TR201613791A2 - Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini sağlayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu - Google Patents

Abstract

Buluş, sağlık sektöründe, iltihabi (enflamatuvar), otoimmün ve alerjik hastalıkların tedavi yöntemi ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi ile ilgilidir. Buluş özellikle organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastalıkların tedavisini sağlayan bir kompozisyon olup, E-selektin Promotör ile İndolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içermektedir.

Description

TARIFNAME Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin önlenmesi ve tedavi edilmesini ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini saglayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu Teknik Alan Bulus, saglik sektöründe, iltihabi (enflamatuvar), otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavi yöntemi ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi ile ilgilidir. Bulus, organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, iltihabi (enflamatuvar) otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisini saglayan, özellikle indüklenebilir promotör olan E- Selektin (ELAM-i) promotör ve terapötik gen olan Indolamin gen kombinasyonu (kompozisyonu) ile ilgilidir.

Teknigin Bilinen Durumu Otoimmün hastaliklar çogunlukla kronik agri ile organ veya doku hasarina bagli islevsel bozukluklara neden olan hastaliklardir. Romatoid Artrit, Lupus Hastaligi, Iltihapli Bagirsak Hastaligi, Guillain-Barre Sendromu, Multipl Skleroz, Sedef Hastaligi, Myasthenia Gravis, dama iltihabi, Kawasaki hastaligi, vb. yaygin olarak bilinen bazi otoimmün hastaliklardir. Otoimmün hastaliklar eklem, kas, kirmizi kan hücreleri, cilt, endokrin bezleri ve bag dokular gibi vücudun farkli bölgelerini etkileyebildigi için belirtileri de degiskendir. Otoimmün hastaliklarin tam olarak nedeni bilinmemektedir.

Otoimmün hastaliklarin tedavisinde; otoimmün sürecini sinirlandiracak ve vücudun enfeksiyon ve antijenlerle mücadele gücünü devam ettirecek bir tedavi yöntemi seçilmesi gerekmektedir. Tedavi seçenekleri, genellikle hastalik türü ve belirtilerine bagli olarak degismektedir. En yaygin tedavi yöntemleri; hastalik türüne göre kan nakli, fiziksel terapi, B12 vitamini, insülin veya tiroid hormonu destegi gibi disardan takviye alimi seklindedir. Bu hastaliklarin tedavisinde konvensiyonel immün sistemi baskilayici ilaçlar (kortikosteroidler, siklosporin, mikofenolat mofetil gibi), TNF-oi gibi molekülleri hedefleyen yeni biyolojik moleküller de (iimünoterapi) kullanilmaktadir.

Otoimmün hastaliklarin büyük bir bölümü, mevcut teknikte uygulanan tedavilerden fayda görmemektedir. Ayrica eklemlerde terapötik düzeylere ulasabilmek için sistemik olarak yüksek dozlarda uygulanan biyolojik ajanlar, ciddi yan etkilere sebep olabilmektedir. Bu oldukça pahali olan yeni proteinlerin kisa yari ömürleri nedeniyle sik sik enjeksiyonlarinin uygulanmasi gerekmektedir. Immünoterapide biyolojik kökenli ajanlarin sistemik kullanimi, halihazirda uygulanmakta olan ilaçlarin istenmeyen yan etkilerini en aza indirebilmek amaciyla klinik kullanima sokulmus olmasina ragmen, ilaç tedavi maliyetlerinde daha fazla artisa neden olmus ve bir takim immünolojik yan etki problemlerinin (Reaktivasyon tüberkülozu gibi) gündeme gelmesine yol açmistir. Örnegin, bir otoimmün hastalik olan Romatoid artritin (RA) tedavisinde kullanilan, genelde her ay tekrarlanan enjeksiyonlar seklinde uygulanan yeni biyolojik moleküllerin (TNF-d antagonistleri, soluble CTLA-4Ig füzyon proteini v.b.) hasta hastasinin var oldugu düsünüldügünde, uygulanmakta olan tedavinin mali boyutunun oldukça fazla oldugu görülmektedir. Ayrica bu ilaçlarin yüksek doz sistemik kullanimina bagli yan etkileri ve bunlarin tedavileri de ek masraflar getirmektedir.

Otoimmün hastaliklarin tedavisinde kullanilmak üzere yukarida bahsedilen bir takim ilaçlar mevcut olmakla beraber bu hastaliklardan korunmak ve bu hastaliklari tedavi etmek için daha az uygulama gerektiren, daha ucuz ve yan etkisi daha az olabilecek daha iyi tedavi stratejileri gelistirilmesi gerekmektedir.

Sonuç olarak yukarida anlatilan olumsuzluklardan dolayi ve mevcut çözümlerin konu hakkindaki yetersizligi nedeniyle ilgili teknik alanda bir gelistirme yapilmasi gerekli kilinmistir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari ortadan kaldiran ve ilave bazi avantajlar enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin önlenmesi ve tedavi edilmesini; organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini saglayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu ile Bulusun öncelikli amaci, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavi edilmesinde, daha az uygulama gerektiren, daha ucuz ve yan etkisi daha az alternatif bir tedavi seçenegi saglamaktir.

Bulus, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavisi ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi için sadece inflamasyonun basladigi esnada üretilen tolerans indükleyici potansiyel terapötik bir molekül olan Indolamin geninin ifade edildigi yeni bir gen tedavi yöntemi gelistirilmesini amaçlamaktadir.

Bulusun bir amaci, E-Selektin promotör ve lDO gen kombinasyonunun kullanilarak enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavi edilmesini saglamaktir.

Bulusun bir baska amaci, enflamasyon durumunda aktive olan bir promotör olan ELAM-1 promotör kullanarak sadece hastaligin basladigi veya aktive oldugu dönemde terapötik IDO genini devreye sokarak henüz daha doku hasari (örnegin artritteki kartilaj hasari) olmadan erken dönemde olayin baskilanmasini saglamaktir.

Bulus ayrica, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavisinde, gen transferi ile durumunda üretilen lDO geninin sistemik ve/veya lokal uygulanmasini amaçlamaktadir.

Bulusun diger bir amaci, indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu ile organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini saglamaktir.

Bulus, yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, Enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisini saglayan bir kompozisyon olup, özelligi; E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu ihtiva etmektedir.

Bulusun amaçlarini gerçeklestirmek 'üzere, bahsedilen kompozisyon E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içeren plazmit formundadir veya E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonu, virus içine yerlestirilerek kullanilmaktadir.

Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir. Bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklama göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir.

Bulusun Anlasilmasina Yardimci Olacak Sekiller Sekil 1: pCMV/ hIDO vektöru (Sino Biological, Çin) ve sekans referans noktalari görünüm'ud'ur.

Sekil 2: pGEM-T Easy vektörü (lnvitrogen, ABD) ve sekans referans noktalari görünümüd'ür.

Sekil 3: pELAM1pro/hIDO vektör'un'L'in sematik görünümüd'ur.

Sekil 4: E selektin promotor bölgesinin çogaltilmasi isleminde, 1% agaroz jelde PCR ürünleri görüntüleridir.

Sekil 5: pGEM-T Easy rekombinantlarinin ve pCMV/hIDO vektör'un'un Mlul ve Saol enzimleri ile kesimi sonrasinda 1% agaroz jelde görüntüsüd'ur.

Sekil 6: pCMV/thO, pGEM-T Easy/E-selektin promoter ve pELAM1pro/thO rekombinantlarinin Mlul ve Saol kesimi sonrasinda 1% agaroz jelde görüntüsüdür.

Sekil 7: Sekanslama sonrasinda elde edilen sekanslarin NCBI/BLAST programi ile hizalanmasini gösteren görünümd'ur.

Sekil 8: Katyonik lipit aracili gen transferi mekanizmasina ait sematik görünümd'ur.

Sekil 9: Ind'uklenebilir lDO ekspresyonunun ELISA ile gösterildigi grafik görünümüdür.

Sekil 10: IDO aktivite ölçüm metodu standart egrisi görünümüd'ur.

Sekil 11: Indüklenebilir lDO ekspresyonunun aktivite ölçüm metodu ile gösterildigi grafik görünümüd'ur.

Sekil 12: ELAM-1 promotör ve lDO gen kompozisyonunun artritli farelerde tedavi edici etkisini gösteren grafik görünümüdür.

Bulusun Detayli Açiklamasi Bu detayli açiklamada, bulus konusu enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin önlenmesi ve tedavi edilmesini; organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini saglayan indüklenebilir promotör ve terapötik gen kombinasyonu ve tercih edilen yapilanmalari, sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak ve hiçbir sinirlayici etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir.

Bulus, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavi edilmesini saglayan, indüklenebilir bir promotör ve terapötik bir gen kompozisyonu ile ilgilidir. Bulus konusu kompozisyon, E-selektin (ELAM-1) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) genlerinin kombinasyonunu içermektedir. Bahsedilen kompozisyonun, organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi ve alerjik hastaliklarin tedavi edilmesi için kullanilmasi da mümkündür.

Bulus konusu E-selektin (ELAM-i) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) gen kombinasyonu tercihen plazmit formunda olup Iipozom veya polimerler gibi tasiyicilar ile hücrelere aktarilabilmektedir. Ancak, virüsler içerisine (adenovirüs, Ientivirüs v.b.) yerlestirilerek de etkin bir biçimde tedavi sirasinda kullanilabilmesi mümkündür.

Söz konusu E-selektin (ELAM-i) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) gen kombinasyonunu içeren plazmit kompozisyonunun elde edilme yöntemi genel olarak; 0 E selektin promotör bölgesinin çogaltilmasi, E selektin promotör bölgesi amplifikasyonunun 3' ucuna A takilmasi, TA klonlama plazmitine bantlarin klonlanmasi, E. coIi kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi, Plazmit izolasyonu ve saflastirma, E selektin promotor bölgesinin TA klonlama plazmitinden kesilerek çikartilmasi, CMV promotor bölgesinin hIDO eksprese eden plazmitten kesilerek çikartilmasi, E selektin promotör bölgesi ile CMV promotör bölgesi çikarilmis olan th0 eksprese eden plazmitin birlestirilmesi, E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi, o Plazmit izolasyonu, o Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi, . Sekanslama sonrasinda elde edilen sekansin hizalanmasi islem adimlarindan olusmaktadir.

Bulus kapsaminda, TA (Timin-Adenin) klonlama plazmiti olarak tercihen pGEM-T Easy vektörü kullanilmistir. Ancak herhangi bir klonlama plazmitinin kullanilmasi mümkündür. Ayrica direkt memeli hücrelerinden elde edilen insan lDO komplementer DNA'si (cDNA) direkt olarak kullanilarak final plazmit içerisine klonlama yapilabilir. th0 eksprese eden plazmit olarak tercihen pCMV/hIDO vektörü kullanilmistir.

Insan IDO (hIDO) geninin E-selektin promotöri'in'ü takiben baglanmasi Insan IDO (hIDO) geni, Kozak sekansindan hemen sonra bulunan MCS bölgesine klonlanmis olarak pCMV vektörü içinde temin edilmektedir (Sino Biological, ÇIN). Bu vektörden CMV promotör bölgesi Mlul ve Sacl restriksiyon enzimleri kullanilarak çikartilmakta ve E-selektin promotör bölgesi bu bölgeye klonlanmaktadir. E-selektin promotör bölgesi, restriksiyon enzimleri Mlul ve Sacl içerecek sekilde tasarlanan primerler ile çogaltilarak öncelikli olarak pGEM-T Easy vektörüne TA klonlamasi ile klonlanmaktadir. Oncelikle pGEM-T plazmiti içine klonlamanin amaci, klonlanmasi hedeflenen genin daha kolay kesimini saglamaktir. Tercihen PGEM-T Easy plazmiti kullanilmakta olup baska benzer TA (Timin-Adenin) klonlama plazmitlerinin de kullanilabilmesi mümkündür. pGEM_T Easy plazmitine klonlanan ve gerekli restriksiyon enzim bölgelerini (Mlul ve Sacl) içeren E-selektin promotör bölgesi, daha sonra bu vektörden ayni enzimlerle kesilerek çikartilmakta ve pCMV vektöründen Mlul ve Sacl rekstriksiyon enzimleri kullanilarak çikarilan CMV promotör bölgesinin yerine klonlanmaktadir.

Bulus kapsaminda hIDO geninin kaynagi olarak thO eksprese eden plazmit kullanilmistir. Ancak, direkt memeli hücrelerinden elde edilen th0 komplementer DNA'si (cDNA) direkt olarak kullanilarak final plazmit içerisine klonlama yapilabilir.

Sekil 1 ve 2'de, pCMV/hIDO ile pGEM-T Easy vektörleri ve sekans referans noktalari verilmektedir. Sekil &de ise CMV promotör bölgesinin yerine E-selektin promotör bölgesi klonlanmis pELAM1pro/hIDO vektörü ve sekans referans noktalari görünümü sunulmaktadir.

Sekil 3'de, pELAMlpro/hIDO vektörü üzerinde, o Indolamin geni o SV4O Early Promoter o Hygromycin direnç (R) geni o Ampisilin direnç (R) geni o Ori gen segmenti bölgeleri görülmektedir.

SV40 Early Promoter: Hygromycin genin transkripsiyonunu desteklemektedir.

Hyqromycin direnç (R) qeni: Higromisin (Hygromycin) direnç geni tasiyan hücreler bu Higromisine karsi dirençli olup Higromisine ile muamele edildiklerinde ölmezler.

Plazmit transfekte edilmis hücreleri plazmit içermeyen hücrelerden ayirmak ve Stabil (kalici) hücre hatlari elde etmek Için kullanilan gen segmentidir.

Ampisilin direnç (R) geni: Plazmitin bakterilerde üretimi sirasinda AmpR geni içeren plazmiti aktarilmis bakteriler yasamlarini sürdürebilecegi için plazmit transformasyonu sonrasi ve pürifikasyonu öncesi seleksiyon amaci ile kullanilmaktadir. Basarili bir sekilde klonlanmis plazmit içeren bakterilerin seçimi için gerekli bir gendir.

Ori gen segmenti: Plazmit replikasyonundan sorumlu gen segmentidir. Bakteri içine aktarilmis plazmitin çogalmasini saglar. Ekspresyon plazmitlerinin olmazsa olmaz parçalarindan biridir.

ELAM-1 Qromotör: Promotör, biyolojide genlerin transkripsiyonunu baslatan DNA parçasidir. Promotörler, ilgili genin transkripsiyon baslangiç bölgesine yakin kisimlarda ve genle ayni DNA iplikçigi üzerinde bulunurlar. Promotörler, transkripsiyonunu baslattiklari gen dizisinden önce karsit tamamlayici DNA dizisinin 3' ucuna dogru olan kisimda bulunurlar. Promotörler genelde farkli nukleotid uzunluklarina sahip olmakla beraber, 100 ila 1000 nukleotid çifti uzunlugunda olurlar.

ELAM-1 promotör, insan E-selektin molekülün'ün promotör bölgesi olup asagida verilen dört adet düzenleyici domene sahiptir. (a) Bir NF-kB baglanma bölgesi (pozisyon -94 ile -85 arasi), (b) Aktive edici transkripsiyon faktör-2 (ATP-2) (ayni zamanda NF-ELAM-1 olarak da bilinir; pozisyon -155 ile -147 arasi) ve yüksek hareketli group protein I (y) (high mobility group protein I (Y); HMG-I(Y)), NF-kB, sitokin ile indüklenen E-selektin transkripsiyonunu düzenlemek için gereklidir, fakat tek basina yeterli degildir. E-selektin promotör bölgesinde yer alan diger baglanma bölgeleri de önem tasimaktadir.

Yapilan in vitro ve in vivo çalismalar, E-selektin'in sitokin ile uyariyi takip eden 4-6 saat içinde ifade edildigini göstermistir. Bu inflamasyonun baslangiç döneminde ELAM-1 promotörün aktive olmasi ile mümkün olmaktadir. Dolayisiyla anti- inflamatuvar etkili terapötik bir proteini kodlayan genin E-selektin promotör kontrolündeki ekspresyonu inflamasyonun basladigi ilk birkaç saatlik evrede terapötik (tedavi edici) ajanin üretilerek devreye girmesini saglayabilmektedir.

Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) geni: Kinurenin yolaginda triptofan yikiliminin baslangiç hiz sinirlayici adimini katalizleyen hücre içi bir enzimdir. IDO kullanimi sonucu gelisen triptofan açligi T h'ücre aktivasyonunu baskilarken, kinL'irenin deriveleri ve serbest oksijen radikalleri gibi triptofan katabolizma ürünleri ise T hücre proliferasyonu (çogalmasi) ve yasamini düzenlemektedir. IDO enfeksiyon, gebelik, transplantasyon, otoimmünite ve hematolojik malgniteleri de içine alan neoplazilerde immün toleransin ind'üklenmesinde önemli rolleri olan bir enzimdir. lDO, bulusta tedavi edici gen kismini olusturmaktadir.

Asagida E-selektin (ELAM-l) Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz (IDO) gen kombinasyonunu içeren plazmit kompozisyonunun elde edilme yöntemine ait islem adimlari detayli olarak verilmektedir.

E selektin promotor bölqesinin çogaltilmasi 200 uL steril PZR tüpünün içerisinde 1X QS Tampon çözeltisi (2 mM MgCl2, New England Biolabs), , 0.02 U/ul Q5 High Fidelity DNA polymeraz, 0.5 uM ileri primer (MluI-F-E selektin 5' ACGCGTATGCATGTAGACTATGGATGA 3'), 0.5 pM geri primer (Sacl-R-E selektin ' GAGCTCTCTCTCAGGTGGGTATCAC 3') ve steril distile su, son hacim 25 uL olacak sekilde karistirilmistir.

PZR döngü kosullari: 98 C 30 saniye ba slangiç denatürasyonu, 35 döngü; 98 C'de dakika 72 C'de tutularak tamamlanmistir. PCR ürünleri 1% agaroz jelde de görüntülenmistir (Sekil 4- M: Moleküler agirlik markörü (100bp marker, Axygen), 1-4 nolu kuyucuklar: E selektin amplifikasyonlari (483bç), 5 nolu kuyucuk: Negatif kontrol).

Kesilen bantlar, Qiagen jel temizleme kiti kullanilarak jelden ayrildiktan sonra TA klonlanmasi için E selektin promotör bölgesi amplifikasyonunun 3' ucuna A takilarak klonlama yapmak üzere kullanilmistir.

E selektin promotor bölqesi amplifikasvonunun 3, ucuna A takilmasi 200 uL steril PZR tüpünün içerisinde 4000ng temizlenmis E selektin promotör bölgesi son hacim 20 uL olacak sekilde karistirilmistir. 30 dakika 72 C'de tutularak reaksiyon gerçeklestirilmistir. pGEM-T Easy vektörüne bantlarin klonlanmasi Agaroz jelden izole edilen ve 3' ucuna A takilan bantlar pGEM-T Easy (Promega) vektörüne klonlanmistir. çözünmüs DNA, 12,5 ng pGEM-T Easy vektörü (Promega), 1X Ligaz Tampon çözeltisi (Promega) ve 100 ünite T4 DNA Ligaz enzimi (Promega) son hacim 10 pL olacak sekilde PZR tüpüne konulmustur. Karisim gece boyunca 4%) de (yakla sik 18 saat) inkübe edilmistir.

E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi E. coli DH5-0i kompetan hücrelerine (New England Biolabs) klonlanmis DNA parçasi içeren pGEM-T Easy vektörü aktarilmistir. Steril 2 mL tübe 5 pL Iigasyon ürünü, ve 50 pL E. coli DH5-oi kompetan hücre eklenmistir. Karisim 30 dakika buzda bekletildikten sonra 42°C 30 saniye isi soku uygulamistir. 5 dakika buzda bekletildikten sonra hücrelerin üzerine 300 mL LB sivi besiyeri eklenerek 37“C 'de 60 dakika büyütülen hücreler LB agar besiyerine ekilerek gece boyunca 37Dde büyümüstür. Transformasyon, hücrelerin ampisilin içeren (LB ampisilin 100 jg/mL) ortamda büyümesi ve X-Gal (80 Eg/mL) kimyasalinin subsurat olarak kullanimi ve lPTG (100 Dg/mL) ile aktive edilen ß Galaktosidaz aktivitesi sebebiyle mavi kolonilerin olusmasi ile kontrol edilmistir. Beyaz koloniler seçilerek hücrelerden plazmit izolasyonu yapilmistir.

Plazmit izolasyonu ve saflastirilmasi Plazmitler QIAGEN QIAprep Spin Miniprep veya Midiprep Kitleri (Qiagen, ABD) gibi plazmit izolasyon kitleri kullanilarak kit içinden çikan prosedüre göre izole edilmistir.

Izole edilen plazmitler %1 agarda görüntülenmistir.

Asagida plazmit izolasyonu ve saflastirma islemi kisaca özetlenmektedir.

Plazmitleri içeren bakteriler kimyasal olarak parçalanip DNAinin disindaki protein ve RNA gibi istenmeyen moleküllerden arindirildiktan sonra plazmit DNA'yi baglayan kolonlara aktarilmistir. Kolonlar iki kez yikandiktan sonra plazmit DNA'yi kolondan ayirmak için elüsyon sivisi kullanilmistir. Plazmit DNA miktari spektrofotometrede 260 nm dalga boyu kullanilarak ölçülmüstür.

Burada kullanilan plazmit izolasyonu ve saflastirma yöntemi yerine herhangi bir benzer ya da baska yöntem kullanilabilir.

Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi DNA'nin plazmit DNA'sina entegre oldugunu göstermek için plazmit DNAisi izole edildikten sonra EcoRI restriksiyon enzimi ile kesilmis beklenen boydaki bantlar tespit edilmistir.

E selektin promotör bölqesinin pGEM-T Easy vektör'ünden kesilerek çikartilmasi pGEMT Easy vektörüne klonlanmis olan E selektin promotör öncelikle restriksiyon enzimi içeren primerler kullanilarak çogaltilip klonlandiklari için bu enzimler ile kesilerek pCMV/thO vektör'üne aktarilmalari saglanmistir. pGEM-T Easy plazmit DNA'si izole edildikten sonra Mlul ve Saol restriksiyon enzimleri ile kesilmis, beklenen boydaki bantlar tespit edilmistir. 8 pg plazmit DNA'si, 1X NE Tampon Çözeltisi , 10 Unite Mlul ve 10 Unite Sacl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs) ve PZR suyu son hacim 50 uL olacak sekilde hazirlanmistir. Karisim 37“C'de 1 saat bekletilmi s, 80“C'de 20 dakika enzim inaktivasyonu yapilarak örnekler 1% agaroz jelde yürütülmüst'ür (Sekil 5 - M1: Moleküler agirlik markör'ü ( 1 -4 nolu kuyucuklar: pGEM- T Easy/Eselektin (483bç), 5-6 nolu kuyucuklar pCMVhIDO (CMV promotor bölgesi CMV promotor bölgesinin pCMVIhIDO vektör'ünden kesilerek çikartilmasi Klonlama yapilmasi için Mlul ve Sacl enzimler ile pCMV/IDO vektöründen CMV promotor bölgesi çikartilmistir. 8 pg plazmit DNArsi, 1X NE Tampon Çözeltisi (New England Biolabs), 1 Ünite Xhol ve 1 Ünite Nhel restriksiyon enzimleri (New England Biolabs) ve PZR suyu son hacim dakika enzim inaktivasyonu yapilarak örnekler 1% agaroz jelde yürütülmüstür (Sekil Klonlanma için kullanilan pCMV/hIDO vektörün'ün restriksiyon haritasi Sekil 1'de gösterilmektedir Mlul ve Saol enzimleri kullanilarak kesim sonucunda CMV sürekli ekspresyon promotörü (590bç) çikartilarak yerine E selektin promotör bölgesi (483 bç) klonlanmistir. Bu sekilde hIDO geni E selektin promotor aktivitesi altinda seçici olarak ekspres olacaktir.

E selektin promotor b'ölqesi ile pCMV/hIDO plazmitinin birlestirilmesi 2 uL jelden temizlenmis plazmit DNA'si (pCMV/thO), 6 uL jelden temizlenmis klonlanacak gen parçasi (E selektin promotor bölgesi), 1X NE Tampon Çözeltisi (MBI Fermentas), , son hacim 10 pL olacak sekilde hazirlanmistir. Karisim 4`C'de gece boyunca bekletilmis ve ertesi gün kompetan E. coli DH50i (New England Biolabs) hücrelerine aktarilmistir.

E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi E. coli DH5-0i kompetan hücrelerine (New England Biolabs), klonlanmis DNA parçasi içeren pREP ELAM-1 pro vektorü aktarilmistir. Steril 2 mL tübe 5 mL dakika buzda bekletildikten sonra 420 30 saniye isi soku uygulamistir. Hücrelerin üzerine 300 mL LB sivi besiyeri eklenerek 37°C 'de 60 dakika büyütülen hücreler 5 dakika buzda bekletildikten sonra LB agar besiyerine ekilerek gece boyunca 37°C37de büyümüstür. Transformasyon, hücrelerin ampisilin içeren (LB ampisilin 100 lg/mL) ortamda büyümesi ile kontrol edilmistir. Büyüyen koloniler seçilerek hücrelerden plazmit izolasyonu yapilmistir.

Plazmit izolasyonu Plazmitler QIAGEN QIAprep Spin Miniprep veya Midiprep Kitleri (Qiagen, ABD) gibi plazmit izolasyon kitleri kullanilarak kit içinden çikan prosedüre gore izole edilmistir.

Izole edilen plazmitler %1 agarda görüntülenmistir.

Asagida plazmit izolasyonu ve saflastirma islemi kisaca özetlenmektedir.

Plazmitleri içeren bakteriler kimyasal olarak parçalanip DNA*nin disindaki protein ve RNA gibi istenmeyen moleküllerden arindirildiktan sonra plazmit DNA'yi baglayan kolonlara aktarilmistir. Kolonlar iki kez yikandiktan sonra plazmit DNA'yi kolondan ayirmak için elüsyon sivisi kullanilmistir. Plazmit DNA miktari spektrofotometrede 260 nm dalga boyu kullanilarak ölçülmüstür.

Burada kullanilan plazmit izolasyonu ve saflastirma yöntemi yerine herhangi bir benzer ya da baska yöntem kullanilabilir.

Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi DNA'nin plazmit DNA'sina entegre oldugunu göstermek için plazmit DNA'si izole edildikten sonra Mlul ve Sacl restriksiyon enzimleri ile kesilmis beklenen boydaki bantlar tespit edilmistir. 10 pg plazmit DNA'si, 1X NE Tampon Çözeltisi 2.1 (New England Biolabs), 10 Unite Mlul ve 10 Unite Sacl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs) ve PZR suyu son hacim 50 uL olacak sekilde hazirlanmistir. Karisim 37°C'de 3 saat bekletilmis, 8ODde 20 dakika enzim inaktivasyonu yapilarak ve örnekler 1% agaroz jelde yürütülmüstür (Sekil 6 - M1: Moleküler agirlik markörü (100bp Iadder, Axygen), 1 nolu kuyucuk: pCMV/hIDO plazmiti ( 590 bç CMV promotor bölgesi), 2-3-4-6-7 nolu kuyucuklar: pCMV/hIDO/E selektin plazmidleri (E selektin promotor bölgesi 483 bç), 5 nolu kuyucuk pGEMT-Easy/ E selektin plazmiti (E selektin promotor bölgesi 483 bç). M2: Moleküler agirlik markörü (1 kb Iadder, Axygen)).

Kesim sonrasinda beklenen boyda bant tespit edilen plazmidlerden 3 adedi 5, AGATCTCCCGATCCCCTATGS' ve 5,CTAGCCAGCTTGGGTCTCC3, primerleri kullanilarak ABl prism-31O Genetic Analyzer kullanilarak sekanslatilmistir. Klonlanan parçanin tamamen dogru sekansda (%100 ayni) oldugu gösterilmistir (Sekil 7).

E-selektin (ELAM-1) Promotör ile Indolamin 2.3 Dioksiienaz (IDO) qen kombinasyonunu iceren plazmitin hücrelere aktarimi ve bahsedilen gg kombinasyonunun islevselliginin test edilmesi Deneylerde, daha önceki çalismalarda kullanilmis olmasi ve kolay transfekte edilebilmesi nedeniyle HeLa hücreleri kullanilmistir. HeLa hücrelerin kültürü için %10 fetal sigir serumu, L-glutamin, penisilin ve streptomisin içeren RPMI164O kullanilmistir.

Plazmitlerin hücre hatlarina ve fare eklem içine aktarilmasi (transfeksiyon) için tercihen lipozom aracili gen transfer yöntemi kullanilmistir. Lipozom aracili gen transferinde anyonik (-) yüklü DNA ile katyonik (+) yüklü çift tabakali lipit keseciklerinin kompleks olusturmasi saglanmaktadir. Ardindan bu kompleks hücrelere veya dokulara uygulandiginda, hücre yüzeyindeki anyonik yük ve hücre membrani-Iipit etkilesimi sonucunda, lipit keseciklerinin tasidigi DNA molekülü hücre içine alinmaktadir. Sekil 8'de katyonik lipit aracili gen transferi mekanizmasi görünümü sematik olarak verilmektedir. Bahsedilen bu çalismalarda tercihen transferi yaptigi gözlenen baska yöntemler de kullanilabilir. Kullanilacak gen transfer yöntemi çalisilacak olan hücre ve dokunun özelliklerine göre degisiklik gösterebilir.

HeLa hücreleri 6 kuyulu kültür plaklarina, 2.5 x 105/kuyu olarak dagitilarak bir gece (yaklasik 18 saat) kültüre edilmistir. Bir kisim kuyudaki hücreler pELAM1.pro/hIDO ile transfekte edilmistir. pELAM-1.pr0/hIDO (Sekil 3) ile transfekte edilen HeLa hücreler farkli dozlarda IL-1 (2 ng/ml ve 5 ng/ml) ile 24 saat süre ile uyarilmistir. Pozitif kontrol olarak th0 geninin yapisal olarak transkripsiyonuna neden olan CMV promotöre sahip pCMV/hIDO, negatif kontrol olarak th0 geni yerine baska bir raportör gene sahip olan pCMV/ßgal (uygunsuz plazmit) kullanilmistir. Uyariyi takiben hücrelerin üst sivilari alinarak ayri tüplere aktarilmis ve ardindan hücreler 2 kez PBS ile yikanarak hücre kazici (cell scraper) ile kazinip 3 kez dondurma ve çözme yapilarak dondurucuda saklanmistir.

Hücre lizatlarindaki hIDO düzeylerinin ölçümü için ELISA testi uygulanmistir.

Indüklenebilir hIDO düzeylerinin IL-1 ile uyarilmayi takiben 24 saat içinde arttirildigi, ancak 5 ng/mL lL-1 ile daha belirgin olarak yükseldigi gözlemlenirken, uyarilmamis hücrelerde hIDO düzeylerinin uygunsuz plazmit ile transfekte hücrelerdekine benzer oldugu saptanmistir. Hücre üstü sivilarinda bakilan, salinan hIDO'nun düzeylerinin ise sadece 5 ng/mL IL-1 uyarisi ile anlamli bir artisa neden oldugu görülmüstür (Sekil lDO enzimatik aktivitesinin ölçümü için yöntem denemesi yapilmistir. lDO aktivitesi triptofan metaboliti olan L-kininürenin konsantrasyonun kalorimetrik ölçümü ile gerçeklestirilmistir (Samikkannu T, et al. AIDS RESEARCH AND HUMAN mM Askorbik asit, 20 pM Metilen mavisi, 200 ug katalaz ve hazirlanan L kininürenin standartlari esit miktardaki buffer ile muamele edilmistir.

Ardindan 30 dk eklenerek reaksiyon durdurulmustur ve 30 dk 52 0C de tekrar inkübe edilmistir. Kisa bir santrifüje takiben süpernatan alinarak esit miktardaki Erlich ayiraci ile renk degisimi gözleninceye (10 dk) kadar oda sicakliginda bekletilmistir. Olusan renk siddeti spektrofotometrik olarak 492 nm 'de okunmustur. Standart egri grafigi L- kininürenin pM cinsinden absorbsiyonu çizilmistir. (Sekil 10).

Hela hücresi kültür lizatlarindaki hIDO aktivitesinin ölçümü için IDO Aktivite testi uygulanmistir. HeLa hücreleri 6 kuyulu kültür plaklarina 2.5 x 105/kuyu olarak dagitilarak bir gece (yaklasik 18 saat) kültüre edilmistir. Bir kisim kuyudaki hücreler pELAM1.pro/hIDO ile transfekte edilmistir. Pozitif kontrol olarak, bir kisim kuyudaki pCMV/hIDO ile, negatif kontrol olarak bir kisim ise pCMV/ßgal (uygunsuz plazmit) ile transfekte edilmistir. Hücreler 24 saat süreyle lL-1 (5 ng/mL) ile uyarilmistir. Hücre lizatlarindaki IDO aktivitesi spektrofotometrik yöntem ile ölçülmüstür. Indüklenebilir thO düzeylerinin lL-1 ile uyarilmayi takiben 24 saat içinde arttirildigi gözlemlenirken, uyarilmamis hücrelerde hIDO düzeylerinin uygunsuz plazmit ile transfekte hücrelerdekine benzer oldugu saptanmistir. (Sekil 11).

Bu deneyler, bulus konusu gen kompozisyonunun islevsel oldugunu ve iltihabi durumlarda lDO geninin üretilebildigini göstermektedir.

Asagida bulus konusu gen kompozisyonunu ile ilgili uygulama örnegi verilmektedir.

Artrit Hauan Modeli Uludag Universitesi, Deneysel Hayvan Yetistirme Uygulama ve Arastirma Merkeziinden 6-8 haftalik (genç) veya 6-8 aylik (yasli) Balb/c tipi erkek ve disi fareler saglanmistir. Fareler Uludag Üniversitesi, Deneysel Hayvan Yetistirme Uygulama ve Arastirma Merkezi'nde (DEHYUAM) kontrollü iklim kosullarinda, sürekli kuru yem ile beslenerek, enfeksiyondan uzak ve veteriner hekim kontrolünde bakilmistir.

Hayvanlar, spesifik patojen free ortam olusturulacak sekilde özel kafes sistemleri içerisinde barindirilmistir. Barindirma isisi 20-24 0C olacak sekilde sabit tutulmus ve aydinlatilmistir. Tüm yapilan uygulamalar, Uludag Üniversitesi Hayvan Etik Kurulunun (HAYDEK) onayladigi prosedürlerle gerçeklestirilmistir.

CIA modelinin olusturulmasi için Collagen bovine nasal septum (Sigma 07806 10mg) ve Freund's Adjuvant Complete (CFA) (Sigma F5881 10mL) kullanilmistir. Bu amaçla kollajen konsantrasyonu 2mg/mL olacak sekilde 0.1 M asetik asit içerisinde çözülmüstür. Deney prosedürüne göre her deney grubunda 10 hayvan (5 disi, 5 erkek) olacak sekilde enjeksiyonlarin 0. gününden itibaren hayvanlarin takibi yapilmistir. 0. gün: Hayvan basina 0.02 mL 2mg/mL kollajen i.a, 0.1 mL CFA ise s.c. olarak enjekte edilmistir. 14. gün: Hayvan basina 0.02 mL 2mg/mL kollajen i.a, 0.1 mL CFA s.c. enjeksiyonlari uygulanmistir. 14. günde yapilan kontrollerde enjeksiyon yapilan ayak eklemlerinde siddetli kizariklik ve sisme gözlenmektedir. . gün: Enjeksiyon yapilan eklemlerde siddetli kizariklik ve sisme 14. gün kontrollerine göre degisiklik göstermemektedir.

ELAM-1 promotör ve lDO qen kompozisyonunun artritli havanlarda tedavi edici etkisi BaIb/c farelere (6-8 haftalik genç veya 6-8 aylik yasli) 3. haftada (artrit olustuktan sonra) yapisal olarak IDO eksprese edilmesini saglayan pCMV/IDO veya hastalikla lDO ekspresyonunun indüklenmesini saglayan pELAM1/lDO plazmiti, lipozom aracili olarak aktarilmistir. Kontrol gruplarina ise PBS uygulanmis veya PCAT/control (uygunsuz plazmit) lipozom aracili olarak aktarilmistir.

Farelerin (her grupta 2 fare) ayak kalinliklari haftalik olarak ölçülmüst'ür. Artritin belirgin olarak olustugu farelerde 3. haftadan itibaren yapilan izlenimlere bakildiginda özellikle indüklenebilir IDO eksprese eden plazmit transfer edilmis, hem genç hem de yasli farelerde, belirgin olarak klinik iyilesme (eklem kalinliginda gerileme) gözlenmektedir. pCMV/lDO ile transfekte edilen farelerde ise genç farelerde kontrol gruplarina göre daha belirgin bir iyilesme saglanabildigi görülmüst'ur (Sekil 12).

Yukarida belirtilen fareler 7. haftada sakrifiye edilerek yapilan histopatolojik degerlendirmelerin sonuçlari asagida Tablo 1'de özetlenmistir.

Asagida Tablo 1'de belirtilen parametreler degerlendirilerek gruplar karsilastirilmis ve 0 ile 4 arasinda degisen derecelerde yangisal reaksiyonlari skorlanmistir.

Tablo 1: Histopatolojik degerlendirme sonuçlari PBS RA iliskili yangisal reaksiyon (4+) pCAT/control (Uygunsuz RA iliskili yangisal reaksiyon (4+) plazmit) pCMV/lDO (terapotik gen) RA iliskili yangisal reaksiyon (2+) pELAM1/IDO RA Iliskili yangisal reaksiyon (2+) 2+ ama kismen grup (indüklenebilirterapötik) içindeki diger 2+!dan daha az siddette yangisal reaksiyon PBS RA iliskili yangisal reaksiyon (4+) pCAT/control (Uygunsuz RA iliskili yangisal reaksiyon (13+) plazmit) pCMV/lDO (terapotik gen) RA iliskili yangisal reaksiyon (3+) pELAM1/IDO RA iliskili yangisal reaksiyon (2+) (induklenebilir terapötik) RA. Romatoid artrit Sonuç olarak; uygulanan gen tedavi stratejisi ile artrit olusturulmus farede klinik ve histopatolojik iyilesme saglanmistir.

Bulus sayesinde, enflamasyon durumunda aktive olan bir promotör (ELAM-1 promotor) kullanilarak, sadece hastaligin basladigi veya aktive oldugu dönemde terapötik madde (IDO) devreye sokularak, henüz daha doku hasari (örnegin artritteki kartilaj hasari) olmadan erken dönemde olayin baskilanmasi saglanabilmektedir.

Bulus, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisi ve organ nakillerinde organ reddinin önlenmesi için sadece inflamasyonun basladigi esnada üretilen tolerans indükleyici potansiyel terapotik bir molekül olan IDOinun ifade edildigi yeni bir gen tedavi kompozisyonudur. Bu bulus sayesinde enflamasyon sirasinda sentezlenen proinflamatuvar sitokinler ve mediyatorler tarafindan uyarilabilen E- selektin promotür*ün kontrolü altinda IDO geninin ifade düzeyi arttirilarak otoimmün yanit baskilanabilmektedir. Enflamasyon geriledikten sonra da sentezlenen tedavi edici proteinin üretimi de sonlanmaktadir.

Bulus, daha az uygulama gerektiren, daha ucuz ve yan etkisi daha az olabilecek gen transferi ile terap'otik genlerin lokal olarak inflamasyon alanina aktarilmasi ya da enflamasyon durumunda üretilen terapötik gen ürünlerinin sistemik ve/veya lokal uygulanmasi seklinde alternatif bir yaklasim sunmaktadir.

Kullanilan plazmit ve tasiyici moleküllerin endotoksin veya immün sistemi uyarici baska bir komponent içermememesi gerekmektedir. Protokollerin en etkin gen transferini saglayacak sekilde optimize edilmesi gerekmektedir.

Claims (4)

ISTEMLER

1. Organ nakillerinde organ reddinin önlenmesini, enflamatuvar, otoimmün ve alerjik hastaliklarin tedavisini saglayan bir kompozisyon olup, özelligi; E-selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içermesidir.

2. Istem “lie uygun kompozisyon olup, özelligi; virüs içine yerlestirilerek kullanilan E- selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içermesidir.

3. istem 1'e uygun kompozisyon olup, özelligi; bahsedilen kompozisyonun, E- selektin Promotör ile Indolamin 2,3 Dioksijenaz gen kombinasyonunu içeren plazmit formunda olmasidir.

4. Istem 3*e uygun plazmit kompozisyonunun elde edilme yöntemi olup, özelligi; E selektin promotör bölgesinin çogaltilmasi, E selektin promotör bölgesi amplifikasyonunun 3' ucuna A takilmasi, TA klonlama plazmitine bantlarin klonlanmasi, E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi, Plazmit izolasyonu ve saflastirma, E selektin promotor bölgesinin TA klonlama plazmitinden kesilerek çikartilmasi, CMV promotor bölgesinin hIDO eksprese eden plazmitten kesilerek çikartilmasi, E selektin promotör bölgesi ile CMV promotör bölgesi çikarilmis olan th0 eksprese eden plazmitin birlestirilmesi, E. coli kompetan hücrelere Iigasyon ürününün aktarilmasi, Plazmit izolasyonu, Izole edilen plazmitlerin görüntülenmesi, Sekanslama sonrasinda elde edilen sekansin hizalanmasi islem adimlarini içermesidir.