CZ20014609A3 - Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující jaderný receptor PPAR a její pouľití pro regulaci exprese - Google Patents

Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující jaderný receptor PPAR a její pouľití pro regulaci exprese Download PDF

Info

Publication number
CZ20014609A3
CZ20014609A3 CZ20014609A CZ20014609A CZ20014609A3 CZ 20014609 A3 CZ20014609 A3 CZ 20014609A3 CZ 20014609 A CZ20014609 A CZ 20014609A CZ 20014609 A CZ20014609 A CZ 20014609A CZ 20014609 A3 CZ20014609 A3 CZ 20014609A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ppar
promoter
plasmid
nucleic acid
composition
Prior art date
Application number
CZ20014609A
Other languages
English (en)
Inventor
Raphaël Darteil
Joël Crouzet
Bart Staels
Abderrahim Mahfoudi
Original Assignee
Aventis Pharma S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9907957A external-priority patent/FR2795425B1/fr
Application filed by Aventis Pharma S. A. filed Critical Aventis Pharma S. A.
Publication of CZ20014609A3 publication Critical patent/CZ20014609A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká oblasti biologie. Týká se zejména oboru regulace exprese genů a zvláště popisuje konstrukci a vývoj nového systému pro farmakologickou regulaci exprese transgenů. Vynález je založen zejména na použití konstruktů humánního původu pro aktivaci transkripce transgenů. Vynález se tedy týká nových kompozic, konstruktů a způsobů, které umožňují účinnou regulaci exprese nukleových kyselin, a to in vitro, ex vivo nebo in vivo, např. ve svalových buňkách. Možnosti využití předkládaného vynálezu jsou četné, např. v experimentech, v klinických aplikacích, v terapii a diagnostice.
Dosavadní stav techniky
Řízení hladiny a délky trvání exprese transgenů je nezbytné při mnohých aplikacích. Tak např. při genové terapii úspěch terapie vyžaduje často specifické testování proteinu syntetizovaného z transgenů. Podobně produkce rekombinantních proteinů in vitro může být zlepšena užitím indukovatelných expresních systémů, což dovoluje např. oddělit růstovou a produkční fázi. Konstrukce transgenních zvířat, výzkum účinků genů a biologické dostupnosti proteinů apod. jsou příklady situací, kdy může být využita vhodná kontrola genové exprese pro zlepšení. Ze stavu techniky jsou známé různé umělé • ·· ·
- 2 regulátory transkripce, které jsou aktivovány xenobiotickou molekulou, která se váže na promotorové sekvence transkripce transgenu.
Prvním příkladem takových regulátorů je regulátor připravený fúzí Lac represoru z E. coli a transaktivátorové domény VP16 z viru herpes simplex (HSV) . Existují dvě verze těchto regulátorů, jedna může být aktivována isopropyl-β-D-thiogalaktosidem (IPTG) a druhá může být inaktivována IPTG (Baim S. et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88 (1991) 50725076; Labow M. et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990) 3343-3356).
Jiný systém byl připraven fúzí represoru Tet z E. coli s transaktivátořovou doménou VP16 z HSV. I tyto regulátory existují ve dvou verzích, jedna je aktivována tetracyklinem nebo jeho deriváty a druhá je inaktivována stejnými molekulami (Gossen M. a Bujard Η., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89 (1992)
5547-5551; Gossen M. et al., Science, 286 (1995) 1766-1769).
Další systém byl připraven fúzí DNA-vazebné domény proteinu GAL4 ze S. cerevisiae s ligand-vazebnou doménou humánního receptorů progesteronu a transaktivátorovou doménou VP16 z HSV, tato verze je aktivována analogy progesteronu jako je např. RU486 (Wang Y. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91 (1994) 8180-8184). Byla také popsána fúze ekdysonového receptorů drosofily s transaktivátorovou doménou VP16 z HSV, která je aktivována ekdysonem a analogy tohoto steroidního hormonu (No D et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93 (1996)
3346-3351). Další systém využívá schopnosti některých imunosupresivních molekul (např. cyklosporin A, rapamycin a jeho deriváty) podporovat kombinaci některých buněčných proteinů. Regulátor transkripce je pak složen ze dvou proteinových podjednotek, první je vytvořena fúzí chimérické
DNA-vazebné domény a třech kopií humánního proteinu FKBP, a druhá je vytvořena fúzí rapamycin-vazebné doména humánního proteinu FRAP a transaktivátorové domény podjednotky p65 humánního NFkB. Tento regulátor transkripce je aktivován rapamycinem, který umožňuje dimerizaci dvou podjednotek (Rivera V. et al., Nat. Med., 2 (1996) 1028-1032).
Ačkoliv tyto systémy umožňují dosáhnout uspokojivé regulace v některých typech tkání, mají jisté nevýhody, které omezují možnosti jejich využití. Tak především tyto regulátory transkripce jsou pro člověk xenogenní proteiny. A skutečně sestávají z proteinových fragmentů získaných z baktérií, virů, kvasinek nebo hmyzu, a i v případě, že obsahují proteinové domény humánního původu, jejich spojením vznikají sekvence cizorodé pro člověka. Tyto proteiny tudíž mohou vyvolávat cytotoxickou imunitní reakci, která vede k destrukci buněk, které exprimuji požadovaný gen pod kontrolou xenogenního regulátoru transkripce, a tudíž k ukončení exprese transgenu. Tato situace může vyvolat potřebu opakovaného podávání terapeutického genu, což představuje hlavní nevýhodu, zejména pokud to zahrnuje i traumatizující chirurgický výkon, a také není vždy účinné, zejména v případě, kdy vektorem terapeutického genu je virus, jehož první injekce vyvolá imunitní reakci. Navíc hladina exprese dosahovaná se systémy regulace podle dosavadního stavu techniky nebyla vždy uspokoj ivá.
Existuje tudíž stálá potřeba zlepšeného systému regulace exprese, který by byl kompatibilní s užitím in vivo, který by se dal využít v různých tkáních, a který v aktivovaném stavu zajišťuje vysokou hladinu exprese. Takové řešení poskytuje právě předkládaný vynález.
• · 4 4 • · • 4 4 4 4
4« 44
4 4 4 4 4
444444 4 4
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká a systému regulace, který využívá aktivátor humánního původu. To umožňuje vyhnout se opakovanému podávání terapeutického genu.
Předkládaný vynález popisuje zejména zlepšený systém indukovatelné exprese užívající jako regulátor transkripce jaderné receptory PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptors). Použití PPRE (PPAR responzívní element) v hepatospecifickém expresním systému bylo popsáno v publikované přihlášce WO98/21349. Zlepšený systém podle vynálezu umožňuje připravit regulátor transkripce (PPAR protein humánního původu, který tudíž není xenogenní pro člověka) a indukovatelný promotor, který řídí expresi transgenu, složený z minimálního promotoru a PPAR responzívniho elementu (PPRE). Systém podle vynálezu je aktivovatelný in vitro a in vivo, zejména ve svalstvu, ligandy specifickými pro PPAR. Navíc hladina exprese transgenu, dosažená po aktivaci, je srovnatelná s expresí při užití silného promotoru jako je např. promotor hCMV-IE.
Systém podle předkládaného vynálezu tudíž projevuje četné výhody, a to současně pokud jde o významnou indukci, toleranci (zejména pro užití in vivo), sílu (účinnost) a podmínky využití.
Vynález popisuje nové konstrukty pro přípravu a použití tohoto systému, zejména promotorové úseky, expresní kazety a plazmidy. Vynález také popisuje nové PPAR konstrukty umožňující zlepšenou kontrolu exprese genů, a také kombinace různých konstruktů. Způsoby a kompozice podle vynálezu dovolují významnou kontrolu a regulaci exprese in vitro
« · a in vivo. Vynález se dále týká buněk obsahujících konstrukty podle vynálezu, a také způsobů screeningu sloučenin, které působí jako ligandy PPAR.
Konkrétně je prvním předmětem vynálezu kompozice obsahuj ící:
(a) první element obsahující požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou indukovatelného promotoru obsahujícího PPAR responzívní element a minimální transkripční promotor, a (b) druhý element obsahující nukleovou kyselinu kódující PPAR pod kontrolou transkripčního promotoru, pro jejich současné (simultánní), oddělené nebo časově oddálené podání.
Ve specifickém provedení kompozice podle vynálezu navíc obsahuj e obsahuj e:
(c) ligand pro PPAR, také pro současné, oddělené nebo časově oddálené podání.
Výhodně obsahuje navíc element (d) obsahující nukleovou kyselinu kódující retinoidový X receptor (RXR) pod kontrolou transkripčního promotoru.
Termíny pro současné, oddělené nebo časově oddálené podání vyjadřují například, že elementy (a), (b) a případně (c) a/nebo (d) jsou připraveny odděleně, zabaleny odděleně a použity postupně, aby umožnily kontrolu exprese požadované nukleové kyseliny. Typicky elementy (a) a (b) , případně (d) jsou připraveny a zabaleny dohromady, zatímco složka (c) je zabalena odděleně a použita v časovém odstupu od (a) a (b), případně (d) , přičemž kombinace těchto různých elementů v buňce, tkáni, orgánu apod. vede k požadovanému účinku regulace exprese.
• · · • · · φ · φ · • · • · · ·
V takovém případě, ve specifické provedení kompozice podle vynálezu jsou elementy (a) , (b) a případně (d) umístěny v odlišných genových konstruktech.
V dalším specifickém a výhodném provedení kompozice podle vynálezu, elementy (a) , (b) a případně (d) jsou sestaveny do jediného genového konstruktu. Předkládaný vynález popisuje komplexní genové konstrukty, které umožňují expresi požadovaného produktu a PPAR. Tyto konstrukty jsou zvláště výhodné, jelikož obsahují svoje vlastní genové elementy nezbytné pro regulaci exprese požadované nukleové kyseliny.
Genové konstrukty podle vynálezu jsou různého původu, zejména plazmidového, epizomálního, chromozomálního, virového nebo fágového apod. Výhodné genové konstrukty jsou plazmidové nebo virové vektory.
Příkladem plazmidů odděleně nesoucích elementy (a) nebo (b) , jsou např. plazmidy JxnS-TK-pGL3, JxnAS-TK-pGL3, DRlxnSTK-pGL3, DRlxnAS-TK-pGL3, JxnAS-CMV-pGL3, pSG5-hPPARg2g2 a JxlOAS-CMV-EF-pGL3, které budou dále v textu podrobněji popsány.
Příkladem plazmidů, kde elementy (a) a (b) byly sestaveny společně, jsou např. plazmidy Jx5AS-TK-Luc-hPPARg2, SV-g2-J10-C-pGL3, hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 a hPPARg2-CMVJxlOAS-CMV-pGL3, které budou dále v textu podrobněji popsány.
Příkladem virového vektoru, který lze uvést, je zejména rekombinantní adenovirus, rekombinantní retrovirus, AAV, herpesvirus, virus vakcínie apod., jejichž příprava může být provedena způsoby, které jsou odborníkovi známy.
Uspořádání a struktura genových konstruktů bude podrobněji popsána dále v textu.
V takovém případě, jak již bylo zmíněno výše, element (a) obsahuje indukovatelný promotor obsahující alespoň ·
· 9 9
- PPAR responzivní element, a
- minimální transkripční promotor.
PPAR responzivní element (PPRE, Peroxysome Proliferator Response Element) je úsek nukleové kyseliny schopný vázat PPAR, takže navázání PPAR může zprostředkovat signál pro sousední úseky nukleové kyseliny. PPAR responzivní element je tedy úsek nukleové kyseliny schopný vázat PPAR. Pro realizaci vynálezu PPAR responzivní element obsahuje konkrétně jedno nebo více PPAR-vazebných míst. Tato vazebná místa byla již dříve popsána ve stavu techniky např. u různých humánních promotorů (např. gen pro apolipoprotein AII) . Taková místa mohou být také uměle zkonstruována a pak testována na jejich PPRE vlastnosti, jak bude ještě dále popsáno.
Ve specifickém provedení PPAR responzivní element obsahuje jedno nebo více míst majících sekvenci TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEKVENCE ID. Č. 1) nebo funkční varianty této sekvence. Sekvence id. č. 1 odpovídá J úseku humánního apoAII promotoru (nukleotidy -734 až -716).
v jiném specifickém provedení PPAR responzivní element obsahuje jedno nebo více míst majících sekvenci AGGTCAAAGGTCA (SEKVENCE ID. Č. 5) nebo funkční varianty této sekvence. Sekvence id. č. 5 odpovídá kanonickému úseku DR1.
Termín funkční varianta označuje jakoukoliv modifikovanou sekvenci, která si zachovává vlastnosti PPRE uvedené výše. Jde zejména o schopnost vázat PPAR. Taková modifikace může obsahovat jednu nebo více změn typu adice, mutace, delece a/nebo substituce nukleotidů v dané sekvenci. Tyto módifikce lze připravit obvyklými metodami molekulární biologie jako je zejména místně cílená mutageneze, a nebo častěji umělá syntéza požadované sekvence pomocí syntetizátoru. Obecně varianty zachovávají alespoň 50 % zbytků • fc • · fc fcfc · ·· · • · · » · · • · · · fcfc · fc fc····*· · 9 • · · · · » · • fc · fcfc fcfc • fcfc · • · · • · · • fcfc fcfc fcfc·· původní sekvence. Výhodněji varianty obsahují modifikace, které ovlivňují méně než 5 nukleotidů v uvažované sekvenci. Získané varianty jsou pak testovány na aktivitu PPRE. Tato vlastnost může být zjišúována různými způsoby, zejména pak způsobem, kdy se:
(i) zkoumaná sekvence se přivede do kontaktu s PPAR a retinoidovým X receptorem (RXR), výhodné v bezbuněčném
testu, a detekuje se vytváření komplexu (např. retardací
migrace na gelu),
(ii) zkoumaná sekvence se vloží do expresní kazety
obsahuj ící minimální promotor a reportérovy gen, kazeta se
vloží do buňky a detekuje se (vhodným testem) exprese
reportérového genu za přítomnosti a absence PPAR a ligandů pro PPAR, nukleovou kyselinou funkční pro účely (iii) jiným způsobem, který je odborníkům znám, a který umožňuje detekovat interakci mezi a proteinem.
Varianta je považována za předkládaného vynálezu, když měřená aktivita, např. výše uvedeným způsobem (II), je výhodné alespoň 50 % aktivity místa majícího sekvenci id. č. 1 nebo 5, výhodněji alespoň 75 %. Funkční varianty PPAR-vazebného místa předkládaného vynálezu byly popsány např al., (J. Biol. Chem. 272 a Nakshatri et al . (NAR 26 (1998) 2491 formou odkazu.
Retinoidové X receptory (RXR) jsou kódovány třemi geny RXRa, RXRfi a RXRy, jejichž izolace a sekvence byly popsány (Mangelsdorf DJ et al. (1990), Nátuře 345, 224-229;
pro potřebu v publikacích (1997) 25252) které jsou zahrnuty
Juge-Aubry et * 4 44 4 4·4 44 ·· ··· ·· · 4 4 4 4 • · · 4 4 4 4 · 4 · • 4444444 · 4 9 4 4 4 ·· 4 44 ·4 44 4444
Mangelsdorf DJ et al. (1992), Genes Dev 6, 329-344). Ve výhodném provedení element (d) kóduje humánní RXRoc.
Pokud jde o heterodimerizaci PPAR/RXR, informace lze najít ve dvou přehledných publikacích: Mangelsdorf DJ, Evans RM (1995), Cell 83, 841-850 a Wilson TM, Wahli W (1997), Current Opinion in Chemical Biology 1, 235-241. Publikace Schulman IG et al. (1989), Molecular and Cellular Biology 18,
3483-3494 popisuje transaktivaci heterodimerem PPARy/RXRa.
Použití elementu (d) je schopné přivodit synergistický účinek na aktivitu elementu (b).
Jak již bylo zmíněno výše, v kompozicích podle vynálezu PPAR responzívní element obsahuje několik míst pro vazbu PPAR. Může se jednat o repetici (opakování) stejného místa nebo o kombinaci různých míst, avšak výhodná je repetice identických míst. Konkrétně responzívní element obsahuje až 30 vazebných míst, výhodné 3 až 20, výhodněji 5 až 15. Výhodným provedením vynálezu je konstrukt obsahující od 10 do 15 vazebných míst, a výsledky uvedené v příkladech skutečně ukazují výhodné vlastnosti takových konstruktů, pokud jde o indukci hladiny exprese, zejména ve svalových buňkách.
Pro přípravu indukovatelného promotoru podle kompozice podle vynálezu je PPAR responzívní minimálním promotorem transkripce.
Minimální promotor je transkripční promotor mající bazální aktivitu nízkou nebo žádnou, přičemž je schopen ji zvýšit elementu (a) element kombinován s v přítomnosti transkripčního aktivovaná PPRE elementem).
aktivátoru (interakce PPAR Minimální promotor může být promotor, který jev přirozeném stavu slabý v savčí buňce, tj. jiným slovy poskytuje netoxickou a/nebo nedostatečnou expresi, která nevede k biologickému účinku. Výhodně je minimální ·*·· • · promotor konstrukt připravený z nativního promotoru odstraněním úseku nebo úseků, které nejsou nezbytné pro transkripční aktivitu. Výhodně je to promotor obsahující nezbytně TATA box, mající obecně velikost méně než 160 nukleotidů a v blízkosti kodonu pro iniciaci transkripce. Minimální promotor může být připraven ze silného nebo slabého virového nebo buněčného promotoru jako je např. promotor genu pro thymidinkinázu (TK) herpesviru, časný promotor CMV, promotor PGK, promotor genu svalové kreatinkinázy (MCK), promotory genů různých isoforem aktinu kosterního svalstva, pro desmin, promotor promotor promotory genu genů genu pro vimentm, lehkého a těžkého řetězce myosinu atd.
promotoru je úsek
Specifickým příkladem minimálního představovaný nukleotidy -54 až +48 z CMV nebo -105 až +56 z promotoru TK. Je zřejmé, že varianty těchto promotorů nebo podobné konstrukty z jiných promotorů mohou být zkonstruovány odborníkem a použity v intencích předkládaného vynálezu.
Minimální promotor (Pmin), PPAR responzívní element (PPRE) a požadovaná nukleové kyselina (NA) jsou funkčně uspořádány v elementu (a), čili minimální promotor řídí expresi požadované nukleové kyseliny a jeho aktivita je regulována PPRE elementem.
Obecně tedy jsou tyto úseky uspořádány v následujícím pořadí v orientaci 5'—>3': PPRE-Pmin-NA.
Avšak odborník může realizovat jakékoliv jiné funkční uspořádání v rámci vynálezecké myšlenky předkládaného vynálezu.
Navíc různé funkční domény zmíněné výše mohou být navzájem přímo spojeny nebo odděleny nukleotidy, které významně neovlivňují regulační charakter promotoru elementu ·· «·· ·
- 11 (a) . Tyto nukleotidy mohou být z funkčního hlediska neutrální zbytky, které jsou např. pozůstatky předchozích klonovacích kroků (PCR konce, restrikční místa apod.). Tyto nukleotidy ale mohou mít i biologické účinky, které poskytují zlepšení některých vlastností nebo aktivit v systému podle vynálezu (enhancer - tj. zesilovací element genů bazálního metabolismu, tzv. housekeeping genů, tkáňově specifický enhancer, silencer, intron, sestřihové místo apod.). V takovém specifickém provedení vynálezu indukovatelný promotor obsahuje navíc enhancerový (zesilovací) úsek. Takový úsek výhodně dovoluje zvýšení hladiny exprese požadované nukleové kyseliny, enhancerový úsek (E) je výhodně umístěn na 3'-konci minimálního promotoru, tedy mezi minimálním promotorem a požadovanou nukleovou kyselinou podle následujícího schématu (5'—>3'): PPRE-Pmín-E-NA.
Navíc v konstruktech podle vynálezu může být přítomen minimální promotor a PPAR responzívní element buďto ve stejné orientaci nebo (tj. ve směru transkripce), nebo v opačné orientaci (tj . PPAR responzívní element je v antisense orientaci vzhledem ke směru transkripce z Pmin promotoru). Jak je dále ilustrováno v příkladech, tato dvě provedení vynálezu dovolují účinnou kontrolu regulace exprese in vitro a in vivo.
Jak již bylo zmíněné výše, element (b) kompozice podle vynálezu obsahuje alespoň:
- nukleovou kyselinu kódující PPAR,
- pod kontrolou druhého transkripčního promotoru.
Receptory PPAR patří do nadrodiny jaderných hormonálních receptorů a tvoří tři odlišné skupiny receptorů, a sice PPARa, PPARó (zvanou též NUC-1 nebo PPARP) a PPARy.
·· · »· ··· · • · ···· · · · · · · « · ···· ··« ···· · • · · ···· · · ·
9· · ·· »· ·· ····
- 12 V odborné literatuře již byla popsána izolace a sekvencování mnohých těchto receptorů (viz zejména Sher T. et al., Biochemistry, 32 (1993) 5598-5604; Mukherjee R. et al. , J.
Steroid Biochem. Molec. Biol., 51 (1994) 157-166; Fajas L. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 18779-18789; Mukherjee R. et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 8071-8076; Schmidt A. et al. ,
Mol. Endocrinol. 6 (1992) 1634-1641). Nvíc byl nedávno klonován promotor PPARy, jak bylo popsáno v dokumentu WO99/05161.
Ve výhodném provedení vynálezu, nukleová kyselina kódující PPAR kóduje humánní PPAR, zejména PPARa nebo PPARy. Výsledky ukázané v příkladech skutečně ukazují, že použití těchto molekul zajišúuje pro systém podle vynálezu vysokou úroveň regulace exprese, zejména ve svalových buňkách.
V prvním provedení vynálezu jsou PPARa nebo PPARy v nativní formě, tj . bez modifikací primární struktury vzhledem k primární struktuře přírodní molekuly.
V jiném provedení vynálezu je PPAR modifikován, takže obsahuje několik vazebných míst pro ligand.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy dále jakýkoliv modifikovaný PPAR obsahující několik vazebných míst pro ligand. Zejména jde o PPARa nebo PPARy, výhodněji o PPARy. Výhodně modifikovaný PPAR podle vynálezu obsahuje 2 až 5 vazebných míst pro ligand, výhodněji 2 až 4 vazebná místa. Konkrétně to je PPAR obsahující 2 až 5 kopií E a F domén zúčastěných ve vazbě ligandu. Proteiny PPAR obsahují různé domény: N-koncovou A/B domény obsahující transaktivační úsek nezávislý na ligandu, C doménu, která je DNA-vazebnou doménou (DBD), D doménu, která je kloubovým (hinge) úsekem, a E/F domény, které obsahují transaktivační úsek závislý na ligandu.
fr· ··»· • · ····
• · · • · · · · ·
E/F domény jsou také označovány jako ligand-vazebné domény (LBD) (viz zejména Schoonjans K. et al. , Biochim. Biophys.
Acta, 1302 (1996) 93-109). Hranice E/F domén jsou různé v různých typech PPAR. Tak např. v isoformě humánního PPARy2 E/F doména zahrnuje úsek od aminokyseliny 284 do aminokyseliny 505. Předkládaný vynález nyní ukazuje, že je možné konstruovat modifikované PPAR obsahující několik opakovaných E a F domén, a přitom tyto modifikované PPAR jsou funkční a mají zlepšené vlastnosti indukovatelnosti ligandy pro PPAR. Takové konstrukty tudíž představují výhodné provedení vynálezu a jsou tak specifickým předmětem předkládaného vynálezu.
Typickým příkladem modifikovaného PPAR podle vynálezu je
PPARy obsahující 2 ligand-vazebná místa (tj. dvě E a F domény). Úplná sekvence proteinu PPARy2y2 je zde uvedena jako sekvence id. č. 24.
SEKVENCE ID. Č. 24
MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYN KPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYD SYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVEAVQ EITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEG QGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPI EDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPL LQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGC QFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGF MTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDI QDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQE IYKDLY
Vynález se týká také jakékoliv varianty sekvence id. č. 24, která si zachovává aktivitu typu PPAR (tj . schopnost v přítomnosti PPAR ligandu jako je BRL49653 aktivovat promotor obsahující sekvenci PPRE). Termínem varianta se rozumí jakákoliv mutanta, deleční mutanta a/nebo polypeptid
44
4 4 I
4 • 4 4 4 • 4 4 4 · • 4 4444 4 4 • 4 4 4
4 4 •4 »»*·
4· 4444
- 14 obsahující jeden nebo více přidaných zbytků. Výhodné varianty zachovávají (konzervují) alespoň 80 % zbytků sekvence id. č. 24 .
Dále se vynález týká jakékoliv nukleové kyseliny kódující takové modifikované PPAR. To je DNA (zejména cDNA nebo syntetická či semisyntetická DNA) nebo RNA. Taková DNA může být zkonstruována obvyklými metodami molekulární biologie, které jsou odborníkům známy (syntéza, ligace, screening knihoven apod.). Výhodně to je jakákoliv nukleová kyselina obsahující sekvenci kódující polypeptid mající sekvenci nebo hybridizující se sekvencí kódující polypeptid mající sekvenci id. č. 24, a kódující polypeptid s aktivitou typu PPAR. Kromě toho tato DNA může obsahovat např. transkripční promotor a/nebo terminátor.
Druhý transkripční promotor, kontrolující expresi nukleové kyseliny kódující PPAR, je jakýkoliv silný nebo selektivní, konstitutivní nebo je funkční v savčích buňkách, Může to být vlastní buněčný promotor (tj. promotor savčího, zejména humánního genu), přírodní nebo syntetický, jednoduchý nebo složený (komplexní), virový, bakteriální, hmyzí nebo rostlinný apod. Příklady vhodných promotorů pro element (b) jsou zejména virové promotory (časný promotor viru SV40, časný promotor viru CMV, promotor z retrovirového LTR, promotor TK herpesviru) nebo buněčné promotory (promotor genu pro PGK, albumin nebo EFla, nebo promotor genů s vysokou hladinou exprese ve svalech jako je např.: promotor genu svalové kreatinkinázy (MCK), promotory slabý, všudypřítomný nebo regulovaný promotor, který zejména v humánních buňkách.
genů různých isoforem aktinu kosterního svalstva, promotor genu pro desmin, promotor genu pro vimentin, promotory genů *» · • 9 9
9999 • 9 «·
9 9 9 9
9 9 9 • · »·· • to · • · « · • »··· 9 · ·· ·
pro lehký nebo těžký řetězec myosinu). Navíc může být promotor modifikován vložením jednoho nebo více enhancerových úseků, jako je např. enhancerový úsek z intronu 2 genu pro beta-globin, enhancer velmi časných genů viru CMV, EFla enhancer, umlčovacích úseků (silencer), úseků poskytujících tkáňovou specificitu (např. úseky izolované z tkáňově specifických promotorů jako je např. promotor genu svalové kreatinkinázy (MCK), promotory genů různých isoforem aktinu kosterního svalstva, promotor genu pro desmin, promotor genu pro vimentin, promotory genů pro lehký nebo těžký řetězec myosinu nebo regulovatelný charakter, nebo modifikované delecí úseků, které nejsou nutné pro aktivitu. Takové promotory mohou být užity pro expresi RXR v elementu (d).
Výhodným příkladem druhého proteinu jsou virové promotory, zejména časný promotor viru SV40 a bezprostředně časný promotor CMV, nebo deriváty těchto promotorů.
Ve specifickém provedení, když jsou elementy (a) a (b), a případně (d) , sestaveny do téhož genového konstruktu, druhý transkripční promotor (elementu (b)) a indukovatelný promotor elementu (a), a případně promotor elementu (d) , jsou uskupeny tak, že tvoří jeden společný, zejména dvousměrný promotorový úsek, jak bude podrobněji vysvětleno ještě dále v textu.
Takže jiným předmětem předkládaného vynálezu je vektor obsahující element (a) a element (b), a případně element (d) , jak byly definovány výše.
Podle jednoho aspektu vynálezu elementy (a) a (b) , a případně (d) , jsou ve vektoru ve stejné orientaci. Taková varianta je ilustrována např. plazmidem SV-g2-J10-C-pGL3 (Obr. 17) .
- 16 V jiné variantě vynálezu jsou ve vektoru elementy (a) a (b) , a případně (d) , v opačné orientaci. Taková varianta je ilustrována např. plazmidem uvedeným na Obr. 16, 18 a 19.
Výhodněji v této variantě provedení vynálezu indukovatelný promotor elementu (a) a transkripční promotor elementu (b) jsou sestaveny ve vektoru tak, že tvoří regulovatelný dvoj směrný promotor. Takové provedení vynálezu je ilustrováno např. plazmidem uvedeným na Obr. 18 a 19.
V takovém případě je specifickým předmětem vynálezu vektor, který obsahuje, ve směru 5'->3', první nukleovou kyselinu kódující PPAR, a první minimální transkripční promotor kontrolující expresi první nukleové kyseliny, jeden nebo více PPAR responzívních elementů, druhý minimální transkripční promotor a, pod kontrolou druhého minimálního transkripčního promotoru, druhou nukleovou kyselinu kódující požadovaný produkt.
Tento typ konstruktu je výhodný, jelikož umožňuje expresi dvou nukleových kyselin v jednom plazmidu, a zesílení této exprese regulací obou nukleových kyselin pomocí PPAR jejich ligandů.
Exprese požadované nukleové kyseliny v kompozici podle vynálezu je obecně aktivována v přítomnosti PPAR ligandů (element (c)). V takovém případě v závislosti na použitém PPAR se užijí různé typy ligandů, přírodní nebo syntetické.
Takže PPARa-aktivující ligandy jsou např. fibráty, jako je např. kyselina fibrová a její analogy. K analogům patří zejména gemfibrozyl (Atherosclerosis 114(1) (1995) 61), bezafibrát (Hepatology 21 (1995) 1025), ciprofibrát (BCE&M
9(4) (1995) 825), clofibrát (Drug Safety 11 (1994) 301), fenofibrát (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical • · 9 • · ···· 9« 9 9 ί «······*·· • · · · · · · · · · • · ···· · · 9 · · · · 9 • · · · 9 9 9 «99 «« « « « · 9 «99999
- 17 Communications, 1995), clinofibrát (Kidney International. 44(6) (1993) 1352), kyselina pirinixová (Wy-14,643) nebo kyselina 5,8,11,14-eikosatetranová (ETYA). Tyto různé sloučeniny jsou kompatibilní s biologickým a/nebo farmakologickým využitím in vitro nebo in vivo.
PPARy-aktivuj ící ligandy jsou vybrány z přírodních a syntetických ligandů. Z přírodních ligandů lze jako příklad zmínit mastné kyseliny a eikosanoidy (např. kyselina linolová, kyselina linolenová, 9-HODE, 5-HODE) a ze syntetických ligandů lze jako příklad uvést thiazolidindiony, jako je zejména rosiglitazon (BRL49653), pioglitazon nebo troglitazon (viz např. Krey G. et al. , Mol. Endocrinol., 11 (1997) 779-791, Kliewer S. a Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev. 8 (1998) 576-581) nebo sloučenina RG12525.
Navíc kompozice podle vynálezu mohou obsahovat několik PPAR aktivátorů v kombinaci, zejména fibrát nebo analog fibrátu kombinovaný s retinoidem.
Dále se vynález týká použití kompozice nebo vektoru, které byly popsány výše, pro expresi požadovaných nukleových kyselin v buňce ex vivo nebo in vitro.
V takovém případě nukleová kyselina je jakákoliv nukleová kyselina (DNA, RNA) kódující požadovaný produkt (RNA, protein, polypeptid, peptid apod.). Jde o požadovaný produkt v potravinách, produkt vhodný pro terapii nebo vakcinaci nebo jako markér apod.
Vynález se týká také použití kompozice nebo vektoru, které byly definovány výše, pro přípravu produktu určeného pro expresi požadované nukleové kyseliny v buňce in vivo.
Předmětem vynálezu je také způsob regulace exprese nukleových kyselin v buňce, který spočívá v tom, že se buňka
- 18 přivede do kontaktu s kompozicí nebo vektorem podle vynálezu.
Pro použití in vitro nebo ex vivo se buňky mohou přivést do kontaktu s kompozicí nebo vektorem podle vynálezu různými postupy. Tak např. buňky v kultuře se inkubují přímo s elementem (a) , (b) a (c) , a případně (d) , podle vynálezu, např. s vektorem obsahujícím elementy (a) a (b) a v přítomnosti ligandu (c). Alternativně se buňky inkubují nejdříve s elementem (a) a (b) a případně (d) (zejména ve formě, kdy tvoří jeden vektor) a pak, ve druhém kroku (po kultivaci a případně selekci modifikovaných buněk), se přidá element (c) . Druhý z uvedených postupů umožňuje např. oddělit kultivační fázi (nebo fázi expanze buněk) od fáze exprese nukleových kyselin. Tyto experimenty lze provádět v jakémkoliv vhodném médiu za pomoci jakýchkoliv vhodných zařízení, výhodně na destičkách, v kultivačních miskách nebo lahvích, a to za sterilních podmínek. Použitá množství buněk, vektoru a ligandu mohou být odborníkem snadno upravena na základě informaci uvedených v příkladech a na základě obecných znalostí v oboru.
Pro použití in vivo jsou buňky (nebo orgány, tkáně apod.) přivedeny do kontaktu tím, že se podávají elementy (a), (b) a (c) , a případně (d), in vivo, simultánně, odděleně nebo časově odděleně. Pro tento účel elementy (a) a (b) , a případně (d), případně ve formě jediného genového konstruktu, jsou obecně podávány parenterálním, zejména intramuskulárním, intravenózním, subkutánním, intradermálním, intratumorálním nebo stereotaktickým způsobem. Způsobem podávání je závislý na požadované aplikaci, cílové tkáni a/nebo typu požadovaného produktu kódovaného transgenem. Pro takové podávání kompozice podle vynálezu obsahuje jakékoliv činidlo podporující buněčnou transfekci (kationtový polymer, lipid apod.). Ve specifickém případě se kompozice podle vynálezu podávají intramuskulárním • ·
způsobem a genové konstrukty jsou užívány ve formě nahé nukleové kyseliny, tzn. bez přidání transfekčního činidla.
Podobně, když jsou elementy (a) a (b) , a případně (d) , vneseny pomocí virových vektorů, není potřeba další transfekční činidlo.
Jak je ilustrováno v příkladech, ligand (c) může být podán před, současně s nebo po elementech (a) a (b), a případně (d).
V takovém případě se podávání ligandu provádí např. perorálním, análním, intravenózním, intraperitoneálním nebo intramuskulárním způsobem.
Používané dávky mohou být snadno upraveny odborníkem na základě údajů o in vivo aplikacích publikovaných v odborné literatuře. Tak např. pro formu nerozpustnou ve vodě je typická dávka ligandu jako je BRL49653 je 5 až 50 mg/kg, např. 30 mg/kg, což umožňuje dosáhnout plazmatické koncentrace alespoň 15 μg/ml. Pro formu ligandu ve vodě rozpustnou, jejíž biologická dostupnost je vyšší (např. BRL49653 ve formě soli kyseliny maleinové), jsou typické dávky nižší, obecně nižší 0,01 až 1 mg/kg. Tyto dávky mohou být upraveny v závislosti na použitém konstruktu, ligandech a požadované aplikaci a účincích. Obecně výsledky uvedené v příkladech ukazují, že kompozice podle vynálezu umožňuje dosáhnout in vivo vysoké a regulované exprese, při dávkách ligandu nižších než jsou normálně užívané. Navíc, i když lze podávat ligand opakovaně, zde uváděné výsledky ukazují, že exprese je značně vysoké již po jediné dávce ligandu.
Obecně použité dávky vektoru mohou být mezi 0,01 a než 5 mg/kg, např. odborníkem snadno
1000 μg, nebo vyšší, v závislosti na aplikaci.
© · · · · · ♦ · ?
- 20 Vynález lze využít pro expresi genu v různých typech buněk, tkání nebo orgánů, a to in vitro, ex vivo nebo in vivo. Zejména se jedná o savčí, výhodně humánní buňky, tkáně a orgány. Příkladem mohou být svalové buňky (nebo sval), jaterní buňky (nebo játra), srdeční buňky (nebo srdce, cévní stěna, stěna artérie), nervové buňky (mozek, mícha) nebo nádorové buňky (nebo nádor).
Výhodné konstrukty, přípravky a způsoby podle vynálezu se užívají pro regulaci exprese nukleových kyselin ve svalových buňkách (nebo svalu) in vitro, ex vivo nebo in vivo. Výsledky uvedené v příkladech ukazují konkrétně výhody vynálezu in vivo nebo in vitro na tomto typu buněk.
Vynález se dále týká jakékoliv buňky modifikované tím, že byla přivedena do kontaktu s kompozicí nebo vektorem jak byly definovány výše.
Vynález se také týká použití kompozice, vektoru nebo buněk podle vynálezu, kde požadovaná nukleová kyselina je reportérový gen (jako je např. secernovaná alkalická fosfatáza nebo luciferáza) pro screening in vitro, ex vivo nebo in vivo (zejména ve svalových buňkách nebo svalu) PPAR ligandů. V takovém případě se vynález týká způsobu identifikace PPAR ligandů, který obsahuje krok, kdy se buňky uvedené výše přivedou do kontaktu s testovanou molekulou (nebo kompozicí), a detekuje se exprese požadované nukleové kyseliny (což je výhodně reportérový gen). Exprese se navíc může porovnat s expresí za podmínky nepřítomnosti testované sloučeniny nebo přítomnosti referenčního ligandu, aby se vyhodnotila aktivita testované sloučeniny.
Vynález se dále týká použití kompozice nebo vektoru, jak byly definovány výše, pro konstrukci transgenních zvířat, vyjma člověka, užitečných pro preklinické studie, nebo pro • · · ·
- 21 studie biologické dostupnosti nebo pro značení apod.
Předkládaný vynález je dále popsán podrobněji formou příkladů, jejichž funkce je ilustrativní a a nijak neomezují rozsah vynálezu.
Popis obrázků
Obr. 1: Schématické znázornění plazmidu FTKpGL3.
Obr. 2 : Schématické znázornění plazmidu Jx3S-TK-pGL3.
Obr. 3 : Schématické znázornění plazmidu Jx3AS-TK-pGL3.
Obr. 4 : Schématické znázornění plazmidu DRlx3S-TK-pGL3.
Obr. 5 : Schématické znázornění plazmidu DRlx3AS-TK-pGL3.
Obr. 6: Aktivity indukovatelných promotorů vyhodnocené v experimentu přechodné exprese in vitro na myších myoblastech (C2C12). Buňky byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu FTKpGL3 (a) , nebo Jx3S-TK-pGL3 (b) , nebo Jx3AS-TK-pGL3 (c) , nebo DRlx3S-TK-pGL3 (d) , nebo DRlx3AS-TK-pGL3 (e) , (ii) zvyšujícím se množstvím plazmidu pSG5-hPPARg2, a (iii) 20 ng plazmidu pRL-null. Aktivita každého indukovateIného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
Obr. 7: Aktivity indukovatelných promotorů vyhodnocené v experimentu přechodné exprese in vitro na myších myoblastech
- 22 (C2C12). Buňky byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu
FTKpGL3 (a) , nebo Jx3S-TK-pGL3 (b) , nebo Jx3AS-TK-pGL3 (c) , nebo DRlx3S-TK-pGL3 (d) , nebo DRlx3AS-TK-pGL3 (e) , (ii) zvyšujícím se množstvím plazmidu pSG5-hPPARa(Koz), a (iii) 20 ng plazmidu pRL-null. Aktivita každého indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
Obr. 8: Schématické znázornění plazmidu Jx5AS-CMV-pGL3.
Obr. 9: Aktivity indukovatelných promotorů vyhodnocené v experimentu přechodné exprese in vitro na myších myoblastech (C2C12). Buňky byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu Jx5ASTK-pGL3 (a), nebo Jx5AS-CMV-pGL3 (b), (ii) zvyšujícím se množstvím plazmidu pSG5-hPPARg2, a (iii) 20 ng plazmidu pRLnull. Aktivita každého indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
Obr. 10: Aktivity indukovatelných promotorů vyhodnocené v experimentu přechodné exprese in vitro na myších myoblastech (C2C12). Buňky byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu JxnASTK-pGL3, (ii) 10 ng plazmidu pSG5-hPPARg2, a (iii) 20 ng plazmidu pRL-null. Aktivita každého indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
• * • ·· ·
• · · • · · ·
- 23 Obr. 11 : Aktivity indukovatelných promotorů vyhodnocené v experimentu přechodné exprese in vitro na myších myoblastech (C2C12). Buňky byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu JxnASCMV-pGL3, (ii) 10 ng (a) nebo 50 ng (b) plazmidu pSG5-hPPARg2, a (iii) 20 ng plazmidu pRL-null. Aktivita každého indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
Obr. 12: Schématické znázornění plazmidu pSG5-hPPARg2g2.
Obr. 13: Srovnání transkripčních regulátorů hPPARg2 a hPPARg2g2. Myší myoblasty (C2C12) byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu Jxl0AS-CMV-pGL3, (ii) zvyšujícím se množstvím plazmidu pSG5-hPPARg2 (a) nebo pSG5-hPPARg2g2 (b) , a (iii) 20 ng plazmidu pRL-null. Aktivita indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis. (c) : Faktory indukce užitím BRL49653 získané s plazmidem pSG5-hPPARg2 nebo plazmidem pSG5-hPPARg2g2. Tento faktor byl vypočten jako podíl aktivity v přítomnosti BRL49653 a aktivity v přítomnosti DMSO.
Obr. 14: Schématické znázornění plazmidu JxlOAS-CMV-EF-pGL3.
Obr. 15: Aktivity indukovatelných promotorů vyhodnocené v experimentu přechodné exprese in vitro na myších myoblastech (C2C12). Buňky byly kotransfekovány: (i) 10 ng plazmidu
JxlOAS-CMV-pGL3 (a) , nebo JxlOAS-CMV-EF-pGL3 (b) , (ii) zvyšujícím se množstvím plazmidu pSG5-hPPARg2g2, a (iii) 20 ng plazmidu pRL-null. Aktivita každého * · · φ · · φ «
- 24 indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
Obr. 16: Schématické znázornění plazmidu Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.
Obr. 17: Schématické znázornění plazmidu SV-g2-J10-C-pGL3.
Obr. 18: Schématické znázornění plazmidu hPPARg2-CMV-Jx5AS-TKpGL3 .
Obr. 19: Schématické znázornění plazmidu hPPARg2-CMV-JxlOASCMV-pGL3.
Obr. 20: Srovnání různých verzí systému indukovatelného in vitro. Myší myoblasty (C2C12) byly transfekovány, pro každou verzi systému,stejným látkovým množstvím (počtem mol) indukovatelné expresní kazety. Výsledky jsou vyjádřeny jako procenta aktivity promotoru hCMV-IE získané užitím plazmidu pCMV-leadTK. Faktory indukce užitím BRL49653 byly vypočteny jako podíl aktivity v přítomnosti BRL49653 a aktivity v přítomnosti DMSO.
= pSG5-hPPARg2 + Jx5AS-TK-pGL3; 2 = Jx5AS-TK-luc-hPPARg2;
= pSG5-hPPARg2g2 + JxlOAS-CMV-pGL3; 4 = pSG5-hPPARg2 +
JxlOAS-CMV-pGL3; 5 = SV-g2-J10-C-pGL3; 6 = hPPARg2-CMV-Jx5ASTK-pGL3; 7 = hPPARg2-CMV-JxlOAS-CMV-pGL3; 8 = hPPARg2-CMVJxl5AS-CMV-pGL3; 9 = hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.
Obr. 21: Srovnání in vitro ligandu BRL49653 a RG12525. Myší myoblasty (C2C12) byly transfekovány: (i) 10 ng plazmidu hPPARg2-CMV-JxlOAS-CMV-pGL3, jehož expresní kazeta je ukázána ♦ · ···· • · · · «· · · · · • · *··· · · 9 t t » t * • « · ···· · ♦ · «· · ·· ·· ·· ····
- 25 v (a), a (ii) 10 ng plazmidu pRL-null. (b) Aktivita indukovatelného promotoru je reprezentována aktivitou luciferázy z Photinus pyralis normalizovanou vzhledem k aktivitě luciferázy z Renilla reniformis.
Obr. 22: Srovnání různých verzí systému indukovatelného in vivo. C57BI/6 myši (6 myší ve skupině) byly inj i kovány bilaterálně v horní části lýtkového svalu, pro každou verzi systému, stejným látkovým množstvím (počtem mol) indukovatelné expresní kazety. Pak byl na každém svalu aplikován elektrotransfer. Ošetřovaná zvířata dostala každý den nuceným krmením dávku 30 mg/kg BRL49653. Čtyři dny po injekci DNA byla zvířata utracena a svaly byly vyjmuty pro měření aktivity luciferázy.
= pCMV-leadTK; 2 = pSG5-hPPARg2 + JxlOAS-CMV-pGL3; 3 = pSG5hPPARg2g2 + JxlOAS-CMV-pGL3; 4 = hPPARg2-CMV-JxlOAS-CMV-pGL3.
Obr. 23: Srovnání in vivo různých protokolů indukce užitím BRL49653. C57BI/6 myši (6 myší ve skupině) byly injikovány bilaterálně do horní části lýtkového svalu 10 gg DNA obsahující 1 gg plazmidu hPPARg2-CMV-JxlOAS-CMV-pGL3, jehož expresní kazeta je ukázána v (a). Aktivity získané podle různých protokolů pro indukci jsou uvedeny na obrázku (b).
Obr. 24: Schématické znázornění plazmidu pRDA02.
Obr. 25: Kinetika indukce získaná in vivo s indukovatelným systémem. (A) Deset myší C57BI/6 bylo injikováno bilaterálně do horní části lýtkového svalu směsí DNA obsahující 3 mg plazmidu pRDA02 a 3 mg plazmidu pSG5-hPPARg2. Pak byl na • · · ·♦ · • · 4 • 4 4 ·4 • 4 4 4
4 4
- 26 každém svalu aplikován elektrotransfer. Čtyři dny a pak 39 dnů po injekci dostala zvířata nuceným krmením dávku 30 mg/kg BRL49653. V různých časech pak byly odebrány vzorky krve do heparinu a byla stanovena aktivita secernované alkalické fosfatázy (hSeAP) v plazmě užitím soupravy Phospha-Light™ (Tropix, PE Biosystéms, Foster City, CA). (B) C57BI/6 myši (2 skupiny po 10 zvířatech) byly injikovány bilaterálně do horní části lýtkového svalu směsí DNA obsahující 3 mg plazmidu pRDA02 a 3 mg plazmidu pSG5-hPPARg2. Pak byl na každém svalu aplikován elektrotranfer. Čtyři dny po injekci DNA zvířata dostala nuceným krmením buďto jedinou dávku BRL49653 (3 0 mg/kg) , nebo 5 dní dostával po jedné denní dávce (3 0 mg/kg) . V různých časech pak byly odebrány vzorky krve do heparinu a byla stanovena aktivita hSeAP v plazmě užitím soupravy Phospha-Light (Tropix). Uvedené výsledky (indukční faktory) odpovídají poměru aktivity hSeAP měřené ve sledovaný den a aktivity měřené v den D4.
Obr. 26: Srovnání, in vivo, různých ligandů PPARg a studie dávkového účinku. C57BI/6 myši (5 myší ve skupině) bylo injikováno bilaterálně do horní části lýtkového svalu směsí DNA obsahující 5 mg plazmidu pRDA02 a 5 mg plazmidu pSG5hPPARg2. Pak byl na každém svalu aplikován elektrotranfer. Šest dnů (A) nebo 10 dnů (B) po injekci DNA byla zvířatům nuceným krmením podána buďto dávka různých ligandů PPARg (A; BRL49653, Actos™ (Takeda (SmithKline Beecham)), nebo
Pharmaceuticals) a Avandia™ různé dávky BRL4 9653 (B) .
V různých časech pak byly odebrány vzorky krve do heparinu a byla stanovena aktivita hSeAP v plazmě užitím soupravy Phospha-Light (Tropix). Uvedené výsledky (indukční faktory)
9 • » ·
• · * 4
4 4
4 4
4 9
4 4444
- 27 odpovídají poměru aktivity hSeAP měřené ve sledovaný den a aktivity měřené v den D6 (A) nebo DIO (B).
Obr. 27: Schématické znázornění plazmidu Jx10AS-CMV-VEGFa165 .
Příklady provedení vynálezu
Materiály a metody použité v příkladech
Metody obvykle užívané v molekulární biologii, jako je např. preparativní extrakce plazmidové DNA, centrifugace plazmidové DNA na gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarózovém, purifikace DNA fragmentů elektroelucí, precipitace plazmidové DNA v roztoku soli s ethanolem nebo isopropanolem, transformace plazmidů do Escherichia coli, jsou odborníkům dobře známy a jsou dostatečně popsány v odborné literatuře (viz např. Sambrook et al. , Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Plazmid pGL3-Basic, použitý pro klonování různých promotorových úseků, a také plazmid pRL-null, jsou komerčně dostupné (Promega Corporation). Plazmidy pSG5 (Stratagen), pBluescript II SK+ (Stratagen) a pSL301
Corporation) jsou také komerčně dostupné, expresních plazmidů pSG5-hPPARg2 (Fajas L. et al Chem., 272 (1997) 18779-18789) a pSG5-hPPARa(Koz) (Invitrogen
Konstrukce , J. Biol. (Gervois P.
et al. , Mol. Endocrinol., 13 (1999) 400-409) byly již dříve popsány.
*4 · 44 4 ·
4 4 · 4 • · · 4 · · • 4444444 · • 4 · · ·
4 44
99 • 9 9 9 9 • 9 9 9
4 4 9 9 • 4 9 ·
44 4444
- 28 Konstrukce plazmidu pCMV-leadTK byla popsána v patentové přihlášce FR 98/120000 podané 25/09/98 a v patentové přihlášce USA SN60/123,298 (prozatímní přihláška).
Pro informaci lze stručně uvést, že tento plazmid byla konstruován následovně. Expresní vektor pCGN popsaný v publikaci Tanaka et al. (Cell, 60 (1990) 375-386) obsahující CMV promotor (-522/+72) fúzovaný s vedoucí (leader) sekvencí genu tk z HSV (+51/+101) proti směru transkripce (upstream) od sekvence kódující hemagglutininový epitop. Plazmid pCGN (10 ng) byl použit jako templát pro amplifikaci v PCR. Byly použity následující oligonukleotidové primery:
- Primer 6718:
(5'CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG3') (SEKVENCE ID. Č. 26), tento primer hybridizuje s promotorem CMV v poloze -522 (8 nukleotidů downstream od místa EcoRI v pCGN).
- primer 6719:
(5'GGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGGCCGAA3') (SEKVENCE ID. Č. 27), tento primer hybridizuje do polohy 101 leader sekvence genu tk. První nukleotid G vyznačený tučně je zde pro obnovu místa Ncol z pGL3-Basic, jak bude ještě vysvětleno dále.
Získaný PCR fragment byl purifikován a pak fosforylován Polynukleotidylkinázy fága T4 (New England Biolabs). Paralelně byl vektor pGL3-Basic (Promega) linearizován užitím Ncol, purifikován a pak ošetřen Klenowovým fragmentem DNA polymerázy (Boehringer Mannheim) pro zaplnění místa Ncol. Vektor byl pak defosforylován užitím alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim) a pak použit pro vložení fosforylovaného PCR fragmentu. Guanosin (G) v priméru 6719 tak umožnil obnovit jen místo Ncol, když fragment vedoucí sekvence (leader) CMV-tk je orientován 5'-koncem (primer 6718, poloha -522 v CMV) směrem downstream od místa HindlII v pGL3-Basic 3'-koncem
0· ··»· • 0 0
0 0 0
0 0 0 0
0000000
0 0 0
00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
00 0000
- 29 (primér 6719, tk leader) je ligován k místu Ncol v pGL3-Basic (první ATG genu luciferázy).plazmid připravený tímto způsobem byl nazván pCMV-leadTK.
Enzymatická amplifikace DNA fragmentů užitím metody PCR (polymerázové řetězové reakce) se provádí pomocí DNA termálního cyklovacího zařízení (Thermal cycler™, Perkin Elmer Cetus) postupme podle doporučení výrobce.
Elektroporace plazmidu DNA do Escherichia coli se provádí pomocí elektroporačního zařízení (Bio-Rad) podle pokynů výrobce.
Verifikace sekvencí nukleových kyselin se provádí sekvencováním podle Sangera et al., {Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 14 (1977) 5463-5467) užitím soupravy komerčně dostupné od firmy Applied Biosystems podle pokynů výrobce.
Myší myoblasty C2C12 byly kultivovány v médiu DMEM™ (Life Technologies lne.) doplněném 10 % fetálního telecího séra (FCS). Kultivace probíhaly v inkubátoru při 37°C, ve zvlhčované atmosféře a s parciálním tlakem CO2 5 %.
Transfekce se prováděly na 24-jamkových destičkách, přitom každá transfekce byla provedena třikrát. Čtyřiadvacet hodin po transfekci byly buňky inokulovány v hustotě 3xl04 buněk na jamku v médiu DMEM. Pro každou jamku bylo 500 ng plazmidu DNA (požadovaný plazmid a pBluescript II SK+ pro nastavení na 500 ng) smícháno s kationtovým lipidem RPR120535 B (WO 97/18185) v množství 6 nmol lipidu na 1 μg DNA v médiu DMEM™ (výsledný objem 20 μΐ) obsahujícím 150 mM NaCl a 50 mM bikarbonát. Po 20 minutách při teplotě místnosti bylo 20 μΐ směsi DNA/lipid přivedeno do kontaktu s buňkami, v nepřítomnosti FCS, na 2 hodiny, a pak bylo do kultivačního média doplněno FCS nebo přípravek ULTROSER™ (BioSepra lne.) na to# #··· • to « • ··« • · to • · · ·· · • · · · ·· ·· • to toto • · · to <· ♦ • · · ··· • · ····
- 30 výslednou koncentraci 10 % nebo 2 %, v uvedeném pořadí. PPAR ligandy, rozpuštěné v DMSO, byly přidány do kultivačního média ve stejném okamžiku jako FCS nebo ULTROSER™. Osmačtyřicet hodin po transfekci bylo kultivační odstraněno a buňky byly opláchnuty dvakrát PBS (Life Technologies lne.). Aktivita luciferázy z Photinus pyralis a aktivita luciferázy z Renilla reniformis byly stanoveny užitím testovací soupravy Dual-Luciferase Reportér Assay Systém™ (Promega Corporation) podle pokynů výrobce.
Experimenty s přenosem genů in vivo se prováděly na samicích myší C57BI/6 stáří 6 týdnů, zvířata byla podrobena anestezi peritoneálním podáním 250 μΐ směsi ketaminu (Rhóne Mérieux, výsledná koncentrace 10 mg/ml) a xylazinu (Bayer Pharma, výsledná koncentrace 0,3 mg/ml). Pak bylo injikováno celkové množství 10 μg DNA do horní (kraniální tibiální) části každého lýtkového svalu. Na každou končetinu pak bylo aplikováno elektrické pole (frekvence 1 Hz; 4 pulzy o délce 20 ms při spádu napětí 250 V/cm). V průběhu celého experimentu zvířata dostávala každé ráno nuceným krmením buďto dávku 30 mg/kg BRL49653 (SmithKline Beecham) v 1% karboxycelulóze (hmot./obj.) nebo samotnou 1% karboxycelulózu. Čtyři dny po přenosu genu byla zvířata utracena a svaly vyjmuty a vloženy do lyzovacího pufru PLB™ (Promega Corporation) v lyzovacích zkumavkách Matrix™ (BIO 101, lne.). Rozdrcení svalové tkáně umožňující extrahovat luciferázu bylo provedeno pomocí zařízení FastPrep™ (BIO 101, lne.) po dobu 25 vteřin při 6,5 m/s. Aktivita luciferázy z Photinus pyralis pak byla stanovena pomocí testovací soupravy Luciferase Assay System™ (Promega Corporation) podle pokynů výrobce.
• · • · 9
9999 »♦ 9999
I · · ·· 99
99 • 9 9 ·
9 9
9 9 9
9 9 9
9999
Příklad 1
Konstrukce promotorů indukovatelných PPAR a expresních plazmidú obsahujících tyto promotory
1.1. Plazmid FTKpGL3.
Fragment DNA, odpovídající části promotoru genu TK z viru herpes simplex typu 1 (HSV-1), mezi polohami -105 a +56 vzhledem k místu iniciace transkripce, byl amplifikován užitím PCR z plazmidú pBLCAT2 (Luckow B. a Schutz G. , Nucleic Acids Res., 15 (1987) 5490) jakožto templátu a s oligonukleotidy 5' CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGC CCA GCG 3' (SEKVENCE ID. Č. 28) a 5' TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3' (SEKVENCE ID. Č. 2) jakožto primery. Tento fragment byl štěpen BglII a HindlII a pak byl klonován do plazmidú pGL3-Basic předtím naštěpeného BglII a HindlII, čímž byl získán plazmid FTKpGL3. Tento plazmid je schématicky znázorněn na Obr. 1.
1.2 Plazmid JxnS-TK-pGL3.
Fragment DNA, obsahující jedno nebo více (n) míst J promotoru humánního genu ApoA-II, byl amplifikován užitím PCR z plazmidú J3TKpGL3 (Vu-Dac N. et al. , J. Clin. Invest., 96 (1995) 741-750) jakožto templátu a s oligonukleotidy 3RDA37
(5' ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTA GAG GAT CTC TAC CAG G 3' ;
SEKVENCE ID. \z c. 3) a 4RDA48 (5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG
TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3' ; SEKVENCE ID. c. 4)
j akožto primery. Tento fragment byl štěpen Xhol a Spěl a pak
byl klonován do plazmidú FTKpGL3 předtím naštěpeného Xhol a Nhel, ve směru transkripce z minimálního promotoru TK (S) , čímž byl získán plazmid JxlS-TK-pGL3, Jx2S-TK-pGL3 a Jx3S-TK44 4···
Ή » « 4 4 4 «444 4
4 4444 4 4 • 4 4 4
4 « *4
4 4 ·
4 4
4 · 4
4 4 • 4 44« 4 pGL3, v závislosti na počtu přítomných míst J. znázornění plazmidu Jx3S-TK-pGL3 je uvedeno na Obr.
Fragment DNA, amplifikovaný užitím PCR
Schématické
2.
z plazmidu
J3TKpGL3 a s oligonukleotidy 3RDA37 a 4RDA48 jakožto primery, naštěpený Xhol a Spěl, byl také klonován do plazmidu Jx3S-TKpGL3 předtím naštěpeného Xhol a Nhel, čímž byl získán plazmid Jx4S-TK-pGL3, Jx5S-TK-pGL3 a Jx6S-TK-pGL3, v závislosti na počtu přítomných míst J.
1.3. Plazmid JxnAS-TK-pGL3.
Plazmid JxnAS-TK-pGL3 se liší od plazmidu JxnS-TK-pGL3 orientací míst J přítomných v indukovatelném promotoru. Fragment DNA obsahující jedno nebo více míst J z promotoru humánního ApoA-II genu, byl amplifikován užitím PCR z plazmidu J3TKpGL3 jakožto templátu a s oligonukleotidy 3RDA37 a 4RDA48 jakožto primery. Tento fragment byl štěpen Sáli a Nhel a pak byl klonován v orientaci opačné k transkripci z minimálního promotoru TK (AS) , do plazmidu FTKpGL3 předtím naštěpeného Xhol a Nhel , čímž byl získán plazmid JxlAS-TK-pGL3, Jx2AS-TKpGL3 a Jx3AS-TK-pGL3, v závislosti na počtu přítomných míst J. Schématické znázornění plazmidu Jx3AS-TK-pGL3 je uvedeno na Obr. 3.
Fragment DNA, amplifikovaný užitím PCR z plazmidu J3TKpGL3 a s oligonukleotidy 3RDA37 a 4RDA48 jakožto primery, naštěpený Kpnl a Spěl, byl také klonován v antisense (AS) orientaci do plazmidu Jx3AS-TK-pGL3 předtím naštěpeného Kpnl a Nhel, čímž byl získán plazmid Jx4AS-TK-pGL3 a Jx5AS-TK-pGL3 v závislosti na počtu přítomných míst J.
• · • ·
1.4 Plazmidy DRlxnS-TK-pGL3.
Tyto plazmidy obsahují jakožto PPAR responzívní element (PPRE) kanonickou sekvenci (AGGTCA A AGGTCA, SEKVENCE
ID. Č. 5) nazvanou kanonická sekvence DR1. Fragment DNA, obsahující jedno nebo více kanonických míst DR1, byl amplifikován užitím PCR s oligonukleotidy 1RDA69 (5' ACG TGT
CGA CAC TAG TCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA
AAG GTC ACG GAG AAC TAG 3 ' ; SEKVENCE ID. Č. 6) a 2RDA64
(5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCG TGA CCT TTG ACC
TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3' ; SEKVENCE ID. Č. 7) j akožto
primery. Tento fragment byl štěpen Xhol a Spěl a pak byl klonován v sense orientaci do plazmidu FTKpGL3 předtím naštěpeného Xhol a Nhel, čímž byl získán plazmid DRlx2S-TKpGL3 a DRlx3S-TK-pGL3, v závislosti na počtu přítomných kanonických míst DR1. Schématické znázornění plazmidu DRlx3STK-pGL3 je uvedeno na Obr. 4.
Fragment DNA, amplifikovaný užitím PCR s oligonukleotidy 1RDA69 a 2RDA64 jakožto primery, naštěpený Xhol a Spěl, byl také klonován do plazmidu DRlx3S-TK-pGL3 předtím naštěpeného Xhol a Nhel, čímž byl získán plazmid DRlx5S-TK-pGL3, DRlx6S~ TK-pGL3 a DRlx7S-TK-pGL3, v závislosti na počtu přítomných kanonických míst DR.
1.5. Plazmidy DRlxnAS-TK-pGL3.
Plazmid DRlxnAS-TK-pGL3 se liší od plazmidu DRlxnS-TKpGL3 orientací kanonické sekvence DR1 přítomné v indukovatelném promotoru. Fragment DNA, obsahující jednu nebo více kanonických sekvencí DR1, byl amplifikován užitím PCR s oligonukleotidy 1RDA69 a 2RDA64 jakožto primery. Tento fragment byl štěpen Sall a Nhel, a pak byl klonován v antisense orientaci do plazmidu FTKpGL3 předtím naštěpeného » · · · · <
• ·
- 34 Xhol a Nhel, čímž byl získán plazmid DRlx2AS-TK-pGL3 a DRlx3AS-TK-pGL3, v závislosti na počtu přítomných kanonických míst DR1. Schématické znázornění plazmidu DRlx3AS-TK-pGL3 je uvedeno na Obr. 5.
Fragment DNA, amplifikovaný užitím PCR s oligonukleotidy 1RDA69 a 2RDA64 jakožto primery, naštěpený KpnI a SPel, byl také klonován do plazmidu DRlx3AS-TK-pGL3 předtím naštěpeného KpnI a Nhel, čímž byl získán plazmid DRlx5AS-TK-pGL3 a DRlx6AS-TK-pGL3 v závislosti na počtu přítomných kanonických míst DR1.
Příklad 2
Specifičnost PPAR pro různé responzivní elementy
2.1. Systém užívající hPPARg2.
Aktivita indukovatelných promotorů užívajících hPPARg2 jakožto regulátoru transkripce, byla vyhodnocena v experimentu s přechodnou (tranzientní) expresí na myších myoblastech (Obr. 6). Výsledky ukazují, že v závislosti na použitém responzívním elementu (PPRE), indukce ligandem hPPARg2 (BRL49653) a výsledná aktivita po aktivaci se různí. Nej lepších výsledků bylo dosaženo užitím míst J jakožto PPRE. Kromě toho je důležitá i orientace PPRE. V případě místa J je
AS orientace výhodnější (viz panel c).
2.2. Systém užívající hPPARa.
Výsledky získané s hPPARa jakožto regulátorem transkripce jsou shrnuty na Obr. 7. Na rozdíl od PPARg2, je • · · ······ · ··© · φ · · * φ φ · © ······· © · • · · · · · · • · · · · «·
- 35 pro hPPARa nej lepším PPRE kanonická sekvence DR1 (Panely d a e) .
Tudíž tyto výsledky ukazují (1) funkčnost plazmidů podle vynálezu a (2) že v závislosti na zvoleném PPAR v indukovatelném systému, je důležité vybrat co nejvhodnější PPRE jako regulátor transkripce. Tento výběr ovlivňuje indukční faktor vzhledem k přítomnosti ligandu, ale také hladinu aktivity dosaženou po indukci. Je zřejmé, že v systémech podle vynálezu lze využít i jiné PPRE.
Příklad 3
Konstrukce promotorů indukovatelných PPAR obsahujících minimální promotor jiný než HSV1-TK, např. minimální promotor hCMV-IE
3.1. Konstrukce plazmidu obsahujícího minimální promotor CMV-IE
Fragment DNA obsahující minimální promotor hCMV-IE (od polohy -54 do +48 vzhledem k místu iniciace transkripce), byl amplifikován užitím PCR z plazmidu pCMVP (Clontech) jakožto templátu a s oligonukleotidy 5RDA32 (5' ACG TAG ATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3'; SEKVENCE ID. Č. 8) a 6RDA29 (5' ACG TAA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3'; SEKVENCE ID. Č. 9) jakožto primery. Tento fragment byl štěpen HindlII a BglII a pak byl klonován do plazmidu FTKpGL3 předtím naštěpeného HindlII a BglII, čímž byl získán plazmid FCMVpGL3.
Plazmid Jx5AS-TK-pGL3 byl štěpen BglII a Nhel, aby byl izolován fragment BglII-Nhel velikosti 179 bp obsahující • · • · · ·
- 36 5 kopií místa J. Tento fragment bylo vložen do plazmidu FCMVpGL3 předtím naštěpeného BglII a Nhel, čímž byl připraven plazmid Jx5AS-CMV-pGL3. Schématické znázornění plazmidu Jx5ASCMV-pGL3 je uvedeno na Obr. 8.
Plazmid Jx5AS-CMV-pGL3 byl štěpen Sphl a Nhel, aby byl izolován fragment SphI-Nhel fragment velikosti 982 bp obsahující 5 kopií místa J, minimální promotor hCMV-IE a 5'-koncový úsek genu kódujícího luciferázu. Tento fragment byl vložen do plazmidu Jx5AS-CMV-pGL3 předtím naštěpeného Sphl a Spěl, čímž byl připraven plazmid JxlOAS-CMV-pGL3. Plazmidy Jxl5AS-CMV-pGL3 a Jx20AS-CMV-pGL3 byly získány užitím stejné strategie.
3.2. Aktivita plazmidu obsahujícího minimální promotor CMV-IE
Srovnání minimálních promotorů, které mohou být užity pro indukovatelný systém, bylo provedeno v experimentu s přechodnou (tranzientní) expresí. Výsledky shrnuté na Obr. 9 ukazují, že v závislosti na použitém minimálním promotoru se výsledná aktivita po indukci liší až dvakrát. Tyto výsledky zejména ukazují, že v podmínkách testu CMV promotor poskytuje vyšší aktivitu. Je zřejmé, že lze využít i jiné minimální promotory, jako jsou např. promotory neobsahující TATA box.
Příklad 4
Význam počtu responzívních elementů přítomných v indukovatelných promotorech
Optimalizace počtu PPRE přítomných v indukovatelném promotoru byla zkoumána v experimentech s tranzientní expresí.
• · · · · • · · 9
99999 9
9 9 6· « · ······
Výsledky shrnuté na Obr. 10 ukazují, že čím větší je počet kopií PPRE, tím větší je indukční faktor pro ligand a indukovaná aktivita. Na druhé straně, když je tento počet příliš vysoký, jak indukční faktor tak i indukovaná aktivita jsou sníženy, a to bez ohledu na množství hPPARg2 přítomného v testu (Obr. 11) . Optimální počet PPRE se zdá být mezi 10 a 15 .
Příklad 5
Konstrukce regulátoru transkripce vysoce indukovatelného ligandy PPAR
5.1. Konstrukce regulátor transkripce obsahujícího dvě kopie ligand-vazebné domény. Konstrukce plazmidu pSG5-hPPARg2g2
Fragment DNA, označený A, obsahující DNA úsek komplementární k hPPARg2 kódující C-koncovou část domény F, byl amplifikován užitím PCR z plazmidu pSG5-hPPARg2 jakožto templátu a s oligonukleotidy 20RDA21 (5' GGT TTG CTG AAT GTG AAG CCC 3'; SEKVENCE ID. Č. 10) a 21RDA42 (5' AGT CTC TAG AGC TAC GCG TAC AAG TCC TTG TAG ATC TGC TGC 3' ; SEKVENCE ID. Č. 11) jakožto primery. Fragment DNA, označený B, obsahující DNA úsek komplementární k hPPARg2 kódující domény E a F, byl amplifikován užitím PCR z plazmidu pSG5-hPPARg2 jakožto templátu a s oligonukleotidy 22RDA32 (5' AGT CAC GCG TGG GCG
ATC TTG ACA GGA AAG AC 3'; SEKVENCE ID. Č. 12) a 23RDA21 (5' GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3'; SEKVENCE ID. Č. 13) jakožto primery. Fragment A naštěpený Sací a Mlul a fragment B naštěpený Mlul a Xbal, byly klonovány společně do plazmidu pSG5-hPPARg2 předtím naštěpeného Sací a Xbal, čímž byl získán « · ···· · ♦ «« ··· · · · ··«« • Φ·*» · · · 9 · · • · ···· « · · · * · · · • β 9 ·· «· ······
- 38 plazmid pSG5-hPPARg2g2. Tento plazmid, jehož schématické znázornění je uvedeno na Obr. 12, obsahuje komplementární DNA, která kóduje regulátor transkripce (označený hPPARg2g2) obsahující dvě kopie domén E a F, čili dvě ligand-vazebné domény. Úplná sekvence PPARy2y2 je uvedena níže (SEKVENCE ID. Č. 24) :
MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTTVDF S SISTPHYEDIPFTRTDPWADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYN KPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS RNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYD SYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEG QGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPI EDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPL LQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGC qfrsveavqeiteYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGF MTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDI QDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQE IYKDLY
Sekvence C-koncové části PPARy2y2, obsahující doménu E a F, je následující SEKVENCE ID. Č. 25:
MMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTL LKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLI SEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALEL DDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTD LRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMG EDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKY GVHEI IYTMLASLMNKDGVLI SEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDS DLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQ IVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY
5.2. Aktivita plazmidu pSG5-hPPARg2g2
Výsledky uvedené na Obr. 13 ukazují, že když je indukovaná aktivita je nižší při použití hPPARg2g2 jakožto regulátoru transkripce (Obr. 13 a, b) , indukční faktor pro ligand (Obr. 13 c) je mnohem vyšší s tímto regulátorem. Rozdíl • · · · ··· ·· * ···« • · · a · a · ·· · • ····· · · · « a · · a • a · · » « · · · a ·* · « · · a ······
- 39 mezi dvěma regulátory transkripce je vysvětlen skutečností, že v případě hPPARg2g2 šum systému v nepřítomnosti ligandu je nízký a zůstává nízký bez ohledu na množství přítomného regulátoru. Na druhé straně čím vyšší je zvýšení hPPARg2g2, tím vyšší je indukovaná aktivita, což není případ systému užívajícího hPPARg2, který se saturuje, jak se zdá.
Přítomnost druhé ligand-vazebné domény (hPPARg2g2) tudíž poskytuje regulátoru transkripce vyšší indukovatelnost ligandem.
Příklad 6
Zvýšení výsledné aktivity indukovatelného promotoru
6.1. Konstrukce indukovatelné expresní kazety obsahující intron hEFla. Konstrukce plazmidu JxlOAS-CMV-EF-pGL3.
Fragment DNA, obsahující první intron genu kódujícího hEFla (od polohy +16 do polohy +984 vzhledem k místu iniciace transkripce; Přístupové číslo v Genbank: E02627), byl amplifikován užitím PCR s oligonukleotidy 25RDA35 (5' AGT CAC
TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG 3'; SEKVENCE ID. Č. 14) a 26RDA36 (5' AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTC ACG
ACC 3'; SEKVENCE ID. Č. 15) jakožto primery. Tento fragment byl štěpen Hindi II a Ncol a pak byl klonován do plazmidu JxlOAS-CMV-pGL3 předtím naštěpeného HindlII a Ncol, čímž byl získán plazmid JxlOAS-CMV-EF-pGL3. Schématické znázornění plazmidu JxlOAS-CMV-EF-pGL3 je uvedeno na Obr. 14.
« · • · ·
- 40 6.2. Aktivita plazmidu JxlOAS-CMV-EF-pGL3.
S cílem zvýšit výslednou aktivitu systému byla enhancerová (zesilovací) sekvence, situovaná v prvním intronu genu hEFla klonována do sousedství indukovatelného promotoru. Výsledky uvedené na Obr. 15 ukazují, že přítomnost enhancerového úseku zvyšuje aktivitu systému, a to bez ohledu na to, jaké množství regulátoru transkripce bylo použito.
Příklad 7
Konstrukce plazmidu obsahujícího jak kazetu pro expresi regulátoru transkripce tak indukovatelnou expresní kazetu
7.1. Plazmid Jx5AS-TK-luc-hPPARg2.
Plazmid pSG5-hPPARa(Koz) byl štěpen Mlul a Seal, aby mohl být izolován Mlul-Scal fragment velikosti 1229 bp obsahující 3'-koncový úsek DNA komplementární k hPPARa. Tento fragment byl vložen do plazmidu pSL301 předtím naštěpeného Mlul a Smál, čímž byl připraven plazmid pSL-3'hPPARa.
Plazmid pSG5-hPPARa(Koz) byl štěpen Sáli a Mlul, aby mohl být izolován Sall-Mlul fragment velikosti 1406 bp obsahující Časný promotor viru SV40 a 5'-koncový úsek DNA komplementární k hPPARa. Tento fragment byl vložen do plazmidu pSL-3'hPPARa předtím naštěpeného Xhol a Mlul, čímž byl připraven plazmid pSL-hPPARa.
Plazmid pSL-hPPARa byl štěpen Spěl a Sáli, aby mohl být izolován Spel-Sall fragment velikosti 2664 bp obsahující časný promotor viru SV4 0 a DNA komplementární k hPPARa. Tento fragment byl vložen do plazmidu pBluescript II SK+ předtím »· to • to to to to to • · · « * to totototo • to·· ·· · ·· « • · ···· « to * · · · · · • to · ···· ··· ·· · «· «· tototo···
- 41 naštěpeného Spěl a Sáli, čímž byl připraven plazmid pBShPPARa.
Plazmid pSG5-hPPARg2 byl štěpen AvrlI a Sací, aby mohl být izolován AvrlI-SacI fragment velikosti 2070 bp, označený C, obsahující 5'-koncový úsek DNA komplementární k hPPARg2. Fragment DNA, označený D, obsahující 3'-koncový úsek DNA komplementární k hPPARg2, byl amplifikován užitím PCR z plazmidu pSG5-hPPARg2 jakožto templátu a s oligonukleotidy 10RDA21 (5' CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3'; SEKVENCE ID.
Č. 16) a 11RDA40 (5' TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA
GAT CTC CTG C 3'; SEKVENCE ID. Č. 17) jakožto primery. Fragment C a fragment D, naŠtěpené Sací a Sáli, byly klonovány společně do plazmidu pBS-hPPARa předtím naštěpeného AvrlI a Sáli, čímž byl získán plazmid pBS-hPPARg2.
Plazmid Jx5AS-TK-pGL3 byl štěpen KpnI a Sáli, aby mohl být izolován KpnI-SalI fragment velikosti 2324 bp obsahující gen luc+ pod kontrolou indukovatelného promotoru. Tento fragment byl vložen do plazmidu pBS-hPPARg2 předtím naštěpeného KpnI a Sáli, čímž byl připraven plazmid Jx5AS-TKluc-hPPARg2. Schématické znázornění plazmidu Jx5AS-TK-luchPPARg2 je uvedeno na Obr. 16.
7.2. Plazmid SV-g2-J10-C-pGL3
Plazmid pBS-hPPARg2 byl štěpen Notl a Sáli, aby mohl být izolován Notl-Sall fragment velikosti 2622 bp, označený E, obsahující DNA komplementární k hPPARg2 pod kontrolou časného promotoru SV40. Fragment DNA, označený F, obsahující polyadenylační místo z viru SV40, byl amplifikován užitím PCR z plazmidu FTK-pGL3 jakožto templátu a s oligonukleotidy 18RDA31 (5' AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACA TGA TAA G 3'; SEKVENCE ID. Č. 18) a 19RDA35 (5' AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTT tttt « · · · · · · · · · • ••tt ·· · · · · • ······· 9 9 9 9 · ·
- 42 ATC GAT TTT ACC AC 3'; SEKVENCE ID. Č. 19) jakožto primery.
Fragment E a fragment F, naštěpené Sall a Nhel, byly klonovány společně do plazmidu JxlOAS-CMV-pGL3 předtím naštěpeného Notl a Nhel, čímž byl získán plazmid SV-g2-J10-C-pGL3. Schématické znázornění plazmidu SV-g2-J10-C-pGL3 je uvedeno na Obr. 17.
7.3. Plazmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3
Fragment DNA, označený G, obsahující DNA komplementární k hPPARg2, byl amplifikován užitím PCR z plazmidu Jx5AS-TKluc-hPPARg2 jakožto templátu a s oligonukleotidy 12RDA50 (5' GTC AGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA
GAT TCT CC 3'; SEKVENCE ID. Č. 20) a 13RDA42 (5' TAC GGG GTA
CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TGG 3' ; SEKVENCE ID.
Č. 21) jakožto primery. Fragment DNA, označený H, obsahující minimální promotor hCMV-IE (od polohy -54 do polohy +48 vzhledem k místu iniciace transkripce), byl amplifikován užitím PCR z plazmidu pCMVP jakožto templátu a s oligonukleotidy 14RDA33 (5' GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC
GGT GGG AGG 3'; SEKVENCE ID. Č. 22) a 15RDA33 (5' TAC GCT CGA
GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GCG 3'; SEKVENCE ID. Č. 23) jakožto primery. Fragment G, naštěpený KpnI a Xhol, a fragment H, naštěpený Xhol a Nhel, byly klonovány společně do plazmidu Jx5AS-TK-pGL3 předtím naštěpeného KpnI a Nhel, čímž byl získán plazmid hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3. Schématické znázornění plazmidu hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3 je uvedeno na Obr. 18.
7.4. Plazmid hPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3
Plazmid Jx5AS-CMV-pGL3 byl štěpen Nhel a Sphl, aby mohl být izolován Nhel-Sphl fragment velikosti 982 bp obsahující ·· · · • · « « ·
9 ·· • · 9 9 9
9 9 9 9 9
9999999 ·
- 43 5'-koncový úsek genu luc+ pod kontrolou indukovatelného promotoru. Tento fragment byl vložen do plazmidu hPPARg2-CMVJx5AS-TK-pGL3 předtím naštěpeného Spěl a Sphl, čímž byl připraven plazmid hPPARg2-CMV-JxlOAS-CMV-pGL3. Schématické znázornění plazmidu hPPARg2-CMV-JxlOAS-CMV-pGL3 je uvedeno na Obr. 19.
Plazmid Jx5AS-CMV-pGL3 byl štěpen Nhel a Sphl, aby mohl být izolován Nhel-Sphl fragment velikosti 982 bp obsahující 5'-koncový úsek genu luc+ pod kontrolou indukovatelného promotoru. Tento fragment byl vložen do plazmidu hPPARg2-CMVJxlOAS-CMV-pGL3 předtím naštěpeného Spěl a Sphl, čímž byl připraven plazmid hPPARg2-CMV-Jxl5AS-CMV-pGL3.
Plazmid JxlOAS-CMV-pGL3 byl štěpen Nhel a Sphl, aby mohl být izolován Nhel-Sphl fragment velikosti 1151 bp obsahující 5'-koncový úsek genu luc+ pod kontrolou indukovatelného promotoru. Tento fragment byl vložen do plazmidu hPPARg2-CMVJxlOAS-CMV-pGL3 předtím naštěpeného Spěl a Sphl, čímž byl připraven plazmid hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3.
Příklad 8
Srovnání různých verzí indukovatelného systému in vitro
Na Obr. 20 jsou shrnuty výsledky získané in vitro s různými verzemi indukovatelného systému. Tyto výsledky ukazují, že systémy užívající dva plazmidy (Obr. 20, řádek řádky 1, 3 a 4) podobně jako systémy pouze s jedním plazmidem (Obr. 20, řádky 2 a 5 to 9) jsou funkční; to znamená, že v přítomnosti ligandu PPARg (v tomto případě BRL49653) se výrazně zvyšuje exprese genu. Který je pod kontrolou
4 4 4
4·· 4·· 4444 • 4*4 44 4 44 4
4444444 4 444 4 4
4 · 4 4 4 444
4 44 ·· 444444
- 44 indukovatelného promotoru. Bylo také pozorováno, že pro některé systémy (Obr. 20, řádky 3 a 7 to 9) je indukční faktor pro ligand větší než 30, a že pro systém uvedený na Obr. 20, řádek 4, je aktivita po indukci je shodná s aktivitou silného promotoru jak je např. promotor hCMV-IE.
Příklad 9
Indukovatelný systém může být aktivován různými PPAR ligandy
9.1. Systém užívající hPPARg2
Výsledky uvedené na Obr. 21 ukazují, že hPPARg ligandy jiné než BRL49653, v tomto případě RG12525 (RPR ligand pro hPPARg), mohou být užity pro aktivaci indukovatelného systému. Při koncentraci 100 μΜ použití RG12525 dokonce vedlo k vyšší indukci než jaké bylo dosaženo při použití BRL49653. Jakékoliv další PPARg ligandy mohou být tudíž užity jako induktory systému.
9.2. Systém užívající hPPARa
Stejným způsobem jako pro systém užívající hPPARg, může být systém užívající hPPARa jako regulátor transkripce aktivován např. fibráty nebo WY-14,643 nebo jakýmkoliv jiným ligandem hPPARa.
• · • 9
- 45 Příklad 10
Indukovatelný systém může být aktivován in vivo ve svalu
Na Obr. 22 jsou shrnuty výsledky získané in vivo ve svalu s různými verzemi indukovatelného systému. Výsledky ukazují, že u těchto testovaných verzí (Obr. 22, řádky 2 až 4) , podáváni nuceným krmením ligandu hPPARg umožnilo výrazné zvýšení aktivity indukovatelného promotoru ve svalu. Indukční faktory byly: xl4 pro verzi na Obr. 22, řádek 2, x8 pro verzi na Obr. 22, řádek 3, a x24 pro verzi na Obr. 22, řádek 4. Kromě toho pro jednu verzi (Obr. 22, řádek 2), byla aktivita dosažená u zvířat po podání BRL49653 stejného řádu jako aktivita silného promotoru jako např. promotoru hCMV-IE.
Výsledky uvedené na Obr. 23 také ukazují, že jediná dávka ligandu může indukovat systém, at je tato dávka podána před nebo po transferu genu. Tento experiment také ukázal, že dávka dvakrát menší než normálně užívaná dovoluje dosáhnout stejný indukční faktor.
Systém užívající jaderný receptor PPAR jako regulátor transkripce je tedy funkční in vivo a může být indukován perorálním podáváním ligandu PPAR.
Příklad 11
Konstrukce plazmidu umožňujícího indukovatelnou expresi genu, jehož produkt je secernován
9· 99 • · 9 • ♦ ·
9 9 • · ·
- 46 11.1 Konstrukce plazmidú pRDA02
Plazmid JxlOAS-CMV-pGL3 byl štěpen HindlII a Mlul, aby mohl být izolován HindlII-MluI fragment velikosti 459 bp. Tento fragment byl vložen do plazmidú pXL3010 (Bettan M. et al. , Anal. Biochem., 271 (1999) 187-189) předtím naštěpeného
HindlII a Mlul, čímž vznikl plazmid pRDA02. Tento plazmid obsahuje DNA komplementární ke genu kódujícímu secernovanou formu humánní placentární alkalické fosfatázy (hSeAP), jejíž exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného systémem užívajícím PPAR jako regulátor transkripce. Schématické znázornění plazmidú pRDA02 je uvedeno na Obr. 24.
Příklad 12
Indukovatelný systém umožňuje regulovat in vivo koncentraci secernovaného proteinu v plazmě
Výsledky uvedené na Obr. 25 ukazují, že užitím indukovatelného systému je možné regulovat v průběhu času plazmatickou koncentraci proteinu secernovaného ze svalu, a sice jednoduchým perorálním podáváním ligandu PPAR. Koncentrace hSeAP v plazmě byla zvýšena 18krát (Obr. 25A) dva dny po podání ligandu, a o týden později se navrátila na základní hladinu. Mezi 21. a 39. dnem byla pozorována imunitní reakce proti hSeAP humánního původu jako důsledek zvýšené koncentrace tohoto proteinu v plazmě. I přes tuto imunitní reakci bylo možné provést druhý indukční cyklus (Obr. 25A).
Jak je ukázáno na Obr. 25B, indukovatelný systém také umožňuje denním podáváním ligandu udržovat vysokou hladinu hSeAP v plazmě po dobu odpovídající délce léčení.
• · · ·« ··· · ·· ·· ·····'···* • · · · ·· · · · * • · ···· » · · · · · · · • · · 4 · · · 4 4 4
4 44 44 44 4444
- 47 Příklad 13
Různé ligandy PPAR aktivují indukovatelný systém in vivo, způsobem závislým na dávce
BRL49653, ve své komerční formě určené k léčení diabetů typu II (Avandia™, SmithKline Beecham), a pioglitazon, ve své komerční formě určený pro stejné léčení (Actos™, Takeda Pharmaceuticals) mohou aktivovat indukovatelný systém (Obr.
26A). Obr. 26B také ukazuje, že indukční faktor přímo koreluje s použitou dávkou ligandů.
Systém užívající jaderný receptor PPAR jako regulátor transkripce tudíž dovoluje velmi přesně regulovat hladinu secernovaného proteinu v plazmě. A navíc lze této regulace docílit užitím různých ligandů.
Příklad 14
Konstrukce plazmidu umožňujícího indukovatelnou expresi genu, jehož produkt je angiogenní faktor
14.1 Konstrukce plazmidu Jx10AS-CMV-VEGFa165 .
Čtecí rámec humánního VEGF165 byl klonován užitím reverzní transkripce a PCR z celkové RNA z humánní placenty (Clontech) (Houck et al. Mol. Endocrinol. 12 (1991) 1806-1814) a pak vložen do plazmidu pBluescript (Stratagen) obsahujícího CMV E/P promotor od polohy -522 do +72 a polyA pozdního SV40, čímž byl připraven plazmid pXL3218. Ten byl dále naštěpen HindlII a BsrGI, aby mohl být izolován HindlII-BsrGI fragment ·· t ·* »»·· ·· ·· • · · 4······ · ··· ·· · · · · • · »··♦ · · · · · · · · ··· « · · · *»· ·· · ·· ·· ·« ·»··
- 48 A velikosti 482 bp. Plazmid pXL3218 byl také naštěpen BsrGI a BamHI, aby mohl být izolován BsrGI-BamHI fragment B velikosti 390 bp. Fragmenty A a B byly pak vloženy do plazmidu JxlOASCMV-pGL3 předtím naštěpeného HindlII a BamHI, čímž byl připraven plazmid Jx10AS-CMV-VEGFa165 . Tento plazmid obsahuje DNA komplementární ke genu kódujícímu VEGFA165, jehož exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného systémem užívajícím PPARs jako regulátor transkripce. Schématické znázornění plazmidu Jx10AS-CMV-VEGFa165 je uvedeno na Obr. 27.
Tento plazmid může být např. užit pro regulaci angiogenní aktivity VEGF pro terapeutické účely.
·· »9 > β · ·
I · · *4 •r • · »··«
- 49 SEZNAM SEKVENCÍ <160> 28 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcaaccttta ccctggtag <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcgccaagct tctcgtgatc tgcggca <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 acgtgtcgac actagtggct agaggatctc taccagg <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagcga gatccttcaa cctttacc ** *·4« • · » • 4 4 4 • 4 4«·· · • 4 4 »
4 ·
4
4 >4 ♦
4 • 4 • · • 4 ·
4
4**4 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aggtcaaagg tca 13 <210> 6 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 acgtgtcgac actagtcaaa actaggtcaa aggtcacgga aaactaggtc aaaggtcacg 60 gaaaactag 69 <210> 7 <211> 64 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagccg tgacctttga cctagttttc cgtgaccttt 60 gacc 64 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 acgtagatct cggtaggcgt gtacggtggg ag 32 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 acgtaagctt ctatggaggt caaaacagc 29 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 • · ggtttgctga atgtgaagcc <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agtctctaga gctacgcgta caagtccttg tagatctcct gc 42
<210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 12 agtcacgcgt gggcgatctt gacaggaaag ac
<210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Homo <400> 13 gcctttgagt sapiens gagctgatac c
<210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 14 agtcactagt aagctttttg ccgccagaac acagg
<210> 15 <2li> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 15 agtcactagt ccatggctgc ccagtgcctc acgacc
<210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens
<40'0> 16
caggtttgct gaatgtgaag c • · • · • · <210> 17 <211> 40 <212> DNA
<213> Homo <400> 17 tgacgtgtcg sapiens 40
acctagtaca agtccttgta gatctcctgc
<210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 18 agtcgtcgac gcttcgagca gacatgataa g 31
<210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 19 agtcgctagc gacggatcct tatcgatttt accac 35
<210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gtcagctagc ctactcgagc caccatgggt gaaactctgg gagattctcc <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tacggggtac ccagacatga taagatacat tgatgagttt gg <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gtcagctagc cggtaggcgt gtacggtggg agg <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tacgctcgag cttctatgga ggtcaaaaca gcg <210> 24 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Met 1 Gly Glu Thr Leu 5 Gly Asp Ser Pro Ile 10 Asp Pro Glu Ser Asp 15 Ser
Phe Thr Asp Thr 20 Leu Ser Ala Asn Ile 25 Ser Gin Glu Met Thr 30 Met Val
Asp Thr Glu 35 Met Pro Phe Trp Pro 40 Thr Asn Phe Gly Ile 45 Ser Ser Val
Asp Leu 50 Ser Val Met Glu Asp 55 His Ser His Ser Phe 60 Asp Ile Lys Pro
Phe 65 Thr Thr Val Asp Phe 70 Ser Ser Ile Ser Thr 75 Pro His Tyr Glu Asp 80
Ile Pro Phe Thr Arg 85 Thr Asp Pro Val Val 90 Ala Asp Tyr Lys Tyr 95 Asp
Leu Lys Leu Gin 100 Glu Tyr Gin Ser Ala 105 Ile Lys Val Glu Pro 110 Ala Ser
Pro Pro Tyr 115 Tyr Ser Glu Lys Thr 120 Gin Leu Tyr Asn Lys 125 Pro His Glu
Glu Pro 130 Ser Asn Ser Leu Met 135 Ala Ile Glu Cys Arg 14 0 Val Cys Gly Asp
Lys 145 Ala Ser Gly Phe His 150 Tyr Gly Val His Ala 155 Cys Glu Gly Cys Lys 160
Gly Phe Phe Arg Arg 165 Thr Ile Arg Leu Lys 170 Leu Ile Tyr Asp Arg 175 Cys
Asp Leu Asn Cys 180 Arg Ile His Lys Lys 185 Ser Arg Asn Lys Cys 190 Gin Tyr
Cys Arg Phe 195 Gin Lys Cys Leu Ala 200 Val Gly Met Ser His 205 Asn Ala Ile
• · · 9
- 54 - • «9 9 • 9 9 9
Arg Phe Gly Arg Met Pro Gin Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu
210 215 220
» Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gin Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg
225 230 235 240
Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu
245 250 255
Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys
260 265 270
Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp
275 280 285
- Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gin Glu Gin Ser Lys Glu
290 295 300
- Val Ala Ile Arg Ile Phe Gin Gly Cys Gin Phe Arg Ser Val Glu Ala
305 310 315 320
Val Gin Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn
325 330 335
Leu Asp Leu Asn Asp Gin Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu
340 345 350
Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu
355 360 365
Ile Ser Glu dy Gin Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu
370 375 380
Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile
405 410 415
Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys
420 425 430
Pro Ile Glu Asp Ile Gin Asp Asn Leu Leu Gin Ala Leu Glu Leu Gin
• 435 440 445
Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gin Leu Phe Ala Lys Leu Leu
- 450 455 460
Gin Lys Met Thr Asp Leu Arg Gin Ile Val Thr Glu His Val Gin Leu
465 470 475 480
Leu Gin Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu
485 490 495
Leu Gin Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp Ala Ile Leu Thr Gly • · ·· · ·
500 505
Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val 515 520
Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe 530 535
Glu Gin Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg 545 550
Arg Ser Val Glu Ala Val Gin Glu Ile 565
Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn 580 585
Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr 595 600
Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly 610 615
Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe 625 630
Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala 645
Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile 660 665
Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp 675 680
Ala Leu Glu Leu Gin Leu Lys Leu Asn 690 695
Phe Ala Lys Leu Leu Gin Lys Met Thr 705 710
Glu His Val Gin Leu Leu Gin Val Ile 725
Ser Leu His Pro Leu Leu Gin Glu Ile 740 745
Ile
Lys
Ile
Thr
570
Asp
Met
Gin
Gly
Leu
650
Leu
Ile
His
Asp
Lys
730
Tyr
Tyr Asp Met 525
His Ile Thr 540
Phe Gin Gly 555
Glu Tyr Ala
Gin Val Thr
Leu Ala Ser 605
Gly Phe Met 620
Asp Phe Met 635
Glu Leu Asp
Ser Gly Asp
Gin Asp Asn 685
Pro Glu Ser 700
Leu Arg Gin 715
Lys Thr Glu
Lys Asp Leu
510
Asn Ser Leu
Pro Leu Gin
Cys Gin Phe 560
Lys Ser Ile 575
Leu Leu Lys 590
Leu Met Asn
Thr Arg Glu
Glu Pro Lys 640
Asp Ser Asp 655
Arg Pro Gly 670
Leu Leu Gin
Ser Gin Leu
Ile Val Thr 720
Thr Asp Met 735
Tyr
750 <210> 25 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 • ·
Met
Glu
Arg
Pro
Tyr
Lys
Phe
Phe
Leu
Leu
145
Ala
Phe
Glu
Ser
Ala
225
Asp
Ile
Gin
Tyr
Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys 5
Gin Ser Lys Glu Val Ala Ile 20
Ser Val Glu Ala Val Gin Glu 35 40
Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu 50 55
Gly Val His Glu Ile Ile Tyr 70
Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu 85
Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro 100
Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn 115 120
Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile 130 135
Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu 150
Leu Glu Leu Gin Leu Lys Leu 165
Ala Lys Leu Leu Gin Lys Met 180
His Val Gin Leu Leu Gin Val 195 200
Leu His Pro Leu Leu Gin Glu 210 215
Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr 230
Met Asn Ser Leu Met Met Gly 245
Thr Pro Leu Gin Glu Gin Ser 260
Gly Cys Gin Phe Arg Ser Val 275 280
Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe
Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gin 10 15
Arg Ile Phe Gin Gly Cys Gin Phe 25 30
Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile 45
Asn Asp Gin Val Thr Leu Leu Lys 60
Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn 75 80
Gly Gin Gly Phe Met Thr Arg Glu 90 95
Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys 105 110
Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp 125
Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly 140
Asp Ile Gin Asp Asn Leu Leu Gin 155 160
Asn His Pro Glu Ser Ser Gin Leu 170 175
Thr Asp Leu Arg Gin Ile Val Thr 185 190
Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met 205
Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp 220
Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr 235 240
Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His 250 255
Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe 265 270
Glu Ala Val Gin Glu Ile Thr Glu 285
Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Glri • 44 9 9 9 9 9 *
44444*4 4 444 4 4
4 4444 444
44 44 44 4444
290 295 300
Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu
305 310 315 320
Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gin Gly
325 330 335
Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp 340 345 350
Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu 355 360 365
Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser 370 375 380
Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gin
385 390 395 400
Asp Asn Leu Leu Gin Ala Leu Glu Leu Gin Leu Lys Leu Asn His Pro
405 410 415
Glu Ser Ser Gin Leu Phe Ala Lys Leu Leu Gin Lys Met Thr Asp Leu 420 ' 425 430
Arg Gin Ile Val Thr Glu His Val Gin Leu Leu Gin Val Ile Lys Lys 435 440 445
Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu Leu Gin Glu Ile Tyr Lys 450 455 460
Asp Leu Tyr
465
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
cccgttacat aacttacggt
aaatggcccg
<210> <211> <212> <213> 27 30 DNA Homo sapiens
<400> 27
gggacgcgct tctacaaggc
gctggccgaa •4 44 44
4 4 4 4 • 4 4 4 • 4.4 · · · 4 4 · 4 4 4 4 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cgactctaga agatcttgcc ccgcccagcg 30

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kompozice vyznačuj ící tím, že obsahuj e:
    (a) první element obsahující požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou indukovatelného promotoru, který obsahuje PPAR responzívní element a minimální transkripční promotor, a (b) druhý element obsahující nukleovou kyselinu kódující PPAR pod kontrolou transkripčního promotoru, pro jejich současné, oddělené nebo časové oddálené použití.
  2. 2. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že navíc obsahuje:
    (c) ligand pro PPAR, pro jejich současné, oddělené nebo časové oddálené použití.
  3. 3. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačuj ící se tím, že elementy (a) a (b) jsou neseny odlišnými genovými konstrukty.
  4. 4. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačuj ící se tím, že elementy (a) a (b) jsou sestaveny v jediném genovém konstruktu.
  5. 5. Kompozice podle nároku 3 nebo 4 vyznačuj ící se tím, že genový konstrukt je plazmidový nebo virový vektor.
    • ·
    9 9 • · ·· ·· • · · · • · ·
    - 60
  6. 6. Kompozice podle nároku 5 vyznačující se tím, že virus je adeno-asociovaný virus (AAV).
  7. 7. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že PPAR responzívní element obsahuje jedno nebo více PPAR-vazebných míst.
  8. 8. Kompozice podle nároku 7 vyznačující se tím, že PPAR responzívní element obsahuje jedno nebo více míst majících SEKVENCI ID. Č. 1 nebo funkčních variant této sekvence.
  9. 9. Kompozice podle nároku 7 vyznačující se tím, že PPAR responzívní element obsahuje jedno nebo více míst majících SEKVENCI ID. Č. 5 nebo funkčních variant této sekvence.
  10. 10. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 vyznačující se tím, že PPAR responzívní element obsahuje až 30 vazebných míst, výhodně 3 až 20 a nejvýhodněji 5 až 15 vazebných míst.
  11. 11. Kompozice podle vyznačující se promotor buněčného nebo odstraněny úseky, které aktivitu.
    kteréhokoliv z nároků 1 až 10 tím, že minimální promotor je virového genu, ve kterém byly nej sou nutné pro transkripční
  12. 12. Kompozice podle vyznačující se kteréhokoliv z nároků 1 až 11 tím, že indukovatelný promotor obsahuje navíc enhancerový úsek.
    • · 4 4 4
    4 4 4 4 4 • 4 4 4 ·· • ······· 4
    - 61
  13. 13. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že minimální promotor a PPAR responzívní element jsou ve stejné orientaci.
  14. 14. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že minimální promotor a PPAR responzívní element jsou v opačné orientaci.
  15. 15. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kódující PPAR kóduje PPARa nebo PPARy.
  16. 16. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kódující PPAR kóduje modifikovaný PPAR, který obsahuje několik vazebných míst pro ligand.
  17. 17. Kompozice podle kteréhokoliv z vyznačující se tím, že element (d) obsahující nukleovou kyselinu kontrolou transkripčního promotoru.
    nároků 1 až 16 obsahuje navíc kódující RXR pod
  18. 18. Vektor obsahující element (a) a element (b) podle nároku 1.
  19. 19. Vektor podle nároku 18, kde elementy (a) a (b) jsou v opačné orientaci.
  20. 20. Vektor podle nároku 18 nebo 19, kde indukovatelný promotor elementu (a) a transkripční promotor elementu (b) ·· · • · · · · · • · · » · · · · · · • ••4 · · · ·« · • · ···· ··· · · · · · • · · · · · « · · · ·· · ·· ·· ·· ··· ·
    - 62 jsou sestaveny ve vektoru tak, že vytvářejí dvoj směrný promotor.
  21. 21. Vektor podle nároku 20, který obsahuje, a to ve směru 5'->3', první nukleovou kyselinu kódující PPAR, první minimální transkripční promotor kontrolující expresi první nukleové kyseliny, jeden nebo více PPAR responzívních elementů, druhý minimální transkripční promotor a druhou nukleovou kyselinu kódující požadovaný produkt pod kontrolou druhého minimálního transkripčního promotoru.
  22. 22. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 18 až 21, který obsahuje navíc element (d) podle nároku 17.
  23. 23. Použití kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22 pro expresi požadované nukleové kyseliny v buňce ex vivo nebo in vitro.
  24. 24. Použití kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22 pro přípravu produktu, který vede k expresi požadované nukleové kyseliny v buňce in vivo.
  25. 25. Způsob regulace exprese nukleové kyseliny v buňce ex vivo nebo in vitro vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se buňka přivede do kontaktu s kompozicí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22.
  26. 26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že buňka je savčí buňka, výhodně lidská buňka.
    • · ·· • · · · · • ·» · ·· ··
    9 9 9 9 9 9 9 • 99 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9
    9· 9 9 9 9 99 9 9
    - 63
  27. 27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že buňka je svalová buňka.
  28. 28. Způsob regulace exprese nukleové kyseliny in vivo vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se podává kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22.
  29. 29. Buňka modifikovaná tím, že byla přivedena do kontaktu s kompozicí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22.
  30. 30. Modifikovaný PPAR obsahující několik vazebných míst pro ligand.
    Nukleová kyselina kódující PPAR podle nároku 30.
    identifikace PPAR ligandů setím, že obsahuje kroky, kdy se 29 přivede do kontaktu s testovanou se exprese požadované nukleové kyseliny.
  31. 32. Způsob vyznačuj ící buňka podle nároku molekulou a detekuje
  32. 33. Způsob identifikace PPAR ligandů in vivo vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se podá kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22 jakož i testovaná molekula, a detekuje se exprese požadované nukleové kyseliny.
CZ20014609A 1999-06-22 2000-06-22 Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující jaderný receptor PPAR a její pouľití pro regulaci exprese CZ20014609A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9907957A FR2795425B1 (fr) 1999-06-22 1999-06-22 Systeme de regulation pharmacologique de l'expression utilisant les recepteurs nucleaires par et leurs ligands
US14972199P 1999-08-20 1999-08-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20014609A3 true CZ20014609A3 (cs) 2002-05-15

Family

ID=26234999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014609A CZ20014609A3 (cs) 1999-06-22 2000-06-22 Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující jaderný receptor PPAR a její pouľití pro regulaci exprese

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP1190084A1 (cs)
JP (1) JP2003503034A (cs)
KR (1) KR20020028909A (cs)
CN (1) CN1370240A (cs)
AU (1) AU6164500A (cs)
BR (1) BR0011897A (cs)
CA (1) CA2375869A1 (cs)
CZ (1) CZ20014609A3 (cs)
HU (1) HUP0203584A2 (cs)
IL (1) IL147104A0 (cs)
MX (1) MXPA01013227A (cs)
NO (1) NO20016347L (cs)
NZ (1) NZ516678A (cs)
WO (1) WO2000078986A1 (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2403189A1 (fr) * 2000-03-14 2001-09-20 Charbel Massaad Promoteurs hybrides inductibles par l'inflammation, vecteurs les contenant et utilisations
EP1288303A1 (en) * 2001-08-23 2003-03-05 Aventis Pharma S.A. Inducible expression systems employing PPAR transcriptional activators
WO2003012113A2 (en) * 2001-08-02 2003-02-13 Gencell S.A. Inducible expression systems employing ppar transcriptional activators
EP2951287B1 (en) * 2013-02-04 2019-04-03 ETH Zurich Designer circuit controlling diet-induced obesity
CN107779454A (zh) * 2016-08-31 2018-03-09 上海米络凯生物科技有限公司 基于PPARγ信号通路的药物筛选模型的构建和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0769052A2 (en) * 1994-07-01 1997-04-23 The Salk Institute For Biological Studies Mammalian peroxisome proliferator-activated receptors and uses thereof
FR2755699B1 (fr) * 1996-11-08 1998-12-18 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible des genes

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0203584A2 (hu) 2003-02-28
NO20016347L (no) 2002-02-19
CA2375869A1 (fr) 2000-12-28
NO20016347D0 (no) 2001-12-21
WO2000078986B1 (fr) 2001-04-19
JP2003503034A (ja) 2003-01-28
BR0011897A (pt) 2002-03-26
KR20020028909A (ko) 2002-04-17
CN1370240A (zh) 2002-09-18
AU6164500A (en) 2001-01-09
EP1190084A1 (fr) 2002-03-27
MXPA01013227A (es) 2002-06-04
WO2000078986A1 (fr) 2000-12-28
IL147104A0 (en) 2002-08-14
NZ516678A (en) 2004-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stieger et al. In vivo gene regulation using tetracycline-regulatable systems
JP4927805B2 (ja) 段階的なトランス活性化能を有する転写活性化因子
JP3817739B2 (ja) キメラｄｎａ結合性タンパク質
Pimental et al. Dioxin receptor and C/EBP regulate the function of the glutathione S-transferase Ya gene xenobiotic response element
WO2001036447A2 (en) Hormone receptor functional entities and methods of their use
WO1997005249A9 (en) Extension of a protein-protein interaction surface to inactivate the function of a cellular protein
Xie et al. AML and Ets proteins regulate the Iα1 germ‐line promoter
US20040038249A1 (en) Inducible expression systems employing PPAR transcriptional activators
CA2333465C (en) Growth differentiation factor promoter and uses therefor
CZ20014609A3 (cs) Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující jaderný receptor PPAR a její pouľití pro regulaci exprese
Perry et al. Structure and expression of an inducible HSP70-encoding gene from Mus musculus
US20030109678A1 (en) Methods and means for regulation of gene expression
CN113874512A (zh) 诱导毛细胞分化的组合物和方法
Youn et al. A critical role of Sp1-and Ets-related transcription factors in maintaining CTL-specific expression of the mouse perforin gene.
Lin et al. The helix-loop-helix proteins (salivary-specific cAMP response element-binding proteins) can modulate cAMP-inducible RP4 gene expression in salivary cells
ZA200200024B (en) Regulation system of expression using nuclear PPAR receptors.
JP2002529081A (ja) 生物学的事象のｆｋ５０６に基づく調節
EP1288303A1 (en) Inducible expression systems employing PPAR transcriptional activators
WO2000078951A1 (en) Chimeric oca-b transcription factors
WO2001098507A1 (en) Chimeric hsf transcription factors
Williams Functional studies on the murine T cell accessory molecule CD8