ES2254378T3 - Promotores hibridos inducibles por la inflamacion, vectores que los contienen y utilizaciones. - Google Patents

Promotores hibridos inducibles por la inflamacion, vectores que los contienen y utilizaciones.

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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
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Abstract

Promotor híbrido que contiene: a) un elemento de respuesta a un receptor activado por proliferador de peroxisomas PPAR que contiene uno o varios sitios de unión del PPAR y b) todo el promotor del gen humano de la Fosfolipasa A2 segregada no pancreática PLA2s o parte de éste que asegura una actividad transcripcional basal al promotor híbrido y un carácter regulable por los mediadores de la inflamación, en el cual el elemento (a) se sitúa secuencia arriba del promotor (b).

Description

Promotores híbridos inducibles por la inflamación, vectores que los contienen y utilizaciones.
Campo técnico
La presente invención se relaciona con el campo de la biología. Se relaciona especialmente con el campo de la regulación de la expresión de genes y, más particularmente, describe la puesta a punto y el desarrollo de un nuevo sistema de regulación farmacológica de la expresión de transgenes. La invención se basa especialmente en la utilización de construcciones que permiten activar la transcripción del transgén en células, tejidos u órganos en condición de inflamación. La invención describe así nuevas composiciones y construcciones para la regulación eficaz de la expresión de un ácido nucleico in vitro, ex vivo o in vivo, por ejemplo en las células condrocíticas. Las aplicaciones que derivan de la presente invención son numerosas en los campos experimentales, clínicos, terapéuticos o diagnósticos, por ejemplo.
Estado de la técnica anterior
El control del nivel y de la duración de la expresión de los transgenes es necesario para numerosas aplicaciones. Así, la terapia génica, la producción de proteínas recombinantes in vitro, la construcción de animales transgénicos, el estudio de los efectos de un gen o de la biodisponibilidad de una proteína, etc. son situaciones en las cuales se puede realizar un control apropiado de la expresión genética y aportar mejoras.
La terapia génica aspira más particularmente a la expresión de los genes (o ácido nucleicos) ya sean defectivos en un individuo dado, ya sean de interés terapéutico en el marco de una patología específica. La expresión de estos genes necesita, aparte de un procedimiento de vectorización, una inducción por un promotor que fije la ARN polimerasa y los factores de transcripción requeridos para obtener la síntesis de ARN mensajero y, por lo tanto, la síntesis proteica. Los promotores víricos o eucariotas no inducibles son frecuentemente utilizados en terapia génica para expresar un gen a nivel de un tejido. Aunque es fácil de realizar, esta aproximación no permite la regulación de la expresión del transgén en función del ambiente y de los estímulos externos. Además, el gen dirigido por un promotor vírico se expresará indiferentemente en todas las células en las cuales el vector haya penetrado, sin ninguna direccionalización. Finalmente, los experimentadores han chocado a veces con la debilidad de la expresión del promotor vírico in vivo con respecto a la constatada in vitro.
Se han conocido en la técnica anterior diferentes reguladores de transcripción artificiales, activados por una molécula xenobiótica, que se unen sobre las secuencias promotoras de la transcripción del transgén.
Se construyó una primera ilustración de estos reguladores por fusión del represor Lac de E. coli con el dominio transactivador de VP16 del virus herpes simplex (HSV). Existen dos versiones de estos reguladores, una que puede ser activada por el isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG) y la otra inactivada por el IPTG (Baim S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (1991), 5072-5076; Labow M. y col., Mol. Cell. Biol., 10 (1990), 3343-3356).
Se construyó otro sistema por fusión del represor Tet de E. coli con el dominio transactivador de VP16 de HSV. Existen igualmente dos versiones de estos reguladores, una que puede ser activada por la tetraciclina o sus derivados y la otra inactivada por estas mismas moléculas (Gossen M. y Bujard H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 5547-5551; Gossen M. y col., Science, 268 (1995), 1766-1769).
Se construyó otro sistema por fusión del dominio de unión al ADN de la proteína GAL4 de S. cerevisiae con el dominio de unión al ligando del receptor humano para la progesterona y el dominio transactivador de VP16 de HSV; esta versión es activada por un análogo de la progesterona, tal como el RU486 (Wang Y. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), 8180-8184). Se ha descrito igualmente una fusión del receptor para la ecdisona de Drosophila con el dominio transactivador de VP16 de HSV, activada por la ecdisona y los análogos de esta hormona esteroidea (No D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), 3346-3351). Otro sistema saca partido de la capacidad de ciertas moléculas inmunosupresoras (ciclosporina A, rapamicina y sus derivados) para promover la asociación de determinadas proteínas celulares. Se constituye entonces un regulador transcripcional de dos subunidades proteicas, la primera que puede formarse por fusión de un dominio de unión al ADN quimérico y de tres copias de la proteína humana FKBP y la segunda por fusión del dominio de unión a la rapamicina de la proteína humana FRAP y del dominio transactivador de la subunidad p65 del NFkB humano. Este regulador transcripcional es activado por la rapamicina, que permite la dimerización de las dos subunidades (Rivera V. y col., Nat. Med., 2 (1996), 1028-1032).
Couturier y col. JBC, Vol. 274, Nº 33 (1999), describen que el promotor de rata tipo II-s PLA2 es homólogo al elemento DR 1 del sitio de unión PPAR. WO 9821349 describe un cassette de expresión que contiene un elemento de respuesta a un PPAR y el promotor del gen humano de la apolipoproteína AII. Sin embargo, estas referencias no muestran la obtención de un promotor humano PLA 2 a partir de una construcción de PPAR secuencia arriba de éste.
Incluso si estos sistemas permiten obtener niveles de regulación satisfactorios en determinados tejidos, presentan, no obstante, ciertos inconvenientes que limitan sus condiciones de utilización. Así, estos reguladores transcripcionales son proteínas xenogénicas en el hombre. Están, en efecto, constituidas por fragmentos proteicos procedentes de bacterias, de virus, de levaduras o de insectos, o, cuando los dominios proteicos son de origen humano, su unión crea secuencias extrañas para el hombre. Estos dominios proteicos pueden, pues, inducir una reacción inmunitaria citotóxica, que conlleva la destrucción de las células que expresan el gen de interés bajo el control del regulador transcripcional xenogénico y de este modo la detención de la expresión del transgén. Esta situación puede imponer el recurso a administraciones repetidas del gen terapéutico, lo que constituye un inconveniente importante, especialmente cuando ello implica un acto quirúrgico traumático, y que no siempre resulta eficaz, especialmente cuando el vector del gen terapéutico es un virus cuya primera inyección provoca una reacción inmunitaria. Además, los niveles de expresión observados con los sistemas de regulación de la técnica anterior no siempre son satisfactorios.
La presente invención describe ahora un nuevo sistema mejorado para la expresión controlada de ácidos nucleicos en células. Esta invención propone un promotor híbrido inducible por los principales mediadores de la inflamación y por compuestos exógenos. Este promotor conduce preferiblemente la expresión de un gen a nivel del tejido asiento de una inflamación, en respuesta a los mediadores sintetizados en el curso del proceso inflamatorio. El interés principal de este promotor reside en la posibilidad de una expresión del gen-medicamento modulable en función de la intensidad de la inflamación. Además, la expresión del gen puede aumentar en caso de tomar AINE. Se trata, pues, de una aproximación transponible a numerosas situaciones inflamatorias para las cuales se contempla una terapia génica.
La presente invención se basa más particularmente en la construcción de un promotor híbrido que incluye un módulo de respuesta a los PPAR y un módulo de respuesta a las citokinas producidas en el curso de la inflamación. Este segundo módulo comprende más particularmente secuencias derivadas del promotor del gen de la fosfolipasa A2 segregada no pancreática (PLA2s) de tipo IIA-1, que se expresa en ciertas células humanas, especialmente en los condrocitos, en condiciones inflamatorias. La combinación de estos dos módulos permite generar un promotor que asegura una expresión específica de genes en condiciones de inflamación, expresión que puede verse aumentada por los mediadores o por medicamentos antiinflamatorios exógenos. Como se ilustrará en los ejemplos, este promotor híbrido posee preferiblemente una actividad basal débil, pero una actividad en condiciones de inducción muy elevada. Este tipo de promotor está, pues, particularmente adaptado a la expresión de productos que tienen una actividad antiinflamatoria, como se explicará con detalles en lo que sigue del texto. Los promotores de la invención son muy particularmente ventajosos para la expresión de genes en los tejidos articulares, especialmente los condrocitos, en diferentes situaciones patológicas en las cuales está presente un componente inflamatorio, y en particular en la artrosis.
La artrosis es una enfermedad del envejecimiento que se acompaña de destrucciones articulares que conllevan un grado variable de invalidez (Chevalier X., 1998). El tratamiento de esta patología es actualmente considerado como una prioridad en términos de salud pública por su frecuencia y por el handicap que provoca. En el plano fisiopatológico, incluso aunque los mecanismos de iniciación permanecen aún mal comprendidos, el blanco tisular responsable de la destrucción articular es el cartílago, tejido compuesto de una matriz extracelular rica en colágeno de tipo II y en proteoglicanos y condrocitos articulares, único tipo celular del cartílago, que son responsables de la síntesis de la matriz. Los condrocitos segregan igualmente factores de crecimiento e inhibidores naturales de proteasas (actividad anabólica), así como proteasas (actividad catabólica). Fisiológicamente, existe un equilibrio entre estas actividades (homeostasis cartilaginosa). En el curso de la artrosis, se asiste a un desequilibrio en detrimento de la actividad anabólica debido a la estimulación de la síntesis de proteasas (esencialmente de metaloproteasas) y a una inhibición de la síntesis de inhibidores de metaloproteasas (TIMP o "tissue inhibitor of metalloproteases") (Lefebvre V. y col., 1997; Dean J. y col., 1990; Hornebeck W., 1990). Estas modificaciones de síntesis se deben a la presencia de mediadores proinflamatorios producidos por los condrocitos y encontrados en grandes cantidades en los líquidos sinoviales de enfermos que sufren de artrosis o de poliartritis reumatoide, de las citokinas (IL-1, TNF) y de los mediadores lipídicos, en particular la prostaglandina E2. Esta prostaglandina estimula la síntesis de colágeno a baja concentración, como el factor de crecimiento, pero inhibe a alta concentración (Di Battista JA. y col., 1996).
La presente invención propone actualmente promotores transcripcionales híbridos que están particularmente adaptados a la expresión de genes terapéuticos en las patologías articulares, como la artrosis. Además, la invención describe igualmente construcciones que aseguran una direccionalización del transfecto y/o de la expresión de un gen de interés a los condrocitos, mejorando aún las propiedades ventajosas de las construcciones para este tipo de aplicaciones.
La invención reside más particularmente en un promotor híbrido que contiene:
a)
un elemento de respuesta a un PPAR que tiene uno o varios sitios de unión al PPAR y
b)
la totalidad del promotor del gen Humano de la fosfolipasa A2 segregado no pancreático PLA2S o parte de éste, asegurando una actividad transcripcional basal al promotor híbrido y un carácter regulable por los mediadores de la inflamación, en donde el elemento (a) está situado secuencia arriba del elemento (b).
La presente invención se basa especialmente en la puesta en evidencia de que este tipo de construcción produce un efecto sinérgico sobre la actividad de expresión, sin alterar el carácter regulado y específico (o preferencial) de las situaciones inflamatorias. La invención describe igualmente vectores, plásmidos y composiciones que contienen estos promotores para la expresión de genes in vitro, ex vivo o in vivo.
El primer elemento de los promotores híbridos de la invención incluye, pues, un elemento de respuesta a un PPAR. Los PPAR ("Peroxisome Proliferator-Activated Receptors") pertenecen a la superfamilia de los receptores nucleares, que comprende los receptores de hormonas esteroideas, los receptores de hormonas tiroideas, del ácido retinoico y de la vitamina D (Schoonjans K. y col., 1996). Los PPAR existen bajo tres isoformas: el PPAR\alpha, el PPAR\beta y el PPAR\gamma. Los PPAR se unen a secuencias específicas a nivel de los promotores de genes diana (secuencias PPRE) e inducen la expresión de estos genes.
Un elemento de respuesta a un PPAR (PPRE, "Peroxysome Proliferator Response Element") es, pues, una región de ácido nucleico capaz de fijar un PPAR, pudiendo entonces la unión del PPAR mediar en una señal hacia regiones nucleicas próximas, especialmente las regiones derivadas de PLA2s según la invención. Un elemento de respuesta a un PPAR según la invención es más particularmente una región de ácido nucleico capaz de unir un PPAR, ya se trate de un PPAR\alpha, \beta o \gamma. Se trata aún más preferiblemente de un ácido nucleico capaz de unir un PPAR\alpha o un PPAR\gamma. Para la práctica de la invención, el elemento de respuesta a un PPAR incluye más particularmente uno o varios sitios de unión del PPAR. Tales sitios de unión han sido descritos en la técnica anterior, como, por ejemplo, en diferentes promotores humanos (sitio consenso DR1, gen de la apoliproproteína AII, por ejemplo). Dichos sitios pueden también ser construidos artificialmente y estudiados en cuanto a sus propiedades de PPRE, como se describe a continuación.
En un modo particular de realización de la invención, el elemento de respuesta a un PPAR incluye uno o varios sitios de secuencia CAAAACTAGGTCAAAGGTCA (SEC ID Nº: 1) o de variantes funcionales de esta secuencia. La secuencia SEC ID Nº: 1 corresponde a la región consenso DR1.
El término variante funcional se refiere a cualquier secuencia modificada que conserve las propiedades de PPRE, tales como las antes mencionadas, es decir, especialmente la capacidad de unir un PPAR. La modificaciones pueden incluir una o varias adiciones, mutaciones, deleciones y/o substituciones de nucleótidos en la secuencia considerada. Estas modificaciones pueden ser introducidas por los métodos clásicos de la biología molecular, tales como especialmente la mutagénesis dirigida o, de una manera más práctica, por síntesis artificial de la secuencia en un sintetizador. En general, las variantes conservan al menos un 50% de los residuos de la secuencia inicial indicada. Más preferiblemente, las variantes poseen modificaciones que afectan a menos de 8 nucleótidos en la secuencia considerada. Las variantes así obtenidas son luego estudiadas en cuanto a su actividad de PPRE. Esta propiedad puede ser verificada de diferentes maneras, y especialmente:
(i)
por contacto de la secuencia de ensayo con un PPAR (por ejemplo, en una prueba acelular) y detección de la formación de un complejo (por ejemplo, por retraso de la migración en gel);
(ii)
por inserción de la secuencia de ensayo en un cassette de expresión que contenga un promotor mínimo y un gen informador, introducción del cassette en una célula y detección (según sea el caso, dosificación) de la expresión del gen informador en presencia y en ausencia de un PPAR y de un ligando de un PPAR;
(iii)
por cualquier otra técnica conocida por el experto en este campo que permita evidenciar la interacción entre un ácido nucleico y una proteína, por ejemplo.
Una variante es considerada como funcional en el sentido de la presente invención cuando la actividad medida, por ejemplo en (ii) anterior, es preferiblemente al menos igual al 50% de la medida con un sitio de secuencia SEC ID Nº: 1, más preferiblemente al menos igual al 75%. Se describen variantes funcionales de sitios de unión de PPAR en el sentido de la invención, por ejemplo, en Juge-Aubry y col. (J. Biol. Chem., 272 (1997), 25252) y en Nakshatri y col. (NAR, 26 (1998), 2491).
Se representan ejemplos específicos de elementos de respuesta a un PPAR según la invención mediante los elementos (DR1)2 17 (SEC ID Nº: 2), (DR1)2 21 (SEC ID Nº: 3) y (DR1)2 31 (SEC ID Nº: 4), tales como los descritos en los ejemplos, o variantes funcionales de éstos.
Otra variante es un fragmento de la secuencia SEC ID Nº: 1, que comprende los residuos 8-20 de ésta.
Las secuencias SEC ID Nº: 1-4 según la invención representan PPRE que responden esencialmente a los PPAR\alpha y \gamma. Como se ilustra en los ejemplos, estas secuencias poseen una fuerte inducibilidad por los PPAR, ligada especialmente al arreglo particular de los sitios de unión. En este sentido, un objeto particular de la invención reside igualmente en un ácido nucleico que contiene una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº: 2-4.
Según otro modo particular de realización, el elemento de respuesta a un PPAR incluye uno o varios sitios J del promotor de la apoAII humana (nucleótidos -734 a -716) o variantes funcionales de esta secuencia, que responde a la activación por los PPAR\beta.
Como se ha indicado antes, en las composiciones según la invención el elemento de respuesta al PPAR puede incluir varios sitios de unión a un PPAR. Puede tratarse de una repetición de un mismo sitio, o de combinaciones de sitios diferentes, siendo preferida la repetición de sitios idénticos. Más particularmente, el elemento de respuesta incluye hasta 30 sitios de unión, preferiblemente de 3 a 20, más preferiblemente de 1 a 5. Un modo de realización preferido de la invención es una construcción que tiene 2 sitios de unión DR1, mostrando los resultados presentados en los ejemplos las propiedades ventajosas de tales construcciones en términos de inducción y de niveles de expresión, especialmente en las células condrocíticas (SEC ID Nº: 2-4).
Para la realización de un promotor híbrido según la invención, el elemento (a) de respuesta a un PPAR se asocia a todo o parte del promotor PLA2s IIA-1 (elemento (b)).
La fosfolipasa A2 segregada no pancreática es una proteína activada por la interleukina 1 beta y conduce a la producción de mediadores inflamatorios, especialmente de mediadores lipídicos (prostaglandina E2). En particular, la prostaglandina PGE2 procede de la activación por la interleukina-1 (IL-1) de la fosfolipasa A_{2} segregada no pancreática (PLA_{2}s) (Nevalainen TJ y col., 1993; Hulkower KJ, 1997), que libera el ácido araquidónico de los fosfolípidos, y de la ciclooxigenasa inducible (COX-2) (Amin AR, 1997; Geng Y. y col., 1995; Knott y col., 1994); esta última convierte el ácido araquidónico en PGH2. La PGH2 se convierte después en PGE2 por la PGE sintasa. Se han evidenciado dos tipos de fosfolipasas A_{2} en las células humanas, especialmente en los condrocitos. La fosfolipasa A_{2} segregada no pancreática (PLA_{2}s) es una proteína de 14 kDa abundantemente sintetizada y segregada en los líquidos sinoviales inflamatorios (Seilhamer JJ y col., 1989). La fosfolipasa A_{2} citosólica (PLA_{2}c) es una proteína citosólica de 85 kDa cuya activación pasa por su fosforilación por las MAP kinasas y su translocación a la membrana (Clark JD y col., 1991). La IL-1 induce la expresión de los genes COX-2 y PLA_{2}s sin afectar a la del gen PLA_{2}c en los condrocitos (Berenbaum F. y col., 1994; Jacques C. y col., 1997). Las razones de PLA_{2} segregadas en la articulación y en el suero guardan correlación con el grado de inflamación, especialmente el grado de la artrosis en el caso de los condrocitos (Pruzanski W. y col., 1994; Lin M. y col., 1996). La cooperación entre la PLA2s y la COX-2 desemboca en una producción prolongada (>48 horas) de la prostaglandina PGE2 bajo la estimulación de la IL-1\beta (Bingham CO y col., 1996; Kuwata H. y col., 1998), mientras que la PLA2c y la ciclooxigenasa constitutiva COX-1 serían responsables de una respuesta precoz. En nuestros anteriores trabajos, se había mostrado una correlación entre la síntesis de PGE2 y la razón de actividad de PLA_{2}s ligada a las membranas condrocitarias (Jacques C. y col.,
1997).
La presente invención propone actualmente composiciones que contienen todo o parte del promotor del gen PLA2s para regular la expresión de ácidos nucleicos de interés en composiciones terapéuticas especialmente. La invención propone especialmente composiciones que contienen todo o partes funcionales del promotor PLA2s IIA para la construcción de un promotor híbrido regulado activo en las células que presentan una situación inflamatoria. En este sentido, los solicitantes han mostrado que un fragmento de 247 pares de bases secuencia arriba del primer exón del gen humano de la PLA2s IIA (SEC ID Nº: 5) era responsable de una estimulación de 6 a 8 veces la actividad del gen informador CAT por la IL-1\beta en los condrocitos de conejo en cultivo primario. Se han caracterizado tres regiones reguladoras en este promotor: la región proximal (-85/-114) asegura una actividad transcripcional basal y une el factor Sp1; la región distal (-247/-210) une miembros de la familia NF1 y el receptor a los glucocorticoides, que estabilizan la fijación de los factores C/EBP entre las posiciones -198/-190 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. La familia de los factores C/EBP lleva tres miembros activadores principales C/EBP\alpha, C/EBP\beta y C/EBP\delta. Los factores C/EBP\beta y C/EBP\delta son activados a nivel transcripcional y post-transcripcional por las citokinas pro-inflamatorias. Se expresan en los condrocitos, mientras que C/EBP_{\alpha} no. C/EBP_{\beta} y C/EBP\delta son responsables de la activación de la transcripción del gen de la sPLA2-IIA por la IL-1\beta. Los solicitantes han mostrado ahora que intervienen igualmente de forma crítica en la inducción de la transcripción del gen de la COX-2 por la IL-1\beta en los condrocitos humanos y de conejo.
En un modo particular de realización, el elemento b) de los promotores híbridos de la invención comprende toda o parte de la secuencia SEC ID Nº: 5 o de un derivado funcional de ésta. La secuencia SEC ID Nº. 5 corresponde a los nucleótidos -247 a +20 del gen humano de la PLA2s IIA (residuos 5 a 271).
El término "parte" designa más particularmente cualquier fragmento de la secuencia considerada que conserve una funcionalidad biológica. Se trata más en particular de una parte que asegura una actividad transcripcional basal al promotor híbrido (caja TATA, por ejemplo) y un carácter regulable por los mediadores inflamatorios, especialmente por la interleukina-1\beta.
En este contexto, una variante preferida de la invención se relaciona con un promotor híbrido que tiene al menos una parte del promotor PLA2s IIA que confiere la inducción por interleukina-1\beta.
Más concretamente, el elemento (b) de un promotor híbrido según la invención puede comprender las secuencias siguientes:
-
al menos los residuos 51 a 61 de la SEC ID Nº: 5 (correspondientes aproximadamente a los residuos -200/-191 del gen PLA2 IIA humano), implicados en la regulación por la IL1, y/o
-
al menos los residuos 23 a 32 de la SEC ID Nº: 5 (correspondientes aproximadamente a los residuos -229/-220 del gen PLA2s IIA humano), que representan un medio sitio NF1 y un medio sitio GRE (estas secuencias están implicadas en la regulación por ciertos compuestos, como la dexametasona, y/o
-
al menos los residuos 148 a 155 de la SEC ID Nº: 5 (correspondientes aproximadamente a los residuos -104/-97 del gen PLA2s IIA humano), implicados en la unión de Sp1, y/o
-
al menos los residuos 5 a 170 de la SEC ID Nº: 5 (correspondientes aproximadamente a los residuos -247/-85 del gen PLA2s IIA humano), o también
-
al menos los residuos 51 a 170 de la SEC ID Nº: 5 (correspondientes aproximadamente a los residuos -200/-85 del gen PLA2s IIA humano).
Un ejemplo específico de promotor híbrido contiene un elemento de respuesta al PPAR (DR1)2 21 unido al fragmento -247/+20 del gen PLA2s IIA. Dicho promotor lleva la secuencia SEC ID Nº: 6, que es también un objeto particular de la presente invención. En esta secuencia, el elemento PPRE corresponde esencialmente a los residuos 13-53 y el elemento PLA2s a los residuos 62-332. Los residuos 1-12 y 54-61 corresponden a regiones neutras en el plano funcional, resultantes de etapas de clonación y que permiten modificar la estructura del promotor (sitios de clonación).
Bien entendido, pueden intervenir variaciones de secuencia en las regiones consideradas, sin afectar de manera substancial a la actividad transcripcional del promotor híbrido de la invención (mutaciones, deleciones, substituciones, inserciones, etc.), especialmente sobre una a cinco bases. Se entiende que tales variaciones representan modos de realización específicos de la presente invención.
El elemento de respuesta al PPAR (PPRE) y la región derivada de PLA2s IIA son arreglados de manera funcional en el promotor híbrido de la invención, es decir, de forma que el promotor híbrido ejerza una actividad transcripcional en presencia de mediadores inflamatorios, preferiblemente regulada por el elemento PPRE.
Preferiblemente, el elemento a) está situado secuencia arriba (en 5') del elemento (b) en el promotor híbrido (véase la figura 1). Esta configuración permite, en efecto, asegurar un nivel de expresión elevado y regulado en las células en presencia de mediadores inflamatorios (LTB4) y/o de activadores de PPAR.
Los diferentes dominios funcionales anteriores pueden estar directamente unidos los unos a los otros o separados por, o asociados a, nucleótidos que no afecten significativamente al carácter regulado del promotor. Tales nucleótidos pueden ser residuos neutros en el plano funcional, resultantes, por ejemplo, de etapas de clonación (extremos PCR, sitios de restricción, etc.). Estos nucleótidos pueden también poseer propiedades biológicas, que permiten conferir características o rendimientos mejorados al sistema de la invención (amplificador de genes de menaje, amplificador de tejidos específicos, silenciador, intrón, sitio de ayustamiento, etc.). En este sentido, en un modo de realización particular de la invención, el promotor híbrido contiene además un elemento c) que confiere una especificidad tisular. Este elemento c) puede localizarse entre los elementos a) y b) o secuencia abajo (3') del elemento b). El término "especificidad tisular" designa una expresión preferencial o mayoritaria en un (tipo) de células dado, sin, no obstante, excluir totalmente una expresión residual o menos importante en otras células.
Un objeto particular de la invención reside más específicamente en un promotor transcripcional híbrido que incluye, en la orientación 5' \rightarrow 3':
a)
un elemento de respuesta a un PPAR\alpha y/o \gamma, que comprende preferiblemente toda o parte de una secuencia SEC ID Nº: 1 a 4,
b)
toda o parte de la secuencia SEC ID Nº: 5 y
c)
según sea el caso, un elemento que confiere una especificidad tisular.
En una aplicación particular, el elemento c) confiere una especificidad de expresión para las células condrocíticas y especialmente comprende toda o parte de la secuencia SEC ID Nº: 7 o de una variante de ésta. Este tipo de promotor está particularmente adaptado a la expresión regulada y selectiva de ácidos nucleicos en los condrocitos, especialmente en situación inflamatoria (artrosis).
La matriz cartilaginosa está constituida por un gran número de proteínas colagénicas y no colagénicas. Ciertos genes que codifican para proteínas de esta matriz son expresados específicamente por el condrocito, como los genes del colágeno de tipo II, del agrecano, de la matrilina-1 (o "cartilage matrix protein") y de la condroadherina. Estas dos últimas proteínas interaccionan específicamente con las integrinas sintetizadas por los condrocitos y son responsables de un anclaje de la célula a los otros componentes de la matriz (Makihira S. y col., 1999; Camper L. y col, 1997). La expresión de los genes del colágeno de tipo II y del agrecano han sido abundantemente citados en la literatura como marcadores positivos de la diferenciación condrocitaria, mientras que la síntesis del colágeno de tipo I señala un fenómeno de desdiferenciación (Benya P. y col., 1986). El grupo del Pr de Crombrugghe ha identificado una secuencia de 18 pares de bases necesaria y suficiente para dirigir la expresión del colágeno de tipo II en los condrocitos. Esta secuencia fija un factor nuclear (SOX9), que estaría además implicado en la diferenciación condrocitaria (Mukhopadhyay K. y col., 1995; Zhou G. y col., 1995). Este factor se colocaliza con la expresión del Colágeno de tipo II en los condrocitos primarios. Se une a la secuencia CATTCAT a nivel del promotor del gen de colágeno de tipo II y activa su transcripción.
Para que el gen de interés se exprese no ya solamente de manera inducible, sino también específicamente en el condrocito, pueden estar integrados elementos del promotor del colágeno de tipo II capaces de fijar los factores SOX (SOX9, SOX6 y L-SOX5) (Mukhopadhyay K. y col., 1995; Zhou G. y col., 1995; Lefebvre V. y col., 1997). Se puede utilizar una secuencia nucleotídica descrita por Zhou y col. (1995) y Lefebvre V. y col. (1997) formada por un duplicado de 231 pb del primer intrón del colágeno de tipo II. Esta construcción demuestra ser la más eficaz en el sistema. Puede ser insertada secuencia abajo de la construcción híbrida (DR1)2 21 -promotor de la sPLA2 IIA, incluyendo sitios de ayustamiento donante (SD) y aceptor (SA) de una y otra parte, todo ello con el fin de constituir un primer intrón sintético a continuación del primer exón de 20 partes de bases no traducidas del gen de la sPLA2-IIA, como se representa esquemáticamente en la figura 7A. La inserción de un primer intrón facilita, en general, la expresión del transgén situado secuencia abajo. Esta inserción permitiría por una parte restringir y, por otra, amplificar la expresión del transgén en los condrocitos gracias a la presencia del sitio para el factor SOX9. En otra construcción, la secuencia que contiene los sitios de unión de los factores SOX como promotor puede ser insertada antes que los sitios de unión de los PPARs, como se representa esquemáticamente en la figura 7B.
Otro objeto de la invención se relaciona con cualquier ácido nucleico que contenga un promotor híbrido tal como se ha definido anteriormente y un gen de interés. El gen de interés puede ser cualquier ácido nucleico (ADNc, ADNg, ADN sintético o semisintético, ARN, etc.) de origen diverso (animal, humano, vegetal, bacteriano, vírico, artificial, etc.) codificante de un producto de interés (ARN, polipéptido o péptido). Se trata ventajosamente de un ácido nucleico codificante de un producto antiinflamatorio, es decir, de un producto capaz de restaurar o de reducir los fenómenos inflamatorios en una célula, tejido u órgano. Entre los productos antiinflamatorios, se pueden citar especialmente el TIMP u otras citokinas o enzimas capaces de reducir el fenómeno de inflamación. El producto de interés puede ser, de forma más general, cualquier enzima, hormona, factor de crecimiento, anticuerpo, péptido inmunogénico, lipoproteína, toxina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, antisentido, factor de transcripción, etc. de interés terapéutico o
vacunal.
El gen de interés está generalmente situado secuencia abajo (3') del promotor híbrido, bajo el control transcripcional de éste. Así, un ácido nucleico preferido en el sentido de la invención comprende, en la orientación 5' \rightarrow 3':
a)
un elemento de respuesta a un PPAR\alpha y/o \gamma, que comprende preferiblemente toda o parte de una secuencia SEC ID Nº: 1 a 4,
b)
toda o parte de la secuencia SEC ID Nº: 5,
c)
según sea el caso, un elemento que confiere una especificidad tisular y
d)
un gen codificante de un producto de interés, especialmente terapéutico o vacunal.
Otro objeto de la invención reside en un vector que consiste en un promotor híbrido o un ácido nucleico tales como los definidos anteriormente. El vector puede ser de naturaleza y/o de origen variados, especialmente plasmídico, episómico, cromosómico, vírico, fágico, etc. Preferiblemente, el vector es un plásmido o un virus recombinante, más preferiblemente un plásmido.
Como ejemplo de vector vírico, se pueden citar especialmente un adenovirus recombinante, un retrovirus recombinante, un AAV, un herpes virus, un virus de la vaccinia, etc., cuya preparación puede ser realizada según los métodos conocidos por el experto en la técnica.
En cuanto a los plásmidos, se puede mencionar cualquier plásmido replicativo o integrante, compatible con una utilización en las células de mamíferos, especialmente humanas.
Otro objeto de la invención reside en una composición que contiene un ácido nucleico o un vector tal como se ha definido antes. La composición puede contener además cualquier vehículo aceptable para una administración in vivo o ex vivo de estas construcciones (especialmente cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable) y/o para una conservación estable de éstas. Como vehículo, se pueden citar especialmente soluciones salinas tamponadas, isotónicas, que contengan eventualmente aditivos tales como polímeros o proteínas de alto peso molecular. Además, las composiciones de la invención pueden incluir agentes que faciliten la penetración de las construcciones genéticas de la invención en las células. Se pueden citar especialmente lípidos, polímeros, péptidos, etc. que permitan mejorar la transfección celular.
A este efecto una composición particular según la invención contiene uno o varios lípidos policatiónicos, eventualmente copulados a polímeros policatiónicos. Este tipo de formulación está particularmente adaptada a la transfección de genes en los condrocitos, que están rodeados por una matriz rica en proteoglicanos cargados negativamente. Pueden integrarse, pues, lípidos policatiónicos fácilmente en esta matriz. La asociación de polímeros policatiónicos como la PEI (polietilenimina) que incluyen aminas incompletamente protonables a pH fisiológico permite aumentar la eficacia de la transfección de los condrocitos. Estas aminas funcionan como una esponja de protones para las propiedades endosomolíticas. El conjunto constituido por lípidos catiónicos, PEI y plásmido portador del transgén constituye una composición particular preferida en el marco de la presente invención.
Por otra parte, las composiciones de la invención pueden también llevar uno o varios elementos de abordaje, que permiten asegurar una transfección preferencial hacia tipos celulares deseados. En este contexto, los elementos de abordaje pueden estar constituidos por ligandos de receptores específicos, por receptores de ligandos, por anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, etc.
Para dirigirse hacia las células condrocíticas, una composición preferida en el sentido de la invención incluye además una o varias moléculas que poseen una afinidad por la membrana condrocitaria. Entre estas proteínas, se pueden mencionar especialmente la proteína Condroadherina, que interacciona con una buena afinidad con la integrina alfa2 beta1 de los condrocitos (Camper L. y col., 1997). Se trata de una pequeña proteína de 36 kDa rica en leucina. Esta proteína puede ser producida (por ejemplo, en un baculovirus recombinante), purificada e incorporada a una composición (especialmente un liposoma) de la invención. La hidrofobicidad de la proteína puede aumentar además por asociación de una secuencia de farnesilación en el extremo C como el extremo Q-Ras4B (Leevers SJ y col., 1994; Stokoe D. y col., 1994; Zlatkine y col., 1997).
Se entiende que se puede contemplar cualquier otro elemento de abordaje según las aplicaciones buscadas.
Además, otro objeto de la invención reside aún en una composición que contiene (i) un ácido nucleico o un vector tales como los definidos anteriormente y (ii) un activador de PPAR para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo.
Como se ha indicado anteriormente, los promotores híbridos llevan un elemento de respuesta a un PPAR. Este PPAR puede liberarse (o inducirse) en las células, por ejemplo en situación inflamatoria, o también en presencia de activadores exógenos (es decir, añadidos o administrados). En este contexto, la expresión "en vistas a una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo" indica que el vector y el activador pueden ser preparados por separado, acondicionados por separado y utilizados secuencialmente para permitir el control de la expresión del ácido nucleico de interés. Típicamente, el vector y el activador son acondicionados por separado y utilizados de manera espaciada en el tiempo, conduciendo la combinación de estos diferentes elementos en una célula, un tejido o un órgano al efecto de regulación o de amplificación de expresión buscado.
Según el promotor híbrido o las aplicaciones buscadas, se pueden utilizar diferentes tipos de ligandos, naturales o sintéticos. Así, puede tratarse preferiblemente de un activador de PPAR\gamma y/o de un activador de PPAR\beta y/o de un activador de PPAR\alpha.
Los ligandos activadores de los PPAR\gamma pueden ser seleccionados entre los ligandos naturales y sintéticos. Como ligandos naturales, se pueden mencionar los ácidos grasos y los eicasonoides (por ejemplo, el ácido linoleico, el ácido linolénico, el 9-HODE, el 5-HODE) y, como ligandos sintéticos, se pueden mencionar las tiazolidinadionas, tales como especialmente la rosiglitazona (BRL49653), la pioglitazona o la troglitazona (véanse, por ejemplo, Krey G. y col., Mol. Endocrinol., 11 (1997), 779-791, o Kliewer S. y Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev., 8 (1998), 576-581), el compuesto RG12525 ó la 15-dioxi-\Delta12-14 PGJ2.
Los ligandos activadores de los PPAR\alpha son, por ejemplo, los fibratos, tales como el ácido fíbrico y sus análogos. Como análogos del ácido fíbrico, se pueden mencionar especialmente el gemfibrozilo (Atherosclerosis 114(1) (1995), 61), el bezafibrato (Hepatology 21 (1995), 1025), el ciprofibrato (BCE&M 9(4) (1995), 825), el clofibrato (Drug Safety 11 (1994), 301), el fenofibrato (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), el clinofibrato (Kidney International, 44(6) (1993), 1352), el ácido piriníxico (Wy-14,643), el ácido 5,8,11,14-eicosatetranoico (ETYA) o los agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como el ibuprofeno y la indometacina. Estos diferentes compuestos son compatibles con una utilización biológica y/o farmacológica in vitro o in vivo.
Además, las composiciones según la invención pueden llevar varios activadores de PPAR en asociación, y en particular un fibrato o un análogo de fibrato asociado a un retinoide.
Estos diferentes ligandos pueden ser utilizados a dosis convencionales, descritas en la técnica anterior e ilustradas en los ejemplos.
Las composiciones según la invención pueden ser formuladas en todo tipo de material adaptado, tal como tubo, ampolla, bolsa, frasco, jeringa, etc., y conservadas en frío (o congeladas) o en forma liofilizada.
La invención puede ser utilizada para expresar un gen en diferentes tipos de células, de tejidos o de órganos, in vitro o ex vivo. En particular, puede tratarse de una célula, de un tejido o de un órgano de mamífero, preferiblemente humano, en particular en estado inflamatorio. A título ilustrativo, se pueden citar las células condrocíticas (o de la matriz ósea), musculares (o un músculo), hepáticas (o el hígado), cardíacas (o el corazón, la pared arterial o vascular), nerviosas (o el cerebro, la médula, etc.) o tumorales (o un tumor).
Preferiblemente, las construcciones, las composiciones y el procedimiento de la invención son utilizados para la expresión regulada de un ácido nucleico en una célula condrocítica in vitro o ex vivo. Los resultados presentados en los ejemplos ilustran más particularmente las ventajas de la invención in vivo o in vitro en este tipo de células.
La invención se relaciona igualmente con la utilización de un vector tal como se ha definido anteriormente para la preparación de una composición destinada a inducir la expresión de un gen en un tejido en situación inflamatoria. Se relaciona también con una composición para la expresión de un gen en un tejido en situación inflamatoria, que incluye un vector o una composición anterior.
Ventajosamente, se trata de una composición para la expresión de un gen en un condrocito.
La invención se relaciona también con ácidos nucleicos, vectores o composiciones como los anteriores para el tratamiento de la artrosis.
Para una utilización in vitro o ex vivo, las células pueden ser puestas en contacto con las composiciones o vectores de la invención según diferentes protocolos. Así, las células en cultivo pueden ser incubadas directamente con los vectores o composiciones de la invención, por ejemplo con un vector que lleva el promotor híbrido y un gen de interés, según sea el caso en presencia del activador. De manera alternativa, las células pueden ser incubadas en un primer tiempo con el vector o ácido nucleico y después, en un segundo tiempo (tras el cultivo y eventualmente la selección de las células modificadas), se puede añadir el activador. Estos experimentos pueden ser realizados en cualquier dispositivo y medio apropiados, preferiblemente en placa, caja o frasco, en condiciones estériles. Las cantidades de células, vector y ligando pueden ser fácilmente adaptadas por el experto en la técnica en base a las informaciones proporcionadas en los ejemplos y a sus conocimientos generales.
Las células (u órganos, tejidos, etc.) son puestas en contacto por administración de los ácidos nucleicos, vectores o composiciones de manera simultánea, separada o espaciada en el tiempo. A este efecto, los vectores, composiciones o ácidos nucleicos están generalmente en forma administrable por vía parenteral, en particular intramuscular, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intraósea, intraarticular o estereotáxica. La elección puede estar guiada por la aplicación contemplada, el tejido abordado y/o el tipo de producto de interés codificado por el transgén.
Las composiciones de la invención pueden incluir cualquier agente que favorezca la transfección celular (polímero catiónico, lípido, etc.)
El activador es administrable antes, simultáneamente o después de los vectores o ácidos nucleicos. A este respecto, el ligando es administrable por vía oral, anal, intravenosa, intraperitoneal, intraocular o intramuscular, por ejemplo.
Las dosis utilizadas pueden ser adaptadas por el experto en la técnica en base a los datos in vivo publicados en la literatura. Así, por ejemplo, para una forma no soluble en agua, las dosis típicas de ligando, tal como BRL 49653, están comprendidas entre 5 y 50 mg/kg, por ejemplo 30 mg/kg, que permiten obtener una concentración plasmática próxima a 15 \mug/ml aproximadamente, al menos. Para una forma hidrosoluble de ligando, cuya biodisponibilidad es mayor (por ejemplo, una sal de maleato del BRL49653), las dosis típicas son más bajas, generalmente inferiores a 5 mg/kg, por ejemplo de 0,01 a 1 mg/kg. Estas dosis pueden muy evidentemente ser adaptadas por el experto en la técnica en función de las construcciones utilizadas, de los ligandos utilizados y de las aplicaciones y efectos buscados. Además, se pueden realizar administraciones repetidas de ligando.
De forma general, las dosis de vector utilizadas pueden variar entre 0,01 y 1.000 \mug o más, según las aplicaciones buscadas.
En un experimento típico, un vector según la invención es administrable por vía local (directamente en el tejido afectado, por ejemplo el asiento de la inflamación, especialmente por vía intraarticular) en presencia de un agente de transfección. Bajo el efecto de los mediadores liberados por las células (PG2, IL1, LTB4, etc.), se observa una expresión del gen de interés, que puede ser estimulada o amplificada por uno o varios ligandos de los PPAR, tales como los definidos anteriormente, o en presencia de los PPAR endógenos.
Así, la liberación de ácido araquidónico y de otros ácidos grasos por las fosfolipasas A_{2} conduce a la síntesis de otros icosanoides y mediadores lipídicos. Estos mediadores activan los factores de transcripción de los PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors). Estos factores son también activados por ciertos medicamentos, como los fibratos hipolipemiantes, las tiazolidinadionas utilizadas en la diabetes y los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (Lehmann JM y col., 1997). Los condrocitos expresan los factores PPAR\alpha y PPAR\gamma (Bordji y col., J. Biol. Chem., en impresión). Los icosanoides (derivados del ácido araquidónico) como las prostaglandinas (PGE2, PGJ2) inducen el PPAR\gamma (Kliewer SA y col., 1995; Krey G. y col., 1997); en particular, la prostaglandina 15-dioxi-\Delta12-14 PGJ2 es el activador más potente de PPAR\gamma. El leucotrieno LTB4 y los fibratos activan el PPAR\alpha (Devchand RP y col., 1996) y los ácidos grasos largos activan las dos isoformas PPAR\alpha y \gamma.
Los resultados presentados en los ejemplos ilustran las propiedades sinérgicas de los promotores híbridos en presencia de dos señales activadoras.
La invención se relaciona también con cualquier célula modificada por contacto con una composición o un vector tal como se ha definido anteriormente, especialmente cualquier célula de mamífero, en particular humano, más específicamente condrocitos.
La invención se relaciona también con diferentes fragmentos del promotor PLA2s tales como los descritos anteriormente, que son utilizables, por ejemplo, para conferir un carácter regulable a promotores.
La presente invención será descrita con más detalle con ayuda de los ejemplos que siguen, que han de ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Representación esquemática de un promotor híbrido de la invención que controla la expresión del TIMP1.
Figura 2: Análisis de unión por retraso sobre gel. Las secuencias DR1, (DR1)2 17, (DR1)2 21 y (DR1)2 31 radiomarcadas son incubadas con 5 ó 10 \mul de extractos Cos-1 enriquecidos en PPAR\gamma y RXR. Las bandas 1, 4, 7 y 10 corresponden a 5 \mul y las bandas 2, 5, 8 y 11 a 10 \mul de extractos. Las bandas 3, 6, 9 y 12 corresponden a 10 \mul de extractos Cos-1 no transfectados.
Figura 3: Cuantificación de la radiactividad obtenida en las bandas diméricas y tetraméricas y en la sonda libre (PPAR\gamma).
Figura 4: Cuantificación de la radiactividad obtenida en las bandas diméricas y tetraméricas y en la sonda libre (PPAR\alpha).
Figura 5: Efecto de la PGJ2 (inductor del PPAR\gamma) y del Wy-14643 (inductor del PPAR\alpha) sobre los promotores sintéticos.
Figura 6: Se transfectaron los condrocitos de conejo con el plásmido que contiene el elemento (DR1)2 21-(-247/+20)sPLA2-CAT. Se añadieron los diferentes inductores antes citados al medio de cultivo.
Figuras 7A y 7B: Representación esquemática de construcciones en las cuales se integraron elementos del promotor del colágeno de tipo II capaces de fijar los factores SOX, respectivamente, secuencia abajo y secuencia arriba de la construcción híbrida (DR1)2 21-promotor de la sPLA2 IIA.
Descripción detallada de la invención Materiales y métodos 1- Cultivos celulares y transfecciones
Se disecan y cortan las extremidades anteriores y posteriores de conejos prepúberes (Fauve de Bourgogne) de 3 semanas en condiciones estériles. Se retira el cartílago con el escalpelo y se disocian luego los condrocitos gracias a las enzimas proteolíticas: hialuronidasa al 0,05% durante 15 minutos, tripsina al 0,25% durante 30 minutos y colagenasa al 0,2% durante 90 minutos. Finalmente, se añade el medio HAM's F12 durante 60 minutos. Se cultiva la suspensión de condrocitos en placas de 6 cm de diámetro (150.000 células por placa) en presencia de un medio HAM's F12 que contenía un 10% de suero de ternera fetal. En estas condiciones, los condrocitos tienen un fenotipo diferenciado, como demuestra la producción de colágeno de tipo II.
Cuando las células alcanzan la pre-confluencia (6 a 7 días), se transfectan con las diferentes construcciones utilizando el método de fosfato de calcio.
2- Medida de las actividades CAT y \beta-galactosidasa
Se mide la actividad CAT según la técnica de doble fase líquida según Desbois y col. (1992). Se mide la actividad \beta-galactosidasa con el fin de normalizar las variaciones de la eficacia de transfección.
3- Preparación de las proteínas nucleares y experimentos de retraso en la electroforesis
Se transfectan las células Cos-1 (fibroblastos de riñón de mono transformados) según la técnica de fosfato de calcio antes citada utilizando 20 \mug de los vectores de expresión del PPAR\gamma, PPAR\alpha o RXR. Células Cos-1 no transfectadas servirán como control. A las 48 horas de la transfección, se incuban las células con un tampón que contiene KCl (0,45 M), Tris-HCl (20 mM, pH=7,5) y 10% de glicerol. Se desprenden por raspado y se rompen después enfriando a -80ºC y descongelando a 37ºC. Se centrifugan entonces estas células a 15.000 rpm durante 10 minutos y a 4ºC. Se congela luego el sobrenadante a - 80ºC y se utiliza para los experimentos de retraso sobre gel.
4- Experimentos de retraso sobre gel
Se radiomarcan las secuencias DR1, (DR1)2 17, (DR1)2 21 y (DR1)2 31 gracias al fragmento Klenow de la ADN polimerasa utilizando dCTP \alpha ^{32}P. Se incuban 100.000 cpm (0,4 ng) de las sondas radiomarcadas durante 30 minutos y a 4ºC con cantidades crecientes de extractos Cos-1 enriquecidos en PPAR o RXR (como se indica en las leyendas de las figuras) y con un tampón de unión específica (KCl 100 mM, Hepes 40 mM, pH 7,5, NP40 al 0,1%, ZnCl_{2} 0,5 mM, PEG al 8%). Se deposita entonces la mezcla sobre un gel de acrilamida/bisacrilamida (5%, TBE 0,25X) y se hace que migre durante 2 horas 30 minutos a 200 voltios. Se seca entonces el gel y se autorradiografía.
5- Biología molecular
Los métodos clásicamente utilizados en biología molecular, tales como las extracciones preparatorias de ADN plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis en gel de agarosa, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, la precipitación de ADN plasmídico en medio salino por etanol o isopropanol y la transformación en Escherichia coli son bien conocidos por el experto en la técnica y están abundantemente descritos en la literatura (Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Los plásmidos son de origen comercial.
La amplificación enzimática de fragmentos de ADN por la técnica de ACP (Amplificación en Cadena por Polimerasa) puede ser efectuada utilizando un DNA Thermal Cycler™ (Perkin Elmer Cetus) según las recomendaciones del fabricante.
La electroporación de ADN plasmídico en células de Escherichia coli puede ser realizada con ayuda de un electroporador (Bio-Rad) según las recomendaciones del fabricante.
La verificación de las secuencias nucleotídicas puede ser efectuada por el método desarrollado por Sanger y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467) utilizando el kit distribuido por Applied Biosystems según las recomendaciones del fabricante.
Ejemplos
En la parte experimental que sigue se han descrito la construcción y la utilización de varios promotores híbridos de la invención, que tienen un elemento inducible especialmente por la IL-1\beta y un elemento inducible por los icosanoides, los ácidos grasos y los antiinflamatorios no esteroideos (AINE).
El primer módulo lleva especialmente la región [-247; +20] (con respecto al sitio de iniciación de la transcripción de la sPLA2). Esta región contiene la caja TATA y el elemento proximal (-114/-85), que es indispensable para la actividad transcripcional y que se une al factor ubicuo Sp1. Lleva también el sitio C/EBP (-198/-190) indispensable para la estimulación por la IL-1\beta y el elemento [-247/-210], que amplifica la actividad de los factores C/EBP. Además este módulo contiene un elemento de respuesta a los glucocorticoides capaz de relevar una inducción por estas hormonas.
La adición del segundo módulo pretende amplificar la inducción en el proceso inflamatorio por los mediadores derivados de los ácidos grasos producidos por la inflamación (prostaglandinas, leucotrienos) o por compuestos exógenos (fibrato, medicamentos antiinflamatorios no esteroideos - AINE). Este módulo lleva un elemento de respuesta a los PPAR (PPRE) situado secuencia arriba del primer módulo.
Ejemplo 1 Construcción de elementos de respuesta a los PPAR
Este ejemplo describe la construcción y el análisis funcional de varios elementos de respuesta a los PPAR, utilizables en los promotores híbridos de la invención.
1- Elaboración de una unidad de respuesta a los PPAR de alta afinidad
Con el fin de obtener una inducción óptima por los ligandos del PPAR, se han ideado y sintetizado varias organizaciones de multímeros de PPRE. A continuación, se da la secuencia de estas regiones.
El elemento DR1 es el sitio consenso de unión del heterodímero PPAR/RXR. Los elementos (DR1)2 17, (DR1)2 21 y (DR1)2 31 están formados por dos DR1 separados de centro a centro por 17, 21 y 31 pares de bases, respectivamente.
1
2- Experimentos de unión 2-1 Unión de PPAR\gamma
Con el fin de verificar el carácter funcional y la eficacia de las regiones PPRE anteriores, se realizaron experimentos de retraso sobre gel, consistentes en estudiar la unión entre una de las cuatro secuencias anteriores, previamente radiomarcada, en presencia de cantidades crecientes (5 y 10 \mul) de proteínas PPAR\gamma y RXR preparadas en células Cos-1 (razón PPAR\gamma/RXR = 3:1). En la Figura 2 se presentan los resultados obtenidos.
Estos resultados muestran que las secuencias construidas unen el heterodímero PPAR/RXR. La secuencia DR1 une un complejo dimérico, mientras que la secuencias (DR1)2 17, (DR1)2 21 y (DR1) 2 31 unen el complejo dimérico, pero también un complejo retardado, de alto peso molecular, que correspondería a un doble heterodímero PPAR/RXR. Además, las cantidades de los complejos diméricos y de alto peso molecular son variables de una secuencia a otra. Esto sugiere que las tres secuencias unen con una cooperatividad diferente los complejos RXR/PPAR\gamma.
Con el fin de saber si los complejos observados provienen de la producción de PPAR\gamma y de RXR en células Cos-1, o bien de proteínas presentes en estas células, se incubaron estas diferentes secuencias con extractos de Cos-1 no transfectadas (10 \mul). La intensidad de los complejos formados con estos extractos es muy débil, lo que está a favor de la producción de proteínas PPAR\gamma y RXR tras la transfección de las células (Fig. 2).
Con el fin de estudiar la cooperatividad de unión del PPAR/RXR sobre estas diferentes secuencias, se realizaron experimentos de retraso sobre gel poniendo cantidades crecientes de extractos Cos-1 enriquecidos en PPAR y RXR (1 \mul a 10 \mul) y cuantificación después de la radiactividad obtenida. La formación del primer dímero PPAR/RXR se caracteriza por la constante de disociación KdII; la del doble dímero, o tetrámero, se caracteriza por la constante de disociación KdIV. La razón KdII/KdIV (R) es el reflejo de la cooperatividad de unión si es superior a
1.
Los diferentes complejos diméricos y tetraméricos y la sonda libre fueron cuantificados gracias a un Phosphorimager y representados en la figura 3. Las razones de cooperatividad fueron calculadas gracias a la fórmula antes citada. Las secuencias (DR1)2 17 y (DR1) 2 31 unen tanto la forma dimérica como la tetramérica. Las razones de cooperatividad son de 9 y 12,6, respectivamente. Sin embargo, la secuencia (DR1)2 21 presenta un perfil de unión diferente. La forma dimérica no forma más que un 20% de la unión total, mientras que la forma tetramérica forma un 80% de la unión total. La razón de cooperatividad es de 34 +/- 11.
El conjunto de estos resultados muestra que las tres secuencias utilizadas unen de manera cooperativa el PPAR y el RXR. La secuencia que presenta la mejor cooperatividad de unión es el (DR1)2 21.
2-2 Unión de PPAR\alpha
Se realizaron experimentos similares con el PPAR\alpha. El vector de expresión de la isoforma \alpha del PPAR fue transfectado en células Cos-1. Se prepararon extractos totales de estas últimas como se ha descrito en el capítulo de materiales y métodos. Se realizaron experimentos de retraso sobre gel utilizando las cuatro secuencias radiomarcadas y cantidades crecientes de los extractos Cos-1 enriquecidos en PPAR\alpha y de RXR (razón 3/1). Se cortaron las bandas correspondientes a las formas diméricas (D) y tetraméricas (T) o a la sonda libre (S) del gel y se cuantificaron después por un recuento en un contador de centelleo beta (Figura 4). Se aplicó el modelo termodinámico antes descrito con el fin de calcular las razones de cooperatividad de unión del heterodímero PPAR\alpha/RXR a las diferentes secuencias
estudiadas.
A diferencia de lo observado con el PPAR\gamma, las razones de cooperatividad obtenidas con las secuencias (DR1)2 21 y (DR1)2 31 son equivalentes (R = 11,2 y 11,6, respectivamente). La razón de cooperatividad obtenida en el caso del elemento (DR1)2 17 es inferior a las dos anteriores (R = 7). También en este caso, las tres secuencias sintetizadas se unen de manera cooperativa al PPAR\alpha, presentando las secuencias (DR1)2 21 y (DR1)2 31 la mejor cooperatividad de unión.
Ejemplo 2 Construcción y análisis funcional de un vector que contiene un promotor híbrido
Este ejemplo describe la construcción de plásmidos que contienen un promotor híbrido de la invención y demuestra sus propiedades de inducción por diferentes mediadores de la inflamación.
1- Construcción de los plásmidos y ensayos funcionales
Se subclonó el fragmento -247/+20 del promotor de la sPLA2 IIA (SEC ID Nº: 5) secuencia arriba del vector informador CAT del plásmido PUC-SH-CAT. Secuencia arriba de este promotor, se insertaron las diferentes secuencias de PPRE citadas anteriormente (SEC ID Nº: 1-4).
Se transfectaron entonces los condrocitos de conejo por las construcciones CAT que contenían las diferentes disposiciones de PPRE (DR1) colocadas secuencia arriba del promotor mínimo de la sPLA2-IIA. Se añadieron entonces la 15-desoxi-\Delta^{12-14}-PGJ2 (10 \muM) (activadora del PPAR\gamma) o el Wy-14643 (200 \muM) (activador del PPAR\alpha) al medio de cultivo durante 24 horas. Los resultados obtenidos son presentados en la Figura 5.
Los resultados muestran que el promotor mínimo (-247/+20) de la sPLA2-IIA, que no contiene sitios PPRE conocidos, no se activa por la PGJ2 o por el Wy 14643. Sin embargo, las diferentes disposiciones de DR1 se activan a diferentes niveles por los inductores del PPAR\gamma o del PPAR\alpha. Se las puede clasificar en el orden creciente siguiente: DR1 < (DR1)_{2 \ 17} = (DR1)_{2 \ 31} < (DR1)_{2 \ 21} en el caso del PPAR\gamma. Comparando los resultados de unión con los resultados funcionales, se observa que la secuencia (DR1)2 21, que tiene la mejor cooperatividad de unión, presenta la mejor sinergia funcional.
En el caso del PPAR\alpha, el orden de inducibilidad por el Wy-14643 es diferente del establecido en el caso de la PGJ2. DR1 < (DR1)_{2 \ 21} < (DR1)_{2 \ 17} < (DR1)_{2 \ 31}. Los experimentos de retraso sobre gel no están en perfecto acuerdo con los experimentos de transfección transitoria. Los experimentos de unión mostraron que las secuencias (DR1)_{2 \ 21} y (DR1)_{2 \ 31} se unen con la misma cooperatividad al PPAR\alpha (R=11), mientras que la secuencia (DR1)_{2 \ 17} presenta una cooperatividad de unión menos importante (R=7).
2- Efectos combinados de la IL-1, de los glucocorticoides y de los inductores de PPAR\alpha (fibratos) y PPAR\gamma (15-dioxi-\Delta12-14-PGJ2) sobre el promotor sintético
Se transfectaron entonces condrocitos de conejo, ya fuera con el promotor mínimo de la sPLA2-IIA, ya fuera con la secuencia (DR1)_{2 \ 21} situada secuencia arriba de este último (promotor híbrido). La PGJ2 (10 \muM) y/o la IL-1 (10 ng/ml) son añadidas al medio de cultivo.
Los resultados obtenidos muestran que la IL-1 induce el promotor de la sPLA2-IIA aproximadamente 6 veces. La prostaglandina J2 o el Wy-14643 no tienen efecto sobre este promotor. En el caso de la construcción (DR1)2 21-(-247/+20) sPLA2-CAT, la IL-1 y la PGJ2 inducen este promotor 4 veces. Los dos productos combinados tienen un efecto sinérgico (inducción con respecto a la actividad basal de 13 veces) (Fig. 6).
Se realizó este mismo tipo de experimento con el Wy-14643. Este compuesto es un inductor específico del PPAR\alpha. El Wy-14643 (200 \muM) activa la transcripción de la construcción (DR1)2 21-(-247/+20) sPLA2-CAT en aproximadamente 3 a 4 veces. El efecto de la IL-1 y del Wy-14643 combinados es sinérgico (inducción de 20
veces).
El efecto de la dexametasona fue además estudiado sobre el promotor sintético (-247/+20)-(DR1)2 21-CAT, sola o combinada con el Wy-14643, la PGJ2 o la IL-1. La dexametasona activa la transcripción de este promotor en aproximadamente 6 veces. Estos resultados muestran que los glucocorticoides circulantes, como el cortisol, o administrados en un tratamiento pueden activar este promotor híbrido.
Se estudió igualmente el efecto de ciertos medicamentos antiinflamatorios no esteroideos, como la indometacina o el ibuprofeno, sobre los promotores sintéticos. Los resultados obtenidos muestran que la indometacina (10^{-4} M) activa aproximadamente cinco veces la construcción (DR1)2 21-(-247/+20)-CAT, mientras que el ibuprofeno (10^{-4} M) activa 17 veces este promotor.
Finalmente, se compararon los niveles de actividades transcripcionales alcanzadas por un promotor vírico, como el promotor RSV ("Rous Sarcoma Virus") y el del promotor sintético. La actividad transcripcional basal del promotor sintético es baja; es inferior al 5% de la actividad del promotor vírico RSV. Tras la inducción por los diferentes efectores, el promotor sintético presenta un nivel de actividad transcripcional que alcanza el 40% de el del RSV (resultados no mostrados). El promotor construido según la presente invención se caracteriza, pues, por una actividad transcripcional inducida alta comparable a los vectores víricos utilizados actualmente en terapia génica y una actividad basal baja.
Conclusiones
Se han puesto a punto promotores sintéticos híbridos inducibles por los componentes de la inflamación, es decir, por las citokinas proinflamatorias, como la IL-1\beta, así como por los ácidos grasos proinflamatorios, como las prostaglandinas o los leucotrienos. Además, los glucocorticoides, circulantes o administrados localmente, así como los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos, como el ibuprofeno o la indometacina, son capaces de activar la transcripción de estos promotores. Estos promotores constituyen, pues, un medio eficaz de modular la actividad de genes en función de la toma o no de un tratamiento antinflamatorio. Estas características permiten contemplar un efecto controlable (on/off) sobre la síntesis del gen-medicamento. Es importante hacer notar que este promotor sintético presenta una actividad basal muy débil, mientras que tiene una actividad transcripcional inducida por los estímulos endógenos o exógenos de una eficacia comparable a los vectores víricos.
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<110> AVENTIS PHARMA S.A.
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<120> PROMOTORES HÍBRIDOS
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<130> PPAR INFLAMACIÓN
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<140>
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<141>
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: elemento PPRE
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<400> 1
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caaaactagg tcaaaggtca 
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<210> 2
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: elemento PPRE
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<400> 2
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38 
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<210> 3
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<211> 41
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: elemento
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caaaactagg tcaaaggtca tcaaaactag gtcaaaggtc a 
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<211> 52
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: elemento PPRE
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento del promotor PLA2s
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 332
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial/promotor híbrido PPRE/PLA2s
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<400> 6
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3 
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<210> 7
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<211> 944
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia que confiere la especificidad de expresión
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<400> 7
4

Claims (16)

1. Promotor híbrido que contiene:
a)
un elemento de respuesta a un receptor activado por proliferador de peroxisomas PPAR que contiene uno o varios sitios de unión del PPAR y
b)
todo el promotor del gen humano de la Fosfolipasa A2 segregada no pancreática PLA2s o parte de éste que asegura una actividad transcripcional basal al promotor híbrido y un carácter regulable por los mediadores de la inflamación, en el cual el elemento (a) se sitúa secuencia arriba del promotor (b).
2. Promotor según la reivindicación 1, caracterizado por incluir el elemento (a) de respuesta a un PPAR uno o varios sitios de secuencia SEC ID Nº: 1 o de variantes funcionales de esta secuencia.
3. Promotor según la reivindicación 2, caracterizado por incluir el elemento (a) de respuesta a un PPAR la secuencia SEC ID Nº: 1, 2, 3 ó 4 un una variante funcional de éstas.
4. Promotor según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por incluir el elemento b) toda o parte de la secuencia SEC ID Nº: 5.
5. Promotor según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por incluir el elemento b) al menos una parte del promotor PLA2S que confiere la inducción por la interleukina-1\beta.
6. Promotor según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por comprender el elemento (b) al menos los residuos 51 a 61 de la SEC ID Nº: 5.
7. Promotor según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por comprender el elemento (b) al menos los residuos 5 a 170 de la SEC ID Nº: 5.
8. Promotor según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por comprender el elemento (b) al menos los residuos 51 a 170 de la SEC ID Nº: 5.
9. Promotor según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por estar situado el elemento a) secuencia arriba del elemento (b).
10. Promotor según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por llevar además un elemento c) que confiere una especificidad tisular.
11. Promotor según la reivindicación 10, caracterizado por conferir el elemento c) una especificidad para las células condrocíticas y especialmente por comprender toda o parte de la secuencia SEC ID Nº: 7 o de una variante de ésta.
12. Ácido nucleico que contiene un promotor híbrido según una de las reivindicaciones 1 a 11 y un gen de interés.
13. Ácido nucleico según la reivindicación 12, caracterizado por ser el gen de interés un gen codificante para un producto antiinflamatorio.
14. Vector que contiene un promotor híbrido según una de las reivindicaciones 1 a 11 o un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 12 ó 13.
15. Vector según la reivindicación 14, caracterizado por tratarse de un plásmido.
16. Utilización del ácido nucleico según la reivindicación 12 ó 13 ó del vector según la reivindicación 14 ó 15 para la preparación de una composición útil para el tratamiento de la artrosis.
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