KR20230042535A - 염증-유도된 골 손실에 대한 신규 유전자 치료제의 개발 - Google Patents

염증-유도된 골 손실에 대한 신규 유전자 치료제의 개발 Download PDF

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KR20230042535A
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Abstract

본 개시내용의 측면은 염증을 감소시키고/거나 골 손실 (예를 들어, 염증에 의해 유도된 골 손실)을 억제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 트랜스진: 슈누리 3 (SHN3)을 표적화하는 억제 핵산, 카텝신 K (CTSK)를 표적화하는 억제 핵산, 스클레로스틴 (SOST)을 표적화하는 억제 핵산, NF-κβ의 수용체 활성화제 (RANK)를 표적화하는 억제 핵산, NF-κβ 리간드의 수용체 활성화제 (RANKL)를 표적화하는 억제 핵산, 가용성 TNF-α 수용체 2 (sTNFR2), 및 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα) 중 1종 이상을 코딩하는 단리된 핵산 및 발현 구축물 (예를 들어, rAAV 등)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 조성물은 염증과 연관된 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 (RA)을 치료하는 데 유용하다.

Description

염증-유도된 골 손실에 대한 신규 유전자 치료제의 개발
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2020년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/067,581의 출원일의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
EFS-웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 7월 22일에 생성된 ASCII 파일은 U012070145WO00-SEQ-SXT로 명명되고, 크기가 41,435 바이트이다.
염증성 관절염, 예컨대 류마티스 관절염 (RA) 상황에서, 염증은 파골세포 (OC)를 활성화시켜 골을 재흡수하면서 동시에 골모세포 (OB)가 골을 구축하는 능력을 억제한다. RA를 갖는 환자는 국소 관절 골 미란 및 전신성 골 손실이 발생하여 골감소증/골다공증이 유발된다. 골 손실을 제어하는 대부분의 기존 치료제는 파골세포 (OC)에 의한 골 흡수를 억제함으로써 작용하지만, 이는 부작용, 예컨대 비정형 골절 및 턱의 골괴사를 동반한다.
본 개시내용의 측면은 염증을 감소시키고/거나 골 손실 (예를 들어, 염증에 의해 유도된 골 손실)을 억제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은, 부분적으로, 염증 및 골 파괴를 동시에 억제할 수 있고, 비-표적 조직에서의 부작용은 제한하면서 염증성 관절염에서 염증이 고도로 활성인 영역에서 골 손상의 치유를 촉진할 수 있는, 1개 이상의 트랜스진, 예컨대 억제 핵산 또는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 및 발현 구축물을 기초로 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 조성물은 특정 염증성 질환 또는 상태, 예를 들어 류마티스 관절염 (RA)을 치료하는 데 유용하다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK), NF-κβ의 수용체 활성화제 (RANK), 및/또는 RANK 리간드 (RANKL)를 표적화하는 1종 이상의 억제 핵산을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 파골세포 (OC)-특이적 프로모터 또는 골모세포 (OB)-특이적 프로모터를 포함하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 치료 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 마커 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 가용성 인간 종양 괴사 인자 알파 수용체 2 (sTNRF2), 가용성 IL-1 수용체 알파 (sIL1Rα), 또는 sTNRF2 및 sIL1Rα를 포함한다.
일부 실시양태에서, OC-특이적 프로모터는 NF-κβ 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, OC-특이적 프로모터는 RANK 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, NF-κβ 프로모터는 염증에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, NF-κβ 프로모터는 PB2 프로모터 (서열식별번호(SEQ ID NO): 3)이다. 일부 실시양태에서, OB-특이적 프로모터는 오스테오칼신 (OCN) 프로모터 (예를 들어, 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같음)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종은 shRNA, miRNA, 또는 인공 miRNA (ami-RNA)이다. 일부 실시양태에서, ami-RNA는 마우스 miRNA 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA 백본은 인간 miR-33 백본이다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 억제 핵산은 SHN3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 서열식별번호: 8-11 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 억제 핵산은 CTSK를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 서열식별번호: 20-25 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 억제 핵산은 SOST를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 서열식별번호: 26-31 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 억제 핵산은 RANK를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 억제 핵산은 RANKL을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 서열식별번호: 12-19 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제1 억제 핵산; 및 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 트랜스진을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 제1 억제 핵산 또는 제2 억제 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CB) 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 CMV 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 대상체에서 염증 (예를 들어, 대상체에서 염증성 시토카인의 발현 또는 방출)에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 PB2 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 단백질을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 치료 단백질이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 가용성 인간 종양 괴사 인자 알파 수용체 2 (sTNRF2), 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα), 또는 sTNRF2 및 sIL1Rα를 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 1개 이상의 miRNA 결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA 결합 부위 중 적어도 1개는 miR-1 결합 부위 또는 miR-122 결합 부위이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 바크미드, 코스미드, 바이러스, 폐쇄형-말단 선형 DNA (ceDNA), 또는 바큘로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산; 및 적어도 1종의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV2-TM, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6-TM, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh39, AAV.43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, 및 AAV2/2-125로부터 선택된 혈청형의 것, 또는 상기 중 임의의 것의 변이체이다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 골모 세포 (OB)를 형질도입하며, 임의로 여기서 캡시드 단백질은 AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAVrh10, AAVrh39로부터 선택된 혈청형의 것, 또는 상기 중 임의의 것의 변이체이다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 파골 세포 (OC)를 형질도입하며, 임의로 여기서 캡시드 단백질은 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV.rh39, 및 AAV.rh43로부터 선택된 혈청형의 것, 또는 상기 중 임의의 것의 변이체이다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 DSS.AAV9 (서열식별번호: 41) 캡시드 단백질이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 골 손실을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 관절에서 염증을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 염증성 상태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심된다. 일부 실시양태에서, 염증성 상태는 류마티스 관절염 (RA)이다.
일부 실시양태에서, 대상체에게의 투여는 주사에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 주사는 전신 주사 (예를 들어, 정맥내 주사 등) 또는 국부 주사 (예를 들어, 근육내 (IM) 주사, 무릎 주사, 및 대퇴 수질내 주사 등)이다. 일부 실시양태에서, 전신 주사는 정맥내 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 국부 주사는 근육내 (IM) 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 국부 주사는 무릎 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 국부 주사는 대퇴 수질내 주사를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에게의 투여는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 포함하는 조직 또는 이식편의 대상체 내로의 이식에 의해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 투여는 대상체에서 염증성 시토카인의 감소 및/또는 골 손실의 감소를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 투여는 활성 오스테오칼신-발현 골모세포의 감소를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 투여는 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP)-발현 파골세포의 증가를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 투여는 유형 I 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드 (Ctx-I)의 증가를 발생시킨다.
도 1a-1f는 골수-유래 기질 세포 (BSMC) 및 섬유모세포-유사 활막세포 (FLS)에서의 SHN3 발현 및 기능을 보여준다. 도 1a는 RA 환자의 혈청에서의 SHN3 mRNA의 상승된 수준을 보여준다. 도 1b는 커들란 주사 3일 후에, 3-개월령 암컷 SKG 마우스의 혈청, 활막, 및 경골로부터 총 RNA를 단리한 것을 보여준다. 도 1c-1f는 TNF, IL-17A, 또는 TNF 및 IL-17A 둘 다로 4시간 자극한 후에, 인간 BMSC, 마우스 BMSC, 마우스 COB 및 마우스 FLS로부터 총 RNA를 단리한 것을 보여준다. SHN3 (HIVEP3) mRNA를 qPCR에 의해 측정하고, HPRT mRNA에 대해 정규화하였다. NS: 유의성 없음, *: P<0.05, **: P<0.005, ***: P.0.0005.
도 2a-2e는 RA 환자의 활막에서의 SHN3 (HIVEP3)의 상향조절된 발현을 보여준다. 도 2a-2b는 비처리된 초기 RA 환자로부터의 활막의 전체 조직 트랜스크립톰 분석을 보여준다. 관절 생검에서의 초음파 활막 두께 점수와의 상관관계 (도 2a) 및 관절 종창과의 상관관계 (도 2b). 도 2c는 전체 트랜스크립톰 분석에 적용된, 백혈구-풍부 또는 백혈구-부족 RA를 갖는 인간 환자의 활막 또는 건강한 활막으로부터 T 세포, B 세포, 섬유모세포, 및 단핵구를 FACS (형광-활성화 세포 분류) 분류한 것을 보여준다. 도 2d-2e는 단일 세포 트랜스크립톰 분석이 RA 환자의 활막에서 SHN3 발현을 보여준다는 것을 보여준다. SC-F: CD45- 포도플라닌+ 서브라이닝 섬유모세포 (F1: CD34+, F2: HLA+, F3: DKK3+, F4: CD55+), SC-M: CD45+ CD14+ 단핵구 (M1: IL1B+, M2: NUPR1+, M3: C1QA+, M4: IFN-활성화).
도 3a-3e는 NF-κB 경로의 활성화가 SHN3 발현을 통한 골모세포 분화 (OBD)를 억제한다는 것을 보여준다. 도 3a는 인간 BMSC를 TNF 플러스 IL-17A로의 자극 4시간 전에 표시된 억제제로 처리한 것을 보여준다. 도 3b는 IKK의 구성적 활성 돌연변이체 (IKK-CA)가 골모세포에서 SHN3 발현을 상향조절한다는 것을 보여준다. IKK-CA 플록싱된 마우스로부터 수득된 두개 골모세포 (COB)를 렌티바이러스 발현 벡터 대조군 (WT) 또는 CRE 레콤비나제 (IKK-CA)로 감염시키고, 미분화 (UD) 또는 골형성 (OBD) 조건 하에 6일 동안 배양하였다. shn3 mRNA를 qPCR에 의해 측정하고, hprt mRNA에 대해 정규화하였다. 도 3c는 WT 및 IKK-CA COB 및 인간 BMSC 발현 벡터 또는 SHN3을 골형성 조건 하에 14일 동안 배양한 것을 보여준다. 무기질화 활성을 알리자린 레드 염색에 의해 측정하였다. 도 3d는 2-개월령 암컷 마우스 (n=5~6/군)의 대퇴골에서 총 부피당 지주 골 부피 (Tra. BV/TV)를 보여주는 마이크로CT 분석을 보여준다. 도 3e는 마우스 hivep3 (shn3) 유전자의 프로모터 영역의 다이어그램을 보여준다. TSS, 전사 개시 부위; iTSS, 내부 TSS.
도 4a-4d는 SHN3-결핍이 SKG 마우스 모델 (Shn3-/-SKG)에서 국부 및 전신 염증 둘 다에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다. 도 4a-4d는 커들란 처리 (i.p. 주사) 7주 후에 면역 세포의 침윤을 결정하기 위해 염증발생 발목 (도 4b)에서 조직학을 평가한 것을 보여준다. 염증발생 관절 내의 활막 세포 (도 4c) 및 비장세포 (도 4d)를 단리하고, 유동 세포측정 분석에 적용하였다 (n=5/군).
도 5a-5i는 SHN3-결핍이 SKG 마우스 모델에서 골 손실을 예방한다는 것을 보여준다. 도 5a는 3-개월령 암컷 마우스 (야생형, SKG, SHN3-/-, 또는 SKG:SHN3-/-)를 커들란으로 처리하고 (i.p. 주사), 7주 후에, 대퇴골에서 총 부피당 지주 골 부피 (BV/TV)를 마이크로CT에 의해 평가한 것을 보여준다. 3D 재구성 영상 및 상대 정량화를 표시하였다 (n=6/군). 도 5b-5c는 지주 골의 표면 상의 활성 OB를 입증하는 오스테오칼신에 대한 면역조직화학 분석을 보여주며 (도 5b), 상대 정량화를 표시하였다 (도 5c). 화살표는 오스테오칼신-발현 OB를 나타낸다. (n=3~5/군) (도 5b). 도 5g-5i는 마이크로CT (도 5g) 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 TRAP 염색을 사용한 조직학 (도 5h-5i) 분석을 보여준다. SKG 및 SKG:SHN3-/- 마우스 (n=6/군)의 염증발생 발목 내의 골 미란, 면역 세포의 침윤, 및 OC로부터의 보호가 관찰되었다. 화살표 (도 5g) 및 별표 (도 5h, 좌측)는 각각 국소 골 미란 영역 및 침윤 면역 세포를 나타낸다. NS: 유의성 없음, **: P≤0.01
도 6a-6d는 SHN3-결핍 OB가 RA의 K/BxN 혈청 전달 (STA) 모델에서 골 손실을 예방한다는 것을 보여준다. 도 6a는 2-개월령 암컷 SHN3 (f/f) 및 SHN3 (f/f);prx1 마우스를 K/BxN 혈청으로 처리하고 (i.p. 주사), 임상 관절 염증을 매일 측정한 것을 보여준다 (n=5). 혈청 전달 관절염 임상 점수화 (평균 임상 염증 점수 및 발목 두께의 변화)를 평가하였다. 도 6b-6c는 혈청 주사 10일 후, 관절 염증 및 발목에서의 관절 골 미란의 조직학적 분석이 SHN3 (f/f) 마우스와 비교하여 SHN3 (f/f);prx1 마우스에서 염증의 차이를 입증하지는 않았지만, SHN3 (f/f);prx1 마우스에서 관절 미란으로부터의 유의한 보호가 관찰되었음을 보여준다. 도 6d는 발목에서의 판누스 형성의 조직학적 분석이 TRAP+ OC에서 감소를 입증하였음을 보여준다 (상부). 대안적으로, 판누스에서의 오스테오칼신에 대한 면역조직화학은 OCN+ Ob에서 유의한 증가를 입증하였다 (하부).
도 7은 SHN3-결핍이 OB 분화의 TNF+IL-17A-유도된 억제를 보호한다는 것을 보여준다. 도 7a-7b는 인간 BMSC가 렌티바이러스 (벡터 단독 (대조군), SHN3 과다발현 (SHN3), 대조군-shRNA (Sh-con), 또는 SHN3 녹다운 (Sh-SHN3))로 감염되고, 골형성 조건 하에 14일 동안 배양된 것을 보여준다 (도 7a). 도 7b는 Sh-con 또는 Sh-SHN3을 발현하는 BMSC를 TNF 및 IL-17A의 부재 또는 존재 하에 14일 동안 배양한 것을 보여준다. 무기질화 활성을 알리자린 레드 염색에 의해 측정하였다. 도 7c는 P5 WT 및 SHN3-KO 새끼로부터 단리된 마우스 COB를 TNF 및 IL-17A의 부재 또는 존재 하에 배양한 것을 보여준다. 배양 14일 후에, 골형성 마커 유전자 발현 (Tnalp mRNA 수준 및 ibsp mRNA 수준)을 RT-PCR에 의해 측정하였고, 배양 21일 후에, 무기질화 활성을 알리자린 레드 염색에 의해 측정하였다. ns: 유의하지 않음, *: P<0.05, **: P≤0.01, ***: P≤0.001, ****: P≤0.0001.
도 8a-8d는 OB 계열 세포에서의 SHN3의 조건부 결실이 마우스에서 TNF-유도된 골 손실을 예방한다는 것을 보여준다. SHN3-플록싱된 마우스 (SHN3fl/fl)를 Prx1-cre 마우스와 교배하여 사지-특이적 중간엽에서 SHN3을 결실시키고 (SHN3prx1), 이들 마우스를 추가로 인간 TNF-α를 발현하는 마우스 (TNFtg)와 교배시켰다. 도 8a 및 8b (마이크로CT 분석)는 무릎 관절 (도 8a) 및 발목 (도 8b)에서 관절 골 미란이 SHN3(f/f);prx1;TNFtg 마우스에서는 보호되었지만, TNFtg 마우스는 중증 관절 골 미란을 나타내었고, 종종 15주령까지 약화되었음을 보여준다. 도 8c (조직학적 분석)는 발목에서의 골 미란이 SHN3의 부재 하에 현저하게 감소되었지만, 관절 염증은 TNFtg와 SHN3 (f/f);prx1;TNFtg 마우스 사이에서 대등하였음을 보여준다.
도 9a-9i는 TNF의 SHN3 하류의 ERK-매개 인산화를 보여준다. 도 9a-9b는 Flag-SHN3을 발현하는 C3H10T1/2 세포를 표시된 시점에 20 μg/ml의 TNF로 자극하고, 항-Flag (M2) 비드로 면역침전시키고, 항-포스포-세린/트레오닌 Ab로 이뮤노블롯팅한 것을 보여준다 (도 9a). 대안적으로, 세포를 TNF 자극 전에 MAPK 억제제로 처리하였다 (도 9b). 도 9c는 재조합 SHN3 (rSHN3)의 재조합 ERK2 (rERKs)-유도된 인산화를 보여주는 시험관내 키나제 검정을 보여준다. 도 9d는 마우스 SHN3의 BAS 도메인 내의 기능적 도메인 및 ERK-결합 부위 (백색 선) 및 ERK에 의해 매개된 5개의 인산화 부위 (S810/S811/T851/S911/S913)를 보여주는 다이어그램을 보여준다. 도 9e는 야생형 rSHN3 (SHN3-WT) 또는 rSHN3 돌연변이체 (SHN3-3KA, SHN3-5STA)를 사용한 재조합 SHN3의 ERK-매개 인산화를 보여주는 시험관내 키나제 검정을 보여준다. 도 9f 및 도 9g는 야생형 SHN3 또는 SHN3 돌연변이체가 야생형 및 SHN-KO BMSC에서 렌티바이러스-매개 전달을 통해 발현되었고, 골형성 조건 하에 배양되었음을 보여준다. 도 9h는 내인성 Shn3 유전자좌에서 3개의 리신의 알라닌으로의 치환을 입증하는 다이어그램을 보여준다. 도 9i는 2-개월령 암컷 마우스의 대퇴 골 질량을 마이크로CT에 의해 평가한 것을 보여준다 (n=6~8/군). Tb.BV/TV: 총 부피당 지주 골 부피, Tb. Th: 지주 두께, Tb. N: 지주 개수, Conn.Dn: 결합 밀도.
도 10a-10g는 SHN3의 AAV-매개 침묵화가 SKG 마우스 모델에서 골 손실을 예방한다는 것을 보여준다. 도 10a는 3-개월령 암컷 WT 및 SKG 마우스에게 커들란 주사 2주 전에 EGFP를 보유하는 골-표적화 DSS.rAAV9를 i.v. 주사하고, 3주 후에 동결절편화된 대퇴골 및 염증발생 발목에서의 AAV의 형질도입을 형광 현미경검사에 의해 평가한 것을 보여준다. 도 10b-g는 3-개월령 암컷 WT 및 SKG 마우스에게 커들란 주사 2주 전에 amiR-ctrl 또는 amiR-shn3을 보유하는 골-표적화 DSS.rAAV9를 i.v. 주사한 것을 보여준다. 경골에서의 shn3 mRNA 수준을 qPCR에 의해 평가하였다 (n=8/군) (도 10b). 도 10c는 관절 염증을 매주 측정한 것을 보여주며, 이는 국부 염증이 DSS.rAAV9에 의해 변경되지 않았음을 보여준다 (n=5-6/군). 도 10d-10e는 비장세포의 유동 세포측정 분석을 보여주며, 이는 전신 염증이 DSS.rAAV9에 의해 변경되지 않았음을 보여준다 (n=1~5/군). 도 10f-10g는 대퇴골에서의 지주 골 질량 및 염증발생 발목에서의 관절 골 미란을 마이크로CT 분석에 의해 평가한 것을 보여준다.
도 11a-11c는 카텝신 K (CTSK)의 골-표적화 AAV-매개 침묵이 SKG 마우스 모델에서 골 손실을 예방한다는 것을 보여준다. 3-개월령 암컷 WT 및 SKG 마우스에게 커들란 주사 2주 전에 amiR-ctrl 또는 amiR-CTSK를 보유하는 골-표적화 DSS.rAAV9를 i.v. 주사하였다 (n=5~8/군). 도 11a는 대퇴골에서의 지주 골 질량 및 피질 골 두께를 마이크로CT 분석에 의해 측정한 것을 보여준다. 대표적인 3D-재구축 (좌측) 및 상대적 정량화 (우측)를 나타낸다. 도 11b는 발의 대표적인 3D-재구축을 마이크로CT에 의해 나타낸 것을 보여준다. 화살표는 발목 및 발 상의 국소 골 미란을 나타낸다. 도 11c는 관절 염증을 매주 측정한 것을 보여주며, 이는 염증이 DSS.rAAV9 벡터로의 처리에 의해 변경되지 않는다는 것을 보여준다 (n=5~8/군).
도 12는 AAV 벡터 구축을 보여주는 개략적 다이어그램을 보여준다. AAV 게놈 벡터 구축물은 골-표적화 rAAV9 캡시드 (DSS.rAAV9) 내로 패키징될 것이다.
도 13a-13d는 트랜스진의 조직-특이적 miRNA-매개 억제를 갖는 조작된 rAAV9의 생성을 보여준다. 도 13a-13b는 egfp 트랜스진을 보유하는 rAAV 벡터의 4 x 1011 GC의 단일 용량을 2-개월령 수컷 마우스에게 i.v. 주사하고, 2주 후에, 전신 (도 13a) 및 개별 조직 (도 13b)에서의 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 영상화에 의해 평가한 것을 보여준다. 도 13c는 총 조직 RNA에서의 EGFP mRNA 수준을 qPCR에 의해 측정한 것을 보여준다. 도 13d는 동결절편화된 대퇴골에서의 EGFP 발현을 형광 현미경검사에 의해 평가한 것을 보여준다 (n=3/군, 축척 막대: 200μm).
도 14a-14b는 염증-반응성 rAAV9 벡터의 생성을 보여준다. 도 14a는 PB2 프로모터-구동된 EGFP 발현 카세트가 AAV 게놈 벡터 내로 클로닝된 것 (PB2-GFP)을 보여준다. 적색: NF-κB-결합 부위. 청색: 최소 FosP 부위. 볼드체: 제한 효소 부위. (서열식별번호: 3). 도 14b는 CD4/TLR4 플라스미드의 부재 또는 존재 하에 벡터로의 형질감염 1일 후, HEK293 세포를 표시된 염증유발 시토카인으로 자극한 것을 보여준다. EGFP 발현을 형광 현미경검사에 의해 가시화하였다.
도 15a-15b는 PB2-egfp 발현 OB 및 OC에서의 염증유발 시토카인에 의한 EGFP의 발현을 보여준다. 두개 골모세포 (COB) 또는 골수-유래 파골세포 (BM-OC)를 PBS (없음) 또는 rAAV9.PB2-egfp와 함께 2일 동안 인큐베이션하였다. 표시된 염증유발 시토카인으로의 처리 1일 후에, EGFP 발현을 형광 현미경검사 (도 15a) 및 항-GFP 항체를 사용한 이뮤노블롯팅 (도 15b)에 의해 평가하였다. 항-Hsp90 항체를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 축척 막대: 1 mm.
도 16a-16c는 염증성 관절염의 SKG 마우스 모델에서의 PB2-egfp-구동된 EGFP 발현을 보여준다. 도 16a는 단일 용량의 PBS 또는 4 x 1011 GC의 rAAV9.PB2-egfp를 2-개월령 수컷 마우스에게 i.v. 주사하고, 2주 후에, 마우스를 PBS 또는 커들란으로 i.p. 주사를 통해 처리한 것을 보여준다. 3주 후에, 전신 (좌측) 및 개별 조직 (우측)에서의 EGFP 발현을 IVIS-100 광학 영상화에 의해 평가하였다. 도 16b는 총 조직 RNA에서의 EGFP mRNA 수준을 qPCR에 의해 측정한 것을 보여준다. 도 16c는 동결절편화된 조직에서의 EGFP 발현을 형광 현미경검사에 의해 평가한 것을 보여준다 (축척 막대: 400 μm).
도 17은 RA의 마우스 모델에 대한 실험 설계를 보여준다.
도 18은 본 개시내용에 기재된 치료 AAV 벡터의 분자 메커니즘의 한 실시양태를 보여주는 개략적 다이어그램을 보여준다.
도 19는 CB 프로모터 또는 OC-특이적 또는 OB-특이적 프로모터를 포함하는 유전자 발현 구축물 (예를 들어, rAAV 벡터)의 실시양태를 도시한 개략도를 보여준다.
도 20은 OCN 프로모터가 성숙 골모세포에서 GFP 단백질을 발현시키는데 특이적인 한편, CB 및 RANK 프로모터는 성숙 골모세포 및 파골세포 둘 다에서 GFP 단백질을 발현시킨다는 것을 보여준다. 두개 골모세포 (COB) 또는 BM-OC를 PBS (없음) 또는 CB, OCN, RANK 프로모터에 의해 GFP 발현이 구동되는 rAAV9로 처리하고 2일 후, COB 및 BM-OC를 각각 골형성 및 파골세포형성 조건 하에 배양하였다. EGFP 발현을 형광 현미경검사에 의해 평가하였다.
도 21은 하기: SHN3, CTSK, RANKL, 및 SOST 중 1종 이상을 표적화하는 ami-RNA의 조합을 포함하는 유전자 발현 구축물 (예를 들어, rAAV 벡터)의 실시양태를 도시한 개략도를 보여준다.
본 개시내용의 측면은 특정 염증성 상태, 예를 들어 류마티스 관절염 (RA)을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은, 부분적으로, 대상체에서 염증을 억제하고/거나 (예를 들어, 염증성 시토카인의 효과를 감소시키고/거나) 염증으로 인한 골 손실을 감소시키는 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산, 벡터, rAAV 등)에 기초한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 파골세포 (OC) 또는 골모세포 (OB)를 특이적으로 표적화하는 1종 이상의 억제 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시토카인을 억제하는 1종 이상의 치료 단백질을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 조성물을 사용하여 염증성 상태, 예컨대 RA를 치료하는 방법에 관한 것이다.
단리된 핵산
트랜스진 (예를 들어 억제 RNA, 예컨대 shRNA, miRNA 등)을 대상체에게 전달하기 위한 조성물 및 방법이 본 개시내용에 제공된다. 조성물은 전형적으로 골 대사를 조정할 수 있는 트랜스진 (예를 들어, 단백질, 억제 핵산 등)을 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 트랜스진은 표적 단백질, 예컨대 골 형성을 촉진 또는 억제하는 것과 연관된 표적 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 표적 단백질, 예컨대 염증을 촉진하는 것과 연관된 표적 단백질 (예를 들어, 염증유발 시토카인 등)의 발현 또는 활성을 감소시킨다.
"골 대사"는 일반적으로 골 형성 및/또는 골 흡수를 수반하는 생물학적 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 골 대사는 골모세포 (OB) 및 최종-분화 골세포에 의해 생산되는 바와 같은 새로운 골의 형성, 및/또는 파골세포 (OC)에 의한 성숙 골 조직 재흡수를 수반한다. OB는 골수 유래 중간엽/기질 세포로부터 발생하며, 이는 궁극적으로 골세포로 최종 분화한다. OB (및 골세포) 기능 또는 활성은 골 형성, 골 무기질화, 및 OC 활성의 조절을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 감소된 골 질량은 OB 및/또는 골세포 기능 또는 활성의 억제로부터 발생되는 것으로 관찰되었다. 증가된 골 질량은 증가된 OB 및/또는 골세포 기능 또는 활성으로부터 발생되는 것으로 관찰되었다. OC는 골수-유래 단핵구로부터 발생하고, 일부 실시양태에서 OB로부터의 신호 및/또는 염증에 의해 제어되는 것으로 관찰되었다. OC 기능은 골 흡수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감소된 골 질량은 증가된 OC 활성으로부터 발생되는 것으로 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 증가된 골 질량은 OC 활성의 억제로부터 발생되는 것으로 관찰되었다. 본 개시내용은, 부분적으로, 특정 OB- 또는 OC-발현 단백질 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등)을 표적화하는 억제 핵산이 염증유발 시토카인의 존재 하에서도 대상체에서 염증-유도된 골 손실을 감소시킬 수 있다는 인식에 기초한다. 골 대사를 조정하는 유전자 생성물을 코딩하는 조성물은, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO2019/183605에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 1종 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종, 또는 그 초과)의 억제 핵산, 예를 들어 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 인공 마이크로RNA (ami-RNA) 등을 코딩한다. 일반적으로, 억제 핵산은 골 대사와 연관된 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질) (예를 들어, SOST, SHN3, CTSK, RANK, RANKL 등)을 코딩하는 유전자의 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과)의 연속 염기에 특이적으로 결합한다 (예를 들어, 혼성화한다). 본원에 사용된 "연속 염기"는 (예를 들어, 핵산 분자의 일부로서) 서로 (예를 들어, 1개 이상의 포스포디에스테르 결합 등에 의해) 공유 결합된 2개 이상의 뉴클레오티드 염기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 억제 핵산은 골 대사와 연관된 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질) (예를 들어, SOST, SHN3, CTSK, RANK, RANKL 등)을 코딩하는 유전자의 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과)의 연속 뉴클레오티드 염기와 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 동일하다.
"마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 전사 또는 번역후 유전자 침묵을 매개할 수 있는 작은 비-코딩 RNA 분자이다. 전형적으로, miRNA는 1차 miRNA (pri-miRNA)로 지칭되는 헤어핀 또는 스템-루프 (예를 들어, 자기-상보성, 단일-가닥 백본을 가짐) 듀플렉스 구조로서 전사되고, 이는 효소적으로 (예를 들어, 드로샤, DGCR8, 파샤 등에 의해) pre-miRNA로 프로세싱된다. pri-miRNA의 길이는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, pri-miRNA는 약 100 내지 약 5000개 염기 쌍 (예를 들어, 약 100, 약 200, 약 500, 약 1000, 약 1200, 약 1500, 약 1800, 또는 약 2000개 염기 쌍) 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, pri-miRNA는 약 200개 초과의 염기 쌍 길이 (예를 들어, 2500, 5000, 7000, 9000개, 또는 그 초과의 염기 쌍 길이)이다.
헤어핀 또는 스템-루프 듀플렉스 구조를 또한 특징으로 하는 pre-miRNA도 또한 길이가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, pre-miRNA는 크기가 약 40개 염기 쌍 길이 내지 약 500개 염기 쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, pre-miRNA는 크기가 약 50 내지 100개 염기 쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, pre-miRNA는 크기가 약 50 내지 약 90개 염기 쌍 길이 (예를 들어, 약 50, 약 52, 약 54, 약 56, 약 58, 약 60, 약 62, 약 64, 약 66, 약 68, 약 70, 약 72, 약 74, 약 76, 약 78, 약 80, 약 82, 약 84, 약 86, 약 88, 또는 약 90개 염기 쌍 길이) 범위이다.
일반적으로, pre-miRNA는 세포질 내로 유출되고, 다이서에 의해 효소적으로 프로세싱되어 먼저 불완전한 miRNA/miRNA* 듀플렉스 및 이어서 단일-가닥 성숙 miRNA 분자가 생산되고, 이는 후속적으로 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 로딩된다. 전형적으로, 성숙 miRNA 분자는 크기가 약 19 내지 약 30개 염기 쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 성숙 miRNA 분자는 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 또는 약 30개 염기 쌍 길이이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 1개 이상의 인공 miRNA를 코딩하는 단리된 핵산 및 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)를 제공한다. 본원에 사용된 "인공 miRNA" 또는 "ami-RNA"는, 예를 들어 문헌 [Eamens et al., (2014), Methods Mol. Biol. 1062:211-224]에 기재된 바와 같이, miRNA 및 miRNA* (예를 들어, miRNA 듀플렉스의 패신저 가닥) 서열이 표적화된 유전자의 고도로 효율적인 RNA 침묵을 지시하는 상응하는 ami-RNA/ami-RNA* 서열로 대체된, 내인성 pri-miRNA 또는 pre-miRNA (예를 들어, 기능적 성숙 miRNA를 생산할 수 있는 전구체 miRNA인 miRNA 백본)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인공 miRNA는 골 대사 조정 (예를 들어, 골 형성 억제제) miRNA를 코딩하는 서열이 내인성 miR-155 성숙 miRNA-코딩 서열 대신 삽입된, miR-155 pri-miRNA 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 마우스 또는 인간 miRNA (예를 들어, 인공 miRNA)는 miR-155 백본 서열, miR-33 백본 서열, miR-30 백본 서열, mir-64 백본 서열, 또는 miR-122 백본 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 슈누리-3 단백질을 코딩하는 SHN3 유전자 (GeneID: 59269)를 표적화하는 억제 핵산 (예를 들어, 인공 마이크로RNA)을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 슈누리-3 (SHN3) 단백질은 NK-κβ 단백질 발현 및 이뮤노글로불린 및 T-세포 수용체 항체 재조합을 조절하는 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_001127714.2 또는 NM_024503.5에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, SHN3 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_001121186.1 또는 NP_078779.2에 의해 나타내어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 SHN3 발현 (예를 들어, SHN3 유전자, 예를 들어 SHN3 유전자에 의해 코딩된 mRNA로부터의 1종 이상의 유전자 생성물의 발현)을 감소시키는데 사용되는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자 (예를 들어, SHN3 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자 (예를 들어, SHN3 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 6 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보성인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자 (예를 들어, SHN3 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 12-24개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자 (예를 들어, SHN3 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 9-27개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SHN3 유전자 (예를 들어, SHN3 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 카텝신 K 단백질을 코딩하는 CTSK 유전자 (GeneID: 1513)를 표적화하는 억제 핵산 (예를 들어, 인공 마이크로RNA)을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 카텝신 K (CTSK) 단백질은 골 재형성 및 흡수에 수반되는 리소솜 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, CTSK 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_000396에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, CTSK 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_000387에 의해 나타내어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CTSK 발현 (예를 들어, CTSK 유전자, 예를 들어 CTSK 유전자에 의해 코딩된 mRNA로부터의 1종 이상의 유전자 생성물의 발현)을 감소시키는데 사용되는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 CTSK 유전자 (예를 들어, CTSK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 CTSK 유전자 (예를 들어, CTSK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 6 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 CTSK 유전자 (예를 들어, CTSK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 12-24개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 CTSK 유전자 (예를 들어, CTSK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 9-27개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 CTSK 유전자 (예를 들어, CTSK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 스클레로스틴 단백질을 코딩하는 SOST 유전자 (GeneID: 50964)를 표적화하는 억제 핵산 (예를 들어, 인공 마이크로RNA)을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 스클레로스틴 단백질은 골 형태발생 단백질 (BMP)을 길항작용하는 분비 당단백질이다. 일부 실시양태에서, SOST 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_025237에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, SOST 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_079513에 의해 나타내어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 SOST 발현 (예를 들어, SOST 유전자, 예를 들어 SOST 유전자에 의해 코딩된 mRNA로부터의 1종 이상의 유전자 생성물의 발현)을 감소시키는데 사용되는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SOST 유전자 (예를 들어, SOST 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SOST 유전자 (예를 들어, SOST 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 6 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SOST 유전자 (예를 들어, SOST 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 12-24개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SOST 유전자 (예를 들어, CTSK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 9-27개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 SOST 유전자 (예를 들어, SOST 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 RANKL 단백질을 코딩하는, 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 11 (TNFSF11)로도 지칭되는, RANKL 유전자 (GeneID: 8600)를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. RANKL 단백질은 골 재생 및 재형성을 제어하는 데 있어서 소정의 역할을 하는 유형 II 막 단백질이다. 일부 실시양태에서, RANKL 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_003701 또는 NM_033012에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, RANKL 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_003692 또는 NP_143026에 의해 나타내어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RANKL 발현 (예를 들어, RANKL 유전자, 예를 들어 RANKL 유전자에 의해 코딩된 mRNA로부터의 1종 이상의 유전자 생성물의 발현)을 감소시키는데 사용되는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANKL 유전자 (예를 들어, RANKL 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANKL 유전자 (예를 들어, RANKL 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 6 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적으로 한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANKL 유전자 (예를 들어, RANKL 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 12-24개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANKL 유전자 (예를 들어, RANKL 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 9-27개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANKL 유전자 (예를 들어, RANKL 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 RANK 단백질을 코딩하는, 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 11 (TNFRSF11A)로도 지칭되는, RANK 유전자 (GeneID: 21934)를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. RANK 단백질은 RANKL-유도된 파골세포발생에 필수적이고, 또한 T 세포와 수지상 세포 사이의 상호작용의 조절에 수반된다. 일부 실시양태에서, RANK 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_009399.3에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, RANK 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_033425.3에 의해 나타내어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RANK 발현 (예를 들어, RANK 유전자, 예를 들어 RANK 유전자에 의해 코딩된 mRNA로부터의 1종 이상의 유전자 생성물의 발현)을 감소시키는데 사용되는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANK 유전자 (예를 들어, RANK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANK 유전자 (예를 들어, RANK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 6 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적으로 한다 (예를 들어, 이에 결합하거나, 또는 이와 상보적인 영역을 포함함). 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANK 유전자 (예를 들어, RANK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 12-24개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANK 유전자 (예를 들어, RANK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 9-27개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 RANK 유전자 (예를 들어, RANK 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체)의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 연속 뉴클레오티드를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제1 억제 핵산 및 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 제1 억제 핵산은 SHN3을 표적화할 수 있고, 제2 억제 핵산은 RANK를 표적화할 수 있다. 또 다른 예에서, 제1 억제 핵산은 SHN3을 표적화할 수 있고, 제2 억제 핵산은 SHN3을 표적화할 수 있다. 또 다른 예에서, 제1 억제 핵산은 SOST를 표적화할 수 있고, 제2 억제 핵산은 RANKL을 표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 6-50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 8-24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 12-36개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 인공 마이크로RNA는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 표적 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 표적 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 표적 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 SHN3 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 SHN3 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 SHN3 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 전신 골 손실을 예방하거나 또는 역전시킨다. 일부 실시양태에서, 전신 골 손실은 골다공증이다. 일부 실시양태에서, 전신 골 손실은 국지적 골 건강보다 더 영향을 미치는 임의의 골 손실일 수 있다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 골모세포를 염증으로부터 예방한다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 파골세포의 염증-유도된 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 염증-유도된 골 손실을 예방한다.
일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 국지적 골 손실을 예방하거나 또는 역전시킨다. 일부 실시양태에서, 국지적 골 손실은 대상체의 국지적 신체 부분에 영향을 미치는 임의의 골 손실일 수 있다. 일부 실시양태에서, 국지적 신체 부분은 발목, 손목, 무릎, 및/또는 사지일 수 있다.
일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP)의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 TRAP의 수준을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 TRAP의 수준을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 TRAP의 수준을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP)-발현 파골세포의 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP)-발현 파골세포의 수준을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 증가시킨다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 TRAP-발현 파골세포의 수준을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 증가시킨다. 일부 실시양태에서, SHN3 유전자의 감소된 발현은 TRAP-발현 파골세포의 수준을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 CTSK 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 CTSK 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 CTSK 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 SOST 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 SOST 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 SOST 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 RANKL 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 RANKL 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 RANKL 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 RANK 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 RANK 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 RANK 유전자의 발현을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 유형 I 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드 (Ctx-I)의 수준을 대조군과 비교하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 Ctx-I의 수준을 대조군과 비교하여 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, 단리된 억제 핵산은 Ctx-I의 수준을 대조군과 비교하여 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 골 손실을 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%만큼, 또는 적어도 2-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 또는 적어도 1000-배만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 억제 핵산은 활성 오스테오칼신-발현 골모세포를 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%만큼, 또는 적어도 2-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 또는 적어도 1000-배만큼 감소시킨다.
본원에 사용된 "대조군"은 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 갖지 않거나, 그러한 것으로 의심되지 않거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 임의의 대상체를 지칭할 수 있다. "대조군"은 본원에 개시된 치료를 받기 전의 동일한 대상체를 지칭할 수 있다. 대조군은 염증성 질환의 1종 이상의 징후 또는 증상을 갖지 않는다. 대조군은 정상적인 건강한 대상체일 수 있다.
본 개시내용은, 부분적으로, 염증-유도된 골 손실의 증가된 억제를 발생시키는, 본원에 기재된 억제 핵산을 발현하는 세포에서의 염증유발 시토카인 활성 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 특정 억제제의 발현을 기초로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 트랜스진은 1종 이상의 치료 단백질을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 치료 단백질은 대상체에서 염증유발 시토카인의 발현 또는 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 가용성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 가용성 단백질은 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 2 (sTNFR2) 또는 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα)이다. 일부 실시양태에서, 가용성 단백질은 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 2 (sTNFR2) 및 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα)이다. 일부 실시양태에서, 가용성 단백질은 대상체에서 염증유발 시토카인의 발현 또는 활성을 감소시키는 임의의 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 가용성 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 수용체 2 (sTNFR2)를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. sTNFR2 단백질은 그의 막 결합된 것의 순환 형태이다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_001065.4 또는 NM_001066.3에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_001056.1 또는 NP_001057.1에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, sTNFR2 단백질은 서열식별번호: 6과, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 단백질은 서열식별번호: 6에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 단백질은 서열식별번호: 7과, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 단백질은 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα)를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. sIL1Rα 단백질은 IL-1 세포 표면 수용체에 결합하고, IL-1 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, sIL1Rα 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_000577, NM_173841, NM_173842, NM_173843, 또는 NM_001318914에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, sIL1Rα 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_000568, NP_001305843, NP_776213, NP_776214, 또는 NP_776215에 의해 나타내어진다.
일부 실시양태에서, sIL1Rα 단백질은 서열식별번호: 34와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sIL1Rα 단백질은 서열식별번호: 34에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sIL1Rα 단백질은 서열식별번호: 35와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sIL1Rα 단백질은 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, sTNFR2 및/또는 sIL1Rα의 발현은 세포에서 염증유발 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 발현 또는 활성을 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, sTNFR2 및/또는 sIL1Rα의 발현은 세포에서 염증유발 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 발현 또는 활성을 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, sTNFR2 및/또는 sIL1Rα의 발현은 세포에서 염증유발 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 발현 또는 활성을 80% 내지 99%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 및/또는 sIL1Rα의 발현은 세포에서 염증유발 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 발현 또는 활성을 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, sTNFR2 및/또는 sIL1Rα의 발현은 세포에서 염증유발 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 발현 또는 활성을 75% 내지 90%만큼 감소시킨다. 일부 측면에서, sTNFR2 및/또는 sIL1Rα의 발현은 세포에서 염증유발 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등)의 발현 또는 활성을 80% 내지 99%만큼 감소시킨다.
트랜스진을 포함하는 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)은 단리된 핵산의 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있다. 영역은 예를 들어 인트론, 5' 또는 3' 비번역 영역 등을 포함하는 핵산의 임의의 비번역 부분에 위치할 수 있다.
일부 경우에, 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 단백질 코딩 서열)의 제1 코돈의 상류에 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)이 위치하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈과 제1 코돈의 상류의 2000개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈과 제1 코돈의 상류의 1000개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈과 제1 코돈의 상류의 500개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈과 제1 코돈의 상류의 250개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 단백질 코딩 서열의 제1 코돈과 제1 코돈의 상류의 150개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다.
일부 경우에 (예를 들어, 트랜스진에 단백질 코딩 서열이 결여된 경우에), 트랜스진의 폴리-A 테일의 상류에 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)이 위치하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 2000개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 1000개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 500개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 250개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 150개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 100개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 50개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 제1 염기와 제1 염기의 상류의 20개 뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 영역은 프로모터 서열의 마지막 뉴클레오티드 염기와 폴리-A 테일 서열의 제1 뉴클레오티드 염기 사이에 위치한다.
일부 경우에, 영역은 트랜스진의 폴리-A 테일의 마지막 염기의 하류에 위치할 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 하류의 2000개 뉴클레오티드 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 하류의 1000개 뉴클레오티드 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 하류의 500개 뉴클레오티드 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 하류의 250개 뉴클레오티드 위치 사이에 있을 수 있다. 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 하류의 150개 뉴클레오티드 위치 사이에 있을 수 있다. 트랜스진이 1개 초과의 miRNA를 코딩하는 경우에, 각각의 miRNA는 트랜스진 내의 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 예를 들어, 제1 miRNA를 코딩하는 핵산은 트랜스진의 인트론에 위치할 수 있고, 제2 miRNA를 코딩하는 핵산 서열은 또 다른 비번역 영역에 (예를 들어, 단백질 코딩 서열의 마지막 코돈과 트랜스진의 폴리-A 테일의 제1 염기 사이에) 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 1개 이상의 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터 등)을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리-A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열 (즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 원하는 경우에, 코딩된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 비롯한 많은 수의 발현 제어 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 골모세포 (OB) 또는 파골세포 (OC)에서 유전자 생성물(들)을 발현할 수 있는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 트랜스진에 관한 것이다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하는 데 요구되는, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "작동가능하게 위치한", "제어 하" 또는 "전사 제어 하"는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 있음을 의미한다.
단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 폴리-A 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 다음에 및 3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 개시내용에 유용한 rAAV 구축물은 또한 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 트랜스진 사이에 위치하는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되고, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 1종 초과의 폴리펩티드를 생산하는 데 사용된다. IRES 서열은 1개 초과의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질을 생산하는 데 사용될 것이다. 이들 및 다른 공통 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 많은 이러한 서열이 이용가능하다 [예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.] 및 그에 인용된 참고문헌, 예를 들어 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27 및 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조]. 일부 실시양태에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 폴리단백질에 포함되고; 이는 폴리단백질의 절단을 매개하는 것으로 밝혀진 작은 펩티드 (대략 18개 아미노산 길이)이다 (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 벡터 (AAV 및 레트로바이러스)를 포함한 인공 시스템에서 이전에 입증되었다 (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; and Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; 및 Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).
구성적 프로모터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐) [예를 들어, 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 [인비트로젠(Invitrogen)]를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 증진된 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 U6 프로모터이다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하고, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예컨대 온도, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 급성기, 세포의 특정한 분화 상태의 존재에 의해, 또는 오직 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 비제한적으로 인비트로젠, 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)를 포함한 다양한 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급되는 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라시클린-억제성 시스템 (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라시클린-유도성 시스템 (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 문헌 [Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조), RU486-유도성 시스템 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템 (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정한 분화 상태에 의해, 또는 오직 복제 세포에서만 조절되는 것이다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 염증성 시토카인의 존재 하에 유도된다 (예를 들어, 전사적으로 활성화됨). 일부 실시양태에서, 염증-유도된 프로모터는 NF-카파 B (NFκB) 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, NF-카파 B (NFκB) 프로모터는 PB2 프로모터이다. 일부 실시양태에서, NF-카파 B (NFκB) 프로모터 (예를 들어, PB2 프로모터)는 서열식별번호: 3과, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NF-카파 B (NFκB) 프로모터 (예를 들어, PB2 프로모터)는 서열식별번호: 3에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 트랜스진에 대한 천연 프로모터가 사용될 것이다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방할 것을 목적으로 하는 경우에 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발생적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특이적 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 컨센서스 서열이 또한 천연 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 조직-특이적 조절 서열은 하기 조직 특이적 프로모터: 간-특이적 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터, 소마토스타틴 프로모터, 췌장 폴리펩티드 (PPY) 프로모터, 시냅신-1 (Syn) 프로모터, 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터, 포유동물 데스민 (DES) 프로모터, α-미오신 중쇄 (a-MHC) 프로모터, 또는 심장 트로포닌 T (cTnT) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예시적인 프로모터는 특히 베타-액틴 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터 (Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)); 알파-태아단백질 (AFP) 프로모터 (Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 골 오스테오칼신 프로모터 (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); 골 시알로단백질 프로모터 (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), CD2 프로모터 (Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)); 이뮤노글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 α-쇄 프로모터, 뉴런 예컨대 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터 (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경필라멘트 경쇄 유전자 프로모터 (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터 (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))를 포함하며, 이는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터는 골 조직-특이적 프로모터이다. 골 조직-특이적 프로모터의 예는 오스테릭스, 오스테오칼신, 유형 1 콜라겐 α1, DMP1, 카텝신 K, Rank 등의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골모세포-특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 골모세포-특이적 프로모터는 오스테오칼신 (OCN) 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, OCN 프로모터는 서열식별번호: 4와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, OCN 프로모터는 서열식별번호: 4에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 파골세포-특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 파골세포-특이적 프로모터는 RANK 프로모터 또는 NFκB 프로모터, 예컨대 PB2 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, RANK 프로모터는 서열식별번호: 5와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RANK 프로모터는 서열식별번호: 5에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 측면은 1개 초과의 프로모터 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 프로모터)를 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 제1 영역 및 억제 RNA (예를 들어, miRNA)를 코딩하는 제2 영역을 포함하는 트랜스진을 갖는 구축물과 관련하여, 제1 프로모터 서열 (예를 들어, 단백질 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 서열)을 사용하여 단백질 코딩 영역의 발현을 구동하고, 제2 프로모터 서열 (예를 들어, 억제 RNA 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터 서열)을 사용하여 억제 RNA 코딩 영역의 발현을 구동하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 제1 프로모터 서열 및 제2 프로모터 서열은 동일한 프로모터 서열 또는 상이한 프로모터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터 서열 (예를 들어, 단백질 코딩 영역의 발현을 구동하는 프로모터)은 RNA 폴리머라제 III (polIII) 프로모터 서열이다. polIII 프로모터 서열의 비제한적 예는 U6 및 H1 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터 서열 (예를 들어, 억제 RNA의 발현을 구동하는 프로모터 서열)은 RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 서열이다. polII 프로모터 서열의 비제한적 예는 T7, T3, SP6, RSV, 및 시토메갈로바이러스 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, polIII 프로모터 서열은 억제 RNA (예를 들어, miRNA) 코딩 영역의 발현을 구동한다. 일부 실시양태에서, polII 프로모터 서열은 단백질 코딩 영역의 발현을 구동한다.
재조합 AAV (rAAV)
본 개시내용의 단리된 핵산은 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (rAAV 벡터)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 또는 그의 변이체를 포함하는 영역 (예를 들어, 제1 영역)을 포함한다. 단리된 핵산 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터)은 캡시드 단백질 내로 패키징되고, 대상체에게 투여되고/거나 선택된 표적 세포에 전달될 수 있다. "재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)로 구성된다. 트랜스진은, 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이, 대상체의 내인성 mRNA를 표적화하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 단백질 및/또는 억제 핵산 (예를 들어, shRNA, miRNA 등)을 코딩하는 1개 이상의 영역을 포함할 수 있다. 트랜스진은 또한 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 예를 들어 단백질 및/또는 발현 제어 서열 (예를 들어, 폴리-A 테일)을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, ITR을 코딩하는 실질적으로 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 사소한 변형이 허용된다. 이들 ITR 서열을 변형시키는 능력은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. (예를 들어, 문헌 예컨대 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)] 참조). 본 발명에 사용된 이러한 분자의 예는 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이며, 여기서 선택된 트랜스진 서열 및 연관된 조절 요소는 5' 및 3' AAV ITR 서열이 플랭킹된다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유동물 AAV 유형을 비롯한 임의의 공지된 AAV로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, AAV2/2-125, 및 그의 변이체로부터 선택된 혈청형을 갖는 적어도 1개의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 AAV2 ITR을 코딩하는 영역 (예를 들어, 제1 영역)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 제2 AAV ITR을 포함하는 영역 (예를 들어, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, AAV2/2-125, 및 그의 변이체로부터 선택된 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 ITR은 기능적 말단 분해 부위 (TRS)가 결여된 돌연변이체 ITR이다. 용어 "말단 분해 부위가 결여된"은 ITR의 말단 분해 부위 (TRS)의 기능을 제거하는 돌연변이 (예를 들어, 센스 돌연변이, 예컨대 비-동의 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이)를 포함하는 AAV ITR, 또는 기능적 TRS를 코딩하는 핵산 서열이 결여된 말단절단된 AAV ITR (예를 들어, ΔTRS ITR)을 지칭할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 기능적 TRS가 결여된 ITR을 포함하는 rAAV 벡터는, 예를 들어 문헌 [McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656]에 기재된 바와 같이 자기-상보적 rAAV 벡터를 생산한다.
본원에 사용된 용어 "자기-상보적 AAV 벡터" (scAAV)는 AAV의 ITR 중 1개로부터 말단 분해 부위 (TR)의 부재에 의해 생성된 이중-가닥 벡터 게놈을 함유하는 벡터를 지칭한다. TR의 부재는 TR이 존재하지 않는 벡터 말단에서 복제의 개시를 방지한다. 일반적으로, scAAV 벡터는 각각의 말단에 야생형 (wt) AAV TR 및 중간에 돌연변이된 TR (mTR)을 갖는 단일-가닥, 역전된 반복부 게놈을 생성한다. 본 발명은, 부분적으로, RNA 헤어핀 구조 (예를 들어, shRNA, miRNA, 및 ami-RNA)를 코딩하는 DNA 단편이 바이러스 게놈 복제 동안 돌연변이체 역전된 말단 반복부 (mTR)와 유사한 기능을 수행하여 자기-상보적 AAV 벡터 게놈을 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 2개의 말단의 각각에 역전된 말단 반복부 (ITR)를 갖는 단일-가닥 자기-상보적 핵산 및 헤어핀-형성 RNA (예를 들어, shRNA, miRNA, ami-RNA 등)를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 중심 부분을 포함하는 rAAV (예를 들어, 자기-상보적 AAV; scAAV) 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-형성 RNA (예를 들어, shRNA, miRNA, ami-RNA 등)를 코딩하는 서열은 돌연변이체 ITR에 의해 정상적으로 점유된 자기-상보적 핵산의 위치에서 치환된다.
"재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)로 구성된다. 캡시드 단백질 내로 패키징되고 선택된 표적 세포로 전달되는 것은 이러한 재조합 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 관심 폴리펩티드, 단백질, 기능적 RNA 분자 (예를 들어, miRNA, miRNA 억제제) 또는 다른 유전자 생성물을 코딩하는, 벡터 서열에 대해 이종인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 표적 조직의 세포에서 트랜스진 전사, 번역, 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동가능하게 연결된다.
본 개시내용은 단일 시스-작용 야생형 ITR을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, ITR은 5' ITR이다. 일부 실시양태에서, ITR은 3' ITR이다. 일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, ITR(들)을 코딩하는 실질적으로 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 사소한 변형이 허용된다. ITR 서열을 변형시키는 능력은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. (예를 들어, 문헌 예컨대 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)] 참조). 예를 들어, ITR은 그의 말단 분해 부위 (TR)에서 돌연변이될 수 있으며, 이는 TR이 돌연변이된 벡터 말단에서 복제를 억제하고 자기-상보적 AAV의 형성을 발생시킨다. 본 개시내용에 사용된 이러한 분자의 또 다른 예는 트랜스진을 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이며, 여기서 선택된 트랜스진 서열 및 연관된 조절 요소는 5' AAV ITR 서열 및 3' 헤어핀-형성 RNA 서열이 플랭킹된다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유동물 AAV 유형을 비롯한 임의의 공지된 AAV로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, 및/또는 AAVrh10 ITR 서열이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 유사형화 rAAV이다. 예를 들어, Y의 단백질로 캡시드화된 혈청형 X의 ITR을 함유하는 유사형화 AAV 벡터는 AAVX/Y로 지정될 것이다 (예를 들어 AAV2/1은 AAV2의 ITR 및 AAV1의 캡시드를 가짐). 일부 실시양태에서, 유사형화 rAAV는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질의 조직-특이적 표적화 능력을 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 바이러스 DNA와 조합함으로써 트랜스진의 표적 조직으로의 표적화된 전달을 가능하게 하는 데 유용할 수 있다.
목적하는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 수득하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, US 2003/0138772 참조, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 전형적으로, 방법은 AAV 캡시드 단백질; 기능적 rep 유전자; AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 및 트랜스진으로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질 내로의 재조합 AAV 벡터의 패키징을 허용하는 충분한 헬퍼 기능을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV의 cap 유전자에 의해 코딩된 구조 단백질이다. AAV는 3개의 캡시드 단백질, 비리온 단백질 1 내지 3 (VP1, VP2 및 VP3으로 명명됨)을 포함하며, 이들 모두는 대안적 스플라이싱을 통해 단일 cap 유전자로부터 전사된다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 각각 약 87 kDa, 약 72 kDa 및 약 62 kDa이다. 일부 실시양태에서, 번역 시, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈 주위에 구형 60량체 단백질 쉘을 형성한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질의 기능은 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 전달하고, 숙주와 상호작용하는 것이다. 일부 측면에서, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈을 숙주에게 조직 특이적 방식으로 전달한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, AAV2/2-125로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 비-인간 영장류로부터 유래된 혈청형, 예를 들어 scAAV.rh8, AAV.rh39, 또는 AAV.rh43 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형의 것이다.
본 개시내용은, 부분적으로, 골 조직에 대해 증가된 향성을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV에 기초한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 골-표적화 펩티드에 그라프팅된다. 이종 골-표적화 펩티드는 OC (예를 들어, OB에 비해 OC를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함) 또는 OB (예를 들어, OC에 비해 OB를 특이적으로 또는 우선적으로 표적화함)를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 골-표적화 펩티드는 (AspSerSer)n (여기서 n은 2 내지 100의 정수임) 펩티드를 포함하며, 이는 또한 DSS 펩티드로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, DSS 펩티드를 포함하는 AAV 캡시드 단백질은 PCT 공개 WO 2019/183605에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 골-표적화 펩티드의 추가의 예는 문헌 [Ouyang et al., (2009) Lett. Organic Chem 6(4):272-277]에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV는 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, DSS-AAV9 캡시드 단백질은 2 내지 10개의 DSS 반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, DSS-AAV9 캡시드 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 DSS 반복부를 포함한다.
AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양될 성분은 숙주 세포에게 트랜스로 제공될 수 있다. 대안적으로, 요구되는 성분 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및/또는 헬퍼 기능) 중 어느 1종 이상은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 요구되는 성분 중 1종 이상을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에 요구되는 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 요구되는 성분(들)은 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 구성적 프로모터의 예는 본원에서, 트랜스진과 함께 사용하기에 적합한 조절 요소의 논의에서 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어 하에 선택된 성분(들) 및 1개 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포 (구성적 프로모터의 제어 하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 제어 하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 또 다른 안정한 숙주 세포가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 생성될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV를 생산하는 데 필요한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전 요소 (벡터)를 사용하여 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전 요소는 본원에 기재된 것을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 실시양태를 구축하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 유전자 공학, 재조합 공학, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조한다. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 널리 공지되어 있고, 적합한 방법의 선택은 본 개시내용에 대한 제한이 아니다. 예를 들어, 문헌 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 번호 5,478,745를 참조한다.
일부 실시양태에서, 삼중 형질감염 방법 (미국 특허 번호 6,001,650에 상세하게 기재됨)을 사용하여 재조합 AAV가 생산될 수 있다. 전형적으로, 재조합 AAV는 숙주 세포를 AAV 입자 내로 패키징될 재조합 AAV 벡터 (트랜스진을 포함함), AAV 헬퍼 기능 벡터, 및 보조 기능 벡터로 형질감염시킴으로써 생산된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 "AAV 헬퍼 기능" 서열 (즉, rep 및 cap)을 코딩하며, 이는 생산적 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 트랜스로 기능한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출가능한 야생형 AAV 비리온 (즉, 기능적 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않으면서 효율적인 AAV 벡터 생산을 지지한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적 예는 미국 특허 번호 6,001,650에 기재된 pHLP19 및 미국 특허 번호 6,156,303에 기재된 pRep6cap6 벡터를 포함하며, 둘 다의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 보조 기능 벡터는 AAV가 복제를 위해 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능 (즉, "보조 기능")을 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 보조 기능은 비제한적으로 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 어셈블리에 수반되는 모이어티를 포함한, AAV 복제에 요구되는 기능을 포함한다. 바이러스-기반 보조 기능은 공지된 헬퍼 바이러스 중 임의의 것, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (단순 헤르페스 바이러스 유형-1이외의 것), 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하는 데 사용되고, 세포는 외인성 DNA가 세포 막 내부에 도입된 경우에 "형질감염"된 것이다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al., (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al., (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기술을 이용하여 1종 이상의 외인성 핵산, 예컨대 뉴클레오티드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.
"숙주 세포"는 관심 물질을 보유하거나 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 (Sf9), 또는 포유동물 (예를 들어, 인간, 설치류, 비-인간 영장류 등) 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 구축물, AAV 미니유전자 플라스미드, 보조 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생산과 연관된 다른 전달 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 본래의 모 세포와 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체에서 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "세포주"는 시험관내에서 연속적 또는 장기간 성장 및 분열이 가능한 세포의 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 전구 세포로부터 유래된 클론 집단이다. 이러한 클론 집단의 저장 또는 전달 동안 핵형에서 자발적 또는 유도된 변화가 발생할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 추가로 공지되어 있다. 따라서, 언급된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지 않을 수 있고, 언급된 세포주는 이러한 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 세포"는 외인성 DNA 절편, 예컨대 생물학적 활성 폴리펩티드의 전사 또는 생물학적 활성 핵산, 예컨대 RNA의 생산으로 이어지는 DNA 절편이 도입된 세포를 지칭한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 제공하며, 여기서 트랜스진은 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 인공 마이크로RNA는 세포 (예를 들어, 골모세포, 파골세포, 골세포, 연골세포) 또는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 세포 또는 대상체에서 SHN3의 발현을 감소시키는 인공 마이크로RNA를 포함한다.
세포 또는 대상체에서 표적 유전자 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등)의 발현은 본 개시내용의 rAAV를 사용하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서 표적 유전자 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등)의 발현은 본 개시내용의 rAAV를 사용하여 75% 내지 90%만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서 표적 유전자 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등)의 발현은 본 개시내용의 rAAV를 사용하여 80% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV를 생산하기 위해 목적하는 AAV 캡시드에 재조합 벡터를 패키징하는 상기 방법은 제한적인 것으로 의도되지 않고, 다른 적합한 방법이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
투여 방식 및 조성물
본 개시내용의 rAAV는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 생리학상 상용성인 담체 중에 (예를 들어, 조성물 중에) 현탁된 rAAV는 대상체, 예를 들어 숙주 동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니 피그, 햄스터, 닭, 칠면조, 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 마카크)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 동물은 인간을 포함하지 않는다.
rAAV의 포유동물 대상체로의 전달은, 예를 들어 근육내 주사에 의해 또는 포유동물 대상체의 혈류 내로의 투여에 의해 이루어질 수 있다. 혈류 내로의 투여는 정맥, 동맥, 또는 임의의 다른 혈관 도관 내로의 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 외과 기술분야에 널리 공지된 기술인 고립 사지 관류에 의해 혈류 내로 투여되며, 상기 방법은 본질적으로 통상의 기술자가 rAAV 비리온의 투여 전에 사지를 체순환으로부터 고립시킬 수 있게 한다. 또한 근육 세포 또는 조직 내로의 형질도입을 잠재적으로 증진시키기 위해 고립 사지의 혈관계 내로 비리온을 투여하는, 미국 특허 번호 6,177,403에 기재된 고립 사지 관류 기술의 변형이 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다. 더욱이, 특정 경우에, 대상체의 골 (예를 들어, 골 조직)에 비리온을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "골 조직"은 척추동물의 골 및/또는 관절 (예를 들어, 연골, 체간 및 체지 골 등)의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 골모세포, 골세포, 파골세포, 연골세포 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 재조합 AAV는 주사에 의해 골에 직접, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 외과적 기술을 사용하여 바늘, 카테터 또는 관련 장치를 사용하여 활막내 주사, 무릎 주사, 대퇴 수질내 주사 등을 통해 골에 직접 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 근육내 주사에 의해 투여된다.
본 개시내용의 측면은 캡시드 단백질 및 트랜스진을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 트랜스진은 1종 이상의 골 대사 조정제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 1개 이상의 AAV ITR을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열 (또는 그의 상보적 서열) 또는 그의 부분을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 SHN3을 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 33, 36 또는 37과, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 33, 36, 또는 37에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 SOST를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 26-31 중 어느 하나와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 26-31 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 CTSK를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 20-25 중 어느 하나와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 20-25 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 RANKL을 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 12-19 중 어느 하나와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 12-19 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 RANK를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 sTNFR2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 6과, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 캡시드 단백질, 및 AAV ITR을 코딩하는 제1 영역 및 트랜스진을 포함하는 제2 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하며, 여기서 트랜스진은 sIL1Rα 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 36과, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 서열식별번호: 36에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 이종 골-표적화 펩티드, 예를 들어 DSS-AAV9 캡시드 단백질을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 측면은 세포에서 표적 유전자 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등) 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 세포는 단일 세포 또는 세포의 집단 (예를 들어, 배양물)일 수 있다. 세포는 생체내 (예를 들어, 대상체 내) 또는 시험관내 (예를 들어, 배양물 내) 세포일 수 있다. 대상체는 포유동물, 임의로 인간, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 돼지, 개, 고양이, 닭, 또는 소일 수 있다.
세포 또는 대상체에서 표적 유전자의 발현은 본 개시내용의 단리된 핵산, rAAV, 또는 조성물을 사용하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서 표적 유전자의 발현은 본 개시내용의 단리된 핵산, rAAV, 또는 조성물을 사용하여 75% 내지 90%만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서 표적 유전자의 발현은 본 개시내용의 단리된 핵산, rAAV, 또는 조성물을 사용하여 80% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 rAAV를 단독으로, 또는 1종 이상의 다른 바이러스 (예를 들어, 1종 이상의 상이한 트랜스진을 코딩하는 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 각각 1종 이상의 상이한 트랜스진을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종, 또는 그 초과의 상이한 rAAV를 포함한다.
적합한 담체는 rAAV가 지시되는 적응증의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 1종의 적합한 담체는 다양한 완충 용액과 함께 제제화될 수 있는 염수 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수)를 포함한다. 다른 예시적인 담체는 멸균 염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩 오일, 참깨 오일, 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 개시내용의 제한이 아니다.
임의로, 본 개시내용의 조성물은 rAAV 및 담체(들)에 더하여, 다른 통상적인 제약 성분, 예컨대 보존제, 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
rAAV는 목적하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 유해 효과 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 제약상 허용되는 투여 경로는 선택된 기관으로의 직접 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 경구, 흡입 (비강내 및 기관내 전달 포함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여 경로는 원하는 경우에 조합될 수 있다.
특정한 "치료 효과"를 달성하는 데 요구되는 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어 게놈 카피/체중 킬로그램 (GC/kg)의 용량의 단위는 rAAV 비리온의 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 요구되는 유전자 또는 RNA 발현의 수준, 치료될 구체적 질환 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 인자에 기초하여 달라질 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 언급된 인자, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 인자에 기초하여 특정한 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 rAAV 비리온 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
rAAV의 "유효량"은 동물을 표적 감염시키고, 목적하는 조직 (예를 들어, 골 조직)을 표적화하기에 충분한 양이다. 유효량은 주로 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 및 표적화될 조직과 같은 인자에 좌우될 것이고, 따라서 동물 및 조직 사이에서 달라질 수 있다. 예를 들어, rAAV의 유효량은 일반적으로 약 109 내지 1016 게놈 카피를 함유하는 약 1 ml 내지 약 100 ml 용액의 범위이다. 일부 경우에, 약 1011 내지 1013 rAAV 게놈 카피의 투여량이 적절하다. 특정 실시양태에서, 1012 또는 1013 rAAV 게놈 카피가 골 조직을 표적화하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 벡터 게놈의 수는 본원에 개시된 치료 및 방법에 적합한 임의의 용량일 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역일 (예컨대 24-시간 기간)당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 역일당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역주 (예컨대 7 역일)당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 격주 (예를 들어, 2 역주 기간에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역월당 1회 (예를 들어, 30 역일에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 6 역월당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 용량은 역년 (예를 들어, 365일 또는 윤년은 366일)당 1회 이하로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, rAAV 조성물은, 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우에 (예를 들어, ~1013 GC/ml 이상), 조성물 중 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제제화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178] 참조, 그의 내용은 본원에 참조로 포함됨).
제약상 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제제화는, 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 이들 제제는 적어도 약 0.1% 또는 그 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 달라질 수 있고, 편리하게는 총 제제의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 또는 그 초과일 수 있다. 당연히, 각각의 치료상-유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량으로 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 이러한 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
특정 상황에서, rAAV-기반 치료 구축물을 본원에 개시된 적합하게 제제화된 제약 조성물로 피하로, 췌장내로, 비강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 척수강내로, 대퇴 수질내로, 또는 경구로, 복강내로, 또는 흡입에 의해 전달하는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시양태에서, 미국 특허 번호 5,543,158; 5,641,515 및 5,399,363 (각각은 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 투여 양식을 사용하여 rAAV를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 투여 방식은 문맥 주사에 의한 것이다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 많은 경우에, 형태는 멸균성이고, 용이한 시린지성이 존재하는 정도로 유체이다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 달성될 수 있다.
주사가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요한 경우에 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스에 의해 등장성으로 될 수 있다. 이들 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 ml의 피하주입액에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량의 일부 변동은 숙주의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 활성 rAAV를 필요에 따라 본원에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기 산, 예컨대 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실 기에 의해 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제제화 시, 용액은 투여 제제와 상용성인 방식으로 및 치료상 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 주사액, 약물-방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.
본원에 사용된 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 어구 "제약상 허용되는"은 숙주에게 투여되는 경우에 알레르기 또는 유사한 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다.
전달 비히클, 예컨대 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로구체, 지질 입자, 소포 등이 본 개시내용의 조성물을 적합한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 전달되는 트랜스진은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구체, 또는 나노입자 등에 캡슐화된 전달을 위해 제제화될 수 있다.
이러한 제제는 본원에 개시된 핵산 또는 rAAV 구축물의 제약상 허용되는 제제의 도입을 위해 바람직할 수 있다. 리포솜의 형성 및 사용은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 최근에, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖는 리포솜이 개발되었다 (미국 특허 번호 5,741,516). 추가로, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다 (미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).
리포솜은 다른 절차에 의한 형질감염에 대해 통상적으로 저항성인 다수의 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포솜은 바이러스-기반 전달 시스템에 전형적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포솜은 유전자, 약물, 방사선요법제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테릭 이펙터를 다양한 배양된 세포주 및 동물 내로 도입하는 데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포솜-매개 약물 전달의 유효성을 조사하는 여러 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포솜은 수성 매질 중에 분산되어 다층 동심원 이중층 소포 (또한 다층 소포 (MLV)로도 명명됨)를 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어에 수용액을 함유하는, 200 내지 500 Å 범위의 직경을 갖는 작은 단층 소포 (SUV)의 형성을 발생시킨다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제제가 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 물질을 안정하고 재현가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.
상기 기재된 전달 방법에 더하여, 하기 기술이 또한 rAAV 조성물을 숙주에 전달하는 대안적 방법으로서 고려된다. 순환계 내로 및 순환계를 통해 약물 투과의 속도 및 효능을 증진시키기 위한 장치로서 초음파영동 (즉, 초음파)이 사용되었고, 미국 특허 번호 5,656,016에 기재되어 있다. 고려되는 다른 약물 전달 대안은 골내 주사 (미국 특허 번호 5,779,708), 마이크로칩 장치 (미국 특허 번호 5,797,898), 안과용 제제 (Bourlais et al., 1998), 경피 매트릭스 (미국 특허 번호 5,770,219 및 5,783,208) 및 피드백-제어 전달 (미국 특허 번호 5,697,899)이다.
치료 방법
유효량의 트랜스진 (예를 들어, 1종 이상의 골 대사 조정제를 코딩하는 단리된 핵산 또는 rAAV)을 대상체에게 전달하는 방법이 본 개시내용에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 골 손실 (예를 들어, 염증성 상태 또는 질환으로 인한 골 손실)을 억제할 수 있는 간섭 RNA를 코딩하는 단리된 핵산의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 골 흡수를 억제할 수 있는 간섭 RNA를 코딩하는 단리된 핵산의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 핵산, rAAV, 및 조성물은 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
본원에 사용된 "조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애"는 1) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착과 골 흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착과 골 흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 3) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착과 골 흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 흡수 (예를 들어, 파괴), 또는 4) 건강한 개체 (예를 들어, 골 침착과 골 흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 흡수 (예를 들어, 파괴)를 유발하는 골 침착과 골 흡수 사이의 불균형을 특징으로 하는 상태를 지칭한다.
"감소된 골 밀도와 연관된 질환"은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 흡수 (예를 들어, 파괴)로부터 유발된 증가된 골 다공성을 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 증가된 골 다공성과 연관된 질환은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 OB 및/또는 골세포 분화, 기능, 또는 활성 및/또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 감소된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 OC 분화, 기능, 또는 활성으로부터 발생할 수 있다. "다공성"은 일반적으로 골 조직에 의해 점유되지 않은 골 분획의 부피를 지칭한다.
"증가된 골 밀도와 연관된 질환"은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 골 침착 (예를 들어, 형성), 또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 골 흡수 (예를 들어, 파괴)로부터 유발된 감소된 골 다공성을 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 감소된 골 다공성과 연관된 질환은 1) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 증가된 OB 및/또는 골세포 분화, 기능, 또는 활성 및/또는 2) 건강한 개체 (예를 들어, 증가된 골 밀도를 특징으로 하는 질환을 갖지 않는 대상체)에 비해 비정상적으로 감소된 OC 분화, 기능, 또는 활성으로부터 발생할 수 있다.
본 개시내용의 측면은 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 조절이상 골 대사는 감소된 골 밀도와 연관된 질환 (예를 들어, 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로 인한 기계적 장애)일 수 있다. 조절이상 골 대사는 증가된 골 밀도와 연관된 질환 (예를 들어, 골화석증, 농축이골증, 경화협착증, 선단비대증, 불소침착증, 골수섬유증, C형 간염-연관 골경화증, 종속영양 골화)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체는 염증성 질환의 1종 이상의 징후 또는 증상을 갖는다. 염증성 질환의 예는 류마티스 관절염 (RA), 건선, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 치주염, 및 심상성 천포창을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 염증성 질환을 갖는 대상체는 정상적인 건강한 대상체에 비해 증가된 수준 또는 양의 염증성 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등) 또는 다른 염증 마커를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 염증성 질환을 갖는 대상체는 정상적인 건강한 대상체와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 적어도 2-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 또는 적어도 1000-배 증가된 수준 또는 양의 염증성 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-17a, IL-17f, IL-18, IL-22, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 감마 (IFNγ), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 등) 또는 다른 염증 마커를 갖는다.
본원에 사용된 "정상적인 건강한 대상체"는 질환 또는 장애를 갖지 않거나, 그러한 것으로 의심되지 않거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 염증성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 골 대사와 연관된다. 일부 실시양태에서, 정상적인 건강한 대상체는 본원에 기재된 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상, 또는 염증성 상태에 대한 소인을 다루거나, 치유하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경하거나, 해소하거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 또는 영향을 미칠 목적으로, 염증성 상태 (예를 들어, RA, 건선, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 치주염, 심상성 천포창 등), 또는 염증성 상태 (예를 들어, RA, 건선, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 치주염, 심상성 천포창 등)에 대한 소인을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV를 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
염증성 상태를 완화시키는 것은 질환의 발생 또는 진행을 지연시키는 것, 또는 질환 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 질환을 완화시키는 것은 반드시 치유적 결과를 요구하지는 않는다. 본원에 사용된 질환 (예컨대 RA, 건선, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 치주염, 심상성 천포창 등)의 발생을 "지연시키는 것"은 질환의 진행을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 늦추는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 길이의 시간일 수 있다. 질환의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 질환의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않은 경우와 비교하여, 주어진 시간 프레임 내에서 질환의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임 내에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다.
질환의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 질환의 발생은 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발생은 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적상, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"은 출현, 재발, 및 발병을 포함한다. 본원에 사용된 염증성 질환의 "발병" 또는 "출현"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 조절이상 골 대사와 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 투여하는 것을 포함한다. rAAV는 골 세포 (예를 들어, 파골세포 및 골모세포)에 대한 그의 표적화를 촉진하는 변형을 포함할 수 있다. 골 세포에 대한 그의 표적화를 촉진하는 rAAV의 비제한적 변형은 이종 골-표적화 펩티드에 의한 캡시드 단백질의 변형, 골-특이적 프로모터에 의한 rAAV 벡터의 변형, 및 다른 조직에 비해 골에 대한 증가된 표적화를 갖는 AAV 혈청형의 사용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 골-표적화 펩티드를 포함하는 rAAV는 골 대사의 조절이상과 연관된 표적 유전자를 상향조절하거나 하향조절하는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애 (예를 들어, 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로 인한 기계적 장애)에서 감소되는 표적 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애에서 증가되는 표적 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애 (예를 들어, 골다공증, 임계 크기-골 결함, 불사용 또는 손상으로 인한 기계적 장애)에서 감소되는 표적 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 감소된 골 밀도와 연관된 장애에서 증가되는 표적 유전자의 발현을 하향조절한다.
본 개시내용의 측면은 대상체에게 캡시드 단백질 및 억제 핵산을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 골 대사의 조절이상을 특징으로 하는 질환 또는 장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. rAAV는 억제 핵산 (예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 ami-RNA)을 포함할 수 있다. 억제 핵산은 골 대사의 조절이상을 특징으로 하는 질환 또는 장애와 연관된 표적 유전자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 감소된 골 밀도와 연관된 유전자를 표적화하는 트랜스진을 포함하는 rAAV 또는 단리된 핵산을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 또는 단리된 핵산은 감소된 골 밀도와 연관된 유전자를 표적화하는 인공 마이크로RNA를 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 SHN3, SOST, CTSK, RANK, 또는 RANKL이다.
본 개시내용의 측면은 rAAV 또는 단리된 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 감소된 골 밀도와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나와, 하기 값 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 또는 단리된 핵산은 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 그의 상보체를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, 서열의 "동일성"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 수학적 모델, 알고리즘, 또는 컴퓨터 프로그램에 의해 다루어지는 갭 정렬 하에서의, 2개 이상의 서열 사이의 동일한 매치의 퍼센트의 측정 또는 계산을 지칭한다. 2개의 서열 (예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열)의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST®), 예컨대 NBLAST® 및 XBLAST® 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 결정될 수 있다. 다중 서열 정렬의 경우 클러스탈 오메가(Clustal Omega)와 같은 정렬 기술이 사용될 수 있다. 다른 알고리즘 또는 정렬 방법은 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 또는 고속 최적 전반적 서열 정렬 알고리즘 (FOGSAA)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
세포 또는 대상체에서 표적 유전자 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등)의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 50% 내지 99% (예를 들어, 50% 및 99%를 포함한 그 사이의 임의의 정수)만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서 표적 유전자 (예를 들어, SHN3, SOST, CTSK, RANK, RANKL 등)의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 75% 내지 90%만큼 감소될 수 있다. 세포 또는 대상체에서 SHN3의 발현은 본 개시내용의 방법을 사용하여 80% 내지 99%만큼 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 조성물 또는 용량과 관련하여 물질의 "유효량" 또는 "유효한 양"은 1종 이상의 목적하는 효과를 생성하기에 (예를 들어, 골 세포 또는 골 조직을 형질도입하기에) 충분한 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 유효량은 대상체의 표적 조직의 충분한 수의 표적 세포를 형질감염시키기에 (또는 rAAV-매개 전달과 관련하여, 감염시키기에) 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 골 조직 (예를 들어, 골 및 골 조직 세포, 예컨대 OB, OC, 골세포, 연골세포 등)이다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV를 통해 전달될 수 있음)의 유효량은 대상체에서 치료 이익을 갖기에, 예를 들어 OB 및/또는 골세포의 활성 또는 기능을 증가시키기에, OB 및/또는 골세포의 활성을 억제하기에, OC의 활성 또는 기능을 증가시키기에, OC의 활성 또는 기능을 억제하기 등에 충분한 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 핵산의 유효량은 골 손실을 부분적으로 또는 완전히 구제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 핵산의 유효량은 골 손실을 유발하는 유전자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 완화시킬 수 있다. 유효량은 또한 바람직하지 않은 반응의 발생을 지연시키는 것을 수반할 수 있다. 유효량은 다양한 인자, 예컨대, 예를 들어, 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 상태의 중증도, 표적화될 조직, 구체적 투여 경로 및 유사 인자에 좌우될 것이고, 따라서 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이 대상체 및 조직 사이에서 달라질 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태는 하기 실시예에 의해 보다 상세히 기재될 것이다. 이들 실시양태는 본 발명의 예시이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 예시적인 실시양태로 제한되지 않음을 인식할 것이다.
실시예
본원에 기재된 본 발명이 보다 완전히 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 본 출원에 기재된 실시예는 본원에 제공된 시스템 및 방법을 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로도 그의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: SHN3 결실을 갖는 마우스 모델은 역전된 염증-유도된 골 손실을 나타내었다
류마티스 관절염 (RA)은 관절 및 전신 골의 염증 및 파괴를 특징으로 한다. 판누스-골 계면에서 생성된 파골세포 (OC)는 인간 RA 및 동물 모델 둘 다에서 관절 골 흡수의 원인이 된다. 흥미롭게도, RA를 갖는 환자에서, 흡수가 치료적 개입에 의해 효과적으로 정지되는 경우에도, 새로운 골의 침착을 동반한 미란의 "복구"는 사례 중 단지 약 10%에서만 발생하며, 이는 염증성 관절염성 환경이 골 흡수 및 형성의 분리와 함께 골모세포 (OB)-매개 골 형성을 또한 억제한다는 것을 시사한다. OB에서 WNT 신호전달의 억제자인 슈누리 3 (SHN3)의 발현은 이들 시토카인이 병원성 역할을 하는 또 다른 염증성 관절염인 건선성 관절염 (PsA)을 갖는 환자에 비해 RA 환자의 혈청에서 상승되는 것으로 관찰되었다 (도 1a). 염증성 관절염의 마우스 모델 (SKG)은 야생형 RNA와 비교하여 혈청 및 골 RNA에서 상승된 수준의 SHN3 mRNA를 나타낸 반면, 활막 RNA에서는 차이가 거의 내지 전혀 검출되지 않았다 (도 1b). 또한, 인간 및 마우스 골수-유래 기질 세포 (BMSC) (도 1c, 1d), 마우스 두개 골모세포 (COB, 도 1e), 및 마우스 섬유모세포-유사 활막세포 (FLS) (도 1f) 및 RA 환자로부터의 FLS는 모두 TNF, IL-17A 또는 그의 조합을 사용한 처리에 반응성이어서 SHN3 전사를 유도한다. 이들 결과는 SHN3의 유도가 RA-연관 시토카인, TNF 및 IL-17A에 의해 달성된다는 것을 입증한다.
비치료된 초기 RA 환자로부터의 전체 활막의 트랜스크립톰 분석은 SHN3 발현과 초음파 상의 활막염 점수 (도 2a) 및 관절 종창 (도 2b)의 상관관계를 보여주었다. 또한, T 세포, B 세포, FLS, 및 단핵구를 백혈구-풍부 또는 -부족 RA를 갖는 인간 환자의 활막으로부터 또는 건강한 활막으로부터 단리하였으며, 이는 SHN3 mRNA 수준에서 차이가 거의 내지 전혀 없음을 입증하였다 (도 2c). 단일 세포 트랜스크립톰 분석을 사용하여, RA 활막으로부터의 FLS, 단핵구, B 세포, T 세포, 및 형질모세포가 높은 수준의 SHN3 mRNA를 발현한다는 것이 관찰되었다 (도 2d, 2e). RA에서 손상된 OB 분화로 이어지는 메카니즘 및 RA 발병기전에서 SHN3의 역할은 완전히 규명되어야 할 것으로 남아있다.
인간 BMSC는 TNF 플러스 IL-17A에 반응하여 SHN3 mRNA의 유도를 나타내며, 이는 NF-κB 경로의 억제에 의해 방지되었다 (도 3a). SHN3 유도는 JNK, ERK, 및 p38 MAPK의 억제제의 존재 하에서는 비교적 보존되었고, 이는 MAPK가 아닌 NF-κB 경로가 OB에서 SHN3의 TNF/IL-17A-유도된 mRNA 발현을 매개한다는 것을 입증한다 (도 3a). 마찬가지로, SHN3 발현은 WT OB와 비교하여 IκB 키나제 β의 구성적으로 활성인 돌연변이체 (Ikk-ca)를 발현하는 OB에서 현저하게 상향조절되었다 (도 3b). NF-κB 경로가 OB 분화의 음성 조절자로서 기능하기 때문에 (도 3c), IKK-CA를 발현하는 (Ikk-ca;prx1) 것에 의한 NF-κB 경로의 OB-특이적 활성화는 WT 대조군 (Ikk-cafl/fl, Ikk-ca fl/fl;shn3fl/fl)과 비교하여 대퇴 골 질량의 유의한 감소를 발생시킨다. 이러한 골 손실은 SHN3의 OB-특이적 결실 (Ikk-ca;shn3;prx1)에 의해 역전되었다 (도 3d). 주목할 것으로, RelA (p65) 및 NF-κB1 (p50)의 헤테로복합체에 대한 다중 κB-결합 부위는 마우스 shn3 유전자의 프로모터 영역에서 제2 전사 개시 부위 (TSS)로부터 10, 120, 360, 및 390 bp 떨어져서 위치한다 (도 3e). 따라서, 데이터는 TNF 플러스 IL-17A에 의한 NF-κB (p65/p50) 헤테로복합체의 활성화가 shn3 프로모터에 대한 p65/p50 결합을 통해 OB에서 SHN3의 전사를 상향조절한다는 것을 나타낸다. 다시, 과다발현된 SHN3은 OB 분화를 억제한다 (도 3c, 하부).
SHN3 발현과 RA에서 염증의 중증도 사이에 연관성이 관찰되었다 (도 2a-2c). SHN3은 또한 RA 활막 및 혈청에서 발현되고, TNF 플러스 IL-17A는 OB 및 FLS에서 SHN3의 발현을 상향조절한다 (도 1). TNF 및 IL-17A 둘 다가 병원성 역할을 하는 염증성 관절염에서 SHN3의 생체내 역할을 시험하기 위해, SHN3의 배선 결실 (shn3-/-)을 갖는 마우스를, ZAP-70 단백질에서의 돌연변이가 T 세포 수용체를 통한 신호전달을 감쇠시키고 말초 T 세포의 자가반응성을 증가시키는 것인 SKG 마우스와 교배시켰다. 이들 마우스에서의 질환의 발병은 1,3-베타-글루칸 (커들란)의 전신 주사에 의해 시기조정될 수 있고, 이는 발 관절에서의 염증의 재현가능한 발생, 활막에서의 TNF, IL-17, IL-1 및 IL-6의 유도를 유발하고, OC-매개 관절 파괴 및 감소된 전신 골 밀도를 발생시킨다. 커들란-처리된 BALB/c 대조군 (흑색) 및 shn3-/- 마우스에서 관절 염증은 거의 내지 전혀 검출되지 않았지만, 커들란은 SKG 및 shn3-/-; SKG 마우스에서 관절 및 전신 염증을 가속화한다 (도 4a, 4b). 주목할 것으로, 활막 세포 및 비장세포의 유동 세포측정 분석은 대식세포, 단핵구, 호중구, 림프구, B 세포, 및 T 세포를 포함한 면역 세포가 SKG 및 shn3-/-;SKG 마우스 사이에서 대등하다는 것을 입증하였으며 (도 4c, d), 이는 SHN3이 활막 내 국부 염증 및 전신 염증 둘 다에서 중요하지 않다는 것을 시사한다. 대퇴골에서 지주 골 질량의 46% 감소를 겪은 염증발생 SKG 마우스와 대조적으로, SHN3의 부재 하의 SKG 마우스에서는 단지 21% 감소가 관찰되었다 (도 5a). 따라서, SKG 마우스는 대퇴 골의 표면 상에서 감소된 수의 활성 오스테오칼신-발현 OB (OCN+ OB) 및 증가된 수의 TRAP+ OC를 나타낸 반면, OCN+ OB 및 TRAP+ OC의 수는 SHN3-결실에 의해 역전되었다 (도 5b-5e). 이는 SKG 마우스에 비해 shn3-/-;SKG 마우스에서의 유형 I 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드 (Ctx-I)의 감소된 혈청 수준과 일치한다 (도 5f). 이들 결과는 SHN3 결실이 염증으로부터 골-상주 OB를 보호하고 동시에 OC의 염증-유도된 활성화를 억제함으로써 염증-유도된 골 손실을 예방할 수 있다는 것을 시사한다. 전신 골 손실 (즉, 골다공증)에 더하여, SHN3 결실은 SKG 마우스의 염증발생 발목에서 관절 골 미란을 보호한다. 마이크로CT 분석은 다중 미란 함요를 나타내는 SKG 발목에 비해 shn3-/-;SKG 발목에서 관절 골 미란이 거의 완전히 보호되었음을 밝혀내었다 (도 5g). 이는 SKG 마우스에 비해 shn3-/-; SKG 마우스의 염증발생 발목 내에서 관절 골 미란으로부터의 유의한 보호를 보여주는 조직학적 분석을 동반하며, 한편 관절 염증은 대등하였다 (도 5h, 5i). 특히, TRAP+ OC의 수는 SKG 마우스에 비해 shn3-/-;SKG 마우스의 염증발생 발목에서 현저하게 감소되었으며 (도 5h), 이는 SHN3 결실에 의한 OC 활성화의 억제를 입증한다. 이들 결과는 SHN3-결실이 염증에서의 어떠한 변경도 없이 염증성 관절염 상황에서 전신 골 손실 및 국소 관절 골 미란 둘 다를 예방하는 데 효과적이라는 것을 나타내며, 이는 적어도 부분적으로 shn3-/-; SKG 마우스에서의 OB 활성 및 골 형성의 증대에 의한 것이다.
K/BxN 혈청 전달 관절염 (STA) 모델은 KRN 자발적 관절염 모델의 파생형이다. K/BxN 마우스에서는 인간 RA를 모방한 자발적 자가면역 관절염이 발생하며, 관절에서 백혈구 침습, 판누스 형성, 연골 파괴 및 골 미란을 갖는다. 이 모델은 단지 2회의 용량의 관절염발생 혈청만 주사하고 마우스를 시간 경과에 따라 추적하는 것에 의해 변형되었다. 이러한 변형에서, 염증은 초기 주사 10일 후에 피크에 도달하고, 28-30일까지 완전히 해소된다. SHN3-결핍 OB가 피크 염증에서 관절 골 미란을 예방할 수 있는지 시험하기 위해, 5-주령 수컷 SHN3 (f/f) 및 SHN3 (f/f);prx1 마우스 (n=5 마우스/군)에게 K/BxN 혈청을 i.p. 주사하고, 발목 관절에서의 염증 및 골용해를 주사 10일 후에 평가하였다. K/BxN 혈청의 주사는 SHN3 (f/f) 및 SHN3 (f/f);prx1 마우스 둘 다에서 관절 염증의 발생으로 이어지며 (도 6a), 이는 관절 염증이 SHN3-결실에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다. 주목할 것으로, 조직학적 분석은 염증발생 발목 관절에 대한 면역 세포의 침윤에서 어떠한 차이도 입증하지 않은 반면 (도 6b 및 6c, 좌측), 관절 미란으로부터의 유의한 보호가, OB-매개 골막 골 형성의 증가 및 미란 부위에서의 OC-매개 골 흡수의 감소와 함께 SHN3 (f/f);prx1 마우스에서 관찰되었다 (도 6c, 우측). SHN3 (f/f) 마우스의 판누스에서, TRAP+ OC의 수는 현저하게 증가되고, 이와 함께 OCN+OB의 수는 감소된다. 대조적으로, SHN3 (f/f);prx1 마우스는 판누스 영역에서 TRAP+ OC의 감소된 수 및 OCN+OB의 증가된 수를 나타낸다 (도 6d). 이들 데이터는 판누스에서의 SHN3-결핍 OB가 RA 시토카인-유도된 억제로부터 저항성일 수 있고, OC의 분화 및/또는 판누스로의 동원을 방해할 수 있다는 것을 나타낸다.
SHN3 발현은 OB-억제 시토카인, TNF 및 IL-17A로 처리된 경우에 OB에서 상향조절되었고, SHN3의 과다발현은 인간 BMSC에서 OB 분화를 유사하게 제거한 반면, OB 분화는 SHN3-결핍 MSC에서 현저하게 증가하였기 때문에 (도 7a), SHN3은 OB 분화의 TNF + IL-17A-유도된 억제를 매개하는 것으로 가설화되었다. 무기질화 및 골형성 유전자 발현은 둘 다 인간 BMSC (도 7b) 및 마우스 두개 OB (COB) (도 7c)에서 현저하게 감소되었지만, SHN3-결핍은 TNF + IL-17A 처리에 의한 OB 분화의 억제로부터 보호하였다. 이들 결과는 SHN3-결핍이 염증성 관절염 상황 (SKG 마우스 모델)에서 상승된 수준의 RA-연관 시토카인으로부터 유발되는 전신 골 손실 및 관절 골 미란을 보호할 수 있는 메카니즘을 설명할 수 있다.
이러한 가설을 생체내 시험하기 위해, SHN3 (f/f);prx1 마우스를 인간 TNF의 과다발현을 갖는 마우스 (TNF-tg)와 교배시킴으로써 인간 TNF를 과다발현하는 OB 계열 세포에서 SHN3을 조건부로 결실시켰다. TNF-tg 마우스는 RA에서 관찰된 것을 모방한 미란성 다발관절염 및 전신성 골다공증을 나타내었다. 이들 마우스에서는 발목, 발 및 무릎에서 3-4주령까지 염증성 관절염이 발생하였고, 이는 중증 관절 골 미란을 초래하였고, 종종 15주령까지 약화되었다. 이들 마우스에서는 4주령까지 전신 골 손실이 발생하기 시작하였다 (도 8a, 8b). TNFtg 마우스와 대조적으로, SHN3 (f/f);prx1;TNFtg 마우스의 마이크로CT 분석은 무릎 관절 (도 8a) 및 발목 (도 8b 및 8c, 우측)에서의 관절 골 미란이 SHN3의 부재 하에 현저하게 감소된 반면, 관절 염증은 TNFtg와 SHN3 (f/f);prx1;TNFtg 마우스 사이에서 대등하다는 것을 (도 8c, 좌측) 밝혀내었다. 추가적으로, 대퇴골에서 지주 골 질량의 유의한 감소를 겪은 TNFtg 마우스와 달리, SHN3의 부재 하에서는 TNFtg 마우스에서 경미한 감소가 관찰되었다 (도 8d). 이들 결과는 SHN3의 OB-특이적 결실이, 관절 염증에서는 어떠한 변경도 없이, TNF-tg 마우스의 배경에서 전신 골 손실 및 관절 골 미란을 예방할 수 있다는 것을 입증하였다. SHN3의 OB-특이적 결실은 관절에서 TNF-유도된 관절 골 미란을 예방하는 데 효과적이었다. 도 8d (마이크로CT 분석)는 조직 부피당 지주 골 부피 (BV/TV), 결합 밀도 (Conn-dens), 개수 (Tb. N), 및 두께 (Tb. Th)를 포함한 대퇴 골 질량의 유의한 감소를 겪은 TNFtg 마우스와 달리, SHN3 (f/f);prx1;TNFtg 마우스에서는 오직 경미한 감소만이 관찰되었고, 이는 SHN3의 OB-특이적 결실이 TNF에 의한 전신 골 손실을 예방하는 데 효과적이라는 것을 입증한다.
SHN3은 OB 분화의 TNF 및 IL-17A-유도된 억제를 매개하기 때문에, 이들 시토카인에 의한 SHN3의 번역후 조절을 조사하였다. 이뮤노블롯팅 분석은 OB에서 SHN3의 인산화가 TNF의 자극 15분 후에 피크에 도달하고 (도 9a), ERK 억제제로 처리한 경우에는 그의 인산화가 현저하게 감소하지만, p38 또는 JNK의 억제제로 처리한 경우에는 그렇지 않다는 것을 밝혀내었다 (도 9b). 그러나, SHN3 인산화는 IL-17A 자극에 의해 영향을 받지 않았다.
이들 결과는 IL-17A가 아니라 TNF에 의한 ERK MAPK 활성화가 OB에서 SHN3의 인산화에 요구된다는 것을 나타낸다. 마우스 SHN3 단백질의 BAS 도메인 내의 MAPK-결합 도메인 (D-도메인; PPKKKRARA, 884-892 aa)은 이전에 확인되었고, 3개의 리신의 알라닌으로의 치환 (SHN3-3KA)은 SHN3에 결합하는 ERK MAPK의 능력을 유의하게 감소시켰다. 놀랍게도, 재조합 SHN3 (rSHN3)은 재조합 ERK2 (rERK2)에 의해 인산화된 반면, rSHN3은 ERK 기질 ELK1의 rERK2-유도된 인산화를 억제하였다 (도 9c). 따라서, 재조합 ERK MAPK (rERK) 및 재조합 SHN3 (rSHN3, 50-930 aa)의 포스포-분광측정 분석은 rERK가 rSHN3을 2개의 세린 (810 및 811 aa), 1개의 트레오닌 (851 aa), 및 2개의 세린 (911 및 913 aa)에서 인산화한다는 것을 밝혀내었다 (도 9d). 5개의 인산화 부위 (SHN3-5STA) 또는 ERK-결합 부위 (SHN3-3KA)가 모두 알라닌으로 치환된 경우에, SHN3의 ERK-유도된 인산화는 현저하게 감소되었으며 (도 9e), 이는 ERK가 이러한 상호작용을 통해 SHN3을 인산화한다는 것을 입증한다. 중요한 것으로, 알칼리성 포스파타제 (ALP) 활성 (도 9f) 및 골형성 유전자 발현 (도 9g)이 SHN3-WT의 과다발현에 의해 SHN3-충분 및 -결핍 BMSC 둘 다에서 현저하게 감소되었지만, ERK에 결합하는 데 실패하였거나 (SHN3-ΔD, SHN3-3KA) 또는 ERK에 의해 인산화되는 데 실패한 (SHN3-5STA) SHN3 돌연변이체에서는 그렇지 않았으며, 이는 ERK-매개 인산화가 OB 분화를 억제하는 SHN3의 기능에 요구된다는 것을 입증한다. 이러한 관찰을 생체내 시험하기 위해, 내인성 shn3 유전자좌에서 SHN3-3KA의 녹-인 대립유전자를 보유하는 마우스 (shn3KI/KI)를 생성하고 (도 9h), TNF-tg 마우스와 교배시켰으며, 이는 SHN3-3KA 돌연변이가 대퇴골에서 TNF-유도된 골 손실로부터 보호하였음을 입증한다 (도 9i). 이들 결과는 SHN3의 ERK-매개 인산화가 TNF-유도된 골 손실에 요구된다는 것을 시사한다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 사용하여 RNAi-기반 골 동화작용 유전자 요법을 조사하였다. rAAV9의 골로의 귀소를 가능하게 하면서 비-관련 조직으로의 탈-표적화 형질도입을 가능하게 하는 rAAV 혈청형 9 캡시드의 변형을 개발하였고, 이는 DSS.rAAV9로 지칭된다. 이러한 변형된 rAAV9는 골에 존재하는 OB 내에서 shn3을 침묵시키고, OB 활성을 증대시키고, 골 형성을 촉진하는 인공 마이크로RNA (ami-RNA, amiR) (amiR-SHN3)를 전달할 수 있다 (예를 들어, DSS.rAAV9.amiR-SHN3). 추가적으로, 폐경후 골다공증의 마우스 모델에서 DSS.rAAV9.amiR-SHN3의 전신 전달은 골 손실을 상쇄시키고 골 기계적 특성을 증진시키는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, DSS.rAAV9는 또한 세포 배양물 및 마우스에서 OC의 형질도입에 효과적이고, 주요 OC 조절제인 카텝신 K의 발현을 침묵시키는 amiR (예를 들어, amiR-CTSK)을 OC에 전달하여 OC-매개 골 흡수를 억제할 수 있다. DSS.rAAV9.amiR-CTSK의 전신 전달은 폐경후 및 노인성 골다공증의 마우스 모델에서 골 손실을 역전시키고 골 기계적 특성을 개선시키는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도, 전신 투여된 DSS.rAAV9.amiR-CTSK는 동시에 OC-매개 골-흡수를 억제하고 OB-매개 골 형성을 촉진할 수 있다.
DSS.rAAV9.egfp-처리된 SKG 마우스를 커들란으로 처리하여 염증성 관절염을 유도하였다. 2주 후에, AAV의 조직 분포를 형광 현미경검사에 의해 평가하였으며 (도 10a), 이는 대퇴골 및 염증발생 발목에 상주하는 OB 및 OC로의 AAV의 형질도입을 나타낸다. DSS.rAAV9.amiR-SHN3의 단일 i.v. 주사는 경골에서 shn3 mRNA 수준의 ~40% 감소를 발생시켰다 (도 10b). 임상 염증 점수 및 비장에서의 골수성 및 림프성 세포 집단은 대조군 및 amiR-SHN3을 발현하는 관절염성 SKG 마우스 사이에서 대등하였고 (도 10c-10e), 이는 국부 및 전신 염증이 SHN3의 AAV-매개 침묵에 의해 영향을 받지 않았음을 입증한다. 현저하게, 커들란-유도된 염증은 대조군-발현 SKG 마우스의 대퇴골에서 지주 골 질량 및 피질 두께의 유의한 감소를 유도한 반면, 관절염성 SKG 마우스에서 SHN3의 AAV-매개 침묵은 전신 골 손실 (도 10f) 및 관절 골 미란 (도 10g)을 예방하였다. 이들 결과는 전신 전달된 AAV9에 의한 SHN3 침묵이 염증성 관절염의 마우스 모델에서 전신 골다공증 및 국소 관절 골 미란 둘 다를 보호하는 데 효과적이라는 것을 시사한다. 유사하게, DSS.rAAV9.amiR-CTSK를 i.v. 주사한 경우에 관절염성 SKG 마우스의 대퇴골에서 전신 골 손실 및 발목 및 발에서 관절주위 골 미란이 보존되었다 (도 11a 및 b). 그러나, 관절 염증은 DSS.rAAV9.amiR-CTSK를 사용한 처리에 의해 약간 증가되었다 (도 11c). 이들 결과는 SHN3 또는 CTSK의 AAV-매개 침묵을 통한 염증성 관절염-유도된 골 손실로부터의 보호가 심지어 대등한 수준의 염증의 존재 하에서도 발생한다는 것을 나타낸다.
관절염성 SKG 마우스에서의 전신 및 관절 염증이 SHN3 또는 CTSK의 AAV9-매개 침묵에 의해 완화되지 않았기 때문에, 염증성 관절염에서 동시에 골 손실/미란을 예방하고 염증을 억제할 수 있는 다가 골-표적화 rAAV9를 생산하였다. sTNFR2 및 sIL1Ra는 그의 동족 수용체에 대해 TNFα 및 IL-1α/β와 경쟁적으로 결합하고, 따라서 각각 TNFα- 및 IL-1α/β-유도된 신호 전달을 억제하는 것으로 이전에 보고되었다. 따라서, 분비된 TNF 길항제, 가용성 인간 TNFR2 또는 분비된 IL-1 길항제, 가용성 인간 IL1Rα를 amiR-ctrl, amiR-SHN3 또는 amiR-CTSK를 보유하는 AAV 벡터 게놈 내로 클로닝하고, DSS.rAAV9 캡시드 내로 패키징하였다 (도 12; 구축물 1은 DSS.rAAV9.amiR-ctrl.sTNFR2 또는 sIL1Ra; DSS.rAAV9.amiR-SHN3.sTNFR2 또는 IL1Ra; DSS.rAAV9.amiR-CTSK.sTNFR2 또는 sIL1Ra를 포함함). 그러나, 전신 전달 후, 이들 벡터는 또한 골에 더하여 간, 심장, 및 골격근도 표적화하는 것으로 관찰되었다. 이를 피하기 위해, rAAV9 게놈 내로 완벽하게 상보적인 miR-1 및 miR-122-결합 부위를 각각 조작함으로써 골격/심장 근육 및 간에서 rAAV 발현을 억제하기 위한 조직-특이적, 내인성 miRNA를 생산하였다. 간, 심장, 및 근육에서의 트랜스진 발현의 침묵은 간세포에서 발현되는 풍부한 (≥60,000 카피/세포) miRNA인 miR-122, 및 사실상 모든 동물의 심장 및 골격근에서 발견되는 miRNA인 miR-1의 자연 발현을 이용하였다.
EGFP 트랜스진의 3'-UTR에서 상보적 miR-1 및 miR-122-결합 부위를 함유하는 골-표적화 rAAV9 (도 12; 예를 들어, 구축물 2= DSS.rAAV9.MIR.BS)를 생산하였다. EGFP 트랜스진을 보유하는 rAAV9, DSS.rAAV9 또는 DSS.rAAV9.MRI.BS 벡터의 단일 i.v. 주사 2주 후, 전신 (도 13a) 및 개별 조직 (도 13b)에서의 그의 생체-분포를 광학 영상화 시스템을 사용하여 EGFP 발현에 의해 평가하였다. 심장, 간, 및 골격근에서 높은 EGFP 발현을 나타내는 rAAV9-처리된 마우스와 비교하여, DSS.rAAV9-처리된 마우스에서는 보통의 발현이 검출되었고, DSS.rAAV9.MIR.BS에서는 발현이 거의 내지 전혀 검출되지 않았다. qPCR 분석은 또한 이들 조직에서 EGFP mRNA 수준의 유사한 패턴을 보여준다 (도 13c). 특히, 대퇴골에서의 EGFP 발현은 처리된 마우스 사이에서 비교적 대등하였다 (도 13c 및 d).
sTNFR2 및 sIL1Ra를 비롯한 항염증 단백질의 구성적 발현은 숙주 세포를 병원성 감염에 대해 감수성으로 만들 수 있기 때문에, 염증성 관절염이 발생한 경우에만 그의 발현을 제한하는 것이 중요하다. 염증성 관절염의 발병기전의 중심은 자가반응성 T 세포에 의한 대식세포의 활성화이며, 이는 염증유발 시토카인, 예컨대 TNF, IL-1, IL-6, 및 IL-17의 방출을 발생시킨다. 이들 시토카인, 그의 동족 수용체 또는 하류 신호전달 성분을 표적화하는 생물학적 항체 및/또는 소분자 화합물은 RA 환자에서 큰 효능을 나타내었다. NF-κB 활성화가 이들 염증유발 시토카인의 신호 전달 하류를 개시하기 위한 핵심임을 고려하여, 2개의 NF-κB-결합 부위 및 1개의 최소 FosP 부위를 함유하는 PB2 프로모터를 이용하여 염증유발 시토카인에 반응하여 EGFP를 발현시켰다 (도 12; 구축물 3 및 도 14a; PB2-GFP). EGFP 발현은 PB2-GFP 벡터-발현 HEK293 세포에서 NF-κB 경로를 활성화시키는 다양한 염증유발 시토카인에 의한 자극 시 현저하게 상향조절되었으며 (도 14b), 이는 PB2 프로모터가 염증에 반응하여 트랜스진 발현을 구동시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
다음으로, 염증유발 시토카인에 대한 PB2-egfp-발현 OB/OC의 반응성을 조사하기 위해, PB2-GFP 카세트를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 AAV9 캡시드 내로 패키징하고, 벡터를 1차 COB 및 BM-OC 내로 형질도입하였다. PB2-egfp-발현 HEK293 세포와 유사하게, COB에서의 EGFP 발현은 TNF, TNF+IL-17A, LPS, 및 IL-1β를 포함한 NF-κB 경로의 강한 활성화인자에 의해 현저하게 상향조절되었고, IFN-γ는 보통의 발현을 유도하였다. 그러나, NF-κB 활성화의 약한 유도인자인 IL-17A, IL-6, IL-22, 및 IL-23의 존재 하에서는 유도가 거의 내지 전혀 검출되지 않았다 (도 15). 마찬가지로, PB2-egfp-발현 BM-OC는 RANKL, TNF, TNF+IL-17A, LPS, 및 IL-1β에 의해 자극된 경우 EGFP의 높은 유도를 나타내지만, IL-17A, IL-6, 및 IL-23에 의해서는 그렇지 않다 (도 15). 이들 결과는 PB2-egfp-발현 OB 및 OC에서의 EGFP 유도가 염증유발 시토카인에 의한 NF-κB 활성화에 상응한다는 것을 나타낸다.
SKG 마우스에서의 질환의 발병은 커들란의 전신 주사에 의해 TNF, IL-17, IL-1 및 IL-6을 비롯한 활막에서의 NF-κB 활성화 시토카인의 상향조절을 통해 시기조정될 수 있다. PB2-egfp-발현 조직이 염증성 관절염 상황에서 EGFP 발현을 유도할 수 있는지 시험하기 위해, WT 또는 SKG 마우스를 rAAV9.PB2-egfp의 주사 2주 후에 커들란으로 처리하고, 3주 후에, 전신 및 개별 조직에서의 EGFP 발현을 광학 영상화 (도 16a) 및 qPCR 분석 (도 16b)에 의해 평가하였다. PBS-처리된 WT 마우스 (없음)에서는 발현이 거의 내지 전혀 검출되지 않았지만, 커들란-처리된 WT 마우스는 뇌, 심장, 간, 및 골격근에서 EGFP의 보통의 발현을 나타낸다. 이들 마우스와 비교하여, 심장, 간, 골격근, 및 대퇴골에서의 EGFP 발현은 커들란-처리된 SKG 마우스에서 현저하게 증가하였다. 이는 커들란으로 처리한 경우 SKG 마우스의 동결절편화된 심장, 간, 골격근, 및 대퇴골에서의 EGFP 발현의 유의한 증가를 보여주는 조직학 데이터와 일치한다 (도 16c).
rAAV9.PB2-egfp 벡터가 염증성 관절염 상황에서 비-골격 조직에서 EGFP를 발현할 수 있다는 것을 고려하여, 상보적 miR-1 및 miR-122-결합 부위가 EGFP 트랜스진의 3'-UTR에 삽입될 것이고, 이어서 AAV 게놈이 골-표적화 AAV9 캡시드 내로 패키징될 것이다 (도 12; 구축물 4=DSS.rAAV9.PB2-egfp.MIR.BS). 이러한 기술은 염증이 발생할 경우 rAAV9.PB2-egfp 벡터가 골 조직에서만 트랜스진을 발현하도록 한다. 추가적으로, 관절 염증을 억제하기 위해, EGFP 트랜스진을 sTNFR2 또는 sIL1Rα로 대체한 다음, AAV 게놈을 DSS.rAAV9 캡시드 내로 패키징하였다 (도 12; 구축물 5= DSS.rAAV9.PB2-sTNFR2.MIR.BS, DSS.rAAV9.PB2-sIL1Rα.MIR.BS). 염증성 관절염에서 sTNFR2 또는 sIL1Rα의 염증-반응성 발현 및 구성적 발현의 치료 유효성을 비교하기 위해, sTNFR2 또는 sIL1Rα의 CB 프로모터-구동된 발현 및 이들 트랜스진의 3'-UTR에서 상보적 miR-1 및 miR-122-결합 부위를 함유하는 AAV 게놈 벡터를 또한 생성하였다 (도 12; 구축물 6= DSS.rAAV9.CB-sTNFR2.MIR.BS, DSS.rAAV9.CB-sIL1Rα.MIR.BS). amiR-ctrl, amiR-SHN3, 또는 amiR-CTSK는 CB- 또는 PB2-프로모터와 sTNFR2 또는 sIL1Rα 트랜스진 사이에 인트론으로 삽입될 것이며, 이는 동시에 염증을 억제하고 골 손실을 예방할 수 있다 (도 12; 구축물 7=DSS.rAAV9.CB.amiR-ctrl, amiR-SHN3, amiR-CTSK.sTNFR2.MIR.BS, DSS.rAAV9.CB.amiR-ctrl, amiR-SHN3, amiR-CTSK.sIL1Rα.MIR.BS; 도 12; 구축물 8= DSS.rAAV9.PB2.amiR-ctrl, amiR-SHN3, amiR-CTSK.sTNFR2.MIR.BS, DSS.rAAV9.PB2.amiR-ctrl, amiR-SHN3, amiR-CTSK.sIL1Rα.MIR.BS).
염증성 관절염 상황에서 전신 및/또는 관절 염증, 전신 골 손실, 및/또는 국소 관절 골 미란을 억제하는 그의 능력을 조사하기 위해, 벡터의 4 x 1011 GC의 단일 용량을 염증성 관절염의 SKG 모델에 i.v. 주사한다. 2주 후에, SKG 마우스를 커들란으로 처리하여 염증성 관절염을 가속화하고, 커들란 주사 6주 후에 안락사시킨다. 마우스는 관절 종창, 발목 두께의 캘리퍼 측정, 및 그립 강도를 포함하는 검증된 점수화 시스템을 사용하여 임상 염증에 대해 매주 점수화될 것이다. 미란의 정량화를 위한 무릎 및 발목 관절의 마이크로CT 영상화를, 관절 미란의 조직학적 평가와 함께 수행한다. 정량적 PCR (qPCR)을 위해 활막 mRNA를 수집하고, 혈청 ELISA 검정으로 시토카인 발현 수준을 측정한다 (도 18).
전신 골 손실은 마이크로CT를 사용하여 장골 및 요추의 지주 골 질량 및 피질 두께를 측정하는 것에 의해 정량화된다 (도 18). 형질도입 효율을 정량화하고 DSS.rAAV9 벡터의 조직 분포를 결정하기 위해, 전신 및 개별 조직에서의 EGFP 발현을 동결절편화된 조직에 대한 IVIS-100 광학 영상화 및 형광 현미경검사에 의해 모니터링한다. 조직 추출물에서의 EGFP 발현은 또한 항-GFP Ab를 사용한 이뮤노블롯팅에 의해 검증된다. 대안적으로, SHN3 또는 CTSK의 녹다운 효율 및/또는 sTNFR2 또는 sIL1Rα의 발현을 경골 RNA에서 mRNA 수준을 측정하는 것에 의해 조사한다 (도 18).
OB 및 OC 분화에 대한 AAV 벡터의 생체내 효과는 대퇴골 및 관절 (무릎/발목)의 H 및 E 염색된 파라핀 절편에서 평가한다. 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP)를 OC 마커로서 사용하고, OB 분화 마커 (OBD)로서 유형 I 콜라겐 α1 (Col1) 및 Runx2 Ab를 사용하여 슬라이드를 면역염색한다. 관절에서의 면역 세포 침윤을 CD11b/Mac-1 (대식세포/단핵구), CD335 (NK 세포), CD4 (T 세포), 및 B220 (B 세포)에 대한 면역조직화학 (IHC)에 의해 평가하여, 군들 사이에 염증에서 차이가 없다는 것을 확인한다 (도 18).
동적 및 정적 조직형태측정법을 수행하여 OB 및 OC의 수, 무기질 부착률 및 무기질화된 표면/골 표면을 분석하여 대퇴골 및 관절에서 골 형성률을 계산한다. 마우스를 5일 간격으로 칼세인 또는 알리자린 표지의 복강내 (i.p.) 주사로 처리하여 이들 표지가 골 내로 혼입되도록 한다 (도 18).
총 장골 RNA의 qPCR 분석을 사용하여 OB 마커 유전자 (예를 들어, 조직 비특이적 알칼리성 포스파타제 (TNALP), 오스테오폰틴 (OPN), 골 시알로단백질 (BSP), 오스테릭스 (OSX), 오스테오칼신 (OCN))의 발현을 분석한다. 전신 OB 및 OC 활성은 각각 유형 1 프로콜라겐의 N-말단 프로펩티드 (P1NP) 및 유형 I 콜라겐 C-말단 텔로펩티드 (CTX)를 포함한 혈청 골 교체 마커를 측정하는 것에 의해 분석된다. 도 18은 본원에 기재된 유전자 발현 구축물과 관련된 분자 메카니즘의 한 실시양태를 보여주는 개략도이다.
실시예 2: 유전자 발현 구축물의 설계
OC-특이적 프로모터 또는 OB-특이적 프로모터를 포함하는 추가의 발현 구축물을 생산하였다 (도 19). 구축물에 포함된 OC-특이적 프로모터는 RANK 프로모터를 포함한다. OB-특이적 프로모터는 오스테오칼신 (OCN) 프로모터를 포함한다.
RNAK 또는 OCN 프로모터가 OB- 또는 OC-특이적 방식으로 GFP 단백질의 발현을 구동하는 능력을 시험하기 위해, CB, OCN, RANK 프로모터에 의해 GFP 발현이 구동되는 rAAV9와 함께 COB 또는 BM-OC를 인큐베이션하였고, 이는 이어서 각각 성숙 골모세포 또는 파골세포로 분화되었다. OCN 프로모터는 성숙 골모세포에서 GFP 단백질을 발현시키는데 특이적이었고, 한편 CB 및 RANK 프로모터는 성숙 골모세포 및 파골세포 둘 다에서 GFP 단백질을 발현시켰다 (도 20).
이중 발현 구축물을 또한 생산하였다. 이중 발현 구축물의 한 실시양태는 도 21에 제시된다. 이들 구축물의 인공 마이크로RNA (amiRNA)는 miR-33 백본을 포함한다. 도 21에 제시된 GFP 단백질은 치료 단백질, 예를 들어 TNFR2, sIL1Rα 등으로 대체될 수 있다는 것을 주목한다.
서열
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산 또는 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산 또는 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열에 상보적인 (예를 들어, 그의 상보체인) 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산 또는 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열의 역 상보체인 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단리된 핵산 또는 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)는 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열의 부분을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 부분은 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열의 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 핵산 서열은 핵산 센스 가닥 (예를 들어, 5'에서 3' 가닥)이거나, 또는 바이러스 서열과 관련하여 플러스 (+) 가닥이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 핵산 서열은 핵산 안티센스 가닥 (예를 들어, 3'에서 5' 가닥)이거나, 또는 바이러스 서열과 관련하여 마이너스 (-) 가닥이다.
>CMV 인핸서 핵산 서열 (서열식별번호: 1)
Figure pct00001
>닭 베타-액틴 (CB) 프로모터 핵산 서열 (서열식별번호: 2)
Figure pct00002
>PB2 (NF-카파 B (NFκB)) 프로모터 핵산 서열 (서열식별번호: 3)
Figure pct00003
>오스테오칼신 (OCN) 프로모터 핵산 서열 (서열식별번호: 4)
Figure pct00004
>RANK 프로모터 핵산 서열 (서열식별번호: 5)
Figure pct00005
>가용성 TNFα 수용체 2 (sTNFR2) 핵산 서열 (서열식별번호: 6)
Figure pct00006
>가용성 TNFα 수용체 2 (sTNFR2) 아미노산 서열 (서열식별번호: 7)
Figure pct00007
>hs-amiRNA33-mSHN3 핵산 서열 (서열식별번호: 8)
Figure pct00008
>hs-amiRNA33-hSHN3 핵산 서열 (서열식별번호: 9)
Figure pct00009
>amiR-33-mSHN3 핵산 서열 (서열식별번호: 10)
Figure pct00010
>amiR-33-hSHN3 핵산 서열 (서열식별번호: 11)
Figure pct00011
>amiR-mRankL 핵산 서열 1 (서열식별번호: 12)
Figure pct00012
>hs-amiR-mRankL 핵산 서열 1 (서열식별번호: 13)
Figure pct00013
>amiR-mRankL 핵산 서열 2 (서열식별번호: 14)
Figure pct00014
>hs-amiR-mRankL 핵산 서열 2 (서열식별번호: 15)
Figure pct00015
>amiR-hRankL 핵산 서열 1 (서열식별번호: 16)
Figure pct00016
>amiR-hRankL 핵산 서열 2 (서열식별번호: 17)
Figure pct00017
>hs-amiR-hRankL 핵산 서열 1 (서열식별번호: 18)
Figure pct00018
>hs-amiR-hRankL 핵산 서열 2 (서열식별번호: 19)
Figure pct00019
>amiRNA-m카텝신 K 핵산 서열 (서열식별번호: 20)
Figure pct00020
>hs-amiRNA-m카텝신 K 핵산 서열 (서열식별번호: 21)
Figure pct00021
>amiRNA-h카텝신 K 핵산 서열 1 (서열식별번호: 22)
Figure pct00022
>amiRNA-h카텝신 K 핵산 서열 2 (서열식별번호: 23)
Figure pct00023
>hs-amiRNA-h카텝신 K 핵산 서열 1 (서열식별번호: 24)
Figure pct00024
>hs-amiRNA-h카텝신 K 핵산 서열 2 (서열식별번호: 25)
Figure pct00025
>amiRNA-mSOST 핵산 서열 (서열식별번호: 26)
Figure pct00026
>hs-amiRNA-mSOST 핵산 서열 (서열식별번호: 27)
Figure pct00027
>amiRNA-hSOST 핵산 서열 1 (서열식별번호: 28)
Figure pct00028
>amiRNA-hSOST 핵산 서열 2 (서열식별번호: 29)
Figure pct00029
>hs-amiRNA-hSOST 핵산 서열 1 (서열식별번호: 30)
Figure pct00030
>hs-amiRNA-hSOST 핵산 서열 2 (서열식별번호: 31)
Figure pct00031
>miR-122 결합 부위 (서열식별번호: 32)
Figure pct00032
>rAAVsc CB6 PI sTNFR2 miR1&122 BS (서열식별번호: 33)
Figure pct00033
Figure pct00034
>가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα) 핵산 서열 (서열식별번호: 34)
Figure pct00035
>가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα) 아미노산 서열 (서열식별번호: 35)
Figure pct00036
>rAAVsc CB6 PI sIL-1Ra miR1&122 BS (서열식별번호: 36)
Figure pct00037
Figure pct00038
>rAAV-scCB6 (hs-amiR33SHN3) EGFP (서열식별번호: 37)
Figure pct00039
Figure pct00040
>rAAV-amiR-m카텝신K (서열식별번호: 38)
Figure pct00041
Figure pct00042
>rAAV-amiR-SHN3+amiR-카텝신K (서열식별번호: 39)
Figure pct00043
Figure pct00044
>rAAV-amiR-SHN3+amiR-SOST (서열식별번호: 40)
Figure pct00045
등가물
본 발명의 여러 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적 적용 또는 적용들에 따라 달라질 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서, 본 발명은 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 한, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수 표현은, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 이와 같이 연결된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉 일부 경우에는 공동으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인되는 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용되는 경우에, 한 실시양태에서, B가 없는 A (B 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 없는 B (A 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 경우에, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 또는 열거된 요소 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 하나 초과, 및 임의로 추가의 미열거 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~중 오직 하나" 또는 "~중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때, "~로 이루어진"과 같이 달리 명백하게 나타낸 용어만이 다수의 또는 열거된 요소 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "~중 하나", "~중 오직 하나" 또는 "~중 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 선행될 때 배타적 대안 (즉, "하나 또는 다른 것, 그러나 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로만 해석될 것이다. "본질적으로 이루어진"이 청구범위에서 사용될 때 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 그의 통상적인 의미를 가질 것이다.
하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인되는 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는 (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함), 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A; 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는 (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함), 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B; 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
청구범위에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "포함하는", "비롯한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "수용하는" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 단지 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"만이 각각 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.
청구범위에서 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구범위 요소를 수식하는 것은 그 자체로 한 청구범위 요소의 또 다른 것에 대한 임의의 우선순위, 우위, 또는 순서, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간적 순서를 내포하는 것이 아니라, 단지 특정 명칭을 갖는 한 청구범위 요소를 (서수 용어를 사용하는 것을 제외하고) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구범위 요소를 구별하기 위한 라벨로서 사용된다.
수치에 선행하는 용어 "약" 및 "실질적으로"는 언급된 수치의 ±10%를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Massachusetts <120> DEVELOPMENT OF NOVEL GENE THERAPEUTICS FOR INFLAMMATION-INDUCED BONE LOSS <130> U0120.70145WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/067,581 <151> 2020-08-19 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc gcccattgac gtcaataatg 60 acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 120 ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 180 attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 240 gactttccta cttggcagta catctactcg aggccacgtt ctgctt 286 <210> 2 <211> 265 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt 60 ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc 120 ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg 180 cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa 240 gcgcgcggcg ggcgggagcg ggatc 265 <210> 3 <211> 247 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tgagctcaca gaggggactt tccgagagat ctacagaggg gactttccga gagcgagctt 60 gggctgcagg tcgaccgtcc atccattcac agcgcttcta taaaggcgcc agctgaggcg 120 cctactactc caaccgcgac tgcagcgagc aactgagaag actggataga gccggcggtt 180 ccgcgaacga gcagtgaccg cgctcccacc cagctctgct ctgcagctcc accagtgtct 240 ctctaga 247 <210> 4 <211> 1030 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gaattgctca tcgcagcctg acggcgtagg ttcatttcat ttccacctag agcaagtgac 60 tgtaacgaca catttctttt tgaatgttct cattcatgaa aggccttcac tttaatatta 120 ttacgaacat ctaatttgtg gacatcaagc gggctcctca cactctgaaa ccagataccc 180 ccgagccccc gcaggttttt cttcctcatt atcaggggtc ccaggcatct ggagcttaat 240 gtgggatgtc tccaacacaa gcagggctag aacctcaagg cagaaggttg atgttgaagc 300 tatagagggg tgctacttac tgacttgctc atcatggcat tctcagcctg ctgtcttata 360 gaacccaaga ccatggccca 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1926 <210> 40 <211> 1926 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120 aagatcaatt cggtacaatt cacgcgtcga cattgattat tgactctggt cgttacataa 180 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc ccgcccattg acgtcaataa 240 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420 gggactttcc tacttggcag tacatctact cgaggccacg ttctgcttca ctctccccat 480 ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 540 gatgggggcg gggggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 600 ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 660 agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 720 gggcgggagc gggatcagcc accgcggtgg cggccctaga gtcgatcgag gaactgaaaa 780 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gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1680 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1740 ggattgggaa gacaattagg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 1800 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1860 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 1920 gcgcag 1926

Claims (51)

  1. 스클레로스틴 (SOST), 슈누리-3 (SHN3), 카텝신 K (CTSK), NF-κβ의 수용체 활성화제 (RANK) 및/또는 NF-κβ 리간드의 수용체 활성화제 (RANKL)를 표적화하는 1종 이상의 억제 핵산을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 파골세포 (OC)-특이적 프로모터 또는 골모세포 (OB)-특이적 프로모터를 포함하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 트랜스진이 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 단백질이 치료 단백질인 단리된 핵산.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단백질이 가용성 인간 종양 괴사 인자 알파 수용체 2 (sTNRF2), 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα), 또는 sTNRF2 및 sIL1Rα를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, OC-특이적 프로모터가 NF-κβ 프로모터 (예를 들어, RANK 프로모터)를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  6. 제5항에 있어서, OC-특이적 프로모터가 염증에 의해 유도되고, 임의로 NF-κβ 프로모터가 PB2 프로모터 (서열식별번호: 3)인 단리된 핵산.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, OB-특이적 프로모터가 오스테오칼신 (OCN) 프로모터 (서열식별번호: 4)를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 shRNA, miRNA, 또는 인공 miRNA (ami-RNA)인 단리된 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 인간 miRNA 백본, 임의로 인간 miR-33 백본을 포함하는 ami-RNA인 단리된 핵산.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 마우스 miRNA 백본, 임의로 마우스 miR-33 백본을 포함하는 ami-RNA인 단리된 핵산.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 SHN3을 표적화하고, 임의로 여기서 억제 핵산이 서열식별번호: 8-11 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 CTSK를 표적화하고, 임의로 여기서 억제 핵산이 서열식별번호: 20-25 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 SOST를 표적화하고, 임의로 여기서 억제 핵산이 서열식별번호: 26-31 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 RANK를 표적화하는 것인 단리된 핵산.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 억제 핵산 중 적어도 1종이 RANKL을 표적화하고, 임의로 여기서 억제 핵산이 서열식별번호: 12-19 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제1 억제 핵산; 및 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 것인 단리된 핵산.
  17. SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제1 억제 핵산; 및 SHN3, CTSK, SOST, RANK, 및 RANKL로부터 선택된 유전자를 표적화하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 트랜스진이 제1 억제 핵산 또는 제2 억제 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴 (CB) 프로모터를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  20. 제19항에 있어서, 트랜스진이 CMV 인핸서 서열을 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산.
  21. 제20항에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터이고, 임의로 여기서 유도성 프로모터는 대상체에서 염증에 의해 유도되는 것인 단리된 핵산.
  22. 제21항에 있어서, 유도성 프로모터가 PB2 프로모터를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 단백질을 추가로 코딩하는 것인 단리된 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 단백질이 치료 단백질인 단리된 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 치료 단백질이 가용성 인간 종양 괴사 인자 알파 수용체 2 (sTNRF2), 가용성 IL-1 수용체 길항제 (sIL1Rα), 또는 sTNRF2 및 sIL1Rα를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 1개 이상의 miRNA 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산.
  27. 제26항에 있어서, miRNA 결합 부위 중 적어도 1개가 miR-1 결합 부위 또는 miR-122 결합 부위인 단리된 핵산.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 것인 단리된 핵산.
  29. 제28항에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인 단리된 핵산.
  30. 서열식별번호: 1-40 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이를 코딩하는 단리된 핵산.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 플라스미드, 바크미드, 코스미드, 바이러스, 폐쇄형-말단 선형 DNA (ceDNA), 또는 바큘로바이러스 벡터인 벡터.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  34. (i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단리된 핵산; 및
    (ii) 적어도 1종의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질
    을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  35. 제34항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh39, AAV.43, AAV2/2-66, AAV2/2-84, 및 AAV2/2-125로부터 선택된 혈청형의 것, 또는 상기 중 임의의 것의 변이체인 rAAV.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 골모 세포 (OB)를 형질도입하며, 임의로 여기서 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAVrh10, AAVrh39로부터 선택된 혈청형의 것, 또는 상기 중 임의의 것의 변이체인 rAAV.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 파골 세포 (OC)를 형질도입하며, 임의로 여기서 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV.rh39, 및 AAV.rh43으로부터 선택된 혈청형의 것, 또는 상기 중 임의의 것의 변이체인 rAAV.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 아미노산 서열 DSSDSSDSSDSSDSSDSS (서열식별번호: 41)를 포함하는 것인 rAAV.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  40. 대상체에게 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 골 손실을 억제하는 방법.
  41. 대상체에게 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 관절에서 염증을 억제하는 방법.
  42. 대상체에게 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물이고, 임의로 여기서 대상체가 인간인 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 염증성 상태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되고, 임의로 여기서 염증성 상태는 류마티스 관절염인 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 주사에 의해 이루어지고, 임의로 여기서 주사는 전신 주사 또는 국부 주사인 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 rAAV를 포함하는 조직 또는 이식편의 대상체 내로의 이식에 의해 이루어지는 것인 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체에서 염증성 시토카인의 감소 및/또는 골 세포 손실의 감소를 발생시키는 것인 방법.
  48. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 주사가 정맥내 주사를 포함하는 것인 방법.
  49. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 국부 주사가 근육내 (IM) 주사, 무릎 주사, 또는 대퇴 수질내 주사를 포함하는 것인 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 활성 오스테오칼신-발현 골모세포의 감소를 발생시키는 것인 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP)-발현 파골세포 또는 유형 I 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드 (Ctx-I)의 증가를 발생시키는 것인 방법.
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