promoters is given in FIG. 4.
  • the number of copies of region J in the final construct is determined by the choice of the plasmid.
  • Example 3 Study of the functionality of the variants of the apoAII promoter.
  • the functionality of the promoters was studied by transfection into a hepatic cell line, the HepG2 cells.
  • a control experiment was carried out in a non-hepatic cell line, the Hela cells.
  • PBK-CMV-PPAR ⁇ PPAR ⁇ expression plasmid
  • PBK-CMV PPAR ⁇ empty plasmid
  • CMV- ⁇ -Gal a ⁇ -Gal expression plasmid
  • the promoters according to the invention are strong, highly inducible, and specific for hepatic cells.
  • the promoters phA-ll N-I (J3); phA-11 'N-I (J3); phA-ll N-J (J3), phA-ll 'N- J (J3), phA-ll N-1 (J3 ⁇ ); phA-ll 'Nl (J3 ⁇ ), phA-ll NJ (J3 ⁇ ) and phA-ll' NJ (J3 ⁇ ) have the advantage of being small, compared to the native apoAII promoter This therefore advantageously allows, in a vector of gene transfer and / or expression, to have a higher cloning capacity
  • Example 4 Construction of inducible and hepatospecific adenoviruses.
  • adenoviruses This example describes the construction of inducible and hepatospecific adenoviruses, and giving very high expression levels These adenoviruses are useful for the expression of genes in vitro, ex vivo or in vivo
  • the adenoviruses described were constructed from the serotype Ad5 It is understood that any other serotype can be used, and in particular the serotypes Ad2, Ad7, Ad12 and CAV2.
  • the adenoviruses were constructed by homologous recombination, in a packaging line, between a shuttle vector bringing the left part of the viral genome and the DNA of a linearized adenovirus, bringing the right part of the viral genome
  • the shuttle vector constructed carries an expression cassette consisting of an apoAII promoter and a nucleic acid coding for a secreted molecule apolipoprotein Al (apoAl) This vector also brings the left part of the viral genome, that is to say the left ITR and a region allowing recombination.
  • the shuttle vectors used for the construction of the adenovirus were constructed from a plasmid pC05 (WO96 / 22378), a plasmid plC20H-Alb-U-AI-SV40 which contains the first intro of apoAl and The apoAl cDNA under the control of a promoter of albumin from Rat, and of a plasmid pBLAIICAT ⁇ which contains an apoAII promoter as described in example 1 or a variant according to example 2.
  • the 5 'primer introduces a NotI site upstream of this sequence and the 3' primer introduces a half site Nrul.
  • the PCR fragment obtained is treated with klenow to obtain blunt ends and cloned in the vector plC20H cleaved by Smal and Nrul, in the orientation which regenerates a Nrul site.
  • the resulting plasmid is called plC20H-SV40.
  • a PCR fragment is amplified from pXL2336 using the primers GGG ATC CGC TGG CTG CTT AGA GAC TGC (SEQ ID No. 11) and GGC GGC CGC CGG GAA GGG GGG CGG CGG (SEQ ID No. 12) respectively BamHI upstream of the first ApoAl exon and a NotI site downstream of the ApoAI coding sequence.
  • the PCR fragment is cloned into pCRI1 (Invitrogen) and its sequence verified.
  • the BamHI / NotI fragment containing the cDNA and the first intron of apoA-1 is then cloned at the same sites of the plasmid plC20H-SV40 to generate the plasmid plC20H-AI-SV40.
  • the oligonucleotides CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAG AAT AAA CGC TCA ACT GTG GC (SEQ ID n ° 13) and CGT GGC CAC AGT TGA GCG TTT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG AAC AAG CA (SEQ ID n ° 14) are then hybridized with each other and cloned at the Dsal site of plC20H-AI-SV40 so that the Pmll site created during this cloning is on the side of the intron and the Dsal site is regenerated at other end.
  • These oligonucleotides make it possible to introduce a fragment of the 5 'untranslated part of the messenger RNA of ⁇ Globin.
  • the plasmid obtained is called plC20H-U-AI-SV40.
  • the oligonucleotides CGT GGC AGG CAG CAG GAC GCA CCT CCT TCT CGC AGT CTC TAA GCA GCC TTC GAA GCA TG (SEQ ID n ° 15) and CTT CGA AGG CTG CTT AGA GAC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT GCC TGC CA (SEQ ID n ° 16) are hybrid between them which creates a cohesive end Sphl and a cohesive end Hpall.
  • This fragment is introduced into a three-partner ligation with an Hpall / Dralll fragment (476/1518) of the plasmid plC20HAIb-U-AI-SV40 containing the cDNA of ApoAl and a Dralll / Sphl fragment (1518/239) of the same plasmid. .
  • the resulting plasmid is called pXL2699.
  • This construction creates a BstBI site compatible with ClaI upstream of the cDNA + intron fragment of apoAl.
  • the BstBI / SalI fragment of pXL2699, containing the ApoAl cDNA is cloned into the plasmid pCO5 cleaved by ClaI and SalI.
  • the resulting plasmid is called pCO5-U-AI-SV40.
  • the apoAII promoter selected (complete promoter or variants) is excised from the corresponding plasmid pBLAIICAT5 in the form of a Hindlll-BamHI fragment, cloned after treatment with Klenov at the EcoRV site of the plasmid pC05- U-AI-SV40 to generate the shuttle vectors pXLPromAII /HAVE.
  • the following vectors are thus obtained:
  • the adenoviruses were produced by homologous recombination, after co-transfection, into the appropriate cells, of two DNA fragments, one bringing the left part of the genome of the recombinant virus (shuttle vector described in example 4.1., Having a deletion in the E1 region), the other bringing the right part of the genome of the recombinant virus (possibly having a deletion in the E4 and / or E3 region).
  • the Ad-AII / AI adenovirus was obtained by homologous in vivo recombination between the DNA of the Ad-RSV- ⁇ Gal virus and the pXL AII / AI shuttle vector, according to the following protocol: the pXL AII / AI shuttle vector linearized by BstXI and the DNA of the Ad-RSV- ⁇ Gal virus linearized by the enzyme Clal, were co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses generated were then selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus was amplified in the cell line 293, which which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 10 pfu / ml.
  • the viral particles are then purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456), or by chromatography (FR96 08164).
  • the Ad-AII / AI adenovirus can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • the structure of the recombinant genome is presented in Figure 5.
  • the IGRP2 cells (Yeh et al., J. Virol 70 (1996) 559), capable of transcomplementing the E1 and E4 functions of the adenovirus, are cotransfected with 5 mg of the shuttle vector digested with BstXI, and 10 mg of the DNA of the virus providing the functional deletion of the E4 region (for example Ad2dl808, Ad5dl1004, Ad5dl1007 or Ad5dl1014) digested with the enzyme ClaI. After the appearance of the cytopathic effect, the viruses are purified by at least two consecutive cycles of spreading in solid for the formation of plaques on IGRP2.
  • the ranges corresponding to the infection of the virus sought are then amplified by consecutive infection cycles.
  • High titer stocks are prepared by purification on a cesium chloride gradient. Viruses are stored at -80 ° C according to conventional techniques of those skilled in the art.
  • This example describes the functional properties of the adenoviruses of the invention, after administration in vivo.
  • Ad viruses Ad viruses 5 x 10 9 pfu of the Ad viruses (ApoAllprom-ApoAI-SV40 and Ad (RSV-ApoAI-bGH) were injected respectively into 8 and 3 C57bl6 mice.
  • Ad Ad
  • Plasma concentrations of human apoA-1 and HDL-cholesterol were measured weekly. The results obtained are presented in FIG. 6.
  • the plasma apoA-1 levels are below the detection threshold (10 mg / dl) for the mice injected with the Ad virus (ApoAllprom-ApoAI-SV40), 81 ⁇ 0.17 mg / dl for mice injected with Ad virus (ApoAllprom-ApoAI-SV40) treated with fenofibrate and 84 115 mg / dl for mice injected with Ad virus (RSV-ApoAI-bGH) which shows an induction of at least 8 times of the apoA-ll promoter under these conditions.
  • Ad virus Ad virus
  • RSV-ApoAI-bGH Ad virus
  • the level of HDL-cholesterol is not modified for mice injected with the Ad virus (ApoAllprom-ApoAI-SV40) (52 ⁇ 2 mg / dl): identical level to untreated animals.
  • the level of HDL-cholesterol is increased on day 7 up to 88,114 mg / dl and 121,122 mg / dl for respectively for the mice injected with the Ad virus (RSV-ApoAI-bGH) and the mice injected with the virus Ad (ApoAllprom-ApoAI-SV40) treated with fenofibrate (Figure 6).
  • SEQ ID No. 1 Sequence of the human apoAII promoter (-911 +29).
  • -734 -716 ⁇ TCTTATTCA CCTCTTTTCC TGCCAGAGCC CTCCATTGGG AGGGGACGGG -711 CGGAAGCTGT TTTCTGAATT TGTTTTACTG GGGGTAGGGT ATGTTCAGTG
  • ATCAGCATCC AGGTCATTCT GGGCTCTCCT GTTTTCTCCC CGTCTCATTA -611
  • ACCCTCATTC CCCTAACCCC CATAGCCCTC
  • AACCCTGTCC CTGATTTCAA -511 TTCCTTTCTC CTTTCTTCTG CTCCCCAATA TCTCTCTGCC AAGTTGCAGT

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant une expression ciblée et inductible de gènes. Elle décrit en particulier de nouveaux promoteurs hybrides et leur utilisation pour l'expression de gènes dans les cellules hépatiques, in vitro, ex vivo ou in vivo.

Description

NOUVELLES CONSTRUCTIONS ET VECTEURS POUR L'EXPRESSION CIBLEE ET INDUCTIBLE DE GENES
La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en particuler le domaine de la régulation de l'expression de gènes. Elle décrit notamment de nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant une expression ciblée et inductibe de gènes. La présente invention est utilisable dans de nombreux domaines, et en particulier pour la production de protéines recombinantes, pour la création de modèles animaux transgéniques, pour la création de lignées cellulaires, pour la mise au point de tests de criblage, ou encore en thérapie génique et cellulaire.
La possibilité de contrôler et de diriger l'expression de gènes constitue un enjeu très important dans le développement des biotechnologies. In vitro, elle permet d'améliorer les conditions de production de protéines recombinantes, en découplant par exemple la phase de croissance cellulaire et la phase de production. Toujours in vitro, elle permet encore de créer des lignées cellulaires capables de produire certaines molécules à des périodes choisies. Ainsi, il est envisageable de construire des lignées cellulaires produisant, de manière régulée, des protéines transcomplementant des génomes viraux défectifs. Toujours in vitro, un système d'expression régulé permet la mise au point de tests de criblages de molécules agissant sur le contrôle de l'expression de gènes. Le contrôle de l'expression de gènes est également très important pour des approches thérapeutiques ex vivo ou in vivo, dans lesquelles la possibilité de contrôler sélectivement la production d'une molécule thérapeutique est essentielle. En effet, selon les applications, selon le gène à transférer, il est important de pouvoir cibler certains tissus ou certaines parties seulement d'un organisme afin de concentrer l'effet thérapeutique et de limiter la dissémination et les effets secondaires.
Ce ciblage peut être réalisé en utilisant des vecteurs présentant une spécificité cellulaire donnée. Une autre approche consiste à utiliser des signaux d'expression spécifiques de certains types cellulaires. A cet égard, des promoteurs dits spécifiques ont été décrits dans la littérature, tels que le promoteur des gènes codant pour la pyruvate kinase, la villine, la GFAP, le promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, le promoteur de l'actine α des cellules du muscle lisse, ou le promoteur du gène de l'albumine humaine par exemple. Cependant, si ces promoteurs présentent une certaine spécificité tissulaire, ils ne sont pas régulables et de ce fait, offrent des possibilités de contrôle limitées. D'autres systèmes, plus complexes,ont été décrits dans la littérature. Ainsi, la demande WO96/01313 décrit un système d'expression de gènes régulé par la tétracyc ne. De même, Wang et al. (PNAS 91 (1994) 8180) ont décrit un système d'expression de gènes régulé par le RU486. Evans et al Ont quant à eux décrit un système basé sur le récepteur à l'ecdysone, hormone d'insecte (PNAS 93 (1996) 3346) Cependant, ces différents systèmes, bien qu'inductibles, ne présentent pas de spécificité tissulaire De ce fait, ils ne permettent pas a eux seuls de cibler l'expression au niveau d'organes ou de tissus désirés, mais simplement d'induire ou de réprimer l'expression de manière ubiquitaire De plus, le système tétracycline présente un niveau de régulation relativement faible, inférieur à un facteur cinq Par ailleurs, ces systèmes fonctionnent avec des molécules hybrides et nécessitent la cotransfection de 2 constructions au moins En outre, ils mettent en oeuvre des éléments hétérologues et risquent donc de générer des reactions immunitaires
L'invention décrit maintenant de nouvelles constructions permettant l'expression ciblée et régulée de gènes L'invention décrit en particulier des vecteurs recombinants permettant une expression de gènes inductible et hépatospécifique L'invention décrit également de nouvelles constructions promotrices ayant des niveaux de régulation améliorés La présente invention offre ainsi un moyen particulièrement performant pour le ciblage de l'expression de gènes dans des cellules hépatiques, in vivo ou in vitro, et pour la régulation de cette expression
La présente demande repose en particulier sur l'utilisation du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine Ail L'apolipoprotéine Ail (apoAII) est l'un des constituants proteiques majeurs des lipoprotéines de hautes densité (HDL) L'apoAII est synthétisée majoritairement dans le foie, bien que des résultats contradictoires suggèrent une synthèse également au niveau de l'intestin Le gène humain de l'apoAII a été clone et séquence (Tsao et al , J Biol Chem 260 (1985) 15222) La région promotrice s'étend sur environ 1 kb en amont du codon d'initiation de la transcription. Elle comporte des éléments régulateurs localisés au niveau des nucléotides -903 à -680, ainsi que des sites multiples additionnels situés au niveau de la région intermédiaire (nucléotides -573 à -255) et proximale (-126 à -33). L'expression optimale est obtenue lorsque des facteurs nucléaires sont liés aux éléments régulateurs proximaux et distaux du promoteur.
La séquence du promoteur du gène humain de l'apoAII, du résidu - 911 à +29 est représentée sur la séquence SEQ ID n° 1.
Il a été observé des mécanismes de régulation du promoteur apoAII contradictoires chez l'homme et chez les rongeurs Dans un cas, une stimulation par les fibrates a été observée, dans l'autre, une inhibition Les fibrates, souvent utilisés comme agents hypolipidémiques, appartiennent à la famille chimique des proliférateurs de peroxisome, dans la mesure où ils induisent une hépatomegalie liée à la prolifération des peroxisomes chez les rongeurs Leur action est médiée par des récepteurs activés (PPAR "Peroxisome Proliferator Activated Receptor"), un groupe de 4 récepteurs nucléaires distincts (α, β, γ, δ). Les PPAR appartiennent à la superfamille des récepteurs hormonaux nucléaires qui se lient à des éléments de réponse spécifiques désignés PPRE ("Peroxisome Proliferator Response Elément") Des PPRE ont été identifiés dans de nombreux gènes codant pour des enzymes impliquées dans la voie de β-oxydation, qui se sont avères être inductibles par les fibrates
La demanderesse a maintenant mis au point un système d'expression de gènes hépatospécifique et inductible par les fibrates, utilisables in vitro et in vivo Plus particulièrement, la demanderesse a construit pour la première fois un vecteur ayant un tropisme pour le foie permettant l'expression de gènes de manière sélective dans le foie ou les cellules hépatiques, et de manière inductible par les fibrates La demanderesse a également construit de nouveaux promoteurs dérivés du promoteur du gène de l'apoAII humain, ayant des propriétés d'inductibilité et de force améliorées
Un premier objet de l'invention réside dans un vecteur recombinant pour l'expression inductible et hépatospécifique d'une molécule caractérisé en ce qu'il comprend, une cassette d'expression constituée d'un acide nucléique codant pour ladite molécule placé sous contrôle du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain.
Selon une variante particulièrement préférée le vecteur recombinant est un vecteur viral dérivé des adénovirus, comprenant, inséré dans son génome, ladite cassette d'expression.
De manière particulièrement remarquable, la demanderesse a en effet montré qu'un tel adénovirus permettait d'exprimer un gène spécifiquement dans le foie, que cette expression était fortement inductible m vivo par les fibrates, et que les niveaux d'expression obtenus étaient comparables à ceux décrits antérieurement avec les promoteurs constitutifs les plus forts.
Le caractère hépatospécifique des virus de l'invention signifie que ces virus permettent l'expression d'un gène de manière très sélective dans les cellules hépatiques, in vitro, ex vivo ou in vivo. Une expression non- spécifique faible dans d'autres tissus ou types cellulaires peut être tolérée, dès lors qu'une expression très majoritaire est observée dans les cellules hépatiques (de préférence plus de 80% des cellules exprimant le transgène sont des cellules hépatiques. Encore plus préférentiellement, plus de 90%) En particulier, contrairement aux indications contradictoires relevées dans l'art antérieur, le virus selon l'invention n'induit aucune expression détectable dans l'intestin et offre donc une sélectivité particulièrement élevée. Ceci est très important pour des approches de transfert et d'expression de gènes toxiques, pour lesquelles un niveau de sélectivité très élevé est nécessaire Par ailleurs, comme indiqué précédemment, les sytèmes inductibles décrits dans l'art antérieur présentent une inductibilité moyenne, d'un facteur cinq environ. Les résultats présentés dans les exemples démontrent que l'adénovirus de l'invention est inductible d'un facteur dix environ. Le niveau d'inductibilité est également très important pour obtenir un contrôle de la quantité de molécules délivrées in vivo. Ceci est particulièrement sensible dans le cas de molécules immunogènes ou susceptibles de générer des réponses inflammatoires. Ceci est également particulièrement intéressant pour l'expression de molécules dont l'efficacité biologique implique des concentrations élevées. D'autre part, une autre caractéristique particulièrement remarquable du vecteur de l'invention réside dans les niveaux d'expression élevés obtenus. En effet, les systèmes inductibles présentent généralement en contrepartie, des niveaux d'expression moyens voire faibles. De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a montré que le système de l'invention permet d'obtenir des niveaux d'expression in vivo comparables à ceux décrits pour les promoteurs constitutifs les plus forts. Le système de l'invention combine donc pour la première fois des propriétés remarquables de sélectivité, d'inductibilité, et de force. L'un des aspects de l'invention réside donc dans l'utilisation du promoteur du gène humain de l'apoAII. Un autre aspect de l'invention réside dans la construction de vecteurs dérivés des adénovirus. Les vecteurs selon l'invention combinent des propriétés remarquables de transfert de gènes, d'inocuité, de spécificité tissulaire, d'inductibilité et de force. Avantageusement, le promoteur utilisé dans les virus de l'invention comprend les éléments régulateurs du promoteur du gène de l'apoAII. Plus particulièrement, ces éléments sont localisés au niveau des nucléotides -903 à -680; -573 à -255; et -126 à -33 du gène humain de l'apoAII. A cet égard, selon une variante particulière, le promoteur comprend les résidus -91 1 à +29 du gène de l'apoAII (séquence SEQ ID π° 1 ).
Il est entendu que des formes plus courtes ou plus longues du promoteur peuvent être utilisées. Ainsi, du coté 3', il est important que le promoteur comprenne le site d'initiation de la transcription du gène de l'apoAII (numéroté +1 sur SEQ ID n° 1 ). En revanche, il est préférable que ce promoteur ne contienne pas le premier intron du gène de l'apoAII, qui commence au nucléotide +38. Ainsi, avantageusement, le fragment utilisé possède une extrémité 3' comprise entre les résidus +5 et +35, plus préférentiellement +10 et +30 du gène apoAII. Pour ce qui est de l'extrémité 5', il est préférable, pour obtenir des niveaux importants d'expression dans le foie, de conserver au moins en partie le site de liaison des facteurs hépatiques. Ce site est localisé au niveau des nucléotides -903 à -680. De ce fait, avantageusement, le fragment utilisé possède une extrémité 5' localisée en amont du nucléotide -903. Cette extrémité peut être localisée par exemple dans la région -950 à -910. Par ailleurs, pour des raisons de capacité de clonage, il est avantageux d'utiliser une région promotrice de taille réduite. De ce fait, on préfère utiliser un fragment dont l'extrémité 5' est localisée dans la région -925 à -910.
Selon une variante avantageuse de l'invention, le promoteur comporte les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -680 (ou - 903 à -720) et -126 à -33, mais pas les éléments intermédiaires localisés au niveau des nucléotides -573 à -255. En particulier, le promoteur utilisé comprend avantageusement une délétion dans la région comprise entre les résidus -710 et -150. A titre d'exemple spécifique, le promoteur peut être avantageusement constitué d'un variant de la séquence SEQ ID n° 1 obtenu par délétion des résidus 708-210. De manière encore plus préférentielle, le promoteur utilisé comprend une délétion dans la région comprise entre les résidus -670 et -210. A titre d'exemple spécifique, le promoteur peut être avantageusement constitué d'un variant de la séquence SEQ ID n° 1 obtenu par délétion des résidus; 653-210.
Les résultats présentés dans les exemples montrent en effet que ce type de construction présente une force élevée et une inductibilité par les fibrates supérieure au promoteur natif de l'apoAII, dans un contexte adénoviral. Ces constructions sont donc avantageuses sur le plan des propriétés régulatrices, comme sur le plan de la capacité de clonage du vecteur, puisque la région promotrice est réduite
Selon un autre mode de réalisation, les adénovirus selon l'invention comprennent comme promoteur un variant du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail comprenant une répétition de motifs J. La multiplication de la région J permet de manière avantageuse d'augmenter également le caractère inductible par les fibrates du promoteur. La région J est constituée de la séquence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID n° 2, soulignée sur SEQ ID n°1 ) Elle est localisée dans le promoteur Ail au niveau des nucléotides -734 à -716 du promoteur. La demanderesse a maintenant construit des virus recombinants comportant des promoteurs modifiés au niveau de la région J. Ces virus présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour le transfert et l'expression de gènes, in vitro comme in vivo. Préférentiellement, le promoteur comprend de 2 à 5 motifs J. Encore plus préférentiellement, il comprend 3 motifs J. Pour la construction de ces variants, la répétition de motifs J peut être positionnée en 5' du promoteur, en 3' du promoteur, ou insérée dans la séquence du promoteur, de préférence au niveau de la séquence J native. Par ailleurs, la multiplication de motifs J peut avantageusement être combinée avec une délétion telle que décrite ci- avant. Ceci permet d'obtenir un promoteur ayant des propriétés encore améliorées en terme de puissance et de contrôle de l'expression de gènes.
Ces différentes constructions peuvent être réalisées selon les techniques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Ainsi, en partant de la séquence SEQ ID n° 1 , l'homme du métier peut effectuer différentes délétions en sélectionnant des enzymes de restriction appropriées. Les délétions peuvent également être réalisées par mutagénèse dirigée ou par PCR. D'autre part, les régions J peuvent être synthétisées artificiellement au moyen de synthétiseurs de nucléotides, puis insérées dans ou fusionnées au promoteur par PCR ou par clivage et ligation au moyen d'enzymes appropriées. Ces différentes approches sont illustrées dans les exemples.
Comme indiqué ci-avant, les capacités remarquables des vecteurs de l'invention découlent du promoteur utilisé, comme du choix du vecteur La mise en évidence de la fonctionnalité des promoteurs dans un contexte adénoviral in vivo a en effet permis la réalisation de ces vecteurs très performants.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ. Il en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adénovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Ad12). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence.
Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions E1 , E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région E1 notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L1 à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs recombinants, différentes constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région E1 , essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gène 101 (1991 ) 195 ; Gosh-Choudhury et al., Gène 50 (1986) 161 ). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une deletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions E1 et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152, WO95/02697, W096/22378). En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (WO96/10088).
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou Ad5.
Avantageusement, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de l'invention comprend une délétion dans la région E1 de son génome. Encore plus particulièrement, il comprend une délétion des régions E1 a et E1 b. A titre d'exemple précis, on peut citer des délétions affectant les nucléotides
454-3328; 382-3446 ou 357-4020 (par référence au génome de l'Adδ).
Selon une variante préférentielle, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de l'invention comprend en outre une délétion dans la région E4 de son génome. Plus particulièrement, la délétion dans la région E4 affecte l'ensemble des phases ouvertes. On peut citer à titre d'exemple précis les délétions 33466-35535 ou 33093-35535. D'autres types de délétions dans la région E4 sont décrites dans les demandes WO95/02697 et W096/22378, incorporées à la présente par référence.
La cassette d'expression peut être insérée en différents sites du génome recombinant. Elle peut être insérée au niveau de la région E1 , E3 ou E4, en remplacement des séquences délétées ou en surplus. Elle peut égeiement être insérée en tout autre site, en dehors des séquences nécessaires en cis à la production des virus (séquences ITR et séquence d'encapsidation).
Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. L'une de ces lignées est par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11 -12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région E1 , incluant E1 a et E1 b, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine plVa2. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région E1 , c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région E1 , et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette lignée est également capable de produire, à température permissive (32°C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible. D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région E1 ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans- complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites. En particulier, on peut citer des lignées complementant les régions E1 et E4 (Yeh et al., J. Viral. 70 (1996) 559 , Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322 , Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complementant les régions E1 et E2 (W094/28152, WO95/02697, WO95/27071 ).
Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Pour la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit peut être le génome viral recombinant complet, éventuellement construit dans une bactérie (WO96/25506) ou dans une levure (WO95/03400), transfecté dans les cellules. Il peut également s'agir d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN viral peut aussi être introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome viral recombinant par recombinaison homologue entre les différents fragments. Après la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par centrifugation en gradient de chlorure de césium. Une méthode alternative a été décrite dans la demande FR96:08164 incorporée à la présente par référence.
Le vecteur recombinant ayant un tropisme pour le foie peut également être construit à partir d'un vecteur non viral de type plasmidique, en particulier tel que décrit dans les demandes WO96/26270 et PCT/FR96/01414.
Comme indiqué ci-avant, les vecteurs de l'invention permettent la production régulée, à haut niveau, et hépatospécifique, de molécules d'intérêt. La molécule d'intérêt est avantageusement une molécule thérapeutique. Il peut s'agir d'une protéine ou d'un acide nucléique (ARNt,
ARN antisens, etc).
De manière particulièrement préférée, la molécule thérapeutique est une protéine sécrétée dans la circulation. On peut citer à titre d'exemple les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (WO94/25073), la dystrophine ou une minidystrophine (WO93/06223), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rapl A, DCC, k-rev, etc (W094/24297), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII,
IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc, W094/29446).
Pour assurer la sécrétion de la protéine, la cassette d'expression comprend avantageusement une séquence signal appropriée. Il peut en particulier s'agir de la séquence signal naturelle de la protéine sécrétée, si celle-ci est fonctionnelle dans une cellule hépatique. Il peut également s'agir de toute séquence hétérologue appropriée. A titre d'exemple, on peut citer la séquence signal de l'apolipoprotéine Al. En outre, la cassette comporte généralement une région située en 3' qui spécifie un signal de terminaison de la transcription et de polyadénylation. On utilise par exemple le site polyA du virus SV40. Il est entendu que le choix de ces signaux entre dans les compétences générales de l'homme du métier.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un hydrogel. Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845. Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 101 4 pfu, et de préférence 10^ à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. En raison de leur caractère hépatospécifique, les vecteurs (notamment adénovirus) selon l'invention sont également utilisables pour la création de modèles animaux de pathologies hépatiques.
Par ailleurs, l'invention concerne également toute cellule modifiée par un vecteur (notamment un adénovirus) tel que décrit ci-avant. Ces cellules peuvent être utilisées pour la production de protéines recombinantes in vitro. Elles peuvent également être destinées à une implantation dans un organisme, selon la méthodologie décrite dans la demande W095/14785. Ces cellules sont préférentiellement des cellules hépatiques. La présente invention a encore pour objet un procédé de production de protéines recombinantes comprenant l'infection ou la transfection d'une population cellulaire avec un vecteur, un adénovirus recombinant ou le génome viral correspondant comprenant une cassette d'expression codant pour une protéine désirée, la culture de ladite population cellulaire recombinante, et la récupération de ladite protéine produite. Avantageusement, pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on utilise des cellules d'origine hépatique. Il peut s'agir de lignées établies ou de cultures primaires.
L'invention concerne également de nouveaux variants du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain ayant des caractéristiques d'expression améliorées. Ces variants selon l'invention comprennent en particulier une répétition de motifs J tels que décrits précédemment. En outre, ces variants comprennent avantageusement une délétion dans la région comprise entre les résidus -710 et -150 du promoteur natif. L'invention concerne également des promoteurs hépatospécifiques et inductibles dérivés du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain comprenant une région régulatrice composée d'un ou plusieurs motifs J du promoteur de l'apolipoprotéine Ail et une région promotrice hépatospécifique issue d'un autre promoteur. Avantageusement, la région promotrice hépatospécifique est issue d'un promoteur hépatospécifique autre que le promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine Ail. Préférentiellement, elle est composée d'un promoteur choisi choisi parmi le promoteur de la sérum albumine, le promoteur de l'apolipoprotéine Al, le promoteur de l'apolipoprotéine Cs. le promoteur de l'apolipoprotéine B100, le promoteur de la chaîne gamma du fibrinogène (JBC 270 (1995) 28350), le promoteur du gène de la phénylalanine hydroxylase humaine (PNAS 93 (1996) 728), le promoteur du gène de l'AMBP (NAR 23 (1995) 395), le promoteur du gène du facteur X (JBC 271 (1996) 2323), le promoteur du cytochrome P450 1A1 (PNAS 92 (1995) 11926), le promoteur du virus de l'hépatite B (Biol.Chem. 377 (1996) 187) ou encore le promoteur de l'α-antitrypsine. La région promoteur utilisée est préférentiellement constituée de la région nécessaire et suffisante pour l'expression hépatique (promoteur minimum). Cette région comprend généralement la boite TATA, et peut être préparée selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme indiqué dans les références citées. Ainsi, les 209 premières paires de bases du promoteur du gène du facteur X sont suffisantes pour conférer l'expression hépatique (JBC précité). De même, des fragments -20 à -23; -54 à -57 et -66 à -77 du promoteur de la chaine gamma du fibrinogène constituent un promoteur minimal permettant une expression hépatospécifique. Ces régions peuvent être jointes aux régions J (de préférence 1 à 5) selon la méthodologie décrite ci-avant et illustrée dans les exemples, pour générer des promoteurs hépatospécifiques et inductibles. En outre, ces promoteurs peuvent porter des séquences additionnelles de régulation de type "enhanceur", permettant d'améliorer les niveaux d'expression.
La région promotrice hépatospécifique peut également être composée d'un promoteur ubiquitaire couplé à un élément enhanceur conférant une expression hépatospécifique. A cet égard, l'élément enhanceur conférant le caractère hépatospécifique peut être choisi parmi l'enhancer des apolipoproteines E/C-l (J. Biol. Chem., 268 (1993) 8221 -8229 et J. Biol. Chem, 270 (1995) 22577- 22585), l'enhancer de l'albumine (Gène therapy, 3 (1996) 802-810), l'enhancer de la transthyretine (Mol. Cell Biol. 15 (1995) 1364-1376), l'enhanceur du virus de l'hépatite B (Biol.Chem. 377 (1996) 187) ou encore des enhancers artificiels contenant des sites HNF (hepatic nuclear factors), sites de liaison aux récepteurs orphelins, membres des récepteurs aux hormones steroidiennes (Human gène therapy, 7 (1996) 159-171 ). Le promoteur ubiquitaire peut être tout promoteur non spécifique d'un tissu. Il peut s'agir en particulier d'un promoteur viral ou d'un promoteur domestique ("housekeeping"). Parmi les promoteurs viraux, on peut citer plus particulièrement le promoteur SV40 (Mol Cell Biol 1982; 2:1044-1051 ); RSV LTR, Rous sarcoma virus long terminal repeat (PNAS USA, 1982; 79:6777- 6781 ); CMV-IE, human cytomegalovirus (Gène 1986; 45:101 -105); MoMLV LTR, Moloney murine leukemia virus (Gène Therapy 1996; 3:806-810) et le promoteur du gène HSV-TK, Thymidine Kinase (Nucleic Acid Res 1980; 8:5949-5964). Parmi les promoteurs domestiques, on peut citer le promoteur des gènes Human EF-1 alpha, elongation factor (Gène 1993, 134:307-308), Beta Actine de poulet (Nucleic Acids Res 1983; 11 : 8287-8301 ), POL II promoteur, ARN polymerase II de souris (Mol Cell Biol 1987; 7: 2012-2018); PGK, Phosphoglycerate Kinase (Gène 1987; 61 : 291 -298); Histone H4 (Mol Cell Biol 1985; 5:380-398), HMG, Hydroxymethylglutaryl CoA:reductase humain (Mol Cell Biol 1987; 7: 1881 -1893), HK2, Hexokinase II de rat (J. Biol. Chem. 1995; 270:16918-16925) et PRP, Prion (Virus gènes 1992; 6: 343- 356). Tout autre promoteur ubiquitaire connu de l'homme du métier peut également être utilisé.
La région promotrice hépatospécifique peut être obtenue en couplant selon les techniques classiques de biologie moléculaire tout ou une partie fonctionnelle d'un promoteur ubiquitaire avec l'élément enhanceur ci-dessus. En particulier, les oligonucleotides correspondants aux sites J contenant les bases -737 à -715 du promoteur de l'apoA-ll humaine peuvent être clones dans les sites BamHI/GglII de plC20H (Gène 1984; 32:481 -485), digérés par HindIII, et sous clones en 5' du promoteur ubiquitaire choisi, par exemple du promoteur de la Thymidine Kinase (TK) dans le plasmide pBLCAT4 (Nucl Acid Res 1987; 15: 5490), pour générer un vecteur contenant les sites J et un promoteur ubiquitaire devant un gène d'intérêt. L'enhancer hépatique peut être ajouté soit en 5' du promoteur ou en 3' du site de polyadenylation. Ces variants sont particulièrement avantageux car combinent les propriétés de force d'expression, de spécificité tissulaire, et d'inductibilité. Ces différents variants peuvent être utilisés pour l'expression de gènes d'intérêt, in vitro et in vivo comme indiqué ci-avant et illustré dans les exemples. L'invention concerne également des vecteurs recombinants comportant une cassette d'expression composée d'un gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur tel que décrit ci-avant.
L'invention concerne également une composition comprenant un vecteur recombinant tel que décrit ci-avant et un activateur de PPAR, en vue d'une utilisation simultanée ou étalée dans le temps.
Le vecteur recombinant est avantageusement un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant, et l'activateur de PPAR est avantageusement un activateur de PPARα. Parmi les activateurs de PPARα, on peut utiliser plus particulièrement les fibrates ainsi que tout composé augmentant l'expression de facteurs de transcription se fixant sur les sites J.
A titre d'exemples préférés de fibrates, on peut citer par exemple l'acide fibrique et ses analogues tels que notamment le gemfibrozil (Atherosclerosis 114(1 ) (1995) 61 ), le bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), le ciprofibrate (BCE&M 9(4) (1995) 825), le clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301 ), le fénofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), le clinofibrate (Kidney International. 44(6) (1993) 1352), l'acide pirinixique (Wy-14,643) ou l'acide 5,8,1 1 ,14-eicosatetranoique (ETYA). Ces différents composés sont compatibles avec une utilisation biologique et/ou pharmacologique in vitro ou in vivo.
A titre d'exemples de composés augmentant l'expression de facteurs de transcription se fixant sur les sites J, on peut citer notamment les rétinoïdes, qui activent l'expression de RXR et HFN4. Par ailleurs, les compositions selon l'invention peuvent comporter plusieurs activateurs de PPAR en association, et en particulier un fibrate ou un analogue de fibrate associé à un rétinoïde.
Comme indiqué ci-avant, le vecteur et l'activateur peuvent être utilisés simultanément ou de manière espacée dans le temps. En outre, ils peuvent être conditionnés de manière séparée. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le vecteur et l'activateur sont conditionnés séparément et utilisés de manière espacée dans le temps. En particulier, le vecteur est avantageusement utilisé en premier, puis, dans un second temps, l'activateur de PPAR. Le terme utilisé désigne la mise en contact dudit vecteur ou activateur avec les cellules, in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro ou ex vivo, la mise en contact peut être effectuée par incubation d'une population cellulaire telle que mentionnée plus haut avec le vecteur (par exemple de 0,01 à 1000 μg de vecteur pour 106 cellules, ou de virus à une Multiplicité d'Infection (MOI) de 0,1 à 1000), suivie d'une incubation avec l'activateur (généralement, dans une gamme de concentration comprise entre 10~3 mM et 10 mM, de préférence entre 10 μM et 500 μM). In vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques ou pour l'expression hépatospécifique de gènes d'intérêt, la mise en contact comprend généralement l'administration du vecteur (dans les conditions décrites ci-avant) suivie de l'administration de l'activateur. A cet égard, l'activateur peut être administré par voie orale, par exemple dans la nourriture (pour les animaux en particulier) ou sous forme de gélules (pour l'homme). Les doses journalières administrées aux animaux sont de l'ordre de 0,01 à 1% (poids/poids), de préférence de 0,2 à 0,5 % (poids/poids). Une dose journalière typique chez la souris par exemple est de 50 mg. Une dose journalière typique de fénobibrate chez l'homme varie entre 100 et 300 mg, de préférence autour de 200mg, qui correspond à une concentration plasmatique de 15 μg/ml environ (Vidal, 1996). En outre, des administrations/incubations répétées de vecteur et/ou d'activateur peuvent être effectuées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Structure du promoteur apoAII et des formes délétées. Figure 2 : Stratégie de duplication de la région J. Figure 3 : Structure des promoteurs apoAII comportant une duplication de la région J en 5', éventuellement combinée à des délétions internes.
Figure 4 : Structure des promoteurs apoAII comportant une duplication de la région J en interne, éventuellement combinée à des délétions internes. Figure 5 : Représentation de l'adénovirus recombinant.
Figure 6 : Inductibilité et force de l'adénovirus recombinant in vivo.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol- chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Bioiabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Bioiabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Bioiabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic
Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1 : Clonage du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine Ail.
Cet exemple décrit le clonage du promoteur gu gène humain de l'apoAII II est entendu que toute autre technique peut être utilisée pour recloner ce promoteur. Par ailleurs, il est également possible, à partir des fragments clones, de préparer selon les techniques de biologie moléculaire classiques des versions plus courtes en 5' et/ou en 3'
1 1. Clonage d'un fragment -911/+29
Le promoteur de l'apophpoproteine Ail humaine a été clone par PCR a partir d'ADN génomique humain Des amorces ATC GAA GCT TCT GAT ATC TAT TTA ACT GAT (SEQ ID n°3) et CGT CTC TGT CCT TGG TGT CTG GAT CCA TCG (SEQ ID n°4) qui introduisent, pour la première, un site HindIII en 5' du promoteur, et pour la seconde, un site BamHI en 3', ont permis de cloner le promoteur de la position -911 à la position +29 La séquence du promoteur a été confirmée par séquençage (SEQ ID n° 1 ) et le fragment Hindlll-BamHI introduit dans le vecteur pBLCATδ pour vérification de I activité transcriptionnelle
1 2. Clonage d'un fragment -911/+160
Un fragment comportant le promoteur apoAII des résidus -91 1/+160 a également été obtenu a partir de la banque génomique, puis clone dans le vecteur pBLCATδ.
Exemple 2 : Construction de variants du Promoteur AH 2.1. Création de formes tronguées
Cet exemple décrit la construction de variants du promoteur apoAII comportant une délétion interne, dans la région comprise entre les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -720, et -126 à -33. Ces variants ont été construits à partir des fragments -911/+29 et -911/+160 décrits dans l'exemple 1.
A partir des vecteurs pBLCAT5 comportant le promoteur complet sous forme d'un fragment -911/+29 ou -911/+160, la région -210 à +29 ou -210 à +160 a été obtenue par PCR en utilisant comme amorce un oligonucléotide -210/- 198 de séquence 5'-GACTCTAGATGTACCCCCTTA-3' (SEQ ID n°5) et un oligonucléotide interne au gène CAT. Le fragment obtenu a été clone dans un plasmide pBLCAT5 pour générer les plasmides -210/+160AII-CAT et - 210/+29AII-CAT. La région distale -91 1 à -653 (N-l) a été obtenue par digestion du fragment -911 à +29 au moyen de l'enzyme alul, puis clonage du fragment obtenu dans les plasmides -210/+160AII-CAT et -210/+29AII- CAT. La région distale -911 à -708 (N-J) a été obtenue par PCR en utilisant comme amorce un oligonucléotide -708/-722 de séquence 5'- GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG-3' (SEQ ID n°6). Le fragment obtenu a ensuite été clone dans les plasmides -210/+160AII-CAT et -210/+29AII-CAT.
La structure des promoteurs est représentée sur la figure 1 .
2.2. Duplication du site J
Cet exemple décrit la construction de variants du Promoteur Ail dans lesquels la région J a été répétée.
Les deux oligonucléotides suivants, correspondant au site J. ont été synthétisés en utilisant un synthétiseur d'ADN.
Oligo 1 : 5'-gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa-3' (SEQ ID n°7) Oligo 2: 5'-gatctCTACCAGGGTAAAGGTTGAag-3' (SEQ ID n°8)
Ces oligonucléotides reconstituent, à l'extrémité 3', un site BamHI et à l'extrémité 5', un site Bglll. Ces oligonucléotides ont été hybrides ensemble et le fragment obtenu a été clone aux sites BamHI-BglII dans le vecteur plC20H (Figure 2). Les plasmides plC20H-J résultant ont été analysés pour déterminer le nombre de copies de sites J insérés, ainsi que leur orientation respective.
Les plasmides suivants ont été sélectionnés :
- un plasmide portant une seule copie du site J,
- un plasmide portant 2 copies du site J dans la même orientation,
- un plasmide portant 2 copies du site J, en orientation inverse.
Pour construire les variants du promoteur apoAII comportant des motifs J répétés en 5', les inserts contenus dans les plasmides ci-dessus ont été excisés sous forme de fragments HindIII et clones en 5' du promoteur apoAII (exemple 1 ) ou des variants décrits dans l'exemple 2.1 , au niveau d'un site HindIII. La structure des promoteurs résultants est donnée sur la figure 3.
Pour construire les variants du promoteur apoAII comportant des motifs J répétés en interne, les inserts contenus dans les plasmides ci-dessus ont été excisés sous forme de fragments de restriction appropriés, puis clones dans le promoteur apoAII (exemple 1 ) ou dans les variants décrits dans l'exemple 2.1 , au niveau d'un site correspondant situé entre la région J native et la région de régulation -126-33 du promoteur natif. La structure des promoteurs résultants est donnée sur la figure 4.
Le nombre de copies de la région J dans la construction finale est déterminé par le choix du plasmide.
Exemple 3 : Etude de la fonctionalité des variants du promoteur apoAII.
La fonctionalité des promoteurs a été étudiée par transfection dans une lignée cellulaire hépatique, les cellules HepG2. Une expérience contrôle a été effectuée dans une lignée cellulaire non-hépatique, les cellules Hela.
Les transfections dans les cellules HepG2 ont été réalisées à 50-60% de confluence par la méthode de précipitation au phosphate de calcium. Les cellules ont été co-transfectées par un mélange de plasmides comprenant : - le plasmide test - un plasmide d'expression du PPARα (PBK-CMV-PPARα) ou le plasmide correspondant vide (PBK-CMV), et,
- 0,5 μg d'un plasmide d'expression de la β-Gal (CMV-β-Gal) comme contrôle de l'efficacité de transfection.
Toutes les transfections ont été réalisées avec la même quantité d'ADN total. 4 h après la transfection, les cellules sont lavées dans un tampon PBS, puis incubées 24 heures avec le fibrate (Wy-14643, 1 μM). L'activité CAT est ensuite déterminée selon la méthode de Gorman et al (Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 1044). Les résultats sont ensuite rapportés à l'efficacité de transfection telle que mesurée par l'expression de la β-Gal.
Les résultats obtenus pour deux séries d'expérience sont présentés dans les Tableaux 1 et 2 ci-après.
Tableau 1 : Activité des Promoteurs sur cellules hépatiques
Figure imgf000025_0001
Tableau 2 : Activité des Promoteurs sur cellules hépatiques
Figure imgf000026_0001
Ces résultats font apparaître clairement que la duplication du motif J dans le promoteur n'altère pas la force du promoteur, et augmente très significativement son inductibilité par les fibrates. Par ailleurs, dans une expérience contrôle réalisée dans les cellules
Hela, aucune inductibilité par les fibrates ou par le PPAR n'a été observée. Ceci démontre que les promoteurs selon l'invention conservent leur spécificité tissulaire.
Ces résultats démontrent donc que les promoteurs selon l'invention sont forts, hautement inductibles, et spécifiques des cellules hépatiques En outre, les promoteurs phA-ll N-I(J3); phA-ll' N-I(J3); phA-ll N-J(J3), phA-ll' N- J(J3), phA-ll N-l(J3ι); phA-ll' N-l(J3ι), phA-ll N-J(J3ι) et phA-ll' N-J(J3ι) possèdent l'avantage d'être de petite taille, comparés au promoteur apoAII natif Ceci permet donc avantageusement, dans un vecteur de transfert et/ou d'expression de gènes, d'avoir une capacité de clonage supérieure
Exemple 4 Construction d'adénovirus inductibles et hépatospécifiques.
Cet exemple décrit la construction d'adénovirus inductibles et hépatospécifiques, et donnant des niveaux d'expression très élevés Ces adénovirus sont utiles pour l'expression de gènes in vitro, ex vivo ou in vivo Les adénovirus décrits ont été construits à partir du serotype Ad5 II est entendu que tout autre serotype peut être utilisé, et notamment les serotypes Ad2, Ad7, Ad12 et CAV2 Les adénovirus ont été construits par recombinaison homologue, dans une lignée de packaging, entre un vecteur navette apportant partie gauche du génome viral et l'ADN d'un adénovirus linéarisé, apportant la partie droite du génome viral
4 1 Constructi on des vecteurs navette
Le vecteur navette construit porte une cassette d'expression constituée d'un promoteur apoAII et d'un acide nucléique codant pour une molécule sécrétée l'apolipoprotéine Al (apoAl) Ce vecteur apporte en outre la partie gauche du génome viral, c'est-à-dire l'ITR gauche et un région permettant la recombinaison.
Les vecteurs navette servant à la construction de l'adénovirus ont été construits à partir d'un plasmide pC05 (W096/22378), d'un plasmide plC20H-Alb-U-AI-SV40 qui contient le premier intron de l'apoAl et I' ADNc de l'apoAl sous contrôle d'un promoteur de l'albumine de Rat, et d'un plasmide pBLAIICATδ qui contient un promoteur apoAII tel que décrit dans l'exemple 1 ou un variant selon l'exemple 2.
a) Constuction de plC20H-Alb-U-AI-SV40
Les deux amorces GCG GCC GCT TCG AGC AGA CAT GAT AA (SEQ ID n°9) et CGA TCT CAA GGG CAT CGG TCG ACG G (SEQ ID n°10) ont permis l'amplification des séquences de polyadenylation de SV40 dans l'orientation tardive. L'amorce 5' introduit un site Notl en amont de cette séquence et l'amorce 3' introduit un demi site Nrul. Le fragment PCR obtenu est traité par la klenow pour obtenir des bout francs et clone dans le vecteur plC20H clivé par Smal et Nrul, dans l'orientation qui régénère un site Nrul. Le plasmide résultant est appelé plC20H-SV40.
La construction pXL2336 contenant un minigene de l'apolipoprotein Al a été décrite précédemment (WO94/25073). Un fragment PCR est amplifié à partir de pXL2336 grâce aux amorces GGG ATC CGC TGG CTG CTT AGA GAC TGC (SEQ ID n°11 ) et GGC GGC CGC CGG GAA GGG GGG CGG CGG (SEQ ID n°12) qui introduisent respectivement un site BamHI en amont du premier exon de l'ApoAl et un site Notl en aval de la séquence codante de l'ApoAI. Le fragment PCR est clone dans pCRIl (Invitrogen) et sa séquence vérifiée. Le fragment BamHI/Notl contenant l'ADNc et le premier intron de l'apoA-l est ensuite clone aux mêmes sites du plasmide plC20H-SV40 pour générer le plasmide plC20H-AI-SV40.
Les oligonucléotides CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAG AAT AAA CGC TCA ACT GTG GC (SEQ ID n°13) et CGT GGC CAC AGT TGA GCG TTT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG AAC AAG CA (SEQ ID n°14) sont ensuite hybrides entre eux et clones au site Dsal de plC20H-AI- SV40 de façon à ce que le site Pmll créé lors de ce clonage soit du coté de l'intron et que le site Dsal soit régénéré à l'autre extrémité. Ces oligonucléotides permettent d'introduire un fragment de la partie 5' non traduite de l'ARN messager de la β Globine. Le plasmide obtenu est appelle plC20H-U-AI-SV40.
Enfin, le fragment Hindlll/Bglll du promoteur de l'albumine de Rat décrit par F. Troche et al (Mol. Cel. Biol, 1989, 4759-4766) traité par la Klenow a été clone dans l'orientation adéquate dans le plasmide plC20H-U-AI-SV40 clivé par BamHI et traité également par la klenow pour générer le plasmide plC20H-Alb-U-AI-SV40.
b) Construction des vecteurs navette
Les oligonucléotides CGT GGC AGG CAG CAG GAC GCA CCT CCT TCT CGC AGT CTC TAA GCA GCC TTC GAA GCA TG (SEQ ID n°15) et CTT CGA AGG CTG CTT AGA GAC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT GCC TGC CA (SEQ ID n°16) sont hybrides entre eux ce qui crée une extrémité cohesive Sphl et une extrémité cohésive Hpall. Ce fragment est introduit dans une ligation trois partenaires avec un fragment Hpall/Dralll (476/1518) du plasmide plC20HAIb-U-AI-SV40 contenant le cDNA de l'ApoAl et un fragment Dralll/Sphl (1518/239) du même plasmide. Le plasmide résultant est appelle pXL2699. Cette construction crée un site BstBI compatible avec Clal en amont du fragment ADNc + intron de l'apoAl. Le fragment BstBI / Sali de pXL2699, contenant l'ADNc de l'ApoAl, est clone dans le plasmide pC05 clivé par Clal et Sali. Le plasmide résultant est appelé pCO5-U-AI-SV40.
Le promoteur apoAII sélectionné (promoteur complet ou variants) est excisé du plasmide pBLAIICAT5 correspondant sous forme d'un fragment Hindlll- BamHI, clone après traitement à la Klenov au site EcoRV du plasmide pC05- U-AI-SV40 pour générer les vecteurs navette pXLPromAII/AI. Les vecteurs suivants sont ainsi obtenus :
Figure imgf000030_0001
Ces vecteurs sont validés pour l'expression de l'apoAl humaine par transfection transitoire dans les lignées 293 ou Cos1. Il est entendu que l'acide nucléique codant pour l'apolipoprotéine Al humaine peut être aisément remplacée dans les vecteurs navette par tout autre acide nucléique codant pour une molécule d'intérêt.
4.2. Construction des adénovirus
Les adénovirus ont été produits par recombinaison homologue, après co- transfection, dans les cellules appropriées, de deux fragments d'ADN, l'un apportant la partie gauche du génome du virus recombinant (vecteur navette décrit dans l'exemple 4.1., possédant une délétion dans la région E1 ), l'autre apportant la partie droite du génome du virus recombinant (possédant éventuellement une délétion dans la région E4 et/ou E3).
a) Construction d'adénovirus défectifs pour la région E1
L'adénovirus Ad-AII/AI a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'ADN du virus Ad-RSV-βGal et le vecteur navette pXL AII/AI, selon le protocole suivant : le vecteur navette pXL AII/AI linéarisé par BstXI et l'ADN du virus Ad-RSV-βGal linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants générés ont ensuite été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456), ou par chromatographie (FR96 08164). L'adénovirus Ad-AII/AI peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol. La structure du génome recombinant est présentée sur la figure 5.
La même stratégie est suivie pour construire les adénovirus portant les différentes formes de promoteurs Ail, en partant des vecteurs navettes décrits dans l'exemple 4.1.
b) Construction d'adénovirus défectifs pour les régions E1 et E4
Les cellules IGRP2 (Yeh et al., J. Virol 70 (1996) 559), capables de transcomplémenter les fonctions E1 et E4 de l'adénovirus, sont cotransfectées par 5 mg du vecteur navette digéré par BstXI , et 10 mg de l'ADN du virus apportant la délétion fonctionnelle de la région E4 (par exemple Ad2dl808, Ad5dl1004, Ad5dl1007 ou Ad5dl1014) digéré par l'enzyme Clal . Après apparition de l'effet cytopathique, les virus sont purifiés par au moins deux cycles consécutifs d'étalement en solide pour la formation de plages sur IGRP2. Les plages correspondant à l'infection du virus recherché (analyse de l'ADN démontrant la double délétion E1 et E4) sont alors amplifiées par des cycles d'infection consécutives. Des stocks à titre élevés sont préparés par purification sur gradient de chlorure de césium. Les virus sont conservés à -80°C selon les techniques classiques de l'homme de l'art.
Exemple 5 : Activité in vivo des adénovirus recombinants
Cet exemple décrit les propriétés fonctionnelles des adénovirus de l'invention, après administration in vivo.
5 x 109 pfu des virus Ad(ApoAllprom-ApoAI-SV40 et Ad(RSV-ApoAI-bGH) ont été injectés respectivement à 8 et 3 souris C57bl6. Quatre des souris injectées avec le Ad(ApoAllprom-ApoAI-SV40) on été nourries avec du fenofibrate à la dose de 0,5% (p/p) mélangée à leur alimentation. Les concentrations plasmatiques en apoA-l humaine et HDL-cholesterol ont été mesurées chaque semaine. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 6. Les niveaux d'apoA-l plasmatique sont inférieurs au seuil de détection (10 mg/dl) pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAI-SV40), 81 ±0.17 mg/dl pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAI- SV40) traitées au fenofibrate et 84115 mg/dl pour les souris injectées aves le virus Ad(RSV-ApoAI-bGH) ce qui montre une induction d'au moins 8 fois du promoteur de l'apoA-ll dans ces conditions.
Le niveau de HDL-cholesterol n'est pas modifié pour les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAI-SV40) (52±2 mg/dl) : niveau identique à des animaux non traités. En revanche, le niveau de HDL-cholestérol est augmenté au jour 7 jusqu'à 88114 mg/dl et 121122 mg/dl pour respectivement pour les souris injectées aves le virus Ad(RSV-ApoAI-bGH) et les souris injectées aves le virus Ad(ApoAllprom-ApoAI-SV40) traitées au fenofibrate (figure 6).
Ces résultats démontrent in vivo le caractère fort, inductible et hépatospécifique des promoteurs de l'invention dans un contexte adénoviral. Combinées aux propriétés remarquables de transfert de gènes des adénovirus, les vecteurs de l'invention présentent des performances très avantageuses pour le transfert et l'expression de gènes.
LISTE DE SEQUENCES
SEQ ID n° 1 : Séquence du promoteur apoAII humain (-911 +29).
AGCTTCTGAT ATCTATTTAA CTGATTTCAC CCAAATGCTT TGAACCTGGG -911 -901
AATGTACCTC TCCCCCTCCC CCACCCCCAA CAGGAGTGAG ACAAGGGCCA
GGGCTATTGC CCCTGCTGAC TCAATATTGG CTAATCACTG CCTAGAACTG -811
ATAAGGTGAT CAAATGACCA GGTGCCTTCA ACCTTTACCC TGGTAGAAGC
-734 -716 ÇTCTTATTCA CCTCTTTTCC TGCCAGAGCC CTCCATTGGG AGGGGACGGG -711 CGGAAGCTGT TTTCTGAATT TGTTTTACTG GGGGTAGGGT ATGTTCAGTG
ATCAGCATCC AGGTCATTCT GGGCTCTCCT GTTTTCTCCC CGTCTCATTA -611
CACATTAACT CAAAAACGGA CAAGATCATT TACACTTGCC CTCTTACCCG
ACCCTCATTC CCCTAACCCC CATAGCCCTC AACCCTGTCC CTGATTTCAA -511 TTCCTTTCTC CTTTCTTCTG CTCCCCAATA TCTCTCTGCC AAGTTGCAGT
AAAGTGGGAT AAGGTTGAGA GATGAGATCT ACCCATAATG GAATAAAGAC
-411
ACCATGAGCT TTCCATGGTA TGATGGGTTG ATGGTATTCC ATGGGTTGAT
ATGTCAGAGC TTTCCAGAGA AATAACTTGG AATCCTGCTT CCTGTTGCAT
-311
TCAAGTCCAA GGACCTCAGA TCTCAAAAGA ATGAACCTCA AATATACCTG AAGTGTACCC CCTTAGCCTC CACTAAGAGC TGTACCCCCT GCCTCTCACC -211 CCATCACCAT GAGTCTTCCA TGTGCTTGTC CTCTCCTCCC CCATTTCTCC
AACTTGTTTA TCCTCACATA ATCCCTGCCC CACTGGGCCC ATCCATAGTC -111
CCTGTCACCT GACAGGGGGT GGGTAAACAG ACAGGTATAT AGCCCCTTCC
TCTCCAGCCA GGGCAGGCAC AGACACCAAG GACAGAGACG -11 +1 +10
SEQ ID n° 2 : Séquence de la région J
TCAACCTTTA CCCTGGTAG
SEQ ID n°3 : ATCGAAGCTT CTGATATCTA TTTAACTGAT SEQ ID n°4
CGTCTCTGTC CTTGGTGTCT GGATCCATCG
SEQ ID n°5 GACTCTAGATGTACCCCCTTA
SEQ ID n°6
GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG
SEQIDn°7
gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa
SEQ ID n°8 gatctCTACCAGGGTAAAGGTTGAag
SEQ ID n°9
GCG GCC GCT TCG AGC AGA CAT GAT AA
SEQIDn°10 CGA TCT CAA GGG CAT CGG TCG ACG G
SEQIDn°11
GGG ATC CGC TGG CTG CTT AGA GAC TGC
SEQ ID n°12
GGC GGC CGC CGG GAA GGG GGG CGG CGG
SEQIDn°13
CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAG AAT AAA CGC TCA ACT GTG GC
SEQ ID n°14 CGT GGC CAC AGT TGA GCG TTT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG AAC AAG CA
SEQIDn°15
CGT GGC AGG CAG CAG GAC GCA CCT CCT TCT CGC AGT CTC TAA GCA GCC TTC GAA GCA TG
SEQIDn°16
CTT CGA AGG CTG CTT AGA GAC TGC GAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT GCC TGC CA

Claims

REVENDICATIONS
1. vecteur recombinant pour l'expression inductible et hépatospécifique d'une molécule caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression constituée d'un acide nucléique codant pour ladite molécule placé sous contrôle du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain.
2. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur comprend les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -680; -573 à -255 et -126 à -33 du promoteur du gène de l'apolipoprotéine AH humain.
3. Vecteur recombinant selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'extrémité 3' du promoteur est comprise entre les résidus +5 et +35, plus préférentiellement +10 et +30 du gène apoAII.
4. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'extrémité 5' du promoteur est comprise entre les résidus -950 à -905, de préférence -925 à -910 du gène apoAII.
5. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur comprend la séquence SEQ ID n° 1 (résidus -91 1 à +29).
6. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 , 3 ou 4 caractérisé en ce que le promoteur comprend les éléments de régulation localisés au niveau des nucléotides -903 à -680, ou -903 à -720, et -126 à -33 du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain, mais pas les éléments intermédiaires localisés au niveau des nucléotides -573 à -255.
7. Vecteur recombinant selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur comprend une délétion dans la région comprise entre les résidus -
670 et -210, de préférence une délétion des résidus - 653-210.
8. Vecteur recombinant selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur comprend une délétion dans la région comprise entre les résidus
-710 et -150.
9. Vecteur recombinant selon la revendication 8 caractérisé en ce que le promoteur comprend une délétion des résidus - 708-210.
10. Vecteur recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le promoteur comprend une répétition de motifs J.
11. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que le promoteur comprend de 2 à 5 motifs J.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la répétition de motifs J est positionnée en 5' du promoteur.
13. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la répétition de motifs J est positionnée en 3' du promoteur.
14. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que la répétition de motifs J est insérée dans la séquence du promoteur.
15. Vecteur recombinant selon la revendication 10 caractérisé en ce que le promoteur comprend une région régulatrice composée d'un ou plusieurs motifs J et une région promotrice hépatospécifique.
16. Vecteur recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce que la région promotrice hépatospécifique est composée d'un promoteur hépatospécifique choisi parmi le promoteur de la sérum albumine, le promoteur de l'apolipoprotéine Al, le promoteur de l'apolipoprotéine Cs, le promoteur de l'apolipoprotéine B100, le promoteur de la chaine gamma du fibrinogène, le promoteur du gène de la phénylalanine hydroxylase humaine, le promoteur du gène de l'AMBP, le promoteur du gène du facteur X et le promoteur de l'α-antitrypsine.
17. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendication 1 à 16 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant.
18. Adénovirus recombinant selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion dans la région E1 de son génome.
19. Adénovirus recombinant selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion des régions E1a et E1 b.
20. Adénovirus recombinant selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion dans la région E4 de son génome.
21. Adénovirus recombinant selon la revendication 20 caractérisé en ce que la délétion dans la région E4 affecte l'ensemble des phases ouvertes.
22. Adénovirus recombinant selon les revendications 18 à 21 caractérisé en ce que la cassette d'expression est insérée au niveau de la région E1 , en remplacement des séquences délétées.
23. Adénovirus recombinant selon les revendications 18 à 21 caractérisé en ce que la cassette d'expression est insérée au niveau de la région E4, en remplacement des séquences délétées.
24. Adénovirus recombinant selon les revendications 18 à 21 caractérisé en ce que la cassette d'expression est insérée au niveau de la région E3.
25. Vecteur recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que la molécule est une protéine thérapeutique.
26. Vecteur recombinant selon la revendication 25 caractérisé en ce que la molécule thérapeutique est une protéine sécrétée dans la circulation.
27. Vecteur recombinant selon la revendication 25 caractérisé en ce que la protéine thérapeutique est choisie parmi les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques, les apolipoprotéines, les suppresseurs de tumeurs et les facteurs impliqués dans la coagulation.
28. Vecteur adénoviral comprenant une cassette d'expression constituée d'un acide nucléique codant pour une molécule d'intérêt placé sous contrôle du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain.
29. Variant du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain comprenant une répétition de motifs J.
30. Variant selon la revendication 29 caractérisé en ce qu'il comprend de 2 à 5 motifs J.
31. Variant selon la revendication 29 ou 30 caractérisé en ce que les motifs J additionnels sont positionnés en 5' du promoteur.
32. Variant selon l'une des revendications 29 à 31 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion dans la région comprise entre les résidus - 710 et -150 du promoteur natif.
33. Variant du promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain caractérisé en ce qu'il comprend une région régulatrice composée d'un ou plusieurs motifs J du promoteur de l'apolipoprotéine Ail et une région promotrice hépatospécifique issue d'un autre promoteur.
34. Variant selon la revendication 33 caractérisé en ce la région promotrice hépatospécifique est composée d'un promoteur hépatospécifique autre que le promoteur du gène de l'apolipoprotéine Ail humain.
35. Variant selon la revendication 33 caractérisé en ce la région promotrice hépatospécifique est composée d'un promoteur ubiquitaire couplé à un élément enhanceur conférant une expression hépatospécifique.
36. Cellule modifiée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 28.
37. Composition pharmaceutique comprenant un adénovirus selon la revendication 17 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
38. Procédé de production d'une protéine recombinante désirée comprenant:
- l'infection ou la transfection d'une population cellulaire avec un vecteur recombinant selon la revendication 1 ou un génome viral comprenant une cassette d'expression codant pour ladite protéine désirée,
- la culture de ladite population cellulaire recombinante, et,
- la récupération de ladite protéine produite.
39. Utilisation d'un adénovirus selon la revendication 17 pour préparer un modèle animal non-humain transgénique.
40. Composition comprenant un vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 28 et un activateur de PPAR, en vue d'une utilisation simultanée ou étalée dans le temps.
41. Composition selon la revendication 40 caractérisée en ce que le vecteur est un adénovirus recombinant selon la revendication 17.
42. Composition selon la revendication 40 ou 41 caractérisée en ce que l'activateur de PPAR est un activateur de PPARα.
43. Composition selon la revendication 42 caractérisée en ce que l'activateur de PPARα est choisi parmi les fibrates et les composés augmentant l'expression de facteurs de transcription se fixant sur les sites J.
44. Composition selon la revendication 43 caractérisée en ce que le fibrate est choisi parmi l'acide fibrique, le gemfibrozil, le bezafibrate, le ciprofibrate, le clofibrate, le fenofibrate et le clinofibrate.
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