TR201613791A2 - Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu - Google Patents
Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu Download PDFInfo
- Publication number
- TR201613791A2 TR201613791A2 TR2016/13791A TR201613791A TR201613791A2 TR 201613791 A2 TR201613791 A2 TR 201613791A2 TR 2016/13791 A TR2016/13791 A TR 2016/13791A TR 201613791 A TR201613791 A TR 201613791A TR 201613791 A2 TR201613791 A2 TR 201613791A2
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- selectin
- inflammatory
- prevention
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 60
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title description 16
- 102000015689 E-Selectin Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 89
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 35
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 19
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 19
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 8
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 101150091799 ido gene Proteins 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- TXQAZWIBPGKHOX-UHFFFAOYSA-N 1H-indol-3-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CNC2=C1 TXQAZWIBPGKHOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 4
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 3
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044688 Activating Transcription Factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 2
- 102100023033 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100029009 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y Human genes 0.000 description 1
- 101710187036 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y Proteins 0.000 description 1
- 101710105440 High mobility group protein I Proteins 0.000 description 1
- 101000622123 Homo sapiens E-selectin Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- YGPSJZOEDVAXAB-QMMMGPOBSA-N L-kynurenine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(=O)C1=CC=CC=C1N YGPSJZOEDVAXAB-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003108 foot joint Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 102000051210 human SELE Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N mycophenolate mofetil Chemical compound COC1=C(C)C=2COC(=O)C=2C(O)=C1C\C=C(/C)CCC(=O)OCCN1CCOCC1 RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N 0.000 description 1
- 229960004866 mycophenolate mofetil Drugs 0.000 description 1
- 210000000492 nasalseptum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Buluş, sağlık sektöründe, iltihabi (enflamatuvar), otoimmün ve alerjik hastalıkların tedavi yöntemi ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi ile ilgilidir. Buluş özellikle organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların tedavisini sağlayan bir kompozisyon olup, E-selektin Promotör ile İndolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içermektedir.
Description
TARIFNAME
Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin önlenmesi ve tedavi edilmesini
ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini saglayan indüklenebilir
promotör ve terapötik gen kombinasyonu
Teknik Alan
Bulus, saglik sektöründe, iltihabi (enflamatuvar), otoimmün ve alerjik hastaliklarin
tedavi yöntemi ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi ile ilgilidir. Bulus,
organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, iltihabi (enflamatuvar) otoimmün ve
alerjik hastaliklarin tedavisini saglayan, özellikle indüklenebilir promotör olan E-
Selektin (ELAM-i) promotör ve terapötik gen olan Indolamin
gen kombinasyonu (kompozisyonu) ile ilgilidir.
Teknigin Bilinen Durumu
Otoimmün hastaliklar çogunlukla kronik agri ile organ veya doku hasarina bagli
islevsel bozukluklara neden olan hastaliklardir. Romatoid Artrit, Lupus Hastaligi,
Iltihapli Bagirsak Hastaligi, Guillain-Barre Sendromu, Multipl Skleroz, Sedef
Hastaligi, Myasthenia Gravis, dama iltihabi, Kawasaki hastaligi, vb. yaygin olarak
bilinen bazi otoimmün hastaliklardir. Otoimmün hastaliklar eklem, kas, kirmizi kan
hücreleri, cilt, endokrin bezleri ve bag dokular gibi vücudun farkli bölgelerini
etkileyebildigi için belirtileri de degiskendir. Otoimmün hastaliklarin tam olarak nedeni
bilinmemektedir.
Otoimmün hastaliklarin tedavisinde; otoimmün sürecini sinirlandiracak ve vücudun
enfeksiyon ve antijenlerle mücadele gücünü devam ettirecek bir tedavi yöntemi
seçilmesi gerekmektedir. Tedavi seçenekleri, genellikle hastalik türü ve belirtilerine
bagli olarak degismektedir. En yaygin tedavi yöntemleri; hastalik türüne göre kan
nakli, fiziksel terapi, B12 vitamini, insülin veya tiroid hormonu destegi gibi disardan
takviye alimi seklindedir. Bu hastaliklarin tedavisinde konvensiyonel immün sistemi
baskilayici ilaçlar (kortikosteroidler, siklosporin, mikofenolat mofetil gibi), TNF-oi gibi
molekülleri hedefleyen yeni biyolojik moleküller de (iimünoterapi) kullanilmaktadir.
Otoimmün hastaliklarin büyük bir bölümü, mevcut teknikte uygulanan tedavilerden
fayda görmemektedir. Ayrica eklemlerde terapötik düzeylere ulasabilmek için
sistemik olarak yüksek dozlarda uygulanan biyolojik ajanlar, ciddi yan etkilere sebep
olabilmektedir. Bu oldukça pahali olan yeni proteinlerin kisa yari ömürleri nedeniyle
sik sik enjeksiyonlarinin uygulanmasi gerekmektedir. Immünoterapide biyolojik
kökenli ajanlarin sistemik kullanimi, halihazirda uygulanmakta olan ilaçlarin
istenmeyen yan etkilerini en aza indirebilmek amaciyla klinik kullanima sokulmus
olmasina ragmen, ilaç tedavi maliyetlerinde daha fazla artisa neden olmus ve bir
takim immünolojik yan etki problemlerinin (Reaktivasyon tüberkülozu gibi) gündeme
gelmesine yol açmistir.
Örnegin, bir otoimmün hastalik olan Romatoid artritin (RA) tedavisinde kullanilan,
genelde her ay tekrarlanan enjeksiyonlar seklinde uygulanan yeni biyolojik
moleküllerin (TNF-d antagonistleri, soluble CTLA-4Ig füzyon proteini v.b.) hasta
hastasinin var oldugu düsünüldügünde, uygulanmakta olan tedavinin mali boyutunun
oldukça fazla oldugu görülmektedir. Ayrica bu ilaçlarin yüksek doz sistemik
kullanimina bagli yan etkileri ve bunlarin tedavileri de ek masraflar getirmektedir.
Otoimmün hastaliklarin tedavisinde kullanilmak üzere yukarida bahsedilen bir takim
ilaçlar mevcut olmakla beraber bu hastaliklardan korunmak ve bu hastaliklari tedavi
etmek için daha az uygulama gerektiren, daha ucuz ve yan etkisi daha az olabilecek
daha iyi tedavi stratejileri gelistirilmesi gerekmektedir.
Sonuç olarak yukarida anlatilan olumsuzluklardan dolayi ve mevcut çözümlerin konu
hakkindaki yetersizligi nedeniyle ilgili teknik alanda bir gelistirme yapilmasi gerekli
kilinmistir.
Bulusun Kisa Açiklamasi
Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari
ortadan kaldiran ve ilave bazi avantajlar enflamatuvar, otoimmün ve alerjik
hastaliklarin önlenmesi ve tedavi edilmesini; organ nakillerinde organ reddinin
önlenmesini saglayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu ile
Bulusun öncelikli amaci, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavi
edilmesinde, daha az uygulama gerektiren, daha ucuz ve yan etkisi daha az alternatif
bir tedavi seçenegi saglamaktir.
Bulus, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavisi ve organ nakillerinde organ
reddinin önlenmesi için sadece inflamasyonun basladigi esnada üretilen tolerans
indükleyici potansiyel terapötik bir molekül olan Indolamin
geninin ifade edildigi yeni bir gen tedavi yöntemi gelistirilmesini amaçlamaktadir.
Bulusun bir amaci, E-Selektin promotör ve lDO gen kombinasyonunun kullanilarak
enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavi edilmesini saglamaktir.
Bulusun bir baska amaci, enflamasyon durumunda aktive olan bir promotör olan
ELAM-1 promotör kullanarak sadece hastaligin basladigi veya aktive oldugu
dönemde terapötik IDO genini devreye sokarak henüz daha doku hasari (örnegin
artritteki kartilaj hasari) olmadan erken dönemde olayin baskilanmasini saglamaktir.
Bulus ayrica, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavisinde, gen transferi ile
durumunda üretilen lDO geninin sistemik ve/veya lokal uygulanmasini
amaçlamaktadir.
Bulusun diger bir amaci, indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu ile
organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini saglamaktir.
Bulus, yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için organ nakillerinde organ
reddinin önlenmesini, Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisini
saglayan bir kompozisyon olup, özelligi; E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3
Dioksijenaz gen kombinasyonunu ihtiva etmektedir.
Bulusun amaçlarini gerçeklestirmek 'üzere, bahsedilen kompozisyon E-selektin
Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içeren plazmit
formundadir veya E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen
kombinasyonu, virus içine yerlestirilerek kullanilmaktadir.
Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller
ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net
olarak anlasilacaktir. Bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklama
göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir.
Bulusun Anlasilmasina Yardimci Olacak Sekiller
Sekil 1: pCMV/ hIDO vektöru (Sino Biological, Çin) ve sekans referans noktalari
görünüm'ud'ur.
Sekil 2: pGEM-T Easy vektörü (lnvitrogen, ABD) ve sekans referans noktalari
görünümüd'ür.
Sekil 3: pELAM1pro/hIDO vektör'un'L'in sematik görünümüd'ur.
Sekil 4: E selektin promotor bölgesinin çogaltilmasi isleminde, 1% agaroz jelde PCR
ürünleri görüntüleridir.
Sekil 5: pGEM-T Easy rekombinantlarinin ve pCMV/hIDO vektör'un'un Mlul ve Saol
enzimleri ile kesimi sonrasinda 1% agaroz jelde görüntüsüd'ur.
Sekil 6: pCMV/thO, pGEM-T Easy/E-selektin promoter ve pELAM1pro/thO
rekombinantlarinin Mlul ve Saol kesimi sonrasinda 1% agaroz jelde görüntüsüdür.
Sekil 7: Sekanslama sonrasinda elde edilen sekanslarin NCBI/BLAST programi ile
hizalanmasini gösteren görünümd'ur.
Sekil 8: Katyonik lipit aracili gen transferi mekanizmasina ait sematik görünümd'ur.
Sekil 9: Ind'uklenebilir lDO ekspresyonunun ELISA ile gösterildigi grafik
görünümüdür.
Sekil 10: IDO aktivite ölçüm metodu standart egrisi görünümüd'ur.
Sekil 11: Indüklenebilir lDO ekspresyonunun aktivite ölçüm metodu ile gösterildigi
grafik görünümüd'ur.
Sekil 12: ELAM-1 promotör ve lDO gen kompozisyonunun artritli farelerde tedavi
edici etkisini gösteren grafik görünümüdür.
Bulusun Detayli Açiklamasi
Bu detayli açiklamada, bulus konusu enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin
önlenmesi ve tedavi edilmesini; organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini
saglayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu ve tercih edilen
yapilanmalari, sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak ve hiçbir
sinirlayici etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir.
Bulus, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavi edilmesini saglayan,
indüklenebilir bir promotör ve terapötik bir gen kompozisyonu ile ilgilidir. Bulus
konusu kompozisyon, E-selektin (ELAM-1) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz
(IDO) genlerinin kombinasyonunu içermektedir. Bahsedilen kompozisyonun, organ
nakillerinde organ reddinin önlenmesi ve alerjik hastaliklarin tedavi edilmesi için
kullanilmasi da mümkündür.
Bulus konusu E-selektin (ELAM-i) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) gen
kombinasyonu tercihen plazmit formunda olup Iipozom veya polimerler gibi tasiyicilar
ile hücrelere aktarilabilmektedir. Ancak, virüsler içerisine (adenovirüs, Ientivirüs v.b.)
yerlestirilerek de etkin bir biçimde tedavi sirasinda kullanilabilmesi mümkündür.
Söz konusu E-selektin (ELAM-i) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) gen
kombinasyonunu içeren plazmit kompozisyonunun elde edilme yöntemi genel olarak;
0 E selektin promotör bölgesinin çogaltilmasi,
E selektin promotör bölgesi amplifikasyonunun 3' ucuna A takilmasi,
TA klonlama plazmitine bantlarin klonlanmasi,
E. coIi kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi,
Plazmit izolasyonu ve saflastirma,
E selektin promotor bölgesinin TA klonlama plazmitinden kesilerek
çikartilmasi,
CMV promotor bölgesinin hIDO eksprese eden plazmitten kesilerek
çikartilmasi,
E selektin promotör bölgesi ile CMV promotör bölgesi çikarilmis olan th0
eksprese eden plazmitin birlestirilmesi,
E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi,
o Plazmit izolasyonu,
o Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi,
. Sekanslama sonrasinda elde edilen sekansin hizalanmasi islem adimlarindan
olusmaktadir.
Bulus kapsaminda, TA (Timin-Adenin) klonlama plazmiti olarak tercihen pGEM-T
Easy vektörü kullanilmistir. Ancak herhangi bir klonlama plazmitinin kullanilmasi
mümkündür. Ayrica direkt memeli hücrelerinden elde edilen insan lDO komplementer
DNA'si (cDNA) direkt olarak kullanilarak final plazmit içerisine klonlama yapilabilir.
th0 eksprese eden plazmit olarak tercihen pCMV/hIDO vektörü kullanilmistir.
Insan IDO (hIDO) geninin E-selektin promotöri'in'ü takiben baglanmasi
Insan IDO (hIDO) geni, Kozak sekansindan hemen sonra bulunan MCS bölgesine
klonlanmis olarak pCMV vektörü içinde temin edilmektedir (Sino Biological, ÇIN). Bu
vektörden CMV promotör bölgesi Mlul ve Sacl restriksiyon enzimleri kullanilarak
çikartilmakta ve E-selektin promotör bölgesi bu bölgeye klonlanmaktadir. E-selektin
promotör bölgesi, restriksiyon enzimleri Mlul ve Sacl içerecek sekilde tasarlanan
primerler ile çogaltilarak öncelikli olarak pGEM-T Easy vektörüne TA klonlamasi ile
klonlanmaktadir. Oncelikle pGEM-T plazmiti içine klonlamanin amaci, klonlanmasi
hedeflenen genin daha kolay kesimini saglamaktir. Tercihen PGEM-T Easy plazmiti
kullanilmakta olup baska benzer TA (Timin-Adenin) klonlama plazmitlerinin de
kullanilabilmesi mümkündür. pGEM_T Easy plazmitine klonlanan ve gerekli
restriksiyon enzim bölgelerini (Mlul ve Sacl) içeren E-selektin promotör bölgesi, daha
sonra bu vektörden ayni enzimlerle kesilerek çikartilmakta ve pCMV vektöründen
Mlul ve Sacl rekstriksiyon enzimleri kullanilarak çikarilan CMV promotör bölgesinin
yerine klonlanmaktadir.
Bulus kapsaminda hIDO geninin kaynagi olarak thO eksprese eden plazmit
kullanilmistir. Ancak, direkt memeli hücrelerinden elde edilen th0 komplementer
DNA'si (cDNA) direkt olarak kullanilarak final plazmit içerisine klonlama yapilabilir.
Sekil 1 ve 2'de, pCMV/hIDO ile pGEM-T Easy vektörleri ve sekans referans
noktalari verilmektedir. Sekil &de ise CMV promotör bölgesinin yerine E-selektin
promotör bölgesi klonlanmis pELAM1pro/hIDO vektörü ve sekans referans noktalari
görünümü sunulmaktadir.
Sekil 3'de, pELAMlpro/hIDO vektörü üzerinde,
o Indolamin geni
o SV4O Early Promoter
o Hygromycin direnç (R) geni
o Ampisilin direnç (R) geni
o Ori gen segmenti bölgeleri görülmektedir.
SV40 Early Promoter: Hygromycin genin transkripsiyonunu desteklemektedir.
Hyqromycin direnç (R) qeni: Higromisin (Hygromycin) direnç geni tasiyan hücreler
bu Higromisine karsi dirençli olup Higromisine ile muamele edildiklerinde ölmezler.
Plazmit transfekte edilmis hücreleri plazmit içermeyen hücrelerden ayirmak ve Stabil
(kalici) hücre hatlari elde etmek Için kullanilan gen segmentidir.
Ampisilin direnç (R) geni: Plazmitin bakterilerde üretimi sirasinda AmpR geni
içeren plazmiti aktarilmis bakteriler yasamlarini sürdürebilecegi için plazmit
transformasyonu sonrasi ve pürifikasyonu öncesi seleksiyon amaci ile
kullanilmaktadir. Basarili bir sekilde klonlanmis plazmit içeren bakterilerin seçimi için
gerekli bir gendir.
Ori gen segmenti: Plazmit replikasyonundan sorumlu gen segmentidir. Bakteri içine
aktarilmis plazmitin çogalmasini saglar. Ekspresyon plazmitlerinin olmazsa olmaz
parçalarindan biridir.
ELAM-1 Qromotör: Promotör, biyolojide genlerin transkripsiyonunu baslatan DNA
parçasidir. Promotörler, ilgili genin transkripsiyon baslangiç bölgesine yakin
kisimlarda ve genle ayni DNA iplikçigi üzerinde bulunurlar. Promotörler,
transkripsiyonunu baslattiklari gen dizisinden önce karsit tamamlayici DNA dizisinin
3' ucuna dogru olan kisimda bulunurlar. Promotörler genelde farkli nukleotid
uzunluklarina sahip olmakla beraber, 100 ila 1000 nukleotid çifti uzunlugunda olurlar.
ELAM-1 promotör, insan E-selektin molekülün'ün promotör bölgesi olup asagida
verilen dört adet düzenleyici domene sahiptir.
(a) Bir NF-kB baglanma bölgesi (pozisyon -94 ile -85 arasi),
(b) Aktive edici transkripsiyon faktör-2 (ATP-2) (ayni zamanda NF-ELAM-1 olarak da
bilinir; pozisyon -155 ile -147 arasi) ve yüksek hareketli group protein I (y) (high
mobility group protein I (Y); HMG-I(Y)),
NF-kB, sitokin ile indüklenen E-selektin transkripsiyonunu düzenlemek için gereklidir,
fakat tek basina yeterli degildir. E-selektin promotör bölgesinde yer alan diger
baglanma bölgeleri de önem tasimaktadir.
Yapilan in vitro ve in vivo çalismalar, E-selektin'in sitokin ile uyariyi takip eden 4-6
saat içinde ifade edildigini göstermistir. Bu inflamasyonun baslangiç döneminde
ELAM-1 promotörün aktive olmasi ile mümkün olmaktadir. Dolayisiyla anti-
inflamatuvar etkili terapötik bir proteini kodlayan genin E-selektin promotör
kontrolündeki ekspresyonu inflamasyonun basladigi ilk birkaç saatlik evrede terapötik
(tedavi edici) ajanin üretilerek devreye girmesini saglayabilmektedir.
Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) geni: Kinurenin yolaginda triptofan yikiliminin
baslangiç hiz sinirlayici adimini katalizleyen hücre içi bir enzimdir. IDO kullanimi
sonucu gelisen triptofan açligi T h'ücre aktivasyonunu baskilarken, kinL'irenin
deriveleri ve serbest oksijen radikalleri gibi triptofan katabolizma ürünleri ise T hücre
proliferasyonu (çogalmasi) ve yasamini düzenlemektedir. IDO enfeksiyon, gebelik,
transplantasyon, otoimmünite ve hematolojik malgniteleri de içine alan neoplazilerde
immün toleransin ind'üklenmesinde önemli rolleri olan bir enzimdir. lDO, bulusta
tedavi edici gen kismini olusturmaktadir.
Asagida E-selektin (ELAM-l) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) gen
kombinasyonunu içeren plazmit kompozisyonunun elde edilme yöntemine ait islem
adimlari detayli olarak verilmektedir.
E selektin promotor bölqesinin çogaltilmasi
200 uL steril PZR tüpünün içerisinde 1X QS Tampon çözeltisi (2 mM MgCl2, New
England Biolabs), , 0.02 U/ul Q5 High Fidelity DNA
polymeraz, 0.5 uM ileri primer (MluI-F-E selektin 5'
ACGCGTATGCATGTAGACTATGGATGA 3'), 0.5 pM geri primer (Sacl-R-E selektin
' GAGCTCTCTCTCAGGTGGGTATCAC 3') ve steril distile su, son hacim 25 uL
olacak sekilde karistirilmistir.
PZR döngü kosullari: 98 C 30 saniye ba slangiç denatürasyonu, 35 döngü; 98 C'de
dakika 72 C'de tutularak tamamlanmistir. PCR ürünleri 1% agaroz jelde de
görüntülenmistir (Sekil 4- M: Moleküler agirlik markörü (100bp marker, Axygen), 1-4
nolu kuyucuklar: E selektin amplifikasyonlari (483bç), 5 nolu kuyucuk: Negatif
kontrol).
Kesilen bantlar, Qiagen jel temizleme kiti kullanilarak jelden ayrildiktan sonra TA
klonlanmasi için E selektin promotör bölgesi amplifikasyonunun 3' ucuna A takilarak
klonlama yapmak üzere kullanilmistir.
E selektin promotor bölqesi amplifikasvonunun 3, ucuna A takilmasi
200 uL steril PZR tüpünün içerisinde 4000ng temizlenmis E selektin promotör bölgesi
son hacim 20 uL olacak sekilde karistirilmistir. 30 dakika 72 C'de tutularak
reaksiyon gerçeklestirilmistir.
pGEM-T Easy vektörüne bantlarin klonlanmasi
Agaroz jelden izole edilen ve 3' ucuna A takilan bantlar pGEM-T Easy (Promega)
vektörüne klonlanmistir. çözünmüs DNA, 12,5 ng pGEM-T Easy
vektörü (Promega), 1X Ligaz Tampon çözeltisi (Promega) ve 100 ünite T4 DNA Ligaz
enzimi (Promega) son hacim 10 pL olacak sekilde PZR tüpüne konulmustur. Karisim
gece boyunca 4%) de (yakla sik 18 saat) inkübe edilmistir.
E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi
E. coli DH5-0i kompetan hücrelerine (New England Biolabs) klonlanmis DNA parçasi
içeren pGEM-T Easy vektörü aktarilmistir. Steril 2 mL tübe 5 pL Iigasyon ürünü, ve
50 pL E. coli DH5-oi kompetan hücre eklenmistir. Karisim 30 dakika buzda
bekletildikten sonra 42°C 30 saniye isi soku uygulamistir. 5 dakika buzda
bekletildikten sonra hücrelerin üzerine 300 mL LB sivi besiyeri eklenerek 37“C 'de
60 dakika büyütülen hücreler LB agar besiyerine ekilerek gece boyunca 37Dde
büyümüstür. Transformasyon, hücrelerin ampisilin içeren (LB ampisilin 100 jg/mL)
ortamda büyümesi ve X-Gal (80 Eg/mL) kimyasalinin subsurat olarak kullanimi ve
lPTG (100 Dg/mL) ile aktive edilen ß Galaktosidaz aktivitesi sebebiyle mavi
kolonilerin olusmasi ile kontrol edilmistir. Beyaz koloniler seçilerek hücrelerden
plazmit izolasyonu yapilmistir.
Plazmit izolasyonu ve saflastirilmasi
Plazmitler QIAGEN QIAprep Spin Miniprep veya Midiprep Kitleri (Qiagen, ABD) gibi
plazmit izolasyon kitleri kullanilarak kit içinden çikan prosedüre göre izole edilmistir.
Izole edilen plazmitler %1 agarda görüntülenmistir.
Asagida plazmit izolasyonu ve saflastirma islemi kisaca özetlenmektedir.
Plazmitleri içeren bakteriler kimyasal olarak parçalanip DNAinin disindaki protein ve
RNA gibi istenmeyen moleküllerden arindirildiktan sonra plazmit DNA'yi baglayan
kolonlara aktarilmistir. Kolonlar iki kez yikandiktan sonra plazmit DNA'yi kolondan
ayirmak için elüsyon sivisi kullanilmistir. Plazmit DNA miktari spektrofotometrede
260 nm dalga boyu kullanilarak ölçülmüstür.
Burada kullanilan plazmit izolasyonu ve saflastirma yöntemi yerine herhangi bir
benzer ya da baska yöntem kullanilabilir.
Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi
DNA'nin plazmit DNA'sina entegre oldugunu göstermek için plazmit DNAisi izole
edildikten sonra EcoRI restriksiyon enzimi ile kesilmis beklenen boydaki bantlar tespit
edilmistir.
E selektin promotör bölqesinin pGEM-T Easy vektör'ünden kesilerek
çikartilmasi
pGEMT Easy vektörüne klonlanmis olan E selektin promotör öncelikle restriksiyon
enzimi içeren primerler kullanilarak çogaltilip klonlandiklari için bu enzimler ile
kesilerek pCMV/thO vektör'üne aktarilmalari saglanmistir.
pGEM-T Easy plazmit DNA'si izole edildikten sonra Mlul ve Saol restriksiyon
enzimleri ile kesilmis, beklenen boydaki bantlar tespit edilmistir. 8 pg plazmit DNA'si,
1X NE Tampon Çözeltisi , 10 Unite Mlul ve 10 Unite Sacl
restriksiyon enzimleri (New England Biolabs) ve PZR suyu son hacim 50 uL olacak
sekilde hazirlanmistir. Karisim 37“C'de 1 saat bekletilmi s, 80“C'de 20 dakika enzim
inaktivasyonu yapilarak örnekler 1% agaroz jelde yürütülmüst'ür (Sekil 5 - M1:
Moleküler agirlik markör'ü ( 1 -4 nolu kuyucuklar: pGEM-
T Easy/Eselektin (483bç), 5-6 nolu kuyucuklar pCMVhIDO (CMV promotor bölgesi
CMV promotor bölgesinin pCMVIhIDO vektör'ünden kesilerek çikartilmasi
Klonlama yapilmasi için Mlul ve Sacl enzimler ile pCMV/IDO vektöründen CMV
promotor bölgesi çikartilmistir.
8 pg plazmit DNArsi, 1X NE Tampon Çözeltisi (New England Biolabs), 1 Ünite Xhol
ve 1 Ünite Nhel restriksiyon enzimleri (New England Biolabs) ve PZR suyu son hacim
dakika enzim inaktivasyonu yapilarak örnekler 1% agaroz jelde yürütülmüstür (Sekil
Klonlanma için kullanilan pCMV/hIDO vektörün'ün restriksiyon haritasi Sekil 1'de
gösterilmektedir Mlul ve Saol enzimleri kullanilarak kesim sonucunda CMV sürekli
ekspresyon promotörü (590bç) çikartilarak yerine E selektin promotör bölgesi (483
bç) klonlanmistir. Bu sekilde hIDO geni E selektin promotor aktivitesi altinda seçici
olarak ekspres olacaktir.
E selektin promotor b'ölqesi ile pCMV/hIDO plazmitinin birlestirilmesi
2 uL jelden temizlenmis plazmit DNA'si (pCMV/thO), 6 uL jelden temizlenmis
klonlanacak gen parçasi (E selektin promotor bölgesi), 1X NE Tampon Çözeltisi (MBI
Fermentas), , son hacim 10 pL olacak sekilde
hazirlanmistir. Karisim 4`C'de gece boyunca bekletilmis ve ertesi gün kompetan E.
coli DH50i (New England Biolabs) hücrelerine aktarilmistir.
E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi
E. coli DH5-0i kompetan hücrelerine (New England Biolabs), klonlanmis DNA
parçasi içeren pREP ELAM-1 pro vektorü aktarilmistir. Steril 2 mL tübe 5 mL
dakika buzda bekletildikten sonra 420 30 saniye isi soku uygulamistir. Hücrelerin
üzerine 300 mL LB sivi besiyeri eklenerek 37°C 'de 60 dakika büyütülen hücreler 5
dakika buzda bekletildikten sonra LB agar besiyerine ekilerek gece boyunca 37°C37de
büyümüstür. Transformasyon, hücrelerin ampisilin içeren (LB ampisilin 100 lg/mL)
ortamda büyümesi ile kontrol edilmistir. Büyüyen koloniler seçilerek hücrelerden
plazmit izolasyonu yapilmistir.
Plazmit izolasyonu
Plazmitler QIAGEN QIAprep Spin Miniprep veya Midiprep Kitleri (Qiagen, ABD) gibi
plazmit izolasyon kitleri kullanilarak kit içinden çikan prosedüre gore izole edilmistir.
Izole edilen plazmitler %1 agarda görüntülenmistir.
Asagida plazmit izolasyonu ve saflastirma islemi kisaca özetlenmektedir.
Plazmitleri içeren bakteriler kimyasal olarak parçalanip DNA*nin disindaki protein ve
RNA gibi istenmeyen moleküllerden arindirildiktan sonra plazmit DNA'yi baglayan
kolonlara aktarilmistir. Kolonlar iki kez yikandiktan sonra plazmit DNA'yi kolondan
ayirmak için elüsyon sivisi kullanilmistir. Plazmit DNA miktari spektrofotometrede
260 nm dalga boyu kullanilarak ölçülmüstür.
Burada kullanilan plazmit izolasyonu ve saflastirma yöntemi yerine herhangi bir
benzer ya da baska yöntem kullanilabilir.
Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi
DNA'nin plazmit DNA'sina entegre oldugunu göstermek için plazmit DNA'si izole
edildikten sonra Mlul ve Sacl restriksiyon enzimleri ile kesilmis beklenen boydaki
bantlar tespit edilmistir. 10 pg plazmit DNA'si, 1X NE Tampon Çözeltisi 2.1 (New
England Biolabs), 10 Unite Mlul ve 10 Unite Sacl restriksiyon enzimleri (New England
Biolabs) ve PZR suyu son hacim 50 uL olacak sekilde hazirlanmistir. Karisim
37°C'de 3 saat bekletilmis, 8ODde 20 dakika enzim inaktivasyonu yapilarak ve
örnekler 1% agaroz jelde yürütülmüstür (Sekil 6 - M1: Moleküler agirlik markörü
(100bp Iadder, Axygen), 1 nolu kuyucuk: pCMV/hIDO plazmiti ( 590 bç CMV
promotor bölgesi), 2-3-4-6-7 nolu kuyucuklar: pCMV/hIDO/E selektin plazmidleri (E
selektin promotor bölgesi 483 bç), 5 nolu kuyucuk pGEMT-Easy/ E selektin plazmiti
(E selektin promotor bölgesi 483 bç). M2: Moleküler agirlik markörü (1 kb Iadder,
Axygen)).
Kesim sonrasinda beklenen boyda bant tespit edilen plazmidlerden 3 adedi 5,
AGATCTCCCGATCCCCTATGS' ve 5,CTAGCCAGCTTGGGTCTCC3, primerleri
kullanilarak ABl prism-31O Genetic Analyzer kullanilarak sekanslatilmistir. Klonlanan
parçanin tamamen dogru sekansda (%100 ayni) oldugu gösterilmistir (Sekil 7).
E-selektin (ELAM-1) Promotör ile Indolamin 2.3 Dioksiienaz (IDO) qen
kombinasyonunu iceren plazmitin hücrelere aktarimi ve bahsedilen gg
kombinasyonunun islevselliginin test edilmesi
Deneylerde, daha önceki çalismalarda kullanilmis olmasi ve kolay transfekte
edilebilmesi nedeniyle HeLa hücreleri kullanilmistir. HeLa hücrelerin kültürü için %10
fetal sigir serumu, L-glutamin, penisilin ve streptomisin içeren RPMI164O
kullanilmistir.
Plazmitlerin hücre hatlarina ve fare eklem içine aktarilmasi (transfeksiyon) için
tercihen lipozom aracili gen transfer yöntemi kullanilmistir. Lipozom aracili gen
transferinde anyonik (-) yüklü DNA ile katyonik (+) yüklü çift tabakali lipit
keseciklerinin kompleks olusturmasi saglanmaktadir. Ardindan bu kompleks
hücrelere veya dokulara uygulandiginda, hücre yüzeyindeki anyonik yük ve hücre
membrani-Iipit etkilesimi sonucunda, lipit keseciklerinin tasidigi DNA molekülü hücre
içine alinmaktadir. Sekil 8'de katyonik lipit aracili gen transferi mekanizmasi
görünümü sematik olarak verilmektedir. Bahsedilen bu çalismalarda tercihen
transferi yaptigi gözlenen baska yöntemler de kullanilabilir. Kullanilacak gen transfer
yöntemi çalisilacak olan hücre ve dokunun özelliklerine göre degisiklik gösterebilir.
HeLa hücreleri 6 kuyulu kültür plaklarina, 2.5 x 105/kuyu olarak dagitilarak bir gece
(yaklasik 18 saat) kültüre edilmistir. Bir kisim kuyudaki hücreler pELAM1.pro/hIDO ile
transfekte edilmistir. pELAM-1.pr0/hIDO (Sekil 3) ile transfekte edilen HeLa hücreler
farkli dozlarda IL-1 (2 ng/ml ve 5 ng/ml) ile 24 saat süre ile uyarilmistir. Pozitif kontrol
olarak th0 geninin yapisal olarak transkripsiyonuna neden olan CMV promotöre
sahip pCMV/hIDO, negatif kontrol olarak th0 geni yerine baska bir raportör gene
sahip olan pCMV/ßgal (uygunsuz plazmit) kullanilmistir. Uyariyi takiben hücrelerin
üst sivilari alinarak ayri tüplere aktarilmis ve ardindan hücreler 2 kez PBS ile
yikanarak hücre kazici (cell scraper) ile kazinip 3 kez dondurma ve çözme yapilarak
dondurucuda saklanmistir.
Hücre lizatlarindaki hIDO düzeylerinin ölçümü için ELISA testi uygulanmistir.
Indüklenebilir hIDO düzeylerinin IL-1 ile uyarilmayi takiben 24 saat içinde arttirildigi,
ancak 5 ng/mL lL-1 ile daha belirgin olarak yükseldigi gözlemlenirken, uyarilmamis
hücrelerde hIDO düzeylerinin uygunsuz plazmit ile transfekte hücrelerdekine benzer
oldugu saptanmistir. Hücre üstü sivilarinda bakilan, salinan hIDO'nun düzeylerinin
ise sadece 5 ng/mL IL-1 uyarisi ile anlamli bir artisa neden oldugu görülmüstür (Sekil
lDO enzimatik aktivitesinin ölçümü için yöntem denemesi yapilmistir. lDO aktivitesi
triptofan metaboliti olan L-kininürenin konsantrasyonun kalorimetrik ölçümü ile
gerçeklestirilmistir (Samikkannu T, et al. AIDS RESEARCH AND HUMAN
mM Askorbik asit, 20 pM Metilen mavisi, 200 ug katalaz ve
hazirlanan L kininürenin standartlari esit miktardaki buffer ile muamele edilmistir.
Ardindan 30 dk
eklenerek reaksiyon durdurulmustur ve 30 dk 52 0C de tekrar inkübe edilmistir. Kisa
bir santrifüje takiben süpernatan alinarak esit miktardaki Erlich ayiraci ile renk
degisimi gözleninceye (10 dk) kadar oda sicakliginda bekletilmistir. Olusan renk
siddeti spektrofotometrik olarak 492 nm 'de okunmustur. Standart egri grafigi L-
kininürenin pM cinsinden absorbsiyonu çizilmistir. (Sekil 10).
Hela hücresi kültür lizatlarindaki hIDO aktivitesinin ölçümü için IDO Aktivite testi
uygulanmistir. HeLa hücreleri 6 kuyulu kültür plaklarina 2.5 x 105/kuyu olarak
dagitilarak bir gece (yaklasik 18 saat) kültüre edilmistir. Bir kisim kuyudaki hücreler
pELAM1.pro/hIDO ile transfekte edilmistir. Pozitif kontrol olarak, bir kisim kuyudaki
pCMV/hIDO ile, negatif kontrol olarak bir kisim ise pCMV/ßgal (uygunsuz plazmit) ile
transfekte edilmistir. Hücreler 24 saat süreyle lL-1 (5 ng/mL) ile uyarilmistir. Hücre
lizatlarindaki IDO aktivitesi spektrofotometrik yöntem ile ölçülmüstür. Indüklenebilir
thO düzeylerinin lL-1 ile uyarilmayi takiben 24 saat içinde arttirildigi
gözlemlenirken, uyarilmamis hücrelerde hIDO düzeylerinin uygunsuz plazmit ile
transfekte hücrelerdekine benzer oldugu saptanmistir. (Sekil 11).
Bu deneyler, bulus konusu gen kompozisyonunun islevsel oldugunu ve iltihabi
durumlarda lDO geninin üretilebildigini göstermektedir.
Asagida bulus konusu gen kompozisyonunu ile ilgili uygulama örnegi verilmektedir.
Artrit Hauan Modeli
Uludag Universitesi, Deneysel Hayvan Yetistirme Uygulama ve Arastirma
Merkeziinden 6-8 haftalik (genç) veya 6-8 aylik (yasli) Balb/c tipi erkek ve disi fareler
saglanmistir. Fareler Uludag Üniversitesi, Deneysel Hayvan Yetistirme Uygulama ve
Arastirma Merkezi'nde (DEHYUAM) kontrollü iklim kosullarinda, sürekli kuru yem ile
beslenerek, enfeksiyondan uzak ve veteriner hekim kontrolünde bakilmistir.
Hayvanlar, spesifik patojen free ortam olusturulacak sekilde özel kafes sistemleri
içerisinde barindirilmistir. Barindirma isisi 20-24 0C olacak sekilde sabit tutulmus ve
aydinlatilmistir. Tüm yapilan uygulamalar, Uludag Üniversitesi Hayvan Etik
Kurulunun (HAYDEK) onayladigi prosedürlerle gerçeklestirilmistir.
CIA modelinin olusturulmasi için Collagen bovine nasal septum (Sigma 07806 10mg)
ve Freund's Adjuvant Complete (CFA) (Sigma F5881 10mL) kullanilmistir. Bu amaçla
kollajen konsantrasyonu 2mg/mL olacak sekilde 0.1 M asetik asit içerisinde
çözülmüstür. Deney prosedürüne göre her deney grubunda 10 hayvan (5 disi, 5
erkek) olacak sekilde enjeksiyonlarin 0. gününden itibaren hayvanlarin takibi
yapilmistir.
0. gün: Hayvan basina 0.02 mL 2mg/mL kollajen i.a, 0.1 mL CFA ise s.c. olarak
enjekte edilmistir.
14. gün: Hayvan basina 0.02 mL 2mg/mL kollajen i.a, 0.1 mL CFA s.c. enjeksiyonlari
uygulanmistir.
14. günde yapilan kontrollerde enjeksiyon yapilan ayak eklemlerinde siddetli
kizariklik ve sisme gözlenmektedir.
. gün: Enjeksiyon yapilan eklemlerde siddetli kizariklik ve sisme 14. gün
kontrollerine göre degisiklik göstermemektedir.
ELAM-1 promotör ve lDO qen kompozisyonunun artritli havanlarda tedavi edici etkisi
BaIb/c farelere (6-8 haftalik genç veya 6-8 aylik yasli) 3. haftada (artrit olustuktan
sonra) yapisal olarak IDO eksprese edilmesini saglayan pCMV/IDO veya hastalikla
lDO ekspresyonunun indüklenmesini saglayan pELAM1/lDO plazmiti, lipozom aracili
olarak aktarilmistir. Kontrol gruplarina ise PBS uygulanmis veya PCAT/control
(uygunsuz plazmit) lipozom aracili olarak aktarilmistir.
Farelerin (her grupta 2 fare) ayak kalinliklari haftalik olarak ölçülmüst'ür. Artritin
belirgin olarak olustugu farelerde 3. haftadan itibaren yapilan izlenimlere bakildiginda
özellikle indüklenebilir IDO eksprese eden plazmit transfer edilmis, hem genç hem de
yasli farelerde, belirgin olarak klinik iyilesme (eklem kalinliginda gerileme)
gözlenmektedir. pCMV/lDO ile transfekte edilen farelerde ise genç farelerde kontrol
gruplarina göre daha belirgin bir iyilesme saglanabildigi görülmüst'ur (Sekil 12).
Yukarida belirtilen fareler 7. haftada sakrifiye edilerek yapilan histopatolojik
degerlendirmelerin sonuçlari asagida Tablo 1'de özetlenmistir.
Asagida Tablo 1'de belirtilen parametreler degerlendirilerek gruplar karsilastirilmis ve
0 ile 4 arasinda degisen derecelerde yangisal reaksiyonlari skorlanmistir.
Tablo 1: Histopatolojik degerlendirme sonuçlari
PBS RA iliskili yangisal reaksiyon (4+)
pCAT/control (Uygunsuz RA iliskili yangisal reaksiyon (4+)
plazmit)
pCMV/lDO (terapotik gen) RA iliskili yangisal reaksiyon (2+)
pELAM1/IDO RA Iliskili yangisal reaksiyon (2+) 2+ ama kismen grup
(indüklenebilirterapötik) içindeki diger 2+!dan daha az siddette yangisal
reaksiyon
PBS RA iliskili yangisal reaksiyon (4+)
pCAT/control (Uygunsuz RA iliskili yangisal reaksiyon (13+)
plazmit)
pCMV/lDO (terapotik gen) RA iliskili yangisal reaksiyon (3+)
pELAM1/IDO RA iliskili yangisal reaksiyon (2+)
(induklenebilir terapötik)
RA. Romatoid artrit
Sonuç olarak; uygulanan gen tedavi stratejisi ile artrit olusturulmus farede klinik ve
histopatolojik iyilesme saglanmistir.
Bulus sayesinde, enflamasyon durumunda aktive olan bir promotör (ELAM-1
promotor) kullanilarak, sadece hastaligin basladigi veya aktive oldugu dönemde
terapötik madde (IDO) devreye sokularak, henüz daha doku hasari (örnegin artritteki
kartilaj hasari) olmadan erken dönemde olayin baskilanmasi saglanabilmektedir.
Bulus, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisi ve organ nakillerinde
organ reddinin önlenmesi için sadece inflamasyonun basladigi esnada üretilen
tolerans indükleyici potansiyel terapotik bir molekül olan IDOinun ifade edildigi yeni
bir gen tedavi kompozisyonudur. Bu bulus sayesinde enflamasyon sirasinda
sentezlenen proinflamatuvar sitokinler ve mediyatorler tarafindan uyarilabilen E-
selektin promotür*ün kontrolü altinda IDO geninin ifade düzeyi arttirilarak otoimmün
yanit baskilanabilmektedir. Enflamasyon geriledikten sonra da sentezlenen tedavi
edici proteinin üretimi de sonlanmaktadir.
Bulus, daha az uygulama gerektiren, daha ucuz ve yan etkisi daha az olabilecek gen
transferi ile terap'otik genlerin lokal olarak inflamasyon alanina aktarilmasi ya da
enflamasyon durumunda üretilen terapötik gen ürünlerinin sistemik ve/veya lokal
uygulanmasi seklinde alternatif bir yaklasim sunmaktadir.
Kullanilan plazmit ve tasiyici moleküllerin endotoksin veya immün sistemi uyarici
baska bir komponent içermememesi gerekmektedir. Protokollerin en etkin gen
transferini saglayacak sekilde optimize edilmesi gerekmektedir.
Claims (4)
1. Organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisini saglayan bir kompozisyon olup, özelligi; E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içermesidir.
2. Istem “lie uygun kompozisyon olup, özelligi; virüs içine yerlestirilerek kullanilan E- selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içermesidir.
3. istem 1'e uygun kompozisyon olup, özelligi; bahsedilen kompozisyonun, E- selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içeren plazmit formunda olmasidir.
4. Istem 3*e uygun plazmit kompozisyonunun elde edilme yöntemi olup, özelligi; E selektin promotör bölgesinin çogaltilmasi, E selektin promotör bölgesi amplifikasyonunun 3' ucuna A takilmasi, TA klonlama plazmitine bantlarin klonlanmasi, E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi, Plazmit izolasyonu ve saflastirma, E selektin promotor bölgesinin TA klonlama plazmitinden kesilerek çikartilmasi, CMV promotor bölgesinin hIDO eksprese eden plazmitten kesilerek çikartilmasi, E selektin promotör bölgesi ile CMV promotör bölgesi çikarilmis olan th0 eksprese eden plazmitin birlestirilmesi, E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi, Plazmit izolasyonu, Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi, Sekanslama sonrasinda elde edilen sekansin hizalanmasi islem adimlarini içermesidir.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TR2016/13791A TR201613791A2 (tr) | 2016-10-03 | 2016-10-03 | Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TR2016/13791A TR201613791A2 (tr) | 2016-10-03 | 2016-10-03 | Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TR201613791A2 true TR201613791A2 (tr) | 2016-12-21 |
Family
ID=67911327
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TR2016/13791A TR201613791A2 (tr) | 2016-10-03 | 2016-10-03 | Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TR (1) | TR201613791A2 (tr) |
-
2016
- 2016-10-03 TR TR2016/13791A patent/TR201613791A2/tr unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102482867B1 (ko) | 면역 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 조합물 및 이의 용도 | |
US20210177902A1 (en) | Ror-1 specific chimeric antigen receptors and uses thereof | |
Golombek et al. | Intradermal delivery of synthetic mRNA using hollow microneedles for efficient and rapid production of exogenous proteins in skin | |
CA3169669A1 (en) | Methods of preparing lipid nanoparticles | |
JP6621409B2 (ja) | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 | |
US20220257794A1 (en) | Circular rnas for cellular therapy | |
JP2020527937A (ja) | 新規の細胞タグの発現 | |
JPH04504125A (ja) | 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現 | |
US11981746B2 (en) | MUC16 specific chimeric antigen receptors and uses thereof | |
KR20230003511A (ko) | 안면견갑상완 근이영양증에 대한 crispr-억제 | |
TR201613791A2 (tr) | Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu | |
US20240123034A1 (en) | Mrnas encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for treating parkinson's disease | |
RU2737487C1 (ru) | Генно-инженерная конструкция для стимуляции ангиогенеза | |
WO2024159175A2 (en) | Compositions, systems, and methods for reducing adipose tissue | |
WO2024026475A1 (en) | Compositions for delivery to hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) and related uses | |
WO2024050551A2 (en) | Compositions and methods for in vivo expression of chimeric antigen receptors | |
WO2024026487A1 (en) | Lipid nanoparticle compositions comprising phospholipid derivatives and related uses | |
JP2007068473A (ja) | Mhc遺伝子の転写因子結合配列を含む発現ベクター | |
TW201139675A (en) | NeuroD1 gene expression in non-endocrine pancreatic epithelial cells (NEPECs) | |
JP2006166908A (ja) | 動物用疾患治療剤およびその製造方法 | |
JP2003526368A (ja) | 炎症により誘導可能なハイブリッドプロモーター、それらを含有するベクター、及びそれらの使用 |