BR112020020836A2

BR112020020836A2 - Vetores de aav bicistrônicos codificando subunidades alfa e beta de hexosaminidase e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020020836A2
Application number: BR112020020836-1A
Authority: BR
Inventors: Miguel Sena ESTEVES; Diane Golebiowski
Original assignee: University Of Massachusetts
Priority date: 2018-04-13
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2021-01-19
Also published as: EP3773748A4; EP3773748A1; CA3096102A1; US20210095314A1; JP2021520811A; WO2019200286A1; CN112203697A

Abstract

vetores de aav bicistrônicos codificando subunidades alfa e beta de hexosaminidase e usos dos mesmos. a presente invenção refere-se a construtos de ácido nucleico de aav bicistrônicos compreendendo um transgene codificando proteínas hexosaminidase a (hexa) e hexosaminidase _ (hexb). em algumas modalidades, a invenção provê métodos para tratamento ou prevenção de distúrbios do armazenamento lisossomal, tais como doença de tay-sachs e doença de sandhoff, usando construtos de ácido nucleico bicistrônicos descritos pela invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “VETORES DE AAV BICISTRÔNICOS CODIFICANDO

SUBUNIDADES ALFA E BETA DE HEXOSAMINIDASE E USOS DOS MESMOS”. PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Número de Série 62/657.243, depositado em 13 de abril de 2018, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.

PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA

[0002] A invenção foi feita com apoio do governo sob o número de concessão NS093941, concedida pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A doença de Tay-Sachs (TSD) e a doença de Sandhoff (SD) são doenças do armazenamento lisossomal autossômicas recessivas (LSDs) causadas por deficiência em hexosaminidase A (HexA) resultante de mutações nos genes HEXA ou HEXB, respectivamente. A deficiência em HexA leva a armazenamento de gangliosídeo GM2 no sistema nervoso central (SNC) e deteriorando progressivamente a função neurológica, regressão desenvolvimental e eventualmente morte prematura. Atualmente não há quaisquer tratamentos disponíveis para essas doenças coletivamente conhecidas como gangliosidose GM2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] Aspectos da invenção se referem a vetores de AAV recombinantes para administração de gene. A descrição é baseada, em parte, na constatação que um vetor de AAV único codificando simultaneamente subunidades alfa e beta de hexosaminidase permite expressão menos invasiva e potencialmente mais eficaz de HexA no

SNC de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo tendo doença de Tay- Sachs ou doença de Sandhoff). Como descrito na seção de Exemplos, as composições da invenção compreendem duas subunidades de HexA (por exemplo, codificam transcritos de HEXA e HEXB) em uma configuração que foi mostrada ser funcional in vivo e atingiram marcos terapêuticos importantes.

[0005] Portanto, em alguns aspectos, a invenção provê um construto de ácido nucleico isolado compreendendo: um primeiro cassete de expressão, compreendendo um ácido nucleico codificando uma subunidade alfa de hexosaminidase (HexA) sob o controle de um primeiro promotor, e um primeiro íntron; e, um segundo cassete de expressão, compreendendo um ácido nucleico codificando uma subunidade beta de hexosaminidase (HexB) sob o controle de um segundo promotor, e um segundo íntron. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são flanqueados por repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV).

[0006] Em algumas modalidades, a HexA compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a HexB compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[0007] Em algumas modalidades, o primeiro íntron está posicionado entre o primeiro promotor e a sequência de ácido nucleico codificando a HexA. Em algumas modalidaides, o primeiro íntron é um íntron quimérico. Em algumas modalidades, o primeiro promotor está posicionado próximo a uma ITR de AAV, opcionalmente onde o primeiro promotor está posicionado entre uma ITR de AAV e uma sequência de ácido nucleico codificando HexA. Em algumas modalidades, o primeiro promotor e/ou o segundo promotor é um promotor P2. Em algumas modalidades, o segundo íntron está posicionado entre o segundo promotor e a sequência de ácido nucleico codificando a HexB. Em algumas modalidades, o segundo íntron é um íntron quimérico. Em algumas modalidades, o segundo promotor está posicionado próximo a uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, onde o segundo promotor está posicionado entre uma ITR de AAV a uma sequência de ácido nucleico codificando HexB.

[0008] Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão compreende um primeiro sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando HexA, opcionalmente em que o primeiro sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) é um sinal de poli A de BGH (por exemplo, cauda de poli A de BGH). Em algumas modalidades, o segundo cassete de expressão compreende um segundo sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando HexB. Em algumas modalidades, o segundo sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) é um sinal de poli A de SV40 (por exemplo, cauda de poli A de SV40). Em algumas modalidades, o primeiro sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) e o segundo sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) são posicionados adjacentes um ao outro. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são orientados em direções opostas (por exemplo, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são transcritos em direção um ao outro).

[0009] Em alguns aspectos, a invenção provê um construto de ácido nucleico isolado compreendendo: um primeiro cassete de expressão, compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma subunidade alfa de hexosaminidase; e, um segundo cassete de expressão, compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma subunidade beta de hexosaminidase, em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são operavelmente ligados por um promotor bidirecional. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são flanqueados por repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV).

[0010] Em algumas modalidades, a HexA compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a HexB compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[0011] Em algumas modalidades, o promotor bidirecional compreende pelo menos um promotor da beta-actina da galinha (CBA). Em algumas modalidades, o promotor bidirecional compreende dois promotores de CBA, em que os promotores de CBA iniciam a transcrição do primeiro cassete de expressão e do segundo cassete de expressão em direções opostas (por exemplo, transcrição do primeiro cassete de expressão ocorre em uma direção que é distal com relação ao segundo cassete de expressão). Em algumas modalidades, o promotor bidirecional compreende uma sequência potencializadora de CMV. Em algumas modalidades, a sequência potencializadora de CMV está posicionada entre os dois promotores de CBA.

[0012] Em algumas modalidades, o primeiro construto de expressão compreende um primeiro sinal de poli A (por exemplo, primeira cauda de poli A), opcionalmente em que o primeiro sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) é proximal a uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, o primeiro construto de expressão compreende um segundo sinal de poli A (por exemplo, segunda cauda de poli A). Em algumas modalidades, o segundo sinal de poli A (por exemplo, segunda cauda de poli A) é proximal a uma ITR de AAV. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo sinal de poli A (por exemplo, cauda de poli A) é cada um selecionado de sinal de poli A de SV40 (por exemplo, cauda de poli A de SV40), sinal de poli A de beta-globulina de coelho (RBG) (por exemplo, cauda de poli A de RBG) e sinal de poli A de hormônio do crescimento bovino (BGH) (por exemplo, cauda de poli A de BGH).

[0013] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado compreendendo a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 3-9. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado codificando proteína HexA e/ou HexB é otimizado no códon.

[0014] Em alguns aspectos, a invenção provê um AAV recombinante (rAAV) compreendendo: uma proteína do capsídeo; e uma sequência de ácido nucleico isolada de qualquer um dos acima. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo é de um sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV-PHP.B e AAV-PHP.eB.

[0015] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma ITR selecionada do grupo consistindo em AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR ou AAV6 ITR.

[0016] Em algumas modalidades, a invenção provê uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o rAAV. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, célula de levedura, célula bacteriana, célula de inseto, célula de planta ou célula fúngica.

[0017] Em alguns aspectos, a invenção provê um método para tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal, o método compreendendo administrar o ácido nucleico isolado ou o rAAV a um indivíduo tendo ou suspeito ter uma doença do armazenamento lisossomal. Em algumas modalidades, um indivíduo é um humano.

[0018] Em algumas modalidades, a doença do armazenamento lisossomal é doença de Tay-Sachs ou doença de Sandhoff. Em algumas modalidades, o indivíduo é caracterizado como tendo uma mutação no gene de HEXA resultando em função reduzida (ou perda da mesma) de uma subunidade alfa de hexosaminidase do indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é caracterizado como tendo uma mutação em um gene de HEXB resultando em função reduzida ou perda dela de uma subunidade beta de hexosaminidase do indivíduo.

[0019] Em algumas modalidades, o rAAV é administrado através de injeção intracraniana, injeção intracerebral ou injeção no CSF através do sistema cerebral ventricular, cisterna magna ou espaço intratecal. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com o ácido nucleico isolado ou o rAAV durante um estágio pressintomático da doença do armazenamento lisossomal. Em algumas modalidades, o estágio pressintomático da doença do armazenamento lisossomal ocorre entre o nascimento (por exemplo, perinatal) e 4 semanas de vida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A FIGURA 1 mostra uma representação esquemática da estrutura de vetores de AAV bicistrônicos codificando simultaneamente subunidades alfa e beta de hexosaminidase. Em algumas modalidades, o vetor de AAV-BiP2i-HexAB carrega duas cópias de um promotor pequeno com um íntron pequeno (P2i) nas extremidades do genoma de AAV direcionando a expressão de subunidades alfa e beta de Hex em direções opostas. Em algumas modalidades, o vetor de AAV-BiCBA- HexAB carrega um promotor da CBA bidirecional projetado através da duplicação do promotor da beta-actina da galinha em direções opostas com um potencializador de CMV no meio.

[0021] As Figuras 2A-2C mostram o desempenho comportamental de camundongos Sandhoff (SD) tratados com AAV (Hexb-/-) que permaneceram estáveis com o tempo. Coordenação motora e desempenho de camundongos SD tratados com AAV e controles foram avaliados em 60, 90, 105, 120 e 149 dias de vida. A FIGURA 2A mostra o desempenho de camundongos SD usando o teste de rotarod de aceleração (4-40 rpm durante 300 segundos). A FIGURA 2B mostra o desempenho de camundongos SD usando o teste de tela invertida avaliando a latência para queda e a FIGURA 2C mostra o desempenho de camundongos SD usando o teste de tela invertida avaliando o número de movimentos do membro traseiro.

[0022] A FIGURA 3 mostra que tratamento com AAV sistêmico reduz o teor de gangliosídeo GM2 em todo o sistema nervoso central (SNC) de camundongos SD. O teor de gangliosídeo GM2 foi medido em 150 dias de vida em camundongos SD tratados com AAV (4 x 1012 vg AAV9 ou 1 x 1012 vg AAV-PHP.B) usando um método de cromatografia líquida espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Os níveis de gangliosídeo GM2 no SNC de animais normais estavam abaixo do limite de detecção do método.

[0023] As Figuras 4A-4D mostram atividade de hexosaminidase aumentada no cérebro de camundongos SD de 150 dias de vida tratados com 4 x 1012 vg AAV9 ou 1 x 1012 vg de vetores de AAV-PHP.B. A FIGURA 4A mostra atividade de enzima HexA no cérebro usando o substrato artificial MUGS. A FIGURA 4B mostra atividade de Hex total (HexA + HexB) no cérebro usando o substrato artificial MUG. A FIGURA 4C mostra atividade de enzima HexA no cerebelo usando MUGS. A FIGURA 44D mostra atividade de Hex total no cerebelo usando MUG.

[0024] A FIGURA 5 mostra atividade de hexosaminidase total aumentada no fígado usando o substrato artificial MUG quando da administração sistêmica de AAV-PHP.B-BiCBA-HexAB em camundongos SD.

[0025] As FIGURAS 6A-6B mostram que tratamento com AAV sistêmico prolonga a sobrevivência de camundongos SD. Camundongos SD de quatro semanas de vida foram tratados ou com dose baixa ou dose alta de terapias com AAV e a sobrevivência foi avaliada. A FIGURA 6A mostra tratamento com dose baixa de AAV9- Bic (1 x 1012 vg), AAV9-P2I (1 x 1012 vg), AAV-PHP.B-Bic (3 x 1011 vg),

AAV-PHP.B-P2I (3 x 1011 vg), vetores ou PBS (KO). A FIGURA 6B mostra tratamento com dose alta de AAV9-Bic (4 x 1012 vg), AAV9-P2I (4 x 1012 vg), AAV-PHP.B (1 x 1012 vg), AAV-PHP.B-Bic-P2I (1 x 1012 vg), vetores ou PBS (KO).

[0026] A FIGURA 7 mostra que administração sistêmica de vetores de AAV-PHP.B-BiCBA-HexAB restaura atividade de Hex em todo o cérebro de camundongos SD. Distribuição de atividade de enzima Hex foi avaliada um mês pós-injeção usando um tingimento histoquímico específico de enzima de seções sagitais do cérebro. Seções de todos os três camundongos tratados com AAV são mostradas.

[0027] As FIGURAS 8A-8D mostram dados indicando que tratamento ICV neonatal de camundongos GM2 com AAV9 bicistrônico melhora a neuroquímica, comportamento e sobrevivência. A FIGURA 8A mostra teor de gangliosídeo GM2 em cérebro [C], cerebelo e tronco cerebral [Cb+BS] em um mês de vida após injeção de AAV9-BiCB- HexAB. A FIGURA 8B mostra avaliação de desempenho motor por um teste rotarod acelerando (4-40 rpm durante 5 min). A FIGURA 8C mostra dados com relação a um teste de tela invertida (max de 120 seg) em 120 e 150 dias de vida. A FIGURA 8D mostra gráfico de sobrevivência Kaplan-Meier. A sobrevivência média de camundongos GM2 não tratados é de 129,5 dias. Testes t bilaterais foram usados para comparar resultados entre controles de GM2 de AAV e não tratados (**** P<0,0001; *** P<0,001; ** P<0,01).

[0028] As Figuras 9A-9C mostram dados indicando que administração intratecal lombar de AAV9-BiCB-HexAB melhora o desempenho motor e aumenta a sobrevivência de camundongos GM2. A FIGURA 9A mostra avaliação de desempenho motor com o tempo em camundongos GM2 tratados com 1x1012 vg em ~6 semanas de idade usando o teste de rotarod acelerado (4-40 rpm durante 5 min). A FIGURA 9B mostra dados se relacionando a um teste de tela invertida

(max de 120 seg). A FIGURA 9C mostra uma análise Kaplan-Meier indicando um aumento significante (P<0,0001) em sobrevivência de camundongos GM2 tratados com AAV com uma sobrevivência média atual de 265 dias comparado com 129,5 dias para camundongos GM2 não tratados. Teste Log-rank foi usado para avaliar benefício de sobrevivência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] Terapia genética mediada por vírus adenoassociado (AAV) é uma abordagem experimental para tratamento de TSD e SD, por exemplo, através da administração intracranial de um transgene ao parênquima cerebral. Superexpressão de ambas as subunidades alfa e beta é necessária uma vez que HexA é um heterodímero αβ. Isso é geralmente obtido através de coinjeção de dois vetores codificando subunidades alfa e beta de Hex separadamente devido à limitação de tamanho de transgene de vetores de AAV recombinantes (~4,7 kb). Administração de dois vetores separados através da corrente sanguínea ou CSF compromete a eficácia dessa abordagem uma vez que superexpressão de HexA requer coinfecção de células com ambos os vetores, e a probabilidade disso até declina vertiginosamente conforme os vetores são diluídos quando da infusão nesses fluidos corporais.

[0030] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a composições e métodos úteis no tratamento de distúrbios do armazenamento lisossomal, por exemplo, doença de Tay-Sachs ou doença de Sandhoff. A invenção é baseada, em parte, em vetores de AAV recombinantes (por exemplo, ácidos nucleicos isolados) e vírus recombinantes adenoassociados (rAAVs) compreendendo cassetes de expressão configurados para expressão bicistrônica de transgenes terapêuticos (por exemplo, 2, 3, etc.) no SNC de um indivíduo. Ácidos Nucleicos Isolados

[0031] Em alguns aspectos, a invenção provê ácidos nucleicos isolados (por exemplo, construtos de expressão bicistrônicos, tais como vetores de rAAV) que são úteis em expressão de transgenes terapêuticos no SNC de um indivíduo.

[0032] Em algumas modalidades, um transgene terapêutico codifica uma ou mais proteínas associadas com uma doença do armazenamento lisossomal (por exemplo, doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff), por exemplo, proteína HexA, proteína HexB ou proteínas HexA e HexB. Em algumas modalidades, uma proteína HexA compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma proteína HexB compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um transgene (por exemplo, um transgene codificando HexA) codifica uma sequência que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, etc.) idêntica a uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um transgene (por exemplo, um transgene codificando HexB) codifica uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, etc.) idêntica a uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um transgene codifica um construto de expressão bicistrônico carregando dois cassetes de expressão em orientações opostas como mostrado na Figura 1, AAV-BiP2i-HexAB e AAV-BiCBA-HexAB. Cada uma das proteínas HexA e HexB codificadas por um construto bicistrônico pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, etc.) idêntica a uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1 ou 2, respectivamente.

[0033] Em algumas modalidades, um transgene (por exemplo, um transgene codificando HexA) compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, etc.) Idêntica a uma sequência de ácido nucleico codificando HexA (por exemplo, sequência de ácido nucleico de HexA do tipo selvagem, sequência de codificação de HexA com códon otimizado, etc.) como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3- 9 (ou uma porção da mesma). Em algumas modalidades, um transgene (por exemplo, um transgene codificando HexB) compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, etc.) idêntica a uma sequência de ácido nucleico codificando HexB (por exemplo, sequência de ácido nucleico de HexB do tipo selvagem, sequência codificando HexB com códon otimizado, etc.) como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3-9 (ou uma porção da mesma).

[0034] Uma sequência de “ácido nucleico” se refere a uma sequência de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, proteínas e ácidos nucleicos da invenção são isolados. Como aqui usado, o termo “isolado” significa produzido artificialmente. Como aqui usado com relação a ácidos nucleicos, o termo “isolado” significa: (i) amplificado in vitro através de, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR); (ii) produzido recombinantemente através de clonagem; (iii) purificado, como através de clivagem e separação em gel; ou (iv) sintetizado através de, por exemplo, síntese química. Um ácido nucleico isolado é um que é prontamente manipulável através de técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. Portanto, uma sequência de nucleotídeo contida em um vetor em que sítios de restrição 5’ e 3’ são conhecidos ou para os quais sequências de iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR) foram divulgadas é considerada isolada, mas uma sequência de ácido nucleico existindo em seu estado nativo em seu hospedeiro natural não. Por exemplo, um ácido nucleico que é isolado dentro de um vetor de clonagem ou expressão não é puro pelo fato que ele pode compreender apenas uma porcentagem muito pequena do material na célula em que ele reside. Tal ácido nucleico é isolado, no entanto, uma vez que o termo é usado aqui porque ele é prontamente manipulável através de técnicas padrão conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica. Como aqui usado com relação a proteínas ou peptídeos, o termo “isolado” se refere a uma proteína ou peptídeo que foi isolado de seu ambiente natural ou artificialmente produzido (por exemplo, através de síntese química, através de tecnologia de DNA recombinante, etc.).

[0035] Os ácidos nucleicos isolados da invenção podem ser vetores de vírus adenoassociado recombinante (AAV) (vetores de rAAV). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado como descrito pela invenção compreende uma região (por exemplo, uma primeira região) compreendendo uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV) ou uma variante da mesma. O ácido nucleico isolado (por exemplo, o vetor de AAV recombinante) pode ser empacotado em uma proteína do capsídeo e administrado a um indivíduo e/ou administrado a uma célula-alvo selecionada. “Vetores de AAV recombinantes (rAAV)” são tipicamente compostos de, no mínimo, um transgene e suas sequências reguladoras e repetições terminais invertidas de AAV 5’ e 3’ (ITRs). O transgene pode compreender uma região codificando, por exemplo, uma proteína e/ou uma sequência de controle de expressão (por exemplo, uma cauda poli-A), como descrito em outro lugar na invenção.

[0036] Em geral, sequências de ITR são de cerca de 145 pb de comprimento. Preferivelmente, substancialmente as sequências inteiras codificando as ITRs são usadas na molécula, embora algum grau de pequena modificação dessas sequências seja permissível. A habilidade em modificar essas sequências de ITR está dentro da habilidade da técnica. (Vide, por exemplo, textos tais como Sambrook e outros,

"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); e K. Fisher e outros, J Virol., 70:520 532 (1996)). Um exemplo de tal molécula usada na presente invenção é um plasmídeo de “ação cis” contendo o transgene, em que a sequência de transgene selecionada e elementos reguladores associados são flanqueados pelas sequências de ITR de AAV 5’ e 3’. As sequências de ITR de AAV podem ser obtidas de qualquer AAV conhecido, incluindo os tipos de AAV de mamífero aqui identificados. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado (por exemplo, o vetor de rAAV) compreende pelo menos uma ITR tendo um sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 e suas variantes.

[0037] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende ainda uma região (por exemplo, uma segunda região, uma terceira região, uma quarta região, etc.) compreendendo uma segunda ITR de AAV. Em algumas modalidades, a segunda ITR de AAV tem um sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 e suas variantes.

[0038] Em adição aos elementos principais identificados acima para o vetor de AAV recombinante, o vetor inclui também elementos de controle convencionais que são operavelmente ligados com elementos do transgene de uma maneira que permite sua transcrição, tradução e/ou expressão em uma célula transfectada com o vetor ou infectada com o vírus produzido pela invenção. Como aqui usado, sequências “operavelmente ligadas” incluem ambas sequências de controle de expressão que são contíguas com o gene de interesse e sequências de controle de expressão que agem em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. Sequências de controle de expressão incluem sequências de iniciação, terminação, promotoras e potencializadoras de transcrição apropriadas; sinais de processamento de RNA eficientes tais como sinais de união e poliadenilação (poliA);

sequências que estabilizam mRNA citoplásmico; sequências que aumentam eficiência de tradução (por exemplo, sequência de consenso Kozak); sequências que potencializam a estabilidade da proteína; e, quando desejado, sequências que aumentam secreção do produto codificado. Várias sequências de controle de expressão, incluindo promotores que são nativos, constitutivos, induzíveis e/ou específicos de tecido, são conhecidos na técnica e podem ser utilizados.

[0039] Como aqui usado, uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de codificação) e sequências reguladoras são ditas ser operativamente ligadas quando elas são covalentemente ligadas de tal maneira a pôr a expressão ou transcrição da sequência de ácido nucleico sob a influência ou controle das sequências reguladoras. Ser for desejado que as sequências de ácido nucleico sejam traduzidas em uma proteína funcional, duas sequências de DNA são ditas ser operavelmente ligadas se indução de um promotor nas sequências reguladoras 5’ resultar na transcrição da sequência de codificação e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resulta na introdução de uma mutação de mudança de estrutura, (2) interfere com a habilidade da região promotora em direcionar a transcrição das sequências de codificação ou (3) interfere com a habilidade do transcrito de RNA correspondente ser traduzido em uma proteína. Portanto, uma região promotora seria operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucleico se a região promotora fosse capaz de realizar transcrição dessa sequência de DNA de modo que o transcrito resultante seria traduzido na proteína ou polipeptídeo desejado. Similarmente, duas ou mais regiões de codificação são ligadas operavelmente quando elas são ligadas de tal maneira que sua transcrição a partir de um promotor comum resulta na expressão de duas ou mais proteínas tendo sido traduzidas em estrutura. Em algumas modalidades, sequências de codificação operavelmente ligadas dão uma proteína de fusão.

[0040] Uma região compreendendo um transgene (por exemplo, uma segunda região, terceira região, quarta região, etc.) pode ser posicionada em qualquer local adequado do ácido nucleico isolado. A região pode ser posicionada em qualquer porção não traduzida do ácido nucleico incluindo, por exemplo, um íntron, uma região não traduzida 5’ ou 3’, etc.

[0041] Em alguns casos, pode ser desejável posicionar a região (por exemplo, segunda região, terceira região, quarta região, etc.) a montante do primeiro códon de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína (por exemplo, uma sequência de codificação de proteína). Por exemplo, a região pode ser posicionada entre o primeiro códon de uma sequência de codificação de proteína e 2000 nucleotídeos a montante do primeiro códon. A região pode ser posicionada entre o primeiro códon de uma sequência de codificação de proteína e 1000 nucleotídeos a montante do primeiro códon. A região pode ser posicionada entre o primeiro códon de uma sequência de codificação de proteína e 500 nucleotídeos a montante do primeiro códon. A região pode ser posicionada entre o primeiro códon de uma sequência de codificação de proteína e 250 nucleotídeos a montante do primeiro códon. A região pode estar posicionada entre o primeiro códon de uma sequência de codificação de proteína e 150 nucleotídeos a montante do primeiro códon.

[0042] Em alguns casos (por exemplo, quando um transgene não tem uma sequência de codificação de proteína), pode ser desejável posicionar a região (por exemplo, a segunda região, terceira região, quarta região, etc.) a montante do sinal de poli-A de um transgene. Por exemplo, a região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 2000 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 1000 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 500 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 250 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 150 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 100 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 50 nucleotídeos a montante da primeira base. A região pode estar posicionada entre a primeira base do sinal de poli-A e 20 nucleotídeos a montante da primeira base. Em algumas modalidades, a região está posicionada entre a última base do nucleotídeo de uma sequência promotora e a primeira base de nucleotídeo de uma sequência de sinal de poli-A.

[0043] Em alguns casos, a região pode ser posicionada a jusante da última base do sinal de poli-A de um transgene. A região pode estar entre a última base do sinal de poli-A e uma posição 2000 nucleotídeos a jusante da última base. A região pode estar entre a última base do sinal de poli-A e uma posição 1000 nucleotídeos a jusante da última base. A região pode estar entre a última base do sinal de poli-A e uma posição 500 nucleotídeos a jusante da última base. A região pode estar entre a última base do sinal de poli-A e uma posição 250 nucleotídeos a jusante da última base. A região pode estar entre a última base do sinal de poli-A e uma posição 150 nucleotídeos a jusante da última base.

[0044] Deve ser compreendido que em casos onde um transgene codifica mais de um polipeptídeo, cada polipeptídeo pode ser posicionado em qualquer local adequado dentro do transgene. Por exemplo, um ácido nucleico codificando um primeiro polipeptídeo pode ser posicionado em um íntron do transgene e uma sequência de ácido nucleico codificando um segundo polipeptídeo pode ser posicionada em uma outra região não traduzida (por exemplo, entre o último códon de uma sequência de codificação de proteína e a primeira base do sinal de poli-A do transgene).

[0045] Um “promotor” se refere a uma sequência de DNA reconhecida pelo maquinário sintético da célula, ou maquinário sintético introduzido, requerida para iniciar a transcrição específica de um gene. As expressões “posicionado operativamente”, “sob controle” ou “sob controle transcripcional” significam que o promotor está em local e orientação corretos em relação ao ácido nucleico para controlar a iniciação de polimerase de RNA e expressão do gene.

[0046] Para ácidos nucleicos codificando proteínas, uma sequência de poliadenilação geralmente é inserida seguindo as sequências do transgene e antes da sequência de ITR de AAV 3’. Um construto de rAAV útil na presente invenção pode também conter um íntron, desejavelmente localizado entre a sequência promotora/potencializadora e o transgene. Uma sequência de íntron possível é derivada de SV-40, e é referida como a sequência de íntron T de SV-40. Um outro elemento de vetor que pode ser usado é um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). Uma sequência de IRES é usada para produzir mais de um polipeptídeo a partir de um transcrito de gene único. Uma sequência de IRES seria usada para produzir uma proteína que contém mais de uma cadeia de polipeptídeo. Seleção desses e outros elementos de vetor comuns são convencionais e muitas tais sequências estão disponíveis [vide, por exemplo, Sambrook e outros e referências citadas nas, por exemplo, páginas 3.18 3.26 e 16.17

16.27 e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York, 1989]. Em algumas modalidades, uma sequência do Vírus 2A da Doença do Pé e Boca está incluída em poliproteína; esse é um peptídeo pequeno (aproximadamente 18 aminoácidos de comprimento) que foi mostrado mediar a clivagem de poliproteínas (Ryan, M. D. e outros, EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion,

N. M. e outros, J. Virology., Novembro 1996; p. 8124-8127; Furler, S. e outros, Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; e Halpin, C. e outros, The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). A atividade de clivagem da sequência de 2A foi anteriormente demonstrada em sistemas artificiais incluindo plasmídeos e vetores de terapia genica (AAV e retrovírus) (Ryan, M. D. e outros, EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N. M. e outros, J. Virology, Novembro 1996; p. 8124-8127; Furler, S. e outros, Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; e Halpin, C. e outros, The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P. e outros, Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P. e outros, Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931; e Klump, H. e outros, Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).

[0047] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limitação, o promotor LTR do vírus sarcoma Rous retroviral (RSV) (opcionalmente com o potencializador de RSV), o promotor de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o potencializador de CMV) [vide, por exemplo, Boshart e outros, Cell, 41:521-530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor da β-actina, o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK) e o promotor de EF1α [Invitrogen]. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor P2. Em algumas modalidaides, um promotor é um promotor da β-actina da galinha (CBA). Em algumas modalidades, um promotor são dois promotores de CBA. Em algumas modalidades, um promotor é são dois promotores de CBA separados por um potencializador de CMV.

[0048] Promotores induzíveis permitem regulagem de expressão de gene e podem ser regulados por compostos fornecidos exogenamente, fatores ambientais tal como temperatura ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula, ou em células de replicação apenas. Promotores induzíveis e sistemas induzíveis estão disponíveis de uma variedade de fontes comerciais incluindo, sem limitação, Invitrogen,

Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas foram descritos e podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica. Exemplos de promotores induzíveis regulados por promotores exogenamente fornecidos incluem o promotor da metalotioneína (MT) de ovelha induzível por zinco, o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV) induzível por dexametasona (Dex), o sistema de promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o promotor de inseto da ecdisona (No e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), o sistema repressível por tetraciclina (Gossen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), o sistema induzível por tetraciclina (Gossen e outros, Science, 268:1766-1769 (1995), vide também Harvey e outros, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), o sistema induzível por RU486 (Wang e outros, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) e Wang e outros, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) e o sistema induzível por rapamicina (Magari e outros, J. Clin. Invest., 100:2865- 2872 (1997)). Ainda outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis nesse contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou células de replicação apenas.

[0049] Em uma outra modalidade, o promotor nativo para o transgene será usado. O promotor nativo pode ser preferido quando é desejado que expressão do transgene imite a expressão nativa. O promotor nativo pode ser usado quando expressão do transgene deve ser regulada temporariamente ou desenvolvimentalmente ou de uma maneira específica de tecido ou em resposta a estímulos transcripcionais específicos. Em uma modalidade adicional, outros elementos de controle de expressão nativos, tais como elementos potencializadores, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso Kozak podem ser também usados para imitar a expressão nativa.

[0050] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras concedem capacidades de expressão de gene específicas de tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas de tecido se ligam a fatores de transcrição específicos de tecido que induzem transcrição de uma maneira específica de tecido. Tais sequências reguladoras específicas de tecido (por exemplo, promotor, potencializadores, etc.) são bem conhecidas na técnica. Sequências reguladoras específicas de tecido exemplares incluem, mas não estão limitadas a, os promotores específicos de tecido que seguem: um promotor de globulina de ligação à tiroxina (TBG) específica de tecido, um promotor de insulina, um promotor de glucagon, um promotor de somatostatina, um promotor de polipeptídeo pancreático (PPY), um promotor de sinapsina-1 (Syn), um promotor de creatina cinase (MCK), um promotor de desmina (DES) do mamífero, um promotor de cadeia pesada da α-miosina (α-MHC) ou um promotor T de Troponina cardíaco (cTnT). Outros promotores exemplares incluem promotor da Beta- actina, promotor do núcleo do vírus da hepatite B, Sandig e outros, Gene Ther., 3:1002-9 (1996); promotor da alfa-fetoprotein (AFP), Arbuthnot e outros, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), promotor da osteocalcina óssea (Stein e outros, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); promotor da sialoproteina óssea (Chen e outros, J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), promotor de CD2 (Hansal e outros, J. Immunol., 161:1063-8 (1998); promotor da cadeia pesada da imunoglobulina; promotor da cadeia α do receptor de célula T, neuronal tal como promotor de enolase específico de neurônio (NSE) (Andersen e outros, Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), promotor do gene da cadeia leve de neurofilamento (Piccioli e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)) e o promotor do gene vgf específico de neurônio (Piccioli e outros, Neuron, 15:373-84 (1995)), dentre outros que serão aparentes ao versado.

[0051] Aspectos da invenção se referem a um ácido nucleico isolado compreendendo mais de um promotor (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais promotores). Por exemplo, no contexto de um construto tendo um transgene compreendendo uma primeira região codificando uma proteína e uma segunda região codificando uma proteína pode ser desejável dirigir a expressão da primeira região de codificação de proteína usando uma primeira sequência de promotor (por exemplo, uma primeira sequência de promotor operavelmente ligada à região de codificação de proteína) e dirigir a expressão da segunda região de codificação de proteína com uma segunda sequência promotora (por exemplo, uma segunda sequência promotora operavelmente ligada à segunda região de codificação de proteína). Em geral, a primeira sequência promotora e a segunda sequência promotora podem ser a mesma sequência promotora ou sequências promotoras diferentes. Em algumas modalidades, a primeira sequência promotora (por exemplo, o promotor dirigindo expressão da região de codificação de proteína) é uma sequência promotora da polimerase de RNA III (pol III). Exemplos não limitantes de sequências promotoras de pol III incluem sequências promotoras U6 e H1. Em algumas modalidades, a segunda sequência promotora (por exemplo, a sequência promotora dirigindo expressão da segundo proteína) é uma sequência promotora de polimerase de RNA II (pol II). Exemplos não limitantes de sequências promotoras de pol II incluem T7, T3, SP6, RSV e sequências promotores de citomegalovírus. Em algumas modalidades, a sequência promotora de pol III dirige a expressão da primeira região de codificação de proteína. Em algumas modalidades, uma sequência promotora de pol II dirige a expressão da segunda região de codificação de proteína.

[0052] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um transgene que codifica uma proteína. A proteína pode ser uma proteína terapêutica (por exemplo, um peptídeo, proteína ou polipeptídeo útil para o tratamento ou prevenção de estados de doença em um indivíduo mamífero) ou uma proteína repórter. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica é útil para tratamento ou prevenção de doenças do armazenamento lisossomal tal como doença de Tay-Sachs ou Sandhoff, incluindo, mas não limitado a Hexosaminidase A (HexA) e Hexosaminidase B (HexB). Construtos de ácido nucleico bicistrônicos

[0053] Alguns aspectos da presente invenção proveem construtos de ácido nucleico bicistrônicos. O termo “cistron” se refere a um cassete de ácido nucleico suficiente para expressão de um produto de gene. Em algumas modalidades, um cistron é um cassete de expressão. Portanto, alguns aspectos da presente invenção proveem construtos de ácido nucleico compreendendo dois ou mais cistrons, por exemplo, dois ou mais cassetes de expressão. O termo “cassete de expressão” se refere a um construto nucleico compreendendo elementos de ácido nucleico suficientes para a expressão de um produto de gene. Tipicamente, um cassete de expressão compreende um ácido nucleico codificando um produto de gene operativamente ligado a uma sequência promotora. Sequências de codificação podem ser operavelmente ligadas a sequências reguladoras em orientação de sentido ou antissentido. Em algumas modalidaides, o promotor é um promotor heterólogo. O termo “promotor heterólogo”, como aqui usado, se refere a um promotor que não é encontrado estar operativamente ligado a uma dada sequência de codificação na natureza. Em algumas modalidades, um cassete de expressão pode compreender elementos adicionais, por exemplo, um íntron, um potencializador, um sítio de poliadenilação, um elemento regulador pós-transcripcional do vírus da hepatite da marmota (WPRE) e/ou outros elementos conhecidos afetar os níveis de expressão da sequência de codificação. Sem desejar ser limitado pela teoria, inclusão de um íntron em um cassete de expressão, por exemplo, entre o sítio de início transcripcional e uma sequência de ácido nucleico de codificação, por exemplo, uma sequência de cDNA de codificação de proteína, é acreditada resultar em níveis de expressão aumentados do ácido nucleico de codificação e do produto de gene codificado comparado com um construto de expressão não incluindo um íntron.

[0054] O termo “íntron” se refere a uma sequência de ácido nucleico em um cassete de expressão que é removida após transcrição de um transcrito primário através de um processo celular chamado união. Sequências de íntron geralmente compreendem um doador de união e um aceitador de união e sequências de tais sítios doadores e aceitadores são bem conhecidas daqueles de habilidade na técnica. “Íntron quimérico” como aqui usado são compostos de sequências de ácido nucleico de duas ou mais fontes diferentes.

[0055] Alguns aspectos da presente invenção proveem construto de expressão bicistrônicos compreendendo dois ou mais cassetes de expressão em várias configurações.

[0056] Em modalidades diferentes, construtos de expressão bicistrônicos são providos, nos quais os cassetes de expressão são posicionados de modos diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, um construto de expressão multicistrônico é provido, no qual um primeiro cassete de expressão é posicionado adjacente a um segundo cassete de expressão. Em algumas modalidades, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são operavelmente ligados por um promotor bidirecional, em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são flanqueados por repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV).

[0057] Em modalidades diferentes, construtos de expressão bicistrônicos são providos, em que os cassetes de expressão são orientados de maneiras diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, construto de expressão bicistrônico é provido compreendendo um primeiro e um segundo cassete de expressão em orientações opostas.

[0058] O termo “orientação” como aqui usado em relação a cassetes de expressão se refere à característica direcional de um dado cassete ou estrutura. Em algumas modalidades, um cassete de expressão carrega um promotor 5’ da sequência de ácido nucleico de codificação, e transcrição da sequência de ácido nucleico de codificação vai do terminal 5’ para o terminal 3’ do filamento de sentido, fazendo dele um cassete direcional (por exemplo, 5’-promotor/(íntron)/sequência de codificação-3’). Uma vez que virtualmente todos os cassetes de expressão são direcionais nesse sentido, aqueles de habilidade na técnica podem facilmente determinar a orientação de um dado cassete de expressão em relação a uma segunda estrutura de ácido nucleico, por exemplo, um segundo cassete de expressão, um genoma viral ou, se o cassete estiver compreendido em um construto de AAV, em relação a uma ITR de AAV.

[0059] Por exemplo, se um dado construto de ácido nucleico compreender dois cassetes de expressão na configuração 5’-promotor 1/sequência de codificação 1---promotor 2/sequência de codificação 2- 3’, >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> os cassetes de expressão estão na mesma orientação, as setas indicam a direção de transcrição de cada um dos cassetes. Para um outro exemplo, se um dado construto de ácido nucleico compreender um filamento de sentido compreendendo dois cassetes de expressão na configuração 5’-promotor 1/sequência de codificação 1---sequência de codificação 2/promotor 2-3’, >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< os cassetes de expressão estão em orientação oposta um para o outro e, como indicado pelas setas, a direção de transcrição dos cassetes de expressão são opostos. Nesse exemplo, o filamento mostrado compreende o filamento de antissentido do promotor 2 e sequência de codificação 2.

[0060] Para um outro exemplo, se um cassete de expressão for compreendido em um construto de AAV, o cassete pode estar ou na mesma orientação que uma ITR de AAV ou um segundo cassete de expressão (por exemplo, transcrição do cassete de expressão prossegue na mesma direção que transcrição da ITR de AAV ou segundo cassete de expressão) ou em orientação oposta (por exemplo, transcrição do cassete de expressão prossegue na direção oposta (por exemplo, distalmente) que a transcrição da ITR de AAV ou segundo cassete de expressão). As ITRs de AAV são direcionais. Por exemplo, um construto de AAV compreendendo uma ITR 5’ exemplificada na FIGURA 1 (superior) estaria na mesma orientação que o cassete de expressão do cassete de expressão de HexA. Em um outro Exemplo, um construto de AAV compreendendo a ITR 5’ exemplificada na FIGURA 1 (inferior) estaria na orientação oposta ao cassete de expressão do cassete de expressão de HexA.

[0061] Um corpo de evidência grande sugere que construtos de expressão bicistrônicos frequentemente não obtêm níveis de expressão ótimos comparado com sistema de expressão contendo apenas um cistron. Uma das causas sugeridas de níveis de expressão abaixo da média atingidos com construtos de expressão bicistrônicos compreendendo dois ou mais elementos promotores é o fenômeno de interferência de promotor (vide, por exemplo, Curtin, J.A., Dane, A.P., Swanson, A., Alexander, I.E., Ginn, S.L. Bidirectional promoter interference between two widely used internal heterologous promoters in a late-generation lentiviral construct. Gene Ther. 2008 Mar;15(5):384- 90; eMartin-Duque, P., Jezzard, S., Kaftansis, L., Vassaux, G. Direct comparison of the insulating properties of two genetic elements in an adenoviral vector containing two different expression cassettes. Hum Gene Ther. 2004 Oct;15(10):995-1002; ambas referências incorporadas a título de referência para descrição do fenômeno de interferência de promotor). Várias estratégias foram sugeridas para superar o problema de interferência de promotor, por exemplo, através da produção de construtos de expressão bicistrônicos compreendendo apenas um promotor dirigindo a transcrição de múltiplas sequências de ácido nucleico de codificação separadas por sítios de entrada ribossomais internos ou por cistrons de separação compreendendo seu próprio promotor com elementos isolantes transcripcionais. Todas as estratégias sugeridas para superar a interferência de promotor são sobrecarregadas com seu próprio conjunto de problemas, no entanto. Por exemplo, expressão de cistrons únicos dirigida por promotor único geralmente resulta em níveis de expressão desiguais dos cistrons. Ainda alguns promotores não podem ser eficientemente isolados e elementos isolantes não são compatíveis com alguns vetores de transferência de gene, por exemplo, alguns vetores retrovirais.

[0062] Em algumas modalidades, um construto de expressão bicistrônico é provido, o qual permite expressão suficiente de uma primeira sequência de ácido nucleico de codificação dirigida por um primeiro promotor e de uma segunda sequência de ácido nucleico de codificação dirigida por um segundo promotor sem o uso de elementos isolantes transcripcionais. Várias configurações de tais construtos de expressão bicistrônicos são providas aqui, por exemplo, construtos de expressão carregando um primeiro cassete de expressão compreendendo um íntron e um segundo cassete de expressão compreendendo um íntron, em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão estão sob o controle de promotores separados localizados próximos das ITRs de AAV que flanqueiam o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão. Em algumas modalidaides, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão estão operavelmente ligados por um promotor bidirecional e são flanqueados por ITRs de AAV.

[0063] Em algumas modalidades, construtos de expressão bicistrônicos são providos, os quais permitem expressão eficiente de duas ou mais sequências de ácido nucleico de codificação. Em algumas modalidades, o construto de expressão bicistrônico compreende dois cassetes de expressão. Em algumas modalidades, um primeiro cassete de expressão de um construto de expressão bicistrônico como aqui provido compreende um promotor de polimerase de RNA II e um segundo cassete de expressão compreende um promotor de polimerase de RNA III. Em algumas modalidades, um primeiro cassete de expressão compreende um promotor P2 e um segundo cassete de expressão compreende um promotor P2. Em algumas modalidades, um primeiro cassete de expressão e um segundo cassete de expressão são operavelmente ligados por um promotor bidirecional. Em algumas modalidades, o construto de expressão bicistrônico provido é um construto de AAV recombinante (rAAV). Vírus adenoassociado recombinante (rAAVs)

[0064] Em alguns aspectos, a invenção provê vírus adenoassociados isolados (AAVs). Como aqui usado com relação a AAVs, o termo “isolado” se refere a um AAV que foi produzido ou obtido artificialmente. AAVs isolados podem ser produzidos usando métodos recombinantes. Tais AAVs são referidos aqui como “AAVs recombinantes”. AAVs recombinantes (rAAVs) têm preferivelmente capacidades de direcionamento específico a tecido, de modo que uma nuclease e/ou transgene do rAAV será administrado especificamente a um ou mais tecido(s) predeterminado(s). O capsídeo de AAV é um elemento importante na determinação dessas capacidades de direcionamento específicos a tecido. Portanto, um rAAV tendo um capsídeo apropriado para o tecido sendo direcionado pode ser selecionado.

[0065] Métodos para obtenção de AAVs recombinantes tendo uma proteína do capsídeo desejada são bem conhecidos na técnica. (Vide, por exemplo, US 2003/0138772), cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade). Tipicamente, os métodos envolvem cultura de uma célula hospedeira que contém uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína do capsídeo de AAV; um gene rep funcional; um vetor de AAV recombinante composto de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV e um transgene; e funções auxiliares suficientes para permitir empacotamento do vetor de AAV recombinante nas proteínas do capsídeo de AAV. Em algumas modalidades, proteínas do capsídeo são proteínas estruturais codificadas pelo gene cap de um AAV. AAVs compreendem três proteínas do capsídeo, proteínas vírion 1 a 3 (chamadas VP1, VP2 e VP3), todas elas são transcritas a partir de um gene cap único por meio de união alternativa. Em algumas modalidades, os pesos moleculares de VP1, VP2 e VP2 são respectivamente cerca de 87 kDa, cerca de 72 kDa e cerca de 62 kDa. Em algumas modalidaides, quando da tradução, proteínas do capsídeo formam uma casca de proteína de 60 mer esférica ao redor do genoma viral. Em algumas modalidades, as funções das proteínas do capsídeo são para proteger o genoma viral, administrar o genoma e interagir com o hospedeiro. Em alguns aspectos, proteínas do capsídeo administram o genoma viral a um hospedeiro de uma maneira específica de tecido.

[0066] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de AAV é de um sorotipo AAV selecionado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10 e AAV.PHP.B. Em algumas modalidaides, uma proteína do capsídeo de AAV é de um sorotipo derivado de um primata não humano, por exemplo, sorotipo de AAVrh8. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de AAV é de um sorotipo derivado de transdução do SNC ampla e eficiente, por exemplo, AAV.PHP.B. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo é de um sorotipo 9 de AAV.

[0067] Os componentes a serem culturados na célula hospedeira para empacotar um vetor de rAAV em um capsídeo de AAV podem ser providos à célula hospedeira em trans. Alternativamente, qualquer um ou mais dos componentes requeridos (por exemplo, vetor de AAV recombinante, sequências rep, sequências cap e/ou funções auxiliares) pode ser provido por uma célula hospedeira estável que foi engenheirada para conter um ou mais dos componentes requeridos usando métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Mais adequadamente, tal célula hospedeira estável conterá o(s) componente(s) requerido(s) sob o controle de um promotor induzível. No entanto, o(s) componente(s) requerido pode estar sob o controle de um promotor constitutivo. Exemplos de promotores induzíveis e constitutivos adequados são providos aqui, na discussão de elementos reguladores adequados para uso com o transgene. Em ainda uma outra alternativa, uma célula hospedeira estável selecionada pode conter componente(s) selecionado(s) sob o controle de um promotor constitutivo e um outro componente(s) selecionado(s) sob o controle de um ou mais promotores induzíveis. Por exemplo, uma célula hospedeira estável pode ser gerada, a qual é derivada de células 293 (que contêm funções auxiliares E1 sob o controle de um promotor constitutivo), mas que contêm as proteínas rep e/ou cap sob o controle de promotores induzíveis. Ainda outras células hospedeiras estáveis podem ser geradas por um versado comum na técnica.

[0068] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira contendo um ácido nucleico que compreende uma sequência de codificação codificando uma proteína ou proteínas (por exemplo, proteínas HEXA e HEXAB). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de levedura, uma célula bacteriana, uma célula de inseto, uma célula de planta ou uma célula fúngica.

[0069] O vetor de AAV recombinante, sequências de rep, sequências de cap e funções auxiliares requeridas para produção do rAAV da invenção podem ser administrados à célula hospedeira de empacotamento usando um elemento genético apropriado (vetor). O elemento genético selecionado pode ser administrado através de qualquer método adequado, incluindo aqueles descritos aqui. Os métodos usados para construir qualquer modalidade da presente invenção são conhecidos daqueles com habilidade em manipulação de ácido nucleico e incluem engenharia genética, engenharia recombinante e técnicas sintéticas. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. similarmente, métodos de geração de vírions de rAAV são bem conhecidos e a seleção de um método adequado não é uma limitação para a presente invenção. Vide, por exemplo, K. Fisher e outros, J. Virol., 70:520-532 (1993) e Pat. U.S. No.

5.478.745.

[0070] Em algumas modalidades, AAVs recombinantes podem ser produzidos usando o método de transfecção tripla (descrito em detalhes na Pat. U.S. No. 6.001.650). Tipicamente, os AAVs recombinantes são produzidos através de transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de AAV (compreendendo um transgene flanqueado por elementos de ITR) a ser empacotado em partículas de AAV, um vetor de função auxiliar AAV e um vetor de função acessório. Um vetor de função auxiliar AAV codifica as sequências de “função auxiliar de AAV” (por exemplo, rep e cap), que funcionam em trans para replicação de AAV produtiva e encapsidação. Preferivelmente, o vetor de função auxiliar AAV dá suporte à produção de vetor AAV eficiente sem geração de quaisquer vírions de AAV do tipo selvagem detectáveis (por exemplo, vírions de AAV contendo genes rep e cap funcionais). Exemplos não limitantes de vetores adequados para uso com a presente invenção incluem pHLP19, descrito na Pat. U.S. No. 6.001.650 e vetor pRep6cap6, descrito na Pat. U.S. No. 6.156.303, o conteúdo de ambas aqui incorporado a título de referência. Os vetores de função acessório codificam sequências de nucleotídeo para funções virais e/ou celulares não derivadas de AAV das quais AAV é independente para replicação (por exemplo, “funções acessório”). As funções acessório incluem aquelas funções requeridas para replicação de AAV, incluindo, sem limitação, aquelas porções envolvidas em ativação de transcrição de gene de AAV, união de mRNA de AAV específico de estágio, replicação de DNA de AAV, síntese de produtos de expressão de cap e montagem de capsídeo de AAV. Funções acessório de base viral podem ser derivadas de qualquer um dos vírus auxiliares conhecidos tais como adenovírus, herpesvírus (exceto vírus herpes simplex tipo-1) e vírus vaccínia.

[0071] Em alguns aspectos, a invenção provê células hospedeiras transfectadas. O termo “transfecção” é usado para se referir à absorção de DNA estranho por uma célula, e uma célula foi “transfectada” quando DNA exógeno foi introduzido na membrana celular. Várias técnicas de transfecção são geralmente conhecidas no campo. Vide, por exemplo, Graham e outros (1973) Virology, 52:456, Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis e outros (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier e Chu e outros. (1981) Gene 13:197. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir um ou mais ácidos nucleicos exógenos, tal como um vetor de integração de nucleotídeo e outras moléculas de ácido nucleico, em células hospedeiras adequadas.

[0072] Uma “célula hospedeira” se refere a qualquer célula que carregue, ou seja capaz de carregar, uma substância de interesse. Frequentemente uma célula hospedeira é uma célula de mamífero. Uma célula hospedeira pode ser usada como um recipiente de um construto auxiliar de AAV, um plasmídeo de minigene de AAV, um vetor de função acessório ou outro DNA de transferência associado com a produção de AAVs recombinantes. O termo inclui a progênie da célula original que foi transfectada. Portanto, uma “célula hospedeira” como aqui usado pode se referir a uma célula que foi transfectada com uma sequência de DNA exógena. É compreendido que a progênie de uma célula parental única pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total à parental original, devido à mutação natural, acidental ou deliberada.

[0073] Como aqui usado, o termo “linhagem de célula” se refere a uma população de células capaz de crescimento e divisão contínuos ou prolongados in vitro. Frequentemente, linhagens de célula são populações clonais derivadas de uma célula progenitora única. É ainda conhecido na técnica que mudanças espontâneas ou induzidas podem ocorrer em cariótipo durante armazenamento ou transferência de tais populações clonais. Portanto, células derivadas da linhagem de célula referida podem não ser precisamente idênticas às células ou culturas ancestrais, e a linhagem de célula referida inclui tais variantes.

[0074] Como aqui usado, o termo “célula recombinante” se refere a uma célula na qual um segmento de DNA exógeno, tal como um segmento de DNA que leva à transcrição de um polipeptídeo biologicamente ativo ou produção de um ácido nucleico biologicamente ativo tal como um RNA, foi introduzido.

[0075] Como aqui usado, o termo “vetor” inclui qualquer elemento genético, tal como um plasmídeo, fago, transposons, cosmídeo, cromossomo, cromossomo artificial, vírus, vírion, etc., que é capaz de replicação quando associado com os elementos de controle apropriados e que pode transferir sequências de gene entre células. Portanto, o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vetores virais. Em algumas modalidades, vetores úteis são compreendidos ser aqueles vetores em que o segmento de ácido nucleico a ser transcrito é posicionado sob o controle transcripcional de um promotor. Um “promotor” se refere a uma sequência de DNA reconhecida pelo maquinário sintético da célula, ou maquinário sintético introduzido, necessário para iniciar a transcrição específica de um gene. A expressão “operativamente posicionado”, “sob controle” ou “sob controle transcripcional” significa que o promotor está em local e orientação corretos em relação ao ácido nucleico para controlar iniciação de polimerase de RNA e expressão do gene. O termo “vetor ou construto de expressão” significa qualquer tipo de construto genético contendo um ácido nucleico em que parte ou toda a sequência de codificação de ácido nucleico é capaz de ser transcrita. Em algumas modalidades, expressão inclui transcrição do ácido nucleico, por exemplo, para gerar um produto de polipeptídeo biologicamente ativo a partir de um gene transcrito. Os métodos acima para empacotamento de vetores recombinantes em capsídeos de AAV desejados para produzir os rAAVs da descrição não pretendem ser limitantes e outros métodos adequados serão aparentes ao versado. Métodos para tratamento de doenças do armazenamento lisossomal

[0076] Métodos para administração de um transgene a um indivíduo são providos pela invenção. Um indivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um humano, primata não humano, roedor, cachorro, gato, cavalo, porco, etc. Em algumas modalidades, um indivíduo é um humano. Os métodos envolvem tipicamente administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de ácido nucleico isolado codificando proteínas hexosaminidase A (HEXA) e hexosaminidase B) (HEXB) (por exemplo,

HEXA e/ou HEXB do tipo selvagem, HEXA e/ou HEXB com códon otimizado ou qualquer combinação do acima) capazes de compensar proteínas HEXA e HEXB mutantes em um indivíduo. Proteínas HEXA e HEXB formam a isozima heterodimérica beta-hexosaminidase A, que é a proteína/enzima lisossomal em humanos que quebra gangliosídeo GM2. Desta maneira, mutações bialélicas em um gene HEXA e/ou gene HEXB geralmente resultam no acúmulo tóxico de gangliosídeo GM2 e distúrbios do armazenamento lisossomal.

[0077] Como aqui usado, um “distúrbio do armazenamento lisossomal” se refere a uma doença metabólica herdada caracterizada por uma formação anormal de gangliosídeo GM2 em células, particularmente neurônios, resultante de mutações bialélica em um gene HEXA e/ou um HEXB. Em algumas modalidades, um indivíduo é caracterizado por ter uma mutação em um gene HEXA resultando em função reduzida ou perda de função da proteína beta-hexosaminidase A do indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é caracterizado por ter uma mutação em um gene HEXB resultando em uma função reduzida ou perda de função da proteína beta-hexosaminidase A do indivíduo. “Mutações bialélicas” se referem a ambas cópias de um gene, nesse caso ou HEXA e/ou HEXB, possuindo alterações em sequência de aminoácido. A formação progressiva de gangliosídeo GM2 em lisossomas leva à destruição de neurônios. Em algumas modalidades, o distúrbio do armazenamento lisossomal é doença de Tay-Sachs (TSD), uma condição causada por função reduzida ou perda de função da proteína HEXA. Em algumas modalidades, o distúrbio do armazenamento lisossomal é doença de Sandhoff (SD), uma condição causada por função reduzida ou perda de função da proteína HEXB.

[0078] Uma “quantidade eficaz” de uma substância é uma quantidade suficiente para produzir um efeito desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico isolado é uma quantidade suficiente para transfectar (ou infectar no contexto de administração mediada por rAAV) um número suficiente de células-alvo de um tecido-alvo de um indivíduo. Em algumas modalidades, um tecido-alvo é tecido do sistema nervoso central (SNC) (por exemplo, tecido cerebral, tecido do cordão espinhal, fluido cerebrospinal (CSF), etc.). Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico isolado (por exemplo, que pode ser administrado por meio de um rAAV) pode ser uma quantidade suficiente para ter um benefício terapêutico em um indivíduo, por exemplo, compensar a redução de função ou perda de função de uma proteína resultante da mutação de um gene (por exemplo, HEXA ou HEXB), prolongar o tempo de vida de um indivíduo, melhorar no indivíduo um ou mais sintomas de doença (por exemplo, um sintoma de TSD ou SD), etc. A quantidade eficaz dependerá de uma variedade de fatores tais como, por exemplo, a espécie, idade, peso, saúde do indivíduo e o tecido a ser direcionado, e podem então variar dentre indivíduo e tecido como descrito em um outro lugar na descrição.

[0079] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou rAAV como descrito aqui é útil para tratar uma doença do armazenamento lisossomal, por exemplo, doença de Tay-Sachs ou doença de Sandhoff. Como aqui usado, o termo “tratar” se refere à aplicação ou administração de uma composição codificando um ácido nucleico isolado (por exemplo, um rAAV compreendendo um ácido nucleico isolado) como aqui descrito a um indivíduo, que tem uma doença do armazenamento lisossomal, um sintoma de uma doença do armazenamento lisossomal ou uma predisposição à doença do armazenamento lisossomal (por exemplo, uma ou mais mutações no gene HEXA, gene HEXB, etc.), com o propósito de curar, cicatrizar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, melhorar ou afetar o distúrbio, o sintoma da doença ou a predisposição à doença do armazenamento lisossomal.

[0080] Alívio de uma doença do armazenamento lisossomal inclui retardo do desenvolvimento ou progressão da doença ou redução da severidade da doença. Alívio da doença não requer necessariamente resultados curativos. Como aqui usado, “retardo” do desenvolvimento de uma doença do armazenamento lisossomal significar protelar, impedir, deixar mais lento, retardar, estabilizar e/ou adiar progressão da doença. Esse retardo pode ser de durações de tempo variáveis, dependendo da história da doença e/ou indivíduos sendo tratados. Um método que “atrasa” ou alivia o desenvolvimento de uma doença, ou atrasa o início da doença, é um método que reduz a probabilidade de desenvolvimento de um ou mais sintomas da doença em um dado prazo e/ou reduz o grau dos sintomas em um dado prazo, quando comparado com não uso do método. Tais comparações são tipicamente baseadas em estudos clínicos, usando vários indivíduos suficientes para dar um resultado estatisticamente significante.

[0081] “Desenvolvimento” ou “progressão” de uma doença significa manifestações iniciais e/ou progressão subsequente da doença. Desenvolvimento da doença pode ser detectável e avaliado usando técnicas clínicas padrão bem conhecidas no campo. No entanto, desenvolvimento também se refere à progressão que pode ser não detectável. Para propósito da presente invenção, desenvolvimento ou progressão se refere ao curso biológico dos sintomas. “Desenvolvimento” inclui ocorrência, recorrência e início. Como aqui usado, “início” ou “ocorrência” de uma doença do armazenamento lisossomal inclui primeiro inicial e/ou recorrência. Modos de Administração

[0082] Os rAAVs da invenção podem ser administrados a um indivíduo em composições de acordo com quaisquer métodos apropriados conhecidos na técnica. Por exemplo, um rAAV,

preferivelmente suspenso em um veículo fisiologicamente compatível (por exemplo, em uma composição), pode ser administrado a um indivíduo, isto é, animal hospedeiro, tal como um humano, camundongo, rato, gato, cachorro, ovelha, coelho, cavalo, vaca, cabra, porco, porquinho-da-índia, hamster, galinha, peru ou um primata não humano (por exemplo, Macaque). Em algumas modalidades, um animal hospedeiro não inclui um humano.

[0083] Administração dos rAAVs a um indivíduo mamífero pode ser através de, por exemplo, injeção intramuscular ou através de administração à corrente sanguínea do indivíduo mamífero. Administração à corrente sanguínea pode ser através de injeção em uma veia, uma artéria ou qualquer outro conduíte vascular. Em algumas modalidades, os rAAVs são administrados à corrente sanguínea por meio de perfusão isolada de membro, uma técnica bem conhecida no campo cirúrgico, o método permitindo essencialmente que o versado isole um membro da circulação sistêmica antes da administração dos vírions de rAAV. Uma variante da técnica de perfusão isolada de membro, descrita na Pat. U.S. No. 6.177.403, pode ser também usada pelo versado para administrar os vírions na vasculatura de um membro isolado para potencialmente melhorar a transdução para células ou tecido musculares. Além disso, em certos casos, pode ser desejável administrar os vírions ao SNC de um indivíduo. Por “SNC” quer dizer todas as células e tecido do cérebro e cordão espinhal de um vertebrado. Portanto, o termo inclui, mas não é limitado a células neuronais, células gliais, astrócitos, fluido cerebrospinal (CSF), espaços intersticiais, osso, cartilagem e similar. AAVs recombinantes podem ser administrados diretamente ao SNC ou cérebro através de injeção na, por exemplo, região ventricular, bem como no estriado (por exemplo, o núcleo caudato ou putâmen do estriado), tálamo, cordão espinhal e junção neuromuscular, ou lóbulo cerebelar, com uma agulha, cateter ou dispositivo relacionado, usando técnicas neurocirúrgicas conhecidas no campo, tal como através de injeção estereotáctica (vide, por exemplo, Stein e outros, J. Virol. 73:3424-3429, 1999; Davidson e outros, PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson e outros, Nat. Genet. 3:219-223, 1993; e Alisky e Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000). Em algumas modalidades, um rAAV como descrito na invenção é administrado através de injeção intravenosa. Em algumas modalidaides, rAAVs são administrados através de injeção intracerebral. Em algumas modalidades, rAAVs são administrados através de injeção intratecal. Em algumas modalidades, rAAVs são administrados através de injeção intraestriatal. Em algumas modalidades, rAAVs são administrados através de injeção intracranial. Em algumas modalidades, rAAVs são administrados através de injeção na cisterna magna. Em algumas modalidaides, o rAAV são administrados através de uma injeção no ventrículo lateral cerebral.

[0084] Aspectos da presente invenção se referem a composições compreendendo um AAV recombinante compreendendo uma proteína do capsídeo e um ácido nucleico codificando um transgene, em que o transgene compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma ou mais proteínas. Em algumas modalidades, cada proteína compreende uma sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 ou 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda ITRs de AAV. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um vetor de rAAV representado pela sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3-9 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, uma composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0085] As composições da invenção podem compreender um rAAV sozinho ou em combinação com um ou mais outros vírus (por exemplo, um segundo rAAV tendo um ou mais transgenes diferentes). Em algumas modalidades, uma composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais rAAVs diferentes cada um tendo um ou mais transgenes diferentes.

[0086] Veículos adequados podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica em vista da indicação para a qual o rAAV é direcionado. Por exemplo, um veículo adequado inclui solução salina, que pode ser formulada com uma variedade de soluções de tamponamento (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Outros veículos exemplares incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de sésamo e água. A seleção do veículo não é uma limitação da presente invenção.

[0087] Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, em adição ao rAAV e veículo(s), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes, ou estabilizantes químicos. Conservantes exemplares adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, galato de propila, os parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, paraclorofenol e poloxâmeros (tensoativos não iônicos) tal como Pluronic® F-68. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.

[0088] Os rAAVs são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado e prover níveis suficientes de transferência e expressão de gene sem efeitos adversos indevidos. Vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitadas a administração direta ao órgão selecionado (por exemplo, administração intraportal ao fígado), oral, inalação (incluindo administração intranasal e intratraqueal), intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradermal, intratumoral e outras vias de administração parentais. Vias de administração podem ser combinadas, se desejado.

[0089] A dose de vírions de rAAV requerida para obter um “efeito terapêutico” particular, por exemplo, as unidades de dose em cópias de genoma/por quilograma de peso corporal (GC/kg), variará com base em vários fatores incluindo, mas não limitado a: a via de administração de vírion de rAAV, o nível de expressão de gene ou RNA requerido para obter um efeito terapêutico, uma doença ou distúrbio específico sendo tratado e a estabilidade do gene ou produto de RNA. Um versado na técnica pode prontamente determinar uma faixa de dose de vírion de rAAV para tratar um paciente tendo uma doença ou distúrbio particular com base nos fatores mencionados acima, bem como outros fatores que são bem conhecidos na técnica.

[0090] Uma quantidade eficaz de um rAAV é uma quantidade suficiente para atingir infectar um animal, atingir um tecido desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um rAAV é administrada ao indivíduo durante um estágio pressintomático da doença do armazenamento lisossomal. Em algumas modalidades, o estágio pressintomático da doença do armazenamento lisossomal ocorre entre o nascimento (por exemplo, perinatal) e 4 semanas de vida.

[0091] Em algumas modalidades, composições de rAAV são formuladas para reduzir agregação de partículas de AAV na composição, particularmente onde concentrações de rAAV altas estão presentes (por exemplo, ~1013 GC/mL ou mais). Métodos para redução de agregação de rAAVs são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, adição de tensoativos, ajuste do pH, ajuste da concentração de sal, etc. (Vide, por exemplo, Wright, F.R. e outros, Molecular Therapy (2005) 12, 171–178, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência).

[0092] Formulação de excipientes e soluções veiculares farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida daqueles de habilidade na técnica, bem como o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para uso das composições particulares descritas aqui em uma variedade de regimes de tratamento.

[0093] Tipicamente, essas formulações podem conter pelo menos cerca de 0,1% do composto ativo ou mais, embora a porcentagem do(s) ingrediente(s) ativo(s) possa, por certo, ser variada e possa convenientemente estar entre cerca de 1 ou 2% e cerca de 70% ou 80% ou amis do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade de composto ativo em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada de tal maneira que uma dosagem adequada será obtida em qualquer dose unitária dada do composto. Fatores tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, vida de prateleira do produto, bem como outras considerações farmacológicas serão compreendidos por um versado na técnica de preparação de tais formulações farmacêuticas e, desta maneira, uma variedade de dosagens e regimes de tratamento pode ser desejável.

[0094] Em certas circunstâncias será desejável administrar os construtos terapêuticos à base de rAAV em composições farmacêuticas adequadamente formuladas divulgadas aqui ou subcutaneamente, intrapancreaticamente, intranasalmente, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intratecalmente ou oralmente, intraperitonealmente ou através de inalação. Em algumas modalidades, as modalidades de administração como descrito nas Pat. U.S. Nos.

5.543.158; 5.641.515 e 5.399.363 (cada uma aqui especificamente incorporada a título de referência em sua totalidade) podem ser usadas para administrar rAAVs. Em algumas modalidades, um modo de administração preferido é através de injeção na veia portal.

[0095] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de micro-organismos. Em muitos casos a forma é estéril e fluida até o ponto que exista seringabilidade fácil. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similar), suas misturas adequadas e/ou óleos vegetais. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser conseguida através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similar. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida através do uso nas composições de agentes de retardo de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0096] Para administração de uma solução aquosa injetável, por exemplo, a solução pode ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glucose suficiente. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administrações intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Com relação a isso, um meio aquoso estéril que pode ser usado será conhecido daqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução de NaCl isotônica e ou adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no sítio de infusão proposto (vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação em dosagem será necessária ocorrer dependendo da condição do hospedeiro. A pessoa responsável pela administração vai, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o hospedeiro individual.

[0097] Soluções estéreis injetáveis são preparadas através da incorporação do rAAV ativo na quantidade requerida no solvente apropriado em vários dos outros ingredientes enumerados aqui, conforme necessário, seguido por esterilização filtrada. Em geral, dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento que fornecem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução anteriormente filtrada estéril do mesmo.

[0098] As composições de rAAV divulgadas aqui podem também ser formuladas em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácidos (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similar. Sais formados com os grupos carboxila livres podem ser também derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos, e tais bases orgânicas são isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similar. Quando da formulação, soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tais quantidades como for terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármaco e similar.

[0099] Como aqui usado, “veículo” inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, tampões, soluções veículares, suspensões, coloides e similar. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados às composições. A expressão “farmaceuticamente aceitável” se refere a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação alérgica ou indevida similar quando administrada a um hospedeiro.

[0100] Veículos de administração tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas de lipídeo, vesículas, e similar, podem ser usados para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Em particular, os transgenes administrados pelo vetor de rAAV podem ser formulados para administração ou encapsulados em uma partícula de lipídeo, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera ou uma nanopartícula ou similar.

[0101] Tais formulações podem ser preferidas para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ou dos construtos de rAAV divulgados aqui. A formação e uso de lipossomas são geralmente conhecidos daqueles versados na técnica. Recentemente, lipossomas foram desenvolvidos com estabilidade no soro e meias-vida de circulação melhoradas (Pat. U.S. No. 5.741.516). Ainda, vários métodos de lipossoma e preparações do tipo lipossoma como veículos de fármaco potenciais foram descritos (Pat. U.S. Nos.

5.567.434; 5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587).

[0102] Lipossomas têm sido usados com sucesso com vários de tipos de célula que são normalmente resistentes à transfecção através de outros procedimentos. Ainda, lipossomas são livres das limitações de comprimento do DNA que são típicas de sistemas de administração de base viral. Lipossomas têm sido usados efetivamente para introduzir genes, fármacos, agentes radioterapêuticos, vírus, fatores de transcrição e efetores alostéricos em uma variedade de linhagens de célula culturadas e animais. Ainda, vários testes clínicos bem-sucedidos examinando a eficácia de administração de fármaco mediada por lipossoma foram completados.

[0103] Lipossomas são formados de fosfolipídeos que são dispersos em um meio aquoso e formam espontaneamente vesículas de bicamadas concêntricas multilamelares (também chamadas vesículas multilamelares (MLVs). MLVs geralmente têm diâmetros de a partir de 25 nm a 4 μm. Sonificação de MLVs resulta na formação de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 Å, contendo uma solução aquosa no núcleo.

[0104] Alternativamente, formulações de nanocápsula do rAAV podem ser usadas. Nanocápsulas podem geralmente aprisionar substâncias de uma maneira estável e reproduzível. Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (tamanho mais ou menos 0,1 μ) devem ser projetadas usando polímeros capazes de ser degradados in vivo. Nanopartículas de polialquil-ciaonacrilato biodegradáveis que satisfazem essas exigências são compreendidas para uso.

[0105] Em adição aos métodos de administração descritos acima, as técnicas que seguem são também compreendidas como métodos alternativos de administração das composições de rAAV a um hospedeiro. Sonoforese (isto é, ultrassom) tem sido usada e descrita na

Pat; U.S. No. 5.656.016 como um dispositivo para aumento da taxa e eficácia de permeação de fármaco para o e por todo o sistema circulatório. Outras alternativas de administração de fármaco compreendidas são injeção intraóssea (Pat. U.S. No. 5.779.708), dispositivos de microchip (Pat. U.S. No. 5.797.898), formulações oftálmicas (Bourlais e outros, 1998), matrizes transdermais (Pat. U.S. Nos. 5.770.219 e 5.783.208) e administração controlada por feedback (Pat. U.S. No. 5.697.899).

EXEMPLOS

[0106] Vetores de AAV codificando ambas subunidades alfa e beta de hexosaminidase (HexA e HexB, respectivamente) foram desenvolvidos (Figura 1) usando dois princípios de projeto para vetores bicistrônicos. Em AAV-BiP2i-HexAB (P2I), os cassetes de transgene são posicionados em orientações opostas com os promotores dirigindo a expressão a partir das extremidades do genoma. O outro vetor, AAV- BiCBA-HexAB (Bic), usa um promotor bidirecional composto de um potencializador de CMV único flanqueado pelo promotor da β-actina da galinha (CBA) mínimo para dirigir a expressão em direções opostas a partir do centro do genoma.

[0107] Estudos de curto prazo usando vetores de AAV-PHP.B demonstraram eficácia. Embora AAV9 seja consideravelmente menos eficiente do que AAV-PHP.B para administração de gene no SNC sistêmica em camundongos, ele é também um capsídeo para o qual há experiência clínica considerável com um histórico de segurança excelente. Além disso, administração sistêmica de AAV9 tem sido observada mediar resultados terapêuticos transformativos em pacientes com atrofia muscular espinhal (SMA). Por essas razões, ele foi incluído em experimentos terapêuticos para um total de quatro vetores sendo testados.

[0108] Camundongos Sandhoff de quatro semanas de vida (Hex-/-)

foram tratados sistemicamente (injeção na veia da cauda) com 1 x 1012 vg (n=8) ou 4 x 1012 vg (n=14) de vetores de AAV9 (Bic ou P2I) ou 3 x 1011 vg (n=8) ou 1 x 1012 vg (n= 14) de vetores de AAV-PHP.B (Bic ou P2I) codificando proteínas HexA e HexB de camundongo. Camundongos SD (n=6) e do tipo selvagem (n=14) injetados com PBS da mesma idade foram usados como controles. Todos os coortes eram compostos de números iguais de machos e fêmeas. Um subconjunto de camundongos (n=6) nos coortes de dose alta e controles normais foi sacrificado em 150 dias de vida ou ponto final humano para avaliar a eficácia usando medidas de resultado bioquímico (atividade enzimática e teor de gangliosídeo GM2) e histológico, enquanto os camundongos restantes foram usados para análise de sobrevivência. Camundongos SD tratados com PBS foram eutanizados quando eles atingiram o ponto final humano (todos antes de 15 dias de vida). O ponto final humano foi determinado através de qualquer um dos parâmetros que seguem: incapacidade de se erguer por 30 segundos quando postos em posição supino, paralisia de um membro traseiro ou mais de 15% de perda de peso corporal a partir do peso de pico. EXEMPLO 1: o desempenho comportamental de camundongos SD tratados com AAV permaneceu estável com o tempo

[0109] O desempenho comportamental de camundongos SD tratados com AAV e controle (KO) foi avaliado usando os testes de rotarod e tela invertida em 60, 90, 105, 120 e 149 dias de vida. A coordenação do motor e o desempenho de camundongos SD tratados com AAV permaneceram comparáveis a controles normais em testes de rotarod acelerado (Figura 2A) e tela invertida (Figuras 2B-2C) até o último ponto de tempo em 149 dias de vida. O desempenho de camundongos SD não tratados declinou com o tempo e quaisquer animais permaneceram vivos no último ponto de tempo. EXEMPLO 2: tratamento com AAV sistêmico reduz o teor de gangliosídeo GM2 em todo o sistema nervoso central de camundongos

SD

[0110] O teor de gangliosídeo GM2 no cérebro, cerebelo, tronco cerebral e cordão espinal de camundongo SD tratados com AAV (dose alta) em 150 dias de idade foi significantemente menor do que em camundongos SD não tratados no ponto final humano, e quase imperceptível em AAV9-Bic e ambos grupos de tratamento AAV-PHP.B (Figura 3). Os níveis de GM2 permaneceram acima da base em animais tratados com AAV9-P2I. EXEMPLO 3: atividade de hexosaminidase aumentada em cérebro e fígado de camundongos SD tratados com AAV

[0111] Atividade de hexosaminidase no cérebro e cerebelo (Figuras 4A-4D) era consistente com as constatações para teor de gangliosídeo GM2. A atividade de enzima no cérebro de camundongos tratados com AAV9-P2I era consistentemente menor do que em outros grupos, mas mesmo assim, restauração de 10% de atividade de HexA normal parece suficiente para reduzir significantemente teor de gangliosídeo GM2 no cérebro (Figura 3). Restauração de atividade de HexA no cérebro para ~20% como em animais tratados com AAV9-Bic (Figura 4) parece suficiente para eliminar bastante armazenamento de gangliosídeo GM2 (Figura 3). Atividade de hexosaminidase (HexA, HexB, HexS) total no fígado foi também avaliada seguindo administração sistêmica de AAV- PHP.Bic usando o substrato artificial MUG (Figura 5). No fígado, a atividade de hexosaminidase total foi restaurada para 15% de normal. EXEMPLO 4: tratamento com AAV sistêmico prolonga a sobrevivência de camundongos SD

[0112] Todos os camundongos SD injetados com vetores de AAV- Bic permaneceram vivos passados 350 dias nos coortes de dose baixa (3 x 1011 vg) e alta (1 x 1012 vg) (Figuras 6A-6B). Tratamento com AAV9- P2I sistêmico teve um impacto marginal de sobrevivência na dose baixa

(1 x 1012 vg), mas aumentou na dose alta (4 x 1012 vg) (Figuras 6A-6B). O impacto de tratamento com AAV9-P2I sobre sobrevivência está de acordo com as constatações bioquímicas do SNC onde níveis de gangliosídeo GM2 foram reduzidos em relação a camundongos SD controle não tratados (Figura 3), mas permaneceram detectáveis, ao contrário e em outros grupos de tratamento ou coortes normais. EXEMPLO 5: tratamento com AAV sistêmico restaura atividade de Hex em todo o cérebro de camundongos SD

[0113] Análise de distribuição de Hexosaminidase no cérebro seguindo administração de AAV-PHP.B-BiCBA-HexAB usando um tingimento histoquímico específico de Hexosaminidase mostrou restauração de atividade de enzima por todo o cérebro (Figura 7) indicando que essa abordagem, em algumas modalidades, media um impacto terapêutico. EXEMPLO 6: administração ao CSF de terapia genética com AAV para doença Tay-Sachs e Sandhoff

[0114] Camundongos GM2 neonatais (n=31 camundongos) receberam injeções bilaterais de AAV9-BiCB-HexAB (7,25x1010 vg) nos ventrículos laterais cerebrais (2 μl por lado). Camundongos GM2 controle (n=8) receberam injeção bilateral de solução salina tamponada com fosfato. Em um mês de vida o teor de gangliosídeo GM2 no cérebro de camundongos GM2 tratados com AAV (n=6) era idêntico àquele em animais normais, que é menos do que 0,5% do nível encontrado em camundongos GM2 não tratados da mesma idade (Figura 8A). O desempenho motor de camundongos GM2 tratados com AAV em duas tarefas, rotarod (Figura 8B) e tela invertida (Figura 8C), foi significantemente melhorado comparado com camundongos GM2 não tratados em 120 dias de vida e permaneceu estável até 150 dias de vida. No momento a maioria dos camundongos GM2 tratados com AAV permaneceu viva passados 400 dias de idade comparado com uma sobrevivência média de 129,5 dias para camundongos GM2 não tratados (Figura 8D). EXEMPLO 7: vetor de AAV9- BiCB-HexAB injetado no CSF através de administração intratecal em camundongos GM2 adultos Injeção intratecal lombar (LIT) de 1x1012 vg de vetor AAV9-BiCB-HexAB em camundongos GM2 de 42-45 dias de vida (n=20) levou a desempenho melhor nos testes de rotarod (Figura 9A) e tela invertida (Figura 9B). A sobrevivência média de camundongos GM2 tratados com AAV foi observada ser pelo menos 265 dias (representando apenas camundongos que viveram mais de 250 dias), comparado com 129,5 dias para camundongos GM2 não tratados (Figura 9C; P<0,0001). Quaisquer camundongos GM2 puros estavam vivos em 246 (n=7) e 299 (n=2) dias de vida (Figura 9C). Os dados indicam um benefício terapêutico de vetor AAV9-BiCB-HexAB administrado LIT em camundongos jovens adultos.

SEQUÊNCIAS >SEQ ID NO: 1; sequência de aminoácido de HexA

MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATALWPWPQNFQTSDQRYVLYPNNFQF QYDVSSAAQPGCSVLDEAFQRYRDLLFGSGSWPRPYLTGKRHTLEK NVLVVSVVTPGCNQLPTLESVENYTLTINDDQCLLLSETVWGALRGL ETFSQLVWKSAEGTFFINKTEIEDFPRFPHRGLLLDTSRHYLPLSSILD TLDVMAYNKLNVFHWHLVDDPSFPYESFTFPELMRKGSYNPVTHIYT AQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYSGSEP SGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWK SNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVF DNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRIS YGPDWKDFYVVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDNTNLVPR LWPRAGAVAERLWSNKLTSDLTFAYERLSHFRCELLRRGVQAQPLN

VGFCEQEFEQT >SEQ ID NO: 2; sequência de aminoácido de HexB

MELCGLGLPRPPMLLALLLATLLAAMLALLTQVALVVQVAEAARAPSV SAKPGPALWPLPLSVKMTPNLLHLAPENFYISHSPNSTAGPSCTLLEE AFRRYHGYIFGFYKWHHEPAEFQAKTQVQQLLVSITLQSECDAFPNIS SDESYTLLVKEPVAVLKANRVWGALRGLETFSQLVYQDSYGTFTINE STIIDSPRFSHRGILIDTSRHYLPVKIILKTLDAMAFNKFNVLHWHIVDD QSFPYQSITFPELSNKGSYSLSHVYTPNDVRMVIEYARLRGIRVLPEF DTPGHTLSWGKGQKDLLTPCYSRQNKLDSFGPINPTLNTTYSFLTTF FKEISEVFPDQFIHLGGDEVEFKCWESNPKIQDFMRQKGFGTDFKKL ESFYIQKVLDIIATINKGSIVWQEVFDDKAKLAPGTIVEVWKDSAYPEE LSRVTASGFPVILSAPWYLDLISYGQDWRKYYKVEPLDFGGTQKQKQ LFIGGEACLWGEYVDATNLTPRLWPRASAVGERLWSSKDVRDMDDA

YDRLTRHRCRMVERGIAAQPLYAGYCNHENM >SEQ ID NO: 3; sequência de ácido nucleico de AAV-BiCBA-HexAB

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGG GCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCC TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT CACTAGGGGTTCCTAGATCTGAATTCTACCACATTTGTAGAGGTTT TACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACATCTCCCCCTGAACCTGAAACA TAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATA ATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGC ATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATG TATCTTATCATGTCTGTCGAGGCGGCCGCTCAGGTCTGCTCAAAT TCCTGCTCACAGAATCCGACATTCAGGGGCTGTGCCTGCACGCCT CTCCTCAGCAGCTCGCACCTGAAGTGGCTCAGCCTTTCGTAAGCG AATGTCAGATCAGAGGTCAGCTTGTTGGACCACAGTCTCTCGGCC ACTGCTCCGGCCCTGGGCCACAGTCGTGGGACCAGATTGGTGTT GTCCACATACTCGCCCCACATACATGCTTCGCCCCCGATGACCAG AGCTTTCTGCTCAGGAGTCCCTTCAAAGGCCAGGGGCTCCACAAT GTAGAAATCCTTCCAGTCTGGTCCATATGAGATCCTGTTCAGGTAC CAAGGGGCACTCAGCAGTGCTCGGAAGCCAGCTTTTGTCACCAG TTCCAGCTCCTTCATATAATTGACAGGAATATCCTCGCGCCACACT TGAATGATGGTATCGGGCTGGATTTTGACCTTGTTGTCAAACACTT CCTGCCAGACCACATAGCCCTTTCCGTATGAACTCACAATGTCCA GCAGAGTCTGGATGTAGAAACTCTCCAGCTGCTTGAAGTCTTCGC CGAACCCTTTCTTCCGCATAAAGTCCTGGATCTCTGGATTAGACTT CCAACATGTGAAATCCACTTCGTCTCCGCCCAGGTGCAGATAAAA GTCAGGGAAGACAGAGGACACCTCCAGAAAGAATGTAGACATGAA CTCGTAGGTATTGTTCAGGGATGGGTTCACAGGTCCGAAGGTGCC GCTTGGCTCACTCCCAGAGTAGCAAGGAGTCAGCAGTCCGGGAA TTCCTGGGCCCCAGCTCAGAGTATGGCCAGGTGTATCGAATTCAG CCAGCACTCGAATCCCCCTCAGTCGGGCATACTCGATGACTTCTT TCACGTCCTGGGCGGTATAGATGTGAGTCACGGGATTGTAGCTGC CCTTGCGCATCAGCTCTGGAAATGTGAAGCTTTCGTAAGGAAATG AGGGATCGTCGACCAGATGCCAGTGGAACACGTTCAGCTTGTTAT AAGCCATCACATCCAGAGTGTCCAGAATGCTTGACAGGGGCAGGT AATGTCTAGATGTATCCAGCAGCAGCCCCCGGTGTGGAAATCTAG GGAAGTCTTCGATCTCAGTTTTGTTGATAAAGAATGTTCCCTCGGC TGACTTCCAGACCAGCTGACTGAAAGTCTCCAGGCCCCTCAGTGC CCCCCACACTGTTTCGGACAGCAGCAGACACTGATCGTCATTGAT TGTCAGGGTATAGTTCTCCACGGATTCCAGGGTGGGCAGCTGATT GCAGCCTGGAGTGACCACGCTGACCACCAGCACGTTTTTCTCCAG GGTGTGGCGCTTCCCAGTCAGATAGGGCCGTGGCCAGGACCCGC TTCCAAACAGCAGATCGCGGTACCGCTGGAATGCCTCGTCCAGG ACGCTGCATCCTGGCTGAGCGGCGCTGCTCACGTCGTACTGAAA CTGGAAATTGTTTGGATACAGCACGTACCTCTGGTCAGATGTCTG GAAGTTCTGAGGCCATGGCCACAGGGCGGTTGCTCGTCCAGCAA ATGCAGCGGCCAGCAGCAGGGAGAACCACAGTCTGGAGCTGGTC ATGGTGGCTTTATCGATACTAGCGCTAGAGCTTGCTCCCGCCCGC CGCGCGCTTCGCTTTTTATAGGGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCGC CATAAAAGGAAACTTTCGGAGCGCGCCGCTCTGATTGGCTGCCG CCGCACCTCTCCGCCTCGCCCCGCCCCGCCCCTCGCCCCCATCG CTGCACAAAATAATTAAAAAATAAATAAATACAAAATTGGGGGTGG GGAGGGGGGGGAGATGGGGAGAGTGAAGCAGAACGTGGCCTCG GATCCCCCGGGCTGCAGTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT TAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT AAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGA CGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTT GGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACAT GACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTC ATCGCTATTACCATGTCGAGGCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCAT CTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAAT TATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGG CGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAA AGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAA AAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGCAAGCTCGCTAGCACTAG TGGAGCACCATGGAGCTGTGCGGGCTGGGGCTGCCCCGGCCGC CCATGCTGCTGGCGCTGCTGTTGGCGACACTGCTGGCGGCGATG TTGGCGCTGCTGACTCAGGTGGCGCTGGTGGTGCAGGTGGCGGA GGCGGCTCGGGCCCCGAGCGTCTCGGCCAAGCCGGGGCCGGC GCTGTGGCCCCTGCCGCTCTCGGTGAAGATGACCCCGAACCTGC TGCATCTCGCCCCGGAGAACTTCTACATCAGCCACAGCCCCAATT CCACGGCGGGCCCCTCCTGCACCCTGCTGGAGGAAGCGTTTCGA CGATATCATGGCTATATTTTTGGTTTCTACAAGTGGCATCATGAAC CTGCTGAATTCCAGGCTAAAACCCAGGTTCAGCAACTTCTTGTCTC AATCACCCTTCAGTCAGAGTGTGATGCTTTCCCCAACATATCTTCA GATGAGTCTTATACTTTACTTGTGAAAGAACCAGTGGCTGTCCTTA AGGCCAACAGAGTTTGGGGAGCATTACGAGGTTTAGAGACCTTTA GCCAGTTAGTTTATCAAGATTCTTATGGAACTTTCACCATCAATGA ATCCACCATTATTGATTCTCCAAGGTTTTCTCACAGAGGAATTTTG ATTGATACATCCAGACATTATCTGCCAGTTAAGATTATTCTTAAAAC TCTGGATGCCATGGCTTTTAATAAGTTTAATGTTCTTCACTGGCAC ATAGTTGATGACCAGTCTTTCCCATATCAGAGCATCACTTTTCCTG AGTTAAGCAATAAAGGAAGCTATTCTTTGTCTCATGTTTATACACC AAATGATGTCCGTATGGTGATTGAATATGCCAGATTACGAGGAATT CGAGTCCTGCCAGAATTTGATACCCCTGGGCATACACTATCTTGG GGAAAAGGTCAGAAAGACCTCCTGACTCCATGTTACAGTAGACAA AACAAGTTGGACTCTTTTGGACCTATAAACCCTACTCTGAATACAA CATACAGCTTCCTTACTACATTTTTCAAAGAAATTAGTGAGGTGTTT CCAGATCAATTCATTCATTTGGGAGGAGATGAAGTGGAATTTAAAT GTTGGGAATCAAATCCAAAAATTCAAGATTTCATGAGGCAAAAAGG CTTTGGCACAGATTTTAAGAAACTAGAATCTTTCTACATTCAAAAG GTTTTGGATATTATTGCAACCATAAACAAGGGATCCATTGTCTGGC AGGAGGTTTTTGATGATAAAGCAAAGCTTGCGCCGGGCACAATAG TTGAAGTATGGAAAGACAGCGCATATCCTGAGGAACTCAGTAGAG TCACAGCATCTGGCTTCCCTGTAATCCTTTCTGCTCCTTGGTACTT AGATTTGATTAGCTATGGACAAGATTGGAGGAAATACTATAAAGTG GAACCTCTTGATTTTGGCGGTACTCAGAAACAGAAACAACTTTTCA TTGGTGGAGAAGCTTGTCTATGGGGAGAATATGTGGATGCAACTA ACCTCACTCCAAGATTATGGCCTCGGGCAAGTGCTGTTGGTGAGA GACTCTGGAGTTCCAAAGATGTCAGAGATATGGATGACGCCTATG ACAGACTGACAAGGCACCGCTGCAGGATGGTCGAACGTGGAATA GCTGCACAACCTCTTTATGCTGGATATTGTAACCATGAGAACATGT AACTCGAGGCGGCCGCTCTAGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAA TTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTA ATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGT GTCTCTCACTCGGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAACCCCTAGT GATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTG AGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCG CCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC ATGCAGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGC CCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGC GCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGC GCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCT TTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCC GTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTG CTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTT CACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGA CGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGG AACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGG ATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAAC AAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCC TGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTA AGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACG GGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGT CTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGT TAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTT CGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATAC ATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCT TCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGT GTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGT TGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTA AGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGA GCACTTTTAAAGTTCTGCTCTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACGTAAGA GAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCC AACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCT TTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGG GAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACAC CACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAAC TGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG GATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCC TTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGC GTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAG CCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACT ATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTG ATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTA GATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGA TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCT TGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAA AACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTAC CAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATAC CAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAA GAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTA CCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTT GGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCT GAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACC TACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCC ACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGA AACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCT ATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTT TTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGAT TCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCT CGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGG AAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGT TGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGGCTGCAGGGGGGGGGGGGG

GGGGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGG >SEQ ID NO: 4; sequência de ácido nucleico de AAV-BiCBA- HexA:HexB com códon otimizado

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGG GCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCC TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT CACTAGGGGTTCCTAGATCTGAATTCTACCACATTTGTAGAGGTTT TACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACATCTCCCCCTGAACCTGAAACA TAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATA ATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGC ATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATG TATCTTATCATGTCTGTCGAGGCGGCCGCTCAGGTCTGCTCAAAT TCCTGCTCACAGAATCCGACATTCAGGGGCTGTGCCTGCACGCCT CTCCTCAGCAGCTCGCACCTGAAGTGGCTCAGCCTTTCGTAAGCG AATGTCAGATCAGAGGTCAGCTTGTTGGACCACAGTCTCTCGGCC ACTGCTCCGGCCCTGGGCCACAGTCGTGGGACCAGATTGGTGTT GTCCACATACTCGCCCCACATACATGCTTCGCCCCCGATGACCAG AGCTTTCTGCTCAGGAGTCCCTTCAAAGGCCAGGGGCTCCACAAT GTAGAAATCCTTCCAGTCTGGTCCATATGAGATCCTGTTCAGGTAC CAAGGGGCACTCAGCAGTGCTCGGAAGCCAGCTTTTGTCACCAG TTCCAGCTCCTTCATATAATTGACAGGAATATCCTCGCGCCACACT TGAATGATGGTATCGGGCTGGATTTTGACCTTGTTGTCAAACACTT CCTGCCAGACCACATAGCCCTTTCCGTATGAACTCACAATGTCCA GCAGAGTCTGGATGTAGAAACTCTCCAGCTGCTTGAAGTCTTCGC CGAACCCTTTCTTCCGCATAAAGTCCTGGATCTCTGGATTAGACTT CCAACATGTGAAATCCACTTCGTCTCCGCCCAGGTGCAGATAAAA GTCAGGGAAGACAGAGGACACCTCCAGAAAGAATGTAGACATGAA CTCGTAGGTATTGTTCAGGGATGGGTTCACAGGTCCGAAGGTGCC GCTTGGCTCACTCCCAGAGTAGCAAGGAGTCAGCAGTCCGGGAA TTCCTGGGCCCCAGCTCAGAGTATGGCCAGGTGTATCGAATTCAG CCAGCACTCGAATCCCCCTCAGTCGGGCATACTCGATGACTTCTT TCACGTCCTGGGCGGTATAGATGTGAGTCACGGGATTGTAGCTGC CCTTGCGCATCAGCTCTGGAAATGTGAAGCTTTCGTAAGGAAATG AGGGATCGTCGACCAGATGCCAGTGGAACACGTTCAGCTTGTTAT AAGCCATCACATCCAGAGTGTCCAGAATGCTTGACAGGGGCAGGT AATGTCTAGATGTATCCAGCAGCAGCCCCCGGTGTGGAAATCTAG GGAAGTCTTCGATCTCAGTTTTGTTGATAAAGAATGTTCCCTCGGC TGACTTCCAGACCAGCTGACTGAAAGTCTCCAGGCCCCTCAGTGC CCCCCACACTGTTTCGGACAGCAGCAGACACTGATCGTCATTGAT TGTCAGGGTATAGTTCTCCACGGATTCCAGGGTGGGCAGCTGATT GCAGCCTGGAGTGACCACGCTGACCACCAGCACGTTTTTCTCCAG GGTGTGGCGCTTCCCAGTCAGATAGGGCCGTGGCCAGGACCCGC TTCCAAACAGCAGATCGCGGTACCGCTGGAATGCCTCGTCCAGG ACGCTGCATCCTGGCTGAGCGGCGCTGCTCACGTCGTACTGAAA CTGGAAATTGTTTGGATACAGCACGTACCTCTGGTCAGATGTCTG GAAGTTCTGAGGCCATGGCCACAGGGCGGTTGCTCGTCCAGCAA ATGCAGCGGCCAGCAGCAGGGAGAACCACAGTCTGGAGCTGGTC ATGGTGGCTTTATCGATACTAGCGCTAGAGCTTGCTCCCGCCCGC CGCGCGCTTCGCTTTTTATAGGGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCGC CATAAAAGGAAACTTTCGGAGCGCGCCGCTCTGATTGGCTGCCG CCGCACCTCTCCGCCTCGCCCCGCCCCGCCCCTCGCCCCCATCG CTGCACAAAATAATTAAAAAATAAATAAATACAAAATTGGGGGTGG GGAGGGGGGGGAGATGGGGAGAGTGAAGCAGAACGTGGCCTCG GATCCCCCGGGCTGCAGTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT TAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT AAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGA CGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTT GGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACAT GACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTC ATCGCTATTACCATGTCGAGGCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCAT CTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAAT TATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGG CGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAA AGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAA 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GG >SEQ ID NO: 5; sequência de ácido nucleico de AAV-BiCBA- HexA:HexB com códon otimizado:com códon otimizado

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G >SEQ ID NO: 8: sequência de ácido nucleico de AAV-hHexA:BiCBA- hHexB com códon otimizado:com códon otimizado

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GGTGGGGGGGGGGGGGGGGGG >SEQ ID NO: 9: sequência de ácido nucleico de AAV-hHexA-BiCBA- hHexB

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGG GCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCC TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT CACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCTACCACATTTGTAGAGGTT TTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACATCTCCCCCTGAACCTGAAAC ATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTAT AATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAG CATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAAT GTATCTTATCATGTCTGTCGAGTCAGGTCTGTTCAAACTCCTGCTC ACAGAAGCCTACATTGAGGGGTTGGGCCTGGACACCTCGCCTCA GCAACTCACAGCGGAAGTGTGACAAACGTTCATAGGCAAATGTCA GGTCAGATGTCAACTTGTTGCTCCACAGCCTTTCGGCAACAGCCC CTGCTCTGGGCCAGAGCCTGGGGACCAGGTTTGTGTTGTCCACA TATTCTCCCCACATACAAGCCTCTCCACCAATCACCAGAGCCTTCT GCTCAGGGGTACCTTCAAATGCCAGGGGTTCCACTATGTAGAAAT CCTTCCAGTCAGGGCCATAGGATATACGGTTCAGGTACCAGGGG GCAGAGAGAAGGGCCCGGAAGCCGGCCTTGGTGACCAGTTCCAG CTCCTTCATATAGTTCACTGGAATATCCTCTCGCCACACCTGTATG ATTGTGTCTGGCTGAATCTTTACTTTATTATCAAACACCTCCTGCC ACACCACATAGCCCTTGCCATAAGAAGAGACGATGTCCAGCAGCG TCTGGATGTAGAAGGACTCCAGCTGCTTGAAGTCCTCACCGAAGC 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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Construto de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um primeiro cassete de expressão compreen- dendo um ácido nucleico codificando uma subunidade alfa de hexosaminidase (HEXA) sob o controle de um primeiro promotor; e (ii) um segundo cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico codificando uma subunidade beta de hexosaminidase (HEXB) sob o controle de um segundo promotor, em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são flanqueados por repetições terminais invertidas (ITRs) do vírus adenoassociado (AAV).

2. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um primeiro íntron está presente entre o primeiro promotor e a sequência do ácido nucleico codificando a subunidade alfa de hexosaminidase (HEXA).

3. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um segundo íntron está presente entre o segundo promotor e a sequência do ácido nucleico codificando a subunidade beta de hexosaminidase (HEXB).

4. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a HexA compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1.

5. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a HexB compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2.

6. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro íntron está posicionado entre o primeiro promotor e a sequência de ácido nucleico codificando a HexA, opcionalmente em que o primeiro íntron é um íntron quimérico.

7. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor está posicionado próximo a uma ITR de AAV, opcionalmente em que o primeiro promotor está posicionado entre uma ITR de AAV e uma sequência de ácido nucleico codificando HexA.

8. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor e/ou o segundo promotor é um promotor P2.

9. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o segundo íntron está posicionado entre o segundo promotor e a sequência de ácido nucleico codificando a HexB, opcionalmente em que o segundo íntron é um íntron quimérico.

10. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o segundo promotor está posicionado próximo a uma ITR de AAV, opcionalmente em que o segundo promotor é posicionado entre uma ITR de AAV e uma sequência de ácido nucleico codificando HexB.

11. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro cassete de expressão compreende um primeiro sinal de poli A ligado operavelmente à sequência de ácido nucleico codificando HexA, opcionalmente em que o primeiro sinal de poli A é sinal poli A de BGH.

12. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o segundo cassete de expressão compreende um segundo sinal de poli

A operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando HexB, opcionalmente em que a segunda cauda de poli A é um sinal de poli A de SV40.

13. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro sinal de poli A e o segundo sinal de poli A são posicionados adjacentes um ao outro.

14. Construto de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um primeiro cassete de expressão compreen- dendo um ácido nucleico codificando uma subunidade alfa de hexosaminidase, e (ii) um segundo cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico codificando uma subunidade beta de hexosaminidase, em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são operavelmente ligados por um promotor bidirecional, e em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são flanqueados por repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV).

15. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a HexA compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1.

16. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a HexB compreende uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2.

17. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o promotor bidirecional compreende pelo menos um promotor da beta-

actina da galinha (CBA).

18. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o promotor bidirecional compreende dois promotores de CBA, em que os promotores de CBA iniciam transcrição do primeiro cassete de expressão e do segundo cassete de expressão em direções opostas.

19. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o promotor bidirecional compreende uma sequência potencializadora de CMV, opcionalmente em que a sequência potencializadora de CMV está posicionada entre os dois promotores de CBA.

20. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto de expressão compreende um primeiro sinal de poli A, opcionalmente em que o primeiro sinal de poli A está próximo de uma ITR de AAV.

21. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que o primeiro construto de expressão compreende um segundo sinal de poli A, opcionalmente em que o segundo sinal de poli A está próximo de uma ITR de AAV.

22. Construto de ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo sinal de poli A é cada um selecionado de sinal de poli A de SV40, sinal de poli A de beta-globulina de coelho (RBG) e sinal de poli A de hormônio do crescimento bovino (BGH).

23. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3-9.

24. AAV recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma proteína do capsídeo; e (ii) um ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

25. rAAV de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo é de um sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10 e AAV.PHP.B.

26. rAAV de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico isolado compreende uma ITR selecionada do grupo consistindo em ITR de AAV1, ITR de AAV2, ITR de AAV3, ITR de AAV4, ITR de AAV5 ou ITR de AAV6.

27. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou o rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24.

28. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de mamífero, célula de levedura, célula bacteriana, célula de inseto, célula de planta ou célula fúngica.

29. Método para tratamento de uma doença do armazenamento lisossomal, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou o rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, a um indivíduo tendo ou suspeito ter uma doença do armazenamento lisossomal.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a doença do armazenamento lisossomal é uma doença de Tay-Sachs ou doença de Sandhoff.

31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30,

caracterizado pelo fato de que o indivíduo é caracterizado como tendo uma mutação em um gene de HEXA resultando em reduzida ou perda de função de uma subunidade alfa de hexosaminidase do indivíduo.

32. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é caracterizado como tendo uma mutação em um gene de HEXB resultando em reduzida ou perda de função de uma subunidade beta de hexosaminidase do indivíduo.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado através de injeção intracraniana, injeção intracerebral ou injeção no CSF por meio do sistema ventricular, cisterna magna ou espaço intratecal.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com o ácido nucleico isolado ou o rAAV durante um estágio pressintomático da doença do armazenamento lisossomal.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o estágio pressintomático da doença do armazenamento lisossomal ocorre entre o nascimento (por exemplo, perinatal) e 4 semanas de vida.