KR20020028909A - 핵 피피에이알 수용체를 이용한 발현 조절 시스템 - Google Patents

핵 피피에이알 수용체를 이용한 발현 조절 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트랜스진 발현의 약리학적 조절을 위한 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 (a)PPAR에 대한 반응 요소 및 최소 전사 수용체를 함유하는 요소를 포함하는 유도성 프로모터의 통제하에 있는 해당 핵산을 포함하는 제 1 요소, 및 (b)전사 프로모터의 통제하에 있는 PPAR 암호화 핵산을 포함하는 제 2 요소를 포함하는, 동시, 분리 또는 장기 사용을 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 실험, 임상, 치료 또는 진단 분야에서 상기 조성물의 용도 및 방법에 관한 것이다.

Description

핵 피피에이알 수용체를 이용한 발현 조절 시스템{REGULATION SYSTEM OF EXPRESSION USING NUCLEAR PPAR RECEPTORS}
트랜스진의 발현 수준 및 지속시간에 대한 조절은 다수의 적용분야에서 필수적이다. 이에 따라, 유전자 요법에서, 요법의 성공은 트랜스진으로부터 합성된 단백질의 고유한 분석을 필요로 할 수 있다. 또한, 시험관내에서 재조합 단백질의 생산은 예를 들어 증식 및 생산 단계를 분리하는 유도성 발현 시스템을 이용하여 개선될 수 있다. 트랜스제닉 동물의 작제, 유전자의 효과 및 단백질의 생체이용율에 관한 연구 등은 유전자 발현의 적절한 조절이 이용될 수 있고 개선될 수 있는 다수의 상황에서 이루어지고 있다.
트랜스진의 전사를 위한 프로모터 서열에 결합하는 외래생물 분자에 의해 활성화되는 다양한 인공 전사 조절제가 선행기술에서 개발되었다.
이러한 조절제에 관한 첫번째 구체적인 예는 이.콜라이 Lac 억제제를 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) VP16 트랜스액티베이터 도메인과 융합시켜 작제되었다. 이들 조절제에는 두가지 형태가 존재하는데, 하나는 이소프로필 β-D-티오갈락토사이드(IPTG)에 의해 활성화될 수 있고 나머지 하나는 IPTG에 의해 불활성화된다(Baim S. et al., Proc Nat1 Acad Sci USA, 88(1991) 5072-5076; Labow M. et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990) 3343-3356).
또다른 시스템은 이.콜라이 Tet 억제제를 HSV VP16 트랜스액티베이터 도메인과 융합시켜 작제되었다. 이들 조절제에도 두가지 형태가 존재하며, 하나는 테트라사이클린 또는 이의 유도체에 의해 활성화되고 다른 하나는 동일 분자들에 의해 불활성화된다(Gossen M. and Bujard H., Proc Natl Acad Sci USA. 89(1992) 5547-5551; Gossen M. et al., Science, 286 (1995) 1766-1769).
또다른 시스템은 에스. 세레비지에 GAL4 단백질의 DNA-결합 도메인을 인간 프로게스테론 수용체의 리간드-결합 도메인 및 HSV VP16 트랜스액티베이터 도메인과 융합시켜 작제되었고; 이러한 형태는 RU486과 같은 프로게스테론 유사체에 의해 활성화된다(Wang Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91 (1994) 8180-8184). 초파리 엑디손 수용체와 HSV VP16 트랜스액티베이터 도메인과의 융합에 관해서도 공지되어 있으며, 이는 엑디손과 이러한 스테로이드 호르몬의 유사체에 의해 활성화된다(No D et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93 (1996) 3346-3351). 또다른 시스템은 특정 면역억제 분자(사이클로스포린 A, 라파마이신 및 이의 유도체)의 능력을 이용하여 특정 세포 단백질의 조립을 촉진시킨다. 전사 조절제는 두개의 단백질 서브유닛으로 이루어진다; 첫번째는 하나의 키메릭 DNA-결합 도메인과 인간 FKBP 단백질의 3 카피를 융합시켜 형성될 수 있고 두번째는 인간 FRAP 단백질의 라파마이신-결합 도메인과 인간 NFkB p65 서브유닛의 트랜스액티베이터 도메인을 융합시켜 형성될 수 있다. 이러한 전사 조절제는 두개의 서브유닛을 이합체 형성시키는 라파마이신에 의해 활성화된다(Rivera V. et al., Nat. Med., 2(1996) 1028-1032).
이러한 시스템을 이용하여 몇몇 조직에서 만족스런 수준의 조절을 얻을 수 있지만, 이는 이의 사용 조건을 제한하는 특정의 단점을 나타낸다. 이에 따라, 이러한 전사 조절제는 인간에게서 외래 단백질이다. 이는 실제로 박테리아, 바이러스, 효모 또는 곤충으로부터 얻어진 단백질 단편으로 이루어지거나, 단백질 도메인이 인간 기원인 경우, 이들을 연결하면 인간에게 이질적인 서열을 만들어낸다. 이러한 단백질 도메인은 세포독성 면역 반응을 유도하여, 외래 전사 조절제의 통제하에 해당 유전자를 발현시키는 세포를 파괴하여 트랜스진의 발현을 종결한다. 이러한 상황은 치료 유전자의 반복된 투여를 필요로 하며, 특히 외상 수술을 수반할 경우에 주된 단점이 되며, 특히 치료 유전자의 벡터가 첫번째 주사에서 면역 반응을 일으키는 바이러스인 경우 늘 효과적인 것은 아니다. 부가적으로, 기존의 조절 시스템의 경우에 관찰된 발현 수준도 늘 만족스러운 것은 아니다.
생체내 사용가능하고, 다양한 조직에서 사용될 수 있으며, 활성화된 상태에서 높은 수준의 발현을 보장하는 개선된 발현 조절 시스템이 필요하다. 본 발명은 이들 문제점에 대해 해결책을 제시한다.
본 발명은 생물학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 말하면, 유전자 발현 조절 분야에 관한 것이며, 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 트랜스진의 약리학적 발현 조절을 위한 새로운 시스템의 디자인 및 이의 개발에 관해 기술하고 있다. 본 발명은 구체적으로는 트랜스진의 전사를 활성화시키는 인간 기원의 작제물의 사용에 기초한다. 본 발명은 예를 들어 시험관내, 생체외 또는 생체내 근육 세포에서 핵산 발현을 효율적으로 조절하는 신규의 조성물, 작제물 및 방법에 관해 기술하고 있다. 본 발명은 예를 들면 실험, 임상, 치료 또는 진단 분야에서 다수의 적용을 가진다.
도 1: 플라스미드 FTKpGL3의 개략도.
도 2: 플라스미드 Jx3S-TK-pGL3의 개략도.
도 3: 플라스미드 Jx3AS-TK-pGL3의 개략도.
도 4: 플라스미드 DR1x3S-TK-pGL3의 개략도.
도 5: 플라스미드 DR1x3AS-TK-pGL3의 개략도.
도 6: 마우스 근모세포(C2C12)로의 시험관내 일시적 형질감염에서 평가된 유도성 프로모터의 활성. 세포를: (i) 플라스미드 FTKpGL3 (a), 또는 Jx3S-TK-pGL3 (b), 또는 Jx3AS-TK-pGL3 (c), 또는 DR1x3S-TK-pGL3 (d), 또는 DR1x3AS-TK-pGL3 (e) 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARg2의 증가량, 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 각 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 7: 마우스 근모세포(C2C12)로의 시험관내 일시적 형질감염에서 평가된 유도성 프로모터의 활성. 세포를: (i) 플라스미드 FTKpGL3 (a), 또는 Jx3S-TK-pGL3 (b), 또는 Jx3AS-TK-pGL3 (c), 또는 DR1x3S-TK-pGL3 (d), 또는 DR1x3AS-TK-pGL3 (e) 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARa(Koz)의 증가량, 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 각 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 8:플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3의 개략도.
도 9:마우스 근모세포(C2C12)로의 시험관내 일시적 형질감염에서 평가된 유도성 프로모터의 활성. 세포를: (i) 플라스미드 Jx5AS-TK-pGL3 (a), 또는 Jx5AS-CMV-pGL3 (b) 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARg2의 증가량, 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 각 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 10: 마우스 근모세포(C2C12)로의 시험관내 일시적 형질감염에서 평가된 유도성 프로모터의 활성. 세포를: (i) 플라스미드 JxnAS-TK-pGL3 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARg2 10 ng, 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 각 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 11: 마우스 근모세포(C2C12)로의 시험관내 일시적 형질감염에서 평가된 유도성 프로모터의 활성. 세포를: (i) 플라스미드 JxnAS-CMV-pGL3 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARg2 10 ng (a) 또는 50 ng (b), 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 각 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 12: 플라스미드 pSG5-hPPARg2g2의 개략도.
도 13: 전사 조절제 hPPARg2 및 hPPARg2g2의 비교. 마우스 근모세포(C2C12)를: (i) 플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARg2 (a) 또는 pSG5-hPPARg2g2 (b)의 증가량, 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다. (c): 플라스미드 pSG5-hPPARg2 또는 플라스미드 pSG5-hPPARg2g2로 수득되는 BRL49653에 의해 의한 유도 계수. 이 유도 계수는 BRL49653의 존재시 활성을 DMSO의 존재시 활성으로 나눔으로써 계산된다.
도 14: 플라스미드 Jx10AS-CMV-EF-pGL3의 개략도.
도 15:마우스 근모세포(C2C12)로의 시험관내 일시적 형질감염에서 평가된 유도성 프로모터의 활성. 세포를: (i) 플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3 (a), 또는 Jx10AS-CMV-EF-pGL3 (b) 10 ng, (ii) 플라스미드 pSG5-hPPARg2g2의 증가량, 및 (iii) 플라스미드 pRL-null 20 ng으로 동시형질감염시킨다. 각 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 16: 플라스미드 Jx5AS-TK-luc-hPPARg2의 개략도.
도 17: 플라스미드 SV-g2-J10-C-pGL3의 개략도.
도 18: 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3의 개략도.
도 19: 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3의 개략도.
도 20: 시험관내 상이한 버전의 유도 가능한 시스템의 비교. 마우스 근모세포(C2C12)를 각 시스템 버전에 대해, 유도성 발현 카세트 동몰수로 형질감염시킨다. 결과는 플라스미드 pCMV-leadTK를 사용하여 수득된 hCMV-IE 프로모터의 활성%으로 표시된다. BRL49653으로의 유도 계수는 BRL49653의 존재시 활성을 DMSO의 존재시 활성으로 나눔으로써 계산된다. 1 = pSG5-hPPARg2 + Jx5AS-TK-pGL3; 2 = Jx5AS-TK-luc-hPPARg2; 3 = pSG5-hPPARg2g2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 4 = pSG5-hPPARg2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 5 = SV-g2-J10-C-pGL3; 6 = hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3; 7 = hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3; 8 = hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3; 9 = hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.
도 21: 리간드 BRL49653 및 RG12525의 시험관내 비교. 마우스 근모세포(C2C12)를: (i) 발현 카세트가 (a)에 나타나 있는 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3 10 ng 및 (ii) 플라스미드 pRL-null 10 ng으로 형질감염시킨다. (b) 유도성 프로모터의 활성은 Renilla reniformis 루시퍼라제의 활성을 이용하여 표준화된 Photinus pyralis의 루시퍼라제 활성을 나타낸다.
도 22: 생체내 상이한 버전의 유도 가능한 시스템의 비교. C57BI/6 마우스(그룹당 6 마리 마우스)에 두개 경골 좌우 양측으로, 각 시스템 버전에 대해, 유도성 발현 카세트 동몰수를 주입한다. 이어서 전기전달을 각 근육에 적용한다. 처리된 동물에 매일 강제-주입으로 BRL49653 30 mg/kg을 투여한다. DNA의 주입 4일 후에, 동물을 참수시켜 루시퍼라제 활성을 측정하기 위해 근육을 제거한다. 1 = pCMV-leadTK; 2 = pSG5-hPPARg2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 3 = pSG5-hPPARg2g2 + Jx10AS-CMV-pGL3; 4 = hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3.
도 23: BRL49653으로의 다양한 유도 프로토콜의 생체내 비교. C57BI/6 마우스(그룹당 6 마리 마우스)에 두개 경골 좌우 양측으로 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3(발현 카세트가 (a)에 나타나 있다) 1 ㎍을 함유하는 DNA 10 ㎍을주입한다. 각종 유도 프로토콜로 얻어진 활성이 패널 (b)에 나타내었다.
도 24: 플라스미드 pRDA02의 개략도.
도 25: 유도 가능한 시스템으로 생체내 얻어지는 유도 역학. (A) 10 마리의 C57BI/6 마우스에 두개 경골 좌우 양측으로 플라스미드 pRDA02 3 mg 및 플라스미드 pSG5-hPPARg2 3 mg을 함유하는 DNA 혼합물을 주입한다. 이어서 전기전달을 각 근육에 적용한다. DNA 주입 4일 후, 이어서 39일 후에, 동물을 강제-주입으로, BRL49653 30 mg/kg으로 처리한다. 다양한 시간에, 혈액 샘플을 헤파린 상에 수집하고 분비된 알칼라인 포스파타제(hSeAP)의 효소 활성을 포스파라이트TM키트(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 Tropix, PE Biosystems)를 사용하여, 혈장에서 측정한다. (B) C57BI/6 마우스(10 마리 마우스의 2 그룹)에 두개 경골 좌우 양측으로 플라스미드 pRDA02 3 mg 및 플라스미드 pSG5-hPPARg2 3 mg을 함유하는 DNA 혼합물을 주입한다. 이어서 전기전달을 각 근육에 적용한다. DNA 주입 4일 후에, 동물에 강제-주입으로, BRL49653(30 mg/kg)을 단일 투여로, 또는 5일간 하루에 1회 투여(30 mg/kg)로 투여한다. 다양한 시간에, 혈액 샘플을 헤파린 상에 수집하고, hSeAP의 효소 활성을 "포스파라이트" 키트(Tropix)를 사용하여, 혈장에서 측정한다. 제시된 결과(유도 계수)는 해당일에 측정된 hSeAP 활성과 D4째에 측정된 활성 사이의 비에 해당한다.
도 26: 상이한 PPARg 리간드의 생체내 비교, 및 이들 중 한 가지의 투여 효과 연구. C57BI/6 마우스(그룹당 5 마리 마우스)에 두개 경골 좌우 양측으로, 플라스미드 pRDA02 5 mg 및 플라스미드 pSG5-hPPARg2 5 mg을 함유하는 DNA 혼합물을 주입한다. 이어서 전기전달을 각 근육에 적용한다. DNA의 주입 6일(A) 및 10일(B) 후에, 동물을, 강제-주입으로, 상이한 PPARg 리간드(A; BRL49653, ActosTM(Takeda Pharmaceuticals) 및 AvandiaTM(SmithKline Beecham)), 또는 BRL49653의 다양한 투여량(B)으로 처리한다. 다양한 시간에, 혈액 샘플을 헤파린 상에 수집하고, hSeAP의 효소 활성을 "포스파라이트" 키트(Tropix)를 사용하여, 혈장에서 측정한다. 제시된 결과(유도 계수)는 해당일에 측정된 hSeAp 활성과 D6(A) 또는 D10(B)째에 얻어진 활성 사이의 비에 해당한다.
도 27: 플라스미드 Jx10AS-CMV-VEGFA165의 개략도.
재료 및 방법
플라스미드 DNA의 예비 추출, 플라스미드 DNA의 세슘 클로라이드 구배의 원심분리, 아가로스 겔 상에서의 전기영동, DNA 단편의 전기용출에 의한 정제, 에탄올 또는 이소프로판올을 함유한 식염수 배지에서 플라스미드 DNA의 침전, 이.콜라이에서의 형질전환과 같은, 분자생물학에서 통상 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 다수의 문헌에 설명되어 있다(Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N,Y., 1989).
각종 프로모터 영역의 클로닝을 위해 사용되는, 플라스미드 pGL3-Basic, 및 플라스미드 pRL-null은 시판되고 있는 모델이다(Promega Corporation). 플라스미드pSG5(Stratagene), pBluescript II SK+(Stratagene) 및 pSL301(Invitrogen Corporation) 또한 시판되고 있는 모델이다. 발현 플라스미드 pSG5-hPPARg2(Fajas L. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789) 및 pSG5-hPPARa(Koz)(Gervois P. et al., Mol. Endocrinol., 13 (1999) 400-409)의 작제방법은 이미 설명되었다.
플라스미드 pCMV-leadTK의 작제방법 또한 1998년 9월 25일자 특허 출원 FR 98/120000 및 특허 출원 US SN 60/123,298(예비 출원)에 이미 설명되었다.
이 플라스미드가 하기의 방법으로 작제된다는 것이 상기된다. Tanaka et al.(Cell, 60 (1990) 375-386)에 의해 이미 설명된 발현 벡터 pCGN은 혈구응집소 에피토프를 암호화하는 서열 상류의 HSV tk 유전자(+51/+101) "리더"와 융합된 CMV 프로모터(-522/+72)를 함유한다. 플라스미드 pCGN(10 ng)이 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용되었다. 사용되는 프라이머는 하기와 같다:
- 프라이머 6718
(5'CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG3')(서열번호 26),
이 프라이머는 -522번 위치에서(pCGN의 EcoRI 부위의 8 뉴클레오타이드 하류) CMV 프로모터와 하이브리드화된다.
- 프라이머 6719
(5'GGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGGCCGAA3')(서열번호 27),
이 프라이머는 tk "리더"의 101번 위치까지 하이브리드화된다. 볼드체의 첫번째 뉴클레오타이드 G는 하기에 설명될 것처럼 pGL3-Basic의 NcoI 부위를 복구하려고 한다.
이렇게 수득된 PCR 단편을 정제한 다음 T4 파아지 폴리뉴클레오타이드 키나제(New England Biolabs)를 통해 포스포릴화한다. 동시에, 벡터 pGL3-Basic(Promega)를 NcoI로 선형으로 만들고, 정제한 다음 Klenow DNA 폴리머라제(Boehringer Mannheim)로 처리하여 NcoI 부위를 채운다. 이어서 이 벡터를 알칼라인 포스파타제(Boehringer Mannheim)를 통해 탈포스포릴화한 다음 포스포릴화 PCR 단편의 삽입을 위해 사용한다. 따라서, 프라이머 6719의 구아노신(G)은 CMV-tk 리더 단편이 pGL3-Basic의 HindIII 부위의 하류에 5' 말단(프라이머 6718, CMV의 -522 위치)와 배향되면 NcoI 부위만 복구할 수 있고 3' 말단(프라이머 6719, tk 리더)는 pGL3-Basic의 NcoI 부위(루시퍼라제의 처음 ATG)에 결합한다. 이렇게 수득된 플라스미드는 pCMV-leadTK로 명명된다.
PCR(폴리머라제 연쇄반응) 기술에 의한 DNA 단편의 효소 증폭은 제조업자의 권장에 따라 DNA 써멀 사이클러TM(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행될 수 있다.
플라스미드 DNA의 이.콜라이 세포로의 일렉트로포레이션은 제조업자의 권장에 따라 일렉트로포레이터(Bio-Rad)를 통해 수행될 수 있다.
뉴클레오타이드 서열의 확인은 제조업자의 권장에 따라 Applied Biosystems에 의해 시판되고 있는 키트를 사용하여 Sanger et al.,(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467)에 의해 개발된 방법으로 수행될 수 있다.
쥐 근모세포 C2C12를 10% 태 송아지 혈청(FCS)으로 보충된 DMEMTM배지(LifeTechnologies Inc.)에서 배양한다. 배양은 습식 대기하 37℃의 오븐에서, 5%의 CO2분압으로 수행된다.
형질감염은 24-웰 플레이트에서 수행되고 각 형질감염은 3회 수행된다. 형질감염 24시간 후에, 세포를 DMEMTM배지에서 웰당 3 ×104세포로 접종시킨다. 각 웰에 대해, 플라스미드 DNA 500 ng(500 ng으로 조절하기 위해 해당 플라스미드와 pBluescript II SK+)을 양이온 지질 RPR120535 B(WO 97/18185)와 NaCl 150 mM 및 비카보네이트 50 mM을 포함하는 DMEMTM배지(최종 20 ㎕)에서 DNA ㎍당 지질 6 nmol의 양으로 혼합한다. 실온에서 20분 후에, DNA/지질 혼합물 20 ㎕를 FCS의 부재하에 2시간 동안 세포와 접촉시킨다. 이어서 배양 배지를 FCS 또는 ULTROSERTM(BioSepra Inc.)로 보충하여 각각 10% 또는 2%의 최종 농도를 달성한다. DMSO에 용해된, PPAR 리간드를 FCS 또는 ULTROSERTM와 동시에 배양 배지에 첨가한다. 형질감염 48시간 후에, 배양 배지를 제거하고 세포를 PBS(Life Technologies Inc.)로 2회 세정한다. 이어서 Photinus pyralis 루시퍼라제 활성 및 Renilla reniformis 루시퍼라제 활성을 공급업자의 권장에 따라 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템TM키트(Promega Corporation)를 통해 측정한다.
생체내 유전자 전달 실험이 생후 6주된 C57BI/6 암컷 마우스로 수행된다. 동물을 케타민(Rhone Merieux, 최종 10 mg/㎖)/자일라진(Bayer Pharma, 최종 0.3 mg/㎖) 혼합물 250 ㎕로 복막내 경로로 마취한다. 이어서 DNA 전량 10 ㎍을 각 두개경골 근육에 주입한다. 이어서 다리를 각각 전기장(주파수 1 Hz; 250 V/cm으로 20 ms의 4 펄스)에 가한다. 실험의 전체 지속시간 동안, 동물에 매일 아침 강제-주입으로, 1% 카복시셀룰로스 중의 BRL49653(SmithKline Beecham) 30 mg/kg(중량/용적) 또는 1% 카복시셀룰로스만을 투여한다. 유전자 전달 4일 후에, 동물을 참수시켜 근육을 Lysing MatrixTM관(BIO 101, Inc.)내의 PLBTM용해 완충액(Promega Corporation)에 수집한다. 루시퍼라제 추출을 가능하게 하는, 근육의 분쇄가 FastPrepTM장치(BIO 101, Inc.)를 통해 25초간 6.5 m/s로 수행된다. 이어서 Photinus pyralis 루시퍼라제의 활성을 공급자의 권장에 따라 Luciferase Assay SystemTM키트(Promega Corporation)를 통해 측정한다.
본 발명은 실제로 인간 기원의 활성제를 이용하는 조절 시스템에 관한 것이다. 이로 인해 치료 유전자의 반복된 투여가 필요없다.
본 발명은 특히 전사 조절제로서 PPAR(퍼옥시좀 증폭제-활성화된 수용체) 핵 수용체를 이용하는 개선된 유도성 발현 시스템에 관해 기술하고 있다. 간 특이성 발현 시스템에서 PPRE의 사용이 출원 WO 98/21349에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 개선된 시스템은 현재 전사 조절제(인간 기원의 PPAR 단백질, 따라서 인간에게서 본질적으로 비이질적임)와 유도성 프로모터를 생산할 수 있으며, 유도성 프로모터는 트랜스진의 발현을 조절하고, 한편으론 최소 프로모터로 구성되고, 다른 한편으론 PPAR 반응 요소(PPRE)로 구성된다. 본 발명의 시스템은 시험관내 및 생체내에서, 특히 근육에서, PPAR에 특이적인 리간드에 의해 활성화된다. 또한, 활성화 이후에 얻어진 트랜스진의 발현 수준은 hCMV-IE 프로모터와 같은 강한 프로모터의 수준에 필적할 만하다.
본 발명에 따른 시스템은 실질적인 유도, 내성(특히 생체내 사용의 경우), 강도 및 사용 조건을 동시에 고려하여 다수의 이점을 나타낸다.
본 발명은 따라서 이러한 시스템, 특히 프로모터 영역, 발현 카세트 및 플라스미드의 제조 및 사용을 위한 신규 작제물에 관해 기술하고 있다. 본 발명은 또한 유전자 발현의 개선된 조절을 허용하는 새로운 PPAR 작제물과, 이러한 상이한 작제물의 조합물에 관해 기술하고 있다. 본 발명은 부가적으로 이러한 방법과 조성물이 시험관내 및 생체내에서 발현의 실질적인 통제 및 조절을 가능케함을 보여준다. 본 발명은 또한 본 발명의 작제물을 포함하는 세포, 및 예를 들어 PPAR에 대한 리간드인 화합물의 스크리닝법에 관한 것이다.
좀더 구체적으로 말하면, 본 발명의 제 1 주제는 동시에, 별도로 또는 일정한 시간 간격으로 사용되는 하기를 포함하는 조성물에 있다:
(a)PPAR 반응 요소와 최소 전사 프로모터를 포함하는 유도성 프로모터의 통제하에 해당 핵산을 포함하는 제 1 요소, 및
(b)전사 프로모터의 통제하에 PPAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 요소.
좀더 구체적인 양태에서, 본 발명의 조성물은 동시에, 별도로, 또는 일정한 시간 간격으로 사용하기 위해 부가적으로 하기를 포함한다:
(c)PPAR에 대한 리간드.
유리하게는, 이는 부가적으로 전사 프로모터의 통제하에 레티노이드 X 수용체(RXR)을 암호화하는 핵산을 포함하는 요소 (d)를 포함한다.
동시에, 별도로 또는 일정한 시간 간격으로 사용되는 발현이란 해당 핵산의 발현을 통제하기 위해 요소 (a), (b) 및 경우에 따라, (c) 및/또는 (d)가 별도로 제조되어, 별도로 포장된 다음 순차적으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 전형적으로, 요소 (a)와 (b), 및 임의적인 (d)는 함께 제조되어 포장되지만, 화합물 (c)는 별도로 포장된 다음 (a)와 (b), 및 임의적인 (d)와 함께 일정한 시간 간격으로 사용되며, 세포, 조직, 기관 등에서 이러한 다양한 요소들의 배합이 원하는 발현 조절 효과를 일으킨다.
이러한 관점에서, 본 발명 조성물의 구체적인 양태에서, 요소 (a), (b) 및 임의적인 (d)는 별개의 유전자 작제물에 의해 운반된다.
본 발명 조성물의 또다른 구체적인 바람직한 양태에서, 요소 (a), (b) 및 임의적인 (d)는 동일한 유전자 작제물에 조립된다. 본 발명은 이에 따라 해당 산물과 PPAR을 발현시킬 수 있는 복합 유전자 작제물에 관해 기술하고 있다. 이들 작제물은 특히 자체내에 해당 핵산의 조절된 발현에 필요한 유전적 요소 모두를 함유하기 때문에 유리하다.
유전자 작제물(들)은 다양한, 특히 플라스미드, 에피솜, 염색체, 바이러스 또는 파아지의 천연 및/또는 기원 등일 수 있다. 바람직하게는, 유전자 작제물은 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다.
요소 (a) 또는 (b)를 별도로 운반하는 플라스미드의 예를 들면, 플라스미드 JxnS-TK-pGL3, JxnAS-TK-pGL3, DR1xnS-TK-pGL3, DR1xnAS-TK-pGL3, JxnAS-CMV-pGL3, pSG5-hPPARg2g2 또는 Jx10AS-CMV-EF-pGL3가 언급될 수 있으며, 후에 상세히 기술하겠다.
요소 (a)와 (b)가 조립된 플라스미드의 구체적인 예를 들면, 플라스미드 Jx5AS-TK-Luc-hPPARg2, SV-g2-J10-C-pGL3, hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 또는 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3가 언급될 수 있으며, 후에 상세히 기술하겠다.
바이러스 벡터의 예를 들면, 특히 제조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, AAV, 허피스바이러스, 백시니아 바이러스 등이 언급될 수 있으며, 이의 제조는 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
유전자 작제물의 배열 및 구조는 이하 본문에서 좀더 상세히 기술될 것이다.
이러한 관점에서, 전술한 바와 같이, 요소 (a)는 적어도
- PPAR 반응 요소, 및
- 최소 전사 프로모터를 포함하는 유도성 프로모터를 포함한다.
PPAR 반응 요소(PPRE, "퍼옥시좀 증폭제 반응 요소")는 PPAR을 결합시킬 수 있는 핵산 영역이고, PPAR의 결합은 이웃한 핵산 영역 주변의 시그널을 매개할 수 있다. PPAR 반응 요소는 PPAR을 결합시킬 수 있는 핵산 영역이다. 본 발명을 수행하기 위해, PPAR 반응 요소는 좀더 구체적으로는 1 이상의 PPAR-결합 부위를 포함한다. 이러한 결합 부위, 예를 들면, 다양한 인간 프로모터(예, 아포리포프로테인 AII에 대한 유전자)에 관해서는 선행기술에 공지되어 있다. 이러한 부위를 하기에 기재된 바와 같이 또한 인공적으로 작제할 수 있고, 이의 PPRE 성질에 관해 시험할 수 있다.
특정 양태에서, PPAR 반응 요소는 서열 TCAACCTTTACCCTGGTAG(서열번호 1) 또는 이러한 서열의 기능성 변이체를 지닌 1 이상의 부위를 포함한다. 서열번호 1의 서열은 인간 apoAII 프로모터의 J 영역(뉴클레오타이드 -734에서 -716)에 상응한다.
또다른 특정 양태에서, PPAR 반응 요소는 서열 AGGTCAAAGGTCA(서열번호 5) 또는 이러한 서열의 기능성 변이체를 가진 1 이상의 부위를 포함한다. 서열번호 5의 서열은 컨센서스 영역 DR1에 상응한다.
용어 기능성 변이체는 앞서 언급된 PPRE의 성질, 즉 PPAR을 부착시키는 능력을 보유한 임의의 변형된 서열을 나타낸다. 변형은 해당 서열에서 뉴클레오타이드의 1 이상의 첨가, 돌연변이, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 통상적인 분자 생물학적 방법, 예를 들면 특히 부위-지향성 돌연변이, 좀더 실제적으로는, 합성기에서 서열의 인공 합성에 의해 도입될 수 있다. 일반적으로, 변이체는 해당 초기 서열 잔기의 적어도 50%를 유지하고 있다. 좀더 바람직하게는, 변이체는 해당 서열에서 5개 이하의 뉴클레오타이드에 영향을 미치는 변형을 가진다. 이렇게 얻어진 변이체를 자신의 PPAR 활성에 대해 시험한다. 이러한 성질을 다양한 방식, 특히 하기의 방식으로 체크할 수 있다:
(i)바람직하게는 무세포 시험에서, 시험 서열을 PPAR 및 레티노이드 X 수용체(RXR)와 접촉시키고, (예를 들어 겔 이동 지연에 의해) 복합체 형성을 검출한다;
(ii)시험 서열을 최소 프로모터와 리포터 유전자를 포함하는 발현 카세트에 삽입하고, 카세트를 세포에 도입한 다음, (적절한 분석의 경우) PPAR 및 PPAR에 대한 리간드의 존재 및 부재하에 리포터 유전자의 발현을 검출한다;
(iii)당업자에게 공지된 기타 기술을 이용하여, 핵산과 단백질간의 상호작용을 검출할 수 있다.
변이체는 상기 (ii)에서 측정된 활성이 바람직하게는 서열번호 1 또는 5의 서열을 가진 부위를 이용하여 측정된 활성의 적어도 50%, 좀더 바람직하게는 적어도 75%에 해당된다면 본 발명의 목적상 기능성인 것으로 간주된다. 본 발명의 목적상 PPAR-결합 부위의 기능성 변이체에 관해서는 예를 들면 문헌[참조: Juge-Aubry et al., J. Biol. Chem. 272(1997) 25252 and in Nakshatri et al. NAR 26 (1998) 2491]에 기술되어 있다.
레티노이드 X 수용체(RXR)는 세가지 유전자 RXRα, RXRβ 및 RXRγ에 의해 암호화되며, 이의 분리 및 서열이 공지되어 있다(Mangelsdorf DJ et al. (1990), Nature 345, 224-229; Mangelsdorf DJ et al. (1992), Genes Dev 6, 329-344). 바람직하게는, 요소 (d)는 인간 RXRα를 암호화한다.
PPAR/RXR 헤테로 이합체 형성의 경우, 두 문헌이 참조될 수 있다: Mangelsdorf DJ and Evans RM(1995), Cell 83, 841-850 and Wilson TM and Wahli W (1997), Current Opinion in Chemical Biology 1, 235-241). 문헌[참조: Schulman IG et al. (1989), Molecular and Cellular Biology 18, 3483-3494]은 PPARγ/RXRα 헤테로 이합체에 의한 트랜스액티베이션에 관해 기술하고 있다.
요소 (d)의 사용은 요소 (b)의 활성을 상승시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물에서, PPAR 반응 요소는 PPAR에 결합하는 다수의 부위를 포함할 수 있다. 이는 동일한 부위의 반복이거나 상이한 부위의 조합일 수 있으며, 동일한 부위의 반복이 바람직하다. 좀더 구체적으로 말하면, 반응 요소는 30개 이하의 결합 부위, 바람직하게는 3 내지 20개, 좀더 바람직하게는 5 내지 15개를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태는 10 내지 15개의 결합 부위를 포함하는 작제물이며, 하기 실시예에 제시된 결과는 특히 근육 세포에서 발현 유도 및 수준 측면에서 이러한 작제물의 유리한 성질을 보여준다.
본 발명의 조성물의 요소(a)에 따른 유도성 프로모터의 제조를 위해, PPAR 반응 요소는 전사 최소 프로모터와 조합된다. 최소 프로모터는 낮거나 존재하지 않을 정도의 기본 활성을 가지고, 전사 활성제(PPRE 요소와 활성화된 PPAR의 상호작용)의 존재하에 증가할 수 있는 전사 프로모터이다. 최소 프로모터는 포유동물 세포에서 본래 약한, 즉, 뚜렷한 생물학적 효능을 얻기 위해 무독성 및/또는 불충분한 발현을 일으키는 프로모터일 수 있다. 유리하게는, 최소 프로모터는 전사 활성에 필수적이지 않은 영역 또는 영역들을 결실시켜 네이티브 프로모터로부터 제조된 작제물이다. 이에 따라, 이는 바람직하게는 본질적으로 TATA 박스를 포함하고, 일반적으로 크기가 160개 이하의 뉴클레오타이드이며, 전사 개시를 위한 코돈 둘레에 집중된 프로모터이다. 최소 프로모터는 강하거나 약한 바이러스 또는 세포 프로모터, 예를 들면 허피스바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자의 프로모터, CMV 즉시 프로모터, PGK 프로모터, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 유전자의 프로모터, 다양한 골격근 액틴 이소폼에 대한 유전자의 프로모터, 데스민 유전자의 프로모터, 비멘틴 유전자의 프로모터, 마이오신 경쇄 또는 중쇄 유전자의 프로모터 등으로부터 제조될 수 있다. 최소 프로모터의 구체적인 예는 예를 들면, CMV의 -54번에서 +48번까지 또는 TK 프로모터의 -105번에서 +56번까지의 뉴클레오타이드로 표시된다. 이들 프로모터의 변이체 또는 기타 프로모터로부터의 유사 작제물은 당업자에 의해 작제될 수 있으며 본 발명의 구조내에 사용될 수 있다.
최소 프로모터(Pmin), PPAR 반응 요소(PPRE) 및 해당 핵산(NA)을 요소 (a)에 기능적으로 배열하는데, 즉, 최소 프로모터가 해당 핵산의 발현을 통제하고 이의활성이 PPRE 요소에 의해 조절되도록 배열된다. 일반적으로, 이들 영역들은 5'→3'방향으로 하기 순서대로 배열된다: PPRE-Pmin-NA. 그러나, 당업자는 본 발명에서 벗어남이 없이 기타 기능성 배열을 행할 수 있다.
부가적으로, 상기 다양한 기능성 도메인은 서로 직접 연결되거나, 요소(a)의 프로모터의 조절성에 그다지 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드는 예를 들어 클로닝 단계(PCR의 마지막, 제한 부위 등)에서 생긴 기능적인 측면에서 볼 때 중성 잔기일 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드는 또한 개선된 특성 또는 성능을 본 발명의 시스템에 제공할 수 있는 생물학적 성질을 보유할 수 있다(하우스키핑 유전자의 인핸서, 조직 특이성 인핸서, 사일런서, 인트론, 스플라이싱 부위 등). 이러한 관점에서, 본 발명의 특정 양태에서, 유도성 프로모터는 부가적으로 인핸서 영역을 포함한다. 이러한 영역은 유리하게는 해당 핵산의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 이러한 인핸서(E) 영역은 하기식(5'→3')에 따라 바람직하게는 후자와 해당 핵산 사이의 최소 프로모터의 3'에 위치한다: PPRE-Pmin-E-NA.
또한, 본 발명의 작제물에서, 최소 프로모터와 PPAR 반응 요소는 동일한 배향(즉, 전사 방향)이거나 반대 배향(즉, PPAR 반응 요소가 Pmin 프로모터의 전사에 대해 안티센스 배향으로 놓임)으로 존재할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 이들 두 양태는 시험관내 및 생체내 발현 조절을 효율적으로 통제할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물의 요소(b)는 적어도
- PPAR을 암호화하는 핵산,
- 제 2 전사 프로모터의 통제
를 포함한다.
PPAR은 핵 호르몬 수용체의 상위부류에 속하고, 세가지 별개 그룹, PPARα, PPARδ(소위 NUC-1 또는 PPARβ) 및 PPARγ로 분류된다. 다수의 인간 PPAR의 분리 및 서열이 특히 문헌[참조: Sher T. et al., Biochemistry, 32(1993) 5598-5604; Mukherjee R. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51(1994) 157-166; Fajas L. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789; Mukherjee R. et al., J. Biol. Chem., 272(1997) 8071-8076; Schmidt A. et al., Mol. Endocrinol. 6(1992) 1634-1641]에 공지되어 있다. PPARγ 프로모터는 부가적으로 출원 WO 99/05161에 기재된 바에 따르면 최근에 클로닝되었다.
본 발명의 바람직한 양태에서, PPAR을 암호화하는 핵산은 인간 PPAR, 특히 PPARα 또는 PPARγ를 암호화한다. 실제로 실시예에서 제시된 결과는 이러한 분자의 사용이 본 발명 시스템의 경우에 특히 근육 세포에서 높은 수준의 조절 및 발현을 보장해 주는 것으로 보여준다.
제 1 양태에 따르면, 이는 네이티브 형태, 즉, 천연 분자에 대해 1차 구조의 변형이 없는 PPARα또는 PPARγ이다.
또다른 양태에 따르면, 이는 다수의 리간드-결합 부위를 포함하는 변형된 PPAR이다.
이러한 관점에서, 본 발명은 다수의 리간드-결합 부위를 포함하는 임의의 변형된 PPAR에 관해 기술함과 동시에 이를 주제로 한다. 좀더 구체적으로 말하면, 이는 PPARα 또는 PPARγ, 좀더 바람직하게는 PPARγ이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형된 PPAR은 2 내지 5개의 리간드-결합 부위, 좀더 바람직하게는 2 내지 4개의 결합 부위를 포함한다. 이는 좀더 구체적으로는 리간드에 대한 결합에 수반된 E와 F 도메인의 2 내지 5개의 카피를 함유한 PPAR이다. PPAR 단백질은 다양한 도메인을 함유한다: 리간드와 무관한 트랜스액티베이션 영역을 함유하는 N-말단 A/B 도메인, DNA-결합 도메인(DBD)인 C 도메인과 힌지 영역인 D 도메인, 및 리간드에 좌우되는 트랜스액티베이션 영역을 함유한 E/F 도메인. E/F 도메인은 또한 리간드-결합 도메인(LBD)으로 불린다(특히 Schoonjans K. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1302(1996) 93-109 참조). E/F 도메인의 범위는 PPAR에 따라 다르다. 예를 들면, 사용된 인간 PPARγ2 이소폼의 경우, E/F 도메인은 284번 아미노산에서 505번 아미노산까지이다. 본 발명은 다수의 반복되는 E와 F 도메인을 포함하는 변형된 PPAR을 작제할 수 있고 이러한 변형된 PPAR이 기능적이고 PPAR에 대한 리간드에 의한 개선된 유도성을 보유함을 보여준다. 이러한 작제물은 따라서 본 발명의 일 양태 및 특정 주제를 나타낸다.
본 발명에 따른 변형된 PPAR의 전형적인 예는 2개의 리간드-결합 부위(즉, 두개의 E 및 F 도메인)를 함유한 PPARγ이다. PPARγ2γ2의 완전한 단백질 서열은 서열번호 24의 서열로 표현된다.
서열번호 24
본 발명은 또한 PPAR-형 활성을 보유하고 있는 서열번호 24 서열의 변이체에 관한 것이다(BRL49653과 같은 PPAR 리간드의 존재하에 PPRE 서열을 함유한 프로모터를 활성화시키는 능력). 변이체는 1개 이상의 부가적인 잔기를 함유한 임의의 돌연변이체, 결실체 및/또는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 한다. 바람직하게는 변이체는 서열번호 24의 서열의 잔기의 적어도 80%를 유지하고 있다.
부가적으로, 본 발명은 또한 이러한 변형된 PPAR을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 이는 DNA(특히 cDNA 또는 합성 또는 반합성 DNA) 또는 RNA일 수 있다. 이러한 DNA는 당업자에게 공지된 통상적인 분자 생물학적 방법(라이브러리의 합성, 연결, 스크리닝 등)에 따라 작제될 수 있다. 이는 유리하게는 서열번호 24의 서열을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하거나, 서열번호 24의 폴리펩타이드를 암호화하고 PPAR-형 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 하이브리드화하는 임의의 핵산이다. 부가적으로, 이러한 DNA는 예를 들면, 전사 프로모터 및/또는 터미네이터를 포함할 수 있다.
PPAR을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 제 2 전사 프로모터는 포유동물세포, 특히 인간 세포에서 기능성인 강하거나 약한, 편재하거나 선택적인, 구조적이거나 조절되는 프로모터일 수 있다. 이는 도메스틱 세포 프로모터(즉, 포유동물, 특히 인간, 유전자), 천연 또는 합성의, 단순하거나 복잡한, 바이러스, 박테리아, 곤충 또는 식물 프로모터 등일 수 있다. 이러한 요소(b)에 대한 적절한 프로모터의 예는 특히 바이러스 프로모터(SV40 바이러스 즉시 프로모터, CMV 바이러스 즉시 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 허피스바이러스 TK 프로모터) 또는 세포 프로모터(PGK, 알부민 또는 EF1α프로모터, 또는 하기와 같이 근육에서 고 발현되는 유전자의 프로모터: 근육 크레아틴 키나제(MCK) 유전자의 프로모터, 각종 골격근 액틴 이소폼의 유전자의 프로모터, 데스민 유전자의 프로모터, 비멘틴 유전자의 프로모터, 마이오신 경쇄 또는 중쇄 유전자의 프로모터)이다. 또한, 프로모터는 1개 이상의 인핸서 영역, 예를 들면 베타-글로빈 유전자의 인트론 2의 인핸서 영역, CMV 바이러스 즉시 초기 유전자의 인핸서, EF1α인핸서, 사일런서 영역(들), 조직 특이성을 제공하는 영역(예; 근육 크레아틴 키나제(MCK) 유전자의 프로모터, 다양한 골격근 액틴 이소폼의 유전자의 프로모터, 데스민 유전자의 프로모터, 비멘틴 유전자의 프로모터, 마이오신 경쇄 또는 중쇄 유전자의 프로모터와 같은 조직-특이성 프로모터에서 분리된 영역들) 또는 조절가능한 특성을 도입하거나, 예를 들어 활성에 비필수적인 영역을 결실시켜 변형될 수 있다. 이러한 프로모터를 이용하여 요소 (d)에 함유된 RXR을 발현시킬 수 있다.
바람직한 제 2 프로모터의 예는 바이러스 프로모터, 특히 SV40 바이러스 초기 프로모터 및 CMV 즉시 프로모터, 또는 이들의 유도체이다.
또한, 특정 양태에서, 요소 (a)와 (b), 및 임의적인 (d)를 동일한 유전자 작제물에서 조립할 때, (요소 (b)의) 제 2 전사 프로모터와 요소 (a)의 유도성 프로모터, 및 임의적인 요소 (d)의 프로모터로 분류되어 오직 하나의 공통, 특히 이방향성 프로모터 영역을 형성할 수 있으며, 이에 관해서는 하기에 좀더 상세히 설명될 것이다.
이를 위해, 본 발명의 또다른 주제는 앞서 정의된 요소 (a)와 요소 (b), 및 임의적인 요소 (d)를 포함하는 벡터에 있다.
본 발명의 제 1 변형에 따르면, 요소 (a)와 (b), 및 임의적인 (d)는 벡터에서 동일 배향을 하고 있다. 이러한 변형의 구체적인 예는 플라스미드 SV-g2-J10-C-pGL3이다(도 17).
본 발명의 또다른 변형에 따르면, 요소(a)와 (b), 및 임의적인 (d)는 벡터에서 반대 배향을 하고 있다. 이러한 변형의 구체적인 예는 도 16, 18 및 19에 도시된 플라스미드이다. 좀더 바람직하게는, 이러한 변형 양태에서, 요소 (a)의 유도성 프로모터와 요소 (b)의 전사 프로모터는 벡터에서 조립되어 조절가능한 이방향성 프로모터를 형성한다. 이러한 양태의 구체적인 예는 도 18과 19에 도시된 플라스미드이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 특정 주제는 5'→3' 방향으로 PPAR을 암호화하는 제 1 핵산, 제 1 핵산의 발현을 조절하는 제 1 최소 전사 프로모터, 1 이상의 PPAR 반응 요소(들), 제 2 최소 전사 프로모터 및, 제 2 최소 전사 프로모터의 통제하에, 해당 산물을 암호화하는 제 2 핵산을 포함함을 특징으로 하는 벡터에 있다.
이러한 종류의 작제물은 동일한 플라스미드에서 두개의 핵산을 동시에 발현시키고, PPAR과 이의 리간드에 의해 두개의 핵산을 조절하여 이러한 발현을 증폭시킬 수 있기 때문에 유리하다.
본 발명의 조성물에서 해당 핵산의 발현은 일반적으로 PPAR 리간드(요소 (c))의 존재하에 활성화된다. 이러한 관점에서, 사용된 PPAR에 따르면, 천연 또는 합성의 다양한 종류의 리간드가 이용될 수 있다.
이에 따라, PPARα-활성화 리간드는 피브르산 및 이의 유사체와 같은 피브레이트이다. 피브르산 유사체로서, 특히 겜피브로질(Atherosclerosis 114(1) (1995) 61), 베자피브레이트(Hepatology 21 (1995) 1025), 시프로피브레이트(BCE&M 9(4) (1995) 825), 클로피브레이트(Drug Safety 11(1994) 301), 페노피브레이트(Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), 클리노피브레이트(Kidney International. 44(6) (1993) 1352), 피리닉스산(Wy-14, 643) 또는 5, 8, 11, 14-에이코사테트라논산(ETYA)이 언급될 수 있다. 이러한 다양한 화합물은 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 및/또는 약리학적 사용에 적합하다.
PPARγ-활성화 리간드는 천연 및 합성 리간드 중에서 선택될 수 있다. 천연 리간드로는 지방산과 에이코사노이드(예를 들; 리놀레산, 리놀렌산, 9-HODE, 5-HODE)가 언급될 수 있고, 합성 리간드로는 티아졸리딘디온, 예를 들어 특히 로시글리타존(BRL49653), 피오글리타존 또는 트로글리타존(예를 들면; Krey G. et al.,Mol. Endocrinol., 11(1997) 779-791 or Kliewer S. and Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev. 8(1998) 576-581) 또는 화합물 RG12525가 언급될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 조합된 형태의 다수의 PPAR 활성제, 특히 레티노이드와 조합된 피브레이트 또는 피브레이트 유사체를 함유할 수 있다.
본 발명의 주제는 또한 생체외 또는 시험관내 세포에서 해당 핵산을 발현시키는 앞서 정의된 조성물 또는 벡터의 용도이다.
이와 관련하여, 핵산은 해당 산물(RNA, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등)을 암호화하는 임의의 핵산(DNA, RNA)일 수 있다. 이들은 식품, 치료 또는 백신 부문, 마커 등에서 해당 산물일 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 해당 핵산을 생체내 발현시키기 위해 목적하는 산물의 제조를 위한 상기에서 정의된 조성물 또는 벡터의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 주제는 또한 세포를 상기에서 정의된 조성물 또는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 핵산의 조절된 발현방법이다.
시험관내 또는 생체외 사용을 위해서, 세포는 다양한 프로토콜에 따라 본 발명의 조성물 또는 벡터와 접촉할 있다. 따라서, 배양액 중의 세포는 본 발명의 요소 (a), (b) 및 (c)와, 임의로 (d)와 함께, 예를 들면 요소 (a) 및 (b)를 함유하는 벡터와 함께 리간드 (c)의 존재하에 직접 배양될 수 있다. 이와 달리, 세포는 제 1 단계에서 요소 (a) 및 (b)와 임의로 (d)(특히 동일한 벡터에 조립)와 함께 배양된 다음, 제 2 단계에서(배양 및 변형된 세포의 임의 선별 후), 요소 (c)가 첨가될 수 있다. 이 후자 유형의 프로토콜은 예를 들어, 핵산 발현 상으로부터 배양 상(또는세포 증식 상)을 분리할 수 있다. 이러한 실험은 멸균 조건하에 적합한 배지 및 도구에서, 바람직하게는 플레이트, 디쉬, 플라스크에서 수행될 수 있다. 세포, 벡터 및 리간드의 양은 실시예에 제공된 정보와 당업자의 일반적인 지식을 근거로, 당업자에 의해 쉽게 변화될 수 있다.
생체내 사용을 위해서는, 세포(또는 장기, 조직 등)가 생체내에서, 동시에, 개별적으로 또는 간격을 두고 요소 (a), (b) 및 (c)와, 임의로 (d)를 투여함으로써 접촉하게 된다. 이를 시행하기 위해, 임의로 단일 유전자 작제물 형태로, 요소 (a) 및 (b)와, 임의로 (d)는 일반적으로 비경구, 특히 근육내, 정맥내, 피하, 피내, 종양내 또는 정위 경로로 투여된다. 투여 모드의 선택은 직면한 적용, 표적 조직 및/또는 트랜스진에 의해 암호화되는 해당 산물의 유형에 의해 좌우될 수 있다. 이러한 투여를 위해, 본 발명의 조성물은 세포성 형질감염을 촉진하는 임의의 제제(양이온 중합체, 지질 등)를 포함할 수 있다. 특정 모드에서, 조성물은 근육내 경로로 투여되고, 유전자 작제물은 "네이키드" 핵산 형태로, 즉 형질감염제 첨가 없이 사용된다.
이와 마찬가지로, 요소 (a) 및 (b)와, 임의로 (d)가 바이러스 벡터에 의해 도입되면, 추가의 형질감염제는 필요없다.
실시예에서 설명되는 것처럼, 리간드 (c)는 요소 (a) 및 (b)와, 임의로 (d) 전에, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다.
이러한 측면에서, 리간드의 투여는 예를 들면, 경구, 항문, 정맥내, 복막내 또는 근육내 경로로 수행될 수 있다.
사용되는 투여량은 문헌에 공개된 생체내 데이타를 근거로, 당업자에 의해 변화될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 물에 불용성 형태인 경우에, BRL49653과 같은 리간드의 통상적인 투여량은 5 내지 50 mg/kg, 예를 들면 30 mg/kg이고, 이는 적어도 약 15 ㎍/㎖ 근처의 혈장 농도 수득을 가능하게 한다. 생체이용률이 더 큰, 수용성 형태의 리간드 경우에는(예를 들면, BRL49653의 말리에이트염), 통상의 투여량이 더 적은데, 일반적으로 5 mg/kg 이하, 예를 들면 0.01 내지 1 mg/kg이다. 이러한 투여량은 사용되는 작제물, 사용되는 리간드 및 목적하는 적용 및 효과의 함수로서 당업자에 의해 꽤 확실히 변화될 수 있다. 일반적으로, 실시예에 제시된 결과는 유리하게도 본 발명의 조성물이 통상 사용되는 것보다 적은 리간드 투여량으로, 생체내 고 발현 및 조절된 발현 달성을 가능하게 한다는 것을 보여준다. 또한, 리간드의 반복 투여가 수행될 수 있지만, 제시된 결과는 또한 리간드의 단일 투여 후에 많이 발현됨을 보여준다.
일반적으로, 사용되는 벡터 투여량은 목적하는 적용에 따라, 0.01 내지 1000 ㎍ 이상으로 다양할 수 있다.
본 발명은 유전자를 각종 유형의 세포, 조직 또는 장기에서, 시험관내, 생체외 또는 생체내 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이들은 포유류, 바람직하게는 인간, 세포, 조직 또는 장기일 수 있다. 설명을 위해, 근육 세포(또는 근육), 간 세포(또는 간), 심장 세포(또는 심장, 동맥벽 또는 혈관벽), 신경 세포(또는 뇌, 골수 등) 또는 종양 세포(또는 종양)가 언급될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 작제물, 조성물 및 방법은 근육 세포(또는 근육)에서 핵산의 조절된 시험관내, 생체외 또는 생체내 발현을 위해 사용된다. 실시예에 제시된 결과는 이러한 유형의 세포에서, 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 장점을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명은 또한 상기에서 정의된 조성물 또는 벡터와 접촉함으로써 변형된 임의의 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 해당 핵산이 PPAR 리간드에 대해 시험관내, 생체외 또는 생체내(특히, 근육 세포 또는 근육에서) 스크리닝하기 위한 리포터 유전자(예, 분비된 알칼라인 포스파타제 또는 루시퍼라제)인, 상기에서 정의된 조성물, 벡터 또는 세포의 사용에 관한 것이다. 이러한 측면에서, 본 발명은 또한 상기에서 정의된 세포를 시험 분자(또는 조성물)와 접촉시키는 단계를 포함하는 PPAR 리간드의 동정방법 및 해당 핵산의 발현 검출방법을 설명하고 있다(후자는 바람직하게는 리포터 유전자이다). 발현은 또한, 시험 화합물의 활성을 평가하기 위해, 시험 화합물의 부재하에 또는 대조 리간드의 존재하에 관찰된 발현과 비교될 수 있다.
본 발명은 또한 예비임상시험, 또는 생체이용률 또는 표지 등의 연구에 유용한, 트랜스제닉 동물, 특히 비인간 포유동물의 작제를 위한, 상기에서 정의된 조성물 또는 벡터의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 설명적이고 비제한적이라고 생각되어야 하는 하기의 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된 것이다.
실시예 1: PPAR에 의해 유도 가능한 프로모터 및 이를 함유하는 발현 플라스미드의 작제.
1.1.플라스미드 FTKpGL3
전사 개시 부위에 대해 -105 내지 +56번 위치간의 허피스 심플렉스 바이러스 1형(HSV-1)의 TK 유전자의 프로모터 부분에 상응하는 DNA 단편을 주형으로서 플라스미드 pBLCAT2(Luckow B. and Schutz G., Nucleic Acids Res., 15 (1987) 5490)를 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 5' CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGC CCA GCG 3'(서열번호 28) 및 5' TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3'(서열번호 2)를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 이 단편을 BglII 및 HindIII로 분해한 다음 플라스미드 FTKpGL3을 수득하기 위해 BglII 및 HindIII로 사전에 분해된 플라스미드 pGL3-Basic에 클로닝한다. 이 플라스미드의 개략도는 도 1에 나타나 있다.
1.2.플라스미드 JxnS-TK-pGL3
인간 ApoA-II 유전자의 프로모터의 하나 이상의 (n) J 부위를 함유하는 DNA 단편을 주형으로서 플라스미드 J3TKpGL3(Vu-Dac N. et al., J. Clin. Invest., 96 (1995) 741-750)을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 3RDA37(5' ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTA GAG GAT CTC TAC CAG G 3'; 서열번호 3) 및 4RDA48(5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3'; 서열번호 4)를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 이 단편을 XhoI 및 SpeI으로 분해한 다음 존재하는 J 부위의 개수에 따라, 플라스미드 Jx1S-TK-pGL3, Jx2S-TK-pGL3 및 Jx3S-TK-pGL3를 수득하기 위해, 최소 TK 프로모터(S)의 전사 방향으로, XhoI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 FTKpGL3에 클로닝한다. 플라스미드 Jx3S-TK-pGL3의 개략도는 도 2에 나타나 있다.
플라스미드 J3TKpGL3과 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 3RDA37 및 4RDA48을 사용하여 PCR에 의해 증폭되고, XhoI 및 SpeI으로 분해된 DNA 단편을 또한 존재하는 J 부위의 개수에 따라, 플라스미드 Jx4S-TK-pGL3, Jx5S-TK-pGL3 및 Jx6S-TK-pGL3을 수득하기 위해, XhoI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 Jx3S-TK-pGL3에 클로닝한다.
1.3.플라스미드 JxnAS-TK-pGL3
플라스미드 JxnAS-TK-pGL3은 유도성 프로모터에 존재하는 J 부위의 방향에의해 플라스미드 JxnS-TK-pGL3과 상이하다. 인간 ApoA-II 유전자의 프로모터의 하나 이상의 J 부위를 함유하는 DNA 단편을 주형으로서 플라스미드 J3TKpGL3을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 3RDA37 및 4RDA48을 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 이 단편을 SalI 및 NheI으로 분해한 다음, 존재하는 J 부위의 개수에 따라, 플라스미드 Jx1AS-TK-pGL3, Jx2AS-TK-pGL3 및 Jx3AS-TK-pGL3을 수득하기 위해, 최소 TK 프로모터의 전사 반대 방향으로(AS), XhoI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 FTKpGL3에 클로닝한다. 플라스미드 Jx3AS-TK-pGL3의 개략도는 도 3에 나타나 있다.
플라스미드 J3TKpGL3과 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 3RDA37 및 4RDA48을 사용하여 PCR에 의해 증폭되고, KpnI 및 SpeI으로 분해된 DNA 단편을 또한 존재하는 J 부위의 개수에 따라, 플라스미드 Jx4AS-TK-pGL3 및 Jx5AS-TK-pGL3을 수득하기 위해, KpnI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 Jx3AS-TK-pGL3에 안티센스(AS) 배향으로 클로닝한다.
1.4.플라스미드 DR1xnS-TK-pGL3
이러한 플라스미드는 PPAR 반응 요소(PPRE)로서, 컨센서스 DR1으로 불리는 컨센서스 서열(AGGTCA A AGGTCA, 서열번호 5)을 함유한다. 하나 이상의 컨센서스 DR1 부위를 함유하는 DNA 단편을 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 1RDA69(5' ACG TGT CGA CAC TAG TCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAG AAC TAG 3'; 서열번호 6) 및 2RDA64(5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCG TGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3'; 서열번호 7)을 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 이 단편을 XhoI 및 SpeI으로 분해한 다음 존재하는 컨센서스 DR1 부위 개수에 따라, 플라스미드 DR1x2S-TK-pGL3 및 DR1x3S-TK-pGL3을 수득하기 위해 XhoI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 FTKpGL3에, 센스 배향으로 클로닝한다. 플라스미드 DR1x3S-TK-pGL3의 개략도는 도 4에 나타나 있다.
프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 1RDA69 및 2RDA64를 사용하여 PCR로 증폭되고, XhoI 및 SpeI으로 분해된 DNA 단편을 또한 존재하는 컨센서스 DR1 부위 개수에 따라, 플라스미드 DR1x5S-TK-pGL3, DR1x6S-TK-pGL3 및 DR1x7S-TK-pGL3을 수득하기 위해 XhoI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 DR1x3S-TK-pGL3에 클로닝한다.
1.5.플라스미드 DR1xnAS-TK-pGL3
플라스미드 DR1xnAS-TK-pGL3은 유도성 프로모터에 존재하는 컨센서스 DR1 부위의 배향에 의해 플라스미드 DR1xnS-TK-pGL3과 상이하다. 하나 이상의 컨센서스 DR1 서열을 함유하는 DNA 단편을 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 1RDA69 및 2RDA64를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 이 단편을 SalI 및 NheI으로 분해한 다음, 존재하는 컨센서스 DR1 부위의 개수에 따라, 플라스미드 DR1x2AS-TK-pGL3 및 DR1x3AS-TK-pGL3을 수득하기 위해 XhoI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 FTKpGL3에 안티센스 배향으로 클로닝한다. 플라스미드 DR1x3AS-TK-pGL3의 개략도는 도 5에 나타나 있다.
프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 1RDA69 및 2RDA64를 사용하여 PCR에 의해 증폭되고, KpnI 및 SpeI으로 분해된 DNA 단편을 또한 존재하는 컨센서스 DR1 부위의 개수에 따라, 플라스미드 DR1x5AS-TK-pGL3 및 DR1x6AS-TK-pGL3을 수득하기 위해 KpnI 및 NheI으로 사전에 분해된 플라스미드 DR1x3AS-TK-pGL3에 클로닝한다.
실시예 2: 상이한 반응 요소에 대한 PPAR의 특이성.
2.1. hPPARg2를 사용하는 시스템
전사 조절제로서 hPPARg2를 사용하는 유도성 프로모터의 활성은 마우스 근모세포에서의 일시적 형질감염에서 평가되었다(도 6). 결과는, 사용된 반응 요소 (PPRE)에 따라, hPPARg2 리간드(BRL49653)에 의한 유도 및 활성화 후의 최종 활성이 변함을 보여준다. 최상의 결과는 PPRE로서 J 부위를 사용하여 수득되었다. 또한, PPRE의 배향이 중요하다. J 부위의 경우에, AS 배향이 더욱 호적하다(패널 c).
2.2.hPPARa를 사용하는 시스템
hPPARa를 전사 조절제로 사용하여 수득된 결과는 도 7에 나타나 있다. hPPARg2와는 달리, 이는 hPPARa에 대한 최상의 PPRE인 컨센서스 DR1이다(패널 d 및 e).
따라서, 이러한 결과는 (1)본 발명의 플라스미드의 기능성 및 (2)유도성 시스템내 선택된 PPAR에 따라, 전사 조절제에 가장 적당한 PPRE를 선택하는 것이 중요함을 보여준다. 이러한 선택은 리간드의 존재로 인해 유도 계수뿐만 아니라 유도후 도달된 활성의 수준에도 영향을 미칠 수 있다. 다른 PPRE도 본 발명의 시스템에 사용될 수 있음이 이해된다.
실시예 3: 예를 들면, hCMV-IE 최소 프로모터와 같은 HSVI-TK의 프로모터가 아닌 최소 프로모터를 함유하는 PPAR에 의해 유도가능한 프로모터의 작제
3.1.hCMV-IE 최소 프로모터를 함유하는 플라스미드의 작제
hCMV-IE 최소 프로모터(전사 개시 부위에 대해 -54번 위치부터 +48번 위치까지)를 함유하는 DNA 단편을 플라스미드 pCMVβ(Clontech)를 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드 5RDA32(5′ACG TAG ATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3′;서열번호 8) 및 6RDA29(5′ACG TAA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3′;서열번호 9)를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 이러한 단편을 HindIII 및 BglII로 분해하고 이어서 HindIII 및 BglII로 사전에 분해시킨 플라스미드 FTKpGL3에 클로닝하여 플라스미드 FCMVpGL3를 수득한다.
플라스미드 Jx5AS-TK-pGL3를 BglII 및 NheI로 분해하여 J 부위의 5 카피를 함유하는 179 bp의 BglII-NheI 단편을 분리한다. 이 단편을 BglII 및 NheI로 사전에 분해시킨 플라스미드 FCMVpGL3에 삽입하여 플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3를 수득한다. 플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3의 개략도를 도 8에 나타내었다.
플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3를 SphI 및 NheI로 분해하여 J 부위의 5 카피, hCMV-IE 최소 프로모터 및 루시퍼라제를 암호화하는 유전자의 5′부분을 함유하는 982 bp의 SphI-NheI 단편을 분리한다. 이 단편을 SphI 및 SpeI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3에 삽입시켜 플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3를 수득한다. 플라스미드 Jx15AS-CMV-pGL3 및 Jx20AS-CMV-pGL3도 동일한 전략에 따라 수득된다.
3.2.hCMV-IE 최소 프로모터를 함유하는 플라스미드의 활성
유도성 시스템에 사용될 수 있는 최소 프로모터를 일시적 형질감염에서 비교한다. 도 9에 나타낸 결과는 최소 프로모터에 따라, 유도 후의 최종 활성이 2배까지 변할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 특히, 시험된 조건하에서, CMV 프로모터가 고활성을 부여하는 것으로 보임을 보여준다. 물론, TATA박스를 함유하지 않는 프로모터와 같은 다른 최소 프로모터도 사용될 수 있다.
실시예 4: 유도성 프로모터에 존재하는 반응 요소 개수의 중요성
유도성 프로모터에 존재하는 PPRE의 수의 최적화가 일시적 형질감염에서 연구되었다. 도 10에 나타낸 결과는 PPRE의 카피수가 클수록, 리간드에 대한 유도 계수 및 유도된 활성이 더 크다는 것을 보여준다. 한편, 이 수치가 지나치게 높으면, 유도 계수 및 유도된 활성이 감소하고, 이는 분석시에 존재하는 hPPARg2의 양과는 무관하다(도 11). PPRE의 최적수는 10 내지 15인 것으로 보인다.
실시예 5: PPAR 리간드에 의해 고도로 유도가능한 전사 조절제의 작제
5.1.리간드-결합 도메인의 두 카피를 포함하는 전사 조절제의 작제. 플라스미드 pSG5-hPPARg2g2의 작제.
F 도메인의 C-말단부를 암호화하는 hPPARg2에 상보적인 DNA 영역을 함유하는 A로 나타낸 DNA 단편을 플라스미드 pSG5-hPPARg2를 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드 20RDA21(5′GGT TTG CTG AAT GTG AAG CCC 3′;서열번호 10) 및 21RDA42(5′AGT CTC TAG AGC TAC GCG TAC AAG TCC TTG TAG ATC TCC TGC 3′;서열번호 11)를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭한다. E 및 F 도메인을 암호화하는hPPARg2에 상보적인 DNA 영역을 함유하는 B로 나타낸 DNA 단편을 플라스미드 pSG5-hPPARg2를 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드 22RDA32(5′AGT CAC GCG TGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG AC 3′;서열번호 12) 및 23RDA21(5′GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3′;서열번호 13)를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. SacI 및 MIuI으로 분해시킨 A 단편 및 MIuI 및 XbaI으로 분해시킨 B 단편을 SacI 및 XbaI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 pSG5-hPPARg2에 함께 클로닝시켜 플라스미드 pSG5-hPPARg2g2를 수득한다. 개략도를 도 12에 나타낸 이 플라스미드는 E 및 F 도메인, 즉 두 리간드-결합 도메인의 두 카피를 포함하는 전사 조절제(hPPARg2g2로 표시)를 암호화하는 상보 DNA를 함유한다.
PPARγ2γ2의 완전한 서열은 하기와 같다(서열번호 24):
E 및 F 도메인을 포함하는 PPARγ2γ2의 C-말단부의 서열은 서열번호 25의 하기 서열이다:
5.2.플라스미드 pSG5-hPPARg2g2의 활성
도 13에 나타낸 결과는 유도된 활성이 전사 조절제로서 hPPARg2g2를 사용할 경우에 더 낮으며(도 13a 및 13b), 리간드에 대한 유도 계수(도 13c)는 이러한 조절제로 훨씬 더 높다는 것을 보여준다. 두 전사 조절제 간의 차이는 hPPARg2g2의 경우에, 존재하는 조절제의 양과 무관하게, 리간드 부재하에서 시스템의 백그라운드 노이즈가 낮고 낮게 유지된다는 사실에 의해 설명된다. 한편, hPPARg2g2의 증가가 높을수록, 유도된 활성도 높아지는데, 이는 포화되는 것으로 보이는 hPPARg2를 사용하는 시스템에 대해서는 맞지 않다.
따라서, 제 2 리간드-결합 도메인(hPPARg2g2)의 존재는 전사 조절제에 리간드에 의한 더 큰 유도능을 부여한다.
실시예 6: 유도성 프로모터의 최종 활성 증가
6.1.hEF1a의 인트론을 포함하는 유도성 발현 카세트의 작제. 플라스미드 Jx10AS-CMV-EF-pGL3의 작제
hEF1a을 암호화하는 유전자(전사 개시 부위에 대해 +16번 위치부터 +984번 위치까지; Genbank 수탁번호: E02627)의 제 1 인트론을 함유하는 DNA 단편을 올리고뉴클레오타이드 25RDA35(5′AGT CAC TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG 3′; 서열번호 14) 및 26RDA36(5′AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTC ACG ACC 3′; 서열번호 15)를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 이 단편을 HindIII 및 NcoI로 분해시키고 이어서 HindIII 및 NcoI로 사전에 분해시킨 플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3에 클로닝하여 플라스미드 Jx10AS-CMV-EF-pGL3을 수득한다.플라스미드 Jx10AS-CMV-EF-pGL3의 개략도를 도 14에 나타내었다.
6.2.플라스미드 Jx10AS-CMV-EF-pGL3의 활성
시스템의 최종 활성을 증가시키기 위하여, hEF1a 유전자의 제 1 인트론에 위치한 인핸서 서열을 유도성 프로모터 부근에 클로닝시킨다. 도 15에 나타낸 결과는 인핸서 영역의 존재가 시스템의 유도된 활성을 증가시킴을 보여주며, 이는 사용된 전사 조절제의 양과 무관하다.
실시예 7: 전사 조절제의 발현 카세트 및 유도성 발현 카세트 모두를 포함하는 플라스미드의 작제
7.1.플라스미드 Jx5AS-TK-luc-hPPARg2
플라스미드 pSG5-hPPARa(Koz)를 MluI 및 ScaI로 분해시켜 hPPARa에 상보적인 DNA의 3′영역을 함유하는 1229 bp의 MluI-ScaI 단편을 분리해낸다. 이 단편을 MluI 및 SmaI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 pSL301에 삽입시켜 플라스미드 pSL-3′hPPARa를 수득한다.
플라스미드 pSG5-hPPARa(Koz)를 SalI 및 MluI로 분해시켜 SV40 바이러스 초기 프로모터 및 hPPARa에 상보적인 DNA의 5′영역을 함유하는 1406 bp의 SalI-MluI 단편을 분리한다. 이 단편을 XhoI 및 MluI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 pSL-3′hPPARa에 삽입시켜 플라스미드 pSL-hPPARa를 수득한다.
플라스미드 pSL-hPPARa을 SpeI 및 SalI로 분해시켜 SV40 바이러스 초기 프로모터 및 hPPARa에 상보적인 DNA를 함유하는 2664 bp의 SpeI-SalI 단편을 분리한다. 이 단편을 SpeI 및 SalI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 pBluescript II SK+에 삽입시켜 플라스미드 pBS-hPPARa를 수득한다.
플라스미드 pSG5-hPPARg2를 AvrII 및 SacI으로 분해시켜 hPPARg2에 상보적인 DNA의 5′영역을 함유하는 C로 표시한 2070 bp의 AvrII-SacI 단편을 분리한다 hPPARg2에 상보적인 DNA의 3′영역을 함유하는 D로 표시된 DNA 단편을 플라스미드 pSG5-hPPARg2를 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드 10RDA21(5′CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3′;서열번호 16) 및 11RDA40(5′TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC CTG C 3′;서열번호 17)을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. SacI 및 SalI으로 분해시킨 C 단편 및 D 단편을 AvrII 및 SalI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 pBS-hPPARa에 함께 클로닝시켜 플라스미드 pBS-hPPARg2를 수득한다.
플라스미드 Jx5AS-TK-pGL3을 KpnI 및 SalI으로 분해시켜 유도성 프로모터의 통제하에 있는 luc+ 유전자를 함유하는 2324 bp의 KpnI-SalI 단편을 분리해낸다. 이 단편을 KpnI 및 SalI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 pBS-hPPARg2에 삽입시켜 플라스미드 Jx5AS-TK-luc-hPPARg2를 수득한다. 플라스미드 Jx5AS-TK-luc-hPPARg2의 개략도를 도 16에 나타내었다.
7.2.플라스미드 SV-g2-J10-C-pGL3
플라스미드 pBS-hPPARg2를 NotI 및 SalI으로 분해시켜 SV40 초기 프로모터의 통제하에 있는 hPPARg2에 상보적인 DNA를 함유하는 E로 표시된 2622 bp의 NotI-SalI 단편을 분리해낸다. SV40 바이러스 폴리아데닐화 부위를 함유하는 F로 표시한 DNA 단편을 플라스미드 FTK-pGL3을 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드18RDA31(5′AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACA TGA TAA G 3′;서열번호 18) 및 19RDA35(5′AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTT ATC GAT TTT ACC AC 3′;서열번호 19)를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. SalI 및 NheI으로 분해한 E 단편 및 F 단편을 NotI 및 NheI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3에 함께 클로닝시켜 플라스미드 SV-g2-J10-C-pGL3을 수득한다. 플라스미드 SV-g2-J10-C-pGL3의 개략도를 도 17에 나타내었다.
7.3.플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3
hPPARg2에 상보적인 DNA를 함유하는 G로 표시한 DNA 단편을 플라스미드 Jx5AS-TK-luc-hPPARg2를 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드 12RDA50(5′GTC AGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3′;서열번호 20) 및 13RDA42(5′TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TGG 3′;서열번호 21)을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. hCMV-IE 최소 프로모터(전사 개시 부위에 대해 -54번 위치부터 +48번 위치까지)를 함유하는 H로 표시한 DNA 단편을 플라스미드 pCMVβ를 주형으로 및 올리고뉴클레오타이드 14RDA33(5′GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AGG 3′;서열번호 22) 및 15RDA33(5′TAC GCT CGA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GCG 3′;서열번호 23)을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. KpnI 및 XhoI로 분해시킨 G 단편 및 XhoI 및 NheI으로 분해시킨 H 단편을 KpnI 및 NheI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 Jx5AS-TK-pGL3에 함께 클로닝하여 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3을 수득한다. 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3의 개략도를 도 18에 나타내었다.
7.4.플라스미드 hPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3
플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3을 NheI 및 SphI으로 분해시켜 유도성 프로모터의 통제하에 있는 luc+ 유전자의 5′영역을 함유하는 982 bp의 NheI-SphI 단편을 분리해낸다. 이 단편을 SpeI 및 Sph으로 사전에 분해시킨 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3에 삽입시켜 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3을 수득한다. 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3의 개략도를 도 19에 나타내었다.
플라스미드 Jx5AS-CMV-pGL3을 NheI 및 SphI으로 분해시켜 유도성 프로모터의 통제하에 있는 luc+ 유전자의 5′영역을 함유하는 982 bp의 NheI-ShpI 단편을 분리해낸다. 이 단편을 SpeI 및 SphI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3에 삽입시켜 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3을 수득한다.
플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3을 NheI 및 SphI으로 분해시켜 유도성 프로모터의 통제하에 있는 luc+ 유전자의 5′영역을 함유하는 1151의 NheI-SphI 단편을 분리해낸다. 이 단편을 SpeI 및 SphI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3에 삽입시켜 플라스미드 hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3을 수득한다.
실시예 8: 시험관내에서 유도성 시스템의 상이한 버전의 비교
도 20에 유도성 시스템의 다양한 버전으로 시험관내에서 수득한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 단지 하나의 플라스미드만을 사용하는 시스템(도 20, 라인 2 및 5 내지 9)과 마찬가지로 두 플라스미드를 사용하는 시스템(도 20, 라인 1, 3 및 4)도 기능성임을; 즉, PPARg 리간드(여기에서는 BRL49653)의 존재가 유도성 프로모터의 통제하에 놓인 유전자의 발현을 대폭 증가시킴을 보여준다. 또한, 일부시스템의 경우에(도 20, 라인 3 및 7 내지 9), 리간드에 대한 유도 계수가 30 이상이고, 도 20의 라인 4에 나타낸 시스템의 경우에, 유도 후의 활성이 hCMV-IE 프로모터의 것과 같이 강력한 프로모터의 것에 필적함이 관찰되었다.
실시예 9: 각종 PPAR 리간드는 유도성 시스템을 활성화시킬 수 있다
9.1.hPPARg2를 사용하는 시스템
도 21에 나타낸 결과는 BRL49653 이외의 hPPARg 리간드, 여기에서는 RG12525(hPPARg에 대한 RPR 리간드)가 유도성 시스템을 활성화시키는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 100 ㎛의 농도에서, RG12525에 의한 처리는 BRL49653으로 수득한 것보다 더 높은 유도를 이끌었다. 따라서, 여타의 PPARg 리간드도 시스템의 유도제로 사용될 수 있다.
9.2.hPPARa을 사용하는 시스템
hPPARg을 사용하는 시스템에 대한 것과 동일한 방법으로, 전사 조절제로서 hPPARa를 사용하는 시스템은 예를 들면, 피브레이트 또는 WY-14,643 또는 여타 hPPARa 리간드로 활성화될 수 있다.
실시예 10: 유도성 시스템은 근육에서 생체내 활성화될 수 있다
유도성 시스템의 상이한 버전으로 근육내 생체내에서 수득된 결과를 도 22에 나타내었다. 결과는 시험된 3개의 버전의 경우에(도 22, 라인 2 내지 4), hPPARg 리간드로 강제-주입함으로써 처리하면 근육에서 유도성 프로모터의 활성을 대폭 증가시킬 수 있음을 보여준다. 유도 계수는 도 22 라인 2 버전의 경우에 x14, 도 22 라인 3 버전의 경우에 x8, 및 도 22 라인 4 버전의 경우에 x24이다. 또한, 버전 중하나에 대해(도 22, 라인 2), BRL49653으로 처리한 동물에서 수득된 활성은 hCMV-IE 프로모터와 같은 강력한 프로모터의 활성 정도이다.
도 23에 나타낸 결과는 또한, 단일 용량의 리간드가 이러한 용량이 유전자 전달 전후 어느 때 취해지든 시스템을 유도할 수 있음을 보여준다. 이러한 실험은 또한, 통상 사용되는 것보다 2배 적은 용량으로도 동일한 유도 계수를 수득케 할 수 있음을 보여준다.
전사 조절제로서 PPAR 핵 수용체를 사용하는 시스템은 따라서 생체내에서 기능성이고 PPAR 리간드의 경구 투여에 의해 유도될 수 있다.
실시예 11: 산물이 분리되는 유전자의 유도성 발현을 허용하는 플라스미드의 작제
11.1플라스미드 pRDA02의 작제
플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3을 HindIII 및 MluI로 분해시켜 459 bp의 HindIII-MluI 단편을 분리해낸다. 이 단편을 HindIII 및 MluI로 사전에 분해시킨 플라스미드 pXL3010(Bettan M. et al., Anal. Biochem., 271(1999) 187-189)에 삽입시켜 플라스미드 pRDA02를 수득한다. 이 플라스미드는 발현이 전사 조절제로서 PPAR을 사용하는 시스템에 의해 유도가능한 프로모터의 통제하에 있는 인간 태반 알칼라인 포스파타제(hSeAP)의 분비된 형태를 암호화하는 유전자에 상보적인 DNA를 함유한다. 플라스미드 pRDA02의 개략도를 도 24에 나타내었다.
실시예 12: 유도성 시스템은 생체내에서, 분비된 단백질의 혈장 농도를 조절 가능하게 한다
도 25에 나타낸 결과는 유도성 시스템을 사용함으로써, 시간 경과에 따라, 근육으로부터 분비된 단백질의 혈장 농도를 조절할 수 있음을 보여주며, 이는 PPAR 리간드의 단순한 경구 투여로 달성된다. hSeAP의 혈장 농도는 리간드 투여 2일 후 18배까지 증가된 다음(도 25a), 1주일 후에 기저수준으로 복귀한다. 21일째와 39일째 사이에, 인간 기원의 hSeAP에 대한 면역반응이 관찰되고 이 단백질의 혈장 농도 감소가 일어난다. 이러한 면역반응에도 불구하고, 제 2 유도 사이클을 수행할 수 있다(도 25a).
도 25b에 나타낸 바와 같이, 유도성 시스템은 또한, 리간드의 일상 투여에 의해, 처리 지속기간에 상당하는 기간 동안 고수준으로 hSeAP의 혈장 수준을 유지시킬 수 있다.
실시예 13: 다양한 PPAR 리간드가 생체내에서 유도성 시스템을 활성화시킬 수 있고, 이는 용량-의존식이다
II형 당뇨병의 치료를 위한 시판 형태의 BRL49653(AvandiaTM, SmithKline Beecham) 및 이러한 동일 치료를 위한 시판 형태의 피오글리타존(ActosTM, Takeda Pharmaceuticals)도 유도성 시스템을 활성화시킬 수 있다(도 26a). 도 26b는 또한, 유도 계수가 사용된 리간드의 용량과 직접 상관관게가 있음을 보여준다.
따라서, 전사 조절제로서 PPAR 핵 수용체를 사용하는 시스템은 분비된 단백질의 혈장 수준을 매우 정확하게 조절할 수 있게 한다. 또한, 이러한 조절은 다양한 PPAR 리간드를 사용하여 수득될 수 있다.
실시예 14: 산물이 맥관형성 인자인 유전자의 유도성 발현을 허용하는 플라스미드의 작제
14.1플라스미드 Jx10AS-CMV-VEGFA165의 작제
인간 VEGF165 판독 프레임을 인간 태반의 전체 RNA(Clontech)(Houck et al., Mol. Endocrinol. 12 (1991) 1806-1814)로부터 역전사 및 PCR에 의해 클로닝한 다음 -522번에서 +72번 위치에 이르는 CMV E/P 프로모터 및 SV40 후기 polyA를 함유하는 플라스미드 pBluescript(Stratagene)에 삽입시켜 플라스미드 pXL3218을 수득한다. 이어서, 후자를 HindIII 및 BsrGI으로 분해시켜 482 bp의 HindIII-BsrGI 단편 A을 분리해낸다. 플라스미드 pXL3218도 BsrGI 및 BamHI으로 분해시켜 390 bp의 BsrGI-BamHI 단편 B를 분리해낸다. 단편 A와 B를 HindIII 및 BamHI으로 사전에 분해시킨 플라스미드 Jx10AS-CMV-pGL3에 삽입시켜 플라스미드 Jx10AS-CMV-VEGFA165를 수득한다. 이 플라스미드는 발현이 전사 조절제로서 PPAR을 사용하는 시스템에 의해 유도가능한 프로모터의 통제하에 있는 VEGFA165를 암호화하는 유전자에 상보적인 DNA를 함유한다. 플라스미드 Jx10AS-CMV-VEGFA165의 개략도를 도 27에 나타내었다.
이 플라스미드는 예를 들면, 시간 경과에 따라, 치료 목적을 위한 VEGF의 맥관형성 활성을 조절하는 데 사용될 수 있다.

Claims (30)

  1. (a)PPAR 반응 요소 및 최소 전사 프로모터를 포함하는 유도성 프로모터의 통제하에 있는 해당 핵산을 포함하는 제 1 요소, 및
    (b)전사 프로모터의 통제하에 있는 PPAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 요소를 포함하는, 동시에, 별도로 또는 일정 시간에 걸쳐서 간격을 두고 사용하기 위한 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, (c)PPAR을 위한 리간드를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 동시에, 별도로 또는 일정 시간에 걸쳐서 간격을 두고 사용하기 위한 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 요소 (a) 및 (b)가 별개의 유전자 작제물에 의해 운반됨을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 요소 (a)와 (b)가 동일한 유전자 작제물에 조립됨을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 유전자 작제물이 플라스미드 또는 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, PPAR 반응 요소가 하나 이상의 PPAR-결합 부위를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, PPAR 반응 요소가 서열번호 1의 서열 또는 이러한 서열의 기능성 변이체를 갖는 하나 이상의 부위를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, PPAR 반응 요소가 서열번호 5의 서열 또는 이러한 서열의 기능성 변이체를 갖는 하나 이상의 부위를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 요소가 30개 이하, 바람직하게는 3 내지 20개, 더욱 바람직하게는 5 내지 15개의 결합 부위를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 프로모터가 전사 활성에 필수가 아닌 영역이 결실된 세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터임을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 프로모터가 인핸서 영역을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 프로모터 및 PPAR 반응 요소가 동일 배향임을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 프로모터 및 PPAR 반응 요소가 반대 배향임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, PPAR을 암호화하는 핵산이 PPARα또는 PPARγ를 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, PPAR을 암호화하는 핵산이 수개의 리간드-결합 부위를 포함하는 변형된 PPAR을 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 프로모터의 통제하에 있는 RXR을 암호화하는 핵산을 포함하는 요소 (d)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  17. 청구항에 따른 요소 (a) 및 요소 (b)를 포함하는 벡터.
  18. 제 17 항에 있어서, 요소 (a) 및 (b)가 반대 배향임을 특징으로 하는 벡터.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 요소 (a)의 유도성 프로모터 및 요소 (b)의 전사 프로모터가 벡터에서 조립되어 조절가능한 이방향성 프로모터를 형성함을 특징으로 하는 벡터.
  20. 제 19 항에 있어서, 5′→3′방향으로, PPAR을 암호화하는 제 1 핵산, 제 1 핵산의 발현을 통제하는 제 1 최소 전사 프로모터, 하나 이상의 PPAR 반응 요소, 제 2 최소 전사 프로모터, 및 제 2 최소 전사 프로모터의 통제하에, 해당 산물을 암호화하는 제 2 핵산을 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 16 항에 따른 요소 (d)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  22. 생체외 또는 시험관내 세포에서 해당 핵산 발현을 위한, 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  23. 생체내 세포에서 해당 핵산 발현용 산물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  24. 세포를 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체외 세포에서 핵산의 조절된 발현 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 포유동물, 바람직하게는 인간 세포임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 근육 세포임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 벡터와 접촉시켜 변형된 세포.
  28. 수개의 리간드-결합 부위를 포함하는 변형된 PPAR.
  29. 제 28 항에 따른 PPAR을 암호화하는 핵산.
  30. 제 27 항에 따른 세포를 시험 분자와 접촉시키고 해당 핵산의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, PPAR 리간드의 확인방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2403189A1 (fr) * 2000-03-14 2001-09-20 Charbel Massaad Promoteurs hybrides inductibles par l'inflammation, vecteurs les contenant et utilisations
EP1288303A1 (en) * 2001-08-23 2003-03-05 Aventis Pharma S.A. Inducible expression systems employing PPAR transcriptional activators
WO2003012113A2 (en) * 2001-08-02 2003-02-13 Gencell S.A. Inducible expression systems employing ppar transcriptional activators
WO2014117945A2 (en) * 2013-02-04 2014-08-07 Eth Zurich Designer circuit controlling diet-induced obesity
CN107779454A (zh) * 2016-08-31 2018-03-09 上海米络凯生物科技有限公司 基于PPARγ信号通路的药物筛选模型的构建和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10502256A (ja) * 1994-07-01 1998-03-03 ザ ソールク インスチチュート フォア バイオロジカル スタディズ 哺乳動物のペルオキシソーム増殖物質活性化受容体およびその使用
FR2755699B1 (fr) * 1996-11-08 1998-12-18 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible des genes

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