JP2003526368A - 炎症により誘導可能なハイブリッドプロモーター、それらを含有するベクター、及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子発現調節に関し、特に、炎症条件下における細胞、組織又は器官内で、導入遺伝子の転写を活性化することができる構築物の使用に基づく。本発明のプロモーターは、好ましくは、ａ）ＰＰＡＲに対する応答因子、及びｂ）ＰＬＡ２ｓＩＩＡ遺伝子のプロモーターの全て又は一部を含む。本発明は、該プロモーターを含むベクター、細胞及び組成物、並びに、インビトロ、エクスビボ又はインビボでの遺伝子の発現調節のためのそれらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、生物学の分野に関する。本発明は、特に、遺伝子発現調節の分野に
関し、より具体的には、導入遺伝子発現の薬理学的調節のための新規な系の開発
を記載する。本発明は、主に、炎症状態にある細胞、組織、又は器官において導
入遺伝子の転写を活性化することができる構築物の使用に関する。本発明は、in
vitro、ex vivo、又はin vivoにおける、例えば軟骨細胞における核酸の発現の
効率的な調節のための、新規な組成物、構築物、及び方法を記載する。例えば実
験分野、臨床分野、治療、及び診断における多くの適用が、本発明から派生する
。

【０００２】 導入遺伝子発現のレベル及び持続期間を制御することは、多くの適用において
必要である。遺伝子治療においては、in vitroにおける組換えタンパク質の作製
、トランスジェニック動物の構築、遺伝子の効果又はタンパク質の生物学的利用
能の研究等は、遺伝子発現の適切な制御が、効果を改良するために利用されうる
状況にある。

【０００３】 より具体的には、遺伝子治療の目的は、ある個体に欠損しているか、又は特定
の病理に関して治療的に重要である遺伝子（又は核酸）を発現させることである
。ベクター化（vectorisation）の手順の他に、そのような遺伝子の発現は、メ
ッセンジャーＲＮＡの合成を得るため、従ってタンパク質合成を得るために必要
なポリメラーゼＲＮＡ及び転写因子を固定するプロモーターによる誘導を必要と
する。遺伝子治療においては、組織において遺伝子を発現させるため、ウイルス
プロモーター又は非誘導可能真核生物が頻用される。この手法は、実施が容易で
あるが、環境及び外的刺激の関数としての導入遺伝子の発現の調節を可能にはし
ない。さらに、ウイルスプロモーターにより指図される遺伝子は、ターゲティン
グされることなく、ベクターが侵入しているであろう全ての細胞において無差別
に発現されよう。最後に、実験者は、in vitroにおいて見出される発現レベルと
比較して低い、in vivoにおけるウイルスプロモーターの発現レベルに直面する
場合がある。

【０００４】 導入遺伝子転写を促進する配列と結合する生体異物分子により活性化される種
々の人工転写調節因子が、先行技術において設計されている。

【０００５】 そのような調節因子の第一の例は、Ｅ．コリ（coli）のＬａｃリプレッサーを
、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６トランスアクチベーター領域と融
合させることにより構築された。そのような調節因子には、イソプロピルｂ−Ｄ
−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により活性化されうる型、及びＩＰＴＧにより
不活性化される型、という２つの型が存在する（Baim S et al., Proc Natl Aca
d Sci USA, 88(1991)5072-5076; Labow M et al., Mol Cell Biol 10(1990)3343
-3356）。

【０００６】 さらなる系は、Ｅ．コリのＴｅｔリプレッサーを、ＨＳＶのＶＰ１６トランス
アクチベーター領域と融合させることにより構築された。これらの調節因子にも
、テトラサイクリン又はその誘導体により活性化されうる型、及び同分子により
不活性化される型、という２つの型が存在する（Gossen M and Bujard H,Proc N
atl Acad Sci USA, 89,(1992)5547-5551; Gossen M et al., Science 268(1995)
1766-1769）。

【０００７】 さらなる系は、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ
のための結合領域を、プロスタグランジンのためのヒト受容体のリガンドのため
の結合領域、及びＨＳＶのＶＰ１６トランスアクチベーター領域と融合させるこ
とにより構築されており、この型は、ＲＵ４８６のようなプロゲステロン類似体
により活性化される（Wang Y et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91(1994)8180-
8184）。エクジソン及びこのステロイドホルモンの類似体により活性化される、
ショウジョウバエ（drosophila）のエクジソン受容体とＨＳＶのＶＰ１６トラン
スアクチベーター領域との融合も、記載されている（No D et al., Proc Natl A
cad Sci USA, 93(1996)3346-3351）。さらなる系は、ある種の免疫抑制分子（シ
クロスポリンＡ、ラパマイシン及びその誘導体）の、ある種の細胞タンパク質の
会合を促進する能力を活用している。この場合、転写調節因子は２つのタンパク
質サブユニットにより構成され、第一は、キメラＤＮＡ結合領域と３コピーのヒ
トタンパク質ＦＫＢＰとを融合させることにより形成され、第二は、ヒトタンパ
ク質ＦＲＡＰのラパマイシン結合領域と、ヒトＮＦｋＢのｐ６５サブユニットの
トランスアクチベーター領域とを融合させることにより形成されうる。この転写
調節因子は、２つのサブユニットの二量体化を可能にするラパマイシンにより活
性化される（Rivera V et al., Nat Med, 2(1996)1028-1032）。

【０００８】 これらの系は、たとえある種の組織において充分なレベルの調節を与えるとし
ても、使用条件を制限する多数の欠点を有している。そのような転写調節因子は
、ヒトにとって異物のタンパク質である。それらは、細菌、ウイルス、酵母、も
しくは昆虫に由来するタンパク質断片より構成されているか、又はタンパク質領
域がヒト由来である場合でも、それらの接合はヒトにとって外来性の配列を作出
する。従って、そのようなタンパク質領域は、その生体異物転写調節因子の制御
下で目的遺伝子を発現している細胞の破壊を引き起こす、細胞障害性免疫反応を
誘導し、従って導入遺伝子の発現を中止させる場合がある。この状況は、治療用
遺伝子の反復投与を必要とする場合があり、特に、これが、必ずしも効果的では
ない外傷性外科的介入を含む場合、特に、治療用遺伝子のためのベクターが、最
初の注射が免疫応答を引き起こすウイルスである場合、それは主要な短所を構成
する。さらに、先行技術の調節系により観察された発現レベルは、必ずしも充分
でない。

【０００９】 本発明は、細胞における制御された核酸発現のための新規な改良された系を記
載する。本発明は、主要な炎症メディエーター及び外因性化合物により誘導され
うるハイブリッドプロモーターを提唱する。このプロモーターは、好ましくは、
炎症過程中に合成されたメディエーターに応答して、炎症巣である組織における
遺伝子の発現をもたらす。このプロモーターの主要な利点は、遺伝子−薬物の発
現を、炎症の強度の関数としてモデュレートすることが可能であるという点にあ
る。さらに、遺伝子の発現は、ＮＳＡＩを採用した場合に強化されうる。従って
、本発明者らは、遺伝子治療が企図される多数の炎症系へと応用されうる手法を
取得した。

【００１０】 より具体的には、本発明は、ＰＰＡＲ応答モジュールと、炎症中に産生される
サイトカインに応答するためのモジュールとを含むハイブリッドプロモーターの
構築にある。より具体的には、この第二のモジュールは、炎症条件下で、ある種
のヒト細胞、特に軟骨細胞において発現されるIIＡ−１型非膵臓分泌性ホスホリ
パーゼＡ２（ＰＬＡ２ｓ）遺伝子のプロモーターに由来する配列を含む。これら
２つのモジュールの組み合わせは、外因性の抗炎症薬又はメディエーターにより
強化されうる、炎症条件における特異的な遺伝子の発現を保証するプロモーター
の生成を可能にする。実施例に示されるように、このハイブリッドプロモーター
は、好ましくは、低い基底活性を有するが、誘導状態においては極めて高い活性
を有する。従って、この型のプロモーターは、本明細書の他の箇所で詳細に説明
されるように、抗炎症活性を有する産物の発現に特に適している。本発明のプロ
モーターは、炎症成分が存在する種々の病理学的状況、特に関節症における、関
節組織、特に軟骨細胞における遺伝子の発現にとって特に有利である。

【００１１】 関節症とは、様々な程度の廃疾を引き起こす軟骨破壊を伴う老年性疾患である
（Chevalier X, 1998）。この疾患の治療は、その頻度、及びそれが引き起こす
能力障害のため、現在、公衆衛生における優先事項と考えられている。生理病理
学的観点からは、たとえ開始メカニズムが未だ十分に理解されていなくも、II型
コラーゲン及びプロテオグリカンに富む細胞外基質と、基質の合成を担う、関節
における唯一の細胞型、関節軟骨細胞とから構成される組織、軟骨が、関節破壊
を担う組織標的である。軟骨細胞は、プロテアーゼ（異化活性）のみならず、増
殖因子及び天然プロテアーゼ阻害剤（同化活性）も分泌する。生理学的に、これ
らの活性の間には平衡（軟骨ホメオスタシス）が存在する。関節症においては、
プロテアーゼ合成（本質的には、メタロプロテアーゼ）の刺激、及びメタロプロ
テアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ又はティッシュインヒビターオブメタロプロテアーゼ
）の合成の阻害のため、同化活性の減損の方向へと平衡が崩壊する（Lefebvre V
et al.1997; Dean J et al.1990; Hornebeck W, 1990）。これらの合成の修飾
は、軟骨細胞により産生される、関節症又は慢性関節リウマチに罹患した患者の
滑液中に大量に見出される炎症誘発性メディエーター、サイトカイン（ＩＬ−１
、ＴＮＦ）、及び脂質メディエーター、特にプロスタグランジンＥ２の存在によ
る。このプロスタグランジンは、増殖因子と同様に、コラーゲン合成を低濃度で
は刺激するが、高濃度では阻害する（Di Battista J A et al.1996）。

【００１２】 本発明は、関節症のような関節病理における治療用遺伝子の発現に特に適した
ハイブリッド転写プロモーターを提唱する。さらに、本発明は、軟骨細胞におけ
る目的遺伝子のトランスファーターゲティング（transfer targeting）及び／又
は発現を保証する構築物も記載し、さらに、この型の適用にとって有利な構築物
の特性を改良する。

【００１３】 第一の面において、本発明は、より具体的には、ａ）ＰＰＡＲ応答因子と、ｂ
）ＰＬＡ２ｓ IIＡ遺伝子プロモーターの全部又は一部とを含むハイブリッドプ
ロモーターを提供する。

【００１４】 本発明は、この型の構築物が、調節されており、かつ特異的（又は優先的）な
炎症状況の性質を改変することなく、発現の活性に対する相乗的な効果を与える
ことの証明にある。本発明は、該プロモーターを含むベクター、プラスミド、及
び組成物、並びにin vitro、ex vivo、又はin vivoにおける遺伝子発現のための
それらの使用も記載する。

【００１５】 従って、本発明のハイブリッドプロモーターの第一の因子は、ＰＰＡＲ応答因
子を含む。ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体）は、ステロイドホ
ルモン受容体、並びに甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及びビタミンＤの受容体
を含む核受容体のスーパーファミリーに属する（Schoonjans K et al.1996）。
ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、及びＰＰＡＲγという３つのアイソフォ
ームで存在する。ＰＰＡＲは、標的遺伝子のプロモーターの中の特異的な配列（
ＰＰＲＥ配列）と結合し、それら遺伝子の発現を誘導する。

【００１６】 従って、ＰＰＡＲ応答因子（ＰＰＲＥ、ペルオキシソーム増殖剤応答因子）は
、ＰＰＡＲを固定し、ＰＰＡＲと結合し、次いで近傍の核酸領域、特に本発明の
ＰＬＡ２ｓに由来する領域へとシグナルを媒介することができる核酸の領域であ
る。より具体的には、本発明のＰＰＡＲ応答因子は、ＰＰＡＲ（ＰＰＡＲα、Ｐ
ＰＡＲβ、又はＰＰＡＲγのいずれであってもよい）と結合することができる核
酸領域である。さらに好ましくは、それは、ＰＰＡＲα又はＰＰＡＲγと結合す
ることができる核酸である。本発明を実施するため、ＰＰＡＲ応答因子は、より
具体的には、ＰＰＡＲ結合部位を１個以上含む。種々のヒトプロモーター内の結
合部位（例えば、ＤＲ１コンセンサス部位、アポリポソームタンパク質ＡII遺伝
子）のような、そのような結合部位は、先行技術において記載されている。その
ような部位は、下記のように、人工的に構築され、ＰＰＲＥ特性に関して試験さ
れてもよい。

【００１７】 本発明の特定の実施態様において、ＰＰＡＲ応答因子は、ＣＡＡＡＡＣＴＡＧ
ＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡ（配列番号１）又はこの配列の機能的変異体を有する部
位を１個以上含む。配列番号１は、ＤＲ１コンセンサス領域に相当する。

【００１８】 「機能的変異体」という用語は、前記のようなＰＰＲＥ特性、即ち、主にはＰ
ＰＡＲと結合する能力を保存している、任意の修飾された配列をさす。修飾は、
考慮中の配列の中の１個以上のヌクレオチドの付加、突然変異、欠失、及び／又
は置換を含みうる。これらの修飾は、定方向突然変異誘発のような従来の分子生
物学的方法により、又は、より実用的には、合成装置における人工的な配列の合
成により、導入されうる。一般的に、変異体は、示された初期配列の中の残基の
少なくとも５０％を保存している。より好ましくは、変異体は、考慮中の配列の
中のヌクレオチド８個未満に影響を与える修飾を有する。次いで、得られた変異
体は、ＰＰＲＥ活性について試験される。この特性は、種々の様式で、特に （ｉ）（例えば、無細胞試験において）試験配列をＰＰＡＲと接触させること、
及び（例えば、ゲルシフトにより）複合体の形成を検出することにより、 （ii）試験配列を、最小プロモーターとレポーター遺伝子とを含む発現カセット
に挿入すること、カセットを細胞に導入すること、並びにＰＰＡＲ及びＰＰＡＲ
リガンドの存在下及び非存在下でレポーター遺伝子の発現を（必要であれば、ア
ッセイにより）検出することにより、 （iii）例えば、核酸とタンパク質との相互作用を証明することができる、当業
者に既知の他の任意の技術により、確認されうる。

【００１９】 本発明に関して、例えば前記（ii）において測定された活性が、配列番号１の
配列を含む部位で測定された活性の、好ましくは少なくとも５０％、より具体的
には少なくとも７５％である場合に、変異体は、機能性であると見なされる。本
発明に関して、ＰＰＡＲ結合部位の機能的変異体は、例えば、参照により本明細
書に組み込まれるJuge-Aubryら（J. Biol. Chem 272(1997)25252)及びNakshatri
ら（NAR 26(1998)2491）に記載されている。

【００２０】 本発明に係るＰＰＡＲ応答因子の具体例は、実施例に記載されたような因子（
ＤＲ１）２１７（配列番号２）、（ＤＲ１）２ ２１（配列番号３）、及び（Ｄ
Ｒ１）２ ３１（配列番号４）、又はそれらの機能的変異体に代表される。

【００２１】 さらなる変異体は、配列番号１の残基８〜２０を含む、配列番号１の配列の断
片である。

【００２２】 本発明に係る配列番号１〜４の配列は、ＰＰＡＲα及びγに対して本質的に応
答性であるＰＰＲＥを代表する。実施例に示されるように、これらの配列は、特
に、結合部位の特定の配置と結合したＰＰＡＲによる高い誘導可能性を有する。
これに関して、本発明の特定の面は、配列番号２〜４から選択される配列を含む
核酸にもある。

【００２３】 本発明の特定の実施態様において、ＰＰＡＲ応答因子は、ＰＰＡＲβによる活
性化に応答するヒトアポＡIIのＪプロモーター部位（ヌクレオチド−７３４〜−
７１６）、又はその配列の機能的変異体を１個以上含む。

【００２４】 前述のように、本発明に係る組成物において、ＰＰＡＲ応答因子は、ＰＰＡＲ
結合部位を複数個含みうる。それは、同一部位の繰り返しであってもよいし、又
は異なる部位の組み合わせであってもよいが、反復が好ましい。より具体的には
、応答因子は、結合部位を最大３０個、好ましくは３〜２０個、より好ましくは
１〜５個含む。本発明の好ましい実施態様は、ＤＲ１結合部位を２個含む構築物
であり、実施例に示された結果は、特に軟骨細胞における誘導及び発現レベルに
関するそのような構築物の有意な特性を示している（配列番号２〜４）。

【００２５】 本発明のハイブリッドプロモーターを作製するため、ＰＰＡＲ応答因子（ａ）
は、ＰＬＡ２ｓ IIＡ−１プロモーターの全部又は一部（因子ｂ））と会合させ
られる。

【００２６】 非膵臓分泌性ホスホリパーゼＡ２は、インターロイキン−１ベータにより活性
化されるタンパク質であり、炎症メディエーター、特に脂質メディエーター（プ
ロスタグランジンＥ２）の産生をもたらす。特に、プロスタグランジンＰＧＥ２
は、リン脂質からアラキドン酸を遊離させる非膵臓分泌性ホスホリパーゼＡ２（
ＰＬＡ２Ｓ）（Nevalainen T J et al. 1993; Hulkower K J 1997）及びアラキ
ドン酸をＰＧＨ２へと変換する誘導型シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）（Am
in A R, 1997; Geng Y et al. 1995; Knott et al. 1994）のインターロイキン
−１（ＩＬ−１）による活性化に由来する。次いで、ＰＧＨ２が、ＰＧＥシンタ
ーゼによりＰＧＥ２へと変換される。ヒト細胞、特に軟骨細胞においては、２つ
の型のホスホリパーゼＡ２が検出されている。非膵臓分泌性Ａ２ホスホリパーゼ
（ＰＬＡ２Ｓ）は、大量に合成され、炎症性滑液中に分泌される１４kDaのタン
パク質である（Seilhammer J J et al., 1989）。細胞質ホスホリパーゼＡ２（
ＰＬＡ２ｃ）は、８５kDaの細胞質タンパク質であり、その活性化は、ＭＡＰキ
ナーゼによるリン酸化、及び膜への移行を介して活性化される（Clark J D et a
l.1991）。ＩＬ−１は、軟骨細胞において、ＰＬＡ₂ｃ遺伝子の発現に影響を与
えることなく、ＣＯＸ−２遺伝子及びＰＬＡ２ｓ遺伝子の発現を誘導する（Bere
nbaum F et al., 1994; Jacques C et al., 1997）。関節及び血清へと分泌され
るＰＬＡ２の量は、炎症の程度、特に軟骨細胞の場合、関節症の程度と相関して
いる（Pruzanski W et al., 1994; Lin M et al., 1996）。ＰＬＡ２ｓとＣＯＸ
−２との共同作用は、ＩＬ−１ベータ刺激下でのプロスタグランジンＰＧＥ２の
延長された産生（＞４８時間）をもたらし（Bingham C O et al., 1996; Kuwata
H et al., 1998）、ＰＬＡ２ｃ及び構成性シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−１は
、初期応答を担っている。本発明者らの最近の研究は、ＰＧＥ２合成と、軟骨細
胞膜と結合したＰＬＡ２Ｓの活性の程度との相関を明らかにした（Jacques C et
al., 1997）。

【００２７】 本発明は、特に治療適用における、目的核酸の発現を調節するための、ＰＬＡ
２ｓ遺伝子プロモーターの全部又は一部の使用を提唱する。特に、本発明は、炎
症状況にある細胞において活性である調節型ハイブリッドプロモーターの構築の
ための、ＰＬＡ２ｓ IIＡプロモーターの全部又は機能的な一部の使用を提唱す
る。この目的のため、本出願人らは、ヒトＰＬＡ２ｓ IIＡ遺伝子の第一エキソ
ンの２４７塩基対上流の断片（配列番号５）が、初代培養ウサギ軟骨細胞におい
て、ＩＬ−１βによるＣＡＴレポーター遺伝子の活性の６〜８倍の刺激を担うこ
とを示した。このプロモーターの中の３つの調節領域が、特徴決定された。近位
領域（−８５／−１１４）は基底転写活性を保証し、Ｓｐ１因子と結合し；遠位
領域（−２４７／−２１０）は、ＮＦ１ファミリーのメンバー及びグルココルチ
コイド受容体と結合し、転写開始部位を基準として−１９８／−１９０位の間に
おけるＣ／ＥＢＰ因子の固定を安定化する。Ｃ／ＥＢＰ因子のファミリーは、Ｃ
／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδという３つの主要な活性化メンバ
ーを含む。因子Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδは、炎症誘発性サイトカインによ
り転写レベル及び転写後レベルで活性化される。それらは、軟骨細胞において発
現されるが、Ｃ／ＥＢＰαは発現されない。Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδは、
ＩＬ−１βによるＰＬＡ２−IIａ遺伝子の転写の活性化を担っている。本出願人
らは、それらが、ヒト及びウサギの軟骨細胞におけるＩＬ−１βによるＣＯＸ−
２遺伝子の転写の誘導にも重大に関与していることを発見した。

【００２８】 特定の実施態様において、本発明のハイブリッドプロモーターの因子ｂ）は、
配列番号５の配列の全部もしくは一部、又はそれらの機能的変異体を含む。配列
番号５は、ヒトＰＬＡ２ｓ−IIＡ遺伝子のヌクレオチド−２４７〜＋２０（残基
５〜２７１）に相当する。

【００２９】 より具体的には、「一部」という用語は、生物学的機能性が保存されている、
考慮中の配列の任意の断片をさす。より具体的には、それは、ハイブリッドプロ
モーターの基底転写活性（例えば、ＴＡＴＡボックス）、及び炎症メディエータ
ー、特にインターロイキン−１βにより調節されうる形質を保証する一部である
。

【００３０】 この目的のため、本発明の好ましい別の実施態様は、インターロイキン−１β
による誘導を提供する、ＰＬＡ２ｓ IIＡプロモーターの一部を少なくとも含む
ハイブリッドプロモーターに関する。

【００３１】 より具体的には、本発明のハイブリッドプロモーターの因子ｂ）は、以下の配
列を含みうる。 ・少なくとも、ＩＬ１による調節に関与している配列番号５の残基５１〜６１（
およそ、ヒトＰＬＡ２ｓ IIａ遺伝子の残基−２００／−１９１に相当）、及び
／又は ・少なくとも、ＮＦ１半部位（half site）及びＧＲＥ半部位を表す配列番号５
の残基２３〜３２（およそ、ヒトＰＬＡ２ｓ IIａ遺伝子の残基−２２９／−２
２０に相当）（これらの配列は、デキサメタゾンのようなある種の化合物による
調節に関与している）、及び／又は ・少なくとも、Ｓｐ１の結合に関与している配列番号５の残基１４８〜１５５（
およそ、ヒトＰＬＡ２ｓ IIａ遺伝子の残基−１０４／−９７に相当）、及び／
又は ・少なくとも、配列番号５の残基５〜１７０（およそ、ヒトＰＬＡ２ｓ IIａ遺
伝子の残基−２４７／−８５に相当）、又は、さらに ・少なくとも、配列番号５の残基５１〜１７０（およそ、ヒトＰＬＡ２ｓ IIａ
遺伝子の残基−２００／−８５に相当）。

【００３２】 ハイブリッドプロモーターの具体例は、ヒトＰＬＡ２ｓ IIＡ遺伝子の−２４
７／＋２０断片と結合したＰＰＡＲ（ＤＲ１）２ ２１応答因子を含む。そのよ
うなプロモーターは、配列番号６の配列を含み、これも本発明の特定の面を構成
する。この配列において、ＰＰＲＥ因子は残基１３〜５３に本質的に相当し、Ｐ
ＬＡ２ｓ因子は残基６２〜３３２に相当する。残基１〜１２及び５４〜６１は、
クローニング工程に起因し、プロモーターの構造の修飾を可能にする、機能的見
地からは中性の領域（クローニング部位）に相当する。

【００３３】 考慮中の領域には、本発明のハイブリッドプロモーターの転写活性に実質的に
影響を与えることなく、特に５つの塩基のうちの１つにおける、配列の変異（突
然変異、欠失、置換、挿入等）が起こりうることは、明らかである。そのような
変異体は、本発明の特定の実施態様を表すことが理解される。

【００３４】 ＰＰＡＲ応答因子（ＰＰＲＥ）及びＰＬＡ２ｓ IIＡに由来する領域は、機能
的な様式で、即ち、ハイブリッドプロモーターが、炎症メディエーターの存在下
で、好ましくはＰＰＲＥ因子により調節された転写活性を発揮するよう、本発明
のハイブリッドプロモーター内に配置される。

【００３５】 好ましくは、ハイブリッドプロモーター内で、因子ａ）は、因子ｂ）の上流（
５′）に位置している（図１参照）。この構図は、炎症メディエーター（ＬＴＢ
４）及び／又はＰＰＡＲアクチベーターの存在下での、細胞における、高レベル
の、調節されたレベルの発現を保証する。

【００３６】 前記の異なる機能的領域は、相互に直接接続されてもよいし、又はプロモータ
ーの調節性には有意に影響を与えないヌクレオチドと会合されてもよい。そのよ
うなヌクレオチドは、例えばクローニング工程に起因する、機能に関しては中性
の残基（ＰＣＲ末端、制限部位等）であり得る。そのようなヌクレオチドは、特
質を提供するか、又は本発明の系の性能を改良する生物学的特性を保有していて
もよい（ハウスホールド（household）遺伝子増幅因子、特異的組織増幅因子、
サイレンサー、イントロン、スプライス部位等）。この目的のため、本発明の特
定の実施態様において、ハイブリッドプロモーターは、組織特異性を提供する因
子ｃ）をさらに含む。この因子ｃ）は、因子ａ）と因子ｂ）との間に位置付けら
れてもよいし、因子ｂ）の下流（３′）に位置付けられてもよい。「組織特異性
」という用語は、ある細胞（型）における優先的又は優勢な発現を意味するが、
他の細胞における残りの又は比較的少ない発現を完全には排除しない。

【００３７】 一つの特定の面において、本発明は、より具体的には、５′−３′方向に、 ａ）好ましくは配列番号１〜４の配列の全部又は一部を含む、ＰＰＡＲα及び／
又はγ応答因子と； ｂ）配列番号５の配列の全部又は一部と； ｃ）必要な場合に含まれる、組織特異性を提供する因子と：を含む、ハイブリッ
ド転写プロモーターを提供する。

【００３８】 特定の適用において、因子ｃ）は、軟骨細胞における発現の特異性を提供し、
特に、それは、配列番号７の配列の全部もしくは一部、又はそれらの変異体を含
む。この型のプロモーターは、軟骨細胞、特に炎症状況（関節症）にある軟骨細
胞における、核酸の調節された選択的発現に、特に適している。

【００３９】 軟骨基質は、多数の膠原性（collagenic）タンパク質及び非膠原性タンパク質
により構成されている。II型コラーゲン、アグリカン（agrecan）、マトリリン
（matrilin）−１（又は、軟骨基質タンパク質）、及びコンドロアドヘリン（ch
ondroadherin）の遺伝子のような、この基質中のタンパク質をコードするある種
の遺伝子は、軟骨細胞により特異的に発現される。これらの最後の２つのタンパ
ク質は、軟骨細胞により合成されたインテグリンと特異的に相互作用し、基質の
他の成分への細胞の固着を担う（Makihira S et al., 1999; Camper L et al.,
1997）。II型コラーゲン遺伝子及びアグリカン遺伝子の発現は、軟骨細胞分化の
陽性マーカーとして文献に広範に記載されており、Ｉ型コラーゲンの合成は脱分
化現象の指標である（Benya P et al., 1986）。de Crombrugghe教授のグループ
は、軟骨細胞におけるII型コラーゲンの発現を指図するために必要かつ十分な１
８塩基対の配列を同定した。この配列は、軟骨細胞分化に関与している核因子（
ＳＯＸ９）を固定する（Mukhopadhyay K et al., 1995; Zhou G et al., 1995）
。この因子は、初代軟骨細胞においてII型コラーゲンの発現と共局在している。
それは、II型コラーゲン遺伝子のプロモーターにおいて配列ＣＡＴＴＣＡＴと接
続されており、その転写を活性化する。

【００４０】 誘導可能なだけでなく特異的な、軟骨細胞における目的遺伝子の発現のため、Ｓ
ＯＸ因子（ＳＯＸ９、ＳＯＸ６、及びＬ−ＳＯＸ５）を固定することができるII
型コラーゲンプロモーターの因子（Mukhopadhyay K et al., 1995; Zhou G et a
l., 1995; Lefebvre V et al., 1997）が組み込まれうる。II型コラーゲンの第
一イントロンの２３１ｂｐの二組みにより形成された、Zhouら（1995）及びLefe
bvreら（1997）により記載されたヌクレオチド配列が、使用されうる。この構築
物は、系において最も効率的であることが示されている。それは、図７Ａに概略
的に示されたようなｓＰＬＡ２−IIＡ遺伝子の最初の非翻訳２０塩基対エキソン
に続く第一合成イントロンを構成する目的で、ドナースプライシング部位（ＳＤ
）及びアクセプター部位（ＳＡ）を両側に含む、ハイブリッド構築物（ＤＲ１）
２ ２１−ｓＰＬＡ２ IIＡプロモーターの下流に挿入されうる。第一イントロ
ンの挿入は、一般的に、下流に位置する導入遺伝子の発現を容易にする。この挿
入は、ＳＯＸ９因子のための部位の存在により、第一に、軟骨細胞における導入
遺伝子の発現の制限を可能にし、第二に、その増幅を可能にする。さらなる構築
物において、ＳＯＸ因子結合部位をプロモーターとして含有する配列が、図７Ｂ
に概略的に示されたように、ＰＰＡＲ結合部位の前に挿入されうる。

【００４１】 さらなる面において、本発明は、前記定義のようなハイブリッドプロモーター
と、目的遺伝子とを含む任意の核酸に関する。目的遺伝子は、目的産物（ＲＮＡ
、ポリペプチド、又はペプチド）をコードしている、多様な起源（動物、ヒト、
野菜、細菌、ウイルス、人工等）の任意の核酸（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成又は
半合成のＤＮＡ、ＲＮＡ等）でありうる。それは、有利には、抗炎症性の産物、
即ち細胞、組織、又は器官における炎症現象を回復又は減少させることができる
産物をコードする核酸である。特記されうる抗炎症性の産物は、ＴＩＭＰ又はそ
の他のサイトカイン又は炎症を減少させることができる酵素を含む。目的産物は
、より一般的には、治療又はワクチン目的の、任意の酵素、ホルモン、増殖因子
、抗体、免疫原性ペプチド、リポタンパク質、毒素、抗体又は抗体断片、アンチ
センス、転写因子等でありうる。

【００４２】 目的遺伝子は、一般的にはハイブリッドプロモーターの下流（３′）に、その
転写制御下で位置付けられる。その場合、好ましい核酸は、５′−３′方向に、
ａ）好ましくは配列番号１〜４の配列の全部又は一部を含む、ＰＰＡＲα及び／
又はγ応答因子と； ｂ）配列番号５の配列の全部又は一部と； ｃ）必要な場合に含まれる、組織特異性を提供する因子と： ｄ）目的産物、特に治療又はワクチン目的の産物をコードする遺伝子と：を含む
。

【００４３】 さらなる面において、本発明は、前記定義のようなハイブリッドプロモーター
又は核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、任意の性質及び／又は起源の
ものであってよく、特にプラスミド、エピソーム、染色体、ウイルス、ファージ
等でありうる。好ましくは、ベクターは、プラスミド又は組換えウイルス、より
好ましくはプラスミドである。

【００４４】 特記されうるウイルスベクターの例は、組換えアデノウイルス、組換えレトロ
ウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクチンウイルス等であり、それらの調
製は、当業者に既知の方法を使用して実施されている。

【００４５】 プラスミドに関しては、哺乳動物細胞、特にヒト細胞における使用に適合して
いる複製型又は組込型のプラスミドを挙げることができる。

【００４６】 さらなる面において、本発明は、前記定義のような核酸又はベクターを含む組
成物を提供する。組成物は、構築物のin vivoもしくはex vivoの投与のための任
意の許容される媒体（特に、任意の医薬的に許容される媒体）、及び／又はそれ
らの安定的な保存のための任意の許容される媒体を含有していてもよい。特記さ
れうる媒体の例は、重合体又は高分子量タンパク質のような添加剤を場合により
含んでいてもよい、生理食塩水、緩衝液、及び等張溶液である。さらに、本発明
の組成物は、本発明の構築物の細胞への侵入を容易にする薬剤を含みうる。特記
されうる例は、細胞トランスフェクションを改良しうる脂質、重合体、ペプチド
等である。

【００４７】 この目的のため、本発明の特定の組成物は、場合によりポリカチオン性重合体
とカップリングしていてもよいポリカチオン性脂質を１個以上含む。この型の製
剤は、負の電荷を有するプロテオグリカンに富む基質により包囲されている軟骨
細胞への遺伝子の移入に特に適している。従って、ポリカチオン性脂質は、基質
へと容易に組み込まれうる。生理学的pHにおいて不完全にプロトン化可能なアミ
ンを含むＰＥＩ（ポリエチレンイミン）のようなポリカチオン性重合体の添加は
、軟骨細胞のトランスフェクションの効率を増加させうる。これらのアミンは、
エンドソーム溶解（endosomolytic）特性を有するプロトンスポンジ（proton sp
onge）として機能する。カチオン性脂質と、ＰＥＩと、導入遺伝子を保持してい
るプラスミドとから構成された集合体は、本発明に関する特に好ましい組成物を
構成する。

【００４８】 さらに、本発明の組成物は、所望の細胞型への優先的なトランスフェクション
を保証するためのターゲティング因子を１個以上含みうる。これに関して、ター
ゲティング因子は、特異的な受容体リガンド、リガンド受容体、抗体、又は抗体
断片等により構成されうる。

【００４９】 軟骨細胞へのターゲティングに関して、本発明の好ましい組成物は、軟骨細胞
膜に対する親和性を有する分子を１個以上さらに含む。これらのタンパク質とし
ては、軟骨細胞のインテグリンアルファ２ベータ１と高い親和性で相互作用する
タンパク質コンドロアドヘリンを特に挙げることができる（Camper L et al., 1
997）。これは、ロイシンに富む小さい３６kDaのタンパク質である。このタンパ
ク質は、（例えば、組換えバキュロウイルスにおいて）作製され、精製され、本
発明の組成物（特に、リポソーム）へと取り込まれうる。タンパク質の疎水性は
、Ｑ−Ｒａｓ４Ｂ末端のようなファルネシル化配列をＣ末端に付加することによ
り改良されうる（Leevers S J et al., 1994; Stokoe D et al., 1994; Zlatkin
e et al., 1997）。

【００５０】 所望の適用に応じて、他の任意のターゲティング因子が企図されうることが理
解される。

【００５１】 さらなる面において、本発明は、同時、別々、又は連続的に使用するための、
（ｉ）前記定義のような核酸又はベクターと、（ii）ＰＰＡＲアクチベーターと
を含む組成物を提供する。

【００５２】 前述のように、ハイブリッドプロモーターは、ＰＰＡＲ応答因子を含む。この
ＰＰＡＲは、炎症状況において、又は外因性の（即ち、添加もしくは投与された
）アクチベーターの存在下で、細胞内に遊離（又は、誘導）されうる。これに関
して、「同時、別々、又は連続的に使用するための」という表現は、ベクターと
アクチベーターとが、別々に調製され、別々にパッケージングされ、目的核酸の
発現を制御するため、連続的に使用されてもよいことを示す。典型的には、ベク
ターとアクチベーターとは、別々にパッケージングされ、連続的に使用され、こ
れらの異なる因子の組み合わせが、細胞、組織、器官等において、発現の調節又
は増幅の所望の効果をもたらす。

【００５３】 ハイブリッドプロモーター又は所望の適用に応じて、天然又は合成であり得る
種々の型のリガンドが使用されうる。好ましくは、それは、ＰＰＡＲγ及び／又
はＰＰＡＲβ及び／又はＰＰＡＲαのアクチベーターである。

【００５４】 ＰＰＡＲγアクチベーターは、天然又は合成のリガンドの中から選択されうる
。挙げられうる天然リガンドは、脂肪酸及びエイコサノイド（例えば、リノール
酸、リノレン酸、９−ＨＯＤＥ、５−ＨＯＤＥ）であり、挙げられうる合成リガ
ンドは、ロシグリタゾン（rosiglitazone）（ＢＲＬ４９６５３）、ピオグリタ
ゾン（pioglitazone）、又はトログリタゾン（troglitazone）のようなチアゾリ
ジンジオン（例えば、Krey G et al., Mol Endocrinol, 11(1997)779-791又はKl
iewer S and Wilson T,Curr Opin in Gen Dev, 8(1998)576-581参照）、化合物
ＲＧ１２５２５又は１５−デオキシ−Δ１２−１４ ＰＧＪ２である。

【００５５】 ＰＰＡＲαアクチベーターリガンドの例は、フィブリン酸（fibric acid）及
びその類似体のようなフィブラート（fibrate）である。挙げられうるフィブリ
ン酸の類似体は、ゲムフィブロジル（gemfibrozyl）（Atherosclerosis 114(1)(
1995)61）、ベザフィブラート（bezafibrate）（Hepatology 21(1995)1025）、
シプロフィブラート（ciprofibrate）（BCE&M 9(4)(1995)825）、クロフィブラ
ート（Drug Safety 11(1994)301）、フェノフィブラート（Fenofibrate Monogra
ph,Oxford Clinical Communications, 1995）、クリノフィブラート（clinofibr
ate）（Kidney International, 44(6)(1993)1352）、ピリニクス酸（pirinixic
acid）（Ｗｙ−１４，６４３）、５，８，１１，１４−エイコサテトラノイック
アシッド（eicosatetranoic acid）（ＥＴＹＡ）、又はイブプロフェン及びイン
ドメタシンのような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩ）である。これらの種々
の化合物は、in vitro又はin vivoの生物学的及び／又は医薬的使用に適合して
いる。

【００５６】 さらに、本発明の組成物は、会合した複数のＰＰＡＲアクチベーター、特にレ
チノイドと会合したフィブラート又はフィブラート類似体を含みうる。

【００５７】 これらの異なるリガンドは、先行技術において記載され、実施例に例示されて
いるような従来の用量で使用されうる。

【００５８】 本発明の組成物は、チューブ、アンプル、ポーチ（pouch）、フラスコ、シリ
ンジ等のような任意の型の適当な装置に製剤化され、冷蔵保存（もしくは凍結）
されるか、又は凍結乾燥されうる。

【００５９】 本発明は、in vitro、ex vivo、又はin vivoで、種々の細胞、組織、又は器官
において遺伝子を発現させるために使用されうる。特に、それは、哺乳動物、好
ましくはヒトの細胞、組織、又は器官、特に炎症状態にあるものでありうる。例
としては、軟骨細胞（もしくは骨基質）、又は筋細胞（もしくは筋肉）、肝細胞
（もしくは肝臓）、心細胞（もしくは心臓、動脈壁、又は血管壁）、神経細胞（
もしくは脳、骨髄等）、もしくは腫瘍細胞（もしくは腫瘍）が特記されうる。

【００６０】 好ましくは、本発明の構築物、組成物、及び方法は、in vitro、ex vivo、又
はin vivoにおける、軟骨細胞における核酸の調節された発現のため使用される
。より具体的には、実施例に示された結果は、この細胞型におけるin vivo又はi
n vitroの本発明の利点を例示している。

【００６１】 本発明は、炎症状態にある組織における遺伝子の発現を誘導するための組成物
を調製するための、前記定義のようなベクターの使用にも関する。本発明は、前
記定義のようなベクター又は組成物を対象へ投与することを含む、炎症状態にあ
る組織における遺伝子の発現のための方法にも関する。

【００６２】 有利には、それは、軟骨細胞における核酸の発現のための方法の使用に関する
。

【００６３】 本発明は、関節症を治療するための、前記定義のような核酸、ベクター、又は
組成物の使用にも関する。

【００６４】 in vitro又はex vivoの使用のため、細胞は、種々のプロトコルを使用して本
発明の組成物又はベクターと接触させられる。培養細胞が、本発明のベクター又
は組成物、例えばハイブリッドプロモーターと目的遺伝子とを含むベクターと共
に、必要であればアクチベーターの存在下で、直接インキュベートされてもよい
。又は、細胞が、第一段階でベクター又は核酸とインキュベートされ、次いで第
二段階で（修飾された細胞を培養し、場合によっては選択した後）、アクチベー
ターが添加されてもよい。これらの実験は、任意の適当な装置及び培地、好まし
くはプレート、ディッシュ、フラスコにおいて、又は無菌状態で実施されうる。
細胞、ベクター、及びリガンドの量は、実施例に提供された情報及び一般的な知
識に基づき、当業者により容易に適合化されうる。

【００６５】 in vivo使用の場合には、核酸、ベクター、又は組成物を、同時、別々、又は
連続的にin vivo投与することにより、細胞（又は器官、組織等）が接触させら
れる。このため、ベクター、組成物、又は核酸は、一般的には、非経口的に、特
に筋肉内に、静脈内に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、骨内に、関節内に、又は定
位的に投与される。投与様式の選択は、企図された適用、標的とする組織、及び
／又は導入遺伝子によりコードされる目的産物の型により指南されうる。そのよ
うな投与のため、本発明の組成物は、細胞トランスフェクションを助長する任意
の薬剤（カチオン性重合体、脂質等）を含みうる。

【００６６】 アクチベーターは、ベクター又は核酸の前に、同時に、又は後に投与されうる
。このため、リガンドの投与は、例えば、経口的に、肛門内に、静脈内に、腹腔
内に、眼内に、又は筋肉内に実施されうる。

【００６７】 使用される用量は、文献に発表されているin vivoデータに基づき、当業者に
より適合化されうる。従って、例えば、水に不溶性の形態の場合、ＰＲＬ４９６
５３のようなリガンドの典型的な用量は、少なくとも１５μg/mlに近い血漿濃度
を与えるよう、５〜５０mg/kgの範囲内、例えば３０mg/kgである。比較的高いバ
イオアベイラビリティを有する水溶性の形態のリガンド（例えば、ＢＲＬ４９６
５３のマレイン酸塩）の場合、典型的な用量は、比較的低く、一般的には５mg/k
g未満、例えば０．０１〜１mg/kgである。これらの用量は、明らかに、使用され
る構築物、使用されるリガンド、並びに所望の適用及び効果の関数として、当業
者により適合化されうる。さらに、リガンドの反復投与も企図されうる。

【００６８】 一般的に、使用されるベクターの用量は、所望の適用に応じて、０．０１〜１
０００μg、又はそれ以上でありうる。

【００６９】 典型的な実験において、本発明に係るベクターは、トランスフェクション剤の
存在下で、局所的に（罹患組織、例えば炎症巣に直接、特に関節内に）投与され
る。細胞より遊離したメディエーター（ＰＧ２、ＩＬ１、ＬＴＢ４等）の効果の
下、目的遺伝子の発現が観察され、それは、前記定義のようなＰＰＡＲリガンド
を１個以上投与することにより、又は内因性ＰＰＡＲの存在下で、刺激又は増幅
されうる。

【００７０】 ホスホリパーゼＡ２によるアラキドン酸及びその他の脂肪酸の遊離は、他のイ
コサノイド及び脂質メディエーターの合成をもたらす。これらのメディエーター
は、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体）転写因子を活性化する。
これらの因子は、抗高脂血症薬、糖尿病において使用されるチアゾリジンジオン
、及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩ）のようなある種の薬物によっても活
性化されうる（Lehmann J M, 1997）。軟骨細胞は、ＰＰＡＲα因子及びＰＰＡ
Ｒγ因子を発現している（Bordji et al., J Biol Chem、出版準備中）。プロス
タグランジン（ＰＧＥ２、ＰＧＪ２）のようなイコサノイド（アラキドン酸誘導
体）は、ＰＰＡＲγを誘導し（Kliewer S A et al., 1995; Krey et al., 1997
）；特に、プロスタグランジン１５ジオキシΔ１２−１４ ＰＧＪ２は、ＰＰＡ
Ｒγの最も強力なアクチベーターである。ロイコトリエンＬＴＢ４及びフィブラ
ートは、ＰＰＡＲαを活性化し（Devchand R P et al., 1996）、長鎖脂肪酸は
２つのアイソフォームＰＰＡＲα及びγを活性化する。

【００７１】 以下の実施例に示された結果は、２つのアクチベーターシグナルの存在下での
ハイブリッドプロモーターの相乗的な特性を例示する。

【００７２】 本発明は、前記定義のような組成物又はベクターと接触させることにより修飾
された任意の細胞、特に任意の哺乳動物細胞、より具体的にはヒト細胞、より具
体的には軟骨細胞にも関する。

【００７３】 本発明は、例えばプロモーターに調節可能形質を付与するために使用されうる
、前記定義のようなＰＬＡ２ｓプロモーターの種々の断片にも関する。

【００７４】 以下、実施例により本発明をより詳細に記載するが、実施例は、制限的なもの
ではなく例示的なものと見なされなければならない。

【００７５】 方法及び装置 １．細胞培養及びトランスフェクション ３週齢の思春期前のウサギ（Fauve de Bourgogne）の前肢及び後肢を解剖し、
無菌条件下で切除した。メスで軟骨を取り出し、次いでタンパク質分解酵素（ヒ
アルロニダーゼ０．０５％、１５分間、トリプシン０．２５％、３０分間、及び
コラゲナーゼ０．２％、９０分間）を使用して軟骨細胞を分離させた。最後に、
ＨＡＭ′ｓ Ｆ１２培地を６０分間添加した。軟骨細胞の懸濁液を、１０％ウシ
胎仔血清を含有するＨＡＭ′ｓ Ｆ１２培地の存在下で、６cm直径のディッシュ
で培養した（１ディッシュ当たり１５００００細胞）。これらの条件下で、軟骨
細胞は、II型コラーゲンの産生により示されるように、分化した表現型を有して
いた。

【００７６】 細胞がプレコンフルエンスに達した時点で（６〜７日）、それらをリン酸カル
シウム法を使用して種々の構築物でトランスフェクトした。

【００７７】 ２．ＣＡＴ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性の測定 ＣＡＴ活性は、Desbois et al., (1992）により記載された二重液相技術を使
用して測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、トランスフェクション効率の変
動を規準化する目的で測定した。

【００７８】 ３．核タンパク質の調製、及び電気泳動ゲルシフト実験 Ｃｏｓ−１細胞（形質転換されたサル腎臓繊維芽細胞）を、ＰＰＡＲγ、ＰＰ
ＡＲα、又はＲＸＲの発現ベクター２０μgを使用して、前記のリン酸カルシウ
ム技術を使用して、トランスフェクトした。トランスフェクトされていないＣｏ
ｓ−１細胞を対照とした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を、ＫＣ
ｌ（０．４５Ｍ）、トリス−ＨＣｌ（２０mM、pH＝７．５）、及び１０％グリセ
ロールを含有する緩衝液と共にインキュベートした。それらを掻き取ることによ
り剥離させ、次いで、−８０℃に冷却し、３７℃に解凍することにより破壊した
。次いで、これらの細胞を、１５０００rpm、４℃で１０分間遠心分離した。次
いで、上清を−８０℃に凍結させ、ゲルシフト実験に使用した。

【００７９】 ４．ゲルシフト実験 ＤＲ１、（ＤＲ１）２ １７、（ＤＲ１）２ ２１、及び（ＤＲ１）２ ３１
の配列を、³²Ｐ ｄＣＴＰαを使用して、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片によ
り放射標識した。放射標識されたプローブ１０００００cpm（０．４ng）を、（
図面の簡単な説明に示されたように）増加する量の、ＰＰＡＲγ及びＲＸＲに富
むＣｏｓ−１抽出物、並びに特異的結合緩衝液（ＫＣｌ １００mM、ヘペス４０
mM、pH７．５、ＮＰ４０ ０．１％、ＺｎＣｌ₂ ０．５mM、ＰＥＧ８％）と共
に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、混合物をアクリルアミド／ビス
アクリルアミドゲル（５％、ＴＢＥ０．２５Ｘ）の上に置き、２００ボルトで２
時間半移動させた。次いで、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーに供した
。

【００８０】 ５．分子生物学 プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム勾配中でのプラスミドＤＮＡの
遠心分離、アガロースゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、エタノ
ール又はイソプロパノールによる生理食塩水中のプラスミドＤＮＡの沈殿、エシ
エリキア・コリ（Escherichia coli）における形質転換のような、分子生物学に
おいて従来使用されている方法は、当業者に周知であり、文献に広範に記載され
ている（Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y,(1989)）。

【００８１】 商業的に入手可能なプラスミドを使用した。

【００８２】 ＰＣＡ（ポリメラーゼ連鎖増幅）によるＤＮＡ断片の酵素画分は、製造業者の
指示に従い、DNA thermal cycler（登録商標）（Perkin Elmer Cetus）を使用し
て増幅した。

【００８３】 エシエリキア・コリの細胞におけるプラスミドＤＮＡの電気穿孔は、製造業者
の指示に従い、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。

【００８４】 ヌクレオチド配列は、製造業者の指示に従い、Applied Biosystemsより供給さ
れたキットを使用して、Sangerら（Proc Natl Acad Sci USA, 74(1977)5463-546
7）により開発された方法を使用して確認した。

【００８５】 実施例 以下の実験の部分において、本発明者らは、特にＩＬ１βにより誘導可能な因
子と、イコサノイド、脂肪酸、及び非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩ）により
誘導可能な因子とを含む本発明のハイブリッドプロモーター複数個の構築及び使
用を記載する。

【００８６】 第一モジュールは、領域〔−２４７；＋２０〕（ｓＰＬＡ２の転写開始部位を
基準とする）を含んでいた。この領域は、ＴＡＴＡボックスと、転写活性にとっ
て不可欠であり、普遍的因子Ｓｐ１と結合する近位因子（−１１４／−８５）と
を含有していた。それは、ＩＬ−１βによる刺激にとって不可欠のＣ／ＥＢＰ部
位（−１９８／−１９０）、及びＣ／ＥＢＰ因子の活性を増幅する因子〔−２４
７／−２１０〕も含んでいた。さらに、このモジュールは、該ホルモンによる誘
導を中継することができるグルココルチコイド応答因子を含有していた。

【００８７】 第二モジュールは、炎症により産生された脂肪酸に由来するメディエーター（
プロスタグランジン、ロイコトリエン）、又は外因性化合物（フィブラート、非
ステロイド性抗炎症薬−ＮＳＡＩ）により、炎症過程における誘導を増幅するこ
とを目的とするものであった。このモジュールは、第一モジュールの上流に位置
するＰＰＡＲ応答因子（ＰＰＲＥ）を含んでいた。

【００８８】 実施例１：ＰＰＡＲ応答因子の構築 この実施例は、本発明のハイブリッドプロモーターにおいて使用するための複
数のＰＰＡＲ応答因子の構築及び機能分析を記載する。

【００８９】 １ 高親和性ＰＰＡＲ応答単位の作製 ＰＰＡＲリガンドによる最適な誘導を得るため、複数の配置のＰＰＲＥマルチ
マーを構想し、合成した。これらの領域の配列を以下に示す。

【００９０】 因子ＤＲ１は、ＰＰＡＲ／ＲＸＲヘテロ二量体のためのコンセンサス結合部位
である。因子（ＤＲ１）２ １７、（ＤＲ１）２ ２１、及び（ＤＲ１）２ ３
１は、中心間にそれぞれ１７個、２１個、３１個の塩基対が介在する２つのＤＲ
１ｄから形成されている。

【００９１】

【表１】

【００９２】 ２ 結合実験 ２−１ ＰＰＡＲγの結合 前記のＰＰＲＥの機能的形質及び効力を確認するため、増加する量（５及び１０
μl）のＣｏｓ−１細胞において調製されたＰＰＡＲγタンパク質及びＲＸＲタ
ンパク質（ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ比＝３：１）の存在下で、予め放射標識された前
掲の配列４つのうち１つとの結合の研究と一致したゲルシフト実験を実施した。
得られた結果を図２に示す。

【００９３】 これらの結果は、構築された配列が、ヘテロ二量体ＰＰＡＲ／ＲＸＲと結合す
ることを示している。ＤＲ１配列は、二量体複合体と結合するが、（ＤＲ１）２
１７、（ＤＲ１）２ ２１、及び（ＤＲ１）２ ３１の配列は、二量体複合体
と結合し、ＰＰＡＲ／ＲＸＲ二重ヘテロ二量体に相当する高分子量のシフトした
複合体とも結合する。さらに、二量体複合体及び高分子量複合体の量は配列によ
って異なっていた。これは、これら３つの配列が、異なる共同作用性により異な
るＲＸＲ／ＰＰＡＲγ配列と結合することを示唆している。

【００９４】 観察された複合体が、Ｃｏｓ−１細胞におけるＰＰＡＲγ及びＲＸＲの産生に
由来するのか、又は細胞内に存在するタンパク質に由来するのかを明らかにする
ため、これらの異なる配列をトランスフェクトされていないＣｏｓ−１の抽出物
（１０μl）と共にインキュベートした。これらの抽出物により形成された複合
体の強度は極めて低く、そのことから、ＰＰＡＲγ及びＲＸＲの配列は、細胞ト
ランスフェクションの後に産生された可能性が高い（図２）。

【００９５】 異なる配列に対するＰＰＡＲ／ＲＸＲの結合共同作用性を研究することを目的
として、増加する量（１〜１０μl）のＰＰＡＲ及びＲＸＲに富むＣｏｓ−１抽
出物を使用して、ゲルシフト実験を実施し、次いで得られた放射能を定量した。
第一のＰＰＡＲ／ＲＸＲ二量体の形成は、解離定数ＫｄIIにより特徴付けられ；
二重二量体又は四量体のそれは、解離定数ＫｄＩＶにより特徴付けられた。Ｋｄ
II／ＫｄＩＶ（Ｒ）比は、１を超える場合、結合共同作用性を反映している。

【００９６】 異なる二量体複合体及び四量体複合体及び遊離プローブを、Phosphorimagerを
使用して定量し、図３に示した。共同作用比は、前記の式を使用して計算した。
（ＤＲ１）２ １７及び（ＤＲ１）２ ３１の配列は、二量体型及び四量体型と
より強く結合する。共同作用比は、それぞれ９及び１２．６であった。しかしな
がら、配列（ＤＲ１）２ ２１は、異なる結合プロフィールを示した。二量体型
は、全結合のわずか２０％であり、四量体が全結合の８０％を占めていた。共同
作用比は、３４±１１であった。

【００９７】 これらの結果は、使用された３つの配列が、共同作用的に、ＰＰＡＲ及びＲＸ
Ｒと結合することを示している。最も高い結合共同作用性を有する配列は、（Ｄ
Ｒ１）２ ２１である。

【００９８】 ２−２ ＰＰＡＲα結合 類似の実験をＰＰＡＲαを用いて実施した。ＰＰＡＲのαアイソフォームのた
めの発現ベクターをＣｏｓ−１細胞へとトランスフェクトした。Ｃｏｓ−１細胞
の全抽出物を、「方法及び装置」のセクションに記載されたようにして調製した
。４つの放射標識された配列、並びに増加する量のＰＰＡＲα及びＲＸＲ（３／
１比）に富むＣｏｓ−１抽出物を使用したゲルシフト実験を実施した。二量体型
（Ｄ）、四量体型（Ｔ）、又は遊離プローブ（Ｓ）に相当するバンドをゲルから
切り出し、次いでベータシンチレーション計数器での計数により定量した（図４
）。ＰＰＡＲα／ＲＸＲヘテロ二量体の、研究された種々の配列との結合に関す
る共同作用比を計算するため、前記の熱力学モデルを適用した。

【００９９】 ＰＰＡＲγに関して観察されたものとは対照的に、（ＤＲ１）２ ２１及び（
ＤＲ１）２ ３１で得られた共同作用比は同等であった（それぞれＲ＝１１．２
及び１１．６）。因子（ＤＲ１）２ １７の場合に得られた共同作用比は、これ
ら２つよりも低かった（Ｒ＝７）。この場合にも、３つの合成配列は、共同作用
的にＰＰＡＲαと結合し、（ＤＲ１）２ ２１及び（ＤＲ１）２ ３１が最も高
い結合共同作用性を有していた。

【０１００】 実施例２：ハイブリッドプロモーターを含むベクターの構築及び機能分析 この実施例は、本発明のハイブリッドプロモーターを含むプラスミドの構築を
記載し、異なる炎症メディエーターによる誘導特性を証明する。

【０１０１】 １）プラスミドの構築及び機能試験 ｓＰＬＡ２ IIＡのプロモーターの−２４７／＋２０断片（配列番号５）を、
プラスミドＰＵＣ−ＳＨ−ＣＡＴのＣＡＴレポーターベクターの上流にサブクロ
ーニングした。前掲の種々のＰＰＲＥ配列（配列番号１〜４）を、このプロモー
ターの上流に挿入した。

【０１０２】 次いで、ウサギ軟骨細胞を、最小ｓＰＬＡ２−IIＡプロモーターの上流に置か
れた種々のＰＰＲＥ（ＤＲ１）配置を含有するＣＡＴ構築物によりトランスフェ
クトした。次いで、１５デオキシΔ^12-14ＰＧＪ２（１０μM）（ＰＰＡＲγアク
チベーター）又はＷｙ−１４６４３（２００μM）（ＰＰＡＲαアクチベーター
）を、２４時間培養培地へ添加した。得られた結果を図５に示す。

【０１０３】 結果は、既知のＰＰＲＥ部位を含有していないｓＰＬＡ２−IIＡの最小プロモ
ーター（−２４７／＋２０）が、ＰＧＪ２又はＷｙ−１４６４３により活性化さ
れなかったことを示している。しかしながら、ＤＲ１の種々の配置は、ＰＰＡＲ
γ又はＰＰＡＲαの誘導剤により、種々のレベルで活性化された。それらは、Ｐ
ＰＡＲγの場合、昇順にＤＲ１＜（ＤＲ１）_{2 17}＝（ＤＲ１）_{2 31}＜（ＤＲ１
）_{2 21}と分類されうる。結合結果を機能結果と比較することにより、最も高い
共同作用結合性を有する（ＤＲ１）２ ２１配列が、最も高い機能的相乗作用を
有することが分かる。

【０１０４】 ＰＰＡＲαの場合、Ｗｙ−１４６４３による誘導可能性の順序は、ＤＲ１＜（
ＤＲ１）_{2 21}＜（ＤＲ１）_{2 17}＜（ＤＲ１）_{2 31}、とＰＧＪ２に関して観察
されたものと異なっている。ゲルシフト実験は、一過性トランスフェクション実
験と完全には一致しなかった。結合実験は、配列（ＤＲ１）_{2 21}及び（ＤＲ１
）_{2 31}が同一の共同作用比（Ｒ＝１１）でＰＰＡＲαと結合し、（ＤＲ１）_{2 17} が比較的小さい共同作用比（Ｒ＝７）を有することを示した。

【０１０５】 ２− ＩＬ−１、グルココルチコイド、並びにＰＰＡＲα誘導剤（フィブラー
ト）及びＰＰＡＲγ誘導剤（１５デオキシΔ１２−１４ＰＧＪ２）の、合成プロ
モーターに対する組み合わせ効果 次いで、ウサギ軟骨細胞を、最小ｓＰＬＡ２−IIＡプロモーター、又はその上
流に置かれた配列（ＤＲ１）２ ２１（ハイブリッドプロモーター）のいずれか
によりトランスフェクトした。ＰＧＪ２（１０μM）及び／又はＩＬ−１（１０n
g/ml）を培養培地へと添加した。

【０１０６】 得られた結果を図６に示す。これらの結果は、産生されたＩＬ−１がｓＰＬＡ
２−IIＡプロモーターを約６倍誘導したことを示している。Ｊ２プロスタグラン
ジン又はＷｙ−１４６４３は、このプロモーターに対する効果を有していなかっ
た。構築物（ＤＲ１）２ ２１−（−２４７／＋２０）ｓＰＬＡ２−ＣＡＴの場
合には、ＩＬ−１及びＰＧＪ２が、このプロモーターを約４倍誘導した。組み合
わせられた２つの産物は、相乗的な効果を有していた（基底活性と比較して１３
倍の誘導）（図６）。

【０１０７】 これと同じ型の実験を、Ｗｙ−１４６４３を用いて実施した。この化合物は、
特異的ＰＰＡＲα誘導剤である。Ｗｙ−１４６４３（２００μM）は、構築物（
ＤＲ１）２ ２１−（−２４７／＋２０）ｓＰＬＡ２−ＣＡＴの転写を約３〜４
倍活性化した。組み合わせられたＩＬ−１及びＷｙ−１４６４３の効果は相乗的
であった（２０倍の誘導）。

【０１０８】 単独の、又はＷｙ−１４６４３、ＰＧＪ２、又はＩＬ−１と組み合わせられた
デキサメタゾンの、合成プロモーター−（−２４７／＋２０）−（ＤＲ１）２
２１−ＣＡＴに対する効果も試験した。デキサメタゾンは、このプロモーターの
転写を約６倍活性化した。これらの結果は、コルチゾールのような循環血中のグ
ルココルチコイド、又は治療中に投与されたものが、このハイブリッドプロモー
ターを活性化しうることを示している。

【０１０９】 インドメタシン又はイブプロフェンのようなある種の非ステロイド性抗炎症薬
の、合成プロモーターに対する効果も試験した。得られた結果は、インドメタシ
ン（１０^-4M）が（ＤＲ１）２ ２１（−２４７／＋２０）−ＣＡＴ構築物を約
５倍活性化し、イブプロフェン（１０^-4M）がこのプロモーターを約１７倍活性
化することを示している。

【０１１０】 最後に、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）のようなウイルスプロモ
ーターにより達成された転写活性レベルと、合成プロモーターのそれとを比較し
た。合成プロモーターの基底転写活性は低く、ＲＳＶウイルスプロモーターの活
性の５％未満であった。種々のエフェクターによる誘導の後、合成プロモーター
は、ＲＳＶの活性の４０％に及ぶ転写活性を有していた（結果は示していない）
。従って、本発明のプロモーター構築物は、現在遺伝子治療において使用されて
いるウイルスベクターに匹敵する強い転写活性の誘導、及び低い基底活性を特徴
とする。

【０１１１】 結論 炎症成分、即ちＩＬ−１βのような炎症誘発性サイトカイン、及びプロスタグ
ランジン又はロイコトリエンのような炎症誘発性脂肪酸により誘導可能なハイブ
リッド合成プロモーターが開発された。さらに、循環血中のものであっても、又
は局所投与されたものであってもよいグルココルチコイド、イブプロフェン又は
インドメタシンのような非ステロイド性抗炎症薬が、これらのプロモーターの転
写を活性化することができる。従って、これらのプロモーターは、進行中の抗炎
症治療の有無の関数として遺伝子活性をモデュレートするための効果的な手段を
構成する。これらの特徴は、企図される遺伝子−薬物の合成に対する制御可能（
オン／オフ）効果を可能にする。この合成プロモーターは、極めて低い基底活性
を有し、内因性又は外因性の刺激により誘導されたその転写活性の効率はウイル
スベクターに匹敵することに注意することが重要である。

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＴＩＭＰ１発現を制御する本発明のハイブリッドプロモーターの概略図。

【図２】 ゲルシフト結合分析。放射標識された配列ＤＲ１、（ＤＲ１）２ １７、（Ｄ
Ｒ１）２ ２１、（ＤＲ１）２ ３１が、ＰＰＡＲγ及びＲＸＲに富むＣｏｓ−
１抽出物５又は１０μlと共にインキュベートされた。トラック１、４、７、１
０は、５μlに相当し、トラック２、５、８、及び１１は抽出物１０μlに相当す
る。トラック３、６、９、及び１２は、トランスフェクトされていないＣｏｓ−
１の抽出物１０μlに相当する。

【図３】 二量体及び四量体のバンド、並びに遊離プローブ（ＰＰＡＲγ）において得ら
れた放射能の定量。

【図４】 二量体及び四量体のバンド、並びに遊離プローブ（ＰＰＡＲα）において得ら
れた放射能の定量。

【図５】 合成プロモーターに対するＰＧＪ２（ＰＰＡＲγ誘導剤）及びＷｙ−１４６４
３（ＰＰＡＲα誘導剤）の効果。

【図６】 ウサギ軟骨細胞が、因子（ＤＲ１）２ ２１−（−２４７／＋２０）ｓＰＬＡ
２−ＣＡＴを含有するプラスミドでトランスフェクトされた。前掲の異なる誘導
剤が培養培地に添加された。

【図７Ａ】 ＳＯＸ因子を固定することができるII型コラーゲンプロモーターの因子が、ハ
イブリッド構築物（ＤＲ１）２ ２１−ｓＰＬＡ２ IIＡプロモーターの下流及
び上流にそれぞれ組み込まれている構築物の概略図。

【図７Ｂ】 ＳＯＸ因子を固定することができるII型コラーゲンプロモーターの因子が、ハ
イブリッド構築物（ＤＲ１）２ ２１−ｓＰＬＡ２ IIＡプロモーターの下流及
び上流にそれぞれ組み込まれている構築物の概略図。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 オリヴィエ，ジャン−リューク フランス国、エフ−75020 パリ、クー ル・ドゥ・バンセンヌ 31 (72)発明者 サルヴァ，コレット フランス国、エフ−75011 パリ、リュ・ パストゥール 11 (72)発明者 ベレジア，ジルベール フランス国、エフ−91120 パレソー、リ ュ・ドゥ・アモ・デ・ジョンシェレット 24 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA01 CA02 DA02 EA04 FA02 FA20 GA11 HA17 HA20

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）ＰＰＡＲ応答因子と、ｂ）ＰＬＡ２ｓIIＡ遺伝子プロモ
   ーターの全部又は一部とを含む、ハイブリッドプロモーター。
2. 【請求項２】 ＰＰＡＲ応答因子ａ）がＰＰＡＲ結合部位を１個以上含むこ
   とを特徴とする、請求項１記載のプロモーター。
3. 【請求項３】 ＰＰＡＲ応答因子ａ）が、配列番号１の配列又は該配列の機
   能的変異体を含む部位を１個以上含むことを特徴とする、請求項２記載のプロモ
   ーター。
4. 【請求項４】 ＰＰＡＲ応答因子ａ）が、配列番号１、２、３、もしくは４
   の配列、又は該配列の機能的変異体を含む部位を１個以上含むことを特徴とする
   、請求項３記載のプロモーター。
5. 【請求項５】 因子ｂ）が、配列番号５の配列の全部又は一部を含むことを
   特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載のプロモーター。
6. 【請求項６】 因子ｂ）が、インターロイキン−１βによる誘導を提供する
   ＰＬＡ２ｓプロモーターの一部を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜
   ５のいずれか一項記載のプロモーター。
7. 【請求項７】 因子ｂ）が、配列番号５の残基５１〜６１を少なくとも含む
   ことを特徴とする、請求項５又は請求項６に記載のプロモーター。
8. 【請求項８】 因子ｂ）が、配列番号５の残基５〜１７０を少なくとも含む
   ことを特徴とする、請求項５又は請求項６に記載のプロモーター。
9. 【請求項９】 因子ｂ）が、配列番号５の残基５１〜１７０を少なくとも含
   むことを特徴とする、請求項５又は６に記載のプロモーター。
10. 【請求項１０】 因子ａ）が、因子ｂ）の上流（５′）に位置することを特
    徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載のプロモーター。
11. 【請求項１１】 組織特異性を提供する因子ｃ）をさらに含むことを特徴と
    する、請求項１〜１０のいずれか一項記載のプロモーター。
12. 【請求項１２】 因子ｃ）が、軟骨細胞に対する特異性を提供すること、及
    び、特に配列番号７の配列の全部もしくは一部又はそれらの変異体を含むことを
    特徴とする、請求項１１に記載のプロモーター。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか一項記載のハイブリッドプロモ
    ーターと、目的遺伝子とを含む核酸。
14. 【請求項１４】 目的遺伝子が、抗炎症物質をコードする遺伝子であること
    を特徴とする、請求項１３に記載の核酸。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１２のいずれか一項記載のハイブリッドプロモ
    ーター、又は請求項１３もしくは１４に記載の核酸を含むベクター。
16. 【請求項１６】 プラスミドであることを特徴とする、請求項１５に記載の
    ベクター。