JP2002529081A - 生物学的事象のｆｋ５０６に基づく調節 - Google Patents

生物学的事象のｆｋ５０６に基づく調節

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Abstract

(57)【要約】 標的遺伝子の転写ならびに遺伝子操作した細胞の成長、増殖もしくは分化といった生物学的事象を調節するための材料および方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本研究は (米国) 国立一般医科学研究所から交付番号GM-52067により一部支援
を受けた。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
【発明の背景】
FK506 は、FK506 結合タンパク質 (FKBP) に高い親和性で結合してFK506:FKBP
複合体を形成する天然産物である。この相互作用に対して報告されたKd値は400
pM程度と低い。FK506:FKBP複合体は、タンパク質ホスファターゼであるカルシニ
ューリンに高い親和性で結合して、三成分(tripartite)複合体である、[FKBP:FK
506]:[カルシニューリン] 複合体を形成する。カルシニューリンは、触媒サブユ
ニット (カルシニューリンＡ) と調節サブユニット (カルシニューリンＢ) とか
らなるヘテロ二量体である。前記三成分複合体において、FK506 はFKBPをカルシ
ニューリンに結合させるための二量体化剤またはアダプターとして作用する。
【０００３】 数多くの天然のFK506 結合タンパク質 (FKBP類) が既知である。例えば、Kay,
1996, Biochem. J. 314:361-385 (総説) を参照。FKBPタンパク質類は、例えば
、Spencer et al, 1993, Science 262:1019-1024およびWO 94/18317 に開示され
ているように、それらのリガンド結合性のために、イムノフィリン系組換えタン
パク質のリガンド媒介多量体化に基づく生物スイッチ(biological switch) に使
用されてきた。
【０００４】 シクロスポリンＡ（サイクロスポリンＡ） は、興味ある別の大環状天然産物
である。これは、タンパク質のシクロフィリンに結合して複合体を形成し、この
複合体はやはりカルシニューリンと結合して、免疫抑制性の複合体を形成する。
従って、シクロスポリンも二量体化剤として作用する。FK506 およびシクロスポ
リンが示す強力な免疫抑制活性は、特に動物におけるそれらの二量体化剤として
の有用性を制限することになるが、本発明は、それら (および関連化合物) の二
量体化剤としての可能性を、それらの根源的な固有の制限を回避しながら活用す
るものである。
【０００５】
【発明の要約】
本発明は生物スイッチの新規な形態に関し、特に動物細胞内での生物学的事象
を調節するための新規な方法および材料を提供する。それらの生物学的事象とし
ては、例えば、遺伝子転写、細胞内シグナル伝達経路の活性化 (例えば、遺伝子
発現、細胞増殖、またはアポトーシスによる細胞死に至る) 、遺伝子ノックアウ
ト、遺伝子の発現の阻止、ならびに遺伝子産物の機能の阻害が挙げられる。本発
明は、２種類の融合タンパク質を利用したものであり、これらの融合タンパク質
は、１つの共通のリガンドへの相互結合により複合体化した時に、直接または間
接に所望の事象を作動させることができる。
【０００６】 本発明は、それら２種の融合タンパク質をコードする組換えDNA 構築物；それ
ら構築物の１もしくは２以上を含むDNA ベクター；前記構築物によりコードされ
る融合タンパク質；本書に記載した１もしくは２以上のDNA 構築物が形質導入さ
れた (即ち、これら構築物を含み、かつ発現することができる) 細胞、特に動物
細胞；上記融合タンパク質の分子に結合し、その多量体化を誘導することができ
る小分子 (２価もしくは多価の多量体化剤) ；ならびにこれらの作製および使用
方法を包含する。
【０００７】 より具体的には、本発明は、FKBP/CABリガンドまたはシクロフィリン/CABリガ
ンドの存在に応答性である、遺伝子操作された細胞の作製および使用のための方
法および材料を提供する。本発明は、リガンドの存在下で互いに複合体を形成で
きる一組の融合タンパク質をコードする組換えDNA の細胞への導入を利用する。
このような遺伝子操作された細胞がリガンドと接触すると、２種類の融合タンパ
ク質の間の複合体形成と生物学的応答の開始とが起こる。２種類の融合タンパク
質の一方は、カルシニューリンＡ／カルシニューリンＢドメイン(CAB) の１もし
くは２以上のコピーと、少なくとも１つの異種タンパク質ドメインとを含んでい
る。もう１つの第２の融合タンパク質は、FKBP/CABリガンドに結合することがで
き、かつCAB 含有タンパク質と複合体を形成することができる、FKBPタンパク質
に由来するドメインの１または２以上のコピーを含んでいる。第２の融合タンパ
ク質は、代わりに、シクロスポリンもしくは他のシクロフィリン/CABリガンドを
結合させることができ、かつCAB 含有タンパク質と複合体を形成することができ
る、シクロフィリンドメインの１または２以上のコピーを含んでいてもよい。第
２の融合タンパク質はまた、第１の融合タンパク質の異種ドメインと同一でも異
なっていてもよい、少なくとも１つの異種ドメインも含んでいる。本発明の融合
タンパク質に使用するCAB およびFKBPドメインは、天然タンパク質から選んでも
よく、また後で詳しく説明するように、さまざまに修飾 (改変) したものでもよ
い。多様な種(species) に由来するCAB 、FKBPおよび異種ドメインを使用するこ
とができるが、ヒトの遺伝子治療の用途に対してはヒトのペプチド配列またはそ
の変異型が好ましい。作用としては、CAB ドメインとFKBPドメインは、受容体 (
または「リガンド結合」) ドメインとして作用し、リガンド分子の媒介下、２種
類の融合タンパク質間の複合体形成を指向する。リガンドが媒介する複合体によ
り始動(trigger) される生物学的応答の性質は、融合タンパク質の異種ドメイン
により決まる。従って、この異種ドメインは「作用」ドメインとも呼ばれる。
【０００８】 これらの融合タンパク質には、とりわけ、DNA 結合ドメイン、転写調節ドメイ
ンおよび細胞シグナリング(cellular signaling)ドメインを包含する、多様な異
種タンパク質ドメインを使用することができる。本発明の１側面では、２つの融
合タンパク質 (その一方は少なくとも１つのCAB ドメインを含み、もう一方は少
なくとも１つのFKBPまたはシクロフィリンドメインを含む) は、それぞれが少な
くとも１つの異なる異種ドメイン、即ち、他方の融合タンパク質には含まれてい
ない異種ドメインを含んでいる。
【０００９】 例えば、ある態様においては、融合タンパク質の一方は少なくとも１つのDNA
結合ドメインを含み、他方の融合タンパク質は少なくとも１つの転写活性化ドメ
インを含む。２つの融合タンパク質のリガンドで媒介される会合は、転写因子複
合体の形成を意味し、融合タンパク質の一方にあるDNA 結合ドメインにより認識
された (即ち、このドメインと結合することができる) DNA 配列に連結した標的
遺伝子の転写の開始を生ずる。
【００１０】 別の態様では、融合タンパク質の一方が、その融合タンパク質を、細胞膜、核
などの特定の細胞位置に向かわせることができる、少なくとも１つのドメインを
含んでいる。細胞膜を標的とする局在化ドメインとしては、ミリストイル化部位
または受容体タンパク質もしくは他の膜架橋(membrane-spanning) タンパク質の
膜貫通領域といったドメインが挙げられる。もう一方の融合タンパク質は、膜局
在化および／またはクラスター化(clustering)した後に、細胞シグナル伝達経路
を活性化することができるシグナリング・ドメインを含んでいる。シグナリング
・ドメインの例には、成長 (増殖) 因子もしくはサイトカイン受容体の細胞内ド
メイン、FAS またはTNF-R1の細胞内ドメインのようなアポトーシス発動ドメイン
、ならびにSOS, Raf, lck, ZAP-70, caspases(カスパス) 等の他の細胞内シグナ
リング・タンパク質に由来するドメインがある。多数のシグナリング・タンパク
質の例が、WO 94/18317 に開示されている (例、23〜26頁を参照) 。
【００１１】 さらに別の態様では、２つの融合タンパク質のそれぞれが、少なくとも１つの
CAB ドメインと、少なくとも１つのFKBPドメインおよび／もしくはシクロフィリ
ンドメイン、ならびに１もしくは２以上の異種ドメインを含んでいる。このよう
な融合タンパク質は、リガンドの存在下でホモ二量体化することができる。
【００１２】 一般に、宿主細胞に内生のペプチド配列を含むドメインが好ましい。例えば、
ヒトの遺伝子治療の用途に対しては、ヒト起源のドメインが特に有利である。 上記融合タンパク質をコードする組換えDNA 分子、ならびに特に真核細胞 (そ
の中でも酵母および動物細胞が特に興味ある) 内でそれらの発現を指令すること
ができるベクターも提供される。融合タンパク質の構成成分のために、これらを
コードする組換えDNA 分子は、(a) 融合タンパク質の所定のリガンド結合ドメイ
ン (CAB ドメイン、FKBPドメインもしくはシクロフィリンドメイン) またはこの
ようなドメインを含むタンパク質をコードするDNA 分子と、(b) 上記の異種ドメ
インまたはこの異種タンパク質ドメインの誘導元であるタンパク質をコードする
DNA 分子、とに選択的にハイブリダイズすることができる。遺伝暗号の縮重がな
ければこのようにハイブリダイズできると予想されるDNA も包含される。
【００１３】 本発明の融合タンパク質をコードするDNA 配列と、真核細胞内でのそれらの発
現を指令することができるベクターとを用いて、多数の重要な用途に対して細胞
を遺伝子操作することができる。そのようにするには、まず、所望の融合タンパ
ク質の真核 (好ましくは動物) 細胞内での発現を指令するための発現ベクターま
たはDNA 構築物を用意し、次いで該細胞内に組換えDNA を、細胞の少なくとも一
部でDNA 取り込みと導入されたDNA の発現とが可能になるように導入する。DNA
を異種遺伝子発現のために細胞内に導入するための各種の方法および材料のいず
れも使用でき、多様なそれらの方法・材料が周知であるか、および／または市販
されている。
【００１４】 かくして、本発明の目的の１つは、本書に説明するように、２つの融合タンパ
ク質をコードする組換えDNA を含む動物細胞を提供することである。この融合タ
ンパク質の一方はリガンドに結合することができ、かつ少なくとも１つのFKBPま
たはシクロフィリンドメインとこれとは異種の少なくとも１つのドメインとを含
んでいる。第２の融合タンパク質は、少なくとも１つのCAB ドメインとこれとは
異種の少なくとも１つのドメインとを含んでいて、第１の融合タンパク質ならび
にリガンドの１もしくは２以上のリガンド分子と一緒に三成分複合体を形成する
ことができる。一部の態様では、融合タンパク質の一方に存在する１または２以
上の異種ドメインが、他方の融合タンパク質にも存在する。即ち、２つの融合タ
ンパク質は１または２以上の共通の異種ドメインを有している。別の態様では、
各融合タンパク質は、それぞれ異なる１または２以上の異種ドメインを含んでい
る。
【００１５】 本発明の具体的目的は、細胞をリガンドと接触させると標的遺伝子の転写を生
ずるように遺伝子操作された、動物細胞を提供することである。このような細胞
は、上記２つの融合タンパク質をコードする組換えDNA に加えて、これらの融合
タンパク質とリガンドとの複合体の存在に応答性のDNA 配列に標的遺伝子を作動
可能に連結させてなる標的遺伝子を含む標的遺伝子構築物を含んでいる。ある態
様では、この細胞は、宿主細胞の内生のFKBPまたはCAB 含有タンパク質への結合
よりも、FKBP融合タンパク質およびCAB 融合タンパク質の方に、検出可能な優先
度で結合するリガンドとの接触に応答性である。また、その内生シクロフィリン
への結合より大きな親和性でシクロフィリン含有融合タンパク質を結合するリガ
ンドも望ましいかもしれない。
【００１６】 本発明の別の具体的目的は、細胞をリガンドと接触させると細胞の成長、分化
または増殖を刺激するように遺伝子操作された動物細胞を提供することである。
このような細胞では、融合タンパク質の少なくとも一方に存在する異種ドメイン
の少なくとも１つが、細胞の成長、分化または増殖を媒介するホルモンの受容体
の細胞内ドメインといったドメインである。細胞の成長、分化および／または増
殖は、受容体の細胞内シグナリングドメインのクラスター化に続いて生ずる。こ
のようなクラスター化は、自然ではホルモン結合の後に、本発明の遺伝子操作さ
れた細胞内ではリガンドとの接触の後に、起こる。
【００１７】 ヒトの遺伝子治療の用途に対してはヒト起源の細胞が好ましいが、多様な起源
(ヒトまたは他の種) の細胞種を使用することもでき、所望によりこれをヒト被
験者用の生体適合性の材料の中に封入 (カプセル化) してもよい。
【００１８】 本発明の別の目的は、前述した遺伝子操作された細胞の作製用の材料および方
法を提供することである。この目的は、上記融合タンパク質をコードする組換え
DNA を、標的遺伝子構築物のような、任意の補助の組換えDNA と一緒に用意し、
これらの組換えDNA を宿主細胞内に、該細胞によるDNA 取り込みが可能な条件下
で導入することにより達成される。このような形質導入は、培養状態に保持され
た宿主細胞を用いて、ex vivo(生体外) で行ってもよい。培養液態で遺伝子操作
された細胞は、その後、例えばex vivo 遺伝子治療用途において、宿主生体内に
導入することができる。そのようにすると、かくして、リガンドの存在に応答性
の (本書に説明した意味で) 宿主生体、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動
物、を提供する方法を構成することになる。或いは、ヒトまたはヒト以外の宿主
生体内に存在する宿主細胞を用いて、形質導入をin vivo(生体内) で行ってもよ
い。この場合には、宿主生体の１種もしくは２種以上の細胞によるDNA の取り込
みが可能な条件下で、DNA 分子を宿主生体内に直接導入する。従って、この手法
は、リガンドの存在に応答性の (本書に説明した意味で) 宿主生体、好ましくは
ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、を提供する別の方法を構成する。培養状態の細
胞内または完全な生体内にDNA を導入するための各種の材料および方法が当分野
で既知であり、これらを本発明の実施において採用することができる。
【００１９】 他の目的も、本書に説明する遺伝子操作された細胞を用いて達成される。例え
ば、本書に説明する遺伝子操作された細胞を、有効量のリガンドと接触させて、
リガンドが融合タンパク質との複合体を形成できるようにすると、本発明の融合
タンパク質を多量体化する方法が提供される。融合タンパク質の多量体化が標的
遺伝子の転写を発動する態様では、これは標的遺伝子の発現を活性化する方法を
構成する。融合タンパク質が１または２以上のシグナリング・ドメインを含む態
様では、これは細胞シグナル伝達経路を活性化する方法となる。これらの方法は
、細胞培養物中でも、またはヒトの患者を含む完全な生体内でも実施できる。前
者の場合には、リガンドを培地に加える。後者の場合には、その完全な生体にリ
ガンド (これは医薬または獣医薬組成物の形態でもよい) を、例えば、経口、非
経口等で投与する。好ましくは動物へのリガンドの投与量は、投与されたレシピ
エント内で過度の免疫抑制を生ずる恐れのある投与量水準より少なくする。
【００２０】 本発明の別の目的は、ヒトまたはヒト以外に動物の細胞を本書に説明するよう
に遺伝子操作する際に用いるためのキットを提供することである。このようなキ
ットの１つは、本発明の一対の融合タンパク質をコードする組換えDNA 構築物を
含んでいる。この組換えDNA 構築物は一般に、動物細胞への導入に適した真核性
発現ベクターの形態をとり、その中で融合タンパク質の発現を指令することがで
きる。このキットはまた、コードされた融合タンパク質と複合体を形成すること
ができるリガンドのサンプルを含んでいてもよい。このキットはさらに、融合タ
ンパク質の一方に結合することはできるが、両方との複合体の形成はできない、
ラパマイシンまたは他の何らかの化合物のような、多量体化アンタゴニストを含
んでいてもよい。ある態様では、融合タンパク質をコードする組換えDNA 構築物
は、１または２以上の異種ドメインをコードするDNA の代わりに、クローニング
部位を含んでおり、それにより実施者は、好きな異種ドメインをコードするDNA
を導入することができるようになる。別のある態様では、キットは、後でより詳
しく説明するように、複合体を形成した融合タンパク質の存在に応答性のDNA 配
列に連結した標的遺伝子またはクローニング部位を含有する標的遺伝子構築物を
さらに含有していてもよい。
【００２１】
【発明の説明】
定義 本書で用いた用語の定義は、本発明の開示の十分な理解に役立つであろう。
【００２２】 「活性化」は、遺伝子の発現または転写に適用された場合、遺伝子産物、例え
ば、遺伝子によりコードされるRNA またはポリペプチド、の産生における直接的
または間接的に観察可能な増大を意味する。
【００２３】 「選択的にハイブリダイズできる」とは、この語句を本書で使用する場合には
、当業者が経験的に選択または容易に決定できるハイブリダイゼーション条件下
で、他のDNA 分子の存在にもかかわらず、２つのDNA 分子が互いとのハイブリダ
イゼーションを受け易いことを意味する。このような処理としては、室温から65
〜75℃まで範囲の温度において、 0.2〜６×SSC を含有するか、および／または
0.1％〜１％ SDSを含有する緩衝液で強く洗浄するといった、高ストリンジェン
トな条件が挙げられる。例えば、F.M. Ausubel et al.,編, Short Protocols in
Molecular Biology, Units 6.3 and 6.4 (John Wiley and Sons, New York, 第
３版, 1995) を参照。
【００２４】 「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、論じている特定の細胞
だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も意味する。突然変異ま
たは環境の影響により、続く世代においてある種の改変が生じるかもしれないの
で、このような子孫は、実際には親細胞と全く同一ではないかもしれないが、本
書で用いる用語の範囲には依然としてそれらも含まれる。
【００２５】 「細胞系」は、in vitroでの継続した又は長期の成長 (増殖) および分裂が可
能な細胞集団を意味する。しばしば細胞系は、１個の母細胞由来のクローン集団
である。さらに当分野では、このようなクローン集団の保存または移動の間に核
型に自発的なまたは誘導された変化が起こり得ることが知られている。従って、
ある細胞系由来の細胞は、先祖細胞または培養物と正確に同一ではないかもしれ
ないが、言及する細胞系はそのような変異物も含む。
【００２６】 「クローニング部位」は、時に「多重クローニング部位」または「ポリリンカ
ー」とも呼ばれ、ベクター内の、制限酵素切断のための複数の部位を含む領域で
あり、それによりこのベクターは外来性遺伝子のクローニングに適したものとな
る。
【００２７】 「コーディング配列」、即ち、特定のポリペプチドもしくはRNA を「コードす
る」配列は、適当な発現制御配列の制御下に置かれた場合に、in vitroもしくは
in vivo において、転写され (DNA の場合) 、またはポリペプチドに翻訳される
(mRNAの場合) 核酸配列である。コーディング配列の境界は、一般に、 5'(アミ
ノ) 末端の開始コドンと 3'(カルボキシ) 末端の翻訳終止コドンとにより決まる
。コーディング配列としては、原核もしくは真核mRNA由来のcDNA、原核もしくは
真核DNA 由来のゲノムDNA 配列、さらには合成DNA 配列を挙げることができるが
、これらに限定されない。転写終止配列は、通常はコーディング配列の3'に位置
するであろう。
【００２８】 「複合体」「融合体」および「組換え体」は、それ以外では自然には直接 (共
有結合的に) 連結している状態では見出されない、例えば、自然では同じ連続ポ
リペプチドもしくは遺伝子において、少なくとも、複合体、融合体もしくは組換
え生成物において存在するのと同じ順序もしくは向き、または同じ間隔では見出
されない、という意味で、互いに異種である少なくとも２つの構成部分を含む核
酸、核酸配列またはポリペプチドなどの材料を意味する。かかる材料は、少なく
とも２つの異なるタンパク質もしくは遺伝子に由来するか、または同じタンパク
質もしくは遺伝子の少なくとも２つの隣接しない部分に由来する成分を含んでい
る。一般に「複合体」とは、異なる２以上のタンパク質もしくは核酸の部分が一
緒に結合して単一の機能性単位を形成したものを意味し、一方「融合体」は、２
以上の機能性単位が一緒に連結されたものを一般に意味する。「組換え体」は、
一般に核酸または核酸配列に関連して用いられる。
【００２９】 ２種以上のウイルスの投与に関する「連帯」なる用語は、動物の１種または２
種以上の細胞中のウイルスの同時存在においていくらかのオーバーラップが起こ
ることを条件として、２種以上の個々のウイルスの同時、順次または離れた投与
を意味する。
【００３０】 「構築物」、例えば「核酸構築物」または「DNA 構築物」は、核酸または核酸
配列を意味する。 「〜由来」または「〜から誘導」とは、一定の配列内から選択されたペプチド
またはヌクレオチド配列を意味する。ある名称の配列に由来するペプチドまたは
ヌクレオチド配列は、親配列に対して少数の修飾または改変をさらに含んでいる
ことがあり、それらは、ほとんどの場合、親配列に存在するアミノ酸残基または
塩基の約15％以下、好ましくは約10％以下、そして多くの場合は約５％以下の、
欠失、置換または挿入の形をとる。DNA の場合、あるDNA 分子が別のDNA 分子に
由来するとも考えられるのは、これら２つが互いに選択的にハイブリダイズでき
る場合である。ポリペプチドまたはポリペプチド配列が参照のポリペプチドまた
はポリペプチド配列に由来するとも考えられるのは、これら２つのポリペプチド
または配列をコードするDNA が互いに選択的にハイブリダイズできる場合である
。典型的には、誘導されたペプチド配列は、親配列と、５までのアミノ酸、多く
の場合３までのアミノ酸、そして非常にしばしば０もしくは１つのアミノ酸の置
換により異なるであろう。誘導された核酸配列は、親配列と、15までの塩基、多
くの場合９までの塩基、そして非常にしばしば０〜３塩基の置換により異なるで
あろう。場合により、アミノ酸または塩基は、置換ではなく、付加または欠失し
ている。
【００３１】 「二量体化」、「オリゴマー化」および「多量体化」は、本書では互換的に使
われており、２以上のタンパク質分子が、そのタンパク質の少なくとも１つへの
薬剤の結合による媒介で会合またはクラスター化することを意味する。好適態様
において、多量体化は、２以上のかかるタンパク質分子が１つの共通の２価また
は多価薬剤に結合することにより媒介される。それぞれ１または２以上のFKBPド
メインを含んでいる２以上のタンパク質分子を、少なくとも２価であるFKBPリガ
ンド (例、FK1012またはAP1510) の１または２以上の分子と一緒に含んでいる複
合体の形成が、このような会合またはクラスター化の例である。少なくとも１つ
のタンパク質が２以上の薬剤結合ドメインを含んでいる場合、例えば、少なくと
も１つのタンパク質がFKBPドメインを３つ含んでいる場合には、２価薬剤が存在
すると、３以上のタンパク質分子のクラスター化が起こる。薬剤が、薬剤結合ド
メインを有するタンパク質へのその結合能力において３価以上 (例、３価) であ
る態様でも、３以上のタンパク質分子のクラスター化を生ずることがある。少な
くとも１つのCAB ドメインを含むタンパク質と、少なくとも１つのFKBPドメイン
を含むタンパク質と、リガンド分子とからなる三成分複合体の形成は、このよう
なタンパク質クラスター化の別の例である。本発明のある態様では、融合タンパ
ク質は複数のCAB および／またはFKBPドメインを含んでいる。このようなタンパ
ク質の複合体は、２分子以上のリガンドまたは他の二量体化剤と、１または２以
上の成分タンパク質の２コピー以上とを含むことがある。このような多量体複合
体も、１または２以上の成分が複数コピーにより表される場合であっても、本書
ではなお、３種類の成分分子の存在を意味する三成分複合体と云うことにする。
少なくとも１つの２価薬剤と、それぞれ少なくとも１つの薬剤結合ドメインを含
んでいる少なくとも２つのタンパク質分子とを含む複合体の形成は、「オリゴマ
ー化」もしくは「多量体化」、または単に「二量体化」、「クラスター化」もし
くは「会合」と云うことがある。
【００３２】 「二量体化剤」とは、多量体複合体中において２以上のタンパク質をまとめて
いる化合物を意味する。 「２価」は、この用語を本書でリガンドに適用した場合には、リガンド結合ド
メインを含む少なくとも２つのタンパク質分子と複合体形成して、３成分 (また
はより多成分) の複合体を形成することができるリガンドを意味する。
【００３３】 「ドメイン」とは、タンパク質またはポリペプチドの部分を意味する。当分野
では、用語「ドメイン」は、別個の二次構造を有するタンパク質の部分を意味す
ることもある。しかし、ここで使用する文脈からも明らかなように、本書で用い
る用語「ドメイン」は、必ずしも一定の二次構造を意味していない。むしろ、こ
こでは単に、ある特定された供給源由来であるか、または意図もしくは観察され
た活性を保有もしくは付与するポリペプチド配列を意味するものとして、あるペ
プチド配列を「ドメイン」と称する。ドメインは天然型のタンパク質から誘導し
たものでもよく、あるいは非天然型配列を含んでいてもよい。
【００３４】 「DNA 認識配列」は、１または２以上のDNA 結合ドメイン (例、転写因子また
は遺伝子操作されたポリペプチドの) に結合することができるDNA 配列を意味す
る。
【００３５】 「内生」または「内在性」とは、細胞に自然に存在する、即ち、細胞の遺伝子
操作または感染より前から存在する分子を意味する。 「外来性」とは、細胞内に自然には存在せず、例えばその細胞 (またはその親
細胞) のトランスフェクションまたは形質導入によって導入された分子を意味す
る。
【００３６】 FKBP (FK506 結合タンパク質) は、FK506 、FK520 およびラパマイシンのよう
なマクロライド(macrolide) の細胞質 (サイトゾル性) 受容体であり、種の系統
を横断して高度に保存されている。本開示の目的にとって、FKBPとは、FKBP/CAB
リガンドに結合することができ、さらにカルシニューリンまたはCAB 含有タンパ
ク質と三成分複合体を形成することができる、タンパク質またはタンパク質ドメ
インである。FKBPドメインは、「FK506 結合ドメイン」と云うこともある。各種
のFKBP種のヌクレオチド配列、クローニング、および他の特徴に関する情報は、
当分野では既知であり、例えば周知の方法および公表された配列に基づいたPCR
プライマーを用いて、所望のFKBPペプチド配列をコードするDNA の合成またはク
ローニングが可能である。例えば、Staendart et al, 1990, Nature 346, 671-6
74 (ヒトFKBP12); Kay, 1996, Biochem. J. 314, 361-385 (総説) を参照。他の
哺乳動物種、酵母、および他の生物内の相同的FKBPタンパク質も、当分野で公知
であり、本書に開示する融合タンパク質に使用することができる。例えば、Kay,
1996, Biochem. J. 314, 361-385(総説) を参照。本発明に使用するFKBPドメイ
ンのサイズは、通常は90〜100 アミノ酸であるが、これは、どのFKBPタンパク質
を使用するかに応じて変わってくる。本発明の融合タンパク質のFKBPドメインは
、FKBP/CABリガンドに結合して、カルシニューリンまたはCAB 含有タンパク質と
の三成分複合体の形成に関与することができるであろう (このような結合を検出
するための任意の直接的または間接的な手段により決定できる) 。
【００３７】 本発明のFKBP融合タンパク質のFKBPドメインのペプチド配列は下記(a) 〜(c)
を包含する： (a) 天然のFKBPペプチド配列、好ましくはヒトFKBP12タンパク質 (後で例示)
に由来するもの、または他のヒトFKBP、ネズミその他の哺乳動物のFKBP、もしく
は何らかの他の動物、酵母もしくは真菌のFKBPに由来するペプチド配列； (b) 天然のペプチド配列の約10個まで (好ましくは１〜５個、より好ましくは
１〜３個、場合によっては１個だけ) のアミノ酸が欠失、挿入、または置換アミ
ノ酸で置換されている、天然FKBP配列の変異物；あるいは (c) 天然のFKBPをコードするDNA 分子と選択的にハイブリダイズできるDNA 配
列によりコードされるか、または遺伝暗号の縮重がなければ天然のFKBPをコード
するDNA 分子と選択的にハイブリダイズできると予想されるDNA 配列によりコー
ドされるペプチド配列。
【００３８】 「FKBP/CABリガンド」は、FKBPタンパク質に結合して、カルシニューリンまた
はCAB タンパク質に結合する複合体を形成する化合物、例えば、FK506 または前
記のいずれかの類似物、同族物、誘導体もしくは模擬物である。同様に、「シク
ロフィリン/CABリガンド」は、シクロフィリンタンパク質に結合して、カルシニ
ューリンまたはCAB タンパク質に結合する複合体を形成する化合物、例えば、シ
クロスポリンまたは前記のいずれかの類似物、同族物、誘導体もしくは模擬物で
ある。
【００３９】 「遺伝子」は、オープンリーディングフレームを含み、かつ少なくとも１つの
エキソンおよび (任意に) イントロン配列を包含する核酸分子または配列を意味
する。
【００４０】 「遺伝子操作された細胞」とは、組換え核酸または異種核酸 (例、１もしくは
２以上のDNA 構築物またはそれらのRNA 対応物) の導入により改変された細胞を
意味し、さらにこの遺伝的改変の一部または全部を保持するこれらの細胞の子孫
も包含する。
【００４１】 「異種」とは、それがコーディング配列および制御配列のような核酸配列に関
する場合、ある特定の細胞と普通なら結合および／または連係しない配列を意味
する。従って、ある核酸構築物の「異種」領域は、別の核酸分子の内部にあるか
、それに付着している核酸のセグメントであって、自然の状態ではその別の分子
と連係しているのが見られないものである。例えば、ある構築物の異種領域とし
ては、コーディング配列であって、両側にくる２つの配列が自然にはそのコーデ
ィング配列と連係しているのが見られないような配列であるものが挙げられよう
。異種コーディング配列の別の例は、コーディング配列自体が自然には見出され
ないもの (例えば、天然型遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列) である構
築物である。また、その細胞に普通には存在しない核酸構築物が形質導入された
細胞の場合、細胞と構築物は本発明の目的にとっては互いに異種であると考えら
れよう。アレリック (対立遺伝子) 変異または自然に起こる突然変異事象は、本
書で用いる意味での異種DNA を生じさせない。
【００４２】 本書で用いた「相互作用」とは、分子間の検出可能な相互作用、例えば酵母も
しくは哺乳動物ツー・ハイブリッド検定や免疫沈降法により検出できる相互作用
を含む意味である。相互作用という用語は、分子間の「結合」相互作用も含むも
のである。相互作用は、自然の状態では、例えば、タンパク質−タンパク質、タ
ンパク質−核酸、タンパク質−小分子または小分子−核酸の間で起こり得る。
【００４３】 「リガンド」は、対応するタンパク質またはタンパク質ドメインと相互作用す
ることができる任意の分子を意味する。リガンドは天然のものでもよく、リガン
ドはまた部分的または完全に合成されたものでもよい。「改変されたリガンド」
という用語は、その改変されていない形態のリガンドの天然型受容体と著しく相
互作用しないように改変れたリガンドを意味する。本書で使用した意味では、リ
ガンドはFKBP/CABリガンドを指す。
【００４４】 「最小プロモーター」は、ある所定のDNA 配列にそれが作動可能に連結した場
合に、そのDNA 配列の転写を開始させるのに必要な最小の発現制御配列を意味す
る。
【００４５】 「プロモーター」および「発現制御配列」はさらに、「組織特異的な」プロモ
ーターおよび発現制御配列、即ち、特定の細胞 (例、特定組織の細胞) において
優先的に、所定のDNA 配列の発現を生じさせるプロモーターおよび発現制御配列
を包含する。ある特定の細胞種での発現が他の細胞種における発現より著しく高
い場合に、その特定の細胞で優先的に遺伝子発現が起こっている。「プロモータ
ー」および「発現制御配列」の用語はまた、いわゆる「漏出性(leaky) 」の「プ
ロモーター」および「発現制御配列」も含んでおり、これは主としてある１つの
組織において所定DNA の発現を調節するが、別の組織でもまた発現を生じさせる
ものである。これらの用語はまた、ほとんどの細胞種において活性である、非組
織特異的なプロモーターおよび発現制御配列も包含する。さらに、プロモーター
または発現制御配列は、構成的、即ち、基礎的 (定常的) に活性であるものでも
よく、あるいは誘導的、即ち、主に刺激に応答して活性となるプロモーターまた
は発現制御配列でもよい。刺激は、例えば、ホルモン、サイトカイン、重金属、
ホルボールエステル、サイクリックAMP (cAMP)、またはレチノイン酸などの分子
でもよい。
【００４６】 「核酸」は、デオキシリボ核酸 (DNA)、および適当であればリボ核酸 (RNA)の
ようなポリヌクレオチドを意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体から
作成されたRNA またはDNA のいずれかの均等物、誘導体、変異物および類似物も
包含し、また、記載されている態様に適用しうるように、一本鎖 (センスもしく
はアンチセンス) ならびに二本鎖のポリヌクレオチドを含むものと理解されるべ
きである。簡潔のため、本書ではしばしばDNA の用語を用いて、任意の核酸を意
味させる。
【００４７】 「核酸結合ドメイン」は、ある特定のヌクレオチド配列とは本質的に関係しな
いヌクレオチド配列を有する核酸に比べて、その特定のヌクレオチド配列を有す
る核酸とより高い親和性で相互作用または結合するポリペプチドを意味する。好
適態様では、核酸結合ドメインはDNA 結合ドメインである。
【００４８】 「作動可能に連結」とは、このように記載された成分がその通常の機能を遂行
するような立体配置になっているエレメントの配置を意味する。例えば、コーデ
ィング配列に作動可能に連結された発現制御配列は、そのコーディング配列の発
現を可能にする。この制御配列は、これがコーディング配列の発現を指令する機
能を果たす限り、コーディング配列と隣接している必要はない。従って、例えば
、プロモーター配列とコーディング配列との間に、翻訳されないが転写される介
在配列が存在していてもよく、その場合のプロモーター配列もなお、コーディン
グ配列に「作動可能に連結」されたと考えることができる。
【００４９】 「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、例えば、コーディ
ング配列によりコードされうるような遺伝子産物を意味する場合には、本書では
互換的に使われる。
【００５０】 「組換えウイルス」は、 (キャプシドに) 詰め込まれた核酸が異種部分を含ん
でいる完全ウイルス粒子である。 「サブユニット」は、活性化ドメインのサブユニットを云う場合、転写活性化
ドメインの部分を意味する。
【００５１】 「標的遺伝子」は、その発現が本発明の方法により調節される、関心ある (目
的の) 核酸である。標的遺伝子は内在性でも外来性でもよく、また細胞ゲノム内
に組込んでも、またはエピソーム性にとどまっていてもよい。標的遺伝子はある
タンパク質をコードするものでもよく、または非コーディング核酸、例えば、ア
ンチセンスRNA もしくはリボザイムに転写される核酸でもよい。
【００５２】 リガンドの「治療有効用量」とは、治療または予防の有効用量、例えば、遺伝
子操作された細胞において検出可能な標的遺伝子転写または細胞成長、増殖、分
化、死滅等を生じさせる用量、或いは動物または細胞培養モデルで得られたデー
タからの外挿によって治療または予防有効性があると予測される用量を意味する
。治療有効用量は、通常は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の治療に好ましい用
量である。
【００５３】 「転写制御エレメント」とは、それらが作動可能に連結したタンパク質コーデ
ィング配列の転写を誘導もしくは制御する、開始シグナル、エンハンサー、およ
びプロモーターといった調節性のDNA 配列を意味する。「エンハンサー」の用語
は、プロモーターからの転写を増加、刺激または強化することができる調節エレ
メントを包含するものである。このような転写調節成分は、コーディング領域の
上流に、または場合によっては (例、エンハンサー) 、イントロン、エキソン、
コーディング領域および3'フランキング配列といった他の位置にもまた、存在し
うる。
【００５４】 「転写因子」とは、転写の開始に関与するが、それ自体はポリメラーゼの一部
ではない任意のタンパク質またはその改変 (修飾) 形態を意味する。転写因子は
、特定の核酸配列、即ち、調節エレメントと優先的に相互作用するタンパク質ま
たはその修飾形態である。一部の転写因子は、それが単量体の形態である時に活
性である。或いは、別の転写因子は、２以上の同一タンパク質からなるオリゴマ
ーまたは異なるタンパク質からなるオリゴマー (ヘテロ二量体) の形態で活性で
ある。転写因子は転写開始中に異なる作用を有し、その相互作用は、他の因子と
、RNA ポリメラーゼと、完全複合体と、活性化剤と、またはDNA との間で起こる
。転写因子は通常は１または２以上の転写調節ドメインを含んでいる。
【００５５】 「転写調節ドメイン」は、転写を調節する任意のドメインを意味し、これは活
性化ドメインと抑制ドメインの両方を包含する。「転写活性化ドメイン」の用語
は、遺伝子転写の速度を正に調節する (増大させる) 転写因子中のドメインを意
味する。「転写抑制ドメイン」の用語は、遺伝子転写の速度を負に調節 (阻害ま
たは減少) する転写因子中のドメインを意味する。
【００５６】 「トランスフェクション」は、裸の核酸分子を受容細胞に導入することを意味
する。「感染」は、ウイルスの遺伝的材料が細胞内で発現可能になるようにウイ
ルスが細胞に入り込む過程をいう。「増殖性感染」は、ウイルスが細胞に入り、
複製された後、細胞から放出される過程をいう (「溶菌」感染とも呼ばれる) 。
「形質導入」は、任意の手段で核酸を細胞中に導入することを包含する。
【００５７】 「導入遺伝子」は、細胞内に導入された核酸配列を意味する。導入遺伝子が導
入された細胞に由来する娘細胞もまた、導入遺伝子を含むと言われる (これが欠
失していなければ) 。導入遺伝子は、これが導入された動物もしくは細胞に対し
て部分的もしくは完全に異種の、例えばポリペプチドをコードすることができる
ものでもよく、または、これが導入された動物もしくは細胞の内在性遺伝子を含
んでいるか、それに由来するものであるが、受容細胞のゲノムにそのゲノムを改
変させるように挿入予定または既に挿入されているもの (例えば、天然型遺伝子
のものとは異なる位置に挿入) でもよい。或いは、導入遺伝子はエピソームに存
在させることもできる。導入遺伝子は、選択されたコーディング配列の最適な発
現に必要もしくは望ましいことのある１または２以上の発現制御配列と任意の他
の核酸 (例、イントロン) とを含むことができる。
【００５８】 「一過性トランスフェクション」とは、外来性DNA がトランスフェクションし
た細胞のゲノムに組込まれない場合、例えば、エピソームDNA がmRNAに転写され
るが、タンパク質に翻訳されない場合、をいう。細胞が核酸構築物で「安定的に
トランスフェクションされた」というのは、核酸構築物がその細胞のゲノムに組
込まれた場合である。
【００５９】 「ウイルス」とは、核酸ゲノムとキャプシドタンパク質コートとの組合わせを
含む野生型(wt)ウイルス粒子、または上述した組換えウイルス粒子といった、完
全ウイルスを意味する。例えば、アデノウイルスは、Ad核酸ゲノムとAdキャプシ
ドタンパク質コートとの組合わせを含む完全ウイルス粒子である。
【００６０】 「野生型」は、普通の細胞に自然に見られることを意味する。 本発明は、新規な二量体化に基づく生物学的スイッチを用いた、遺伝子操作さ
れた細胞における融合タンパク質の多量体化のための方法と材料に関係する。
【００６１】 各種の二量体化に基づく生物学的スイッチの設計および実施が、特に、本書に
引用したSpencer らの論文および各種国際特許出願に報告されている。この一般
的な手法を応用した他の上首尾の事例も報告されている。エフェクタードメイン
に融合させたヒトFRAP由来のドメインを含む融合タンパク質が、Rivera et al.,
1996, Nature Medicine 2, 1028-1032 ならびにWO 96/41865 (Clackson et al)
およびWO 95/33052 (Berlin et al)に開示された。既に述べたように、この融合
タンパク質は、エフェクタードメインを含有する融合タンパク質のリガンド媒介
「二量体化」または「多量体化」による該ドメインの会合が、所望遺伝子の転写
、細胞死、細胞増殖等といった所望の生物学的事象を発動させる。例えば、Ｔ細
胞受容体CD3 ζドメインの細胞内部分に由来する作用ドメイン(action domain)
を含む融合タンパク質のクラスター化は、IL-2プロモーターまたはそれに由来す
るプロモーターエレメントの転写制御下に、遺伝子の転写を発動させる。別の態
様では、作用ドメインは、オリゴマー化すると細胞のアポトーシスを発動させる
ことができる、FAS またはTNF-α受容体 (TNF α-R1)といったタンパク質の細胞
内部分に由来するドメインを含んでいる。また別の態様では、作用ドメインは、
GAL4またはZFHD1 のようなDNA 結合ドメインと、VP16またはp65 等の転写活性化
ドメインとが対を形成して、融合タンパク質のオリゴマー化が、DNA 結合ドメイ
ンにより認識される (該ドメインと特異的に結合相互作用できる) DNA 配列に連
結された遺伝子の転写を発動させる転写因子複合体の組立てを表すようになった
ものを含んでいる。
【００６２】 １または２以上のリガンド結合ドメインと、例えば、標的遺伝子の転写活性化
、細胞死もしくは他のシグナル伝達経路の発動、細胞局在化、細胞増殖等のため
の、１または２以上の作用ドメインとを含む融合タンパク質は、WO 94/18317 、
PCT/US94/08008、Spencer et al 前出、およびBrau et al.(PNAS 1997 94:3076)
に開示されている。リガンドが媒介する遺伝子ノックアウト、またはリガンドが
媒介する遺伝子発現の阻止もしくは遺伝子産物機能の阻害のための、この種の融
合タンパク質の設計および使用は、PCT/US95/10591に開示されている。標的遺伝
子の調節された転写が関係する態様に有用な、新規なDNA 結合ドメインとこれが
結合するDNA 配列は、例えば、Pomeranz et al, 1995, Science 267:93-96 に開
示されている。これらの文献は、本発明の実施者に有用かも知れない類似の融合
タンパク質をコードするDNA 構築物、標的遺伝子構築物、および他の要素の設計
、構築、および使用に関する実質的な情報、指針および実例を提供する。
【００６３】 融合タンパク質を適切に選択すると、本発明により、上に引用した特許文書お
よび他の文献に記載の系に似た、FK506 依存性の様式で、遺伝子操作された細胞
における、所望遺伝子の転写の活性化、または細胞成長、増殖、分化もしくはア
ポトーシスの作動、あるいは他の生物学的事象の発動を行うことが可能となる。
遺伝子操作された細胞、好ましくは動物細胞は、培養状態で増殖または維持され
ているものでもよく、或いはヒトの遺伝子治療、トランスジェニック動物、およ
び他のこの種の用途の場合のように、完全な生体内に存在していてもよい。FKBP
/CABリガンドは、場合に応じて、細胞培養物または遺伝子操作された細胞を含ん
でいる生体に投与され、その投与量は、FKBP融合タンパク質とCAB 融合タンパク
質とを多量体化させるのに有効な量 (こうして発動された標的遺伝子の転写、ア
ポトーシスまたは他の生物学的過程を監視することにより間接的に観察しうる)
である。完全な生体に投与する場合、リガンドは、そのリガンドと１種もしくは
２種以上の許容される獣医学用もしくは薬剤用希釈剤および／もしくは賦形剤と
を含有する組成物の形態で投与してもよい。
【００６４】 融合タンパク質の一方には結合するが、両方の融合タンパク質と三成分複合体
を形成することのない化合物を、多量体化アンタゴニスト（拮抗剤）として使用
してもよい。その場合、この化合物は、リガンドの効果を阻止または逆転させる
、即ち、融合タンパク質の多量体化を防止、阻害または中断させる、のに有効な
量で、遺伝子操作された細胞に、またはそれを含む生体に (完全な動物に投与す
る場合には上述した組成物の形態が好ましい) 投与することができる。例えば、
ラパマイシン、ラパログ、またはFKBPおよびCAB との三成分複合体を形成しない
多くの合成FKBPリガンドのいずれかをアンタゴニストとして使用してもよい。
【００６５】 本発明の１つの重要な側面では、所望遺伝子の転写のリガンド依存性の直接活
性化のための材料および方法が提供される。このような１態様において、２以上
の異なる融合タンパク質と、それらの発現を指令することができる対応するDNA
構築物とからなる１セットが提供される。このような融合タンパク質の１つは、
その作用ドメインとして、１または２以上の転写活性化ドメインを含んでいる。
他方の融合タンパク質は、その作用ドメインとして、１または２以上のDNA 結合
ドメインを含んでいる。選択されたリガンドは、両方の融合タンパク質に結合し
て、二量体または多量体の複合体を形成することができ、従って、この複合体は
少なくとも１つのDNA 結合ドメインと少なくとも１つの転写活性化ドメインとを
含んでいる。このような複合体の形成は、前記DNA 結合ドメインが結合すること
ができるDNA 配列に、このDNA 配列の転写制御下で連結された標的遺伝子の転写
の活性化を生じ、これは、標的遺伝子産物の存在または濃度を直接的または間接
的に監視することにより観察することができる。
【００６６】 好ましくは、DNA 結合ドメインと、これを含む融合タンパク質は、他のDNA 配
列、たいていは非常に多くの他のDNA 配列、の共存にもかかわらず、選択された
DNA 配列への結合が観察されうる (直接的または間接的に) ような十分な選択性
で、その認識されたDNA 配列に結合する。選択されたDNA 配列へのDNA 結合ドメ
インを含む融合タンパク質の結合は、in vitro結合試験によるか、または任意の
別のDNA 配列による場合と比べた、選択されたDNA 配列と連係する遺伝子の転写
の相対的な速度もしくはレベルの測定により求めた場合に、任意の別のDNA 配列
への結合より、好ましくは少なくとも２桁、より好ましくは少なくとも３桁、さ
らにより好ましくは４桁以上も大きくなる。
【００６７】 このような１セットの構築物を、任意の所望の補助構築物と一緒に含有するよ
うに遺伝子操作された細胞は、これが所望遺伝子の転写の調節、アポトーシスの
発動のようなシグナル伝達経路の発動または他の事象の調節をするなら、所望の
生物学的事象のリガンド媒介による調節された作動が関係する用途に使用するこ
とができる。例えば、標的遺伝子の調節可能な発現のために遺伝子操作された細
胞は、標的遺伝子によりコードされる所望タンパク質 (または他の遺伝子産物)
の調節された産生に使用することができる。このような細胞は、慣用手段により
培養により増殖させてもよい。この細胞を含む培地にリガンドを添加すると、細
胞による標的遺伝子の発現と、その遺伝子によりコードされるタンパク質の産生
とを生ずる。遺伝子の発現とタンパク質の産生は、培地にそれ以上のリガンドを
加えるのを止めるか、培地から残留リガンドを除去するか、または培地に多量体
化アンタゴニスト剤を添加することにより、停止させることができる。
【００６８】 本発明の遺伝子操作された細胞は、完全な生体、好ましくは動物、特にヒトを
、例えば細胞がこれを含む動物内で所望のタンパク質または他の結果を生ずるよ
うに改変するため、in vivo で作製および／または使用することもできる。この
ような使用は遺伝子治療用途を包含する。
【００６９】 アポトーシスの調節可能な作動を包含する態様は、FK506 で誘導可能な細胞死
に感受性のある遺伝子操作された細胞を提供する。このような遺伝子操作細胞は
、これをその意図した用途 (例、所望のタンパク質または他の産物の産生) に供
した後、これが望ましくない特性を持つか作り出す場合、またはこれがもはや有
用、安全または望ましいものではなくなった場合、細胞培養物または宿主生体か
ら消失させることができる。消失は、リガンドを培地に添加するか、または宿主
生体に投与することにより行われる。この場合、融合タンパク質の作用ドメイン
は、それらのシグナリング経路の成分の下流のFAS またはTNF-R1の細胞内ドメイ
ンのようなタンパク質ドメイン、またはオリゴマー化によりアポトーシスを発動
する他のタンパク質ドメインである。
【００７０】 換言すると、本発明は、前述した目的、例えば、標的遺伝子（典型的には治療
用タンパク質のための異種遺伝子）の転写の活性化、細胞の成長もしくは増殖、
細胞死、または他の何らかの選択された生物学的事象、の何れかを、これを必要
とし、本発明の遺伝子操作された細胞を含んでいる動物、好ましくはヒトの患者
において達成するための方法を提供する。その方法は、リガンドを含有する薬剤
組成物を、遺伝子操作された細胞の少なくとも一部において融合タンパク質の多
量体化を生じさせるのに有効な投与経路および量で、該動物に投与することを包
含する。多量体化は、標的遺伝子発現の出現；細胞の成長、増殖もしくは死滅；
または融合タンパク質の設計と細胞の遺伝子操作の他の目的、を検出することに
よって間接的に検出してもよい。
【００７１】 本発明はさらに、本発明の多量体化アンタゴニストを、薬剤に許容される担体
および場合により１種もしくは２種以上の薬剤に許容される賦形剤と混和してな
る、被験者における本発明の遺伝子操作された細胞内の融合タンパク質の多量体
化の程度を、全体的または部分的に、阻害ないし軽減し、こうして、例えば標的
遺伝子の転写を失活させ、または本発明の別の生物学的作用を停止させるための
薬剤組成物も包含する。即ち、多量体化リガンドと多量体化アンタゴニスト剤と
を用いて薬剤組成物を調製し、それらの薬理学的結果を得ることも本発明に包含
される。
【００７２】 本発明のリガンドに応答性である宿主生体、好ましくは動物、典型的にはヒト
以外の哺乳動物またはヒトを提供する方法も開示される。この方法は、本発明に
従って遺伝子操作された細胞、即ち、融合タンパク質をコードする１または２以
上の核酸構築物を含有する細胞など、を生体に導入することを包含する。遺伝子
操作された細胞は、宿主生体に導入する前に、多様な材料および方法のいずれか
を用いてカプセル化してもよい。或いは、例えば哺乳動物といった宿主生体への
本発明の核酸構築物の導入は、宿主哺乳動物の１または２以上の細胞中へのその
取り込みを可能にする条件下で、例えばウイルスベクター、注射もしくはカテー
テルによるDNA の導入等を用いて行うこともできる。
【００７３】 本発明のリガンドに応答性の細胞を作製するためのキットもまた提供される。
このようなキットの１つは、リガンドが媒介するオリゴマー化により所望の生物
学的応答を発動する融合タンパク質をコードし、その発現を指令することができ
る、１または２以上の核酸構築物を含んでいる。このキットはまた、キットの核
酸構築物によりコードされる融合タンパク質分子を多量体化することができる、
ある量のリガンドを含んでいてもよく、さらにある量の多量体化アンタゴニスト
を含んでいてもよい。このキットはさらに、二量体化された融合タンパク質によ
り認識されるコグネイト(cognate、同族) DNA 配列に連結した標的遺伝子 (また
はクローニング部位）をコードする核酸構築物を含んでいてもよい。それにより
、多量体化された融合タンパク質分子の存在下でそのコグネイトDNA 配列に連結
した遺伝子の転写が可能となる。核酸構築物には、トランスフェクタントの選択
の便宜のための１または２以上の選択マーカー、ならびに原核生物中での複製、
真核生物中での発現などに有用な他の慣用のベクターエレメントが付随していて
もよい。選択マーカーは、異なる核酸構築物ごとに同じでも、または異なってい
てもよく、このような各構築物を含む細胞の選択を可能にする。
【００７４】 細胞内にコグネイトDNA 配列と一緒に標的遺伝子を導入するための補助構築物
は、標的遺伝子の代わりにクローニング部位を含んでいてもよい。このような構
築物を含むキットは、遺伝子の調節可能な発現のための細胞の遺伝子操作を実施
者が行うことを可能にする。
【００７５】 本発明の別のキットは、融合タンパク質のための１もしくは２（またはそれ以
上）の核酸構築物を含んでいてもよく、その１または２以上が転写活性化剤また
はDNA 結合タンパク質の代わりにクローニング部位を含んでいて、使用者が望む
このようなドメインのどれもが挿入可能となる。このようなキットは任意に、上
述したような他のエレメント、例えば、予め選択したDNA 結合ドメイン用のコグ
ネイトのDNA 配列を伴うか、伴わない、標的遺伝子用の核酸構築物、を含んでい
てもよい。
【００７６】 キットのどれも、リガンドへの細胞の露出に応答してリポーター遺伝子（CAT
では、β−ガラクトシダーゼまたは任意の好都合に検出できる遺伝子産物) を発
現するように、本発明の構築物で安定に形質転換された陽性対照(positive cont
rol)の細胞をさらに含んでいてもよい。リポーター遺伝子の発現の検出および／
または定量のための試薬を用意してもよい。
【００７７】 本発明の実施に使用するのに適しているかもしれない、このようなシステムま
たはその成分の設計、作製および使用に関する、より詳しい情報および指針につ
いては、下記刊行物の参照が示唆される：Spencer et al, 1993, 前出; Rivera
et al, 1996, 前出; Spencer et al, 1996, Current Biology 6, 839-847; Lue
et al, 1996, Nature 383, 181-185; Ho et al, 1996, Nature 382, 822-826; B
elshaw et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4604-4607; Spencer et
al, 1996, TIG 12(5), 181-187; Spencer et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 92, 9805-9809; Holsinger et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92, 9810-9814; Pruschy et al, 1994, Chemistry & Biology 1(3), 163-172;
ならびに公開国際特許出願 WO 94/18317, WO 95/02684, WO 95/33052, WO 96/20
951 および WO 96/41865。
【００７８】 FKBPドメインおよび融合タンパク質 FKBP融合タンパク質は、FKBPドメインのペプチド配列の全部または一部を含む
少なくとも１つのFKBPドメインと、少なくとも１つの異種の作用ドメインとを含
む。この融合タンパク質はリガンドに結合できなければならず、その結合は、直
接結合測定 (例、蛍光消光) 、競合的結合測定 (例、対FK506)、FKBP酵素活性 (
ロタマーゼ) の阻害 、または他の検定方法により測定して、Kd値が約100 nM以
下、より好ましくは約10 nM 以下、より一層好ましくは約１nM以下となることが
好ましい。典型的には、この融合タンパク質は、例えば国際特許出願PCT/US94/0
1617に記載されているような、ヒトFKBP12といった、天然のFKBPタンパク質のも
のから選択したペプチド配列からなる１または２以上のタンパク質ドメインを含
んでいよう。そのペプチド配列は、通常は10個以下、好ましくは５個以下、場合
によっては１〜３個、往々にして１個のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失に
より、結合特異性を調整するように修飾されていてもよい。このような修飾は、
ある態様では、下記(a) または(b) の結合プロファイルの一方または両方を生ず
るように選択される：(a) 修飾されたFKBPドメインまたはこれを含む融合タンパ
ク質へのリガンドの結合が、FKBP12または遺伝子操作すべき宿主細胞に内在性の
FKBPへの結合に比べて、好ましくは少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも
２桁、より一層好ましくは３〜４桁またはそれ以上の大きさで良好である (いず
れかの測定法で) ；および(b) FKBP：リガンド複合体のCAB 融合タンパク質への
結合が、遺伝子操作すべき宿主細胞に内在性のカルシニューリンへの結合に比べ
て、好ましくは少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも２桁、より一層好ま
しくは少なくとも３桁の大きさで良好である (いずれかの測定法で) 。
【００７９】 FKBP融合タンパク質は、少なくとも１つの異種の作用ドメイン、即ち、非FKBP
ペプチド配列を含むタンパク質ドメイン、も含んでいる。この作用ドメインは、
例えば、本書のどこか、またはPCT/US94/01617もしくはその他の引用文献に記載
されているように、DNA 結合ドメイン、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン
、細胞局在化ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインなどでよい。一般的に言っ
て、作用ドメインは、別の作用ドメインとの会合または集合により (例えば、同
一もしくは異なる作用ドメインを含むタンパク質どうしの多量体化により) 、そ
の融合タンパク質を選択された特定の細胞位置に向かわせるか、または生物学的
作用を開始させることができる。
【００８０】 このような融合タンパク質をコードする組換え核酸は、元 (親) のFKBPタンパ
ク質、例えば、ヒトFKBP12をコードするDNA と選択的にハイブリダイズできるか
、または遺伝暗号の縮重がなければこのようにハイブリダイズできるものであろ
う。これらの融合タンパク質は、別のタンパク質、例えば、Gal4, ZFHD1, p65,
VP16, FAS, CD3ζ鎖等、に由来する作用ドメインを含んでいるので、この融合タ
ンパク質をコードする組換えDNA も、そうした他のタンパク質をコードするDNA
と選択的にハイブリダイズできるか、または遺伝暗号の縮重がなければこのよう
にハイブリダイズできるものであろう。
【００８１】 本発明のFKBP融合タンパク質、ならびに後で詳述するCAB 融合タンパク質は、
１または２以上の異なるリガンド結合ドメインの１または２以上のコピーと、１
または２以上の作用ドメインの１または２以上のコピーとを含んでいればよい。
リガンド結合ドメイン (即ち、FKBPまたはCAB ドメイン) は、作用ドメインのＮ
末端側、Ｃ末端側、または散在のいずれでもよい。複数コピーのリガンド結合ド
メインを含む態様では、そのコピー数は通常は２、３または４である。例えば、
FKBP融合タンパク質は、２、３または４個のFKBPドメインを含有しうる。FKBP融
合タンパク質 (および後述するCAB 融合タンパク質) の各種ドメインは、場合に
より、連結ペプチド領域 (これは隣接ドメインの１つに由来するものでもよく、
または異種でもよい) により離されていてもよい。
【００８２】 本発明の実施に使用できるFKBP融合タンパク質を例示すると、PCT/US94/01617
(Stanford & Harvard), PCT/US94/08008 (Stanford & Harvard), Spencer et a
l (前出), PCT/US95/10591 (ARIAD) およびPCT/US95/06722 (Miotix, Inc.) な
らびに本書に引用した他の文献に開示されたFKBP融合タンパク質；後述する実施
例に開示されたFKBP融合タンパク質；１もしくは２以上のFKBPドメインに10個ま
で (好ましくは１〜５個) のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換を含むが、リガ
ンドになお結合することができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異
物；天然のFKBPドメインをコードするDNA 配列と選択的にハイブリダイズできる
DNA 配列によりコードされるFKBPドメインの１もしくは２以上のコピーを含むが
、リガンドになお結合することができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれか
の変異物；１もしくは２以上の異種の作用ドメインが欠失しているか、または別
の異種の作用ドメインで置換もしくは追加されている前記のいずれかの変異物；
ヒト以外の供給源に由来するFKBPを含んでいて、FKBP/CABリガンドに結合するこ
とができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異物；ならびにヒトFKBP
12のTyr26, Phe36, Asp37, Arg42, Phe46, Phe48, Glu54, Val55, もしくはPhe9
9 に対応する１もしくは２以上のアミノ酸残基を含み、これらのアミノ酸残基の
１もしくは２以上が別のアミノ酸で置換されているが、リガンドに結合すること
ができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異物、が挙げられる。
【００８３】 例えば、多くの場合、FKBP融合タンパク質は、ヒトFKBP12のアミノ酸１〜107
を含むFKBPドメインの複数コピーを含んでおり、各コピー間は、制限エンドヌク
レアーゼ SpeI および XbaI でそれぞれ切断したDNA の連結産物、ACTAGA、でコ
ードされる2-アミノ酸のリンカー、Thr-Arg 、により離されている。次の表は前
記FKBP12配列に基づく突然変異FKBPドメインの代表的なサブセットを示す。
【００８４】
【表１】
【００８５】 注：表示は、元のアミノ酸を１文字記号と配列位置とで表記し、その後に突然
変異体の置換アミノ酸を示す。例えば、F36Vは、36位置のフェニルアラニンがバ
リンで置換されたヒトFKBP12配列を表示する。F36V/F99A は、36および99位置の
フェニルアラニンがそれぞれバリンおよびアラニンで置換された二重変異を意味
する。
【００８６】 シクロフィリンドメインおよび融合タンパク質 シクロフィリン融合タンパク質は、全部または一部のマウス・シクロフィリン
Ｃ配列 (例、残基36〜212; Freidman et al., Cell 664 (1991) 799-806)または
ヒト・シクロフィリンＣ配列 (Genbank 受託番号S71018; Schneider et al., Bi
ochemistry 33(27), 8218-8224 (1994))を含むことができる。これらの融合タン
パク質は異種の作用ドメインを含んでおり、FKBP融合タンパク質について上述し
たように、シクロスポリンのような、シクロフィリン/CABリガンドと、複合体を
形成する。シクロフィリンドメインは、やはりFKBPドメインについて上に詳述し
たように、通常は10個以下、好ましくは５個以下、場合によっては１〜３個、往
々にして１個のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失により、結合特異性を調整
するように修飾されていてもよい。一般に、本発明におけるFKBPドメインならび
にその融合タンパク質および使用に関するすべての説明が、シクロフィリンドメ
インにも同様にあてはまる。シクロフィリンドメインとキメラタンパク質におけ
るその使用については、米国特許5,830,462 、特に実施例4cに説明されており、
その全内容を参考としてここに援用する。
【００８７】 CAB ドメインおよび融合タンパク質 カルシニューリンホスファターゼに複合体化したFKBP-FK506の構造 (Griffith
et al., Cell, 82:507-522, 1995)が報告されている。カルシニューリンＡ (残
基12〜394)は、Gal4に融合させた３個のFKBPと、Gal4活性化ドメインのＣ末端に
融合させたマウスカルシニューリンＡの残基12〜394 とを用いた、酵母における
スリー(three) ハイブリッドシステムを利用した二量体化ドメインとして有効で
あることが示された (Ho, 1996 Nature 382:822-826)。FK506 の添加は、これら
の細胞におけるリポーター遺伝子の転写を活性化した。しかし、このシステムは
、内在性のカルシニューリンＢとこのカルシニューリンＡ融合タンパク質との間
で複合体を形成する必要があるため、最適なものではない。さらに、カルシニュ
ーリン融合タンパク質はカルシニューリンシグナリング経路を妨害する恐れがあ
る。
【００８８】 本発明は、CAB と名付けた「最小」カルシニューリンドメインを与える。CAB
は、生物学的過程を調節する目的でタンパク質の二量体化を制御するために、一
般的な方法で使用することができる、より小さく、より操作が容易なドメインで
ある。本発明のあるCAB ドメインは、FKBP/CABリガンドの存在下でFKBPと複合体
を形成できなければならない。別の態様では、CAB ドメインは、シクロフィリン
ドメインおよびシクロスポリンと三成分複合体を形成できる。即ち、二量体化ド
メインとしてのCAB の最も魅力的で可能性を秘めた特徴の１つは、２つの異なる
リガンドの制御下で２つの異なる相手とドッキングできるというその能力である
。このシステムでは、単一の二量体化ドメイン (即ち、CAB)が、２つの他のタン
パク質の相手と、添加する薬剤の種類に応じて同時にまたは競合的に、相互作用
することができる。同じことがFKBPについても当てはまり、FKBPは、この場合、
ラパマイシンもしくはラパログの存在下ではFRAP、FKBP/CABリガンドの存在下で
はCAB のいずれかに加入させることが可能である。
【００８９】 CAB は FK506：FKBP複合体とシクロスポリン：シクロフィリン複合体の両方を
結合するはずであるので、異種の作用ドメインへのCAB の融合体が、同じ細胞内
に、１つはFKBPを含み、１つはシクロフィリンを含む２つの他の融合タンパク質
として存在する細胞または動物を遺伝子操作することができる。この細胞へのFK
506 の添加はFKBP/FK506/CAB複合体の生成を生じ、一方、同じ細胞へのシクロス
ポリンの添加はシクロフィリン/シクロスポリン/CAB複合体の生成を生ずる。こ
の状況の１例を図６Ａに示す。
【００９０】 さらに、FKBPは、FK506 またはラパマイシンの両方とそれらの細胞標的との間
の相互作用を媒介することが要求されるので、異種の作用ドメインへのCAB の融
合体が、同じ細胞内に、FRB ドメインを含む融合タンパク質として存在する細胞
または動物を遺伝子操作することもできる。FRB ドメインはWO 95/33052 および
WO 96/41865 に詳述されている。この態様では、細胞へのFK506 の添加は、FKBP
/FK506/CAB複合体の生成を誘導するが、ラパマイシンの添加は、FKBP/ラパマイ
シン/FRB複合体の生成を生ずるはずである。これにより、細胞培養物中での複雑
な添加順序の実験または機能のために局在化もしくはタンパク質会合を必要とす
るシグナル伝達過程についてのより複雑な制御が可能となる。この状況の１例は
図６Ｂに示す。
【００９１】 本発明のCAB ドメインは、得られた複合(composite) リガンド結合ドメインが
FKBP-FK506複合体と接触するカルシニューリンホスファターゼの表面を含むよう
に、カルシニューリンＡの一部とカルシニューリンＢの一部とを含む、複合リガ
ンド結合ドメインである。切り捨てられたカルシニューリンの領域は、自己調節
ドメインとカルモジュリンドメインとを含んでおり、これらはFKBP結合には関与
しない。実施例に用いたカルシニューリンＡの部分は、全長のCAB ではヒトカル
シニューリンＡの残基12〜394 または残基12〜370 を含んでいるが、他の種に由
来するカルシニューリン遺伝子の等価（対応）領域も使用することができよう。
例えば、トランスジェニック動物の作製のためにマウスまたはラット遺伝子の配
列を使用したい場合もあろう。カルシニューリンＡ部分のＮまたはＣ末端を、所
望により短縮または伸長することもできよう。12〜394 CAB は活性ホスファター
ゼドメインを含んでいるのに対し、12〜370 CAB は、ホスファターゼ活性を破壊
するカルシニューリンＡのH151A 突然変異を有する。
【００９２】 実施例に記載されたCAB のカルシニューリンＢ部分は、ヒトカルシニューリン
Ｂの残基２または３から170 までを含んでいる。Ｎ末端のメチオニン (残基１)
またはメチオニンおよびグリシン (残基１および残基２) は、そのＮ末端でのカ
ルシニューリンＢのプロセシングもしくはミリストイル化を防止し、別の翻訳開
始部位を除くために、除去することができる。複合体ドメインのカルシニューリ
ンＢ部分も、所望により短縮してもよい。各種カルシニューリン遺伝子の文献参
照とGenbank 受託番号を下の表に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】 カルシニューリンＡの残基370 とカルシニューリンＢのＮ末端との間の距離は
、結晶構造から求めて、17.5Åである。従って、CAB ドメインを、カルシニュー
リンＡ部分がカルシニューリンＢ部分のＮ末端側にくるように構築すると、この
２つをつなぐのに小さなリンカーしか必要ない。実際、この構造はカルシニュー
リンＡが残基370 までしか硬直した構造を維持しないことを示すので、カルシニ
ューリンＡのＣ末端を直接カルシニューリンＢのＮ末端に連結し、それによりカ
ルシニューリンＡの残基 370〜394 をリンカー領域として利用できる。従って、
本発明の好適態様は、カルシニューリンＡの残基12〜394 をカルシニューリンＢ
の残基３〜170 のＮ末端側に融合させてなるCAB ドメインを含む。
【００９５】 CAB 融合タンパク質は、少なくとも１つのCAB ドメインと少なくとも１つの異
種の作用込め、即ち、非CAB ペプチド配列を含有するタンパク質ドメイン、とを
含んでいる。作用ドメインは、例えば、本書のどこか、またはPCT/US94/01617も
しくはその他の引用文献に記載されているように、DNA 結合ドメイン、転写活性
化ドメイン、転写抑制ドメイン、細胞局在化ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメ
インなどでよい。一般的に言って、作用ドメインは、別の作用ドメインとの会合
または集合により (例えば、同一もしくは異なる作用ドメインを含むタンパク質
どうしの多量体化により) 、融合タンパク質を選択された特定の細胞位置に向か
わせるか、または生物学的作用を開始させることができる。実施例に述べるよう
に、CAB-VP16融合タンパク質とCAB-GAL4融合タンパク質は両方とも、SEAPリポー
ター検定で機能性である。FKBP融合タンパク質の場合と同様に、CAB ドメインは
、カルシニューリンＡまたはカルシニューリンＢのいずれかまたはその部分とハ
イブリダイズできるはずであるか、または遺伝暗号の縮重がなければそうできる
であろう。
【００９６】 ミニCAB と名付けた短縮版のCAB ドメインは、カルシニューリンＡの残基 340
〜394 をカルシニューリンＢの残基３〜170 のＮ末端側に融合させたものからな
る。この構築物は、カルシニューリンのホスファターゼドメインが消失しており
、二量体化システムに使用するためのより小型のタンパク質となる。実施例８は
、ミニCAB がリポーター検定において全長CAB と同様に作用できることを示して
いる。FKBPについて上述したように、本発明のCAB 融合タンパク質は、このリガ
ンド結合ドメインの１または２以上のコピーと、１または２以上の作用ドメイン
の１または２以上のコピーとを含みうる。CAB ドメインは、作用ドメインのＮ末
端側、Ｃ末端側、もしくは散在のいずれでもよい。複数コピーのリガンド結合ド
メインを含む態様では、そのコピー数は通常は２、３または４である。例えば、
CAB 融合タンパク質は、２、３または４個のCAB ドメインを含有しうるが、現時
点では、調節された転写の好ましい態様は２個のCAB ドメインを含有する。
【００９７】 混合融合タンパク質 第３の種類の融合タンパク質は、１または２以上にFKBPドメインと、１または
２以上の異種の作用ドメインと、CAB 融合タンパク質について説明したような１
または２以上のCAB ドメインとを含んでいる。
【００９８】 混合融合タンパク質分子は、これが結合するFKBP/CABリガンドの存在下で、ホ
モ二量体またはホモ多量体タンパク質の複合体を形成することができる。混合融
合タンパク質を利用した態様は、そうしないとFKBP融合タンパク質とCAB 融合タ
ンパク質の両方の発現を指令するのに必要となる２種類の組換え核酸構築物の代
わりに、単一の組換え核酸構築物を細胞内に導入するだけですむ、という利点が
ある。
【００９９】 混合融合タンパク質をコードする組換えDNA は、FKBPタンパク質をコードする
DNA 、カルシニューリンＡまたはＢをコードするDNA 、ならびに１もしくは２以
上のエフェクタードメインの起源であるタンパク質 (例、Gal4, VP16, Fas, CD3
ζ鎖等) をコードする異種DNA 配列と選択的にハイブリダイズできるか、または
遺伝暗号の縮重がなければこのようにハイブリダイズできるものであろう。
【０１００】 異種ドメイン 上述したように、本発明の融合タンパク質の異種の作用ドメインは、これらを
有する融合タンパク質の相互の会合により、DNA 結合および／もしくは標的遺伝
子の転写といった事象の発動 (もしくは阻害) 、細胞の成長、分化、増殖もしく
はアポトーシスの作動、タンパク質の特定の細胞位置への指向、または他の生物
学的事象の作動、が可能であるタンパク質ドメインである。
【０１０１】 調節可能な遺伝子転写に関連する態様は、第１および第２の融合タンパク質の
異種ドメイン間の会合または多量体化に応答性のDNA エレメントによる転写制御
下で、標的遺伝子（これは対象のポリペプチド、アンチセンスRNA 、リボザイム
等をコードする）を含む標的遺伝子構築物を使用することを包含する。
【０１０２】 転写の直接的な活性化を行う本発明の態様では、第１と第２の融合タンパク質
の異種ドメインは、それぞれ、Gal4のようなDNA 結合ドメインまたはZFHD1 のよ
うな融合NA結合ドメインと、VP16またはp65 に由来するもののような転写活性化
ドメインとからなる。このような転写活性化ドメインを含む融合タンパク質が、
DNA 結合ドメインを含む融合タンパク質と多量体化すると、転写因子は、DNA 結
合ドメインが結合している発現制御配列を標的にするので、その発現制御配列に
連結した標的遺伝子の転写が活性化される。転写活性化ドメインを先にするか、
または転写活性化ドメインの代わりにリプレッサードメイン (PCT/US94/01617を
参照) を使用すると、標的遺伝子の転写を阻害するのに有用な類似の融合タンパ
ク質が得られる。複合DNA 結合ドメインおよびこれが結合するDNA 配列は、 Pom
erantz et al, 1995, 前出, に開示されており、その内容を参考のためにここに
援用する。このような複合DNA 結合ドメインも、本発明を実施する際にDNA 結合
ドメインとして、複合DBD が結合するコグネイトDNA 配列を含む標的遺伝子構築
物と一緒に使用しうる。
【０１０３】 転写の間接的な活性化を行う態様では、融合タンパク質の異種ドメインは、集
合または多量体化により、応答性プロモーターの制御下で転写の活性化を発動さ
せるシグナリングタンパク質の作用ドメインである。例えば、このシグナリング
ドメインは、Ｔ細胞受容体のζサブユニットの細胞内ドメインでよく、これは集
合すると、IL-2プロモーターまたはその誘導体 (例、反復NF-AT 結合部位) に連
結した遺伝子の転写を発動させる。あるいは、シグナリングドメインは、エリト
ロポエチン受容体のような細胞表面受容体であってもよく、これは多量体化によ
り細胞増殖を開始させることができる。
【０１０４】 本発明の別の側面では、異種ドメインは、相互に会合すると細胞の死を発動さ
せることができるタンパク質ドメインである。この種のドメインの例は、Fas 抗
原またはTNF R1の細胞内ドメインである。Fas ドメインを含む融合タンパク質は
PCT/US94/01617の開示と同様にして設計および調製することができる。
【０１０５】 遺伝子操作された受容体ドメイン 既述したように、FKBPおよびCAB ドメインは、天然のFKBPおよびCAB ドメイン
のペプチド配列から選択されたペプチド配列を含有しうる。天然の配列は、ヒト
FKBP12の配列およびヒト・カルシニューリンＡまたはカルシニューリンＢの一部
を包含する。或いは、このペプチド配列は、このような天然のペプチド配列から
誘導されるが、このようなペプチド配列の一方または両方に一般には10まで、好
ましくは１〜５の突然変異を含んでいるものでもよい。本書でより詳しく開示す
るように、かかる突然変異は、多くの重要な特徴を付与することができる。例え
ば、FKBPドメインを改変して、これが改善されたリガンドを優先的に結合する、
即ち、改変されていないFKBPドメインによるリガンド結合と比べて、少なくとも
１桁、好ましくは２桁、さらにより好ましくは３〜４桁まはそれ以上もより効果
的に結合することができるようにしてもよい。CAB ドメインも改変して、これが
ある (改変もしくは未改変) FKBP：リガンド複合体を優先的に結合、即ち、改変
されていないCAB ドメインと比べて、少なくとも１桁、好ましくは２桁、さらに
より好ましくは３桁もより効果的に、結合することができるようにしてもよい。
FKBPおよびCAB ドメインを改変して、これらが改善されたリガンドとの三成分複
合体を優先的に形成、即ち、改変されていないFKBPおよびCAB ドメインと比べて
、少なくとも１桁、好ましくは２桁、さらにより好ましくは３桁もより効果的に
形成することができるようにしてもよい。
【０１０６】 各種置換基 (「バンプ (こぶ) 」) を含んでいるFK506 の誘導体を結合する高
められた能力を付与するFKBP突然変異を同定する方法が、米国特許5,830,462 に
開示されている。この手法では、分子モデルを用いてリガンド置換基を収容する
と思われるFKBPドメイン中のアミノ酸置換基の候補を同定し、次いで位置指定突
然変異誘発を用いて、こうして同定されたタンパク質突然変異を遺伝子操作して
もよい。突然変異体を標準的な方法により発現させ、突然変異体が適当な活性／
親和性を保持している場合には、そのリガンドに対する結合親和性を、例えばロ
タマーゼ活性の阻害またはFK506 のような分子との結合に対する競合により測定
する。
【０１０７】 同様の手法を用いて、CAB ドメインのバンプ−穴のペアを同定することもでき
る。典型的なFKBP/CABリガンドは、C40-フェニル-FK506である。この化合物は、
一過性トランスフェクション実験においてNFAT-SEAP リポーターのPMA/イオノマ
イシン誘導活性化のその用量依存性抑制により測定して、FK506 より免疫抑制作
用が少なくとも30倍は小さいようである。
【０１０８】 特定の理論に拘束されるものではないが、C40-フェニル-FK506がNFAT-SEAP 活
性を阻害できないのは、FKBP12/C40-フェニル-FK506複合体が内在性カルシニュ
ーリンを結合することができないとして理解することができる。FK506 によるNF
AT-SEAP 活性の阻害は、FKBP12/FK506複合体のカルシニューリンへの結合を必要
とし、この結合がカルシニューリンホスファターゼ活性の低下を生ずることが知
られている (J. Liu, et al. Cell, 1991, 66:807-815; J. Liu et al., Bioche
mistry, 1992, 31:3896-3901) 。実際、FKBP12/FK506のカルシニューリンとのヘ
テロ二量体の結晶構造から、FK506 の末端C39-C40 オレフィンがカルシニューリ
ンＡとカルシニューリンＢとの間のタンパク質−タンパク質界面内に突出してい
ることが明らかである (J.P. Griffith et al., Cell, 1995, 82(3):507-522)。
この構造上へC40-フェニル-FK506のフェニル基のモデルをグラフティング(graft
ing)すると、その側鎖が結合を排除する立体障害の原因となっている可能性のあ
るカルシニューリンのいくつかの残基 (カルシニューリンＡからのW352, S353お
よびF356；カルシニューリンＢからのL116, M119およびV120) を同定することが
できる。問題の残基はいずれもCAB 最小結合ドメイン構造の一部である。従って
、これらの残基を不作為または合理的に突然変異させて、バンプつきFK506 を収
容する「穴のある」CAB を得ることができる。これらの突然変異を、FKBPについ
て上述したように、不作為または統制されたやりかたで挿入してもよい。
【０１０９】 単一または複数の突然変異体の遺伝子操作と試験の反復という手法に代わる別
の方法は、１または２以上のリガンドまたはFK506 置換基と接触しているか、そ
の近くにあるか、またはその可能性がある、構造が同定された残基を共ランダム
化(co-randomination)する手法である。同定された位置 (前節で述べたような)
でランダム化されたFKBPまたはCAB ドメインを含有するポリペプチドのコレクシ
ョンを、例えば慣用の合成方法または遺伝学的方法により準備する。このような
コレクションは、かかる位置の１または２以上で置換アミノ酸を含有する受容体
ドメインの１セットを表す。このコレクションをスクリーニングして、所望のリ
ガンド結合特性を有する変異物を選び出す。一般に、数個の残基を同時にランダ
ム化すると、これが側鎖間の有益な協同的相互作用の見込みを最大限にするため
、所定のバンプを持つリガンドに対してより高い親和性および特異性を持つ補償
性突然変異体(compensating mutant) を生ずることが予想される。不連続な位置
でランダム化されたライブラリーを調製する技法は公知であり、縮重オリゴヌク
レオチドを用いたプライマー指定(primer-directed) 突然変異誘発、縮重オリゴ
ヌクレオチドを用いたPCR 、および縮重オリゴヌクレオチドを用いたカセット突
然変異誘発等が挙げられる (例えば、Lowman, H.B. and Wells, J.A., Methods:
Comp. Methods Enzylmol. 1991, 3, 205-216; Dennis, M.S. and Lazarus, R.A
., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22129-22136; ならびにこれらの中の参考文献を
参照) 。
【０１１０】 多くの場合、FK506 の所定位置に直接接触しているか、その付近にある２〜３
個の残基だけのランダム化では、リガンド置換基 (バンプ) を最適に収容する可
能性のあるFKBPまたはCAB 配置形態の可能な変更例のすべてを探査することがで
きないかも知れないことを我々はさらに考えている。即ち、バンプを持つリガン
ドへの優先的結合を付与する微妙な突然変異またはその組合わせを同定するには
、構造上の考察に基づかないランダム置換基を持つ偏りのないライブラリーの構
築も考慮する。アラニン走査突然変異誘発(Cunningham and Wells (1989) Scien
ce 244, 1081-1085)、PCR 誤取込み(misincorporation)突然変異誘発 (Cadwell
and Joyce, 1992, PCR Meth. Applic. 2, 28-33 を参照) 、および「DNA シャフ
リング (DNA shuffling)」(Stemmer, 1994, Nature 370, 389-391 およびCramer
i et al, 1996, Nature Medicine 2, 100-103)を始めとするいくつかの適当な突
然変異誘発スキームがこれまでに報告されている。これらの方法は、ランダム突
然変異体のライブラリーまたは単一突然変異体(single mutants)のセットを作製
するので、これをその後にスクリーニングまたは選択手法によりサーチする。
【０１１１】 多くの場合、所定バンプの優先的結合に対する最良の突然変異体を同定するた
めの効果的な方策は、構造に基づく偏りのない手法の組合わせである。Clackson
and Wells, 1994, Trends Biotechnology 12, 173-184 (総説) を参照。例えば
、重要な接触残基を、縮重オリゴヌクレオチドを使ったPCR 法により、但しラン
ダム部位にさらに突然変異を導入するためエラー促進条件を用いて増幅を実施し
ながらランダム化するライブラリーの構築を我々は考えている。別の例は、DNA
シャフリングを用いた構造に基づく偏りのないランダムライブラリーからの成分
DNA 断片の組合わせである。
【０１１２】 所望の突然変異に対するライブラリーのスクリーニングは、酵母ツーハイブリ
ッドシステム (Fields and Song (1989) Nature 340, 245-246) の使用により行
うことができる。例えば、１つのベクターにCAB-VP16融合体を導入し、ランダム
化したFKBP配列のライブラリーを別のGAL4融合ベクターにクローニングする。酵
母の共形質転換体をリガンドで処理して、相補的FKBP突然突然変異体を保有する
ものを、使用したベクターに応じて、例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシ
フェラーゼ産生 (スクリーン) 、または必須栄養素を欠いたプレート上での生存
(選択) により同定する。バンプ付きFK506 にとってFKBP-CAB相互作用の架橋が
必要であることは、擬陽性(false positives) を消去する有用なスクリーンであ
る。
【０１１３】 FKBP (またはシクロフィリンもしくはCAB) 突然変異体のライブラリーから修
飾されたリガンド結合ドメインを単離するための別の方策は、Huらにより報告さ
れた機能性二量体形成の遺伝的選択 (Hu, J.C. et al, 1990, Science 250:1400
-1403;総説についてはHu J.C. 1995, Structure 3:431-433 を参照) を利用する
。この方策は、バクテリオファージλリプレッサー cI がホモ二量体としてDNA
に結合し、このようなホモ二量体のオペレーターDNA への結合がファージの生活
環の溶菌経路に関与するファージ遺伝子の転写を防止することを利用する。即ち
、機能性λリプレッサーを発現する細菌細胞は、ファージλを重感染させること
により溶菌に対して免疫性となる。リプレッサータンパク質は、アミノ末端DNA
結合ドメイン (アミノ酸１〜92) を、カルボキシ末端二量体化ドメインに40アミ
ノ酸可変性リンカーにより結合させたものからなる。単離されたＮ末端ドメイン
は、非効率的な二量体形成のために、低い親和性でしかDNA に結合しない。高親
和性のDNA 結合は、GCN4「ロイシンジッパー(leucine zipper)」のような異種二
量体化ドメインで回復させることができる。Huらは、大集団の配列からλリプレ
ッサー二量体形成を媒介することができるGCN4ロイシンジッパー突然変異体を単
離するための遺伝的選択としてファージ免疫を使用するシステムを報告している
(Hu et al, 1990) 。
【０１１４】 例えば、バンプ付きリガンドに相補的なFRAP突然変異体を同定するためにλリ
プレッサーシステムを使用するには、突然変異FRAP配列を有するλリプレッサー
-FRAP ライブラリーを、野生型λリプレッサー-FKBP タンパク質を発現するE. c
oli(大腸菌) 細胞中に形質転換する。高力価のλファージと「バンプ付き」FK50
6 化合物を含有する細菌プレート上での溶菌で生存するコロニーから、FRAP突然
変異体を発現するプラスミドを単離する。或いは、FKBP突然変異体を単離するた
めに、野生型λリプレッサー-FRAP タンパク質を発現するE. coli 細胞中に形質
転換された突然変異FKBP配列を有するλリプレッサー-FKBP ライブラリーを用い
て、上記手法を反復する。
【０１１５】 別の変更例は、ランダム化されたFKBP配列をファージ表示(display) のための
ベクター中にクローニングして、リガンドに最もよく結合する変異物のin vitro
選択を可能にすることである。in vitro親和性選択は、多くの方法で実施するこ
とができる。例えば、リガンドを親和性ハンドル (例えば、ヘキサヒスチジン・
タグまたはGST)で標識されたCAB の存在下で溶液状態のライブラリーファージプ
ールと混合し、生成した複合体を、相補的突然変異を有するFKBPを表示するファ
ージを富化するように、適当な親和性マトリックス上で捕捉する。ファージ表示
の手法は、既に文献に記載されており、他のin vitro選択システム (例えば、λ
ファージ上での表示、プラスミド上での表示、バキュロウイルス上での表示) も
考慮することができる。さらに、in vivo 安定性の向上といった本発明の用途に
有利な他の性質を改善するために、選択およびスクリーニングの方策を使用する
こともできる。総説についてはClackson, T. and Wells, J.A. 1994, Trends Bi
otechnol. 12, 173-184 を参照。
【０１１６】 また、本発明の受容体ドメインを最適化する場合、ポリペプチド配列の免疫原
性は、MHC タンパク質によるペプチドの結合と、内在性Ｔ細胞受容体による提示
ペプチドの異物としての認識を必要とすると考えられていることを理解すべきで
ある。少なくともヒトの遺伝子治療用途では、連結ペプチド配列を含む所定の外
来のペプチド配列を、これがヒト中で免疫学的に提示される確率を最小限にする
ように仕立てることが好ましいかも知れない。例えば、ヒトMHC クラスＩ分子に
結合するペプチドは、結合ペプチド中の重要な「アンカー」位置にある或る種の
残基に対して厳格な要件を持つ。例えば、HLA-A2は２位置にロイシン、メチオニ
ンもしくはイソロイシンを、Ｃ末端にロイシンもしくはバリンを必要とする (総
説については、Stern and Wiley (1994) Structure 2, 145-251 を参照) 。従っ
て、本発明の実施におけるタンパク質の遺伝子操作では、これらの残基のこの周
期性を、特にヒトの遺伝子治療用途では、避けることが好ましい。以上のことは
、受容体ドメイン中への点突然変異の遺伝子操作を制限なしに包含する本発明の
全てのタンパク質遺伝子操作の側面、ならびに各種のタンパク質ドメイン間の境
界の選択もしくは設計にも当てはまる。
【０１１７】 リガンド 遺伝子操作されたFKBPドメインと共に使用するための修飾FKBPリガンドは、WO
94/18317 および米国特許5,830,462 を含む科学文献および公開特許出願に多数
記載されている。C40-フェニル-FK506、C40-p-フェノキシフェニル-FK506、C40-
p-ビフェニル-FK506、C40-β-ナフチル-FK506、C40-m-フルオロフェニル-FK506
、C40-p-ヨードフェニル-FK506、および"C41"-トリメチルシリル-FK506を含む、
多数の修飾FKBP/CABリガンドが同定および合成されている。FKBP/CABリガンドの
合成は実施例９に記載されている。
【０１１８】 これらの化合物はいずれも、適当なスチレン誘導体を用いて作製されるが、例
外は"C41"-トリメチルシリル-FK506であり、これはアリルトリメチルシランを用
い、これを、オレフィン・メタテシス (複分解) 反応を促進させるためグラブス
(Grubbs)触媒を用いてFK506 の末端オレフィンに結合させる。図３に示すように
、実施例９に記載した方法を用いて、FK506 のＣ40位置に任意のスチレン誘導体
を付加することができる。かかる手段により、本発明の実施に使用できる、多様
なアリールおよびヘテロアリール置換C40 FK506 誘導体を調製してもよい。
【０１１９】 修飾 (変性) シクロスポリンＡ誘導体も調製され、米国特許5,830,462 、特に
実施例22、およびWO 98/08956 、特に実施例１に詳述されている。その全内容を
参考としてここに援用する。
【０１２０】 他の成分、設計の特徴および用途 本発明の融合タンパク質は、膜保持ドメインのような細胞局在化ドメインを異
種ドメインとして含んでいてもよい。例えば、PCT/US94/01617、特に26〜27頁を
参照。簡単に述べると、膜保持ドメインは、宿主細胞に内在性であるか否かにか
かわらず、任意の好都合な膜結合タンパク質から単離することができる。膜保持
ドメインは、多くの受容体を始めとする、膜貫通保持ドメイン、即ち、細胞表面
タンパク質の場合のように、膜を横断する長さのアミノ酸配列であってもよい。
膜貫通ペプチド配列はまた、細胞外および／または細胞内ドメインの一部または
全部に達する長さであってもよい。或いは、膜保持ドメインは、細胞表面膜の脂
質との会合を可能にするミリストイル化またはパルミトイル化部位のような脂質
膜保持ドメインであってもよい。脂質膜保持ドメインは、膜へのＮ末端結合に対
してはコーディング配列の5'末端に、またＣ末端結合に対しては3`末端付近に、
通常は付加されよう。脂質膜結合を与える翻訳後プロセシングを行うペプチドは
、Carr et al, PNAS USA (1988) 79, 6128; Aitken et al, FEBS Lett. (1982)
150, 314; Henderson et al, PNAS USA (1983) 80, 319; Schulz et al, Virolo
gy (1984) 123, 2131; Dellman et al, Nature (1985) 314, 374に記載され、An
n. Rev. of Biochem. (1988) 57, 69 に総括されている。興味あるアミノ酸配列
としては、配列 M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-Rが挙げられる。各種のDNA 配列を
用いて、本発明の各種融合タンパク質内のこのような配列をコードすることがで
きる。他の局在化ドメインとしては、-K-D-E-Lおよび-H-D-E-Lのような細胞小器
官 (オルガネラ) 標的ドメインおよび配列 (これは、これを有するタンパク質を
小胞体に標的化する) 、ならびに (直接的) 転写調節用に設計された融合タンパ
ク質に特に有用な核局在化配列が挙げられる。各種の細胞局在化配列およびシグ
ナルが当分野において周知である。
【０１２１】 別の融合タンパク質に、束化(bundling)ドメインを異種ドメインとして含むも
のがある。lac リプレッサー四量体化ドメインのようなこの種のドメインは、か
かるドメインを含有するタンパク質を構成的にオリゴマー化する。束化ドメイン
を用いて、所定のプロモーターに活性化ドメインまたはDNA 結合ドメインの追加
コピーを送り込んでもよい。
【０１２２】 CD3 ζ鎖のような細胞質シグナル開始ドメイン、とりわけVP16およびGAL4を始
めとする核転写因子ドメイン、Fas 細胞質ドメインを始めとするアポトーシスを
発動させることができるドメイン、その他を包含する、各種の作用ドメインを含
んでいる融合タンパク質をコードする構築物の設計、組立ておよび使用に関して
、本発明の実施に利用してもよいそれ以上の詳細は、PCT/US94/01617およびPCT/
US95/10591に開示されている。後者の国際出願はさらに、特に生物薬学の研究に
疾病モデルとして使用できる遺伝子操作された動物の作製に適用できる別の内容
も開示している。これらの内容は、融合タンパク質の発現のために構築物中の組
織特異的な調節要素を使用すること、および標的遺伝子としてのCre リコンビナ
ーゼへの発現に調節された転写を適用して、両末端にloxP配列がくる対象遺伝子
の消去を生ずること、を包含する。或いは、Cre およびlox の代わりに、flp お
よびそのコグネイト認識配列を使用してもよい。それらの内容を本発明に適用し
てもよい。
【０１２３】 さまざまな場合において、特に本発明に従って遺伝子操作された細胞を含んで
いる完全な動物を利用する態様において、融合タンパク質の各種ドメインを宿主
細胞と同じ種のタンパク質から誘導することが、往々にして好ましく、場合によ
っては必要となろう。例えば、ヒト細胞の遺伝子操作に対しては、異種ドメイン
(ならびにFKBPおよびCAB ドメイン) が、細菌、酵母または他のヒト以外の起源
に由来するものではなく、ヒト起源のものであることが好ましいことが多い。
【０１２４】 好都合な検出を可能にするため、エピトープ標識を本発明の融合タンパク質に
取り込んでもよいことにも我々は注目している。 組織特異的または細胞型特異的な発現 ある種の態様では、本発明の融合タンパク質を細胞特異的または組織特異的に
発現させることが好ましいであろう。このような発現の特異性は、この融合タン
パク質をコードする１または２以上のDNA 配列を、細胞型特異的な転写調節配列
(例、プロモーター／エンハンサー) に作動可能に連結することにより達成しう
る。数多くの細胞型特異的な転写調節配列が既知である。他のものも細胞型特異
的に発現される遺伝子から得ることができる。例えば、PCT/US95/10591、特に36
〜37頁を参照。
【０１２５】 例えば、本発明の融合タンパク質を発現する構築物は、選択された組織中での
特異的発現のために既知の遺伝子に由来する調節配列を含んでいてもよい。 代表例を次に表にまとめて示す。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
【表４】
【０１２８】 標的遺伝子 本書で用いた「標的遺伝子」の用語は、その転写が本発明の方法に従って刺激
される遺伝子を意味する。１好適態様では、遺伝子は細胞の染色体DNA に組込ま
れる。別の態様では、遺伝子はエピソームである。標的遺伝子を含む細胞を、本
書では「標的細胞」と称する。
【０１２９】 本発明の１好適態様では、標的遺伝子は内在性遺伝子ある。ここで用いた「内
在性遺伝子」の用語は、その自然の環境において細胞内に天然に存在する遺伝子
を意味し、即ち、遺伝子操作により細胞内に導入された遺伝子ではない。この内
在性遺伝子は、少なくとも１つの転写因子により認識されるプロモーターを有す
る任意の遺伝子でよい。１好適態様において、内在性遺伝子のプロモーターまた
は任意のその調節エレメント（それぞれ「内在性プロモーター」および「内在性
調節エレメント」) は、既知の好ましくはクローニングされたDNA 結合タンパク
質 (それが転写アクチベーターであろうと、リプレッサーであろうと) によって
認識される。或いは、標的プロモーターと相互作用するDNA 結合タンパク質が知
られていない場合には、標的プロモーターの少なくとも一部による発現ライブラ
リーのスクリーニングといった、当分野で周知の方法を用いて、過度の実験を行
わずに、かかる因子をクローニングすることも可能である。さらに、標的配列へ
のDNA 結合ドメインの結合親和性を、当分野で既知の方法に従って改善すること
ができる。この種の方法は、例えばDNA 結合ドメインに突然変異を導入し、DNA
結合親和性が増大した突然変異体についてスクリーニングすることを含む。
【０１３０】 本発明の別の態様では、標的遺伝子は内在性遺伝子であるが、これが外来性標
的配列を含んでいる。外来性標的配列は、内在性プロモーター中に挿入してもよ
く、または内在性プロモーターの少なくとも一部を置換していてもよい。好適態
様では、内在性標的プロモーターに導入された外来性プロモーターまたは調節エ
レメントは、標的配列に高い親和性および特異性で結合できるDNA 結合タンパク
質により認識される。１好適態様において、DNA 結合タンパク質はヒト起源であ
る。しかし、DNA 結合タンパク質は任意の他の種に由来するものでもよい。例え
ば、DNA 結合タンパク質は酵母GAL4タンパク質に由来するものでよい。
【０１３１】 さらに別の態様では、標的遺伝子は外来性遺伝子である。１好適態様において
、外来性遺伝子は細胞の染色体DNA に組込まれる。外来性遺伝子を染色体DNA に
挿入してもよく、または外来性遺伝子は内在性遺伝子の少なくとも一部を置換す
ることもできる。標的遺伝子は１コピーまたは複数コピーで存在させることがで
きる。本書に記載した実験結果からみて、標的遺伝子を２コピー以上存在させる
必要はない。しかし、標的遺伝子でコードされたタンパク質のより一層高いレベ
ルが望ましい場合には、複数コピーの遺伝子を使用してもよい。
【０１３２】 １態様において、標的遺伝子構築物は、標的遺伝子の転写を、本発明に従って
転写因子により調節することを可能にする。かかる標的遺伝子構築物は、典型的
には下記 (1)〜(5) からなる合成転写単位を含むDNA 分子からなる：(1) 転写ア
クチベーターを含む融合タンパク質または転写アクチベーターを加入させするタ
ンパク質のDNA 結合ドメインにより高親和性で認識されるDNA 配列の１コピーま
たは複数コピー、(2) 最小限、TATAボックスと開始配列とからなるが、場合によ
り他の転写因子結合部位を含んでいてもよい、プロモーター配列、(3) 適宜、翻
訳の開始および終止を促進させる配列を含む、所望遺伝子産物に対するコーディ
ング配列、(4) スプライスドナー、スプライスアクセプターおよび介在イントロ
ンDNA からなる任意配列、ならびに(5) 生成したRNA 転写物の切断およびポリア
デニル化を指令する配列。
【０１３３】 対象の (関心ある) 治療用タンパク質、アンチセンス配列、またはリボザイム
を包含する、多様な遺伝子を標的遺伝子として採用することができる。標的遺伝
子は、所望の表現型を与える、対象の任意の配列でよい。これは、表面膜タンパ
ク質、分泌タンパク質、もしくは細胞質タンパク質をコードするものでもよく、
あるいは異なる産物をコードする複数の標的遺伝子からなるものでもよい。標的
遺伝子は、転写調節タンパク質を阻害することにより特定の経路を調節 (抑制)
することができるか、または特定の経路のインヒビターの翻訳を阻害することに
より該経路を刺激することができるアンチセンス配列でもよい。標的遺伝子は、
関係する転写調節剤の発現または特定経路のインヒビターの発現を、RNA レベル
で妨害することにより、特定の経路を調節 (抑制) しうるリボザイムをコードす
るものでもよい。単独であるいは組み合わせて発現されるタンパク質は、ホーミ
ング、細胞傷害、増殖、免疫応答、炎症反応、凝血もしくは血栓溶解、ホルモン
調節等に関係することができる。タンパク質は、天然タンパク質、天然タンパク
質の突然変異物、ユニーク配列、またはそれらの組合わせでよい。
【０１３４】 各種の分泌産物としては、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、下垂
体放出因子、ACTH、メラノトロピン、リラキシン等のホルモン類；EGF 、IGF-1
、TGF-αもしくはβ、PDGF、G-CSF 、M-CSF 、GM-CSF、FGF 、エリトロポエチン
、トロンボポエチン、巨核球刺激・増殖因子等の増殖 (成長) 因子；IL-1からIL
-13 まで等のインターロイキン類；TNF-αおよびβ等；ならびに組織プラスミノ
ーゲン活性化因子、補体カスケードのメンバー、パーフォリン、スーパーオキシ
ドジムスターゼ、凝固因子、アンチトロンビン-III、VIIIc 因子、VIIIvW因子、
IX因子、α1-アンチトリプシン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、エンドルフィン
、ダイノルフィン、骨誘導因子等の酵素および他の因子が挙げられる。
【０１３５】 遺伝子は、天然の表面膜タンパク質または適当なシグナルペプチドおよび膜貫
通配列の導入でそのようにしたタンパク質をコードすることができる。各種のこ
のようなタンパク質としては、ホーミング受容体 [例、L-セレクチン (Mel-14)]
、血液関連タンパク質、特にクリングル構造を持つもの (例、VIIIc 因子、VIII
vW因子) 、造血細胞マーカー (例、CD3, CD4, CD8, Ｂ細胞受容体、TCR サブユ
ニットα, β, γもしくはδ, CD10, CD19, CD28, CD33, CD38, CD41等)、イン
ターロイキン受容体IL-2R, IL-4R等の受容体；イオン (例、Ca2+, K+, Na+, Cl- 等) の流入もしくは流出のためのチャンネルタンパク質；CFTR、チロシン活性
化モチーフ、Zap-70等が挙げられる。
【０１３６】 タンパク質は、エキソサイトーシスのために小胞体への輸送用に改変してもよ
い。タンパク質由来の配列のうち、その配列が一方または他方の末端の近くで改
変されている場合には小胞体に向かう配列を、またはタンパク質供給源と類似位
置に位置する配列を、付加することにより、改変されたタンパク質は小胞体中で
の詰め込みのためにゴルジ装置に向かうようになろう。このプロセスを、エキソ
サイトーシス用の融合タンパク質の存在と組合わせると、細胞外培地へのタンパ
ク質の迅速な移行と比較的高い局在化濃度が可能となる。
【０１３７】 また、宿主細胞の性質に応じて、例えば、代謝経路内のタンパク質、調節タン
パク質、ステロイド受容体、転写因子などの細胞内タンパク質を対象とすること
もできる。上に列挙したタンパク質の一部は細胞内タンパク質としても作用でき
る。
【０１３８】 さらに例示すると、Ｔ細胞では、Ｔ細胞受容体の１つまたは両方の鎖をコード
する遺伝子を導入することが望まれるかもしれない。Ｂ細胞については、分泌の
ための免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を供給することができよう。角質細胞、特に
角質幹細胞等の皮膚細胞については、α、βまたはγインターフェロン、抗走化
性因子、細菌細胞壁タンパク質に特異的なプロテアーゼなどを分泌することによ
って感染に対する防御を提供できよう。
【０１３９】 治療価値を有する遺伝子の発現を提供することに加えて、細胞を特定部位に指
向させることが望まれる種々の状況があるだろう。このような部位としては、解
剖学上の部位、例えば、リンパ節、粘膜組織、皮膚、滑膜、肺もしくはその他の
内部器官、または機能性部位、例えば血塊、損傷部位、外科手術の部位、炎症、
感染等が挙げられる。宿主標的部位で天然エピトープへの結合を与えることによ
り宿主細胞を特定部位に指向させる表面膜タンパク質の発現を与えることにより
、分泌産物の局在化濃度を達成することができる。興味あるタンパク質としては
、ホーミング受容体、例えば、L-セレクチン、GMP140、CLAM-1等、またはアドレ
ッシン(adressin)、例えばELAM-1、PNAd、LNAd等、血塊結合タンパク質または走
化性因子の局在化勾配に応答する細胞表面タンパク質が挙げられる。治療用産物
の放出が大きな価値を持つと予想される特定の部位に細胞を指向させることが望
まれる状況は非常に数多い。
【０１４０】 遺伝子治療に使用する場合、標的遺伝子は個体 (患者) に有益な任意に遺伝子
産物をコードすることができる。遺伝子産物は、分泌タンパク質、膜タンパク質
、または細胞質タンパク質でよい。好ましい分泌タンパク質としては、成長 (増
殖) 因子、分化因子、サイトカイン、インターロイキン、tPA 、およびエリトロ
ポエチンが挙げられる。好ましい膜タンパク質としては、受容体、例えば、成長
因子もしくはサイトカイン受容体、またはアポトーシス媒介タンパク質、例えば
、Fas 受容体が挙げられる。これ以外の治療用遺伝子の候補は、PCT/US93/01617
に開示されている。
【０１４１】 さらに別の態様において、ゲノムDNA との相同的組換えにより内在性遺伝子の
転写調節配列を変化させる「遺伝子活性化」構築物を用いて、本発明の遺伝子操
作したタンパク質の１つのDNA 結合活性に対する認識エレメントを導入すること
ができる。遺伝子活性化構築物の多様な異なるフォーマットが利用可能である。
例えば、Transkaryotic Therapies, Inc. のPCT 公開 WO 93/09222, WO 95/3156
0, WO 96/29411, WO 95/31560 およびWO 94/12650 を参照。
【０１４２】 DNA 構築物の設計および組立て 構築物は、ここで引用する特許文献および科学文献に開示された原理、代表例
ならびに材料および方法に従い、これをここに説明したように修正およびさらな
る具体化を行って設計すればよい。構築物の成分は、次のようにして常法により
調製できる。コーディング配列および調節領域を単離し、必要に応じ連結し、適
宜クローニング用宿主でクローニングし、制限酵素切断または配列決定、あるい
は他の好適な手段で解析すればよい。特に、 PCR法を用いて機能性単位の全部も
しくは一部を含む個々の断片を単離してもよく、その場合１または２以上の突然
変異を「プライマー修復」、連結、in vitro突然変異誘発等を適宜用いて導入し
てもよい。融合タンパク質をコードするDNA 構築物の場合、個々のドメインおよ
びサブドメインをコードするDNA 配列を、これが細胞または細胞溶解液において
全ての成分ドメインを有する単一のポリペプチドに翻訳されることができる融合
タンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを構成するように
結合させる。次いで、この融合タンパク質をコードするDNA 構築物を、適宜の細
胞種内でタンパク質の発現を指令するベクター中に入れてもよい。コードされた
融合タンパク質の生化学的解析のために、細菌中もしくは網状赤血球−溶解液系
においてタンパク質の発現を指令するプラスミドを作成するのが望ましいことも
ある。哺乳動物細胞におけるタンパク質の産生に用いるには、タンパク質をコー
ドする配列を、これらの細胞中で発現を指令する発現ベクター中に導入する。こ
のような用途に適した発現ベクターは当分野では周知である。多くの種類のこの
ようなベクターが市販されている。
【０１４３】 本発明の融合タンパク質および標的遺伝子をコードする構築物は、１または２
以上のDNA 分子または構築物として、多くの場合はこの構築物を含んでいる宿主
細胞の選択を可能にする１または２以上のマーカーと組合わせて、細胞に導入す
ることができる。完成し、適当な配列を有することが証明された構築物は、その
後、任意の好都合な手段により宿主細胞中に導入すればよい。構築物は、エピソ
ーム複製が可能なベクター (例、BPV もしくはEBV ベクター) または宿主細胞の
染色体に組込まれるように設計されたベクター中に導入することができる。構築
物を、非複製性の欠損ウイルスゲノム、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス(AAV) もしくは単純ヘルペスウイルス(HSV) 他 (レトロウイルスベクターを
含む) に、細胞への感染または形質導入のために組込んで、詰め込むこともでき
る。ウイルスによる送入(delivery)システムについては後でより詳しく説明する
。あるいは、構築物を、プロトプラスト (原形質体) 融合、エレクトロポレーシ
ョン (電気穿孔) 、バイオリスティックス(biolistics)、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、リポフェクション、DNA の微量注入等により導入してもよい
。宿主細胞は、場合によって、構築物の導入の前に培養して成長、増殖させてか
ら、構築物の導入および構築物の組込みのための適宜処理を行うこともある。そ
の後、細胞を増殖および／または構築物に存在するマーカーによりスクリーニン
グする。うまく使用しうる各種マーカーとしては、hprt、ネオマイシン耐性、チ
ミジンキナーゼ、ヒグロマイシン(hygromycin)耐性等、および Tac, CD8, CD3,
Thy1およびNGF 受容体などの各種細胞表面マーカーがある。
【０１４４】 場合によっては、相同的組換えのための標的部位を利用することがあり、その
場合には、構築物は特定遺伝子座に組込むことが望まれる。例えば、ある内在性
遺伝子 (同じ遺伝子座もしくは別の遺伝子座) を欠失させるか、および／または
本発明の組換え標的構築物で置換しうる。相同的組換えの場合、一般的にはΩま
たはO-ベクターのいずれかを使用すればよい。例えば、Thomas & Capecchi, Cel
l (1987) 51, 503-512; Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352;ならび
にJoyner, et al., Nature (1989) 338, 153-156を参照。
【０１４５】 構築物は、遺伝子の全部をコードする単一のDNA 分子として、または１もしく
は２以上の遺伝子を有する異なる２以上のDNA 分子として導入すれることができ
る。構築物は、それぞれ同一または異なるマーカーと共に、同時にまたは連続的
に導入することができる。
【０１４６】 細菌もしくは酵母の複製起点、選択可能および／もしくは増幅可能なマーカー
、真核もしくは原核細胞内での発現のためのプロモーター／エンハーサーエレメ
ント、ならびに哺乳動物の発現制御エレメント等といった、構築物DNA のストッ
クを調製してトランスフェクションを行うのに使用できる、有用なエレメントを
含むベクターが当分野で周知であり、多くのものが市販されている。
【０１４７】 核酸の送入、ex vivo およびin vivo 宿主細胞、特に真核細胞、さらに特に動物細胞、好ましくはヒトまたはヒト以
外の哺乳動物細胞に異種核酸を導入するための任意の手段を本発明の実施に適合
させることができる。この説明の目的にとって、ここに記載の各種核酸構築物を
全体として導入遺伝子という。DNA 送入のためのex vivo 手法としては、リン酸
カルシウム沈降、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびウイルス
ベクターを介した感染が挙げられる。２つの一般的なin vivo 遺伝子治療手法と
して、(a) 「裸の」、脂質複合体化もしくはリポソーム処方、または他の方法で
処方したDNA の送入、ならびに(b) ウイルスベクターを介した異種核酸の送入、
がある。前者の手法では、DNA の処方 (例、脂質による) の前に、所望のDNA 構
築物を有する導入遺伝子を含有するプラスミドをまず、実験により発現のために
最適化してもよい[ 例、5'非翻訳領域内のイントロンの挿入および不必要な配列
の除去 (Felgner et al., Ann NY Aca Sci 126-139, 1995)]。その後、例えば各
種の脂質やリポソーム材料によるDNA の処方を既知の方法および材料を用いて行
い、受容哺乳動物に送り込めばよい。
【０１４８】 各種のウイルスベクターを本発明の実施に使用することができるが、レトロウ
イルス、AAV 、およびアデノウイルスに基づく手法が特に興味あるものである。
例えば、Dubuensky et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533
; Kaneda et al., (1989) Science 243, 375-378; Hiebert et al. (1989) Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al, (1990) J. Biol. Ch
em. 265, 17285-17293およびFerry, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 88, 8377-8381 を参照。ウイルスベクターを使用する場合、本発明の組換え核
酸は、単一のウイルス内で送入してもよく、または２以上のウイルスに分けて送
入してもよい。例えば、融合タンパク質構築物を１つのウイルスにより送入し、
標的遺伝子は別のウイルス上とすることができよう。標的遺伝子ウイルスは、追
加の転写調節ドメイン構築物をさらに含んでいてもよい。以下の、ウイルス部位
の選択および使用に関するさらなる指針は、実務者に役立つかもしれない。
【０１４９】 ウイルスベクター： アデノウイルスベクター 本発明において有用なウイルスによる遺伝子送入系はアデノウイルス由来ベク
ターを利用する。36 kb の直鎖状二本鎖DNA ウイルスであるアデノウイルスの遺
伝的構成の知識により、アデノウイルスDNA の大きな片を、8 kbまでの外来配列
で置換することが可能である。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDN
A の宿主細胞への感染により、染色体への組込みが生じることはないのは、アデ
ノウイルスDNA がエピソーム的に複製しうるためであり、遺伝毒性の可能性はな
い。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、大量の増幅後にもゲノム再編
成は検出されていない。アデノウイルスは、実質的にすべての上皮細胞を、その
細胞周期の段階にかかわらず感染させうる。これまでところ、アデノウイルスは
、ヒトにおける急性呼吸系疾患のような軽い病気にのみ関連するようである。
【０１５０】 アデノウイルスは、その中程度の大きさのゲノム、扱いの容易さ、高力価、広
い標的細胞範囲および高い感染性のために、特に遺伝子導入ベクターとして用い
るのに適している。このウイルスゲノムの両末端はアデノウイルスゲノムの3'お
よび5'末端領域に 100〜200 塩基対(bp)の逆方向末端反復配列(ITR) を含み、そ
れらはウイルスDNA の複製およびパッケージング (詰め込み) に必要なシスエレ
メントである。例えば、Gingeras et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:13475-13
491 を参照。このゲノムの初期(E) および後期(L) 領域は、ウイルスDNA の複製
開始により分裂する異なる転写単位を含有する。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイ
ルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写調節を担うタンパク質をコードする。
E2領域(E2AおよびE2B)の発現は、ウイルスDNA 複製のためのタンパク質合成を生
じる。これらのタンパク質は、DNA 複製、後期遺伝子発現および宿主細胞の停止
(host cell shut off)に関与する (Renan (1990) Radiotherap. Oncol. 19:197)
。ウイルスキャプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プ
ロモーター(MLP) により生じる単一の一次転写物のかなりのプロセシングの後に
のみ発現する。MLP (16.8 m.u.に位置する) は感染の後期相において特に効率的
であり、このプロモーターから生じるmRNAはすべて、これらを翻訳のための好ま
しいmRNAとする5'三部分リーダー(TL)配列を有する。
【０１５１】 アデノウイルスのゲノムは、関心ある遺伝子産物をコードするが、正常な溶菌
ウイルス生活環においてはその複製能の点で不活性化されるように操作しうる (
例えば、Berkner er al., (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al., (1
991) Science 252:431-434; およびRosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155
を参照) 。アデノウイルスAd 5型 d1324株または他のアデノウイルス株 (例、Ad
2, Ad3, Ad7 等) 由来の適当なアデノウイルスが当業者に周知である。組換えア
デノウイルスは、分裂しない細胞に感染することができず、気管支上皮 (Rosenf
eld et al., (1992)、上記で引用) 、内皮細胞 (Lemarchand et al., (1992) PN
AS USA 89:6482-6486)、肝細胞 (Herz and Gerard, (1993) PNAS USA 90:2812-2
816)および筋肉細胞 (Quantin et al., (1992) PNAS USA 89:2581-2584) を含む
、広範な細胞種の感染に使用できる点で、状況によっては有利となりうる。
【０１５２】 アデノウイルスはまた、ワクチンの開発にも使用されてきた (Grunhaus and H
orwitz (1992) Seminar in Virology 3:237; Graham and Prevec (1992) Biotec
hnology 20:363) 。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与する際の実験には
、気管点滴注入 (Rosenfeld et al. (1991); Rosenfeld et al. (1992) Cell 68
:143) 、筋肉注射 (Ragot et al. (1993) Nature 361:647) 、末梢静脈注射 (He
rz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2812) および脳への
定位固定接種 (Le Gal La Salle et al. (1993) Science 254:988)がある。
【０１５３】 さらに、このウイルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮がしやすく、そし
て上記のように感染性スペクトルに影響するように改変することができる。さら
に、アデノウイルスは増殖および扱いが容易で、in vitroおよびin vivo で広い
宿主範囲を示す。この属のウイルスは、高力価、例えば 109〜1011プラーク形成
単位 (PFU)/mL で得ることができ、感染性が高い。アデノウイルスの生活環は宿
主ゲノムに組込まれることを必要としない。アデノウイルスにより送入された外
来遺伝子はエピソーム的であり、従って宿主細胞に対する遺伝毒性は低い。野生
型アデノウイルスを用いたワクチンの研究において副作用は報告されておらず (
Couch et al., 1963; Top et al., 1971) 、in vivo 遺伝子導入ベクターとして
の安全性と治療可能性を示している。さらに、外来DNA のためのアデノウイルス
ゲノムの保持能は、他の遺伝子送入ベクターに比べて大きい(8キロベースまで)
(Berkner et al.,前出；Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267)。
【０１５４】 本発明は、組換えアデノウイルス、 pAdΔ、を提供し、これは複製とビリオン
包膜 (encapsidation)に必要なアデノウイルスのシスエレメントを欠失しており
、標的遺伝子ならびに／または本発明の融合タンパク質をコードする１もしくは
２以上の遺伝子を含んでいる。 pAdΔによる増殖性ウイルス感染にはヘルパー・
アデノウイルスが必要であり、これが単独で、またはパッケージング細胞系と一
緒に、増殖性ウイルス感染に必要な十分な遺伝子配列を供給する。好ましいヘル
パーウイルスは、効率的なパッケージを指令する１または２以上の天然の遺伝子
配列が改変されており、それによりその複製のためのパッケージング機能もしく
は能力が「無能化」または不可能にされたヘルパーウイルスが作製される。この
ような組換えアデノウイルスは、Wilsonらにより公開PCT 出願No. PCT/US95/140
17 (公開No. WO 96/13597)にさらに説明されている。
【０１５５】 現在使用され、従って、本発明において好ましい複製欠損アデノウイルスのほ
とんどは、ウイルスE1およびE3遺伝子の全部または一部を欠失しているが、アデ
ノウイルス遺伝物質の約80％までは保持している (例えば、Jones et al., (197
9) Cell 16:683; Berkner et al., 前出; Graham et al., Methods in Molecula
r Biology, E.J. Murray, 編 (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7, pp. 109-1
27参照) 。従って、本発明の好ましいアデノウイルスは、E1およびE3遺伝子が欠
失または突然変異しており、E1遺伝子が本発明の融合タンパク質および／または
リポーター遺伝子をコードする遺伝子で置換されているアデノウイルスである。
E1/E3 欠失アデノウイルスは、8 kbまでの挿入が可能である。好ましいウイルス
主鎖 (backbone) はE1a, E1bおよびE3に欠失があるd1327 である。E1およびE3領
域遺伝子以外のアデノウイルス遺伝子内の欠失も、ウイルスゲノムのサイズをさ
らに小さくして、それによりより大きな対象の遺伝子の挿入を可能にするのに有
用となる場合がある。また、これらのウイルスの複製とウイルスタンパク質発現
はin vivo では低減または消失するので、感染した宿主のウイルスおよびウイル
スタンパク質への免疫応答も低減する。宿主免疫応答の低減により、挿入された
遺伝子の発現の持続性 (残存性) が高まる。このようなベクターは、Wilsonおよ
びEngelhardtにより公開PCT 出願No. PCT/US94/06338 (公開No. WO 94/28938)に
さらに説明されている。
【０１５６】 アデノウイルスが複製欠損性であるか、少なくとも条件的に欠損性であるとい
う要件の他は、アデノウイルスの性質は本発明を成功裏に実施するのに必須では
ないと考えられる。アデノウイルスは、42の異なる既知の血清型またはA-F の亜
群のいずれでもよい。亜群Ｃの５型アデノウイルスは、本発明の方法に用いる条
件的複製欠損アデノウイルスを得るために好ましい出発材料である。これは、ア
デノウイルス５型は多くの生化学的および遺伝学的情報が知られているヒトアデ
ノウイルスであり、アデノウイルスを採用するほとんどの構築物について、これ
が歴史的に用いられてきたからである。上述のように、本発明に係る典型的ウイ
ルスは複製欠損性であり、アデノウイルスE1領域をもたないであろう。従って、
対象の核酸を、E1コーディング配列が除去された位置に導入するのが最も好都合
であろう。しかし、対象の核酸の、アデノウイルス配列内のある領域における挿
入位置は、本発明にとって重要でない。例えば、対象の核酸はまた、Karlsson等
(1986) により既報のE3置換ウイルス中の欠失E3領域の代わりに、あるいはヘル
パー細胞系もしくはヘルパーウイルスがE4欠失を補完するE4領域に挿入してもよ
い。
【０１５７】 各種のアデノウイルスが、遺伝子をヒトを含む哺乳動物に導入するのに有用で
あることが示されてきた。複製欠損アデノウイルスは、肺上皮におけるマーカー
タンパク質およびCFTRを発現するのに用いられた。分裂中の細胞に効率的に感染
するその能力、その肺への指向性および高力価のストックの製造が比較的容易で
あることから、アデノウイルスはこの数年多くの研究の対象であったし、各種の
ベクターがヒト患者の肺に遺伝子を送入するのに用いられてきた (Zabner et al
., Cell 75:207-216, 1993; Crystal, et al., Nat Genet. 8:42-51, 1994; Bou
cher, et al., Hum Gene Ther 5:615-639, 1994)。第一世代のE1a 欠失アデノウ
イルスは、温度感受性E2a ウイルスタンパク質を含む第二世代を用いて改良され
てきて、ウイルスタンパク質の発現が少なく、それによりウイルス感染細胞が免
疫系の標的となることが少ないように設計されている (Goldman et al., Human
Gene Therapy 6:839-851, 1995) 。より最近では、ウイルスの全オープンリーデ
ィングフレームが欠失したウイルスベクターが報告された (Fisher er al., Vir
ology 217:11-22, 1996)。さらに、ウイルスのIL-10 の発現がアデノウイルス抗
原に対する免疫応答を阻害することも示された (Qin et al., Human Gene Thera
py 8:1365-1374, 1997) 。
【０１５８】 アデノウイルスはまた、細胞型特異的であってもよい、すなわち限られた種類
の細胞のみに感染し、および／または限られた種類の細胞においてのみ導入遺伝
子を発現する。例えば、米国特許第5,698,443 号 (Henderson and Schuur、1997
年12月16日発行) に記載のように、ウイルスは、標的宿主細胞によって特異的に
調節された転写開始領域の転写制御下に遺伝子を含有する。このように、複製コ
ンピテント(competent) アデノウイルスは、例えば細胞特異的応答エレメントを
挿入して、複製に必要なタンパク質 (例、E1A またはE1B)の合成を調節すること
により、ある種の細胞に限定することができる。
【０１５９】 肝細胞、膵臓および胆汁上皮細胞、内皮細胞を含む多様な細胞へのウイルスの
導入法が、下記公開PCT 出願に記載されている：WilsonらによるPCT/US96/03041
(WO 96/26286) (肝細胞); Mulligan とWilsonによるPCT/US91/09700 (WO 92/12
242) (肝細胞);およびWilsonとMulliganによるPCT/US89/00422 (WO 89/07136) (
肝細胞); J.M. WilsonによるPCT/US94/05187 (WO 94/26915) (膵臓細胞); Rafie
ldらによるPCT/US91/08127 (WO 92/07573)およびWilsonとMulliganによるPCT/US
88/04383 (WO 89/05345) (内皮細胞) 。
【０１６０】 多数のアデノウイルス型のDNA 配列がGenBank から入手可能である。例えば、
ヒトアデノウイルス５型はGenBank 受託番号No. M73260である。アデノウイルス
DNA 配列は現在同定されている42の型のヒトアデノウイルスの任意のものから得
ればよい。各種アデノウイルス株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン (ロックビル、メリーゴーランド州) から、または多数の商業的および学術
的機関から要請により入手できる。ここに記載の導入遺伝子は、任意のアデノウ
イルス中に、CFTRもしくはその他の遺伝子をベクターに挿入するのに用いるのと
同じ方法 (制限酵素切断、リンカー連結もしくは末端補充および連結) によって
任意の送入プロトコルにより導入すればよい。
【０１６１】 別の態様において、本発明は、組換え複製欠損ウイルスであるウイルス、例え
ば、アデノウイルス、を提供する。この組換えウイルスは、哺乳動物細胞に感染
することができる、該ウイルスのゲノムの少なくとも一部の、またはこれに対応
する、DNA を含み、また両側がトランスポゾンのシス作用末端反復配列で挟まれ
ている発現制御配列に作動可能に連結した、対象の遺伝子を含む、第１の発現配
列も含んでいる。この発現配列は両末端がウイルスのDNA に隣接する。この組換
えウイルスは、哺乳動物細胞に感染することができ、そして対象の遺伝子を発現
し、これをトランスポゼースの存在下にin vivo またはin vitroで該細胞のクロ
マチンに移行させることができる。このウイルスは、その発現制御配列に作動可
能に連結した適当なトランス作用トランスポゼースをコードする遺伝子をさらに
含むことができる。このような組換えウイルスは、哺乳動物細胞に感染すること
ができ、そしてトランスポゼースの存在下の場合に、選択された遺伝子を発現し
て、これをin vivo またはin vitroで感染細胞のクロマチンに移行させることが
できる。これらのウイルスは、Kelly とWilsonにより公開PCT 出願No. WO 97/15
679 にさらに説明されている。
【０１６２】 本発明のウイルスは、ウイルスに対する起こり得る免疫反応を低減させるよう
に宿主動物に投与することができる。これは、例えば、ウイルスと一緒に、ウイ
ルスでコードされる抗原および／またはウイルスタンパク質含有細胞の細胞溶解
Ｔ細胞消失に抗するよう指令された抗体応答の中和の出現を実質的に低減させる
、選択された免疫調節剤(modulator) を投与することにより達成することができ
る。この免疫調節剤は、ウイルスの投与と同時またはその前に投与することがで
きる。免疫調節剤は、例えば、サイトカイン、CD4+Ｔ細胞を低減もしくは阻害で
きる薬剤、抗Ｔ細胞抗体、Ｔ細胞上のCD40リガンドとＢ細胞上のCD40との相互作
用をブロックできる薬剤、Ｔ細胞上のCD28またはCTLA4 リガンドとＢ細胞上のB7
との相互作用をブロックできる薬剤、ならびにシクロホスファミドよりなる群か
ら選ぶことができる。この方法は、Wilsonらにより公開PCT 出願No. WO 96/2628
5 にさらに説明されている。
【０１６３】 好ましいヘルパー細胞系は293 (ATCC 受託No. CRL1573)である。「パッケージ
ング細胞系」とも呼ばれるこのヘルパー細胞系は、Frank Grahamにより開発され
(Graham et al. (1987) J. Gen. Virol. 36:59-72およびGraham (1977) J. Gen
eral Virology 68:937-940) 、E1A およびE1B をトランスで与える。しかし、ヘ
ルパー細胞系は、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胚性間充
識もしくは上皮細胞に由来するものでもよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒト
アデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来するものでもよい。この
ような細胞には、例えばベロ細胞またはその他のサル胚性間充織もしくは上皮細
胞がある。
【０１６４】 アデノウイルス産生細胞系は、アデノウイルス遺伝子E1、E2a およびE4 DNA配
列の１または２以上を含むことができる。１または２以上のこれらの遺伝子が変
異しているか欠失しているアデノウイルスのパッケージングについては、例えば
、Kadan 等のWO 96/18418; Kovesdi等のWO 95/346671; ImLer 等のWO 94/28152;
Perrocaudet等のWO 95/02697; Wang 等のWO 96/14061 に記載されている。
【０１６５】 AAV 本発明の融合遺伝子の送入に有用なまた別のウイルス系は、アデノ随伴ウイル
ス(AAV) である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖性生活環のた
めのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどの別のウ
イルスを必要とする天然の欠損ウイルスである (総説としてMuzyczka et al., C
urr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129) 。
【０１６６】 AAV はいずれの病気の原因とも関連しない。AAV はトランスフォーミングまた
は発癌性ウイルスではない。AAV のヒト細胞系染色体への組込みは、細胞の増殖
特性や形態的特徴に何ら著しい変化を生じさせない。これらの性質により、AAV
は潜在的に有用なヒト遺伝子治療用ベクターとして推奨される。
【０１６７】 AAV はまた、そのDNA を非分裂性細胞、例えば肺上皮細胞や筋肉細胞中に組込
んでもよい数少ないウイルスの１つであり、高頻度の安定な組込みを示す (例え
ば、Flotte et al., (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. 7:349-356; SamLuski
et al., (1989) L. Virol. 63:3822-3828;およびMcLaughlin et al., (1989) J.
Virol. 62:1963-1973参照) 。AAV のわずか 300塩基対ほどを含むベクターをパ
ッケージングし、組込むことができる。外来DNA のための空間は約4.5 kbに制限
される。Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 に記載のも
のなどのAAV ベクターが、DNA を細胞に導入するのに使用できる。多様な核酸が
AAV ベクターを用いて異なる細胞種に導入されてきた (例えば、Hermonat et al
., (1984) PNAS USA 81:6466-6470; Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Bio
l. 4:2072-2081; Wondisford et al. Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et
al., (1984) J. Virol. 51:611-619;およびFlotte et al., (1993) J. Biol. C
hem. 268:3781-3790参照) 。
【０１６８】 典型的に使用されるAAV に基づく発現ベクターは、導入遺伝子のサブクローニ
ングのために使用できる制限酵素部位の両端に隣接する 145ヌクレオチドのAAV
逆方向末端反復配列(ITR) を含んでおり、これは、利用しうる制限酵素部位を用
いて直接に、あるいは制限酵素で導入遺伝子を切り出した後、末端の平滑化、適
宜DNA リンカーの連結、制限酵素切断およびITR 間の部位への連結を経ることに
より上記目的に使用できる。「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または
「AAV ITR 」は、AAV ゲノムの3'および5'末端の末端反復配列を含むパリンドロ
ーム領域を意味する。AAV ITR 領域は、AAV プロウイルス (即ち、AAV ゲノム)
をAAV ウイルスキャプシド内にパッケージングするための配列を提供する。ITR
領域はまた、AAV 複製のための自己プライマーとして作用する二次構造を形成す
る。例えば、Samulski等 (J. Virol. 63:3822, 1989) が、AAV ITR の配列およ
び構造を報告している。AAV ITR 領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば
、AAV-2 の配列については、Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-80
1; Berns, K.I., "Parvoviridae and their Replication", Fundamental Virolo
gy, 第２版, (B.N. Fields and D.M. Knipe 編) を参照。本発明で用いる「AAV
ITR 」は、これに示されている野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例
えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により改変されていてもよい。また
、AAV ITRは、AAV-1 、AAV-2 、AAV-3 、AAV-4 、AAV-5 、AAVX7 等を制限を伴
わずに包含する、幾つかのAAV 血清型のいずれに由来するものでもよい。さらに
、意図した通りに機能する、即ち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから対象の配
列の切り出しと奪還を可能にし、かつrep 遺伝子が細胞内に存在する (同じか、
または異なるベクター上に) 時に受容細胞ゲノム中への異種配列の組込みを可能
にする限り、AAV ベクター内で特定のヌクレオチド配列の両末端に位置する5'お
よび3'のITR は、必ずしも同一である必要はなく、また同じAAV 血清型もしくは
単離物に由来する必要もない。
【０１６９】 AAV ベクターの収容能力は約4.4 kbである。各種AAV に基づくベクターと、多
様なプロモーター／エンハンサーとを用いて、次のようなタンパク質が発現され
てきた：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ、ファンコニ貧血遺伝子、嚢胞性繊維症膜貫通調節因子お
よび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (Kotin, R.M., Human Gene Therap
y 5:793-801, 1994,表１) 。本発明の各種DNA 構築物を導入する導入遺伝子は、
同様にAAV に基づくベクター中に含有させることができる。融合タンパク質、例
えば活性化ドメインまたはDNA 結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする
組換えDNA の発現を推進するための、CMV などの構成的プロモーターを含有させ
ることに代え、AAV プロモーターを使用できる (ITR 自身またはAAV p5 (Flotte
et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993)) 。
【０１７０】 かかるベクターを既報の方法によりAAV ビリオンにパッケージングすることが
できる。例えば、293 のようなヒト細胞系を、AAV に基づく発現ベクターと内生
AAV プロモーターまたは異種プロモーターの制御下にAAV rep およびcap(組換え
ウイルス構築物の複製およびパッケージングに必須である) をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む他のプラスミドとでコトランスフェクションする
ことができる。ヘルパーウイルスが存在しないと、rep タンパク質Rep68 および
Rep78 は複製型の蓄積を防止するが、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス
が重感染すると、これらのタンパク質は ITR (導入遺伝子を含む構築物において
のみ存在) からの複製およびウイルスキャプシドタンパク質の発現を可能にする
。このシステムは導入遺伝子DNA のAAV ビリオンへのパッケージングを生じさせ
る (Carter, B.J., Current Opinion in Biotechnology 3:533-539, 1992; Koti
n, R.M., Human Gene Therapy 5:793-801, 1994)。典型的には、トランスフェク
ション後３日目に組換えAAV をアデノウイルスと共に細胞から集め、次いで混入
アデノウイルスを熱処理によ不活性化する。
【０１７１】 AAV 力価の改善のための方法もまた、AAV ビリオンにおける導入遺伝子の発現
に用いることができる。かかる方策は次のようなものを含むが、これに限定され
ることはない：細胞系中での ITRを両端にもつ導入遺伝子の安定な発現の後、ウ
イルスパッケージングを指示する第二のプラスミドでのトランスフェクション；
AAV タンパク質を誘導的に発現する (例えば、温度感受性誘導性発現や薬理学的
誘導性発現など) 細胞系の使用。あるいは、細胞を、異種遺伝子の両端に5'ITR
、3'ITR を含む第一のAAV と、薬剤 (例、SV40T 抗原) により誘導することがで
き、AAV rep およびcap タンパク質をコードするDNA 配列を含有する、誘導性複
製起点 (例、SV40複製起点) を含む第二のAAV ベクターとに感染させることがで
きる。薬剤による誘導後、第二のAAV ベクターは高コピー数で複製してもよく、
それにより数の増加した感染性AAV 粒子を産生してもよい (例えば、Chiorini等
の米国特許第5,693,531 号、1997年12月２日発行、参照) 。多量の組換えAAV を
産生するためのさらに別の方法では、エプスタイン・バール核抗原 (EBNA) 遺伝
子、エプスタイン・バールウイルスの後期複製起点 (oriP) およびAAV ゲノムを
導入する融合プラスミドを用いる。これらのプラスミドは293 細胞などの細胞中
に複数コピーの染色体外エレメントとして維持される。野生型ヘルパー機能の付
加により、これらの細胞は大量の組換えAAV を産生するであろう (Lebkowski 等
の米国特許第5,691,176 号、1997年11月25日発行) 。別の系では、 rep遺伝子の
発現を可能にするAAV パッケージングプラスミドが提供され、ここでは通常 rep
発現を制御するp5プロモーターを異種プロモーターで置換する (Flotte等の米国
特許第5,658,776 号、1997年８月19日発行) 。さらに、Wilson等のWO 96/39530
に記載のように、細胞を、一本鎖形態を二本鎖形態に変換するのを容易にする薬
剤で処理することによりAAV 形質導入の効率を増加させてもよい。
【０１７２】 AAV ストックは、HermonatおよびMuzyczka (1984) PNAS 81:6466に記載のよう
にして製造し、Samulski et al., (1989) J. Virol. 63:3822 に記載されている
pAAV/Ad を用いて改変することができる。ウイルスの濃縮および精製は、AAV の
in vivo 発現の最初の報告 (Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1
993)で用いられたように塩化セシウム勾配におけるバンディング、またはO'Rior
dan et al., WO 97/08298 に記載のようなクロマトグラフィーによる精製などの
既報の方法で達成することができる。
【０１７３】 AAV ベクターのin vitroパッケージング方法も利用でき、粒子に詰め込まれる
DNA の大きさに制限がないという利点を有する (Zhou等の米国特許第5,688,676
号、1997年11月18日発行、参照) 。この操作は無細胞パッケージング抽出液の調
製も含む。
【０１７４】 導入遺伝子の取り込み方法と材料、この導入遺伝子を含む組換えAAV の増殖と
精製、ならびに細胞および哺乳動物のトランスフェクションにおけるその使用を
含む、本発明の実施に有用であるかもしれないAAV 技術に関するさらに詳細な指
針に関しては、例えば、Carter等の米国特許第4,797,368 号 (1989年１月10日);
Muzyczka等の米国特許第5,139,941 号 (1992年８月18日); Lebkowski 等の米
国特許第5,173,414 号 (1992年12月22日); Srivastava 等の米国特許第5,252,47
9 号 (1993年10月12日); Lebkowski等の米国特許第5,354,678 号 (1994年10月11
日); Shenk等の米国特許第5,436,146 号 (1995年７月25日); Chatterjee 等の米
国特許第5,454,935 号 (1995年12月12日); Carter 等のWO 93/24641 (1993 年12
月９日発行);およびNatsoulis 等の米国特許第5,622,856 号 (1997年４月22日)
参照。AAV および必要とされるアデノウイルスもしくはヘルペスヘルパー機能に
関するさらなる情報は以下の論文中に見られる: Berns およびBohensky (1987),
「アデノ随伴ウイルス：最新情報」 Advanced in Virus Research, Academic Pr
ess, 33:234-306 。AAV のゲノムは、Laughlin et al., (1983) 「細菌プラスミ
ドにおける感染性アデノ随伴ウイルスゲノムのクローニング」, Gene, 23:65-73
に記載されている。AAV の発現は、Beaton et al., (1989) 「アデノ随伴ウイル
スp5およびp19 プロモーターからの発現はrep タンパク質によりトランスに負に
調節される」 J. Virol., 63:4450-4454に記載されている。rAAVの作製は多数の
刊行物に記載されている： Tratschin et al. (1984)「哺乳動物細胞内の遺伝子
の高頻度組込み、発現および奪還のためのアデノ随伴ウイルスベクター」Mol. C
ell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) 「哺乳動物DNA クロ
ーニングベクターとしてのアデノ随伴ウイルスの使用: 哺乳動物組織培養細胞へ
のネオマイシン耐性の形質導入」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470;
McLaughlin et al. (1988)「アデノ随伴ウイルス一般的形質導入ベクター: プロ
ウイルス構造の解析」J. Virol., 62:1963-1973;およびSamulski et al. (1989)
「組換えアデノ随伴ウイルスの無ヘルパーストック: 普通の組込みはウイルス遺
伝子発現を必要としない」J. Virol., 63:3822-3828 。rAAVにより感染すること
ができる細胞系は、Lebkowski et al. (1988) 「アデノ随伴ウイルス: 多様な哺
乳動物細胞種へのDNA の効率的な導入および組込みのためのベクター系」Mol. C
ell. Biol., 8:3988-3996 に記載されているものである。組換えレトロウイルス
の製造に用いる「プロデューサー」または「パッケージング」細胞系は、Doughe
rty et al. (1989) J. Virol., 63:3209-3212;およびMarkowitz et al. (1988)
J. Virol., 62:1120-1124 に記載されている。
【０１７５】 雑種アデノウイルス-AAV 雑種アデノウイルス-AAVは、アデノウイルスの一部を含む核酸と、選択された
導入遺伝子の両末端にプロモーターの制御下に結合しているAAV 由来の5'および
3'ITR 配列とを含んでいる、アデノウイルスキャプシドにより表される。例えば
、Wilson et al.,国際特許出願公開 WO 96/13598号参照。この雑種ウイルスは、
宿主細胞への高力価の導入遺伝子の送入と、rep 遺伝子の存在下で宿主細胞染色
体に安定的に導入遺伝子を組込む能力とを特徴とする。このウイルスは、実質的
にすべての細胞種への感染 (そのアデノウイルス配列により付与) と宿主細胞ゲ
ノムへの安定的な長期の導入遺伝子組込み (そのAAV 配列により付与) とが可能
である。
【０１７６】 このベクターで用いられるアデノウイルス核酸配列は、雑種ウイルス粒子の産
生にヘルパーウイルスの使用が必要であるような最小の配列量から、欠失遺伝子
の産物をパッケージング細胞により雑種ウイルス法で送入できる、アデノウイル
ス遺伝子の単に選択された欠失までの範囲に及ぶ。例えば、雑種ウイルスは、ア
デノウイルスの5'および3'逆方向末端反復(ITR) 配列 (これは複製起点として機
能する) を有していてもよい。使用できるAd5 ゲノムの左末端配列(5')配列は、
通常のアデノウイルスゲノムのbp１から約360(マップ単位０〜１ともいう) に広
がり、5'ITR およびパッケージング／エンハンサードメインを含んでいる。雑種
ウイルスの3'アデノウイルス配列は、約580 ヌクレオチドである右末端3'ITR 配
列 (アデノウイルスのほぼbp35,353〜末端、マップ単位約98.4〜100 ともいう)
を含んでいる。
【０１７７】 雑種ベクターにおいて有用なAAV 配列は、rep およびcap ポリペプチドをコー
ドする配列が欠失しているウイルス配列であり、通常シス作用性5'および3'ITR
配列である。従って、AAV ITR 配列は、選択されたアデノウイルス配列が両末端
に存在し、AAV ITR 配列自体は選択された導入遺伝子の両端に存在する。雑種ベ
クターの調製は、「雑種アデノウイルス-AAVウイルスおよびその使用方法」と題
する公開PCT 出願 WO 96/13598 (Wilson等) にさらに詳しく述べられている。
【０１７８】 導入遺伝子の取り込み方法と材料、導入遺伝子を含む組換えウイルスの増殖と
精製、ならびに細胞もしくは哺乳動物のトランスフェクションにおけるその使用
を含む、本発明の実施に有用であるかもしれないアデノウイルスおよび雑種アデ
ノウイルス-AAV技術に関するさらに詳細な指針は、Wilson等のWO 94/28938 、WO
96/13597 およびWO 96/26285 およびそこで引用された参考文献を参照。
【０１７９】 レトロウイルス レトロウイルスは、逆転写の過程によって感染細胞中でそのRNA を二本鎖DNA
に変換する能力を特徴とする一本鎖RNA ウイルス群である (Coffin (1990) 「レ
トロウイルス科とその複製」Fields, Knipe 編, Virology所載, ニューヨーク：
Raven Press)。得られたDNA は、その後プロウイルスとして細胞の染色体に安定
に入り込み、ウイルスタンパク質の合成を指令する。この組込みは、受容細胞お
よびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生ずる。レトロウイルスゲノ
ムは３つの遺伝子、gag 、pol 、およびenv を含み、これらはそれぞれ、キャプ
シドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする。gag
遺伝子の上流に見出された配列はpsi と命名され、ゲノムのビリオンへのパッケ
ージングのためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復(LTR) 配列がウ
イルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよび
エンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組込みにも必要である (Coffin (
1990),前出) 。
【０１８０】 レトロウイルスベクターの構築には、対象の核酸を、ある種のウイルス配列の
代わりにウイルスゲノム中に挿入し、複製欠損のウイルスを作製する。ビリオン
の作製には、gag 、pol およびenv 遺伝子を含むが、LTR およびpsi 成分をもた
ない、パッケージング細胞系を作る (Mann et al., (1983) Cell 33:153)。ヒト
cDNAを含む組換えプラスミドを、レトロウイルスLTR およびpsi 配列と一緒に、
この細胞系に導入する (例えば、リン酸カルシウム沈降により) と、psi 配列に
より組換えプラスミドのRNA 転写物がウイルス粒子に詰め込まれることが可能と
なり、次いでこれが培地中に分泌される (Nicolas and Rubenstein (1988) 「レ
トロウイルスベクター」Rodriguez and Denhardt編 "ベクター: 分子クローニン
グベクターとその使用の概説" 所載、Stoneham: Butterworth; Temin, (1986)「
遺伝子導入用のレトロウイルスベクター: 外来性DNA への効率的な組込みとその
脊椎動物細胞ゲノム中での発現」Kuncherlapati 編 "遺伝子導入" 所載、New Yo
rk: Plenum Press; Mann et al., 1983 前出) 。次いで、組換えレトロウイルス
を含む培地を集め、場合により濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルス
ベクターは広範な細胞種に感染しうる。しかし、組込みと安定な発現には宿主細
胞の分裂を必要とする (Paskind et al., (1975) Virology 67:242) 。
【０１８１】 レトロウイルスの使用のための主な前提条件は、その使用の安全性、特に細胞
集団中に野生型ウイルスが広がる可能性に関する安全性を確保することである。
複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊な細胞系 (「パッケージング細胞」
と称する) の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が増し、
欠損レトロウイルスは遺伝子治療目的のための遺伝子導入に使用するのに十分な
程度に特性決定されている (総説として、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271参
照) 。このようにして、レトロウイルスコーディング配列の一部 (gag, pol, en
v)を本発明の融合タンパク質をコードする核酸で置き換え、レトロウイルスの複
製を欠損させた組換えレトロウイルスを作成することができる。次いで、複製欠
損レトロウイルスを、標準的方法によりヘルパーウイルスを用いて標的細胞に感
染させるのに使用できるビリオンに詰め込む。組換えレトロウイルスの作成なら
びにin vitroもしくはin vivo で細胞にこれらのウイルスを感染させるためのプ
ロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.
,(編) Greene Publishing Associates, (1989), 9.10-9.14 節およびその他の標
準的実験マニュアルに見出される。適当なレトロウイルスの例には、当業者に周
知のpLJ, pZ1P, pWEおよびpEM がある。好ましいレトロウイルスベクターはpSR
MSVtkNeo (Muller et al., (1991) Mol. Cell. Biol. 11:1785) および pSR MSV
(Xbal) (Sawyers et al., (1995) J. Exp. Med, 181:307)ならびにそれらの誘導
体である。例えば、これらの両ベクターにおけるユニークBamHI 部位は、ベクタ
ーをBamHI で切断し、クレノウ酵素で補充し、複製して、それぞれ pSMTN2 およ
び pSMTX2 を作成することによって除去できる (Clackson等のPCT/US 96/09948
に記載のように) 。同種指向性および両指向性レトロウイルスシステムの調製の
ための適当なパッケージングウイルス系の例としてはCrip, Cre, 2およびAmがあ
る。
【０１８２】 レトロウイルスは、多様な遺伝子を、多くの異なる細胞種、例えば、神経細胞
、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞にin vitroおよ
び／またはin vivo で導入するのに使用されてきた (例えば、Eglitis et al.,
(1985) Science 230:1395-1398, Danos and Mulligan, (1988) PNAS USA 85:646
0-6464; Wilson et al., (1988) PNAS USA 85:3014-3018; Armentano et al., (
1990) PNAS USA 87:6141-6145; Huber et al., (1991) PNAS USA 88:8039-8043;
Ferry et al., (1991) PNAS USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., (1991) Sc
ience 254:1802-1805; van Beusechem et al., (1992) PNAS USA 89:7640-7644;
Kay et al., (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., (1992) PNA
S USA 89:10892-10895; Hwu et al., (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国
特許第4,868,116;米国特許第4,980,286; PCT出願 WO 89/07136; PCT出願 WO 89/
02468; PCT出願 WO 89/05345; およびPCT出願 WO 92/07573を参照) 。
【０１８３】 さらに、レトロウイルス、従ってレトロウイルスに基づくベクターの感染スペ
クトルを、ウイルス粒子表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変する
ことにより制限できることが示されている (例、PCT 公開 WO 93/25234、WO 94/
06920 およびWO 94/11524 参照) 。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペ
クトルの改変の方策には次のものがある：細胞表面抗原に特異的な抗体をウイル
スenv タンパク質に結合させる (Roux et al., (1989) PNAS USA 86:9079-9083;
Julan et al., (1992) J. Gen Virol 73:3251-3255;およびGroud et al., (198
3) Virology 163:251-254)、または細胞表面リガンドをウイルスenv タンパク質
に結合させる (Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146) 。結合
は、タンパク質またはその他 (例、env タンパク質をアシアロ糖タンパク質に変
換するためにはラクトース) との化学的架橋の形態でよく、また融合タンパク質
(例、単鎖抗体／env 融合タンパク質) の形成によっても可能である。この方法
はある種の組織への感染を制限するかあるいは指令するのに有用であるが、同種
指向性ベクターを両指向性ベクターに変えるのにも用いることもできる。
【０１８４】 その他のウイルス系 遺伝子治療に応用可能なその他のウイルスベクター系が、ヘルペスウイルス、
例えば単純ヘルペスウイルス (Woo 等の米国特許第5,631,236 号、1997年５月20
日発行) 、ワクシニアウイルス (Ridgeway (1988) Ridgeway「哺乳動物発現ベク
ター」Rodriguez RL, Denhardt DT 編 "ベクター: 分子クローニングベクターと
その使用の概説" 所載、Stoneham: Butterworth; Baichwal and Sugden (1986)
「動物DNA ウイルス由来の遺伝子導入用ベクター: 導入された遺伝子の一過性お
よび安定な発現」Kuncherlapati R 編 "遺伝子導入" 所載、New York: Plenum P
ress; Coupar et al. (1988) Gene, 68:1-10) およびいくつかのRNA ウイルスか
ら誘導されてきた。好ましいウイルスとしては、アルファウイルス、ポックスウ
イルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が挙げられる
。特に、ヘルペスウイルスは中枢神経系および眼組織の細胞における組換え遺伝
子の保持のための独特の方策を提供しうる (Pepose et al., (1994) Invest Oph
thalmol Vis Sci 35:2662-2666) 。それらは各種哺乳動物細胞に対していくつか
の魅力的な特徴を提供する (Friedman (1989) Science, 244:1275-1281; Ridgew
ay, 1988, 前出; Bichwal and Sugden, 1986, 前出; Coupar et al., 1988; Hor
wich et. (1990) J. Virol., 64:642-650)。
【０１８５】 欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の知見により、異なるウイルス配列の構造−機能
の関連性において新たな視点が得られた。in vitroの研究により、このウイルス
はそのゲノムの80％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージング
能および逆転写能を保持しうることが示された (Horwich 等、1990、前出) 。こ
れは、このゲノムの広い部分を外来遺伝物質で置換できることを示唆した。肝臓
親和性および持続性 (組込み) は、特に肝臓指向の遺伝子導入に魅力的な性質で
ある。Chang 等は最近、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CA
T)遺伝子を、アヒルのＢ型肝炎ウイルスゲノムにポリメラーゼ表面コーディング
配列およびプレ表面コーディング配列の代わりに導入した。それは、野生型ウイ
ルスと共に鳥類の肝細胞系へコトランスフェクションされた。高力価の組換えウ
イルスを含む培地をアヒル雛の初代肝細胞に感染させるのに用いた。安定な CAT
遺伝子発現がトランスフェクション後の少なくとも24日間は検出された (Chang
et al., (1991) Hepatology, 14:124A) 。
【０１８６】 ウイルスベクターの投与 一般にウイルス粒子は、生体適合性の溶液もしくは製剤的に許容しうる送入用
ビヒクル、例えば滅菌 (生理) 食塩水またはその他の水性もしくは非水溶性の等
張性滅菌注射液もしくは懸濁液 (これらの数多くの例が当業者に周知であり、例
えばリンゲル液、リン酸緩衝化食塩水またはその他の同様のビヒクル) に移行さ
せる。組換えウイルスベクターの送入は、筋肉内注射、静脈内投与、皮下注射、
肝臓内投与、カテーテル法 (心臓カテーテル法を含む) 、頭蓋内注射、噴霧化／
吸入または気管支鏡法による点滴注入を含むいくつかの投与経路の任意のものに
より行うことができる。
【０１８７】 DNA もしくは組換えウイルスの投与量は、受容者の標的細胞 (これは筋肉細胞
、肝細胞、各種気管上皮細胞および平滑筋細胞、神経単位 (ニューロン) 、心筋
細胞等を含むが、これらに限定されない) 内で細胞にトランスフェクトして、標
的タンパク質の観察しうるリガンド応答性の分泌を、好ましくは過度の副作用の
ない治療効果を付与するレベルで、生ずるのに十分なレベルの導入遺伝子の発現
を与えるのに十分な量とすることが好ましい。
【０１８８】 DNA もしくはウイルスの最適投与量は、上述のような各種因子に依存し、従っ
て、患者によりある程度異なるかもしれない。また、ウイルスの治療有効用量は
、１mL当たり約１×107 〜約１×1010pfu のウイルス、例えば、１×108 〜１×
109 pfu のウイルスの濃度を含む約20〜約50 mL の (生理) 食塩水の範囲である
と考えられる。
【０１８９】 宿主細胞 本発明は特に、動物細胞の遺伝子操作およびこの操作された動物細胞の使用に
関連する用途において有用である。動物細胞は、中でも、昆虫、虫または哺乳動
物細胞でよい。例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミおよび非ヒト
霊長類の細胞をはじめとする各種の哺乳動物細胞が使用できるが、ヒト細胞が特
に重要である。多様な種の中で、多様な種類の細胞、例えば造血、神経、グリア
、間充織、皮膚、粘膜、ストロマ、筋肉 (平滑筋細胞を含む) 、脾臓、網膜内皮
、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺、繊維芽細胞およびその他の細胞種が使用
できる。特に重要なのは、造血細胞 (これは、赤血球、リンパ球もしくは骨髄単
球系統(myelomonocyte lineage) に関与しうる任意の有核細胞を包含しうる) 、
ならびに筋芽細胞および繊維芽細胞である。また、幹細胞および前駆細胞、例え
ば造血、神経、ストロマ、筋肉、肝臓、肺、胃腸および間充織幹細胞も重要であ
る。
【０１９０】 細胞は、自己の細胞、同系細胞、同種異系細胞でよく、ある場合には意図する
宿主生物に関して異種細胞であってもよい。細胞は、主要組織適合遺伝子複合体
("MHC") 特性を変化させることにより改変してもよい。これは、β2-ミクログロ
ブリンを不活性化して機能性クラスI MHC 分子の形成、クラスII分子の不活性化
を防止し、１または２以上の MHC分子の発現を与え、細胞傷害活性に関係する遺
伝子の発現を増加あるいは阻止することにより細胞傷害性を上昇または不活性化
する等により行える。
【０１９１】 場合によっては、特定抗原特異性もしくはホーミング標的部位特異性を有する
Ｔ細胞およびＢ細胞といった、細胞が特定の特異性を有している特定クローンま
たはオリゴクローン細胞に関心があるかもしれない。
【０１９２】 構築物の動物への導入 DNA 構築物によりex vivo 改変された細胞を、選択的条件下で培養し、所望の
構築物を持つとして選ばれた細胞を次いで増殖させ、さらに例えば宿主細胞内の
構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応および／または所望の遺伝
子産物の産生に対する検定を用いて、さらに解析する。改変された宿主細胞が同
定されたら、次いでこれを計画通りに用いて、例えば培養により増殖させるか、
または宿主生体中に導入する。
【０１９３】 細胞の性質に応じて、細胞の宿主生体 (例、哺乳動物) への導入は多様な方法
により実施しうる。造血細胞を注射により血管系内に投与してもよく、細胞数は
通常は少なくとも約104 個で、一般に約1010個以下である。使用する細胞数は、
多くの状況、導入の目的、細胞の寿命、使用すべきプロトコル、例えば、投与回
数、細胞の増殖能力、治療剤の安定性、治療剤の生理学的必要性等に依存しよう
。一般に、例えば筋芽細胞または繊維芽細胞については、細胞数は約104 個以上
、約109 個以下であり、分散液として、一般に対象位置またはその付近に注射さ
れて投与しうる。細胞は通常は生理学的に許容される媒体または培地中で用いら
れる。
【０１９４】 本発明に従って遺伝子操作された細胞はまた、治療用タンパク質の産生のため
に宿主生体または患者に移植する前に、例えば慣用の生体適合性の材料と方法を
用いて (マイクロ) カプセル化してもよい。例えば、Hguyen et al, 宿主内で高
い生存細胞密度を維持するための組織移植システム及び方法, 米国特許第5,314,
471 (Baxter International, Inc.); Uludag and Sefton, 1993, J Biomed. Mat
er. Res. 27(10): 1213-24 (Hep G2細胞／ヒドロキシエチルメタクリレート−メ
チルメタクリレート膜); Chang et al, Hum Gene Ther 4(4):433-40 (hGH発現マ
ウスLtk 細胞／免疫防御性perm選択性アルギン酸塩マイクロカプセル; Reddy et
al, 1993, J Infect Dis 168(4):1082-3(アルギン酸塩); Tai and Sun, 1993,
FASEB J 7(11):1061-9 (hGH 発現マウス繊維芽細胞／アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−
リジン−アルギン酸塩膜); Ao et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):334
9, 3350(アルギン酸塩); Rajotte et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):
3389 (アルギン酸塩); Lakey et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):3266
(アルギン酸塩); Korbutt et al, 1995, Transplantation Proc. 27(6):3212(
アルギン酸塩); Dorian et al,米国特許第5,429,821 号 (アルギン酸塩); Emeri
ch et al, 1993, Exp Neurol 122(1):37-47(ポリマーカプセル化PC12細胞); Sag
en et al, 1993, J Neurosci 13(6):2415-23 (ポリマー半透膜でカプセル化され
、ラット脊髄・くも膜下空間に移植されたウシクロム親和性細胞); Aebischer e
t al, 1994, Exp Neurol 126(2):151-8(サルに移植されたポリマーカプセル化ラ
ットPC12細胞; Aebischer, WO 92/19595も参照); Savelkoul et al, 1994, J Im
munol Methods 170(2):185-96(抗体を産生するカプセル化ハイブリドーマ；各種
サイトカインを発現するカプセル化トランスフェクション細胞系); Winn et al,
1994, PNAS USA 91(6):2324-8 (免疫分離高分子装置内にカプセル化され、ラッ
トに移植されたヒト神経成長因子を発現する遺伝子操作されたBHK 細胞); Emeri
ch et al, 1994, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 18(5):935-46 (
ラットに移植されたポリマーカプセル化PC12細胞); Kordower et al, 1994, PNA
S USA 91(23):10898-902 (サルに移植されたhNGFを発現するポリマーカプセル化
された遺伝子操作BHK 細胞);およびButler et al WO 95/04521 (カプセル化装置
) 参照。その後、動物宿主、好ましくは哺乳動物、より好ましくはその必要があ
るヒト患者に、細胞をカプセル化形態で導入することができる。好ましくは、カ
プセル化材料は半透性であり、カプセル化された細胞により産生される標的タン
パク質の宿主への放出を可能にする。多くの態様では、半透性カプセル化により
、カプセル化細胞はそれが導入された宿主生物から免疫学的に分離される。その
ような態様では、カプセル化される細胞は、宿主の種のタンパク質由来、および
／またはウイルスタンパク質または宿主の種以外の種からのタンパク質由来の成
分ドメインを含む１または２以上の融合タンパク質を発現してもよい。例えば、
このような場合に、融合タンパク質は、GAL4およびVP16に由来するエレメントを
含有しうる。この細胞は、受容物 (者) ではない１または２以上の (同種の) 個
体に由来するものでもよく、また受容生体または患者とは異なる種に由来するも
のでもよい。
【０１９５】 細胞のex vivo 改変の代わりに、多くの場合、細胞をin vivo 改変したいこと
がある。このために、標的組織および細胞のin vivo 改変用に各種手法が開発さ
れている。上述したように、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレト
ロウイルスといった多くのウイルスベクターが開発されており、これらは宿主へ
の該ウイルスのトランスフェクションと場合により組込みを可能にする。例えば
、Debenksky et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Kaned
a et al, (1989) Scienece 243, 375-378; Hiebert et al (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu et al (1990) J. Biol. Chem. 265,
17285-17293;およびFerry et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8377
-8381 を参照。ベクターは注射 (例、血管内または筋肉内) 、吸入または他の非
経口方式で投与しうる。リポソームとの複合体または注射、カテーテルもしくは
バイオリスティックスによるによるDNA の投与といった、非ウイルス型の送入も
使用できる。
【０１９６】 in vivo 遺伝的改変によれば、改変方法は、組織の性質、要求される細胞改変
の効率、その細胞を改変する機会の数、導入すべきDNA 組成物への組織の接近の
し易さ等に依存しよう。所望により、標的転写開始領域を有する弱毒化または改
変されたレトロウイルスを採用することにより、ウイルスが産生され、隣接細胞
をトランスフェクションすることができるように、本発明の転写因子構築物の一
つを用いてウイルスを活性化することができる。
【０１９７】 DNA 導入はすべての場合に組込みを生じる必要はない。状況によっては、導入
されたDNA の一時的な維持で十分である。このようにして短期間の効果を得るこ
とができ、その場合、細胞を宿主に導入してから、所定時間後、例えば細胞を特
定の部位に戻ることができるようになった後、ターンオン(turn on) することが
できる。
【０１９８】 結合特性、検定 (アッセイ) FK506 は、ヒトタンパク質のFKBP12に結合し、セリン／トレオニンホスファタ
ーゼのカルシニューリンと三成分複合体を形成することが知られている。FK506
類似物を、そのヒトFKBP12への結合能力および／またはヒトFKBPおよびCAB を含
有する融合タンパク質との三成分複合体の形成能力に関して、特性決定およびFK
506 との比較を行うことができる。例えば、WO 96/41865 (Clackson et al)を参
照。その出願は、ある化合物がヒトFKBP12に結合する能力、またはそれぞれヒト
FKBP12とヒトFRAPのFRB ドメインを含む２種類のタンパク質と三成分複合体を形
成する (即ち、ヘテロ二量体化する) 能力、を定量するのに使用できる各種材料
および方法を開示している。このような検定としては、結合を測定するための蛍
光偏光検定がある。また、ある化合物が上記三成分複合体を形成する能力を、遺
伝子操作された哺乳動物細胞がその化合物の存在下で産生するリポーター遺伝子
産物の観察されたレベルとの相関により間接的に測定する、細胞に基づく転写検
定も挙げられる。対応する細胞に基づく検定が、遺伝子操作された酵母細胞中で
も実施しうる。例えば、WO 95/33052 (Berlin et al)を参照。
【０１９９】 本発明のリガンドが、生理学的に許容され (即ち、これを適用する細胞または
生体に対する過度の毒性がなく) 、動物が経口摂取でき (即ち、遺伝子治療を含
めて、完全な動物体内の投与において経口で活性であり) 、および／または特定
の用途に対して必要となるように、細胞または他の膜を貫通できることが好まし
いことが多い。
【０２００】 また、好ましいリガンドは、自然または天然型イムノフィリンより、突然変異
イムノフィリン (制限しない例として、Phe36 が別のアミノ酸、好ましくはバリ
ンもしくはアラニンのように、より嵩の小さいＲ基を持つアミノ酸、で置換され
たヒトFKBP) に優先的に結合するものである。例えば、このような化合物は、任
意の科学的に有効で本分野で許容されている検定方法により求めて、ヒトFKBP12
に結合する場合より、少なくとも一桁良好に、突然変異FKBPに優先的に結合し、
場合によっては、ヒトFKBP12に結合するより二桁、さらには三桁またはそれ以上
良好な大きさで、優先的に突然変異FKBPに結合することがある。
【０２０１】 ヒトFKBP12、その変異物、または他のイムノフィリンタンパク質に関する本発
明の各種リガンドの結合親和性は、FKBPの場合に使用される既知の方法を適合し
て求めることができる。例えば、実施者は、既知リガンドの興味あるタンパク質
への結合と競合する本発明の化合物の能力を測定してもよい。例えば、Sierkier
ka et al, 1989, Nature 34l, 755-757 (試験化合物が標識FK506 誘導体のFKBP
への結合と競合) を参照。
【０２０２】 本発明の好ましいリガンドの１セットは、ヒトFKBP12に、上述したようにその
変異物に、またはこの種のFKBPドメインを含有する融合タンパク質に結合し、そ
の結合のKd値は、直接結合測定 (例、蛍光消光) 、競合的結合測定 (例、対FK50
6)、FKBP酵素活性 (ロタマーゼ) の阻害、または他の検定方法により測定して、
約200 nM以下、より好ましくは約50 nM 以下、より一層好ましくは約10 nM 以下
、さらに一層好ましくは１nM以下である。このような化合物の１つのサブセット
では、FKBPドメインは、36位置のフェニルアラニンがより嵩の小さい側鎖を持つ
アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、メチオニンまたはセリンで置換されたも
のである。
【０２０３】 競合的結合FP検定は、下記の実施例に詳述されている。この検定では、ある化
合物が、例えば、FK506 といった、標識したFKBPリガンドと競合状態でFKBPタン
パク質に結合するその能力を反映した、その化合物のIC50値のin vitro測定が可
能である。
【０２０４】 本発明の１つの好ましい種類の化合物は、競合的結合FP検定におけるIC50値が
、フルオレセイン化FK506 標準で、ある所定のFKBPドメインおよびリガンド対、
例えば、ヒトFKBP12または10まで、好ましくは５までのアミノ酸置換によるその
変異物に対して、1000 nM より良好、好ましくは300 nMより良好、より好ましく
は100 nMより良好、そしてさらに一層好ましくは10 nM より良好であるリガンド
である。この種の１サブセットにおいて、FKBPドメインは36位置での上述した修
飾を持つものである。
【０２０５】 リガンドが融合タンパク質を多量体化する能力は、このような多量体化により
発動される事象の出現を測定することにより、細胞に基づく検定で測定すること
ができる。例えば、１または２以上のFKBPドメインと１または２以上の作用ドメ
インとを含有する第１の融合タンパク質をコードするDNA 、ならびに１つのCAB
ドメインと、多量体化すると生物学応答を作動させることができる１または２以
上の作用ドメインとを含有する第２の融合タンパク質をコードするDNA を含有し
ていて、これらを発現することができる細胞を使用することができる。使用する
細胞は、２つの融合タンパク質の多量体化に応答する調節エレメント (即ち、プ
ロモーター) の転写制御下であるリポーター遺伝子をさらに含有することが好ま
しい。このように遺伝子操作した細胞における代表的な成分の設計と作製および
その使用については、WO 96/41865 および本書のこの部分と上記部分に挙げた他
の国際特許出願に記載されている。細胞は培養により増殖または維持される。培
地にリガンドを添加し、適当なインキュベーション時間 (遺伝子発現および分泌
を生じさせるため、例えば、数時間または一晩) の後、リポーター遺伝子産物の
存在を測定する。正の結果、即ち、多量体化は、リポーター遺伝子産物の出現に
より観察されるように、リポーター遺伝子の転写と相関する。リポーター遺伝子
産物は、都合よく検出できるタンパク質 (例、ELISA により) でもよく、または
都合よく検出できる産物 (例、着色) の産生を触媒してもよい。このような検定
を実施するための適当な細胞系の作製材料および方法は、本セクションで上に引
用した国際特許出願に開示されている。典型的に使用される標的遺伝子には、例
示として、SEAP、hGH 、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質および
ルシフェラーゼがあり、そのための便利な検定 (キット) が市販されている。
【０２０６】 本発明の別の好ましい種類の化合物は、FKBPドメインを含有する融合タンパク
質に基づくツーハイブリッド転写検定において検出可能なシグナルを誘導するこ
とができるものである。好ましくは、FKBPドメインは、野生型ヒトFKBP12以外の
FKBPドメインである。
【０２０７】 FKBPに基づく転写検定に似た、融合タンパク質を多量体化させるリガンドの能
力を測定する別の検定は、このような多量体化により発動される事象の出現を測
定する細胞に基づく検定である。この場合、検出可能な産物を構成的に発現する
細胞を使用する。この細胞は、１または２以上のイムノフィリン由来リガンド結
合ドメインと、多量体化すると細胞死を発動させることができる１または２以上
の作用ドメイン (例えば、FAS の細胞内ドメイン) とを含有する融合タンパク質
をコードするDNA も含有していて、これを発現することができる。このように遺
伝子操作した細胞における代表的な成分の設計と作製およびその使用については
、WO 95/02684 に記載されている。WO 96/41865 も参照。細胞は培地中で維持ま
たは培養され、細胞の増殖または継続した生存を可能にする。細胞または培地を
構成的細胞産物の存在について検定し、こうしてリポーターの基底レベルを確定
する。hGH または他の任意の都合よく検出できる産物の構成的産生のために遺伝
子操作した細胞を、リポーターとして供するために使用することができる。試験
する化合物を培地に添加し、細胞をインキュベーションし、細胞溶解液または培
地を、１または２以上の時点でリポーターの存在について試験する。リポーター
産生の低減は細胞死の表示であり、融合タンパク質の多量体化の間接的な尺度と
なる。
【０２０８】 本発明の別の好ましい種類の化合物は、このようなFKBP/CABに基づくアポトー
シス検定において、検出可能なシグナルを誘導することができるものである。好
ましくは、FKBPドメインは、野生型ヒトFKBP12以外のFKBPドメインである。場合
によっては、FKBPドメインは上述したように修飾されていてもよい。また、CAB
ドメインも野生型CAB 以外のCAB ドメインであることが好ましい。
【０２０９】 このような検定の実施により、実施者は、所望のIC50値を持つか、および／ま
たは野生型ヒトFKBP12より変異FKBPに対する結合優先性を持つリガンドを選択す
ることが可能となる。競合的結合FP検定により、所望のIC50値を持つか、および
／またはFK506 のような対照に比べた、変異FKBPもしくは野生型FKBPに対する結
合優先性を持つモノマーまたはリガンドを選択することが可能となる。
【０２１０】 用途 本発明のリガンドおよびリガンド結合ドメインは、WO 94/18317, WO 95/02684
, WO 96/20951, WO 95/41865に記載されたようにして、遺伝子治療を含めて、培
養中または完全生体中の遺伝子操作された細胞において、例えば、所望遺伝子の
転写を調節可能に活性化するため、標的遺伝子を除去するため、アポトーシスを
作動させるため、または他の生物学的事象を発動させるために使用することがで
きる。下記は本発明の用途の非制限的な例である。
【０２１１】 １. 調節された遺伝子治療：多くの場合、治療用遺伝子のオン、オフの切替え
が随意に可能であること、または発現の強さを正確に定量できること、が治療効
力に重要である。本発明は特にヒトの遺伝子治療の分野で治療用標的遺伝子の調
節された発現を得るのによく適している。その１例は、本発明の一対の融合タン
パク質 (一方は少なくとも１つのCAB ドメインを含み、他方は少なくとも１つの
FKBPドメインを含む) と、この融合タンパク質を二量体化することができるリガ
ンドと、発現させる標的遺伝子構築物とを使用する。融合タンパク質の一方は、
DNA 結合ドメイン、好ましくはPomerantz et al, 前出, に説明したような複合D
NA 結合ドメインを、異種の作用ドメインとして含有する。第２の融合タンパク
質は、転写活性化ドメインを異種の作用ドメインとして含有する。本発明の改善
されたリガンドは、両方の融合タンパク質に結合することができ、こうしてこれ
ら２つの融合タンパク質を効果的に架橋することができる。これらの融合タンパ
ク質をコードし、その発現を指令することができるDNA 分子を、遺伝子操作する
細胞内に導入する。やはりこの細胞内に導入されるのは、DNA 結合ドメインが結
合することができるDNA 配列に連結した標的遺伝子である。遺伝子操作した細胞
またはその子孫を改善されたリガンドと接触させると (動物または患者へのその
投与により) 、転写因子複合体の組立て、従って標的遺伝子の発現を生ずる。同
様な成分の設計および使用は、PCT/US93/01617およびWO 96/41865 (Clackson 等
) に開示されている。実施において、標的遺伝子発現のレベルは、融合転写因子
複合体の数または濃度に依存して変化し、この数または濃度は改善されたリガン
ドの濃度に依存することになる。典型的には、用量 (改善されたリガンドの) に
応答する遺伝子発現が観察される。
【０２１２】 改善されたリガンドは、標的遺伝子の転写を活性化するため、所望に応じて患
者に投与してもよい。改善リガンドの結合親和性に応じて、望まれる応答、投与
方法、リガンドおよび／もしくは標的遺伝子mRNAの生物学的半減期、遺伝子操作
された細胞の存在数、各種プロトコルを選択しうる。改善リガンドは非経口また
は経口を含む各種経路で投与しうる。投与回数は、上述した因子に応じて変動し
よう。改善リガンドの投与は、錠剤、散剤、もしくは分散液として経口；バッカ
ル；舌下；静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下注射；吸入等の経路でよい。改善リガ
ンド (およびアンタゴニストである単量体化合物) は、各種の投与経路に対して
当分野で周知の慣用方法および材料を用いて処方することができる。正確な投与
量および具体的な投与方法は上記の因子に依存し、担当医やヒトもしくは動物の
健康管理提供者により決定されよう。ほとんどの場合、投与方法は経験または実
験的に決定されよう。
【０２１３】 改善リガンドによる転写活性化を逆転または停止させたい場合には、改善リガ
ンドと競合することができる単量体化合物を投与してもよい。即ち、副作用が現
れたか、または治療効果を終了させたい場合、二量体化剤 (改善リガンド) に対
するアンタゴニスト (拮抗物質) を、任意の好都合な方法で、特に素早い逆転が
望まれるなら血管内経路で、投与することができる。或いは、リガンド結合ドメ
インと一緒に不活性化ドメイン (または転写サイレンサー) を存在させるように
してもよい。別の手法として、各所に記載されているように、Fas またはTNF 受
容体を介したシグナリングを経てアポトーシスにより細胞を排除してもよい。国
際特許出願PCT/US94/01617およびPCT/US94/08008を参照。
【０２１４】 特定レベルの発現の維持が長期間 (例、約２週間以上) にわたって望まれる場
合、または短期間にわたる改善リガンドの個々のもしくは反復投与を長期の間隔
(例、２週間またはそれ以上) で繰り返す反復治療を行う場合、各投与に対する
改善リガンドの具体的な投与量は、治療投与量の監視に対して使用される手順に
従って決定しうる。所定範囲内の改善リガンドの用量を投与し、応答を監視して
、時間−発現レベルの関係を得ると同時に、治療応答を観察する。その時間内に
観察されたレベルおよび治療応答に応じて、その応答に続く次回には用量を増減
することができる。この方法が、治療範囲内である投与量が得られるまで反復し
て繰り返されよう。改善リガンドを長期投与する場合には、改善リガンドの維持
用量を決定したら、その細胞系が発現産物の適当な応答およびレベルを与え続け
ることが確保されるような長さの間隔で検定を行うことができる。
【０２１５】 このシステムは、改善リガンドに対する細胞応答、発現の効率、ならびに適宜
、分泌のレベル、発現産物の活性、患者の具体的な必要性 (これは時間と状況に
より変動しうる) 、細胞自体もしくは個々の細胞の発現活性の消失に起因する細
胞活性の低下の速度等の多くの変動因子による影響を受けることは云うまでもな
い。
【０２１６】 ２. 組換えタンパク質およびウイルスの生産：商業および研究目的で組換え治
療用タンパク質の生産が、高レベルにタンパク質を発現するように遺伝子操作さ
れた哺乳動物の細胞系を用いてしばしば行われている。細菌または酵母ではなく
、哺乳動物細胞を使用することは、タンパク質の適正な機能が、異種細胞では一
般に達成されない翻訳後改変 (修飾) を必要とする場合に指示される。このよう
にして商業生産されているタンパク質の例としては、エリトロポエチン、組織プ
ラスミノーゲン・アクチベーター、第VIII:c因子のような血液凝固因子、抗体等
が挙げられる。このような手法でのタンパク質の生産コストは、遺伝子操作した
細胞で達成される発現のレベルに直接関連する。このようなタンパク質の生産に
及ぼす別の制限は、宿主細胞に対する毒性であり、タンパク質発現が細胞の高密
度増殖を妨げて、生産レベルが急減することがある。そのため、調節された遺伝
子治療について説明したように、タンパク質発現を緊密に制御できることから、
タンパク質を産生させずに、細胞を高密度に増殖させることが可能である。最適
の細胞密度に達した後で始めて、遺伝子の発現を活性化させ、その後で生産され
たタンパク質を採集する。
【０２１７】 同様の問題が、商業用 (例、遺伝子治療) および実験用の組換えウイルスの生
産についても「パッケージング (詰め込み) 系」の構築および使用において経験
されている。これらの細胞系は、欠陥組換えゲノムをもつ感染性ウイルス粒子の
組立てに必要なウイルス性タンパク質を生産するように遺伝子操作される。かか
るパッケージング系に依存するウイルスベクターとしては、レトロウイルス、ア
デノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV) が挙げられる。後者の場合、或
るパッケージング系から得られるウイルスストックの力価は、ウイルスrep およ
びコアタンパク質の産生レベルに直接関係する。しかし、これらのタンパク質は
宿主細胞に対する毒性が高い。従って、高力価の組換えAAV ウイルスの作製は困
難であることが証明されてきた。本発明は、rep およびコア遺伝子を、ここに説
明した設計の、調節可能な転写因子の制御下に置いた、パッケージング系の構築
を可能にすることで、この問題に対する解答を与える。このパッケージング細胞
系を高密度に増殖させ、ヘルパーウイルスに感染させ、組換えウイルスゲノムで
トランスフェクションすることができる。その後、二量体化材料を添加して、パ
ッケージング細胞でコードされるウイルスタンパク質の発現を誘導させると、高
力価のウイルスの生産が可能になる。
【０２１８】 ３. 生物学的研究：本発明は、標的遺伝子の正確な制御が求められる広範囲の
生物学実験に適用可能である。このような実験には、(1) 生化学的精製のための
対象タンパク質もしくはRNA の発現、(2) その生物学的機能を評価するための、
組織培養細胞中 (または遺伝子操作された細胞によりin vivo ) の対象タンパク
質もしくはRNA の調節された発現、(3) その生物学的機能を評価するための、ト
ランスジェニック動物中の対象タンパク質もしくはRNA の調節された発現、(4)
その遺伝子の生物学的機能を評価するための、内在性遺伝子に作用する別の調節
タンパク質、リボザイムまたはアンチセンス分子をコードする遺伝子の発現の調
節、が含まれる。本発明の成分を適用できるトランスジェニック動物モデルおよ
び他の応用としては、PCT/US95/10591に開示されているものがある。
【０２１９】 本発明はさらに、以上の用途に有用なキットも提供する。かかるキットは、本
発明の融合タンパク質をコードし、その発現を指令することができるDNA 構築物
を含み (さらに上述した追加のドメインを含んでいてもよい) 、調節された遺伝
子転写を行う態様では、その融合タンパク質の多量体化により活性化される、１
または２以上の転写制御エレメントに連結された標的遺伝子を含んでいる標的遺
伝子構築物も含む。或いは、標的遺伝子構築物は、実施者による所望の標的遺伝
子の挿入のためのクローニング部位を含んでいてもよい。かかるキットは、２種
類の組換えタンパク質を二量体化して、標的遺伝子の転写を活性化することがで
きる二量体化剤のサンプルをさらに含んでいてもよい。
【０２２０】 処方、投与量および投与 タンパク質−タンパク質相互作用を促進させるというその能力のため、本発明
のリガンドは、本発明の遺伝子操作された細胞を含むヒトまたはヒト以外の哺乳
動物における、本発明の融合タンパク質の複合体の形成を促進させるための薬剤
組成物および方法に使用することができる。
【０２２１】 このような治療または予防の好ましい方法は、遺伝子操作された細胞内で測定
可能な上記複合体の形成を促進させるか、好ましくはこのような複合体形成によ
り発動される所望の生物学的事象、例えば、標的遺伝子の転写、遺伝子操作細胞
のアポトーシス等、の測定可能な作動を促進させるのに有効な量のリガンド化合
物を、該哺乳動物に投与することである。
【０２２２】 治療／予防用の投与および薬剤組成物 本発明のリガンドは、遊離形態で、または適当であれば塩の形態で、存在しう
る。多くの種類の化合物の薬剤に許容される塩とその調製は当業者には周知であ
る。本発明の化合物の薬剤に許容される塩には、例えば、無機または有機の酸ま
たは塩基により形成される、この化合物の慣用の無毒な塩または第四級アンモニ
ウム塩が含まれる。
【０２２３】 本発明の化合物は、水和物または溶媒和物を形成しうる。電荷を持つ化合物は
水を用いて凍結乾燥すると水和種を形成し、また適当な有機溶媒との溶液状態で
濃縮すると溶媒和物を形成することは当業者には知られている。
【０２２４】 本発明は、治療 (または予防) に有効な量の前記化合物と、薬剤に許容される
担体または賦形剤とからなる薬剤組成物にも関する。担体の例としては、食塩水
、緩衝剤含有食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および
これらの混合物が挙げられ、後でより詳しく説明する。この組成物はまた、所望
により、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる
。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、持効性
処方剤、または散剤の形態をとりうる。組成物は、トリグリセライド等の慣用の
結合剤兼担体を用いて座剤として処方することもできる。経口用の処方は、薬剤
用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナ
トリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含有しうる。処方
は、所望の製剤に応じて、成分の混合、顆粒化および圧縮、または溶解といった
操作を適宜含みうる。
【０２２５】 使用する薬剤用担体は、例えば、固体と液体のいずれでもよい。 固体の担体の例としては、乳糖、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペ
クチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等が挙げられる。
固体担体は、香料、滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、グリダント(glidant) 、
圧縮助剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用しうる１種または２種以上の
物質を含有することができ、またカプセル化材料であってもよい。散剤の場合、
担体は微粉砕した固体であり、これを微粉砕した有効成分と混合する。錠剤では
、有効成分を、必要な圧縮特性を持つ担体と適当な割合で混合し、所望の形状お
よび寸法に圧縮する。散剤および錠剤の有効成分の含有量は、好ましくは99％ま
でである。適当な固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、糖類、乳糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セル
ロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニ
ルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。
【０２２６】 液体担体の例としては、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、水などが挙げら
れる。液体担体は溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤 (乳剤) 、シロップ剤、エ
リキシル剤および加圧組成物の調製に使用される。有効成分を、水、有機溶媒、
両者の混合物などの薬剤に許容される液体担体、または薬剤に許容される油脂に
溶解または懸濁させることができる。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、
保存料、甘味料、香料、懸濁剤、増粘剤、着色料、粘度調整剤、安定剤、または
浸透圧調整剤などの他の適当な製薬用添加剤を含有しうる。経口および非経口投
与用の液体担体の適当な例としては、水 (上記の添加剤、例えば、セルロース誘
導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を部分的に含有す
る) 、アルコール (１価アルコールおよび多価アルコール、例、グリコールを含
む) およびその誘導体、ならびに油 (例、分留ヤシ油およびアラキス<arachis>
油) がある。非経口投与に対しては、担体はオレイン酸エチルおよびミリスチン
酸イソプロピルのような油状エステルであってもよい。滅菌液体担体は、非経口
投与用の滅菌液体形態組成物に有用である。加圧組成物用の液体担体は、ハロゲ
ン化炭化水素その他の薬剤に許容される噴射剤でよい。滅菌溶液または懸濁液で
ある液体薬剤組成物は、例えば、筋肉内、腹腔内、または皮下注射により利用す
ることができる。滅菌溶液はさらに静脈内投与も可能である。化合物はまた、液
体または固体のいずれかの組成物形態で経口投与することもできる。
【０２２７】 担体または賦形剤は、モノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グ
リセリル単独、またはこれとワックス、エチルセルロース、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース、メチルメタクリレート等との組合わせといった、当分野で周
知の遅効材料を含有していてもよい。経口投与用に処方する場合、PHOSAL PG-50
(1,2-プロピレングリコールとのリン脂質濃厚液, A. Nattermann & Cie. GmbH)
中の0.01％Tween 80溶液が、他の化合物に対する許容される経口処方物を与える
ことが認められており、本発明の各種化合物に対する処方物にも適用しうる。
【０２２８】 多様な剤形を採用できる。固体担体を使用した場合、調剤物を打錠するか、粉
末もしくはペレット状で硬質ゼラチンカプセル内に充填するか、またはトローチ
もしくはロジンジの形態にすることができる。固体担体の量は広範囲に変動しう
るが、好ましくは約25 mg ないし約１ｇであろう。液体担体を使用する場合には
、調剤物はシロップ、エマルジョン、軟質ゼラチンカプセル、アンプルもしくは
バイアル内の滅菌注射用溶液もしくは懸濁液、または非水液体懸濁液の形態とな
ろう。
【０２２９】 安定な水溶性の投与形態を得るには、多量体化剤の薬剤に許容される塩を、コ
ハク酸またはクエン酸の0.3M溶液といった有機酸または無機酸の水溶液中に溶解
させてもよい。或いは、酸性誘導体を適当な塩基性溶液中に溶解させることもで
きる。可溶性の塩の形態が利用できない場合には、化合物を適当な共溶媒または
２種以上の共溶媒の混合物中に溶解させる。このような適当な共溶媒の例として
は、これらに限られないが、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール300 、ポリソルベート80、グリセリン、ポリオキシエチル化脂肪酸、
脂肪アルコールまたはグリセリンヒドロキシ脂肪酸エステルなどが挙げられ、全
容積の０〜60％の範囲内の濃度で使用される。
【０２３０】 各種の供給システムが公知であり、本発明の多量体化剤またはその各種の処方
物 (錠剤、カプセル剤、注射液、リポソーム内封入剤、微粒子剤、マイクロカプ
セル剤等を含む) を投与するのに使用することができる。導入方法としては、こ
れに限られないが、皮膚、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻孔内、肺、
硬膜外、眼、および経口経路 (これが通常は好ましい) が挙げられる。化合物は
任意の好都合なまたはその他の点で有利な経路、例えば、輸注もしくはボーラス
注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等)
を通る吸収により投与してもよく、また他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与
してもよい。投与は全身または局所でよい。鼻孔、気管支または肺の症状の治療
または予防の場合、好ましい投与経路は経口、経鼻、または気管支用エアゾール
またはネブライザーである。
【０２３１】 ある種の態様では、化合物を治療を必要とする部位に局所的に投与することが
望ましいことがある。これは、例えば (限定としてではないが) 手術中の局所輸
注、局部の塗布、注射、カテーテルの使用、座薬として、または皮膚パッチもし
くは移植片 (この移植片は、シアラスティック<sialastic> 膜のような膜を含む
、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料のもの、あるいは繊維でよい) によ
り達成することができる。
【０２３２】 ある具体的態様においては、薬剤組成物をヒトへの静脈内投与に適合した薬剤
組成物として、常套的な手順に従って処方する。典型的には、静脈内投与用の組
成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、組成物はさらに可
溶化剤や、注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔薬を含有していてもよい。
一般に、各成分は別々に供給されるか、一緒に混合されて単位投与形態にされ、
例えば、有効成分の量を表示したアンプルまたは小袋のような密封容器内に凍結
乾燥粉末または水を含まない濃厚液として収容される。組成物を輸注により投与
すべき場合には、滅菌した薬剤用の水または食塩水を入れた輸液ビンで投薬する
ことができる。組成物を注射により投与する場合には、成分を投与前に混合する
ことができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを用意することがで
きる。
【０２３３】 有効量の化合物の個体への投与は、化合物をその個体の皮膚の患部に直接投与
することにより局所的に行うこともできる。このためには、ゲル、軟膏、ローシ
ョン、またはクリームといった、薬剤に許容される局所用担体を含む組成物中で
化合物が投与または塗布される。この担体は、水、グリセロール、アルコール、
プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセライド、脂肪酸エステル、
または鉱油といった担体 (これらに制限されないが) を含んでいる。
【０２３４】 他の局所用担体には、流動石油 (パラフィン) 、パルミチン酸イソプロピル、
ポリエチレングリコール、エタノール (95％) 、水中のポリオキシエチレンモノ
ラウレート(5％) 、または水中のラウリル硫酸ナトリウム(5％) がある。酸化防
止剤、保湿剤、粘度安定剤、および類似の添加剤といった他の材料も、必要に応
じて添加しうる。アゾン(Azone) のような経皮浸透向上剤も含有させることがで
きる。
【０２３５】 さらに、ある種の態様では、皮膚の上、中、または下に置いた器材の内部に化
合物を配置する場合があることも予想される。かかる器材としては、受動的また
は能動的放出機構により化合物を皮膚に放出する、パッチ、移植片、および注射
が挙げられる。
【０２３６】 多様な処方物を作るための材料および方法は当分野において周知であり、本発
明の実施に適合させうる。例えば、米国特許第5,182,293 号および第4,837,311
号 (錠剤、カプセル剤およびその他の経口用処方ならびに静脈内処方) ならびに
欧州特許出願公開第0 649 659 号 (1995年４月26日公開；静脈内投与用処方例)
および第0 648 494 号 (1995年４月19日公開；経口投与用処方例) を参照。
【０２３７】 化合物の有効用量は、哺乳動物の体重１kg当たりで、典型的には約0.01〜約50
mg/kg、好ましくは約 0.1〜約10 mg/kgの範囲内であり、１回または複数回投与
されよう。一般に、本発明の化合物は、かかる治療を必要とする患者に、一人当
たり約１〜約2000 mg の日用量範囲内で投与しうる。
【０２３８】 具体的な疾患または症状の治療または予防に有効な化合物の量は、多量体化す
る融合タンパク質の特徴、遺伝子操作された細胞の特徴および位置、ならびにそ
の疾患または症状の性質にも部分的には依存し、標準的な臨床技法により決定す
ることができる。また、最適の投与量範囲の確定を助けるため、in vitroもしく
はin vivo 検定を随意に採用してもよい。有効量は、in vitroまたは動物モデル
試験システムで得られた用量−応答曲線から外挿してもよい。正確な投与量水準
は、担当医または他の健康管理提供者により決定されるべきであり、投与経路や
その個体の年齢、体重、性別、および全般的健康状態；その疾患の性質、重篤度
および臨床段階；同時に行う治療の有無；ならびに患者内の細胞の遺伝子操作の
性質と程度、を含む周知の因子に依存しよう。
【０２３９】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の１または２以上の成分を入れた１または
２以上の容器からなる薬剤パックまたはキットも提供する。このような容器に任
意に付随しうるのは、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制す
る政府機関により指示された形態の注意書である。この注意書は、ヒトの投与用
の製造、使用または販売の監督官庁による認可を反映した内容となる。この注意
書または包装挿入物は、ここに開示した内容と矛盾しない、本発明の改善された
リガンドの使用のため使用説明書を含んでいてもよい。
【０２４０】
【実施例】
【０２４１】
【実施例１】 ヒトCAB 融合タンパク質の作製 すべての構築物 (作製物) は、pcDNA3ベクターから、主鎖SalI部位の突然変異
と新規なポリリンカー領域の挿入とにより誘導した、pcDNA3/m.jy2ベクター (B.
Sockwell, J. Yang) 中で作製された。このプラスミドは、E. coli の選択を可
能にするアンピシリン耐性と、高プラスミド遺伝子発現を可能にするサイトメガ
ロウイルスプロモーターとを含んでいる。他の二量体化系の多くで使用されてい
るプラスミドであるPBJ5の代わりに、pcDNA3/m.jy2ベクターを選択したのは、カ
ルシニューリン構築物のクローニングを容易にする制限酵素切断プロファイルを
有するからである。
【０２４２】 ポリメラーゼ連鎖反応 本プロジェクトで用いた全てのカルシニューリン構築物の3'および5'末端のた
めのプライマーを設計した。これらのプライマーは、pcDNA3/m.jy2ベクターへの
遺伝子の連結を容易にするため、各遺伝子の両末端に特定の制限 (酵素) 部位を
組込んだ。プライマーは、Perkin Elmer Applied Biosystems 394 DNA/RNA 合成
装置で合成し、Perkin Elmer精製プロトコルを用いて精製した。
【０２４３】 PCR 反応は、M5研究用ミニサイクラーで実施した。全体的なPCR プロトコルは
、95℃で５分間のインキュベーションを含んでいた。その後の30秒は、55℃でア
ニーリングさせた。次に、72℃で１分間の伸長 (反応) と、その後の95℃で１分
間のインキュベーション (変性) が続いた。アニーリング、伸長およびインキュ
ベーションの各工程は25〜30回繰り返した。得られた反応混合物を、さらに処理
するまで４℃で保存した。PCR 産物は、Qiagen PCR精製キットおよびそのプロト
コルを用いて精製した。
【０２４４】 カルシニューリンＡ(CNA) 断片の作製用オリゴ CNA 配列は太字, Junk＝ジャンク
【０２４５】
【化１】
【０２４６】
【化２】
【０２４７】 ヒトカルシニューリンＢ(CNB) 用に設計されたオリゴ 太字部分がCNB 配列, Junk＝ジャンク
【０２４８】
【化３】
【０２４９】 CNA-CNB リンカーの作製用に設計されたオリゴ 太字部分がCNA 配列, Junk＝ジャンク
【０２５０】
【化４】
【０２５１】 PCR 条件 (全CNA およびCNB 断片用) 工程 温度 (℃) 時間 (秒) 1. 95 180 2. 37 30 3. 72 60 4. 95 60 5. 37 30 6. 72 60 7. 工程４へ (９回) 8. 95 60 9. 55 30 10. 72 60 11. 工程８へ (25回) 12. 72 300 13. 4 PCR 条件 (リンカー長さのランダム化用) 工程 温度 (℃) 時間 (秒) 1. 95 180 2. 37 30 3. 72 60 4. 95 60 5. 45 30 6. 72 60 7. 工程４へ (９回) 8. 95 60 9. 55 30 10. 72 60 11. 工程８へ (25回) 12. 72 300 13. 4
【０２５２】
【実施例２】 カルシニューリンＡをカルシニューリンＢに連結する方法 CAB 内のカルシニューリンＡとカルシニューリンＢとを連結する方法は、２つ
のカテゴリーに分かれる。
【０２５３】 最初の方法は、残基12、340 または350 用コドンのすぐ前の5'Xho1制限部位と
、残基370 または384 用コドンのすぐ後の3'Sal1制限部位とを含むようにPCR に
より作成した、カルシニューリンＡをコードする遺伝子の断片 (残基12〜370 、
12〜394 、 340〜370 、 340〜394 、 350〜370 または 350〜394)を用いた。カ
ルシニューリンＢをコードする遺伝子の断片 (残基２〜170 または３〜170)も、
残基２または３用のコドンのすぐ前の5'Xho1制限部位と、残基170 用コドンのす
ぐ後の3'Sal1制限部位とを含むようにPCR により作成した。２つの断片の連結は
、カルシニューリンＡの断片がカルシニューリンＢに対し5'に位置し、連結部位
がSal1／Xho1融合 (gtcgag) の結果であるように実施した。その結果、CAB のカ
ルシニューリンＡ部分とそのCAB のカルシニューリンＢ部分との間にバリンおよ
びグルタミン酸(glutamate) をコードする２つの追加コドンが生成した。
【０２５４】 CAB を連結する第２の方法は、残基370 のすぐ後に付着した、サイズが６〜24
アミノ酸の範囲に及ぶリンカーを持つ、カルシニューリンＡ断片のプールを作成
することであった。これらの断片を、それらが残基12、340 、350 用コドンのす
ぐ前の5'Xho1制限部位と、可変リンカーをコードするコドンのすぐ後の3'Sal1制
限部位も含むようにPCR 処理した。カルシニューリンＢ断片は、前節に述べたも
のと同じであった。連結は、カルシニューリンＡの断片がカルシニューリンＢに
対し5'に位置し、連結部位がSal1／Xho1融合 (gtcgag) の結果であるように実施
した。その結果、CAB のカルシニューリンＡ−リンカー部分とそのCAB のカルシ
ニューリンＢ部分との間にバリンおよびグルタミン酸をコードする２つの追加コ
ドンが生成した。
【０２５５】 カルシニューリンＡ上での多様な長さの可変リンカーの作成は、この目的に開
発された２段階PCR 法により実施した。PCR によって、カルシニューリンＡの残
基370 用コドンの後に下記の塩基を付加した： CNA 残基370 − GGTGGTTCTGGTTCTGGTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGG TTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCT これは下記の最大長さ可変リンカーをコードする。
【０２５６】 GGSGSGGSGSGSGSGSGSGSGSGS その後、下記の相補的配列とSal 1 制限部位を(gtc gag) とを含んだ２つのプ
ライマーを用いて、上記鋳型上でPCR を実施した： プライマー１: 5' GTC GAC AGA ACC AGA ACC AGA 3' プライマー２: 5' GTC GAC ACC AGA ACC AGA ACC 3' 鋳型カルシニューリンＡの多くのレジスター(register)でアニーリングすること
ができる両プライマーによるPCR により、７〜24アミノ酸の可変リンカーを含有
するカルシニューリンＡの断片が作成された。興味深いことに、全ての断片が、
アミノ酸 GGSGSの後に続いて、１つおきに交互に並んだグリシンとセリンを所定
の数だけ含んでいた。予測されたPCR 産物は２つのGGSGS 反復配列を有するはず
であったが、我々は全てのクローンにおいて１つだけを得た。さらに、この手法
は、２回目のPCR 工程がリンカーを成長させることができるため、我々が予測し
たものより長いリンカーを持つ断片も与えた。
【０２５７】
【実施例３】 FKBPとCAB の融合タンパク質の作製 全てのCNA 構築物はヒトカルシニューリンＡ (イソ型) から誘導した。全ての
CNB はヒトカルシニューリンＢから誘導した。 CNBM はＮ末端メチオニンを含ん
でおり、 CNBMGはメチオニンとグリシン残基の両方を含んでいる。GAL4からの残
基１〜147 をGAL4 DNA結合ドメイン(GE)として使用する。VP16からの残基 413〜
490 をVP16転写活性化ドメイン(VE)として使用する。各VE構築物は、SV40ラージ
Ｔ抗原由来のＮ末端核局在化配列 (NLS)を含んでおり、一方、全てのGE構築物は
、GAL4配列の内部のNLS を含んでいる。全てのGE構築物はFLAGエピトープタグを
含み、全てのVE構築物はFLU エピトープタグを含んでいる。全てのFKBP構築物は
ヒトコーディング配列の全体を含んでいる。FRB 構築物は、ヒトFRAPタンパク質
の残基2025〜2114を含んでいる。UAS-SEAPリポーター遺伝子は、５個の上流Gal4
結合部位 (UAS 部位) と１つの最小インターロイキン２基本(basic) プロモータ
ーとを含んでおり、熱安定性アルカリホスファターゼである分泌アルカリホスフ
ァターゼ(SEAP, SEcretd Alkaline Phosphatase)をコードする。
【０２５８】 同じ基本的な酵素切断、連結、および形質転換手順を用いて、各構築物を得た
。カルシニューリンＡ断片は、PCR 産物をXhoIとXbaIとで切断し、同じ酵素で予
め切断しておいたベクター中に連結することで、pcDNA3/m.jy2ベクター中に入れ
た。CNB は、XhoIおよびApaI制限部位を用いてこのベクター中に連結した。FKBP
3-VEおよびFKBP3-GEは、SacII およびEcoRI 酵素を用いてPBJ5からpcDNA3/m.jy2
ベクターに連結した。これらの基本親ベクターは、カルシニューリンＡおよびカ
ルシニューリンＢ断片がXhoIとSalIまたはXhoIとApaIとによる切断で取り出すこ
とができ、一方 VE はSalIとApaIとで取り出すことができるため、これ以後の全
ての構築物の作成も可能であった。また、GE、CNA またはCNB 含有ベクターは、
SpaIとApaIとによる切断で作成することができた。XhoIとSalIは相補的スティッ
キーエンド (付着末端) を形成するので、本プロジェクトで用いた全てのカルシ
ニューリン構築物は、上記切断物の異なる組合わせおよび構築物の連続的な作成
の切断物から生じさせることができた。
【０２５９】 ベクターおよび挿入DNA を適当な制限酵素で切断した後、生成物を次いで１％
または２％アガロースゲル (１％は300 塩基対より大きな全ての生成物に使用)
に流した。その後、目的のDNA バンドを、Qiagen Gel精製キットおよびそのプロ
トコルを用いて単離した。ベクターと挿入バンドは、１mLのT4 DNAリガーゼおよ
び１mLのNEB 連結反応緩衝液を含む11 mL の容積中、挿入断片：ベクターの２：
１ (またはそれ以上) の比率で、16℃にて４時間ないし一晩連結した。次に、こ
の連結反応を使って、GIBCO BRL から入手したサブクローニング効率DH5aの細菌
細胞を、この細胞と共に提供されたプロトコルに従って形質転換させた。SalI-A
paI 連結のように一部の非効率的な連結に対しては、最大効率DH5aの細胞を使用
した。アンピシリンを用いて陽性の形質転換体を選択した。各連結反応から数個
の陽性コロニーをさらに解析するために選んだ。Wizard Mini-Prepキットとその
プロトコルを用いて、それらの陽性コロニーからプラスミドDNA を単離した。擬
陽性クローンをスクリーニングするため、DNA を制限酵素切断分析に付した。真
の陽性コロニーからのDNA をWizard Mini-Prepキットとそのプロトコルを用いて
調製した。調製したDNA を下記の関係式を用いて定量した： [二本鎖DNA]＝(50 mg/mL)*(A260) ここで、A260は、260 nm波長の光でのDNA サンプルの吸光度である。
【０２６０】
【実施例４】 転写活性化のリポーターに基づく検定 我々が利用する転写検定は、WO 94/18317 およびRivera et al, 1996前出に記
載されている。概略の検定法は次の通りである。
【０２６１】 10％FBS 、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびにグルタミン酸を添
加したRPMI培地中、５％CO2 、37℃で培養中の対数増殖期にある、Ｔ抗原で形質
転換された1000万個のJurkatＴ細胞を、1000xgで５分間遠心分離する。得られた
ペレットを、フェノールレッドを含まないRPMIで洗浄し、1000xgで５分間の遠心
分離により再ペレット化する。各1000万個の細胞を、フェノールを含まない200
μL のRPMIを用いて再懸濁させる。この200 μL の細胞を次いで、上記UAS-SEAP
リポーター１μg 、DNA 結合ドメインを含む構築物１μg 、および活性化ドメイ
ンを含む構築物５μg と共に、室温で10分間培養する。エレクトロポレーション
をBTX エレクトロポレーターにより250 mV、129 Ωで行う。細胞を室温でさらに
10分間回復させる。この細胞を、次いで、10％FBS 、ペニシリン、ストレプトマ
イシン、およびグルタミン酸を添加した、フェノールレッドを含まない10 mL の
RPMIに再懸濁させ、５％CO2 、37℃のインキュベーターに24時間戻す。
【０２６２】 回復後、細胞を1000xgで５分間の遠心分離によりペレット化し、10％FBS 、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミン酸を添加した、フェノールレ
ッドを含まない5 mLのRPMIに再懸濁させる。この細胞懸濁液の100 μL を96ウェ
ルプレートにプレーティングする。エタノール溶液として得た二量体化剤の適宜
希釈度 (２μM から0.2 nM) を、細胞を再懸濁させたのと同じ培地中で作製して
、エタノールの濃度が１％未満となるようにする。これらの希釈液100 μL を、
96ウェルプレートの細胞が入っているウェルに添加する。細胞を再び５％CO2 、
37℃のインキュベーターに24〜48時間置く。
【０２６３】 二量体化剤と共に培養した後、細胞が入っている96ウェルプレートをサランラ
ップ(R) で包み、65〜75℃に２時間加熱する。熱処理後、プレートを冷えるまで
室温に置く。各ウェルの100 μL を、下記溶液100 μL が入っている新たなプレ
ートに移す。各96ウェルプレートに対して、2MジエタノールアミンpH 10 (CO2含
有) 11 mL を用意し、1 mLの2MジエタノールアミンpH 10 (CO2含有) に4-メチル
ウンベリフェリルホスフェート(MUP) 25.6 mg を含有させた溶液132 μL を使用
。これらのプレートを次いで37℃に１〜24時間戻し、標準的なFITCフィルターセ
ットを用いてマイクロプレートリーダーで読み取る。最大の読みは1-2000を超え
るべきではない。この読みは基質がほとんど消耗していることを示しているから
である。
【０２６４】
【実施例５】 CAB 融合タンパク質を用いた転写活性化 CAB を、Spencer et al., 1993, Science 262:1019-1024; WO 94/18317; Rive
ra et al., 1996, Nature Medicine 2, 1028-1032;およびWO 96/41865 (Clackso
n et al)に記載のようなスリーハイブリッド様転写検定で広範囲に試験した。
【０２６５】 上述したように、多量体CAB 、単独の全長もしくはミニCAB または CABの一部
分を、Gal4-DNA結合ドメインにＣ末端側で融合させ、Ｎ末端側NLS とＣ末端側VP
16活性化ドメインとの間に配置する。３コピーのFKBPが他方の二量体化ドメイン
として機能し、これを、Gal4のＣ末端、またはＮ末端側NLS とVP16活性化ドメイ
ンとの間、のいずれかに融合させる。リポーターは、GAL4の上流活性化配列 (12
縦列コピー) に続いて、分泌アルカリホスファターゼ遺伝子(SEAP)を含んでいる
。FK506 滴定を用いて、SEAPの二量体化剤依存性転写活性化を引き出し、これを
メチルウンベリフェリルホスフェート(MUP) を基質とする蛍光プレートリーダー
で検出した。発現に用いたベクターはPharmacia Biotech のpCDNA3のあるバージ
ョンであり、これはそのXho1およびSal1制限部位が破壊され、クローニングを容
易にするための新たなポリリンカーが挿入されたものである。これらの実験に用
いた細胞はＴ抗原で形質転換されたJurkatＴ細胞である。
【０２６６】 この転写検定における我々のデータのまとめは次の通りである。全長 CAB (カ
ルシニューリンＡの残基12〜394 をカルシニューリンＢの残基２または残基３に
融合させたもの) は、VP16またはGAL4に融合させた時に機能性である。これらの
EC50は〜１ナノモル(nM)である。
【０２６７】 我々は、カルシニューリンＡの残基 340〜370 がカルシニューリンＢとの複合
体の形成に十分であることを同定した；残基 350〜370 ではカルシニューリンＢ
との複合体形成ができない。これは、ミニCAB を用いた融合タンパク質において
も反映され、全てのミニCAB が機能する。その機能の程度は、活性化の全体レベ
ルに関しては変動するが、EC50に関してはほぼ同一である。
【０２６８】 リンカーの長さは、次に述べるように、CAB により誘発される活性の量は確か
に調節できるようであるが、CAB のEC50についてはそうではない。試験した最も
短いリンカー (７または８アミノ酸) と最も長いリンカー (16〜18アミノ酸) と
が、全活性化(total activation)がほぼ８〜10倍で最高であるようであり、カル
シニューリンＡの残基 340〜394 とカルシニューリンＢの残基２または３〜170
との間の直接融合に匹敵している。
【０２６９】 カルシニューリンＢの２つのバージョンは、２つの点でわずかに異なる。残基
３〜370 由来のカルシニューリンＢは、総活性化(overall activation)が約10％
高くなるようであるが、「フリー」カルシニューリンＢおよびカルシニューリン
Ａとのバックグラウンド会合もやや高いようである。残基２〜370 由来のカルシ
ニューリンＢは、総活性化はやや低いが、フリーカルシニューリンＡまたは「フ
リー」カルシニューリンＢの相互作用も小さいようである。この「フリー」カル
シニューリンＡまたはカルシニューリンＢとの相互作用が全く極小であることは
注目すべきである。これらの全ての構築物に対する平均EC50は、１〜３nMの範囲
内である。
【０２７０】 ミニCAB (CNAの 340〜394 とCNB の 3〜170)の多量体をVP16への融合体として
試験したところ、３FKBPに融合させたGal4に加入させた時に、３および４縦列CA
B は上記の最良の単独CAB と同一に機能する。２縦列CAB は、全活性化に関して
２倍良好に (〜20倍) 機能し、EC50はFK506 により約 0.1〜0.3 nMの範囲内にシ
フトする。
【０２７１】
【実施例６】 ミニCAB タンパク質の作成と試験 我々の分析による示唆から、CAB のCNA ドメインのＮ末端領域を除去でき、得
られたタンパク質はなおFK506-FKBPを結合させることが予測できた。４種類のこ
のような最小CAB タンパク質を、PCR と連結により作成した。２種類のミニCAB
(miniCAB) は、 CNBMGまたは CNBM のいずれかに融合したCNA 残基 340〜394 を
含んでいた(340ミニCAB)。残り２種類のミニCAB は、 CNBMGまたは CNBM のいず
れかに融合したCNA 残基 350〜394 を含んでいた(350ミニCAB)。これらの各ミニ
CAB も、VP16転写活性化ドメイン(VE)に融合させた。
【０２７２】 ２種類の340miniCAB-VE 構築物は両方とも、標準的なSEAP検定条件下でFK506
依存性的にFKBP3-GEとコトランスフェクションした時に、SEAP活性を刺激するこ
とができた。 CNBMGと CNBM の相対的活性と相応して、340miniCABMG-VE は340m
iniCABM-VE より高いSEAP活性を誘導することができた。これに対して、２種類
の350miniCABはどちらも、同様の実験でSEAP活性を刺激することができなかった
。これらの結果は、CNA の残基 340〜394 が、SEAP検定により検出可能な検出能
でCNB とFKBP-FK506の両方との機能的な相互作用を遂行することができる最小ド
メインを表すことを示している。
【０２７３】 340miniCABMG-VE 構築物が刺激するSEAP活性(6.5 0.6倍<0.6 fold>) はまた、
対応する全長 CABMG-VE の値(4.0 0.4倍) より高い。ミニCAB が全長CAB より高
いSEAP活性を生ずるという知見は、より小さいミニCAB タンパク質が、より大き
な全長CAB タンパク質に比べて、より安定であるか、またはより効率的に翻訳も
しくはフォールディング (折り畳み) されることに起因するかもしれない。ミニ
CAB のEC50は約３nMであり、全長 CABMG-VE より一桁大きい。この結果は、全長
CAB-VEの方が、340miniCABより、FK506-FKBPとの結合接触点をより多く作ること
ができることを考えれば、理解可能である。
【０２７４】 全長CAB との場合と同様に、ミニCAB が分子間または分子内メカニズムを通し
て作用するか否かを調べるため検定を行った。全長CAB と同様、340miniCAB-VE
はCNA-GEとわずかな相互作用だけを示した。また、両方の340miniCAB-VE がCNB-
GEとわずかな相互作用だけを示した。これは、CNB-GEと高レベルの相互作用を示
す全長 CABMG-VE とは対照的である。恐らく、340miniCAB-VE のより嵩の小さい
CNA ドメインが、全長CAB のより大きなCNA ドメインに比べ、分子間の結合相手
を見つける際の効率がより小さいのであろう。これらは、二量体化ドメインとし
てのミニCAB の使用に対する将来有望な結果である。なぜなら、ミニCAB は、全
長 CABMG-VE とは異なり、両方のミニCAB-VEタンパク質が、ミニCAB タンパク質
の効率を低下させたり、または他のタンパク質の機能遂行の妨害を生じたりする
恐れがある望ましくない分子間相互作用に関与することがないことを暗示するか
らである。ミニCAB は分子間相互作用に著しくは関与するようには見えないので
、これは、これらのタンパク質のCNA およびCAB の両ドメインが、分子内様式で
別個にではなく、一緒に作用して、FK506-FKBP結合部位を形成することを暗示し
ている。
【０２７５】 得られた結果は、これらの340miniCAB-VE が、設計した通りに、分子内様式で
効率的な二量体化ドメインとして機能することを暗示している。また、これらの
340miniCAB-VE は全長CAB の触媒ドメインを欠失しており、24 kDaで、約35 kDa
より小さい。
【０２７６】 複数の二量体化ドメインの直列配置によるミニCAB 系の改善 従来の二量体化系では、GAL4 DNA結合ドメインとVP16転写活性化ドメインの両
方に融合させた複数の二量体化ドメインは、CID により誘導されるSEAP活性の最
大量を増加させうることが認められていた。例えば、縦列融合させた３分子のFK
BPは、直列(in series) の１、２または４分子のFKBPより高いSEAP活性を生ずる
ことが見られた (Belshaw, PJ. et al. 「タンパク質のヘテロ二量体化を誘導す
る合成リガンドによるタンパク質会合と細胞下局在化の制御」PNAS 1996, 93:46
04-4607)。これが、全ての上記実験に対してFKBP3 構築物を使用してきた理由で
ある。縦列二量体化ドメインの最適な数は、各ドメインごとに異なるかもしれな
い。あるタンパク質内の複数の直列二量体化ドメインが、そのタンパク質のリガ
ンド結合部位の数を増加させるであろう。これは、そのタンパク質に対するリガ
ンドの効果的な親和性を増大させよう。直列の二量体化ドメインが多すぎると、
融合タンパク質に過大な嵩を付加して、その環境との不利な立体相互作用をもた
せることになろう。これらの因子の間のバランスにより、ある特定の構築物に対
して直列に置くべき二量体化ドメインの理想的な数が決まる。
【０２７７】 ミニCAB 二量体化系を改善する試みとして、１、２、３、または４個の340min
iCABを直列にVEに融合させた構築物を、既存の構築物の連結により作成した [(3
40miniCAB)n-VE と呼ぶ、ここでｎ＝1, 2, 3, 4] 。ミニCAB 構築物の制限プロ
ファイルのため、各340miniCABサブユニットの間には、２残基リンカーが存在し
た。これらの複数340miniCAB構築物は CNBMG含有ミニCAB とだけで作製した。こ
れらが二量体化検定で最高のシグナルを与えたからである。
【０２７８】 図４は、FKBP3-GEとコトランスフェクションした時に、２個の直列340miniCAB
ドメインがFK506 の存在下で最も高いSEAP活性 (9.9 0.4 倍) を生ずることを示
している。１個または３個の直列340miniCABは似たレベルのSEAP活性を生じ、４
個のミニCAB は非常に低いシグナルを生ずる。２および３直列ミニCAB のEC50は
、約1.3 nMの値でほぼ同じであり、１ミニCAB の値より低い。340miniCABMG-VE と同様に、(340miniCABMG)2-VE は、CNA-GEまたはCNBMG-GE とほとんど分子間
会合を示さない。これは、この構築物の活性が、そのCNA およびCNB の両ドメイ
ンが分子内様式で一緒に作用することに起因することを暗示している。
【０２７９】 現時点では、(340miniCABMG)2ドメインが最も最適化されたCAB 二量体化試薬
である。
【０２８０】
【実施例７】 CAB-VE以外の分野でのCAB 媒介二量体化の実施 CAB が本当に有用な新規二量体化ドメインであることを示すには、VP16以外の
活性化ドメインの分野でも機能しなければならない。CAB の多方面性の簡単な試
験は、CAB-GEがFKBP-VE とヘテロ二量体化するのを示すことができる新規な転写
活性化系を創出することであろう。これは、CAB およびFKBPを融合させる活性化
ドメインを交換させたことを除けば、最初のCAB-VE系と同じである。この新たな
系の実施のため、６種類のCAB-GE構築物を作製した。そのうち２つは、全長CAB
とCNBMGまたはCNBM のいずれかとの組合わせであった。残り４つは、340miniCAB
および350miniCABといずれかの形態のCNB との組合わせであった。これらのタン
パク質を試験するには、FKBP-VE 融合タンパク質が必要であった。FKBP3-GEと同
様に、FKBP3-VEはPBJ5ベクター中で既に利用可能であり、本プロジェクトの全て
の構築物に対して使用したpcDNA3/m.jy2ベクターに容易に移行された。
【０２８１】 我々は、CAB-GE構築物がCAB-VE構築物と同様に作用することを見出した。しか
し、全長CABMG-GE タンパク質はSEAP活性を2.0 倍だけ高めるのに対し、全長CAB MG -VE タンパク質はこれを約４倍高めることができた。全長(full)CAB-GEおよび
CAB-VEが両方とも、FKBP3-GEにヘテロ二量体化した時にSEAP活性を刺激すること
ができ、これは全長CAB ドメインの多方面性を実証している。また、これらはFK
506 の不存在下では活性を刺激しない。この結果は、全長CAB にそのまま残って
いるホスファターゼ活性部位の存在は、上述したCNA とCNB との構成的会合実験
により最初に提起された懸念である、SEAP活性の高まりには関係していないこと
を暗示している。
【０２８２】 340miniCAB-GE 構築物は、340miniCAB-VE 構築物と同レベルにSEAP活性を高め
る。340miniCABMG-GE と340miniCABM-GE との間には差異は見られなかった。340
miniCAB-VE と同様に、340miniCABMG-GE はCNA またはCNB と著しい構成的活性
を示さず、従って、分子間メカニズムではなく分子内メカニズムにより作用する
ようである。
【０２８３】
【実施例８】 全長CAB-GEとミニCAB-GE間の差異の探索 全長 CABMG-GE 構築物がその340miniCABMG-GE 対応物と同じほどには良好に作
用しないこと (VE CABタンパク質でも見られた傾向) の理由を探索するためさら
に実験を行った。普通のSEAP検定プロトコルは、GE構築物DNA ：VE構築物DNA の
１：５の比率でのトランスフェクションを要求する。この比率は、FKBP1012とラ
パマイシンの二量体化系に対して最良の結果を生ずるように実験的に決定された
ものである。恐らく、トランスフェクションされたDNA の比率は翻訳されたGEお
よびVE含有タンパク質の比率に影響する。全長 CABMG-GE を用いて、トランスフ
ェクションDNA の合計量は一定に保ったまま、トランスフェクションするGE DNA
：VE DNAの比率１：５ (普通) から１：１〜５：１に変化させて、一連のSEAP検
定を実施した。全長 CABMG-GE DNA の量が増えるほど、SEAP活性の高まりもまた
増大した。
【０２８４】 同様の系列の実験を340miniCABMG-GE についても実施したが、GE DNA：VE DNA
のトランスフェクション比の変化は、全長 CABMG-GE 構築物の場合ほど顕著には
最大誘導SEAP活性に影響しなかった。興味深いことに、GE DNA：VE DNAが５：１
の実験では、全長 CABMG-GE により誘導されたSEAP活性の最大量は、340miniCAB MG -GE により生ずるものと等しかった。たとえタンパク質発現レベルを直接検査
しなくても、これらの結果は、より多くのトランスフェクションDNA がより高レ
ベルの発現につながると仮定すれば、全長 CABMG-GE のより大きな発現によって
、その二量体化ドメインとしての性能が、340miniCABMG-GE により達成されるレ
ベルまで増大することを示唆している。この知見は、ミニCAB の方が、そのより
小さなサイズのために、より大きな全長CAB タンパク質に比べてより安定または
より効率よく翻訳または折り畳まれるので、全長CAB より良好な性能を示すとい
う既に示した提示を支持する。
【０２８５】
【実施例９】 Ｃ40バンプつきFK506 の合成 FK506 の抽出／精製 Prograf(R)ブランドの薬用タクロリムス(tacrolimus)カプセルからの粉末を水
に懸濁させ、3/7 容積比のEtOAc を用いてFK506 を抽出し、回転蒸発により回収
した。粗製FK506 抽出物を、縦列J14 およびJ11 9C13カラムを取付けた日本分析
工業(Japan Analytial Industries) LC-908 再循環合成用HPLCを用いたサイズ排
除クロマトグラフィー (以下、「サイジングJAI 」という) により精製した。こ
の物質の同定は、TLC 、FAB-MSおよびプロトンNMR により確認した。
【０２８６】 C40-フェニル-FK506の合成 12mgの精製FK506 を、炎乾燥した20mlの丸底フラスコ内に攪拌棒と一緒に密封
し、フラスコをアルゴンでパージした。CaH2上で蒸留したばかりの12mlのCH2Cl2 を注入し、軽く攪拌して、FK506 を溶解させた。0.25mLのスチレン (150 eq) を
、3.6mg のグラブス触媒 (ビス−トリシクロヘキシルホスフィン・ベンジリジン
ルテニウムクロリド)(0.3 eq) を含有する2.2ml のCH2Cl2と一緒に注入した。最
終的なFK506 の反応濃度は約１mMであった。この反応混合物をアルゴン下、室温
で24時間攪拌した。生成物と未反応SM (スチレンモノマー) を回転蒸発により回
収し、酢酸エチルに溶解させ、Celite(R) で濾過した。この時点で、新たな溶媒
とスチレンと触媒を上記と同じ比率で添加し、反応をさらに24時間繰返した。
【０２８７】 C40-フェニル-FK506の精製 上述したような回転蒸発と濾過に続いて、生成物／SM混合物をCH2Cl2に再懸濁
させ、(a) CH2Cl2、(b) CH2Cl2:iPrOH:PhH 18:1:1 、(c) CH2Cl2:iPrOH:PhH 12
:1:1、(d) CH2Cl2:iPrOH:PhH 9:2:2 の段階的勾配を用いたフラッシュクロマト
グラフィーにより分離した。カラムの各画分をTLC により分析し、標準物質と比
較して、三つの主要画分にプールするのを助け、これらの画分をFAB-MSにより分
析した。画分Ｉはスチレンとスチルベンを含有し、画分IIはFK506 とC40-フェニ
ル-FK506を含有し、画分III はFK1012 (FK506 の自己メタテシス生成物) を含有
していた。画分IIの成分を２回のHPLCにより分離した。まず、この混合物を、２
つの縦列JAIgel GS310カラムを取付けた日本分析工業LC-908再循環合成用HPLCを
用いたアフィニティーHPLC (以下、「アフィニティーJAI 」という) により分離
した。このようにして、粗製のC40-フェニル-FK506ならびに粗製の回収FK506 が
得られた。次に、アフィニティーJAI からの各粗製画分を、上記のようにしてサ
イジングJAI により均質物に精製した。各精製化合物の同定は、FAB-MSおよびプ
ロトンNMR により確認した。
【０２８８】 他のC40-誘導体化FK506 の合成／精製 各場合において、これらの誘導体を調製するための合成経路は、本質的に上記
と同じであるが、スチレンそれ自体の代わりに、適当な末端オレフィン化合物 (
通常は置換スチレン) を使用する。例えば、C40-p-フェノキシ-フェニル-FK506
の合成にはp-フェノキシスチレンを使用し、C40-m-フルオロフェニル-FK506の合
成にはm-フルオロスチレンを使用した。反応過程を追跡する主な手段は、目的物
に対応する親イオンピークの出現に重点を置いた、FAB-MSである。精製中もFAB-
MSを用いて、JAI 画分の成分を迅速に同定した。但し、この場合には、FK506 に
対応する親イオンピークの不存在に重点を置いた。この重点が必要であるのは、
FK506 が生物学的用途では各生成物と競合するため、生成物の収率を最大限にす
るより、FK506 の絶対的な不存在の方が重要であると考えられるからである。一
部の場合には、この目標を追求するため、JAI 精製工程の順序を逆転させ (即ち
、最初にサイジングJAI 、次にアフィニティーJAI)、あるいはこのような工程を
さらに追加した。
【０２８９】
【実施例１０】 CAB/p65 融合タンパク質の作成 CAB/p65 融合タンパク質は、ラージ腫瘍抗原で形質転換された哺乳動物細胞の
高コピー数に対するSV40複製起点を含んでいる、pBJ5.2X ベクター中で調製した
。pBJ5のこのバージョンは、哺乳動物細胞に対する選択カセットを含んでおらず
、細菌細胞中での選択のためのアンピシリン耐性カセットを含んでいる。このプ
ラスミドは、哺乳動物中での高レベルの発現のためにSRa プロモーターを含んで
いる。このプラスミドのポリリンカー配列は、下記エレメントからなる (HAは赤
血球凝集素エピトープタグである) 。
【０２９０】 NotI/SacII−Kozak−ATG−XhoI−SalI−HA−SpeI−TAA 全長CAB (fCAB)および最小CAB (mCAB)に対応するカルシニューリンＡの２つの
異なる断片を増幅するために、制限部位を含むプライマーを調製した。これらの
PCR 断片を、ポリリンカー内に方向指定的にサブクローンニングして、下記構築
物を作製した。
【０２９１】 ATG−XhoI−CnA(12-394)−SalI−SpeI−TAA−EcoRI ATG−XhoI−CnA(340-394)−SalI−SpeI−TAA−EcoRI カルシニューリンＢの残基 3〜170 に対応するこのタンパク質の断片を増幅す
るために、制限部位を含むプライマーを調製した。これらのPCR 断片を、カルシ
ニューリンＡ断片を既に含む構築物に方向指定的にサブクローンニングして、下
記のCAB 構築物を作製した ( S＼X は、相補的なSalIおよびXhoI制限部位の融合
で、もはやいずれの酵素でも切断できないものを表す) 。
【０２９２】 ATG−XhoI−CnA(12-394)−(S＼X)−CnB(3-170)−SalI−HA−SpeI−TAA ATG−XhoI−CnA(340-394)−(S＼X)−CnB(3-170)−SalI−HA−SpeI−TAA FKBP:FK506の関係で転写活性化を媒介するCAB の能力を検討するため、NF-kB
のp65 サブユニットの転写活性化ドメインを含有する(XhoI/SpeI) 断片を、(Sal
I/SpeI) 切断mCAB構築物に挿入した。この融合は、別の(SalI/XhoI) 融合を生じ
、これはいずれの酵素でも切断できない。同様の方策が、CAB ドメインの多量体
の形成にも可能であり、これらの試薬の製造を著しく容易にする。コーディング
領域内の全ての制限酵素が６塩基カッターであるので、これらはタンパク質合成
のためのリーディングフレームを保存する。成熟CAB は、下記のアミノ酸配列を
有するべきである： NH2-Met-Leu-Glu-(CnA断片)-Val-Glu-(CnB断片)-Val-Asp-Thr-Ser-COOH 新規なmCAB-p65構築物は、配列決定解析により証明された。
【０２９３】
【実施例１１】 カルシニューリン阻害検定での「バンプ」としてのFK506 誘導体の実証 FK506 誘導体が、カルシニューリンの結合において、FK506 それ自体より効果
が小さいことを実証するため、カルシニューリンに対するFK506 の作用に感受性
のあるリポーター遺伝子検定を実施した。具体的には、ヒトTAg JurkatＴ細胞を
リポーター構築物であるNFAT-SEAP でトランスフェクションした。後者は、分泌
アルカリホスファターゼ(SEAP)に対する遺伝子の上流側に12コピーのNFAT応答エ
レメントを融合させたものからなる。トランスフェクション後、細胞をホルボー
ルミリステートアセテート(PMA) およびイオノマイシン(IO)に露出した。これら
は一緒になってNFAT-SEAP リポーター活性を活性化させることができる。FK506
は、カルシニューリンを阻害することにより、用量依存的にPMA+IOの効果を打ち
消す拮抗作用を示す。具体的には、１条件当たり1000万個のJurkat細胞を、エレ
クトロポレーション(40ms パルス) により500 ngのNFAT-SEAP リポーター構築物
でトランスフェクションし、96ウェル・マイクロタイタープレートに 0.3×106 ／ウェルで分注した。PMA (50ng/mL) と IO (1μM)とを全細胞に添加し、FK 506
、FK506 誘導体またはビヒクルの連続希釈液を添加した。組織培養インキュベー
ターで細胞を36時間培養した後、65℃で２時間の熱不活化を行った。この加熱後
、細胞上清100 μL を、検定緩衝液 (2Mジエタノールアミンビカーボネート中の
120 μM 4-メチルウンベリフェリルホスフェート、pH 10) 100μL が入っている
レプリカプレートに移した。検定物を８時間培養してから、Fluoroskan(R) プレ
ートリーダーで測定した。これらの実験の結果を図７に示す。
【０２９４】 我々は、FK506 誘導体が示すリポーター遺伝子活性の拮抗能力の低下 (この検
定でのそのより高いIC50により判定される) の原因は、FKBP：リガンド複合体の
カルシニューリン結合能力が損なわれるためでると推定した。この検定における
誘導体の低下した活性の別の可能性は、(1) 組織培養培地中での化合物の不溶性
、(2) 化合物が細胞膜を通過することができない、または(3) 化合物がFKBPに結
合できないことである。これらの他の可能性を除外するために、上記誘導体の２
つを、ミンク肺細胞におけるラパマイシン依存作用(Paul A Clemons およびBren
t Stockwell 、未公開の知見) を抑制するそれらの能力について試験した。フェ
ニルおよびフェノキシフェニル誘導体のどちらもこの試験でラパマイシンの作用
を抑制することができたので、これらはいずれも可溶性、細胞通過性で、FKBPに
結合できると考えられる。
【０２９５】
【実施例１２】 リポーター遺伝子活性に対する全長CAB (fCAB)の過発現の影響 上節に述べた検定との対比として、我々は、バンプ付き化合物が示す全長CAB
(fCAB)のホスファターゼ活性をこれらの構築物の一過性トランスフェクション後
に阻害する能力も試験しようと考えた。最初の実験は、500 ngのNFAT-SEAP リポ
ーター遺伝子と共に 500〜5000 ng のfCAB構築物DNA をコトランスフェクション
するものであった。図８はこれらの実験結果を示しており、高レベルのfCAB過発
現(overexprssion) がFK506 またはその誘導体が示すリポーター遺伝子活性を阻
害する能力に打ち勝った。トランスフェクションした構築物DNA の各濃度に対応
するウェスタンブロットも示してある。
【０２９６】 一過性にトランスフェクションしたfCABの場合のホスファターゼ検定を調整す
るために、fCAB構築物DNA の濃度を3.2ng ないし320ng の範囲で変化させながら
上記のようにSEAP検定を行った。これらの実験の結果は図９に示す。
【０２９７】
【実施例１３】 FK506 誘導体への結合を復帰させることができる突然変異CAB についてスクリ
ーニングするため、p65 の活性化ドメインのＮ末端へのmCABモジュールの融合体
を上記のように調製した。この活性化ドメインを使用した根本的な理由は、mCAB
をVP16と融合させた最初の転写構築物が、転写検定で低いシグナル振幅を与えた
ことであった。我々は、活性化ドメインの変更がこのシグナルを改善し、転写活
性化の安定したEC50を与えるだろうと期待した。これらの両方が、転写検定を用
いた突然変異体のプールの効果的なスクリーニングにとって必要である。
【０２９８】 簡単に述べると、ヒトTAG JurkatＴ細胞に、SEAPの遺伝子の上流側に12コピー
のGal4応答エレメントを含むリポーター構築物 (GRE-SEAP) を、Gal4-(FKBP)3お
よびmCAB-p65融合体と一緒に、トランスフェクションした。NFAT-SEAP 検定の場
合と同様に、96ウェルプレート内の細胞にFK506 、その誘導体、またはビヒクル
を添加した。最初の試験が非常に有望な結果を与えたので、３種類の構築物のそ
れぞれについてDNA 濃度を系統的に変化させて、この転写システムを最適化する
ことに取り組んだ。三つの引き続いた実験において、これらのトランスフェクシ
ョンに対する下記の最適DNA 濃度を見出した。
【０２９９】 GRE-SEAPリポーター遺伝子 500ng Gal4-(FKBP)3 DB 融合体 1500ng mCAB-p65 AD 融合体 500ng DNA 濃度の最適化に続いて、FK506 と２つの誘導体を転写検定で試験した。こ
の実験の結果を図10Ａに示す。これらの実験の活性化の振幅は、CAB 突然変異体
のプールを補償性結合(compensatory binding)に対してスクリーニングする試み
を保証するのに十分である。
【０３００】 これらの細胞における用量応答の安定性と取り組むため、FK506 およびフェニ
ル-FK506のより精密な滴定を実施した。これらのデータを図10Ｂに示す。これは
この性質を示しており、この転写システムが補償性結合に対するCAB 突然変異体
のプールのスクリーニング用の見込みある検定を構成することを示している。
【０３０１】
【実施例１４】 CAB 「穴」発見の突然変異誘発方策 上述したように、我々は、FK506 誘導体への補償性結合に対して突然変異体の
プールをスクリーニングするための改善された転写システムの使用を構想してい
る。簡単にいえば、これはmCAB-p65突然変異体に対応するDNA 種の混合物のトラ
ンスフェクションと、次に、図10に示した用量−応答曲線において左側にシフト
するもの探すことを含む。
【０３０２】 mCAB-p65構築物の突然変異誘発のために、突然変異誘発すべきアミノ酸位置の
それぞれで、縮重した内部プライマー対を作製した。これらのプライマーは、そ
れれらのそれぞれのアミノ酸位置 (位置は原文書にアウトラインされている同じ
６位置である) に対応するコドンで完全に縮重している。各プライマーと、コー
ディング領域の外側 (ベクターアーム内) の対応する (逆平行) プライマーとを
用いて、２つの縮重した、重複 (オーバーラッピング) PCR 産物が作製された。
第２のPCR 反応では、これらの２つの断片を鋳型として用いて、２つの外部プラ
イマーを用いた重複伸長により増幅した。これらの最終産物を切断し、pBJ5.2X
宿主ベクターに戻した。これらのライブラリーが、転写検定において補償性突然
変異体に対してスクリーニングされることになるのである。
【０３０３】 潜在的な補償性突然変異体を同定する別の方策は、酵母スリーハイブリッドシ
ステムを利用するものである。このシステムでは、栄養マーカー遺伝子の発現を
推進する適宜に応答性のリポーターと一緒に、一方の二量体化ドメインへのDNA
結合ドメイン融合体と、他方の二量体化ドメインへの活性化ドメイン融合体とで
、酵母を形質転換させる。酵母形質転換体を、「野生型」mCAB-p65構築物を有す
る酵母の増殖ができないFK506 または誘導体の濃度で、増殖の回復に対してスク
リーニングする。このシステムの利点は、ずっと多くのクローンを同時にスクリ
ーニングすることができ、mCAB内の複数のアミノ酸位置を同時にランダム化する
ことができることである。FKBPおよびFRB ドメインの突然変異誘発ライブラリー
をスクリーニングするためのこのようなスリーハイブリッドシステムの使用は、
米国特許5,830,462 およびWO 96/41865 に記載されている。
【０３０４】 CAB ライブラリーのスクリーニングに使用したシステムは、Clonetech からの
MatchMaker LexA ツハーハイブリッドシステム (カタログ＃K1609-1)に基づく。
これはplex-AおよびpB42ADの２つのベクターを利用し、これらはそれぞれLex-A
由来のDNA 結合ドメインおよび活性化ドメイン(B42) を含んでいる。さらに、酵
母EGY48 株が、LexAop(X6)-Leu2 オペレータの制御下に組込みLEU2リポーターを
含んでおり、LEU2脱落プレート上でLexA誘導リポーター活性化に対して直接スク
リーニングするこを可能にしている。
【０３０５】 pB42AD由来の普通のポリリンカーを除去し、下記のポリリンカーで置換する。
両方のドメインのＣ末端にFKBPとCAB の１コピーを融合した。 LexA-miniCAB-E (E＝フラッグ(flag)エピトープタグ) B42AD-FKBP-E (E＝フラッグエピトープタグ) このシステムを用いて、約500 万個の異なる突然変異mCABを、非常に少量の化
合物を用いて１つのシャーレで同時にスクリーニングすることができる。FK506
のアリル側鎖、またはアリル側鎖の置換基、と接触状態にあると推定される残基
の一部または全てを、下記のオリゴヌクレオチドを用いたPCR により、個々にま
たは同時に突然変異させることができる。これらのライブラリーを次いで、LexA
-miniCAB-E構築物中に連結し、Gibco BRL からのDH5-alpha e-coli電気感応(ele
ctrocompetent)細胞中にエレクトロポレーションする。DNA をDH5-alpha 中で増
幅させ、精製し、B42AD-FKBP-Eを発現する酵母株EGY48 中に形質転換させる。ラ
イブラリーは、糖供給源のグルコースと共に-HIS-TRPプレート上で培養すること
により (LexA-mCAB とB42AD-FKBP構築物の両方の選択のために) 酵母中でさらに
増幅された後、100 nM濃度の各バンプ化合物を含有する-HIS-TRP-LEUガラクトー
ス／ラフィノースプレート上にプレーティングする。増殖するコロニーを、化合
物の不存在下で-HIS-TRP-LEUガラクトース／ラフィノースプレート上にプレーテ
ィングすることによりチェックして、薬剤誘導会合を促進するものから、構成的
に会合させるもの (即ち、擬陽性) の間で識別する。上記の対照で増殖しないコ
ロニーを、次に、各バンプ化合物の100 nMで-HIS-TRP-LEU+ガラクトース／ラフ
ィノース上に再プレーティングして、その化合物が増殖を誘導することを確認す
る。増殖するコロニーをその後、バンプ化合物を３倍希釈した-HIS-TRP-LEU+ガ
ラクトース／ラフィノースプレートにプレーティングすることにより比較する。
最低の薬剤濃度で増殖を誘導することができるクローンをさらに解析する。最高
の陽性クローンからのDNA を救出するか、PCR 処理して、陽性ヒットの配列決定
用の鋳型を作製する。これらの突然変異物を、その後、我々がFKBPに関連してバ
ンプ化合物へのミニCAB の親和性の改善を証明するために細胞培養において開発
した１または２以上の検定 (即ち、mCABによる転写検定) において試験する。単
純な連結によって、これらの突然変異ミニCAB をこれらの他のシステムにシャト
リング(shuttling) することができる。それらがいずれも5' XhoI 部位ならびに
3' Sal1 部位および3' Apa1 部位を含んでいるからである。
【０３０６】 構築物の調製 Ａ. pB42AD構築物 pB42ADベクターをEcoR1 およびXho1で切断し、ゲル精製して、下記のポリリン
カーに連結すると、pB42AD-PL3が得られる。PB42ADにより作製された全ての構築
物は、このpB42AD-PL3ベクター中である。
【０３０７】 pB42AD用のポリリンカーオリゴ： 下記の２種類のオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し
、アニーリングし、予めEcoR1 およびXho1で切断しておいたpB42AD中に連結して
、順に下記制限部位を持つ新たなポリリンカーを得た。
【０３０８】 5' Xho1-スヘ゜ーサー-Sal1-Nco1-BstEII-BspEI-AfIII-ApaI-EcoR1 3' 5' tcg acg aat tcg ggc ccc tta agt ccg gag gtc acc cat ggg tcg acg tcg
gtc gta gac tcg aga 3' 5' aat ttc tcg agt cta cga ccg acg tcg acc cat ggg tga cct ccg gac tta
agg ggc ccg aat tcg 3' 上に報告した構築物からのミニCAB およびFKBPを、次にXho1およびEcoR1 で切
断し、pB42AD-PL 中に直接連結した。
【０３０９】 Ｂ. pLexA 構築物 下記のオリゴを標準的なPCR 条件下で用いて、5' EcoR1と3' BamHIを１つずつ
有するFKBP断片を作製した。pLexA とこの断片をEcoR1 およびBamH1 で切断し、
ゲル精製し、連結した。
【０３１０】 FKBPオリゴ： 1. FKBP Y2Hex 5' (EcoR1およびXho1制限部位を持つFKBP用5'オリゴ)
【０３１１】
【化５】
【０３１２】 2. FKBP Y2Hsb 3' (3' Sal 1 およびBamH1 制限部位を持つFKBP用3'オリゴ、停
止コドンなし)
【０３１３】
【化６】
【０３１４】 pLexA のためのミニCAB の作製： mCABを、下記のオリゴを用いて、私の最初のミニCAB 鋳型から(off of)標準的
なPCR 条件でPCR 処理し、NcoIおよびBamHI で切断した。このゲル精製した断片
を、BamHI およびNcoIで切断した、ゲル精製pLexA に連結した。
【０３１５】 3. mCAB Y2Hex 5' (5' BamH1 およびXho1制限部位を持つ、CNA の残基340 から
始まるmCAB用5'オリゴ)
【０３１６】
【化７】
【０３１７】 4. mCAB Y2Hsfann 3' (3' Sal1 、フラッグ、停止、Apa1、Not1およびNco1を持
つmCAB用3'オリゴ)
【０３１８】
【化８】
【０３１９】 Ｃ. mCAB用突然変異原性オリゴ 下記が突然変異mCABのライブラリーを作成するのに使用したオリゴヌクレオチ
ドである。これらは、我々が突然変異誘発させた下記の各位置のコドン NN(G/C)
(N=G, A, T または C) で構築した。mCAB内の各独立タンパク質からのナンバリ
ング・スキームは保持されている。
【０３２０】 CNB 部分に対しては、オーバーラップ (重複) 突然変異方策を採用した。私の
最初のミニCAB 鋳型から、突然変異を持たないＮ末端断片をPCR 処理した。これ
は、表示したオリゴヌクレオチドとのPCR により作成したＣ末端断片とアニーリ
ングする領域を有している。これらの２つの断片を混合し、標準的な条件でPCR
に付して、Ｎ末端Pflm1 部位とＣ末端Apa1部位とを持つ断片を作成した。この反
応は適切なサイズの目視できる断片を形成したので、これを次いで上記のオリゴ
４ (mCAB Y2Hsfann 3') と下記のPflm1 オリゴとでさらに増幅して、著しい量の
生成物を作成した。これをその後、Pflm1 およびNco1で切断し、予めPflm1 およ
びNco1で切断しておいたpLexA-mCAB-Eに連結し、ゲル精製した。mCABのCNA 部分
は、下の２に記載したオリゴでPCR により突然変異誘発させて、3' Pflm 部位と
5' Xho部位とを有するmCABの小断片を作成した。これをPflm1 とXho1とで切断し
たpLexA-mCABE に連結した。５位置のライブラリーを作成するため、これを、３
位置が突然変異誘発されたpLexA-mCABE ライブラリーに連結することができる。
【０３２１】 1. mCABのCNB 部分のオーバーラップ伸長突然変異誘発 オーバーラップのためのCNB のＮ末端部分の形成用5'オリゴ
【０３２２】
【化９】
【０３２３】 オーバーラップのためのCNB のＮ末端部分の形成用3'オリゴ 5' ggg aac aat ctg aaa gat aca cag tta cag c 3' オーバーラップのためのCNB のＣ末端部分の形成用5'突然変異原性オリゴ
【０３２４】
【化１０】
【０３２５】 オーバーラップのためのCNB のＣ末端部分の形成用3'突然変異原性オリゴ
【０３２６】
【化１１】
【０３２７】 2. mCABのCNA 部分の突然変異原性オリゴ 5' Xho I部位を有する5'突然変異原性オリゴ
【０３２８】
【化１２】
【０３２９】 3'突然変異原性オリゴ
【０３３０】
【化１３】
【０３３１】
【実施例１５】 複数の結合相手との複合体におけるCAB ドメインの使用 FKBP/FK506/CAB複合体ならびにシクロフィリン／シクロスポリン／CAB 複合体
の両方を含んでいる細胞を遺伝子操作するには、まずCAB ドメインがシクロフィ
リン／シクロスポリン／CAB 複合体を形成する能力について、実施例４に記載し
た転写検定において、FKBPを直接シクロフィリンに置換することにより試験する
ことになろう。即ち、細胞を、シクロフィリンとGAL4のようなDNA 結合ドメイン
とを含んでいる第１の融合タンパク質と、p65 のような転写活性化ドメインに融
合したCAB ドメインを含んでいる第２の融合タンパク質とでトランスフェクショ
ンする。細胞にシクロスポリンを添加した後に、リポーター遺伝子発現を検出す
る。このような実験は、WO 98/08956 、特に実施例３に記載してある。シクロフ
ィリン／シクロスポリン／CAB 複合体の形成が実証されたら、次にシクロフィリ
ン融合タンパク質とFKBP融合タンパク質の両方を含んでいる細胞は、正しいリガ
ンドの添加により適切な複合体を形成することができよう。
【０３３２】 図５に示したCAB 機能の各モードに対する原理実験のプルーフ (証明) は、蛍
光タンパク質を利用しよう。FRB またはCAB のいずれかの同じ(FKBP)ドックへの
加入を実証するため、これらの各モジュールの異なる蛍光タンパク質 (BFP およ
びGFP など) への融合体を作製した後、これらの構築物を核 (または膜局在化)
FKBP構築物と共にコトランスフェクションする。ラパマイシン、FK 506、または
両者で処理すると、一方または両方の蛍光シグナルの核 (または膜) への移動が
起こるはずである。FKBPまたはシクロフィリンのいずれかへのCAB のドッキング
を実証するために、これらの各イムノフィリンの別の局在化シグナル配列 (核ま
たは膜局在化のためのもの等) への融合体を作製した後、これらの構築物をCAB-
GFP と共にコトランスフェクションする。FK 506、シクロスポリン、または両者
で処理すると、緑の蛍光シグナルの適当な位置への移動が起こるはずである。こ
れらの実験は、理想的には免疫沈降による試験でバックアップされよう。例えば
、カルシニューリンまたはCAB ドメインの抗体を用いて、FK506 またはシクロス
ポリンの存在下でCAB ドメインを免疫沈降させることができよう。その後、免疫
沈降物をSDS-pageに流し、ウェスタン転移を行い、FKBPまたはシクロフィリンの
いずれかの抗体でブロッティングすることにより複合体形成を検出する。
【０３３３】 このシステムの使用は、タンパク質キナーゼAkt およびPDK1の条件調節(condi
tional regulation)において構想されたことがある。これらのキナーゼは、互い
どうしと膜へのそれらの近接により複雑に調節される。上述した最初の局在化モ
ードを使用し、ただしBFP およびGFP のそれぞれをこれらのキナーゼの一方で置
換して、ラパマイシンおよびFK506 の添加順序実験を行うことができた。この実
験では、処理された細胞を、これらのキナーゼの一方または他方の下流であるこ
とが既知の読み出しに対して監視する。これらのキナーゼは、ラパマイシンとFK
506 の両方の細胞標的が関係する経路を、直接的または間接的に侵害するので、
これらの実験を行うには、これらのイムノフィリン−リガンド複合体のそれぞれ
に対して「バンプ−穴」の解決策があることが好ましい。
【０３３４】 本書に引用した特許文書および科学文献のそれぞれの全内容を参考としてここ
に援用する。これらの文書は、本発明の各種側面の現状技術を例示する作用も果
たす。本発明の数多くの改変および変更が当業者には明らかであるはずである。
異種作用ドメインの選択における設計選択、リガンド、融合タンパク質の設計、
DNA 組成物、ウイルスベクターまたは他のDNA 供給手段、導入遺伝子の投与方法
および経路等を含む、このような改変および変更は、本発明の範囲および特許請
求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 CAB 二量体化系 (システム) に使用した構築物。
【図２】 E/Z C40-フェニル-FK506の合成の反応式。
【図３】 FK506 とのクロス・メタテシス(cross-metathesis 、横断複分解) に用いたス
チレン類似物。
【図４】 分泌アルカリホスファターゼ活性に及ぼすCAB ドメイン数の変化の影響。
【図５】 全長CAB 及びミニCAB により誘導される分泌アルカリホスファターゼ活性。
【図６】 CAB 二量体化ドメインが関係する３構築物システムの説明図。 Ａ：核局在化シグナル(NLS) の場合のFKBPへの、または核輸出(export)シグナ
リング(NES) の場合のシクロフィリンＡ(CypA)への、いずれかのCAB 融合タンパ
ク質の加入。 Ｂ：CaaXイソプレニル化シグナルのため原形質膜に局在化したFKBPへの、CAB
ドメインまたはFRB ドメインのいずれかに融合したキナーゼの加入。
【図７】 カルシニューリン依存性リポーター遺伝子活性に及ぼすC40 誘導体化の影響。
結果は、１誘導体あたり少なくとも３回の別個の実験の平均値を表す。略号の意
味：Nap ＝ナフチル、Ph＝フェニル、PhOPh ＝フェノイルフェニル、TMS ＝トリ
メチルシリル、FPh ＝フルオロフェニル、IPh ＝ヨードフェニル。
【図８】 NFAT-SEAP リポーター遺伝子活性に及ぼす高レベルfCAB発現の影響。SEAP検定
は、トランスフェクションした細胞の分注液をウェスタンブロッティングによる
分析のため別々に培養した点を除いて、上記と同様に実施した。 Ａ: HAエピトープタグに対抗する抗体 (3F10、Gibco)を用いたウェスタンブロ
ット。トランスフェクションしたDNA の濃度により変化するfCABタンパク質の発
現を示す。 Ｂ: 過発現したfCABの存在下で高い構成的リポーター活性を示すSEAP検定の結
果。図示のデータは、トランスフェクションしたfCAB DNAが4000ngの場合。
【図９】 fCAB構築物DNA 濃度の変化によるホスファターゼ検定の調整。SEAP検定は、表
示の量のfCAB構築物DNA を用いて上記のように実施した。データは２回の別個の
実験の平均を表す。
【図１０】 CAB-p65 融合タンパク質を用いたFK506 媒介転写検定の展開。SEAP検定は、各
DNA 種の最適化濃度と表示用量のFK506 またはFK506 誘導体とを用いて上記のよ
うに実施した。 Ａ: FK506 と２種類の誘導体による転写の活性化を示すSEAP検定結果。データ
は３回の別個の実験の平均値を表す。 Ｂ: 狭い濃度範囲で少し異なる多くの用量による用量応答の挙動を示すSEAP検
定結果。データは３回の別個の実験の平均値を表す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月４日（２００１．１２．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２０】 他の成分、設計の特徴および用途 本発明の融合タンパク質は、膜保持ドメインのような細胞局在化ドメインを異
種ドメインとして含んでいてもよい。例えば、PCT/US94/01617、特に26〜27頁を
参照。簡単に述べると、膜保持ドメインは、宿主細胞に内在性であるか否かにか
かわらず、任意の好都合な膜結合タンパク質から単離することができる。膜保持
ドメインは、多くの受容体を始めとする、膜貫通保持ドメイン、即ち、細胞表面
タンパク質の場合のように、膜を横断する長さのアミノ酸配列であってもよい。
膜貫通ペプチド配列はまた、細胞外および／または細胞内ドメインの一部または
全部に達する長さであってもよい。或いは、膜保持ドメインは、細胞表面膜の脂
質との会合を可能にするミリストイル化またはパルミトイル化部位のような脂質
膜保持ドメインであってもよい。脂質膜保持ドメインは、膜へのＮ末端結合に対
してはコーディング配列の5'末端に、またＣ末端結合に対しては3`末端付近に、
通常は付加されよう。脂質膜結合を与える翻訳後プロセシングを行うペプチドは
、Carr et al, PNAS USA (1988) 79, 6128; Aitken et al, FEBS Lett. (1982)
150, 314; Henderson et al, PNAS USA (1983) 80, 319; Schulz et al, Virolo
gy (1984) 123, 2131; Dellman et al, Nature (1985) 314, 374に記載され、An
n. Rev. of Biochem. (1988) 57, 69 に総括されている。興味あるアミノ酸配列
としては、配列 M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R (配列番号１) が挙げられる。各
種のDNA 配列を用いて、本発明の各種融合タンパク質内のこのような配列をコー
ドすることができる。他の局在化ドメインとしては、-K-D-E-L (配列番号２) お
よび-H-D-E-L (配列番号３) のような細胞小器官 (オルガネラ) 標的ドメインお
よび配列 (これは、これを有するタンパク質を小胞体に標的化する) 、ならびに
(直接的) 転写調節用に設計された融合タンパク質に特に有用な核局在化配列が
挙げられる。各種の細胞局在化配列およびシグナルが当分野において周知である
。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２４５】
【化１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２４６】
【化２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２４８】
【化３】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２５０】
【化４】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２５５】 カルシニューリンＡ上での多様な長さの可変リンカーの作成は、この目的に開
発された２段階PCR 法により実施した。PCR によって、カルシニューリンＡの残
基370 用コドンの後に下記の塩基を付加した： CNA 残基370 − GGTGGTTCTGGTTCTGGTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGG TTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCT (配列番号16) これは下記の最大長さ可変リンカーをコードする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２５６】 GGSGSGGSGSGSGSGSGSGSGSGS (配列番号17) その後、下記の相補的配列とSal 1 制限部位を(gtc gag)(配列番号20) とを含
んだ２つのプライマーを用いて、上記鋳型上でPCR を実施した： プライマー１: 5' GTC GAC AGA ACC AGA ACC AGA 3' (配列番号18) プライマー２: 5' GTC GAC ACC AGA ACC AGA ACC 3' (配列番号19) 鋳型カルシニューリンＡの多くのレジスター(register)でアニーリングすること
ができる両プライマーによるPCR により、７〜24アミノ酸の可変リンカーを含有
するカルシニューリンＡの断片が作成された。興味深いことに、全ての断片が、
アミノ酸 GGSGS (配列番号21) の後に続いて、１つおきに交互に並んだグリシン
とセリンを所定の数だけ含んでいた。予測されたPCR 産物は２つのGGSGS(配列番 号21) 反復配列を有するはずであったが、我々は全てのクローンにおいて１つだ
けを得た。さらに、この手法は、２回目のPCR 工程がリンカーを成長させること
ができるため、我々が予測したものより長いリンカーを持つ断片も与えた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２９２】 ATG−XhoI−CnA(12-394)−(S＼X)−CnB(3-170)−SalI−HA−SpeI−TAA ATG−XhoI−CnA(340-394)−(S＼X)−CnB(3-170)−SalI−HA−SpeI−TAA FKBP:FK506の関係で転写活性化を媒介するCAB の能力を検討するため、NF-kB
のp65 サブユニットの転写活性化ドメインを含有する(XhoI/SpeI) 断片を、(Sal
I/SpeI) 切断mCAB構築物に挿入した。この融合は、別の(SalI/XhoI) 融合を生じ
、これはいずれの酵素でも切断できない。同様の方策が、CAB ドメインの多量体
の形成にも可能であり、これらの試薬の製造を著しく容易にする。コーディング
領域内の全ての制限酵素が６塩基カッターであるので、これらはタンパク質合成
のためのリーディングフレームを保存する。成熟CAB は、下記のアミノ酸配列を
有するべきである： NH2-Met-Leu-Glu-(CnA断片)-続いてVal-Glu-(CnB断片)-続いてVal-Asp-Thr-Se
r-COOH（配列番号22） 新規なmCAB-p65構築物は、配列決定解析により証明された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３０８】 5' Xho1-スヘ゜ーサー-Sal1-Nco1-BstEII-BspEI-AfIII-ApaI-EcoR1 3' 5' tcg acg aat tcg ggc ccc tta agt ccg gag gtc acc cat ggg tcg acg tcg
gtc gta gac tcg aga 3' (配列番号23) 5' aat ttc tcg agt cta cga ccg acg tcg acc cat ggg tga cct ccg gac tta
agg ggc ccg aat tcg 3' (配列番号24) 上に報告した構築物からのミニCAB およびFKBPを、次にXho1およびEcoR1 で切
断し、pB42AD-PL 中に直接連結した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３１１】
【化５】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３１３】
【化６】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３１６】
【化７】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３１８】
【化８】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３２２】
【化９】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３２３】 オーバーラップのためのCNB のＮ末端部分の形成用3'オリゴ 5' ggg aac aat ctg aaa gat aca cag tta cag c 3' (配列番号30) オーバーラップのためのCNB のＣ末端部分の形成用5'突然変異原性オリゴ
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３２４】
【化１０】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３２６】
【化１１】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３２８】
【化１２】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３３０】
【化１３】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３３４】 本書に引用した特許文書および科学文献のそれぞれの全内容を参考としてここ
に援用する。これらの文書は、本発明の各種側面の現状技術を例示する作用も果
たす。本発明の数多くの改変および変更が当業者には明らかであるはずである。
異種作用ドメインの選択における設計選択、リガンド、融合タンパク質の設計、
DNA 組成物、ウイルスベクターまたは他のDNA 供給手段、導入遺伝子の投与方法
および経路等を含む、このような改変および変更は、本発明の範囲および特許請
求の範囲に包含されるものである。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College <120> FK506-based regulation of biological events <130> ARIAD 385A PCT/US <140> US 09/831,096 <141> 2001-05-03 <160> 34 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Arificial <220> <221> BINDING <222> (1)..(14) <223> membrane binding domain <400> 1 Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Arificial <220> <221> BINDING <222> (1)..(4) <223> organelle targeting domain <400> 2 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Arificial <220> <221> BINDING <222> (1)..(4) <223> organelle tagreting domain <400> 3 His Asp Glu Leu 1 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(42) <223> hCNA cloning oligo.12 <400> 4 cgggcccccc ctcgagtcta cgaccgacag ggtggtgaaa gc 42 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(41) <223> hCNA cloning oligo.340 <400> 5 atataaatcg ctcgagccat actggcttcc aaatttcatg g 41 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(43) <223> hCNA cloning oligo.350 <400> 6 atataaatcg ctcgagttta cttggtccct tccatttgtt gggg 44 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(58) <223> hCNA cloning oligo.370 <400> 7 ccagtagggt ctagatctgg gcccacgata taagtcgacg ttgaggacat ttaccagc 58 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(9) <223> overlapping Xba1 and BglII sites <400> 8 tctagatct 9 <210> 9 <211> 63 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(63) <223> hCNA cloning oligo.394 <400> 9 ttaatctaga tcttcacttg tcatcgtcat ctttatagtc gacctctttc cgggctgcag 60 ctg 63 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(41) <223> hCNB cloning oligo.2 <400> 10 atataaatcg ctcgagggaa atgaggcaag ttatcctttg g 41 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(38) <223> hCNB cloning oligo.3 <400> 11 atataaatcg ctcgagaatg aggcaagtta tcctttgg 38 <210> 12 <211> 65 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(65) <223> hCNB/FLAG cloning oligo <400> 12 ttaatctaga tctgggccct cacttgtcat cgtcatcttt atagtcgacc acatctacca 60 ccatc 65 <210> 13 <211> 116 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(116) <223> hCNA template linkers <400> 13 cgatttatat gggccctcta gatctagaac cagaaccaga accagaacca gaaccagaac 60 cagaaccaga accagaacca ccagaaccag aaccaccgtt gaggacattt accagc 116 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(58) <223> CNA-CNB linker oligo.1 <400> 14 gaatcgcaaa tctagatctg ggcccgtcat ctttatagtc gacaccagaa ccagaacc 58 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_structure <222> (1)..(58) <223> CNA-CNB linker oligo.2 <400> 15 gaatcgcaaa tctagatctg ggcccgtcat ctttatagtc gacagaacca gaaccaga 58 <210> 16 <211> 72 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_signal <222> (1)..(72) <223> CNA 370 linker oligo <400> 16 ggtggttctg gttctggtgg ttctggttct ggttctggtt ctggttctgg ttctggttct 60 ggttctggtt ct 72 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Arificial <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> CNA 370 linker <400> 17 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> CNA primer.1 <400> 18 gtcgacagaa ccagaaccag a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> CNA primer.2 <400> 19 gtcgacacca gaaccagaac c 21 <210> 20 <211> 6 <212> DNA <213> Arificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Sal1 Site <400> 20 gtcgac 6 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Arificial <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> GS linker repeats <400> 21 Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mature CAB peptide fragment <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> mature CAB fragment <400> 22 Val Asp Thr Ser 1 <210> 23 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pB42AD polylinker oligo.1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(66) <223> pB42AD polylinker oligo1 <400> 23 tcgacgaatt cgggcccctt aagtccggag gtcacccatg ggtcgacgtc ggtcgtagac 60 tcgaga 66 <210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pB42AD polinker oligo 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(66) <223> pB42AD polinker oligo 2 <400> 24 aatttctcga gtctacgacc gacgtcgacc catgggtgac ctccggactt aaggggcccg 60 aattcg 66 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligos.1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> oligos.1 <400> 25 cgggcccccc gaattcctcg agatgggcgt gcaggtggag ac 42 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligos.2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> oligos.2 <400> 26 gggtctggat ccgtggactt ccagttttag aagctcg 37 <210> 27 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligos.3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(50) <223> oligos.3 <400> 27 atataaatcg ggatccgtct cgagccatac tggcttccaa atttcatgg 49 <210> 28 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligos.4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(72) <223> oligos.4 <400> 28 tctttaacca tggcggccgc gggccctcac ttgtcatcgt catctttata gtcgaccaca 60 tctaccacca tc 72 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pLexA-mCABE.1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> pLexA-mCABE.1 <400> 29 cttggtccct tccatttgtt ggggaaaaag tgactgag 38 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pLexA-mCABE.2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> pLexA-mCABE.2 <400> 30 gggaacaatc tgaaagatac acagttacag c 31 <210> 31 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Where "v" represents nucleotides G or C and "n" represents any of the nucleotides A, G, C or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(64) <223> oligo.1 <400> 31 gctgtaactg tgtatctttc agattgttcc cvnnvnncat cttvnntacc tggaagagtt 60 cccc 64 <210> 32 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo.2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(65) <223> oligo.2 <400> 32 ttaatctaga tctgggccct cacttgtcat cgtcatcttt atagtcgacc acatctacca 60 ccatc 65 <210> 33 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo.3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> oligo.3 <400> 33 atataaatcg ctcgagccat actggcttcc aaatttcatg g 41 <210> 34 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Where "v" represents nucleotides G or C and "n" represents any of the nucleotides A, G, C or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(52) <223> oligo.4 <400> 34 ctcagtcact ttttccccaa caaatggaag vnnvnnagta aaaacatcca tg 52
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 グラッドストーン、ブライアン・ジー アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02125、ドーチェスター、ハーバー・ポイ ント・ブルバード50、＃208 (72)発明者 セス、アブヒナブ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07670、テナフライ、エングル・ストリー ト300 (72)発明者 シュライバー、スチュアート・エル アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02115、ボストン、マールバラ・ストリー ト434 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA07 DA02 DA03 EA02 HA17 4B065 AA93 AB06 BA02 CA24 CA43 CA44 4C084 AA06 AA13 CA53 CA56 CA59 MA02 MA52 MA55 NA20 4H045 AA10 AA30 BA41 CA40 EA20 FA74

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 カルシニューリンＡの一部分とカルシニューリンＢの一部分
    とを含むCAB ドメインをコードする組換え核酸であって、該CAB ドメインがFKBP
    /CABリガンドおよびFKBPドメインと三成分複合体を形成する組換え核酸。
  2. 【請求項２】 CAB ドメインのカルシニューリンＡの部分が下記ペプチド配
    列のいずれかから選ばれたペプチド配列を含む、請求項１記載の組換え核酸：ヒ
    トカルシニューリンＡの残基12〜394 、ヒトカルシニューリンＡの残基12〜370
    、またはヒトカルシニューリンＡの残基 340〜394 。
  3. 【請求項３】 CAB ドメインのカルシニューリンＢの部分がヒトカルシニュ
    ーリンＢの残基 3〜170 を含む、請求項１記載の組換え核酸。
  4. 【請求項４】 天然のカルシニューリンペプチド配列とは、10までのアミノ
    酸の置換、欠失または挿入により異なるカルシニューリンＡおよび／またはカル
    シニューリンＢペプチド配列をコードする核酸配列を含む、請求項１、２または
    ３記載の組換え核酸。
  5. 【請求項５】 請求項１の少なくとも１つのCAB ドメインと、これに異種の
    少なくとも１つの別のドメインとを含む融合タンパク質をコードする、組換え核
    酸。
  6. 【請求項６】 異種ドメインが、DNA 結合ドメイン、転写調節ドメイン、細
    胞局在化ドメイン、およびシグナリングドメインを含む群から選ばれる、請求項
    ５記載の組換え核酸。
  7. 【請求項７】 異種ドメインが、lexA、GAL4もしくは複合DNA 結合ドメイン
    であるか、またはこれに由来するものである、請求項６記載の組換え核酸。
  8. 【請求項８】 異種ドメインが、p65 、VP16もしくはAPドメインであるか、
    またはこれに由来するものである、請求項６記載の組換え核酸。
  9. 【請求項９】 異種ドメインが、KRABドメインもしくはssn-6/TUP-1 ドメイ
    ンであるか、またはこれに由来するものである、請求項６記載の組換え核酸。
  10. 【請求項１０】 異種ドメインが、細胞表面受容体の細胞内ドメインである
    か、またはこれに由来するものである、請求項６記載の組換え核酸。
  11. 【請求項１１】 FKBPドメイン含有タンパク質、およびFK506 より優先的に
    非天然のFKBP/CABリガンドと、三成分複合体を形成する１または２以上のCAB ド
    メインを含有する融合タンパク質をコードする組換え核酸。
  12. 【請求項１２】 請求項５〜11のいずれかに記載の第１の組換え核酸、およ
    び少なくとも１つのFKBPドメインとこれに異種の少なくとも１つの別のドメイン
    とを含む融合タンパク質をコードする第２の組換え核酸を含む、核酸組成物。
  13. 【請求項１３】 第２の核酸が、第１の融合タンパク質の異種ドメインと同
    一または異なる異種ドメインを含有する融合タンパク質をコードする、請求項12
    記載の核酸組成物。
  14. 【請求項１４】 第１の融合タンパク質がCAB ドメインおよび転写活性化ド
    メインを含み、第２の融合タンパク質がFKBPドメインおよびDNA 結合ドメインを
    含む、請求項13記載の核酸組成物。
  15. 【請求項１５】 第１の融合タンパク質がCAB ドメインおよびDNA 結合ドメ
    インを含み、第２の融合タンパク質がFKBPドメインおよび転写活性化ドメインを
    含む、請求項13記載の核酸組成物。
  16. 【請求項１６】 第１と第２の融合タンパク質がリガンドの存在下でリガン
    ド依存性複合体を形成し、この複合体が検出可能な生物学的シグナルを開始させ
    る、請求項12記載の核酸組成物。
  17. 【請求項１７】 生物学的シグナルが、転写、細胞増殖、細胞分化、アポト
    ーシスよりなる群から選ばれる、請求項16記載の核酸組成物。
  18. 【請求項１８】 組成物がさらに標的遺伝子構築物を含む、請求項12記載の
    核酸組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項５〜11のいずれかに記載の組換え核酸でコードされ
    る融合タンパク質。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜３または５〜11のいずれかに記載の組換え核酸
    を含むベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項４記載の組換え核酸を含むベクター。
  22. 【請求項２２】 請求項12記載の核酸組成物を含むベクター。
  23. 【請求項２３】 ベクターがウイルスベクターである、請求項20記載のベク
    ター。
  24. 【請求項２４】 ベクターがウイルスベクターである、請求項22記載のベク
    ター。
  25. 【請求項２５】 ウイルスベクターが、アデノウイルス、AAV 、ヘルペスウ
    イルス、レトロウイルス、アデノウイルス／AAV 雑種、ポックスウイルス、レン
    チウイルスよりなる群から選ばれる、請求項23または24記載のベクター。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜３または５〜11のいずれかに記載の組換え核酸
    を含む宿主細胞。
  27. 【請求項２７】 請求項12記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 ヒト起源のものである、請求項26記載の宿主細胞。
  29. 【請求項２９】 ヒト起源のものである、請求項27記載の宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 生体適合性の材料で包まれている、請求項26記載の宿主細
    胞。
  31. 【請求項３１】 生体適合性の材料で包まれている、請求項27記載の宿主細
    胞。
  32. 【請求項３２】 請求項26記載の宿主細胞を含んでいるヒト以外の動物。
  33. 【請求項３３】 請求項27記載の宿主細胞を含んでいるヒト以外の動物。
  34. 【請求項３４】 請求項１〜３または５〜11のいずれかに記載の組換え核酸
    を、細胞によるDNA 取り込みが可能な条件下で該宿主細胞に導入することを含む
    、遺伝子操作された宿主細胞の作製方法。
  35. 【請求項３５】 請求項12〜18のいずれかに記載の核酸組成物を、細胞によ
    るDNA 取り込みが可能な条件下で該宿主細胞に導入することを含む、遺伝子操作
    された宿主細胞の作製方法。
  36. 【請求項３６】 核酸をex vivo で導入する、請求項34記載の方法。
  37. 【請求項３７】 核酸をex vivo で導入する、請求項35記載の方法。
  38. 【請求項３８】 細胞が生体内に存在する、請求項34記載の方法。
  39. 【請求項３９】 細胞が生体内に存在する、請求項35記載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項27記載の細胞内の融合タンパク質を多量体化する方
    法であって、該細胞を、該融合タンパク質との複合体形成が可能な条件下で、有
    効量のリガンドと接触させることを含む方法。
  41. 【請求項４１】 請求項27記載の細胞内の検出可能な生物学的シグナルを開
    始させる方法であって、該細胞を、該融合タンパク質と複合体形成できる、遺伝
    子発現を可能にする有効量のリガンドと接触させることを含む方法。
  42. 【請求項４２】 細胞を培地中で増殖させ、該接触を培地へのリガンドの添
    加により行う、請求項40または41記載の方法。
  43. 【請求項４３】 細胞が宿主生体内に存在し、該接触を宿主生体へのリガン
    ドの投与により行う、請求項40または41記載の方法。
  44. 【請求項４４】 宿主生体が哺乳動物であり、リガンドを、適宜そのビヒク
    ル中で、経口、バッカル、舌下、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、または
    筋肉投与により投与する、請求項43記載の方法。
  45. 【請求項４５】 請求項12〜18のいずれかに記載の核酸組成物を宿主動物細
    胞内に導入することを含む、リガンドに応答性の動物細胞を提供する方法。
  46. 【請求項４６】 請求項12〜18のいずれかに記載の核酸組成物を、適宜の包
    装挿入物と一緒に含むキット。
  47. 【請求項４７】 該融合タンパク質と複合体形成できるリガンドをさらに含
    む、請求項46記載のキット。
  48. 【請求項４８】 多量体化アンタゴニストをさらに含む、請求項47記載のキ
    ット。
  49. 【請求項４９】 １または２以上のDNA 構築物が、異種ドメインの代わりに
    クローニング部位を含む、請求項46記載のキット。
  50. 【請求項５０】 標的遺伝子構築物が、標的遺伝子の代わりにクローニング
    部位を含む、請求項46記載のキット。
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