JP2021520811A - ヘキソサミニダーゼアルファおよびベータサブユニットをコードしているバイシストロニックａａｖベクターならびにその使用 - Google Patents

Abstract

本開示の態様は、ヘキソサミニダーゼＡ（ＨＥＸＡ）およびヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）タンパク質をコードしている導入遺伝子を含むバイシストロニックＡＡＶ核酸構築物に関する。一部の実施形態において、本開示は、本開示に記載されるバイシストロニック核酸構築物を使用してテイサックス病およびサンドホフ病等のリソソーム蓄積疾患を処置または防止する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１８年４月１３日出願の米国特許仮出願第６２／６５７，２４３号の出願日における米国特許法第１１９条の下での利益を主張するものであり、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号ＮＳ０９３９４１の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

テイサックス病（ＴＳＤ）およびサンドホフ病（ＳＤ）は、それぞれＨＥＸＡまたはＨＥＸＢ遺伝子における突然変異に起因するヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）の欠損が原因の常染色体劣性リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。ＨｅｘＡ欠損は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＧＭ２ガングリオシドの貯蔵ならびに神経機能の進行的悪化、発達上の退行および最終的に早死をもたらす。現在のところ、総称してＧＭ２ガングリオシド蓄積症として公知であるこれらの疾患に対する利用可能な処置は存在しない。

本開示の態様は、遺伝子送達用の組換えＡＡＶベクターに関する。本開示は、ヘキソサミニダーゼアルファおよびベータサブユニットを同時にコードしている単一のＡＡＶベクターが、対象（例えば、テイサックス病またはサンドホフ病を有する対象）のＣＮＳにおいてＨｅｘＡの、より低侵襲であり潜在的により効果的な発現を可能にするという発見に一部基づく。実施例の節に記載の通り、本開示の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで機能的であることが示されている構成で２つのＨｅｘＡサブユニット（例えば、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ転写産物をコードする）を含み、重要な治療的マイルストーンを実現する。

したがって、一部の態様において、本開示は：第１のプロモーターの制御下にヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨｅｘＡ）をコードしている核酸および第１のイントロンを含む第１の発現カセット；ならびに第２のプロモーターの制御下にヘキソサミニダーゼベータサブユニット（ＨｅｘＢ）をコードしている核酸および第２のイントロンを含む第２の発現カセットを含む、単離された核酸構築物を提供する。一部の実施形態において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。

一部の実施形態において、ＨｅｘＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨｅｘＢは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、第１のイントロンは、第１のプロモーターとＨｅｘＡをコードしている核酸配列との間に位置する。一部の実施形態において、第１のイントロンは、キメライントロンである。一部の実施形態において、第１のプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲの近位に位置し、任意選択で、第１のプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲとＨｅｘＡをコードしている核酸配列との間に位置する。一部の実施形態において、第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、Ｐ２プロモーターである。一部の実施形態において、第２のイントロンは、第２のプロモーターとＨｅｘＢをコードしている核酸配列との間に位置する。一部の実施形態において、第２のイントロンは、キメライントロンである。一部の実施形態において、第２のプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲの近位に位置する。一部の実施形態において、第２のプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲとＨｅｘＢをコードしている核酸配列との間に位置する。

一部の実施形態において、第１の発現カセットは、ＨｅｘＡをコードしている核酸配列に作動可能に連結された第１のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）を含み、任意選択で第１のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）は、ＢＧＨポリＡシグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ尾部）である。一部の実施形態において、第２の発現カセットは、ＨｅｘＢをコードしている核酸配列に作動可能に連結された第２のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）を含む。一部の実施形態において、第２のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）は、ＳＶ４０ポリＡシグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡ尾部）である。一部の実施形態において、第１のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）および第２のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）は、互いに近接して位置する。一部の実施形態において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、反対方向に向けられる（例えば、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは互いに向かって転写される）。

一部の態様において、本開示は：ヘキソサミニダーゼアルファサブユニットをコードしている核酸配列を含む第１の発現カセット；およびヘキソサミニダーゼベータサブユニットをコードしている核酸配列を含む第２の発現カセットを含む、単離された核酸構築物であって、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットが、双方向性プロモーターによって作動可能に連結されている、単離された核酸構築物を提供する。一部の実施形態において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。

一部の実施形態において、ＨｅｘＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨｅｘＢは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、双方向性プロモーターは、少なくとも１つのチキンベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含む。一部の実施形態において、双方向性プロモーターは、２つのＣＢＡプロモーターを含み、ＣＢＡプロモーターは、反対方向で第１の発現カセットおよび第２の発現カセットの転写を開始する（例えば、第１の発現カセットの転写は、第２の発現カセットに対して遠位方向に起こる）。一部の実施形態において、双方向性プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー配列を含む。一部の実施形態において、ＣＭＶエンハンサー配列は、２つのＣＢＡプロモーターの間に位置する。

一部の実施形態において、第１の発現構築物は、第１のポリＡシグナル（例えば、第１のポリＡ尾部）を含み、任意選択で第１のポリＡシグナル（例えば、第１のポリＡ尾部）は、ＡＡＶ ＩＴＲに近位である。一部の実施形態において、第１の発現構築物は、第２のポリＡシグナル（例えば、第２のポリＡ尾部）を含む。一部の実施形態において、第２のポリＡシグナル（例えば、第２のポリＡ尾部）は、ＡＡＶ ＩＴＲに近位である。一部の実施形態において、第１および／または第２のポリＡシグナル（例えば、ポリＡ尾部）は、ＳＶ４０ポリＡシグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡ尾部）、ウサギベータグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（例えば、ＲＢＧポリＡ尾部）およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ尾部）からそれぞれ選択される。

一部の態様において、本開示は、配列番号３〜９に記載の配列を含む単離された核酸を提供する。一部の実施形態において、ＨｅｘＡタンパク質および／またはＨｅｘＢをコードしている単離された核酸は、コドン最適化される。

一部の態様において、本開示は、カプシドタンパク質；および上記のいずれかの単離された核酸配列を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。一部の実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢから選択される血清型のものである。

一部の実施形態において、単離された核酸は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲまたはＡＡＶ６ ＩＴＲからなる群から選択されるＩＴＲを含む。

一部の実施形態において、本開示は、核酸またはｒＡＡＶを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である。

一部の態様において、本開示は、リソソーム蓄積症を処置する方法を提供し、本方法は、リソソーム蓄積症を有するもしくはそれと疑われる対象に単離した核酸またはｒＡＡＶを投与するステップを含む。一部の実施形態において、対象はヒトである。

一部の実施形態において、リソソーム蓄積症はテイサックス病またはサンドホフ病である。一部の実施形態において、対象は、対象のヘキソサミニダーゼアルファサブユニットの機能の減少（または喪失）をもたらすＨＥＸＡ遺伝子内の突然変異を有すると特徴付けられる。一部の実施形態において、対象は、対象のヘキソサミニダーゼベータサブユニットの機能の減少または喪失をもたらすＨＥＸＢ遺伝子内の突然変異を有すると特徴付けられる。

一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、頭蓋内注射、脳内注射または脳室系、小脳延髄槽もしくはくも膜下腔内スペースを通したＣＳＦへの注射によって投与される。一部の実施形態において、対象は、リソソーム蓄積症の前駆症状段階の間に、単離された核酸またはｒＡＡＶを投与される。一部の実施形態において、リソソーム蓄積症の前駆症状段階は、出生（例えば、周産期）と４週齢との間に起こる。

ヘキソサミニダーゼアルファおよびベータサブユニットを同時にコードしているバイシストロニックＡＡＶベクターの構造の概略図である。一部の実施形態において、ＡＡＶ−ＢｉＰ２ｉ−ＨｅｘＡＢベクターは、ＡＡＶゲノムの末端に小さいプロモーターを２コピーと小さなイントロン（Ｐ２ｉ）を保有し、Ｈｅｘアルファおよびベータサブユニットの反対方向の発現を駆動する。一部の実施形態において、ＡＡＶ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢベクターは、中央にＣＭＶエンハンサーを持つ反対方向のチキンベータアクチンプロモーターの複製によって設計された双方向性ＣＢＡプロモーターを保有する。 ＡＡＶ処置サンドホフ（ＳＤ）マウス（Ｈｅｘｂ^−／−）の行動成績が経時的に安定なままであったことを示す図である。ＡＡＶ処置ＳＤマウスおよび対照の運動協調性および成績が、６０、９０、１０５、１２０および１４９日齢で評価された。図２Ａは、加速ロータロッド試験（４〜４０ｒｐｍ、３００秒超）を使用したＳＤマウスの成績を示す。図２Ｂは、落下待ち時間を評価する反転スクリーン試験を使用したＳＤマウスの成績を示し、図２Ｃは、後肢運動数を評価する反転スクリーン試験を使用したＳＤマウスの成績を示す。 全身性ＡＡＶ処置が、ＳＤマウスの中枢神経系（ＣＮＳ）の全体にわたってＧＭ２ガングリオシド含有量を減少させることを示す図である。ＧＭ２ガングリオシド含有量は、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）方法を使用してＡＡＶ処置ＳＤマウス（４×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９または１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）において１５０日齢で測定された。正常動物のＣＮＳ中のＧＭ２ガングリオシドレベルは、本方法の検出限界未満であった。 図４Ａ〜Ｄは、４×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９または１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクターで処置した１５０日齢ＳＤマウスの脳内のヘキソサミニダーゼ活性の増大を示す図である。図４Ａは、人工基質ＭＵＧＳを使用した大脳におけるＨｅｘＡ酵素活性を示す。図４Ｂは、人工基質ＭＵＧを使用した大脳における全Ｈｅｘ（ＨｅｘＡ＋ＨｅｘＢ）活性を示す。図４Ｃは、ＭＵＧＳを使用した小脳におけるＨｅｘＡ酵素活性を示す。図４Ｄは、ＭＵＧを使用した小脳における全Ｈｅｘ活性を示す。 図４Ａ〜Ｄは、４×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９または１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクターで処置した１５０日齢ＳＤマウスの脳内のヘキソサミニダーゼ活性の増大を示す図である。図４Ｂは、人工基質ＭＵＧを使用した大脳における全Ｈｅｘ（ＨｅｘＡ＋ＨｅｘＢ）活性を示す。図４Ｃは、ＭＵＧＳを使用した小脳におけるＨｅｘＡ酵素活性を示す。 図４Ａ〜Ｄは、４×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９または１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクターで処置した１５０日齢ＳＤマウスの脳内のヘキソサミニダーゼ活性の増大を示す図である。図４Ｄは、ＭＵＧを使用した小脳における全Ｈｅｘ活性を示す。 ＳＤマウスにおいてＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢの全身性送達と同時に人工基質ＭＵＧを使用した肝臓内の全ヘキソサミニダーゼ活性の増大を示す図である。 全身性ＡＡＶ処置が、ＳＤマウスの生存を延長させることを示す図である。４週齢ＳＤマウスが、低用量または高用量のＡＡＶ療法で処置され、生存が評価された。図６Ａは、低用量のＡＡＶ９−Ｂｉｃ（１×１０^１２ｖｇ）、ＡＡＶ９−Ｐ２Ｉ（１×１０^１２ｖｇ）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−Ｂｉｃ（３×１０^１１ｖｇ）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−Ｐ２Ｉ（３×１０^１１ｖｇ）ベクターまたはＰＢＳ（ＫＯ）による処置を示す。図６Ｂは、高用量ＡＡＶ９−Ｂｉｃ（４×１０^１２ｖｇ）、ＡＡＶ９−Ｐ２Ｉ（４×１０^１２ｖｇ）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（１×１０^１２ｖｇ）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−Ｂｉｃ−Ｐ２Ｉ（１×１０^１２ｖｇ）ベクターまたはＰＢＳ（ＫＯ）による処置を示す。 ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢベクターの全身性送達が、ＳＤマウスの脳全体にわたりＨｅｘ活性を回復させることを示す図である。Ｈｅｘ酵素活性の分布は、矢状脳切片の酵素特異的組織化学的染色を使用して注射１ヵ月後に評価された。ＡＡＶ処置マウス３匹全ての切片が、示される。 バイシストロニックＡＡＶ９によるＧＭ２マウスの新生児ＩＣＶ処置が、神経化学、挙動および生存を改善することを示すデータを示す図である。図８Ａは、ＡＡＶ９−ＢｉＣＢ−ＨｅｘＡＢの注射後１ヵ月の月齢における大脳［Ｃ］、小脳および脳幹［Ｃｂ＋ＢＳ］内のＧＭ２ガングリオシド含有量を示す。図８Ｂは、加速ロータロッド（４〜４０ｒｐｍ ５分間超）試験による運動成績のアセスメントを示す。図８Ｃは、１２０および１５０日齢における反転スクリーン試験（最大１２０秒間）に関するデータを示す。図８Ｄは、カプラン―マイヤー生存プロットを示す。無処置ＧＭ２マウスの生存中央値は、１２９．５日間である。両側ｔ検定が、ＡＡＶと無処置ＧＭ２対照間の予後を比較するために使用された（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１）。 ＡＡＶ９−ＢｉＣＢ−ＨｅｘＡＢの腰部くも膜下腔内送達が、運動成績を改善し、ＧＭ２マウスの生存を増大させることを示すデータを示す図である。図９Ａは、加速ロータロッド（４〜４０ｒｐｍ ５分間超）試験を使用して、およそ６週齢に１×１０^１２ｖｇで処置したＧＭ２マウスにおける経時的な運動成績のアセスメントを示す。図９Ｂは、反転スクリーン試験（最大１２０秒間）に関連するデータを示す。図９Ｃは、無処置ＧＭ２マウスの１２９．５日間と比較して、現在の生存の中央値２６５日間であるＡＡＶ処置したＧＭ２マウスの生存の有意な増大（Ｐ＜０．０００１）を示すカプラン―マイヤー分析を示す。ログランク検定を使用して、延命効果を評価した。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性遺伝子療法は、ＴＳＤおよびＳＤの処置に対する１つの実験的な手法であり、例えば脳実質への導入遺伝子の頭蓋内送達による。ＨｅｘＡはαβヘテロ二量体なので、アルファおよびベータサブユニット両方の過剰発現が必要である。これは、組換えＡＡＶベクターの導入遺伝子のサイズ制限（およそ４．７ｋｂ）のためＨｅｘアルファおよびベータサブユニットを別々にコードしている２つのベクターの同時注入によって通常実現される。ＨｅｘＡ過剰発現は、両方のベクターによる細胞の同時感染を必要とし、ベクターがこれら体液への注入によって希釈されるにつれて同時感染の可能性はいっそう急激に低下するので、血流またはＣＳＦを介する２つの別々のベクターの送達は、この手法の有効性を弱める。

一部の態様において、本開示は、リソソーム蓄積疾患、例えばテイサックス病またはサンドホフ病の処置に有用な組成物および方法に関する。本開示は、対象のＣＮＳにおいて複数（例えば、２、３個等）の治療的導入遺伝子をバイシストロニックに発現させるように構成された発現カセットを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、単離された核酸）および組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に一部基づく。

単離された核酸
一部の態様において、本開示は、対象のＣＮＳ中で治療的導入遺伝子を発現させるのに有用な単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター等のバイシストロニック発現構築物）を提供する。

一部の実施形態において、治療的導入遺伝子は、リソソーム蓄積症（例えば、テイサックス病、サンドホフ病）に関連する１つまたは複数のタンパク質、例えばＨｅｘＡタンパク質、ＨｅｘＢタンパク質もしくはＨｅｘＡおよびＨｅｘＢタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＨｅｘＡタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨｅｘＢタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、ＨｅｘＡをコードしている導入遺伝子）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％等）同一である配列をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、ＨｅｘＢをコードしている導入遺伝子）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％等）同一であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、図１のＡＡＶ−ＢｉＰ２ｉ−ＨｅｘＡＢおよびＡＡＶ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢに示すように反対向きに２つの発現カセットを保有するバイシストロニック発現構築物をコードする。バイシストロニック構築物にコードされるＨｅｘＡおよびＨｅｘＢタンパク質のそれぞれは、それぞれ配列番号１または２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％等）同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、ＨｅｘＡをコードしている導入遺伝子）は、配列番号３〜９のいずれか１つに記載のＨｅｘＡコード核酸配列（例えば野生型ＨｅｘＡ核酸配列、コドン最適化ＨｅｘＡコード配列、等）（または、それらの部分）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％等）同一である核酸配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、ＨｅｘＢをコードしている導入遺伝子）は、配列番号３〜９のいずれか１つに記載のＨｅｘＢコード核酸配列（例えば、野生型ＨｅｘＢ核酸配列、コドン最適化ＨｅｘＢコード配列等）（または、それらの部分）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％等）同一である核酸配列を含む。

「核酸」配列とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のことを指す。一部の実施形態において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、人工的に作製されたことを意味する。核酸に関連して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅された；（ｉｉ）クローニングによって組換えにより作製された；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離等によって精製された；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能なものである。したがって、５’および３’制限部位が公知であるまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含有されているヌクレオチド配列は、単離されているとみなされるが、自然の宿主内に天然の状態で存在している核酸配列は、みなされない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、その必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内に単離された核酸は、存在する細胞内の材料を極めてわずかなパーセンテージ含み得るという点で純粋ではない。そのような核酸は、しかしながら、当業者に公知の標準的な技術によって容易に操作可能なので、その用語が本明細書において使用されるとき、それは単離されている。タンパク質またはペプチドに関連して本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、その天然の環境から単離されたまたは人工的に作製された（例えば、化学合成、組換えＤＮＡ技術によって等）タンパク質またはペプチドを指す。

本発明の単離される核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）でもよい。一部の実施形態において、本開示に記載される単離される核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む領域（例えば、第１の領域）、またはそのバリアントを含む。単離された核酸（例えば、組換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質内にパッケージングされてもよく、対象に投与されてもおよび／または選択した標的細胞に送達されてもよい。「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、最低でも、導入遺伝子およびその調節配列ならびに５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）で一般に構成される。本開示の他の部分に記載されているように、導入遺伝子は、例えば、タンパク質および／または発現制御配列（例えば、ポリＡ尾部）をコードしている領域を含んでもよい。

一般に、ＩＴＲ配列は、長さ約１４５ｂｐである。好ましくは、実質的に、ＩＴＲをコードしている全体の配列は、分子で使用されるが、これら配列のある程度の小さい修飾は、許容可能である。これらＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の技術範囲内にある。（例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)、等の原文を参照のこと）。本発明に利用されるそのような分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作動性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントは、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物のＡＡＶ型を含めた任意の公知のＡＡＶから得られ得る。一部の実施形態において、単離される核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびそれらのバリアントから選択される血清型を有する少なくとも１つのＩＴＲを含む。

一部の実施形態において、単離される核酸は、第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域、等）をさらに含む。一部の実施形態において、第２のＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびそれらのバリアントから選択される血清型を有する。

組換えＡＡＶベクターについて上で同定された主要なエレメントに加えて、ベクターは、ベクターでトランスフェクトされるまたは本発明によって作製されるウイルスで感染させられる細胞において導入遺伝子の転写、翻訳および／もしくは発現を可能にする様式で導入遺伝子のエレメントと作動可能に連結される従来通りの制御エレメントも含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、対象の遺伝子と連続する発現制御配列とトランスでまたは対象の遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終了、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル等効果的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強させる配列（例えば、コザック共通配列）；タンパク質安定性を増強させる配列；ならびに必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強させる配列を含む。天然、構成的、誘導可能および／または組織特異的なプロモーターを含め多くの発現制御配列が、当技術分野で公知であり、利用され得る。

本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列が、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くような方法で共有結合される場合、それらは作動可能に連結されていると言われる。核酸配列が機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、５’調節配列中のプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指令するプロモーター領域の能力を妨げない、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力を妨げない場合、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されていると言われる。したがって、得られた転写産物が、所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るようにプロモーター領域が、そのＤＮＡ配列の転写を実行する能力がある場合、プロモーター領域は、核酸配列に作動可能に連結されたことになる。同様に、共通のプロモーターからの２つ以上のコード領域の転写が、正しい読み枠で翻訳された２つ以上のタンパク質の発現を得られるように連結される場合、それらは作動可能に連結されている。一部の実施形態において、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を産する。

導入遺伝子を含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域等）は、単離される核酸の任意の適した場所に位置し得る。その領域は、例えばイントロン、５’または３’非翻訳領域、等を含めた核酸の任意の非翻訳部分に位置してもよい。

一部の場合において、タンパク質をコードしている核酸配列（例えば、タンパク質コード配列）の第１コドンの上流に領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域等）を位置させることが望ましい場合もある。例えば、領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの２０００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの１０００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの５００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの２５０ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の第１コドンと第１コドンの１５０ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。

一部の場合（例えば、導入遺伝子がタンパク質コード配列を欠く場合）において、導入遺伝子のポリＡシグナルの上流に領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域等）を位置させることが望ましい場合もある。例えば、領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の２０００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の１０００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の５００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の２５０ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の１５０ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の１００ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の５０ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの第１の塩基と第１の塩基の２０ヌクレオチド上流との間に位置してもよい。一部の実施形態において、領域は、プロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基とポリＡシグナル配列の第１のヌクレオチド塩基との間に位置する。

一部の場合において、領域は、導入遺伝子のポリＡシグナルの最後の塩基の下流に位置してもよい。領域は、ポリＡシグナルの最後の塩基と最後の塩基の２０００ヌクレオチド下流の位置との間であってもよい。領域は、ポリＡシグナルの最後の塩基と最後の塩基の１０００ヌクレオチド下流の位置との間であってもよい。領域は、ポリＡシグナルの最後の塩基と最後の塩基の５００ヌクレオチド下流の位置との間であってもよい。領域は、ポリＡシグナルの最後の塩基と最後の塩基の２５０ヌクレオチド下流の位置との間であってもよい。領域は、ポリＡシグナルの最後の塩基と最後の塩基の１５０ヌクレオチド下流の位置との間であってもよい。

導入遺伝子が、２つ以上のポリペプチドをコードする場合、各ポリペプチドは、導入遺伝子内の任意の適した場所に位置し得ることは理解されるべきである。例えば、第１のポリペプチドをコードしている核酸は、導入遺伝子のイントロン内に位置してもよく、第２のポリペプチドをコードしている核酸配列は、別の非翻訳領域内（例えば、タンパク質コード配列の最後のコドンと導入遺伝子のポリＡシグナルの第１の塩基との間）に位置してもよい。

「プロモーター」とは、細胞の合成機構によって認識される、または合成機構を導入される、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列のことを指す。語句、「作動的に位置する」、「制御下にある」、または「転写制御下にある」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御する核酸に対して正しい場所および向きにあることを意味する。

タンパク質をコードしている核酸の場合、ポリアデニル化配列は、導入遺伝子配列の後であって３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に一般に挿入される。本開示における有用なｒＡＡＶ構築物は、イントロンを含有してもよく、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に望ましくは設置される。考え得る１つのイントロン配列は、ＳＶ−４０から得られ、ＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と称される。使用され得る別のベクターエレメントは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列を使用して、単一の遺伝子転写産物から２つ以上のポリペプチドが作製される。ＩＲＥＳ配列を使用して、２つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質が作製される。これらの選抜および他の一般的なベクターエレメントは従来通りであり、多くのこれら配列が利用可能である［例えば、Sambrook et al.およびその中の引用文献、例えばpages 3.18 3.26 and 16.17 16.27ならびにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989を参照のこと］。一部の実施形態において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質中に含まれ；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さいペプチド（長さおよそ１８アミノ酸）である（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子療法ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工系においてこれまで実証されてきた（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931；およびKlump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。

構成的プロモーターの例には、レトロウイルスのニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを持つ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを持つ）［例えば、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照のこと］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］があるがこれに限定されない。一部の実施形態において、プロモーターはＰ２プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはチキンβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは２つのＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーによって分離されている２つのＣＢＡプロモーターである。

誘導可能なプロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度等の環境因子によって、または特定の生理的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞においてのみ調節され得る。誘導可能なプロモーターおよび誘導可能な系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含むが、これに制限されない様々な商業的供給源から利用可能である。他の多くの系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導可能なプロモーターの例には、亜鉛誘導可能なヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)も参照のこと）、ＲＵ４８６誘導系（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)、およびWang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）がある。この文脈において有用であり得る誘導可能なプロモーターのなお他の型は、特定の生理的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞においてのみ調節されるものである。

別の実施形態において、導入遺伝子の天然のプロモーターが、使用されることになる。導入遺伝子の発現が、天然の発現を模倣するべきことが所望される場合、天然のプロモーターが好ましい場合がある。導入遺伝子の発現が時間的にまたは発達上、または、組織特異的様式において、または特定の転写刺激に対する応答して調節されなければならない場合、天然のプロモーターが使用されてもよい。さらなる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザック共通配列等、他の天然の発現制御エレメントを使用して、天然の発現を模倣してもよい。

一部の実施形態において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力をもたらす。一部の場合において、組織特異的調節配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。これらの組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）は、当技術分野で周知である。典型的な組織特異的調節配列には、以下の組織特異的プロモーター：肝臓特異的サイロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン−１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、αミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーター、または心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターがあるが、これに限定されない。他の典型的なプロモーターには、当業者にとって明らかになる中で、ベータアクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、（Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)）、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α鎖プロモーター、ニューロン特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）等のニューロン性がある。

本開示の態様は、２つ以上のプロモーター（例えば、２、３、４、５個、またはより多くのプロモーター）を含む単離された核酸に関する。例えば、タンパク質をコードしている第１の領域およびタンパク質をコードしている第２の領域を含む導入遺伝子を有する構築物の文脈において、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域に作動可能に連結された第１のプロモーター配列）を使用して第１のタンパク質コード領域の発現を駆動し、第２のプロモーター配列（例えば、第２のタンパク質コード領域に作動可能に連結された第２のプロモーター配列）により第２のタンパク質コード領域の発現を駆動することが望ましい場合がある。一般に、第１のプロモーター配列および第２のプロモーター配列は、同じプロモーター配列または異なるプロモーター配列であり得る。一部の実施形態において、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域の発現を駆動するプロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列の非限定的な例には、Ｕ６およびＨ１プロモーター配列がある。一部の実施形態において、第２のプロモーター配列（例えば、第２のタンパク質の発現を駆動するプロモーター配列）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌ ＩＩプロモーター配列の非限定的な例には、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ＲＳＶおよびサイトメガロウイルスプロモーター配列がある。一部の実施形態において、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列は、第１のタンパク質コード領域の発現を駆動する。一部の実施形態において、ｐｏｌ ＩＩプロモーター配列は、第２のタンパク質コード領域の発現を駆動する。

一部の実施形態において、核酸は、タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。タンパク質は、治療用タンパク質（例えば、哺乳動物対象における病態の処置または予防に有用なペプチド、タンパク質またはポリペプチド）またはレポータタンパク質であり得る。一部の実施形態において、ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）およびヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）を含むがこれに限定されない治療用タンパク質は、テイサックスまたはサンドホフ病等のリソソーム蓄積症の処置または予防に有用である。

バイシストロニック核酸構築物
本発明の一部の態様は、バイシストロニック核酸構築物を提供する。用語「シストロン」は、遺伝子産物の発現に充分な核酸カセットのことを指す。一部の実施形態において、シストロンは発現カセットである。したがって、本発明の一部の態様は、２つ以上のシストロン、例えば、２つ以上の発現カセットを含む核酸構築物を提供する。用語「発現カセット」は、遺伝子産物の発現に充分な核酸エレメントを含む核酸構築物のことを指す。一般に、発現カセットは、プロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子産物をコードしている核酸を含む。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで調節配列に作動可能に連結され得る。一部の実施形態において、プロモーターは異種プロモーターである。本明細書で使用される場合、用語「異種プロモーター」とは、天然において所与のコード配列に作動可能に連結されていることが見られないプロモーターのことを指す。一部の実施形態において、発現カセットは、追加的なエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）および／またはコード配列の発現レベルに影響を及ぼすことが公知の他のエレメントを含んでもよい。理論に束縛されることを希望するものではないが、発現カセット内、例えば、転写開始部位とコード核酸配列、例えばタンパク質コードｃＤＮＡ配列との間にイントロンを含めることにより、イントロンを含まない発現構築物と比較して、コード核酸およびコードされている遺伝子産物の発現レベルの増大が得られると考えられている。

用語「イントロン」は、一次転写産物の転写後にスプライシングと称される細胞過程によって除去される発現カセット中の核酸配列のことを指す。イントロン配列は、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターを一般に含み、そのようなドナーおよびアクセプター部位の配列は、当業者に周知である。本明細書で使用される場合「キメライントロン」は、２つ以上の異なる供給源由来の核酸配列で構成される。

本発明の一部の態様は、様々な構成で２つ以上の発現カセットを含むバイシストロニック発現構築物を提供する。

異なる実施形態において、発現カセットが異なる方法で位置するバイシストロニック発現構築物が、提供される。例えば、一部の実施形態において、第１の発現カセットが第２の発現カセットに近接して位置するマルチシストロニック発現構築物が提供される。一部の実施形態において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、双方向性プロモーターによって作動可能に連結されており、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。

異なる実施形態において、発現カセットが異なる向きに向けられるバイシストロニック発現構築物が提供される。例えば、一部の実施形態において、反対向きで第１および第２の発現カセットを含むバイシストロニック発現構築物が提供される。

発現カセットに関連して本明細書で使用される場合、用語「向き」とは、所与のカセットまたは構造の指向性特性のことを指す。一部の実施形態において、発現カセットは、コード核酸配列の５’にプロモーターを保有し、コード核酸配列の転写は、センス鎖の５’末端から３’末端まで続き、その鎖が指向性カセット（例えば、５’−プロモーター／（イントロン）／コード配列−３’）になる。実質的に全ての発現カセットがこの意味で指向性なので、当業者は、第２の核酸構造、例えば、第２の発現カセット、ウイルスゲノムに関して、または、カセットがＡＡＶ構築物に含まれる場合、ＡＡＶ ＩＴＲに関して、所与の発現カセットの向きを容易に決定することができる。

例えば、所与の核酸構築物が、構成
５’−プロモーター１／コード配列１−−−プロモーター２／コード配列２−３’
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で２つの発現カセットを含む場合、発現カセットは同じ向きであり、矢印は、カセットのそれぞれの転写方向を示す。別の例の場合、所与の核酸構築物が、構成
５’−プロモーター１／コード配列１−−−コード配列２／プロモーター２−３’
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で２つの発現カセットを含むセンス鎖を含む場合、発現カセットは、互いに反対向きであり、矢印によって示されるように、発現カセットの転写の方向は向かい合っている。この例において、示される鎖は、プロモーター２およびコード配列２のアンチセンス鎖を含む。

別の例の場合、発現カセットがＡＡＶ構築物に含まれる場合、カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲまたは第２の発現カセットと同じ向きである（例えば、発現カセットの転写は、ＡＡＶ ＩＴＲまたは第２の発現カセットの転写と同じ方向に進行する）か、反対の方向である（例えば、発現カセットの転写は、ＡＡＶ ＩＴＲまたは第２の発現カセットの転写と反対向き［例えば、遠位］に進行する）かいずれかであり得る。ＡＡＶ ＩＴＲは指向的である。例えば、図１（上段）に例示される５’ＩＴＲを含むＡＡＶ構築物は、ＨｅｘＡ発現カセットと同じ向きである。別の例において、図１（下段）に例示される５’ＩＴＲを含むＡＡＶ構築物は、ＨｅｘＡ発現カセットと反対向きである。

証拠の大部分は、バイシストロニック発現構築物が、シストロンを１つだけ含有する発現系と比較して最適な発現レベルをしばしば実現しないことを示唆している。２つ以上のプロモーターエレメントを含むバイシストロニック発現構築物により実現される標準以下の発現レベルの示唆される原因のうちの１つは、プロモーター干渉の現象である（例えば、Curtin JA, Dane AP, Swanson A, Alexander IE, Ginn SL. Bidirectional promoter interference between two widely used internal heterologous promoters in a late-generation lentiviral construct. Gene Ther. 2008 Mar;15(5):384-90；および、Martin-Duque P, Jezzard S, Kaftansis L, Vassaux G. Direct comparison of the insulating properties of two genetic elements in an adenoviral vector containing two different expression cassettes. Hum Gene Ther. 2004 Oct;15(10):995-1002を参照のこと；両方の参照は、プロモーター干渉現象の開示のために参照により本明細書に組み込まれる）。プロモーター干渉の問題を解決するために様々な戦略、例えば、内部リボソーム進入部位によって分離されている複数のコード核酸配列の転写を駆動するプロモーターを１つだけ含むバイシストロニック発現構築物を作製することによる、または専用のプロモーターを含むシストロンを転写絶縁エレメントで分離することによる、が提案されてきた。プロモーター干渉を解決するために提案された全ての戦略は、しかしながら、独自の一組の問題で悩まされる。例えば、複数のシストロンを単一プロモーターで駆動する発現は、シストロンの一様でない発現レベルを通常もたらす。さらに、一部のプロモーターは、効率的に分離され得ず、分離エレメントは、一部の遺伝子運搬ベクター、例えば、一部のレトロウイルスベクターに適合しない。

一部の実施形態において、転写絶縁エレメントを使用せずに第１のプロモーターによって駆動される第１のコード核酸配列および第２のプロモーターによって駆動される第２のコード核酸配列の効果的な発現を可能にするバイシストロニック発現構築物が、提供される。そのようなバイシストロニック発現構築物の様々な構成、例えば、イントロンを含む第１の発現カセットおよびイントロンを含む第２の発現カセットを保有する発現構築物が、本明細書に提供され、ここで第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲに近位に設置される別々のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、双方向性プロモーターによって作動可能に連結されており、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。

一部の実施形態において、２つ以上のコード核酸配列の効果的な発現を可能にするバイシストロニック発現構築物が、提供される。一部の実施形態において、バイシストロニック発現構築物は、発現カセットを２つ含む。一部の実施形態において、本明細書に提供したバイシストロニック発現構築物の第１の発現カセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含み、第２の発現カセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む。一部の実施形態において、第１の発現カセットはＰ２プロモーターを含み、第２の発現カセットはＰ２プロモーターを含む。一部の実施形態において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、双方向性プロモーターによって作動可能に連結されている。一部の実施形態において、提供されるバイシストロニック発現構築物は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物である。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
一部の態様において、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。ＡＡＶに関連して本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、人工的に作製されたまたは得られたＡＡＶのことを指す。単離されたＡＡＶは、組換え方法を使用して作製されてもよい。そのようなＡＡＶは、ここでは「組換えＡＡＶ」と称される。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ｒＡＡＶのヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子が１つまたは複数の予め定めた組織に特異的に送達されることになるような組織特異的標的化能力を好ましくは有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定するのに重要なエレメントである。したがって、標的される組織に適当なカプシドを有するｒＡＡＶが、選択され得る。

所望のカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得る方法は、当技術分野で周知である。（例えば米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号明細書を参照のこと。その内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。一般に、本方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードしている核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子で構成される組換えＡＡＶベクター；ならびにＡＡＶカプシドタンパク質への組換えＡＡＶベクターのパッケージングを可能にするのに充分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養するステップを含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子にコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１〜３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と命名される）を含み、その全てが、選択的スプライシングによって単一のｃａｐ遺伝子から転写される。一部の実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、それぞれ約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。一部の実施形態において、翻訳と同時に、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周りに球状の６０マーのタンパク質シェルを形成する。一部の実施形態において、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護する、ゲノムを送達する、および宿主と相互作用することである。一部の態様において、カプシドタンパク質は、組織特異的様式で宿主へウイルスゲノムを送達する。

一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂからなる群から選択されるＡＡＶ血清型のものである。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒト以外の霊長類から得られる血清型のもの、例えばＡＡＶｒｈ８血清型である。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、幅広く、効果的なＣＮＳ形質導入のために得た血清型のもの、例えばＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂである。一部の実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９のものである。

ＡＡＶカプシド内にｒＡＡＶベクターをパッケージングするために宿主細胞中で培養される成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。別の場合には、必要な成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）の任意の１つまたは複数は、１つまたは複数の必要とされる成分を含有するように当業者に公知の方法を使用して操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。最も適切には、そのような安定な宿主細胞は、誘導可能なプロモーターの制御下に必要な成分を含有することになる。しかしながら、必要な成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導可能および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子での使用に適した調節エレメントに関する議論において、本明細書に提供される。さらに別の選択肢において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分および１つまたは複数の誘導可能なプロモーターの制御下にある他の選択された成分を含有してもよい。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）から得られる安定な宿主細胞が生成され得るが、その宿主細胞は、誘導可能なプロモーターの制御下にｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する。なお他の安定な宿主細胞が、当業者によって生成されてもよい。

一部の実施形態において、本開示は、タンパク質（単数）またはタンパク質（複数）（例えば、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢタンパク質）をコードしているコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。一部の実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である。

本開示のｒＡＡＶを作製するために必要とされる組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、任意の適当な遺伝的エレメント（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達されてもよい。選択された遺伝的エレメントは、本明細書に記述される方法を含めた任意の適切な方法によって送達され得る。本開示の任意の実施形態を構築するために使用する方法は、核酸操作における技術者に公知であり、遺伝子工学、組換え操作および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、適切な方法の選択は本開示によって制限されない。例えば、K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)、および米国特許第５,４７８,７４５号明細書を参照のこと。

一部の実施形態において、組換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション方法（米国特許第６，００１，６５０号明細書に詳細に記載されている）を使用して作製されてもよい。一般に、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子にパッケージングされるＡＡＶベクター（ＩＴＲエレメントに隣接する導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、およびアクセサリ機能ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることによって作製される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードし、その配列は、増殖性ＡＡＶ複製およびキャプシド形成に対してトランスで機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（例えば、機能性ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成することなく効果的なＡＡＶベクターの産生を支持する。本開示による使用に適したベクターの非限定的な例には、米国特許第６,００１,６５０号明細書に記載されるｐＨＬＰ１９、米国特許第６,１５６,３０３号明細書に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターがあり、両方の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。アクセサリ機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能（例えば、「アクセサリ機能」）のヌクレオチド配列をコードする。アクセサリ機能は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶカプシドアセンブリに関係する部分を含むが、これに限定されないＡＡＶ複製に必要とされる機能を含む。ウイルスに基づくアクセサリ機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純疱疹ウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルス等、公知のヘルパーウイルスのいずれかから得ることができる。

一部の態様において、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外因的なＤＮＡが細胞膜内部に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当技術分野に一般に公知である。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照のこと。そのような技術を使用して、適切な宿主細胞へヌクレオチド組み込み型ベクターおよび他の核酸分子等、外因的な核酸を１つまたは複数導入することができる。

「宿主細胞」とは、対象となる物質を保有する、または保有し得る任意の細胞のことを指す。しばしば、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリ機能ベクターまたは組換えＡＡＶの作製に関連する他の運搬ＤＮＡのレシピエントとして使用されてもよい。本用語は、トランスフェクトされた元の細胞の後代を含む。したがって、本明細書で使用される場合「宿主細胞」とは、外因的ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞のことを指してもよい。単一の親細胞の後代は、天然、偶然または計画的な突然変異のため、元の親と形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において必ずしも完全に同一でなくてもよいと理解される。

本明細書で使用される場合、用語「細胞系」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連続または長期的な成長および分裂が可能な細胞の集団のことを指す。しばしば、細胞系は、単一のプロジェニター細胞に由来するクローン集団である。そのようなクローン集団を貯蔵または運搬する間に、自発的もしくは誘導による変化が核型に起こり得ることは、当技術分野でさらに公知である。したがって、参照される細胞系から得られる細胞は、祖先細胞または培養と正確に同一でなくてもよく、参照される細胞系は、そのようなバリアントを含む。

本明細書で使用される場合、用語「組換え細胞」とは、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡ等の生物学的に活性な核酸の産生をもたらすＤＮＡ断片等、外因的ＤＮＡ断片が導入された細胞のことを指す。

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等、任意の遺伝的エレメントを含み、それらは、適当な制御エレメントと会合した場合に複製する能力があり、細胞間で遺伝子配列を運搬することができる。したがって、用語は、クローニングおよび発現媒体ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態において、有用なベクターは、転写される核酸断片が、プロモーターの転写制御下に位置するベクターと考えられる。「プロモーター」とは、細胞の合成機構によって認識される、または合成機構を導入される、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列のことを指す。語句、「作動的に位置する」、「制御下にある」、または「転写制御下にある」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御する核酸に対して正しい場所および向きにあることを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、核酸コード配列の一部または全体が転写され得る核酸を含有する任意の型の遺伝的構築物を意味する。一部の実施形態において、発現は、核酸を転写して、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物を生成することを含む。本開示のｒＡＡＶを作製するために所望のＡＡＶカプシド内に組換えベクターをパッケージングする前述の方法は、限定することを意味するものではなく、他の適切な方法が当業者にとって明らかになる。

リソソーム蓄積症を処置する方法
対象へ導入遺伝子を送達する方法が、本開示によって提供される。対象は、任意の哺乳動物、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等であり得る。一部の実施形態において、対象はヒトである。本方法は、対象において変異体ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢタンパク質を補償する能力があるヘキソサミニダーゼＡ（ＨＥＸＡ）およびヘキソサミニダーゼＢ（ＨＥＸＢ）（例えば、野生型ＨＥＸＡおよび／もしくはＨＥＸＢ、コドン最適化したＨＥＸＡおよび／もしくはＨＥＸＢ、または前述の任意の組み合わせ）タンパク質をコードしている単離された核酸の有効量を対象へ投与するステップに一般に関係する。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢタンパク質は、ヘテロ二量体アイソザイムベータヘキソサミニダーゼＡを形成し、それは、ヒトにおいてＧＭ２ガングリオシドを分解するリソソームタンパク質／酵素である。したがって、ＨＥＸＡ遺伝子および／またはＨＥＸＢ遺伝子の２対立遺伝子突然変異は、ＧＭ２ガングリオシドの毒性蓄積およびリソソーム蓄積疾患を一般にもたらす。

本明細書で使用される場合、「リソソーム蓄積疾患」とは、ＨＥＸＡ遺伝子および／またはＨＥＸＢ遺伝子における２対立遺伝子の突然変異に起因する細胞、特にニューロンにおけるＧＭ２ガングリオシドの異常な集積によって特徴付けられる遺伝性代謝疾患のことを指す。一部の実施形態において、対象は、対象のベータヘキソサミニダーゼＡタンパク質の機能の減少または喪失をもたらすＨＥＸＡ遺伝子内の突然変異を有することによって特徴付けられる。一部の実施形態において、対象は、対象のベータヘキソサミニダーゼＡタンパク質の機能の減少または喪失をもたらすＨＥＸＢ遺伝子内の突然変異を有することによって特徴付けられる。「２対立遺伝子突然変異」とは、遺伝子の両方のコピー、この場合ＨＥＸＡおよび／またはＨＥＸＢのいずれかが、アミノ酸配列に改変を持つことを指す。リソソームにおけるＧＭ２ガングリオシドの進行性の集積は、ニューロンの破壊をもたらす。一部の実施形態において、リソソーム蓄積疾患は、ＨＥＸＡタンパク質の機能の減少または喪失に起因する状態であるテイサックス病（ＴＳＤ）である。一部の実施形態において、リソソーム蓄積疾患は、ＨＥＸＢタンパク質の機能の減少または喪失に起因する状態であるサンドホフ病（ＳＤ）である。

物質の「有効量」は、所望の効果を生じるのに十分な量である。一部の実施形態において、単離された核酸の有効量は、対象の標的組織の標的細胞の十分な数をトランスフェクトする（またはｒＡＡＶ媒介性送達の文脈において、感染させる）のに十分な量である。一部の実施形態において、標的組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）組織（例えば、脳組織、脊髄組織、脳脊髄液［ＣＳＦ］等）である。一部の実施形態において、単離した核酸（例えば、ｒＡＡＶによって送達され得る）の有効量は、対象において治療利益、例えば、遺伝子（例えば、ＨＥＸＡまたはＨＥＸＢ）の突然変異に起因するタンパク質の機能の減少または喪失を補償する、対象の寿命を延長する、対象において疾患の徴候（例えば、ＴＳＤまたはＳＤの徴候）の１つもしくは複数を改善する、等を有するのに十分な量であり得る。有効量は、例えば、種、年齢、体重、対象の健康および標的される組織等、様々な因子によって決まることになり、したがって本開示の他の部分で記載されるように対象および組織間で変動し得る。

一部の実施形態において、本明細書に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶは、リソソーム蓄積症、例えばテイサックス病またはサンドホフ病を処置するのに有用である。本明細書で使用される場合、用語「処置」とは、障害、疾患の徴候もしくはリソソーム蓄積症に対する素因を治癒、平癒、緩和、軽減、改変、修復、改良、改善する、またはそれらに影響を及ぼす目的で、リソソーム蓄積症、リソソーム蓄積症の徴候もしくはリソソーム蓄積症に対する素因（例えば、ＨＥＸＡ遺伝子、ＨＥＸＢ遺伝子等における１つ以上の突然変異）を有する対象に本明細書に記載の単離された核酸をコードしている組成物（例えば、単離された核酸を含むｒＡＡＶ）を適用もしくは投与することを指す。

リソソーム蓄積症を緩和することは、疾患の発症または進行を遅延させる、または疾患の重症度を減少させること含む。疾患を緩和することは、治癒的結果を必ずしも必要とするわけではない。本明細書で使用される、リソソーム蓄積症の発症を「遅延させる」ことは、疾患の進行を引き延ばす、妨げる、遅らせる、遅延させる、安定化するおよび／または先送りすることを意味する。この遅延は、疾患の既往歴および／または処置される個人に応じて時間の長さが変動し得る。疾患の発症を「遅延させる」もしくは緩和する、または疾患の発病を遅延させる方法とは、本方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠において疾患の徴候の１つもしくは複数が発症する確率を減少させるおよび／または所与の時間枠において徴候の程度を減少させる方法である。そのような比較は、統計的に有意な結果を得るのに十分な多数の対象を使用する臨床研究に一般に基づく。

疾患の「発症」または「進行」とは、初期の徴候および／または続いて起こる疾患の進行を意味する。疾患の発症は、当技術分野で周知の標準的な臨床的技術を使用して検出可能であり、評価され得る。しかしながら、発症とは、検出不可能な進行のことも指す。この開示の目的で、発症または進行とは、徴候の生物学的経過のことを指す。「発症」は、出現、再発および発病を含む。本明細書で使用される場合リソソーム蓄積症の「発病」または「出現」は、初期の発病および／または再発を含む。

投与の機序
本開示のｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意の適切な方法による組成物で対象に送達されてもよい。例えば、生理的に適合する担体中（例えば、組成物中）に好ましくは懸濁されているｒＡＡＶは、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、チキン、シチメンチョウまたはヒト以外の霊長類（例えば、マカク）等の対象、すなわち宿主動物に投与され得る。一部の実施形態において、宿主動物は、ヒトを含まない。

哺乳動物対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、筋肉注射または哺乳動物対象の血流への投与によってもよい。血流への投与は、静脈、動脈または他の任意の脈管導管への注射によってもよい。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、外科技術者に周知の技術である分離式肢灌流によって血流へと投与され、本方法は、熟練者がｒＡＡＶビリオンの投与前に体循環から肢を分離することを本質的に可能にする。米国特許第６,１７７,４０３号明細書に記載されている分離式肢灌流技術の変形も当業者により利用されて分離した肢の脈管系へビリオンが投与され、それにより筋肉細胞または組織への形質導入が潜在的に増強され得る。さらに、特定の例において、対象のＣＮＳにビリオンを送達することが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」は、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞ならびに組織を意味する。したがって、用語は、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨等を含むが、これに限定されない。組換えＡＡＶは、例えば、脳室領域内への注射によってＣＮＳまたは脳へ、ならびに定位注射による等、当技術分野で公知の神経外科的技術を使用して、注射針、カテーテルまたは関連デバイスを用いて、線条体（例えば、尾状核または線条体の果核）、視床、脊髄および神経筋接合部、または小脳小葉へ直接送達され得る（例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999；Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000；Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993；およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照のこと）。一部の実施形態において、本開示に記載のｒＡＡＶは、静脈注射によって投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、脳内注射によって投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、くも膜下腔内注射によって投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、線条体内注射によって投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、頭蓋内注射によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、小脳延髄槽注射によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、大脳側脳室注射によって送達される。

本開示の態様は、カプシドタンパク質および導入遺伝子をコードしている核酸を含む組換えＡＡＶを含む組成物に関し、導入遺伝子は、１つまたは複数のタンパク質をコードしている核酸配列を含む。一部の実施形態において、各タンパク質は、配列番号１または２のいずれかに記載の配列を含む。一部の実施形態において、核酸はＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３〜９のいずれかに記載の配列で表されるｒＡＡＶベクターまたはそれらの部分を含む。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１つもしくは複数の他のウイルス（例えば、１つまたは複数の異なる導入遺伝子をコードしている第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含んでもよい。一部の実施形態において、組成物は、１つまたは複数の異なる導入遺伝子をそれぞれ有する異なるｒＡＡＶを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはより多く含む。

適切な担体は、ｒＡＡＶが向けられる適応を考慮して当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体には、生理食塩水があり、それは様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）で製剤化され得る。他の典型的な担体には、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、胡麻油および水がある。担体の選抜は、本開示を制限しない。

任意選択で、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学安定化剤等、他の従来通りの医薬品成分を含有してもよい。適切な典型的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノールおよびプルロニック（登録商標）Ｆ−６８等のポロキサマー（非イオン性界面活性剤）がある。適切な化学安定化剤には、ゼラチンおよびアルブミンがある。

ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害効果なしに充分なレベルの遺伝子運搬および発現を提供するのに十分な量で投与される。従来通りのおよび薬学的に許容される投与経路には、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮内、腫瘍内、および他の非経口投与経路があるが、これに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わせられてもよい。

特定の「治療効果」を実現するのに必要とされるｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、ゲノムコピー数／体重１ｋｇ当たり（ＧＣ／ｋｇ）における用量の単位は、ｒＡＡＶビリオン投与の経路、治療効果を実現するのに必要とされる遺伝子もしくはＲＮＡ発現のレベル、処置される特定の疾患または障害、および遺伝子もしくはＲＮＡ産物の安定性を含むがそれに限らないいくつかの因子に基づいて変動することになる。当業者は、上述した因子および当技術分野で周知の他の因子に基づいて特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。

ｒＡＡＶの有効量は、動物を感染させ、所望の組織を標的とするのに十分な量である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量は、リソソーム蓄積症の前駆症状段階の間に対象に投与される。一部の実施形態において、リソソーム蓄積症の前駆症状段階は、出生（例えば、周産期）と４週齢との間に起こる。

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、特に高ｒＡＡＶ濃度が存在する（例えば、およそ１０^１３ＧＣ／ｍＬまたはより多く）場合、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を減少させるように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を減少させる方法は、当技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整等がある（例えば、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照のこと。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。）

薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、様々な処置レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに適切な投薬および処置レジメンの開発同様に、当業者に周知である。

一般に、これらの製剤は、少なくとも約０．１％またはより多くの活性化合物を含有し得るが、活性成分のパーセンテージは、当然ながら変動してもよく、都合よく、全製剤の質量または容積のうち約１もしくは２％〜約７０％もしくは８０％もしくはより多くてもよい。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、所与の任意の単位用量の化合物において得られるような方法で調製され得る。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、産物貯蔵寿命等の因子および他の薬理学的に考慮すべき点が、そのような医薬品製剤を調製する当業者によって考えられることになり、したがって、様々な投薬量および処置レジメンが、望ましくなり得る。

特定の状況において、本明細書に開示される適切に製剤化された医薬品組成物中のｒＡＡＶに基づく治療的構築物を、皮下、膵臓内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、硬膜下腔内、もしくは経口、腹膜内のいずれかまたは吸入によって送達することが望ましくなる。一部の実施形態において、米国特許第５,５４３,１５８号明細書；第５，６４１，５１５号明細書および第５，３９９，３６３号明細書（それぞれは、その全体が参照により本明細書に特に組み込まれる）に記載の投与形式を使用してｒＡＡＶを送達してもよい。一部の実施形態において、投与の好ましい機序は、門脈注射による。

注射可能な使用に適した医薬品形態には、無菌水溶液または分散液および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末がある。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中に調製されてもよい。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製品は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。多くの場合、形態は、無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流動的である。それは、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物および／または植物油を含有する溶媒もしくは分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合必要な粒子サイズの維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましくなる。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物における吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。

注射可能な水溶液を投与する場合、例えば、溶液は適切に緩衝され、必要に応じて、液体希釈剤は充分な生理食塩水またはグルコースにより初めに等張性にされ得る。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹膜内投与に適している。これに関連して、利用され得る無菌の水溶性媒体が、当業者に公知である。例えば、１回の投薬量は、等張性ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解され、皮下注入液１０００ｍＬに添加されてもまたは提案された注入部位で注射されてもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。投薬量の多少の変動は、宿主の条件に応じて必然的に起こることになる。投与責任者が、いずれにしても、個々の宿主に適当な用量を決定することになる。

無菌の注射可能な溶液は、本明細書に列挙されている他の様々な成分と共に適当な溶媒中に必要量で活性なｒＡＡＶを組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上で列挙した他の必要な成分を含有する無菌媒体へ様々な無菌化した活性成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製の方法は、事前に無菌濾過した溶液からの活性成分＋その任意の追加的な所望の成分の粉末を産する真空乾燥および凍結乾燥技術である。

本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物は、中性または塩形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容できる塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）があり、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸等と共に形成される。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基等から得ることもできる。製剤化すると、溶液は、投薬製剤と適合する様式および治療上有効であるような量で投与されることになる。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル、等の様々な投薬形態で容易に投与される。

本明細書で使用される場合、「担体」には、全ての溶媒、分散媒、媒体、コーティング剤、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁剤、コロイド等がある。医薬品活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。補助活性成分も、組成物に組み込まれ得る。語句「薬学的に許容される」とは、宿主に投与した際にアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物のことを指す。

リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等の送達媒体を使用して、適切な宿主細胞に本開示の組成物を導入してもよい。特に、ｒＡＡＶベクター送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子等のいずれかの中にカプセル化された送達のために製剤化され得る。

そのような製剤は、本明細書に開示される核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入に好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、当業者に一般に公知である。近年では、血清安定性および循環半減時間を改善したリポソームが開発された（米国特許第５,７４１,５１６号明細書）。さらに、潜在的薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法について記載されている（米国特許第５,５６７,４３４号明細書；第５，５５２，１５７号明細書；第５，５６５，２１３号明細書；第５，７３８，８６８号明細書および第５，７９５，５８７号明細書）。

リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに対して通常抵抗性である多数の細胞型で成功裏に使用されてきた。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達系で典型的であるＤＮＡ長の制約がない。リポソームを効果的に使用して、様々な培養細胞系ならびに動物に遺伝子、薬物、放射線治療薬、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターが導入されてきた。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を調査するいくつかの成功した臨床試験が、完了している。

リポソームは、水溶性媒体中に分散しているリン脂質から形成され、多層同心性二重層小胞（多層小胞［ＭＬＶ］とも称される）を自発的に形成する。ＭＬＶは、直径２５ｎｍ〜４μｍを一般に有する。ＭＬＶの超音波処理により、コアに水溶液を含有する直径２００〜５００Åの小型単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。

別の場合、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が、使用されてもよい。ナノカプセルは、安定で、再現性がある方法で物質を一般に捕捉することができる。細胞内でのポリマー過積載による副作用を回避するために、そのような超微細な粒子（およそ０．１μｍに設定される）は、ｉｎ ｖｉｖｏで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の使用が考えられる。

上述した送達の方法に加えて、以下の技術も、宿主へｒＡＡＶ組成物を送達する代替方法として考えられる。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）が使用され、循環系内へならびにそれを経由して薬物浸透性の率および有効性を増強させるためのデバイスとして米国特許第５,６５６,０１６号明細書に記載されている。考えられる他の薬物送達の選択肢は、骨内注射（米国特許第５,７７９,７０８号明細書）、マイクロチップデバイス（米国特許第５,７９７,８９８号明細書）、眼製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮性基材（米国特許第５,７７０,２１９号明細書および第５，７８３，２０８号明細書）およびフィードバック制御送達（米国特許第５,６９７,８９９号明細書）である。

ヘキソサミニダーゼのアルファおよびベータサブユニット（それぞれＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ）をコードしているＡＡＶベクターが、バイシストロニックベクターのために２つの設計原理を使用して開発された（図１）。ＡＡＶ−ＢｉＰ２ｉ−ＨｅｘＡＢ（Ｐ２Ｉ）において、導入遺伝子カセットは、ゲノム末端からの発現を駆動するプロモーターと共に反対向きに位置する。他のベクター、ＡＡＶ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢ（Ｂｉｃ）は、最小のチキンβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターに隣接する単一のＣＭＶエンハンサーで構成される双方向性プロモーターを使用して、ゲノムの中心から反対方向に発現を駆動する。

ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクターを使用する短期研究は、有効性を実証した。ＡＡＶ９は、マウスにおける全身性ＣＮＳ遺伝子送達についてＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより効果が相当劣るが、ＡＡＶ９は、優れた安全実績を伴う相当な臨床経験があるカプシドでもある。さらに、ＡＡＶ９の全身性送達が、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）患者において形質転換的治療結果を媒介することが観察されてきた。これらの理由から、ＡＡＶ９は、試験された合計４つのベクターに対する治療的実験に含まれた。

４週齢のサンドホフマウス（Ｈｅｘ^−／−）が、マウスＨｅｘＡおよびＨｅｘＢタンパク質をコードしている１×１０^１２ｖｇ（ｎ＝８）もしくは４×１０^１２ｖｇ（ｎ＝１４）のＡＡＶ９ベクター（ＢｉｃまたはＰ２Ｉ）または３×１０^１１ｖｇ（ｎ＝８）もしくは１×１０^１２ｖｇ（ｎ＝１４）のＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクター（ＢｉｃまたはＰ２Ｉ）で全身的に処置された（尾部静脈注射）。年齢を合わせＰＢＳ注射したＳＤ（ｎ＝６）および野生型（ｎ＝１４）マウスが、対照として使用された。全てのコホートは、等しい数の雄および雌で構成された。高用量コホートおよび正常対照マウスのサブセット（ｎ＝６）は、１５０日齢または人道的終点で屠殺されて、生化学的（酵素活性およびＧＭ２ガングリオシド含有量）および組織学的転帰尺度を使用して有効性を評価され、残りのマウスは生存率分析に使用された。ＰＢＳ処置ＳＤマウスは、人道的な終点に到達したら安楽死させた（全て１５０日齢前）。人道的終点は、以下のパラメータ：仰臥位に置いた場合に３０秒間自身で常態に戻ることができない、片方の後肢の麻痺、または最高質量からの１５％より多い体重減少、のいずれかによって決定された。

[実施例１]
ＡＡＶ処置ＳＤマウスの行動成績は、経時的に安定なままであった
ＡＡＶ処置ＳＤおよび対照（ＫＯ）マウスの行動成績を、６０、９０、１０５、１２０および１４９日齢でロータロッドおよび反転スクリーン試験を使用して評価した。ＡＡＶ処置ＳＤマウスの運動協調性および成績は、１４９日齢の最後の時点まで加速ロータロッド（図２Ａ）および反転スクリーン（図２Ｂ〜図２Ｃ）試験において正常対照と同程度のままであった。無処置ＳＤマウスの成績は経時的に低下し、最後の時点でどの動物も生き残らなかった。

[実施例２]
全身性ＡＡＶ処置は、ＳＤマウスの中枢神経系の全体においてＧＭ２ガングリオシド含有量を減少させる
１５０日齢におけるＡＡＶ処置ＳＤマウス（高用量）の脳、小脳、脳幹および脊髄中のＧＭ２ガングリオシド含有量は、人道的終点における無処置ＳＤマウスより有意に低く、ＡＡＶ９−Ｂｉｃおよび両方のＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ処理群においてわずかに検出可能であった（図３）。ＧＭ２レベルは、ＡＡＶ９−Ｐ２Ｉ処置動物においてバックグラウンドより上のままであった。

[実施例３]
ＡＡＶ処置ＳＤマウスの脳および肝臓におけるヘキソサミニダーゼ活性の増大
大脳および小脳内のヘキソサミニダーゼ活性（図４Ａ〜図４Ｄ）は、ＧＭ２ガングリオシド含有量の所見と一致した。ＡＡＶ９−Ｐ２Ｉ処置マウスの脳内の酵素活性は、他の群より一貫して低かったが、それでもなお、正常なＨｅｘＡ活性のおよそ１０％の回復は、大脳内のＧＭ２ガングリオシド含有量を有意に減少させるのに十分であると思われる（図３）。ＡＡＶ９−Ｂｉｃ処置動物（図４Ａ）の場合のようにおよそ２０％の大脳内のＨｅｘＡ活性の回復は、ＧＭ２ガングリオシド貯蔵をほとんど排除するのに十分であると思われる（図３）。肝臓中の全ヘキソサミニダーゼ（ＨｅｘＡ、ＨｅｘＢ、ＨｅｘＳ）活性も、人工基質ＭＵＧを使用してＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂｉｃの全身性投与後に評価された（図５）。肝臓において、全ヘキソサミニダーゼ活性は、正常の１５％まで回復された。

[実施例４]
全身性ＡＡＶ処置は、ＳＤマウスの生存を延長する
ＡＡＶ−Ｂｉｃベクターで注射された全てのＳＤマウスは、低（３×１０^１１ｖｇ）および高用量コホート（１×１０^１２ｖｇ）において３５０日間を過ぎて生き残る（図６Ａ〜図６Ｂ）。全身性ＡＡＶ９−Ｐ２Ｉ処置は、低用量（１×１０^１２ｖｇ）で生存の影響が僅かにあったが、影響は、高用量（４×１０^１２ｖｇ）で増大した（図６Ａ〜図６Ｂ）。生存に対するＡＡＶ９−Ｐ２Ｉ処置の影響は、ＣＮＳ生化学所見と一致し、ＧＭ２ガングリオシドレベルは、無処置の対照ＳＤマウスと比較して減少した（図３）が、他のＡＡＶ処置群または正常コホートとは異なり検出可能であり続けた。

[実施例５]
全身性ＡＡＶ処置は、ＳＤマウスの脳全体でＨｅｘ活性を回復させる
ヘキソサミニダーゼ特異的組織化学的染色を使用する、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢを送達後の脳内のヘキソサミニダーゼ分布の分析は、脳の全体で酵素活性の回復を示し（図７）、このことは、本手法が、一部の実施形態において、治療的影響を媒介することを示している。

[実施例６]
テイサックスおよびサンドホフ病に対するＡＡＶ遺伝子療法のＣＳＦ送達
新生児のＧＭ２マウス（ｎ＝３１マウス）が、側脳室にＡＡＶ９−ＢｉＣＢ−ＨｅｘＡＢ（７．２５×１０^１０ｖｇ）の両側注射を受けた（側当たり２μＬ）。対照ＧＭ２マウス（ｎ＝８）は、リン酸緩衝食塩水の両側注射を受けた。生後１ヵ月におけるＡＡＶ処置ＧＭ２マウス（ｎ＝６）の脳内のＧＭ２ガングリオシド含有量は、正常動物と同一であり、その量は、年齢を一致させた無処置ＧＭ２マウスに見られるレベルの０．５％未満である（図８Ａ）。２つの作業、ロータロッド（図８Ｂ）および反転スクリーン（図８Ｃ）におけるＡＡＶ処置ＧＭ２マウスの運動成績は、１２０日齢において無処置ＧＭ２マウスと比較して有意に改善され、１５０日齢まで安定であり続けた。現在、ＡＡＶ処置ＧＭ２マウスの大多数は、無処置ＧＭ２マウスの１２９．５日間の生存期間の中央値と比較して、４００日齢を過ぎて生き続けた（図８Ｄ）。

[実施例７]
若年成体ＧＭ２マウスにおいてくも膜下腔内送達によってＣＳＦに注射されたＡＡＶ９−ＢｉＣＢ−ＨｅｘＡＢベクター
４２〜４５日齢ＧＭ２マウス（ｎ＝２０）におけるＡＡＶ９−ＢｉＣＢ−ＨｅｘＡＢベクター１×１０^１２ｖｇの腰部くも膜下腔内（ＬＩＴ）注射は、ロータロッド（図９Ａ）および反転スクリーン（図９Ｂ）試験において成績の改善をもたらした。ＡＡＶ処置ＧＭ２マウスの生存期間の中央値は、無処置ＧＭ２マウスの１２９．５日間と比較して、少なくとも２６５日間になることが観察された（２５０日間を超えて生きたマウスだけを説明する）（図９Ｃ；Ｐ＜０．０００１）。ナイーブ ＧＭ２マウスは、２４６日齢（ｎ＝７）および２９９日齢（ｎ＝２）において生きていた（図９Ｃ）。データは、若年成体マウスにおいてＬＩＴ送達されたＡＡＶ９−ＢｉＣＢ−ＨｅｘＡＢベクターの治療利益を示す。

配列
配列番号１；ＨｅｘＡアミノ酸配列

配列番号２；ＨｅｘＢアミノ酸配列

配列番号３；ＡＡＶ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡＢ核酸配列

配列番号４；ＡＡＶ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡ：コドン最適化ＨｅｘＢ核酸配列

配列番号５；ＡＡＶ−ＢｉＣＢＡ−ＨｅｘＡ：コドン最適化ＨｅｘＢ：コドン最適化核酸配列

配列番号６：Ｐ２ｉ−ｍＨｅｘＡＢ核酸配列

配列番号７：ＡＡＶ−ｈＨｅｘＡ：コドン最適化−ＢｉＣＢＡ−ｈＨｅｘＢ核酸配列

配列番号８：ＡＡＶ−ｈＨｅｘＡ：コドン最適化−ＢｉＣＢＡ−ｈＨｅｘＢ：コドン最適化核酸配列

配列番号９：ＡＡＶ−ｈＨｅｘＡ−ＢｉＣＢＡ−ｈＨｅｘＢ核酸配列

Claims (35)

1. （ｉ）第１のプロモーターの制御下にヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）をコードしている核酸を含む第１の発現カセット；および
   （ｉｉ）第２のプロモーターの制御下にヘキソサミニダーゼベータサブユニット（ＨＥＸＢ）をコードしている核酸を含む第２の発現カセット
   を含む、単離された核酸構築物であって、
   前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している、単離された核酸構築物。
2. 第１のイントロンが、前記第１のプロモーターと前記ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）をコードしている前記核酸の配列との間に存在する、請求項１に記載の単離された核酸。
3. 第２のイントロンが、前記第２のプロモーターと前記ヘキソサミニダーゼベータサブユニット（ＨＥＸＢ）をコードしている前記核酸の配列との間に存在する、請求項１または２に記載の単離された核酸。
4. 前記ＨｅｘＡが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
5. 前記ＨｅｘＢが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
6. 前記第１のイントロンが、前記第１のプロモーターと前記ＨｅｘＡをコードしている前記核酸配列との間に位置し、任意選択で、前記第１のイントロンが、キメライントロンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
7. 前記第１のプロモーターが、ＡＡＶ ＩＴＲの近位に位置し、任意選択で、前記第１のプロモーターが、ＡＡＶ ＩＴＲとＨｅｘＡをコードしている核酸配列との間に位置する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
8. 前記第１のプロモーターおよび／または前記第２のプロモーターが、Ｐ２プロモーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
9. 前記第２のイントロンが、前記第２のプロモーターと前記ＨｅｘＢをコードしている前記核酸配列との間に位置し、任意選択で、前記第２のイントロンが、キメライントロンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
10. 前記第２のプロモーターが、ＡＡＶ ＩＴＲの近位に位置し、任意選択で、前記第２のプロモーターが、ＡＡＶ ＩＴＲとＨｅｘＢをコードしている核酸配列との間に位置する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
11. 前記第１の発現カセットが、ＨｅｘＡをコードしている前記核酸配列に作動可能に連結された第１のポリＡシグナルを含み、任意選択で、前記第１のポリＡシグナルが、ＢＧＨポリＡシグナルである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
12. 前記第２の発現カセットが、ＨｅｘＢをコードしている前記核酸配列に作動可能に連結された第２のポリＡシグナルを含み、任意選択で、前記第２のポリＡ尾部が、ＳＶ４０ポリＡシグナルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
13. 前記第１のポリＡシグナルおよび前記第２のポリＡシグナルが、互いに近接して位置する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
14. （ｉ）ヘキソサミニダーゼアルファサブユニットをコードしている核酸を含む第１の発現カセット；および
    （ｉｉ）ヘキソサミニダーゼベータサブユニットをコードしている核酸を含む第２の発現カセットを含む、単離された核酸構築物であって、
    前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットが、双方向性プロモーターによって作動可能に連結されており、前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している、単離された核酸構築物。
15. 前記ＨｅｘＡが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離された核酸構築物。
16. 前記ＨｅｘＢが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１４または１５に記載の単離された核酸構築物。
17. 前記双方向性プロモーターが、少なくとも１つのチキンベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
18. 前記双方向性プロモーターが、２つのＣＢＡプロモーターを含み、前記ＣＢＡプロモーターが、反対方向で前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットの転写を開始する、請求項１７に記載の単離された核酸構築物。
19. 前記双方向性プロモーターが、ＣＭＶエンハンサー配列を含み、任意選択で、前記ＣＭＶエンハンサー配列が、前記２つのＣＢＡプロモーターの間に位置する、請求項１８に記載の単離された核酸構築物。
20. 第１の発現構築物が、第１のポリＡシグナルを含み、任意選択で、前記第１のポリＡシグナルが、ＡＡＶ ＩＴＲに近位である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
21. 前記第１の発現構築物が、第２のポリＡシグナルを含み、任意選択で、前記第２のポリＡシグナルが、ＡＡＶ ＩＴＲに近位である、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
22. 前記第１および／または前記第２のポリＡシグナルが、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウサギベータグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡシグナルおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルからそれぞれ選択される、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸構築物。
23. 配列番号３〜９のいずれかに記載の配列を含む、単離された核酸。
24. （ｉ）カプシドタンパク質；および
    （ｉｉ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された核酸
    を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
25. 前記カプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂから選択される血清型のものである、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。
26. 前記単離された核酸が、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲまたはＡＡＶ６ ＩＴＲからなる群から選択されるＩＴＲを含む、請求項２４または２５に記載のｒＡＡＶ。
27. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む、宿主細胞。
28. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
29. リソソーム蓄積症であるまたはそれと疑われる対象に、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを投与するステップを含む、リソソーム蓄積症を処置する方法。
30. 前記リソソーム蓄積症が、テイサックス病またはサンドホフ病である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記対象が、前記対象のヘキソサミニダーゼアルファサブユニットの機能の減少または喪失をもたらすＨＥＸＡ遺伝子内の突然変異を有すると特徴付けられる、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 前記対象が、前記対象のヘキソサミニダーゼベータサブユニットの機能の減少または喪失をもたらすＨＥＸＢ遺伝子内の突然変異を有すると特徴付けられる、請求項２９または３０に記載の方法。
33. 前記ｒＡＡＶが、頭蓋内注射、脳内注射または脳室系、小脳延髄槽もしくはくも膜下腔内スペースを通したＣＳＦへの注射によって投与される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記対象が、前記リソソーム蓄積症の前駆症状段階の間に、前記単離された核酸または前記ｒＡＡＶを投与される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記リソソーム蓄積症の前記前駆症状段階が、出生（例えば、周産期）と４週齢との間に起こる、請求項３４に記載の方法。
    

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