FR2813085A1 - Systeme de regulation in vivo de l'expression d'un transgene par inhibition conditionnelle - Google Patents

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Michael Bettan
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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles constructions, compositions et un nouveau procédé pour la régulation de l'expression d'un transgène d'intérêt in vivo par inhibition conditionnelle, ainsi que leurs utilisations dans les domaines expérimentaux, cliniques, thérapeutiques, ou pour la production d'animaux ou végétaux.Plus particulièrement, le nouveau procédé de régulation repose sur la coexpression d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, de sorte à obtenir une inhibition constitutive de l'activité du transcrit d'intérêt, et à pouvoir assurer une régulation efficace du transcrit d'intérêt, soit par inhibition de son transcrit inhibiteur, soit par activation du transcrit d'intérêt, soit encore par activation du transcrit d'intérêt et inhibition concomitante de son transcrit inhibiteur.

Description

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SYSTEME DE REGULATION IN VIVO DE L'EXPRESSION D'UN TRANSGENE
PAR INHIBITION CONDITIONNELLE
La présente invention concerne de nouvelles compositions ainsi qu'un nouveau procédé destiné au contrôle de l'expression in vivo d'un transgène d'intérêt thérapeutique ou expérimental, par un système d'inhibition conditionnelle. La présente invention est particulièrement utile pour la génération d'animaux et de végétaux modifiés ainsi que dans les applications de thérapie génique.
La thérapie génique, qui consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante etc. ) ou encore à traiter une pathologie grâce à l'expression d'un transgène thérapeutique, est généralement mise en oeuvre par l'introduction d'un gène exogène ou transgène dans la cellule ou le tissu affecté. Le transgène est placé sous le contrôle d'un promoteur fort, constitutif ou inductible, afin d'assurer une expression quantitativement et qualitativement optimale in vivo.
Toutefois, si ces systèmes d'expression constitutive permettent d'obtenir de bons niveaux d'expression d'un transgène d'intérêt transféré, ils n'offrent pas la possibilité de moduler le niveau d'expression du transgène.
Par ailleurs, dans le cas des systèmes inductibles actuels, l'on observe généralement une expression résiduelle souvent trop élevée du transgène d'intérêt, qui peut provoquer une certaine toxicité, incompatible avec une application thérapeutique ou expérimentale.
Or, la possibilité d'exercer un contrôle efficace, particulièrement d'inhibition, du transgène d'intérêt peut s'avérer déterminante pour le succès de certaines expérimentations ou de la thérapie, notamment lorsque l'expression du transgène s'accompagne d'effets secondaires, par exemple de cytotoxicité. C'est notamment le cas de certaines cytokines, comme le TNF-a, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, GM-CSF (Agha-Mohammadi, et al.,
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J.Clin.lnvest, 105 (2000) 1173-1176), des anticoagulants, des anticorps, de certains activateurs enzymatiques de substances actives (Springer et al., J.Clin.lnvest., 105 (2000) 1161-1167), des molécules cancerotoxiques ou encore des hormones.
Différents systèmes artificiels de contrôle de l'expression ont été conçus dans l'art antérieur. Un premier système utilise une protéine régulatrice désignée LAP (Lac Activator Protein) construite par fusion du répresseur Lac de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 du virus de l'herpès (HSV). LAP est notamment susceptible d'activer, en absence d'isopropyl ss-D-thiogalactoside (IPTG) un promoteur minimum précoce de SV40, comprenant en amont ou en aval de l'unité de transcription, les séquences de l'opérateur lac, alors qu'en présence d'IPTG, l'activation du promoteur est inhibée (Labow et al., Mol.Cell.Biol.,
10 (1990) 3343-3356).
Un autre système utilise une protéine transactivatrice contrôlée par la tétracycline, qui a été construite par fusion du répresseur Tet de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 de HSV, de sorte notamment à activer, en absence de tétracycline, la transcription d'un promoteur minimum comprenant les séquences de l'opérateur tet de réponse à la tétracycline, cette activation pouvant être inhibée en présence de tétracycline d'un de ses dérivés (Gossen et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89, (1992) 5547-5551 ; et al, Science, 268 (1995) 1766-1769).
Ces systèmes de régulation négative souffrent néanmoins d'une expression résiduelle encore trop élevée à l'état inhibé, qui limite leur efficacité ainsi que leurs utilisations in vivo. De plus, ces systèmes nécessitent l'apport d'un agent répresseur, tel que la tétracycline ou l'IPTG, ce qui est contraignant lorsque seule une expression périodique du transgène d'intérêt est requise.
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D'autres systèmes d'inhibition de l'expression de gènes qui utilisent des acides nucléiques recombinants, tels que des oligonucléotides antisens (W083/01451) ou des ARN antisens complémentaires d'un gène endogène cible (McCall, Biochim Biophys Acta, 1397(1) (1998), 65-72) ont été développés.
Ceux-ci ont été jusqu'à présent uniquement utilisés pour la régulation de gènes endogènes. Bien qu'ils permettent d'obtenir une inhibition d'environ 60 à 90% lorsqu'ils sont testés in vitro, ils sont largement inefficaces pour la régulation de gènes endogènes in vivo, de sorte que leur développement a été mis de côté, malgré leur faible toxicité et l'absence d'immunogénicité.
De manière surprenante, les demandeurs ont découvert que si, l'inhibition d'un gène exogène ou transgène par un ARN antisens complémentaire in vitro était du même ordre que celle obtenue par un ARN antisens complémentaire d'un gène endogène, c'est à dire très insatisfaisante, l'inhibition de ce même gène exogène par son transcrit antisens complémentaire devenait particulièrement forte lorsqu'elle était réalisée in vivo.
Les demandeurs, ont par ailleurs découvert, que cette inhibition n'était pas reproduite en injectant et en exprimant dans un premier temps le transgène seul, puis en injectant dans un second temps, la séquence codant pour son transcrit inhibiteur, mais qu'il était au contraire nécessaire de coinjecter et de coexprimer les acides nucléiques comprenant les séquences du transcrit antisens inhibiteur et du transgène afin d'obtenir une inhibition efficace de ce dernier in vivo.
Les demandeurs ont enfin découvert que le transgène pouvait non seulement être efficacement inhibé par son ARN antisens, mais également
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qu'il était possible de rétablir un niveau d'expression biologiquement efficace du transgène, et ainsi de contrôler l'expression de ce dernier par l'intermédiaire de son transcrit inhibiteur spécifique de type antisens.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de régulation in vivo de l'expression d'un transgène d'intérêt qui consiste à : - introduire simultanément dans un tissu ou une cellule cible, un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant chacune sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe, - coexprimer lesdits acides nucléiques dans le tissu ou la cellule cible afin de permettre l'inhibition constitutive de l'activité du transcrit d'intérêt par le transcrit inhibiteur.
Dans une étape supplémentaire du procédé selon l'invention, l'on administre au tissu ou à la cellule cible, un agent externe dit répresseur, conduisant à inhiber l'activité du transcrit inhibiteur et ainsi à restaurer une activité du transcrit d'intérêt, proportionnellement à la quantité de l'agent répresseur externe utilisé.
De manière alternative ou additionnelle, l'on administre au tissu ou à la cellule cible, un agent externe dit activateur, conduisant à accroître l'activité du transcrit d'intérêt. Ainsi, une activité du transcrit d'intérêt peut être restaurée proportionnellement à la quantité de l'agent activateur externe utilisé.
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La présente invention a aussi pour objet une méthode de transfert in vivo d'un transgène d'intérêt, consistant à coadministrer et coexprimer dans un tissu ou une cellule cible, un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt. Selon cette méthode, l'expression du transgène d'intérêt ou l'activité du transcrit d'intérêt est inhibée de manière constitutive, et peut être restaurée en inhibant l'activité du transcrit inhibiteur par l'administration d'un agent externe répresseur, et/ou en administrant un agent externe susceptible de conduire à l'induction de l'activité du transcrit d'intérêt.
La présente invention a également pour objet une méthode destinée à réduire l'expression résiduelle d'un transgène d'intérêt in vivo, qui consiste à coinjecter et à coexprimer les séquences codant pour le transcrit d'intérêt et pour son transcrit inhibiteur spécifique.
La présente invention a en outre pour objet une nouvelle association administrée in vivo et susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'invention. Celle-ci comporte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, et un acide nucléique comprenant une séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, chacune des séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit d'intérêt et/ou du transcrit inhibiteur pouvant être régulée par un agent externe.
On entend par transgène d'intérêt, toute molécule d'acide nucléique exogène, codant pour un produit biologique, à savoir soit un transcrit d'intérêt ou utile tel qu'un ARNm, un ARNr, un ARNt, un ribozyme, ou un aptazyme, soit une protéine, un polypeptide, ou un peptide d'intérêt
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thérapeutique ou expérimental. Selon l'invention, le transgène d'intérêt inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique.
On entend par transcrit d'intérêt ou transcrit utile, un ARN produit par transcription à partir du transgène d'intérêt comme défini précédemment. Le transcrit d'intérêt peut se présenter sous la forme d'un ARNm et être traduit en une protéine ou un peptide thérapeutique à action intracellulaire ou sécrétée. Alternativement, le transcrit d'intérêt ou transcrit utile peut se présenter sous la forme d'un ARN ayant une activité biologique intrinsèque tel qu'un aptazyme, un ribozyme, un ARN antisens, ou un ARN capable d'interagir avec les constituants des cellules transfectées, comme par exemple un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), ou un aptamère.
On entend par transgène inhibiteur, toute molécule d'acide nucléique exogène, susceptible de produire par transcription, un transcrit inhibiteur ayant pour cible le transcrit d'intérêt. Selon l'invention, le transgène inhibiteur inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique.
On entend par transcrit inhibiteur spécifique, un ARN qui peut se présenter sous la forme d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le transcrit d'intérêt.
Le transcrit est dit inhibiteur dans la mesure où il est capable d'inhiber efficacement et constitutivement le transcrit d'intérêt, avec lequel il est coexprimé dans le tissu ou la cellule cible, soit au niveau traductionnel, en bloquant la traduction du transcrit d'intérêt de type ARNm, soit au niveau de son activité biologique, en bloquant l'interaction du transcrit d'intérêt
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ARNr, ARNt, ou aptamère avec les constituants cellulaires, soit en bloquant l'interaction du transcrit d'intérêt de type aptazyme, ribozyme, ou ARN antisens avec une séquence nucléique cible, soit encore en diminuant la concentration du transcrit d'intérêt par dégradation enzymatique. Ce transcrit inhibiteur est par ailleurs dit répressible, c'est à dire qu'il peut faire lui-même l'objet d'une inhibition par l'intermédiaire d'un agent répresseur externe.
On entend par activité du transcrit d'intérêt, soit sa traduction en une protéine ou un peptide d'intérêt thérapeutique ou expérimental, lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un ARNm, soit son activité biologique lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un aptazyme, d'un ribozyme, ou d'un ARN antisens, soit encore son interaction avec les constituants cellulaires, lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un ARN ribosomique, d'un ARN de transfert, ou d'un aptamère.
On entend par agent externe, tout agent chimique, et de préférence pharmacologique, ou physique tel que la chaleur, administrable par voies entérales ou parentérales, ayant une faible toxicité, et présentant une activité d'inhibition ou d'activation de l'expression d'un gène.
Une des caractéristiques avantageuses du procédé de régulation par inhibition réversible selon la présente invention réside dans sa capacité à bloquer efficacement de manière constitutive l'expression d'un transgène d'intérêt in vivo ou l'activité du transcrit d'intérêt ou utile, et à rétablir cette expression lorsque cela est souhaité pour des raisons cliniques ou expérimentales. Ce système repose sur la coinjection et la coexpression d'un transgène d'intérêt et de son transcrit inhibiteur spécifique in vivo, et la possibilité de réguler efficacement le transgène d'intérêt, soit par inhibition de son transcrit inhibiteur spécifique, soit par activation du transcrit d'intérêt,
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soit encore par activation du transcrit d'intérêt et inhibition concomitante de son transcrit inhibiteur spécifique.
Selon un premier mode de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur est inhibé par un agent répresseur externe, afin de lever l'inhibition du transcrit d'intérêt et de rétablir indirectement l'activité du transcrit d'intérêt ou un niveau biologique suffisant du transcrit d'intérêt.
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut être obtenue en plaçant la séquence du transgène inhibiteur codant pour le transcrit inhibiteur sous le contrôle d'un promoteur répressible ou sensible à un agent répresseur externe. On peut utiliser par exemple le système de répression par la tétracycline (TrRS) qui dérive de l'opéron de résistance à la tétracycline de E.coli (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89 (1992), 5547-5551). Ce système utilise l'affinité du répresseur tet (tetR) pour la séquence de l'opérateur tet (tetO), l'affinité du tetR pour la tétracycline, ainsi que l'activité ubiquitaire du transactivateur du virus de l'herpès VP16 dans les cellules eucaryotes. Ce système de régulation TrRS fonctionne donc grâce à un transactivateur (tTA) chimérique qui résulte de la fusion de l'extrémité C- terminale de VP16 avec l'extrémité C-terminale de la protéine tetR.
En absence de tétracycline, la partie tetR du transactivateur tTA se fixe sur une séquence de régulation comprenant par exemple des séquences répétées (2,7, ou 10 répétitions) de l'opérateur de la tétracycline, et placé en amont d'un promoteur transcriptionnel minimum par exemple du Cytomegalovirus humain (hCMV), et active la transcription du transgène inhibiteur et la production du transcrit inhibiteur, assurant une inhibition constitutive efficace du transcrit d'intérêt. En présence de tétracycline, celle-ci se fixe sur la partie tetR du transactivateur chimérique tTA, provoque un changement de sa conformation ainsi qu'une perte d'affinité pour les séquences répétées de l'opérateur de réponse à la
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tétracycline (tetO). Il en résulte alors une inhibition de la production du transcrit inhibiteur à partir du transgène inhibiteur et le rétablissement d'un niveau d'expression du transgène d'intérêt ou de l'activité du transcrit d'intérêt.
Les séquences régulatrices comprenant les séquences répétées de tetO sont avantageusement intégrées au sein d'un amplificateur/promoteur tissu-spécifique ou peuvent être utilisées en remplacement de certaines séquences amplificatrices (Rose et al., J.Biol. Chem. 272 (1997) 4735-4739 ; Agha-Mohammadi et al, Gene Ther, 5 (1998) 76-84). Ce système confère ainsi non seulement un ciblage temporel de la régulation du transgène d'intérêt, mais également spatial.
De préférence, la séquence codante pour le transactivateur tTA et le promoteur TrRS conduisant la transcription du transcrit inhibiteur sont portés sur une seule molécule d'acide nucléique. Cette dernière peut comprendre par exemple la séquence codant pour tTA sous le contrôle d'un promoteur viral ou tissu-spécifique, puis la cassette du promoteur répressible par la tétracycline (TrRS) liée de manière fonctionnelle avec la séquence codant pour le transcrit inhibiteur (O'Brien et al., Gène, 184 (1997) 115-120).
Une organisation alternative de type bicistronique comprenant la cassette d'expression TrRS liée fonctionnellement à la séquence codant pour un transcrit inhibiteur, suivie d'une séquence IRES (Internai Ribosome Entry Site) et d'une séquence codante pour le tTA, ou vice versa, peut être également utilisée. Encore un autre exemple d'organisation comprend un promoteur bidirectionnel qui conduit l'expression du tTA est du transcrit inhibiteur. En absence de tétracycline, le tTA est exprimé et active la transcription du transgène inhibiteur en un transcrit inhibiteur, qui vient à son tour inhiber le transcrit utile ou d'intérêt (Liang et al., Gène Ther., 3 (1996) 350-356).
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L'agent répresseur externe utilisé selon ce premier mode de réalisation, peut être la tétracycline ou l'un de ses analogues tels que la doxycycline, l'anhydrotétracycline, ou l'oxytétracycline (Agha-Mohammadi et al., Gène Ther, 4 (1997) 993-997) susceptibles de conduire à une inhibition de la transcription du transgène inhibiteur, et donc de l'activité du transcrit inhibiteur. L'administration de tétracycline ou d'un de ses analogues permet de lever l'inhibition par le transcrit inhibiteur et ainsi de rétablir un niveau biologiquement efficace du transcrit d'intérêt. Le niveau d'expression du transcrit d'intérêt peut être avantageusement corrélé avec la quantité de tétracycline ou de l'analogue administrée, dans la mesure où les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la tétracycline et de ses analogues sont bien connues de l'homme du métier, et se trouvent entre autres détaillées dans le Vidal, et dans le chapitre "Antimicrobial Agents : Tetracyclines" dans :Goodman and Gilaman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ème Ed., Joel G. Hardman, Alfred Goodman Gilamn, Lee E.
Limbird Ed.
Par ailleurs, du fait de la forte affinité de la tétracycline pour la protéine tetR, la tétracycline ou un analogue de celle-ci peut être utilisé à de faibles concentrations et par conséquent les effets secondaires sont minimes.
De manière encore plus préférentielle, la séquence du transgène inhibiteur est placé sous le contrôle d'un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) ou du CMV humain en amont duquel se trouve une séquence régulatrice telle que décrite notamment dans W096/30512.
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut également être obtenue par insertion au sein de sa séquence ou de ses extrémités 5' ou 3', de @ séquences particulières telles que les aptamères qui sont décrits dans la
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demande européenne EP 99402552, et par Werstuck et al. (Science 282 (1998) 296-298) et présentent une activité autocatalytique de préférence en présence d'un ligand. Ainsi, par insertion d'une séquence aptamère, le transcrit inhibiteur acquiert une activité autocatalytique, qui peut être activée en présence d'un ligand spécifique, lorsque l'on souhaite rétablir une activité de transcrit d'intérêt. La séquence nucléotidique de l'aptamère qui est utilisée pour inhiber le transcrit inhibiteur peut être toute séquence codant pour un ARN ayant une activité autocatalytique ligand-dépendant. Il s'agit par exemple des ribozymes à tête de marteau, des ribozymes du virus de l'hépatite delta, des ribozymes VS Neurospora, des ribozymes en tête d'épingles, des introns du groupe 1 et II, et de la RNAse P, ou toute séquence dérivée fonctionnelle artificiellement obtenue (Clouet-d'Orval et al., Biochemistry 34 (1995)11186-11190 ; Olive et al.., EMBO J 14 (1995) 3247-3251 ; Rogers et al., J. Mol Biol 259 (1996) 916-925). La taille de la séquence aptamère peut varier selon sa nature et son origine, mais est de préférence comprise entre 20 et 200 pb. La localisation de l'insertion des séquences aptamères est généralement déterminée à l'aide de logiciels de bioinformatique tels que " RNA fold " afin d'assurer une stabilité ainsi qu'une activité de clivage optimales en fonction de l'environnement et de la conformation (Zuker M, Method Mol Biol 25 (1994) 267-94 ;Stage- Zimmermann TK, RNA 4 (1998) 875-889).
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut enfin être réalisée par l'intermédiaire d'un ribozyme agissant en trans qui, du fait de sa spécificité de séquence pour une partie du transcrit inhibiteur, est capable de reconnaître et de s'hybrider avec le transcrit inhibiteur, et ainsi de le dégrader. De préférence, le ribozyme trans se présente sous la forme d'un ribozyme allostérique, c'est à dire qu'il présente une activité catalytique ligand-dépendante, qui est notamment activée en présence d'un ligand. De tels ribozymes allostériques sont bien connus de l'homme du métier et sont
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notamment décrits par Soukup et al., Structure 7 (1999) 783-791 et dans W094/13791.
Les ligands activateurs utilisés sont par exemple des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides ou des sucres, ou encore toutes molécules organiques ou inorganiques capables de se fixer sur la séquence aptamère du transcrit inhibiteur ou sur une séquence du ribozyme allostérique par un mécanisme de reconnaissance moléculaire, et ainsi d'activer l'activité catalytique (Famulok M, Curr Opin Struc Biol 9 (1999) 324-329). Ceux-ci sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits entre autres par Cowan et al. (Nucleic Acids Res.
28 (15)(2000)2935-2942) et par Werstuck et al. (Science, 282 (1998), 296- 298). A titre d'exemples, on peut citer les antibiotiques, tels que la doxycycline, la pefloxacine, la tobramycine, la kanamycine, les colorants tels que les colorants Hoechst H33258 et H33342, des mononucléotides tels que le FMN (flavine mononucléotide), l'ATP, l'AMPc, les drogues telles que la theophylline, les adjuvants, et les substituts.
Selon ce mode de réalisation, le transgène d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fonctionnel dans le tissu ou les cellules cibles, de mammifères et de préférence humaines. Le promoteur constitutif conduisant l'expression de transcrit d'intérêt est de préférence tissu- spécifique.
Selon un deuxième mode de réalisation de la présente invention, le transcrit d'intérêt est activé, alors que l'activité du transcrit inhibiteur est soit maintenue constante, soit inhibée de manière concomitante à l'activation du transcrit d'intérêt, afin de rétablir un niveau d'expression ou d'activité biologique suffisant de ce dernier.
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L'activation du transcrit d'intérêt peut être obtenue en plaçant la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur inductible. Le transcrit d'intérêt peut être également activé en agissant sur la stabilité de ce dernier.
L'activité du transcrit inhibiteur peut alors être maintenue constante, et dans ce cas, le transgène inhibiteur est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, et n'est soumis à aucune inhibition par l'intermédiaire d'un aptamère ou d'un ribozyme à activité catalytique cis ou trans ligand- dépendante.
Selon un mode de réalisation préférentiel, l'activité du transcrit inhibiteur est réprimée, comme précédemment décrit, de manière concomitante à l'activation du transcrit d'intérêt.
Les promoteurs constitutifs ou inductibles utilisés dans ces modes de réalisation, sont bien connus de l'homme du métier. Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée d'origine différente, hétérologue ou homologue, tissu-spécifique ou non, fort ou faible, fonctionnel dans le tissu ou les cellules cibles et donc capable de diriger la transcription d'une séquence liée fonctionnellement.
On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier les promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, de la phosphoglycérate kinase (PGK), a-actine, tubuline, des histones), les promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), les promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, IX, ApoAl, ApoAII, Albumine, Thymidine kinase, etc), les promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, de la villine, de la protéine intestinale de liaison des acides gras, de l'a-actine du muscle
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lisse, les promoteurs spécifiques de cellules endothéliales comme le promoteur du facteur de Willebrand, les promoteurs spécifiques des cellules de lignées myéloïdes, et hématopoïétiques, tels que le promoteur des IgG, le promoteur de l'énolase spécifique neuronale (Forss-Petter et al., Neuron, 5 (1990) 187); etc), le promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la VAChT (transporteur de l'acétylcholine ; Cervini et al., J.BioLChem. 270 (1995) 24654), les promoteurs fonctionnels dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc), tel que le promoteur du gène p53, le promoteur du récepteur de la transferrine ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). Dans le cas de ces derniers, les agents externes sont des facteurs activateurs transcriptionnels spécifiques capables de se fixer en trans, soit directement, soit par l'intermédiaire de récepteurs nucléaires, sur un élément de réponse (RE) du promoteur inductible qui dirige l'expression du transcrit d'intérêt.
L'on peut également utiliser le système de régulation par la rapamycine (PRS) (Rivera et al., Nat. Med. 2 (1996) 1028-1032).Celui-ci utilise un facteur de transcription bipartie comprenant deux peptides chimériques d'origine humaine, à savoir une première protéine chimérique de ZFHD1-FKBP12 de liaison à l'ADN et une deuxième protéine chimérique qui résulte de la fusion de la protéine cellulaire FRAP tronquée et d'une séquence de 189 acides aminés en C-terminal de la protéine NF-kB65. En présence de rapamycine, la protéine ZFHD1-FKBP12 se fixe sur la protéine chimérique FRAP-p65 qui active le promoteur ZFHD1 dépendant. De préférence, on utilise pour l'activation du promoteur, en tant qu'agent externe activateur, des analogues inertes de la rapamycine, qui peuvent être administrés par exemple par voie orale ou par voie intraveineuse (Ye et al., Science, 283 (1999) 88-91).
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De préférence, la séquence inductible promotrice du transgène d'intérêt est telle que décrite dans la demande française FR 99 07957 ou par Frohnert et al. (J. Biol. Chem. 274 (1999) 3970-3977) et comprend un ou plusieurs éléments de réponse (PPRE) lié à un promoteur transcriptionnel minimal. Ce système d'activation de l'expression du transgène d'intérêt fonctionne avec les récepteurs nucléaires PPAR a ou y (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) en tant que régulateurs transcriptionnels. Avantageusement, on utilise en tant que corégulateur transcriptionnel, les récepteurs rétinoïdes X (RXR), tel que le RXRa humain, qui sont capables de s'hétérodimériser avec les PPAR et ainsi de synergiser l'activation du transgène d'intérêt (Mangelsdorf et al., Nature 345 (1990) 224-229 ; Mangelsdorf et al., Gènes Dev 6 (1992) 329-344 ; Mangelsdorf et al., Cet/ 83 (1995) 841-851 ; et al., Curr Op Chem Biol 1 (1997) 235- 241 ; Schulman et al., Mol and Cell Biol 18 (1998) 3483-3494 ; Mukherjee et al., Arterioscler Thromb Vase Biol 18 (1998) 272-276). On peut utiliser un PPAR a ou y dans sa forme native, sans modification de structure primaire ou un PPAR modifié comprenant un ou plusieurs sites de liaison au ligand ou domaines E/F, de préférence compris entre 2 à 4 (Schoonjans et al., Biochim Biophys Acta 1302 (1996) 93-109). Les limites des domaines E/F varient d'un PPAR à l'autre. A titre d'exemple, pour l'isoforme PPARy2 humaine, le domaine E/F s'étend de l'acide aminé 284 à l'acide aminé 505.
On utilise avantageusement, en tant que régulateur transcriptionnel de l'expression in vivo du transgène d'intérêt, le PPARy2y2, c'est à dire un PPAR y humain modifié comprenant deux domaines E et F répétés dont la séquence protéique complète est représentée sur la séquence SEQ ID NO : 1.
SEQ ID NO : 1
MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDI
KPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYN
KPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS
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RNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYD SYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEG
QGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPI EDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPL LQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGC QFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGF
MTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDI QDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQE
IYKDLY
Par ailleurs, l'élément de réponse au PPAR (PPRE) qui est donc une région d'acide nucléique capable de fixer un PPAR, et ainsi médier un signal d'activation de transcription du transgène d'intérêt, peut comprendre un ou plusieurs sites de liaison du PPAR. De tels sites sont décrits dans l'art antérieur, comme par exemple dans différent promoteurs humains tels que le promoteur du gène de l'apolipoprotéine All (Apoll) humain (Vu-Dac et al., J Clin Invest, 96 (2), (1995), 741-750). On peut également utiliser des sites construits artificiellement correspondant notamment à la région J du promoteur de l'ApoAll humain localisé par exemple au niveau des nucléotides -734 à-716, par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, de séquence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID NO : 2) ou tout autre variant fonctionnel de cette séquence. On peut encore utiliser comme site de liaison au PPAR, une séquence correspondant à la région consensus DR1 de séquence AGGTCAAAGGTCA (SEQ ID NO : 3).
En tant qu'agent externe activateur, on utilise les ligands activateurs des PPARa, par exemple les fibrates tels que l'acide fibrique et ses analogues. Comme analogues de l'acide fibrique on peut mentionner notamment le gemfibrozyl (Atherosclerosis 114(1) (1995) 61), le bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), le ciprofibrate (BCE&M 9 (4) (1995) 825), le clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301), le fénofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), le clinofibrate (Kidney International. 44 (6) (1993) 1352), l'acide pirinixique (Wy-14,643) ou l'acide @
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5,8,11,14-eicosatetranoique (ETYA). Ces différents composés sont compatibles avec une utilisation biologique et/ou pharmacologique in vivo.
Les agents externes activateurs peuvent également être choisis parmi les ligands naturels et synthétiques des PPARy. Comme ligands naturels, on peut mentionner les acides gras et les eicosanoïdes tels que par exemple l'acide linoléique, l'acide linolénique, le 9-HODE, le 5-HODE, et comme ligands synthétiques on peut mentionner les thiazolidinediones, telles que notamment la rosiglitazone (BRL49653), la pioglitazone ou la troglitazone (voir par exemple Krey G. et coll., Mol. Endocrinol., 11 (1997)
779-791 ou Kliewer S. et Willson T., Cuir. Opin. in Gen. Dev. 8 (1998) 576-581) ou le composé RG12525.
De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, telles que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, le promoteur du gène TK du virus de l'herpès, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition ou délétion de séquences.
Contrairement aux systèmes inductibles connus, qui présentent des périodes de dé-induction du gène exogène, c'est à dire de retour de l'expression à un taux de base, assez longues du fait de la durée de vie et/ou de la difficulté de diffusion des facteurs d'induction, le système selon la présente invention assure une activation et une inhibition consécutive du gène exogène plus rapides et efficaces. En effet, le procédé selon la présente invention permet simultanément à la dé-induction du transcrit utile, de lever l'inhibition du transcrit inhibiteur, et ainsi de réduire, de manière plus rapide et à un niveau résiduel fortement abaissé, l'expression d'un transgène d'intérêt.
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Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens, et est dit transcrit inhibiteur de type ARN antisens. Ce dernier comprend généralement une séquence nucléotidique complémentaire d'au moins une partie du transcrit d'intérêt, et s'hybride de manière sélective aux transcrits d'intérêt par des interactions de type Watson-Crick classique. Le transcrit inhibiteur de type ARN antisens peut donc se fixer au transcrit d'intérêt et par exemple bloquer l'accès à la machinerie cellulaire de traduction à l'extrémité 5' du transcrit d'intérêt lorsque ce dernier est un ARNm, gêner sa traduction en protéine, et permettre la suppression de l'expression du transgène d'intérêt in vivo (Kumar et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev, 62 (1993) 1415-1434). De tels polynucléotides ont été par exemple décrits dans les brevets EP 92574 et EP 140308.
Lorsque le transcrit inhibiteur est de type ARN antisens, il peut couvrir toute ou partie de la séquence codante du transcrit d'intérêt de type ARNm, ou toute ou partie de la séquence non codante en 3' ou en 5'. De préférence, le transcrit inhibiteur antisens est complémentaire de la séquence de fixation du ribosome et d'initiation de la traduction (Coleman J et al., Nature 315 (1990) 601-603). De préférence, le transcrit inhibiteur a une longueur d'au moins 10 ribonucléotides.
La détermination de la longueur et de la séquence de l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur peut être effectuée par une expérimentation de routine consistant à coinjecter et coexprimer les acides nucléiques codant pour le transcrit inhibiteur et pour le transcrit d'intérêt, et à vérifier une inhibition efficace par diverses techniques de détection connues de l'homme du métier que sont par exemples la RT-PCR, les diverses techniques de dosage de la protéine d'intérêt, et de détection sur Western blot.
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Les acides nucléiques codant pour le transcrit d'intérêt et pour le transcrit inhibiteur de type antisens comprennent avantageusement les signaux permettant l'arrêt de la transcription ainsi que des signaux permettant sa stabilisation tels que par exemple une coiffe en 5' et un site de polyadénylation en 3', et éventuellement un intron.
Selon ce mode de réalisation particulier, les transcrits inhibiteurs de type ARN antisens, qui sont coexprimés avec le transgène d'intérêt dans un tissu ou des cellules cibles, sont ainsi capables de bloquer de manière efficace l'expression du transgène d'intérêt au niveau traductionnel, ou l'activité biologique du transcrit d'intérêt au niveau du tissu ou des cellules cibles.
Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le transcrit inhibiteur peut également se présenter sous la forme d'un ARN catalytique ou ribozyme ayant pour cible le transcrit d'intérêt, et est désigné transcrit inhibiteur de type ribozyme. Le ribozyme peut être par exemple un cis ribozyme, c'est à dire agir au niveau intracellulaire en cis (Cech TR, Biosci Rep, 10 (3)(1990), De préférence, il s'agit d'un trans ribozyme, c'est à dire capable de dégrader plusieurs transcrits d'intérêt en trans (Robertson et al., Nature 344 (1990) 467 ; Ellington et al. Nature, 346 (1990) 818 ; Piccirilli et al., Science 256 (1992) 1420 ; Noller et al., Science, 256 (1992), 1416 ; Ellington et al. Nature, 355 (1992) 850 ; Bock et al. 355 (1992) 564 ; Beaudry et al., Science 257 (1992) 635).
Le transcrit inhibiteur de type ribozyme présente généralement deux régions distinctes. Une première région qui présente une certaine spécificité pour le transcrit d'intérêt et est donc capable de se lier à ce dernier, alors que la deuxième région confère au ribozyme son activité catalytique de clivage, ligation et epissage du transcrit d'intérêt. Divers types de ribozymes peuvent être utilisés comme par exemples les ribozymes à tête de marteau
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ou ribozymes circulaires, les ribozymes en épingles à cheveux, les ribozymes en lasso, les ribozymes tétrahymena, ou RNAse P (Clouet- d'Orval B. et al., Biochemistry, 34 (1995) 11186-90; Olive J. E. et al., EMBO J, 14 (1995) 3247-51 ; Rogers et al. J Mol Biol, 259 (1996), 916-25).
De préférence, le transcrit inhibiteur de type ribozyme est allostérique, c'est à dire que son activité catalytique est régulée par un ligand (Szostak, TIBS, 10 (1992) 89). Certains ribozymes allostériques présentent une activité de clivage spontanée d'ARN cibles, alors que d'autres sont activés ou inhibés suite à un changement de conformation ou suite à une réaction d'hybridation. D'autres ribozymes allostériques dit aptazymes sont doués d'une activité d'autoclivage ligand-dépendante qui est de préférence activée par la fixation d'un ligand. De tels ribozymes régulables qui sont décrits entre autres dans les demandes internationales WO 94/13791 et W096/21730, et présentent généralement une séquence ribozyme ainsi qu'une séquence de liaison à un ligand qui assure le contrôle de l'activité de clivage. Le transcrit inhibiteur de type ribozyme utilisé dans la présente invention est de préférence inactivé par la fixation d'un ligand, c'est à dire qu'il exerce une activité catalytique constitutive à l'encontre du transcrit d'intérêt en absence de ligand, et peut être inactivé grâce à l'administration d'un ligand, afin de rétablir un niveau biologiquement suffisant du transcrit d'intérêt. (Forter et al., Science, 249 (1990) 783-786).
La taille du transcrit inhibiteur ribozyme peut varier selon sa nature ou/et son origine. Elle est généralement comprise entre 10 et 500 paires de base, et de préférence au dessous de 300 paires de base. L'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur de type ribozyme peut, en particulier, provenir de séquences d'ARN d'origine naturelle ou être obtenu par synthèse chimique par exemple à l'aide de synthétiseur automatique.
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Les ligands utilisés pour la régulation des ribozymes allostériques sont par exemple des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides ou des sucres, ou encore toutes molécules organiques ou inorganiques capables de se fixer sur le transcrit inhibiteur ribozyme et d'inhiber la réaction de clivage du transcrit d'intérêt, ou bien de se fixer sur le transcrit inhibiteur aptazyme, et ainsi d'activer la réaction d'autoclivage.
De préférence, le ligand est un agent externe tel qu'un agent ou une drogue non toxique qui peut être administrée in vivo par diverses voies externes, et ainsi agir au niveau de la cellule ou du tissu cible afin d'inhiber le ribozyme allostérique, et de restaurer une concentration et une activité suffisantes du transcrit d'intérêt. Il s'agit de préférence d'un antibiotique tel que la tétracycline, la doxycycline, ou la pefloxacine, ou bien d'un adjuvant inoffensif pour l'organisme auquel il est administré.
Selon ce mode de réalisation particulier, les transcrits inhibiteurs de type ribozyme, qui sont coexprimés avec le transgène d'intérêt dans un tissu ou des cellules cibles, sont ainsi capables de bloquer de manière efficace l'expression du transgène d'intérêt au niveau traductionnel, de diminuer la concentration du transcrit d'intérêt par dégradation enzymatique de type nucléase, transférase, et polymérase, l'activité biologique du transcrit d'intérêt au niveau du tissu ou des cellules cibles, ou encore son interaction avec les constituants cellulaires.
Encore selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN formant des triples hélices, et capable de s'associer au transgène d'intérêt ou transcrit d'intérêt avec lequel il est coexprimé in vivo. Un tel ARN est décrit entre autres, dans la demande W095/18223, par Giovannangeli et al., (J. Am. Chem. Soc., 113 (1991) 7775-7) et par Hélène et al. (CibaFound Symp. 209 (1997), 84- 102). , et code plus particulièrement pour des ARN composites comprenant au moins :
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- une première région capable de former une double-hélice avec l'acide nucléique simple-brin ciblé au niveau de la séquence du transgène d'intérêt ou avec une partie de celui-ci.
- une deuxième région capable de former une triple-hélice avec la double- helice ainsi formée ou avec une partie de celle-ci, et - un ou deux bras reliant les deux régions, chacune des régions pouvant être continue ou interrompue.
De préférence le polynucléotide selon ce mode de réalisation particulier possède une longueur supérieure à 10 bases, et, plus préférentiellement, supérieure à 15 bases. Cette longueur est adaptée par l'homme du métier en fonction de la longueur de l'acide nucléique du transgène d'intérêt ciblé en simple-brin ou du transcrit d'intérêt, de manière à assurer la stabilité, la spécificité et la sélectivité du transcrit inhibiteur triple hélice.
Comme précédemment décrit, le procédé selon la présente invention permet le transfert de gènes étrangers ou exogènes et le contrôle de leur expression de manière efficace et réversible. Ceci est avantageux lorsque le produit thérapeutique du transgène d'intérêt a une action optimale dans une certaine plage de concentration bien définie et devient toxique au dehors de cette plage de concentration (Dranoff et al. Proc. Natl.Acad.Sci.
(1993) 3539-3543 ; Schmidt et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 92 (1995) 4711- 4714; Naffakh et al., Mol.Med.Today, 2 (1996) 343-348). Par ailleurs, certaines applications cliniques nécessitent une régulation précise de l'expression du transgène d'intérêt à des niveaux biologiques ou thérapeutiques prédéfinis, en vue d'optimiser son activité in vivo.
De plus, le procédé de régulation négative réversible selon la présente invention est particulièrement utile lorsque l'expression d'un transgène d'intérêt ou l'activité du transcrit d'intérêt doit être maintenue à
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son minimum, voire même éteinte sur de longues périodes et qu'une induction rapide est requise à des moments précis, que ce soit pour des besoins thérapeutiques ou expérimentaux.
Le procédé de contrôle de l'expression d'un gène exogène par inhibition réversible selon l'invention permet de contrôler l'expression de tout transgène ayant un intérêt expérimental dont on souhaite étudier la fonction in vivo, l'implication dans les mécanismes moléculaires ou dans la signalisation cellulaire tels que par exemple des récepteurs, des facteurs de transcription, des transporteurs, etc, ou encore tout transgène d'intérêt codant notamment pour un produit d'intérêt thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, le transgène d'intérêt est une séquence d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain, animal, végétal, etc. ) codant pour un produit protéique.
Le transcrit d'intérêt peut être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le transcrit d'intérêt peut être également un ARN ligand (W091/19813).
La présente invention est particulièrement adaptée à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3) (W096/07981), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Ce système est donc particulièrement adapté à des
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stratégies de thérapies antitumorales par exemple, pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple, dont la production incontrôlée peut avoir des effets secondaires très marqués.
Ce système est aussi particulièrement adapté pour des stratégies de thérapies géniques telles que l'angiogenèse utilisant un gène d'un facteur de croissance comme par exemple le FGF ou le VEGF. Il est adapté pour le contrôle de l'expression d'hormone telle que erythropoiétine ou encore d'anti-cytokines telles que le récepteur soluble du TNF-a utilisé à des fins de thérapies anti-inflammatoires.
Selon le procédé de la présente invention, l'association de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt et de l'acide nucléique comprenant la séquence codant pour le transcrit inhibiteur est transférée simultanément dans le tissu ou la cellule cible pour permettre leur coexpression. Différentes techniques physiques ou mécaniques existent pour effectuer le transfert de ces acides nucléiques, telles que par exemples l'injection, la technique balistique, l'électroporation, l'électroperméabilisation, l'électrotransfert, la sonoporation, les techniques utilisant les champs électriques, les microondes, la chaleur, la pression hydrostatique, ou toute combinaison appropriée de ces techniques (Budker et al., J. Gen. Medicine, 2 (2000) 76-88). De préférence, l'association des acides nucléiques est introduite par injection et électrotransfert, c'est à dire par l'action d'un champ électrique. La technique d'électrotransfert est notamment décrite dans les demandes W099/01157 et W099/01158 et par Aihara et al., Nat. Biotechnol. 16 (9) (1998) 867-870 ; Mir et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96 (1999), 4262-4267 ; Rizzuto et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 96 (1999) 6417-6422. Les molécules d'acides nucléiques que l'on souhaite transférer peuvent être administrées par exemple par voie directe dans.. le tissu ou par voie topique ou systémique, puis une ou
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plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre 1 et 800 Volts/cm, de préférence entre 20 et 200 Volts/cm sont appliquées.
Alternativement, l'association des acides nucléiques selon la présente invention peut être injectée sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrée sous forme complexée avec un agent chimique ou biochimique.
En tant qu'agent chimique ou biochimique, on peut citer par exemple la lipofectamine, qui s'associe avec l'ADN en formant des vésicules appelées lipoplexes, ainsi que d'autres polymères tels que le DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), la polyamidoamine (PAMAM), la polylysine, le polyéthylenimine (PEI), le polyvinylpyrrolidone (PVP), et le polyvinylalcool (PVA), etc, voire les protéines virales qui s'associent pour former des virosomes (Schoen et al., Gen Ther, 6 (1999), 5424-5431), ou les molécules dérivées des protéines virales (Kichler et al., J Viral, 74 (2000) 5424-5431).
On peut également citer les protéines cationiques telles que les histones (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375) et les protamines. Les acides nucléiques peuvent en outre être incorporés à des lipides sous forme brute(Felgner et al., PNAS, 84 (1987) 7413) ou encore être incorporés dans un vecteur tel qu'un liposome (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) ou une nanoparticule. Les liposomes sont des vésicules phospholipidiques comportant une phase aqueuse interne dans laquelle les acides nucléiques peuvent être encapsulés. La synthèse de liposomes et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques est connue dans l'art antérieur (W091/06309, W092/19752, W092/19730). Les nanoparticules sont des particules de petite dimension, généralement inférieure à 500 nm, capables de transporter ou de vectoriser un principe actif (tel qu'un acide nucléique) dans les cellules ou dans la circulation sanguine. Les nanoparticules peuvent être constituées par des polymères comportant une majorité de motifs dégradables tels que l'acide polylactique, éventuellement
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copolymérisé à du polyéthylène glycol. D'autres polymères utilisables dans la réalisation de nanoparticules ont été décrits dans l'art antérieur (EP 275 796 ; EP 520 889).
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à des vecteurs qui comportent un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt. Les acides nucléiques peuvent être portés par le même vecteur ou par des vecteurs distincts.
Lorsqu'ils sont portés sur le même vecteur, ils sont portés de préférence portés sur le même brin.
L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'efficacité de transfert dans les cellules cibles, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. Par ailleurs, l'emploi de vecteurs permet également de cibler certaines populations de cellules dans lesquelles les molécules thérapeutiques doivent être produites.
Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules végétales et animales, et de préférence les cellules humaines. Il peut s'agir aussi bien d'un vecteur non viral tel qu'un plasmide, un épisome, un cosmide, un chromosome artificiel, ou d'un vecteur viral. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV), le virus de l'herpès, le cytomégalovirus, le virus de la vaccine, etc. Il peut également s'agir d'un phage, d'une bactérie invasive ou d'un parasite.
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Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford- Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241 ; EP 185 573; Levrero et al., Gène 101 (1991) 195 ; Le Gal la Salle et al., Science, 259 (1993) 988; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem, 208 (1992) 211 ; Dobson et al., Neuron, 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 ; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238 ; W091/18088).
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif. Le terme " virus défectif " désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence de l'acide nucléique double-brin de l'invention.
Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Le procédé selon la présente invention utilise des vecteurs notamment viraux contenant les séquences nucléiques d'un transgène d'intérêt et du transgène inhibiteur spécifique, sans toxicité pour les cellules de production, puis ensuite d'induire l'expression de ces molécules toxiques sélectivement dans des cellules cibles en traitant avec l'agent répresseur.
L'invention peut être utilisée pour réguler l'expression d'un transgène d'intérêt dans différents types de cellules, de tissus, ou d'organes, in vivo. En particulier, il peut s'agir d'une cellule, d'un tissu, ou d'un organe d'origine végétale ou animale, de préférence mammifère, et encore plus préférentiellement d'origine humaine. A titre illustratif, on peut
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citer les cellules musculaires (ou un muscle), hépatiques (ou le foie), cardiaques (ou le coeur, la paroi artérielle ou vasculaire), nerveuses (ou le cerveau, la moelle, etc) ou tumorales (ou une tumeur). Préférentiellement, les compositions, constructions et procédé selon l'invention sont utilisés pour l'expression régulée d'un transgène d'intérêt dans une cellule musculaire ou un muscle in vivo. Les résultats présentés dans les exemples illustrent particulièrement les avantages de l'invention in vivo dans ce type de cellules.
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à des cellules ou des tissus d'origine animale ou végétale, susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que décrit précédemment, et comprenant un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt, et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt.
Les tissus selon la présente invention sont de préférence des tissus d'origine animale ou végétale qui sont reconstitués ex vivo, pour donner par exemples des organoïdes ou néorganoïdes, dont les cellules ont été modifiées de façon à exprimer le produit biologique du transgène d'intérêt selon le procédé de contrôle de la présente invention, et qui peuvent être ainsi réimplantés (Vandenburgh et al., Hum. Gen Ther. 9 (17) (1998) 2555- 2564 ; Powell et al. Hum Gen Ther, 10 (4), (1999) 565-577 ;MacColl et al., J.Endocrinol, 162(1) (1999) 1-9).
Encore un autre aspect de la présente invention se rapporte à une composition administrable in vivo comprenant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou utile, la séquence nucléique d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié.
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La présente invention se rapporte également à une composition administrable in vivo comprenant au moins un vecteur comportant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, la séquence nucléique d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié, les transcrits d'intérêt et inhibiteurs étant susceptibles d'être activés ou inhibés par un agent externe.
La présente invention se rapporte également à une composition pharmaceutique destinée à être administrée in vivo comprenant au moins un vecteur comportant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, et d'un acide nucléique codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié, les transcrits d'intérêt et inhibiteurs étant susceptibles d'être activés ou inhibés par un agent externe.
La présente invention se rapporte également à médicament comprenant au moins un vecteur comportant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, la séquence nucléique d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié, les transcrits d'intérêt et inhibiteurs étant susceptibles d'être activés ou inhibés par un agent externe.
L'on utilise selon la présente invention tout véhicule approprié à une administration par exemple par voie topique, cutanée, orale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intra- oculaire, transdermique, etc.
De préférence, un véhicule pharmaceutiquement acceptable est utilisé pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe @ au niveau de l'organe désiré, ou pour toute autre administration. Il peut
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s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les concentrations d'acides nucléiques, comprenant les séquences du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt et du transgène inhibiteur codant pour le transcrit inhibiteur, utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations et le volume des injections peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du transgène d'intérêt dont on veut réguler l'expression, ou encore en fonction de la durée du traitement recherchée.
Parmi les transgènes d'intérêt au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour - les enzymes, comme l'a-1-antitrypsine, les proteinase (métalloproteinases, urokinase, uPA, tPA, et streptokinase), les protéases clivant des précurseurs pour libérer des produits actifs (ACE, ICE) ou leurs antagonistes (TIMP-1, tissue plasminogen activator inhibitor PAI, TFPI) ; - les dérivés sanguins comme les facteurs impliqués dans la coagulation : facteurs VII, VIII, IX, les facteurs du complément, la thrombine ; - les hormones, ou les enzymes impliquées dans la voie de synthèse des hormones, ou les facteurs impliqués dans le contrôle de la synthèse ou de l'excrétion ou de la sécrétion des hormones, telles que l'insuline, les facteurs proches de l'insuline (IGF), ou l'hormone de croissance, l'ACTH, les enzymes de synthèse des hormones sexuelles ; - les lymphokines et cytokines : interleukines, chemokines (CXC et CC), interférons, TNF, TGF, facteurs chimiotactiques ou activateurs comme MIF, MAF, PAF, MCP-1, l'eotaxine, LIF, etc. (brevet français FR 2 688 514) ; - les facteurs de croissance, par exemple les IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferine ;
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- les facteurs angiogéniques tels que les VEGF ou FGF, angiopoietine 1 ou 2, l'endothéline ; - les enzymes de synthèse de neurotransmetteurs ; - les facteurs trophiques, en particulier neurotrophiques pour le traitement des maladies neurodégénératives, des traumatismes ayant endommagé le système nerveux, ou des dégénérescences rétiniennes, tels que les membres de la famille des neurotrophines tels que le NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6 leurs dérivés et gènes apparentés - les membres de la familles du CNTF tels que le CNTF, l'axokine, le LIF et leurs dérivés - l'IL6 et ses dérivés - la cardiotrophine et ses dérivés - le GDNF et ses dérivés - les membres de la famille des IGF, tels que l'IGF-1, l'IFGF-2 et leurs dérivés - les membres de la famille de FGF, tels que le FGF 1,2, 3, 4, 5,6, 7,8, 9 et leurs dérivés, le TGFss ; - les facteurs de croissance osseuse ; - les facteurs hématopoïétiques, comme erythropoietine, les GM-CSF, M- CSF, LIF, etc. ; - les protéines de l'architecture cellulaire comme la dystrophine ou une minidystrophine (brevet français FR 2 681 786), les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine désaminase, enzymes à cytochrome P450), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques ; - les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple les lipases, la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidyl acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaison des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les
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récepteurs aux LDL, les récepteurs des chylomicrons et les récepteurs scavenger, et la leptine pour le traitement de l'obésité ; - les facteurs régulant la pression sanguine, comme les enzymes impliquées dans le métabolisme du NO, l'angiotensine, la bradykinine, vasopressine, l'ACE, la rénine, les enzymes codant pour les mécanismes de synthèse ou de relargage des prostaglandines, du thromboxane, ou de l'adénosine, les récepteurs de l'adénosine, les kallikréines et kallistatines, ANP, ANF, les facteurs diurétiques ou antidiurétiques, les facteurs impliqués dans la synthèse, le métabolisme ou le relargage des médiateurs comme l'histamine, la sérotonine, les cathécholamines, les neuropeptides ; - les facteurs anti-angiogéniques comme le ligand de Tie-1 et de Tie-2, l'angiostatine, le facteur ATF, les dérivés du plasminogène, l'endothéline, les thrombospondines 1 et 2, le PF-4, l'interféron a ou ss, l'interleukine 12, le TNFa, le récepteur de l'urokinase, flt1, KDR, PAI1, PAI2, TIMP1, le fragment prolactine ; - les facteurs protégeant contre l'apoptose, comme la famille AKT ; - les protéines susceptibles d'induire une mort cellulaire, soit actives en elles-mêmes comme les caspases, soit de type "pro-drogues" nécessitant une activation par d'autres facteurs, soit les protéines activant des pro- drogues en agent provoquant une mort cellulaire, comme la thymidine kinase du virus herpétique, les désaminase, permettant en particulier d'envisager des thérapies anticancéreuses ; - les protéines impliquées dans les contacts et l'adhésion inter-cellulaires : VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, intégrines, cathénines ; - les protéines de la matrice extra-cellulaire ; - les protéines impliquées dans la migration des cellules ; - les protéines de type transduction du signal, type FAK, MEKK, p38 kinase, tyrosines kinases, sérines- thréonines kinases ;
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- les protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (p21, p16, cyclines) ainsi que les protéines mutantes ou dérivées dominant négatif bloquant le cycle cellulaire et pouvant le cas échéant induire l'apoptose ; - les facteurs de transcription : jun, fos, AP1, p53 et les protéines de la cascade de signalisation de p53 ; - les protéines de structure de la cellule, comme les filaments intermédiaires (vimentine, desmine, kératines), la dystrophine, les protéines impliquées dans la contractilité et le contrôle de la contractilité musculaire, en particulier les protéines impliquées dans le métabolisme calcique et les flux de calcium dans les cellules (SERCA).
Dans les cas de protéines fonctionnant par des systèmes ligands et récepteurs, il est envisageable d'utiliser le ligand (par exemple le FGF ou le VEGF) ou le récepteur (FGF-R, VEGF-R). On peut également citer des gènes codant pour des fragments ou des mutants de protéines de ligands ou de récepteurs, notamment des protéines précitées, présentant soit une activité supérieure à la protéine entière, soit une activité antagoniste, voire même de type "dominant négatif' par rapport à la protéine initiale (par exemples, des fragments de récepteurs inhibant la disponibilité de protéines circulantes, associés ou non avec des séquences induisant une sécrétion de ces fragments par rapport à un ancrage dans la membrane cellulaire, ou d'autres systèmes de modification du trafic intracellulaire de ces systèmes ligand-récepteurs de façon à détourner la disponibilité d'un des éléments) soit même possédant une activité propre distincte de celle de la protéine totale (ex. ATF).
Parmi les transgènes d'intérêt codant pour des protéines ou peptides sécrétés par le tissu, il est important de souligner les anticorps, les fragments variables d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance pour son utilisation en immunothérapie, par exemple pour le traitement des maladies
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infectieuses, des tumeurs, des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques (anticorps antiidiotype), ainsi que les ScFv se fixant sur les cytokines pro-inflammatoires telles que par exemple IL1 et TNFa pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde. D'autres transgènes d'intérêt utilisés dans le médicament selon l'invention codent, de façon non limitative, pour des récepteurs solubles, comme par exemple le récepteur CD4 soluble ou le récepteur soluble du TNF pour la thérapie anti-HIV, le récepteur TNFa ou le récepteur soluble IL1 pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde, le récepteur soluble de l'acétylcholine pour le traitement de la myasthénie ; des peptides substrats ou inhibiteurs d'enzymes, ou bien des peptides agonistes ou antagonistes de récepteurs ou de protéines d'adhésion comme par exemple pour le traitement de l'asthme, de la thrombose de la resténose, des métastases ou de l'inflammation ; des protéines artificielles, chimériques ou tronquées. Parmi les hormones d'intérêt essentiel, on peut citer l'insuline dans le cas du diabète, l'hormone de croissance et la calcitonine. On peut citer encore des protéines capables d'induire une immunité antitumorale ou stimuler la réponse immunitaire (IL2, GM-CSF, IL12, etc. ). Enfin on peut citer les cytokines qui diminuent la réponse TH1 telles que IL10, IL4 et IL13.
D'autres transgènes présentant un intérêt peuvent également être utilisés dans les compositions et les médicaments selon la présente invention ont été notamment décrits par McKusick, V.A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. Eighth edition. John Hopkins University Press (1988)), et dans Stanbury, J. B. et al. (The metabolic basis of inherited disease, Fifth Edition. McGraw-Hill (1983)). Les transgènes d'intérêt recouvrent les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants de la cellule.
On peut ainsi citer de manière non limitative les gènes associés aux maladies du métabolisme, des carbohydrates comme par exemple fructose-1-phosphate aldolase, fructose-1,6-diphosphatase,
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glucose-6-phosphatase, a-1,4-glucosidase lysosomale, amylo-1,6- glucosidase, amylo-(1,4 :1,6)-transglucosidase, phosphorylase musculaire, phosphofructokinase musculaire, phosphorylase-b-kinase, galactose-1- phosphate uridyl transférase, toutes les enzymes du complexe pyruvate déshydrogénase, pyruvate carboxylase, 2-oxoglutarate glyoxylase carboxylase, D-glycérate déhydrogénase.
On peut également citer : - les gènes associés avec des maladies du métabolisme des amino- acides comme par exemple phénylalanine hydroxylase, dihydrobioptérine synthétase, tyrosine aminotransférase, tyrosinase, histidinase, fumarylacéto- acétase, glutathion synthétase, y-glutamylcystéine synthétase, ornithine-8- aminotransférase, carbamoylphosphate synthétase, ornithine carbamoyltransférase, argininosuccinate synthétase, argininosuccinate lyase, arginase, L-lysine déhydrogénase, L-lysine kétoglutarate réductase, valine transaminase, leucine isoleucine transaminase, décarboxylase des 2- céto-acides à chaîne ramifiée, isovaléryl-CoA déhydrogénase, acyl-CoA déhydrogénase, 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA lyase, acétoacétyl-CoA 3- kétothiolase, propionyl-CoA carboxylase, méthylmalonyl-CoA mutase, ATP :cobalamine adénosyltransférase, dihydrofolate réductase, méthylène tétrahydrofolate réductase, cystathionine p-synthétase, le complexe sarcosine déshydrogénase, les protéines appartenant au système de clivage de la glycine, ss-alanine transaminase, carnosinase sérique, homocarnosinase cérébrale.
- Les gènes associés avec des maladies du métabolisme des graisses et des acides gras, comme par exemple lipoprotéine lipase, apolipoprotéine C-II, apolipoprotéine E, d'autres apolipoprotéines, lécithine cholestérolacyltransférase, récepteur des LDL, stérol hydroxylase du foie, " acide phytanique " a-hydroxylase.
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- Les gènes associés avec des déficiences lysosomales, comme par exemple a-L-iduronidase lysosomale, iduronate sulfatase lysosomale, héparan N-sulfatase lysosomale, N-acétayl-a-D-glucosaminidase lysosomale, acétyl-CoA : a-glucosamine N-acétyltransférase lysosomale, N- acétyl-a-D-glucosamine 6-sulfatase lysosomale, galactosamine 6-sulfate sulfatase lysosomale, ss-galactosidase lysosomale, arylsulfatase B lysosomale, ss-glucuronidase lysosomale, N-acétylglucosaminyl- phosphotransférase, a-D-mannosidase lysosomale, a-neuraminidase lysosomale, aspartylglycosaminidase lysosomale, a-L-fucosidase lysosomale, lipase acide lysosomale, céramidase acide lysosomale, sphingomyelinase lysosomale, glucocérébrosidase lysosomale et galactocérébrosidase lysosomale, galactosylcéramidase lysosomale, arylsulfatase A lysosomale, a-galactosidase A, ss-galactosidase acide lysosomale, chaîne a de l'hexosaminidase A lysosomale.
On peut également citer, de façon non restrictive, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des stéroïdes et des lipides, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des purines et des pyrimidines, les gènes associés à des maladies du métabolisme de la porphyrine et de l'hème, les gènes associés à des maladies du métabolisme du tissu conjonctif, des et des os ainsi que les gènes associés avec des maladies du sang et des organes hématopoïétiques, des muscles (myopathie), du système nerveux (maladies neurodégénératives) ou de l'appareil circulatoire (traitement des ischémies et de la sténose par exemple) et les gènes impliqués dans les maladies génétiques mitochondriales.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation de l'association telle que précédemment décrite pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de certaines anomalies ou déficiences
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génétiques, telles que par exemple les maladies génétiques mitochondriales, l'hémophilie, et la p-thalassémie.
En outre, elle a pour objet l'utilisation de l'association selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de certaines maladies telles que par exemple l'ischémie, la sténose, les myopathies, les maladies neurodégénératives, les maladies du métabolisme telles que les maladies lysosomales, les maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïdes, les troubles hormonaux tels que le diabète, les maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension, les hyperlipidémies telles que l'obésité.
La présente invention a encore pour objet l'utilisation de l'association telle que précédemment décrite pour la préparation d'un médicament anticancéreux, ou pour la préparation de vaccins, par exemple ADN antitumoral.
Les nombreux exemples qui précèdent et ceux qui suivent illustrent l'étendue potentielle du champ d'application de la présente invention.
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à des animaux transgéniques qui expriment un transgène d'intérêt codant pour ou transcrit d'intérêt ainsi qu'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt dans un ou plusieurs types cellulaires. Les méthodes de génération d'animaux transgéniques particulièrement de souris transgéniques, sont maintenant bien connues de l'homme du métier, et sont notamment décrites par Hogan et al. (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory.
Selon la présente invention, les acides nucléiques précédemment décrits sont transférés dans des ovocytes fertilisés non humains par microinjection, en implantant l'ovocyte chez une femelle porteuse, afin que celui-ci se développe. Généralement, les acides nucléiques sont intégrés
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dans le génome de la cellule à partir de laquelle l'animal transgénique se développe et restent dans le génome de l'animal adulte, de sorte qu'une expression du transgène d'intérêt et du transgène inhibiteur dans une ou plusieurs cellules ou tissus de l'animal transgénique peut être observée. Les animaux transgéniques portant les séquences nucléiques du transgène d'intérêt et du transgène inhibiteur peuvent être également être croisés à d'autres animaux transgéniques portant d'autres transgènes.
Comme animaux transgéniques ainsi produits, on peut citer par exemple une souris, une chèvre, un mouton, un cochon, une vache ou tout autre animal domestique. De tels animaux transgéniques ont un phénotype semblable aux animaux sauvages, toutefois le transgène ou transcrit d'intérêt est restauré lorsque l'on administre à l'animal un agent externe répresseur du transcrit inhibiteur et/ou d'un agent activateur de l'activité du transcrit d'intérêt.
Ces animaux transgéniques sont utilisés pour simuler la physiopathologie de certaines maladies humaines ou animales et constituent donc des modèles expérimentaux des maladies humaines ou animales. Par exemple, chez un animal hôte, le transgène d'intérêt susceptible d'être impliqué dans une pathologie peut être cointroduit avec son transgène inhibiteur spécifique, sans provoquer l'apparition d'un phénotype particulier. L'expression du transgène d'intérêt étudié peut ensuite être modulée par l'administration d'un agent externe répresseur du transcrit inhibiteur, et/ou d'un agent externe activateur du transcrit d'intérêt, afin de déterminer la relation qui existe entre l'expression de ce gène et l'apparition d'un phénotype pathologique. Une telle approche présente un certain avantage sur la technique usuelle d'invalidation ( knock out) puisque les animaux transgéniques selon la présente invention permettent non seulement une inactivation totale d'un transgène d'intérêt, mais également réversible ainsi que la possibilité de réguler son expression de manière plus efficace.
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Un dernier aspect de la présente invention se rapporte à des cellules végétales et des plantes transgéniques comprenant dans leur génome un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt. Ces plantes peuvent être obtenues par les techniques habituelles de transgénèse végétale. Des plasmides portant les acides nucléiques codant pour le transgène ou le transcrit d'intérêt et pour le transcrit inhibiteur placés sous le contrôle de promoteurs de transcription naturellement fonctionnels chez les plantes sont introduits par exemple dans une souche d'Agrobacterium tumefaciens. La transformation des plantes peut être ensuite réalisée en utilisant les protocoles de transformation et de régénération standard (Deblaere et al., Nucleic Acid Research 13 (1985) 4777-4788 ; Dinant et al., European Journal of Plant Pathology 104 (1998) 377-382).
On peut utiliser des promoteurs constitutifs tels que par exemple le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleurs (CaMV) (Odell et al., Nature 313 (1985) 810-812). Pour diriger l'expression du transcrit d'intérêt, on peut utiliser des promoteurs inductibles, tels que les promoteurs inductibles par les glucocorticoïdes qui est activé entre autres par la dexaméthasone (Aoyama et al., Plant J. 11 (1997) 605-612 ; et al., Gène Expression in Plants (1999) 44-59), le système inductible par l'éthanol (Caddick et al., Nat Biotechnol, 16 (1998) 177-180), les systèmes d'activation transcriptionnel par les hormones stéroïdiennes telles que le p- estradiol (Bruce et al., Plant Cell 12 (2000) 65-80). Alternativement, on utilise un système transcriptionnel inductible à l'ecdysone tel que décrit par Martinez et al. (Plant J, 19 (1999) 97-106) qui fonctionne avec un activateur hybride contenant les séquences de transactivation de récepteur des glucocorticoïdes (GR) et de VP16, le domaine de liaison à l'ADN du GR, et
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le domaine de régulation hormone-dépendant du récepteur à l'ecdysone. Ce dernier système peut être activé entre autres par un agoniste non stéroïdien de l'ecdysone, le RH5992, et permet donc de restaurer un niveau d'expression du transgène d'intérêt à l'état activé. Toutefois, alors que ce système de régulation présente à l'état non activé un niveau basal élevé, lorsqu'il est utilisé pour conduire l'expression d'un transgène d'intérêt en coexpression avec un transcrit inhibiteur de celui-ci, selon la présente invention, le niveau basal du transgène d'intérêt est fortement abaissé.
Selon ce dernier aspect, un gène étranger cytotoxique, voire même létal peut être exprimé de manière ponctuelle sur un laps de temps court sans inhiber la régénération de la plante transduite et en limitant la mort cellulaire. Ce système d'inhibition réversible de l'expression du transgène d'intérêt est par conséquent extrêmement utile pour certaines applications de biotechnologie de production de plantes et dans le cadre de la recherche fondamentale agronomique.
Ainsi, la présente invention est particulièrement utile pour l'étude de gènes dont la surexpression ou même une expression de base a des effets délétères pour l'organisme dans lequel ils sont exprimés. A titre d'exemples, une production non contrôlée de cytokines chez une plante provoque par exemple l'apparition de phénotypes anormaux au cours du développement tel que l'absence de racine, la perte de la dominance apicale, la stérilité, ou une toxicité cellulaire qui bloque dans le cas des plantes la régénération des tissus végétaux ou entraîne même des problèmes de létalité.
Le procédé d'inhibition réversible selon la présente invention de gènes exogènes peut par ailleurs s'avérer utile pour l'étude de la stabilité du produit du transgène d'intérêt (Gil et al., EMBO J., 15 (1996), ou l'évaluation le turnover du produit d'un gène exogène.
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Les plantes transgéniques selon la présente invention portant les constructions du transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et du transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, selon la présente invention, peuvent également servir à l'étude de certains mécanismes moléculaires et d'interactions des gènes.
En effet, lorsque l'expression de certains gènes conduit à la mort cellulaire, les lignées transgéniques portant à la fois les séquences du transgène d'intérêt létal et de son transcrit inhibiteur peuvent être utilisées pour isoler les mutants qui permettent d'étudier par la suite les interactions et mécanismes moléculaires de la mort cellulaire. Outre le contournement du phénotype létal, le système selon la présente invention facilite l'analyse fonctionnelle de certains gènes et de leur intervention dans l'apparition d'un phénotype, ainsi que leurs implications éventuelles dans certaines voies de transduction des signaux.
Egalement, le procédé selon l'invention permet de faciliter l'étude de gènes végétaux qui sont susceptibles d'affecter le développement du végétal aux stades précoces, mais peuvent jouer un rôle à des stades plus tardifs du développement. Des mutations de ces gènes affectent le développement de la plante, et par conséquent empêchent l'étude des fonctions tardives éventuelles de ces gènes. Des plantes transformées avec la séquence portant le transgène d'intérêt et son transcrit inhibiteur peuvent suivre un développement précoce normal, et l'administration d'un agent externe approprié à un stade de développement ultérieur permet avantageusement de restaurer l'expression des gènes en question et de déterminer leurs fonctions tardives. Les chimères végétales selon l'invention sont donc susceptibles de fournir de nouvelles informations, par exemple sur les mécanismes de signalisation chez les plantes.
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La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES Figure 1A à 1E : Représentations schématiques des plasmides pXL3031 (fig. 1A), pXL3010 (fig. 1 B), pSeAPantisens (fig. 1C), pXL3296(fig. 1D), et pLucAntisens (fig. 1 E).
Figure 2A à 2E : Représentation schématique des plasmides pTet-Splice (fig. 2A), pTetLucAntisens (fig. 2B), pTetLuc (fig. 2C), pTetSplice-SeAP antisens (fig. 2D) et pTet-tTAk (fig. 2E).
Figure 3 (A) :illustre l'activité de la SeAP mesurée 48h après cotransfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants : 1 :0.25 g de pXL3010 (S) + 0.75 g pXL3296 (V) ; 2 : 0. 25 g de pXL3010 (S) + 0.25 g pSeAPantisens (A) + 0.50 g pXL3296.(V) ; 3 : 0. 25 g de pXL3010 (S) + 0.50 g pSeAPantisens (A) + 0.25 g pXL3296 (V) ; 4 : 0. 25 g de pXL3010 (S) + 0.75 g pSeAPantisens (A) ; et 5 : 0. 25 g pSeAPantisens (A) + 0.75 g pXL3296 (V).
Figure 3(B) : illustre les activités relatives luciférase mesurée 24 h après cotransfection des plasmides suivants : 1 : 0. 125 g de pXL3031 + 0.75 g pXL3296.
2 : 0. 125 g de pXL3031 + 0.125 g pLucAntisens + 0.25 g pXL3296.
3 :0.125 g de pXL3031 + 0.25 g pLucAntisens + 0.125 g pXL3296.
4 :0.125 g de pXL3031 + 0.375 g pLucAntisens.
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5 : 0.125 g pLucAntisens + 0.375 g pXL3296.
Figure 4 : représente une photographie d'un gel d'électrophorèse illustrant la présence des ARN sens et antisens par RT-PCR in vitro.
Pistes 1 et 9 : 100 paires de bases (Gibco BRL) Piste 2 : témoin PCR en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice.
Piste 3: RT-PCR sur les ARN totaux extraits des cellules transfectées par 0.25 g de pXL3010 + 0.75 g pXL3296.
Piste 4: RT-PCR sur les ARN extraits des cellules transfectées par
0. 25 g de pXL3010 + 0.25 g pSeAPantisens + 0.50 g pXL3296.
Piste 5: RT-PCR sur les ARN extraits des cellules transfectées par
0. 25 g de pXL3010 + 0.75 g pSeAPantisens.
Pistes 6 à 8 : PCR (sans RT) effectuées sur les ARN utilisés respectivement en 3,4 et 5.
Figure 5A : illustreles activités SeAP in vitro mesurées 24h après cotransfection des jeux de plasmides suivants : condition 1 : pXL3010 + 75% pXL3296 condition 3 : 25% pXL3010 + 25% pSeAPantisens + 50% pXL3296 condition 5 : 25% pXL3010 + 25% pLucAntisens + 50% pXL3296 Figure 5B : illustre les activités relatives de luciférase, mesurées 24h suite à des transfections indépendantes in vitro des jeux de plasmides suivants : condition 2 : 25% pXL3031 + 75% pXL3296 condition 4 : 25% pXL3031 + 25% pLucantisens + 50% pXL3296 condition 6 : 25% pXL3031 + 25% pSeAPantisens + 50% pXL3296
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Figure 6 : illustre les taux relatifs de la SeAP circulante mesurés après injections bilatérales intramusculaires dans le muscle squelettique tibial cranial et électrotransfert de plasmides codant pour la séquence sens (pXL3010) et la séquence antisens (pSeAPantisens) du gène rapporteur de la SeAP, soit simultanément (lot 2) soit à 22 jours d'intervalle (lot 1).
Lot 1 : souris injectées avec 30ug d'un plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 30ug de pSeAPantisens + électrotransfert (2eme injection au jour 22) ; Lot 2 :10 souris coinjectées avec 30ug d'un plasmide pXL3010 + 30ug d'un plasmide pSeAPantisens + électrotransfert (coinjection) ; Lot 3 : souris injectées avec 30ug d'un plasmide pSeAPantisens + électrotransfert (groupe témoin).
Figure 7 A : une photographie d'un gel d'électrophorèse illustrant la présence d'ARN sens et antisens du gène rapporteur SeAP par RT-PCR in vivo des lots 1 à 3 de la figure 6 Piste 1 et 13 : marqueur d'ADN 100 bp (Gibco) ; Piste 2 et 3 : sens et antisens respectivement, dans des muscles des souris du lot 1 (pXL3010 puis réinjection de pSeAPantisens 22 jours après) ; Pistes 4 et 5 : sens et antisens, respectivement, dans des muscles des souris du lot 2 (coinjection de pXL3010 et de pSeAPantisens) ; Pistes 6 et 7 : sens et antisens, respectivement, dans des muscles des souris du lot 3 (pSeAPantisens seul).
Pistes 8 à 10 : PCR sans RT des ARN utilisés dans les pistes 2 à 7; Piste 11 : contrôle : PCR en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice ; Piste 12 : plasmide pXL3010.
Figure 7B : représente une photographie d'un film d'autoradiographie obtenu par transfert et hybridation sur membrane de nitrocellulose du gel
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d'agarose photographié à la figure 7A en présence d'oligonucléotides sondes marqués au 32P spécifiques de la séquence sens du gène rapporteur SeAP (S) et de la séquence antisens (AS).
Figure 8 : Suivi de l'activité relative de SeAP circulante dans le plasma de souris après injections bilatérales intramusculaires dans le muscle squelettique tibial cranial et électrotransfert des plasmides suivants aux intervalles de temps décrits ci-dessous : Lot 1: 10 souris injectées avec 15 g de plasmide pXL3010 + électrotransfert.
Lot 2: 10 souris injectées avec 15 g de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 45 g de pXL3296 + électrotransfert 21 jours après ; Lot 3: 10 souris injectées avec 15 ug de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 15 g de pSeAPantisens + 30 g de pXL3296 + électrotransfert 21 jours après ; Lot 4: 10 souris injectées avec 15 g de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 30 g de pSeAPantisens + 15 g de pXL3296 + électrotransfert 21 jours après ; Lot 5: 10 souris injectées avec 15 g de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 45 g de pSeAPantisens + électrotransfert 21 jours après.
Figure 9 : Suivi de l'activité relative de SeAP circulante dans le plasma de souris après coinjection et electrotransfert (ET) des plasmides suivants : Lot 1 : souris injectées avec 30 g de plasmide pXL3010 + ET; Lot 2 : 9 souris injectées avec 30 ug de plasmide pXL3010 + ET; Lot 3 : 9 souris coinjectées avec 30 g de plasmide pXL3010 + 30 g de pSeAPantisens + ET;
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Lot 4 : 9 souris injectées avec 30 g de plasmide pXL3010 + ET; Lot 5 : 9 souris injectées avec 30 g de plasmide pXL3010 + ET; Figure 10 A : Activitésrelatives de la SeAP in vitro mesurées après transfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants avec ou sans traitement ultérieur de tétracycline: Colonne 1 : 1 g pXL3010 + 1 g pXL3296 (vide) Colonne 2: 1 g pXL3010 + 0.5 g pXL3296 (vide) + 0.5 g pSeAPantisens Colonne 3 : 1 g pXL3010 + 1 g pSeAPantisens Colonne 4 : 1 g pXL3010 + 0.5 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk sans tétracycline Colonne 5 : 1 g pXL3010 + 0.5 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk avec tétracycline (1 mg/ml) Colonne 6 : 1 g pXL3010 + 1 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk sans tétracycline Colonne 7 : 1 g pXL3010 + 1 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk avec tétracycline (1 mg/ml) Figure 10B: Activités relatives de la SeAP in vitro mesurées après transfection des cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants avec ou sans traitement ultérieur de tétracycline: Colonne 1 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pXL3296 (vide) Colonne 2 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pSeAPantisens Colonne 3 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetSeAPantisens sans tétracycline Colonne 4: 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetSeAPantisens avec tétracycline (1 mg/ml) Colonne 5 : 0. 5 g pXL3010 + 2.5 g pXL3296 (vide)
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Colonne 6: 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 2.5 g pTetSeAPantisens sans tétracycline Colonne 7 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 2.5 g pTetSeAPantisens avec tétracycline (1 mg/ml) FIGURE 11 : Activités relatives de la luciférase 24h après cotransfection des cellules NIH 3T3 (80000 cellules par puits) avec les plasmides suivants (0.7 ou 1.1 g d'ADN par puits) avec ou sans administration de tétracycline: 1 : 0. 1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pXL3296.
2 : 0.1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pLucAntisens.
3 : 0. 1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pTetLucAntisens sans tétracycline.
4 : 0. 1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pTetLucAntisens avec tétracycline (1 mg/ml).
5 : 1 g pXL3031 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pXL3296.
6 : 0. 1 g pXL3031 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetLucAntisens sans tétracycline.
7 : 0. 1 g pXL3031 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetLucAntisens avec tétracycline (1 mg/ml).
FIGURE 12A : Taux relatifs de SeAP circulante in vivo après coinjection en intramusculaire de souris SCID femelles de 6 semaines des plasmides suivants avec ou sans administration de tétracycline à des intervalles de temps variables : Lot 1 : souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 + 40 g pTet- tTAk ; Lot 2 : 10 souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 + 20 g pTet- tTAk + 20 g pSeAPantisens ;
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Lot 3 : souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 +20 g pTet- tTAk + 20 g pTetSeAPantisens ; FIGURE 12B : Taux relatifs de SeAP circulante in vivo après coinjection en intramusculaire de souris SCID femelles de 6 semaines des plasmides suivants avec ou sans administration de tétracycline à des intervalles de temps variables : Lot 1 : 10 souris injectées avec 20 ug de plasmide pXL3010 + 20 g pTet- tTAk + 20 g pSeAPantisens ; Lot 2 : 10 souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 +20 g pTet- tTAk + 20 ug pTetSeAPantisens ; Lot 3 : lot 2 + boisson à la tétracycline (2mg/ml + 2 mg/ml de sucrose) pendant 9 jours. Puis arrêt de la tétracycline au 10léme jour. Remise sous tétracycline au 22ème jour (injection IP tous les deux jours, 500 g/souris), et arrêt au 30ème jour. Remise sous doxycycline au 63ième jour (400 mg/l dans la boisson).
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EXEMPLES EXEMPLE 1: Construction des plasmides portant l'amplificateur/promoteur précoce du Cytomegalovirus (CMV) 1. 1 Plasmide pXL3031 (plasmide luciferase) Le plasmide pXL3031 est également un plasmide pCOR décrit dans pCOR (Soubrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488) et comprend notamment le rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1A.
1.2 Plasmide pXL3010 (plasmide SeAP) Le plasmide pXL3010 a été construit par ligation dans un fragment Mlul/Sall de pGL3-basic (Promega), d'un fragment Mlul/Sphl de pCDNA3-basic (Invitrogen) contenant le promoteur précoce du cytomegalovirus humain (hCMV-IE), le gène SeAP extrait de pSeAP-basic (Clontech) avec Sphl/Clal et un fragment Clal/Sall contenant le signal de poly-adénylation tardif du virus simian (polyA SV40) amplifié à partir de pGL3-basic par une réaction de polymérisation en chaîne avec les amorces suivantes (5'- ATGCATCGATGGCCGCTTCGAGCAGACATG-3' et 5'-ATGCGTCGACTCTA GCCGATTTTACCACATTTGTAGAGG-3'). Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 B.
1.3 Plasmide pSeAPantisens (plasmide SeAP antisens dans pCOR) Un fragment d'ADN contenant le gène de la SeAP est préparé par ACP en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice et les oligonucléotides 1 (5' CGAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC 3') et 2 (5' GGGTCTA GATTAACCCGGGTGCGCGGCGTCGGT 3') comme amorces.
Ces oligonucléotides sont situés respectivement aux positions 765-797 et
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2290-2267 sur le plasmide pXL3010. Ce fragment a été ensuite digéré par les enzymes de restriction Xbal et Sphl, purifié sur gel d'agarose 0.8%, extrait à l'aide du kit Jetsorb, puis cloné en orientation antisens par rapport du promoteur CMV dans le plasmide pXL3296, préalablement digéré par Sphl et Xbal, pour obtenir le plasmide pSeAPantisens. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 C.
1.4 Plasmide pXL3296 (plasmide pCOR vide) Le plasmide pXL3296 est un plasmide pCOR (Soubrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488) et comporte l'ori y de R6K, la cassette d'expression de l'ARNt suppresseur Phénylalanine (sup Phe), ainsi qu'une partie -522/+72 du enhancer/promoteur précoce du virus CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 D.
1. 5 Plasmide pLucAntisens (plasmide luciferase antisens dans pCOR) Le plasmide pXL3031 a été digérée par Hindlll et traité par le fragment de Klenow afin de rendre les extrémités franches. Après précipitation à l'éthanol, le fragment a été digéré par Xbal à 37 C pendant 2 heures. Après purification sur gel d'agarose 0.8%, le fragment de environ 1. 6 kb contenant le gène luciférase a été extrait à l'aide du kit Jetsorb. Le fragment Xbal de 1.6Kb du gène de la luciférase a été ensuite cloné, en orientation antisens par rapport au promoteur CMV, dans le plasmide pXL3296 préalablement digéré par Xhol, et traité par le fragment de Klenow en présence de déoxynucléotides triphosphates à 37 C pendant 30 minutes afin de rendre l'extrémité franche, pour obtenir le plasmide pLucAntisens. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 E.
EXEMPLE 2: Construction de plasmides portant le promoteur répressible par la tétracycline (TrRS)
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2. 1 Plasmide pTetLucAntisens (plasmide luciferase antisens dans pTet- Splice) et plasmide pTetLuc (plasmide luciferase dans pTet-Splice) Le fragment Hindlll et Xbal d'environ 1. 7 kb, contenant le gène de la luciférase, a été digéré à partir du plasmide pXL3031, traité par le fragment de Klenow pour remplir les extrémités, et cloné en orientation sens et antisens, dans le plasmide pTetSplice (Gibco BRL), préalablement digéré par EcoRI, traité par le fragment de Klenow et déphosphorylé, afin d'obtenir respectivement les plasmides pTetLuc et pTetLucAntisens. Une représentation schématique de ces deux plasmides est présentée respectivement dans les figures 2C et 2B.
2. 2 Plasmide pTetSeAPantisens (plasmide SeAP antisens dans pTet- Splice) Le fragment Clal et EcoRV d'environ 1. 6 kb, contenant le gène de la SeAP a été digéré à partir du plasmide pXL3010 et cloné dans le plasmide pTet- Splice, dont la carte est donnée à la figure 2A (Gibco BRL), préalablement digéré par Clal et EcoRV, pour donner pTetSeAPantisens. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la Figure 2D.
2. 3 Plasmide pTet-tTAk Le fragment contenant la séquence du transactivateur tTA obtenu à partir du plasmide pUHD15-1 tel que décrit par Gossen et al. (Proc Natl Acad Sci, 89 (1992) 5547-5551) et cloné dans le plasmide pTet-Splice, (figure 2A) (Gibco BRL), préalablement digéré par Hindlll et Spel, pour donner pTet-tTAk. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la Figure 2E.
EXEMPLE 3 : des plasmides comprenant une séquence codant pour un transcrit inhibiteur de type antisens in vitro Exemple 3. 1 Culture cellulaire
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Les cellules utilisées sont des fibroblastes murins NIHT3T3 (ATCC : CRL- 1658). Ces cellules sont ensemencées 24 h avant la transfection, en plaques de 6 ou 24 puits, à une densité de 5.104 cellules/puits dans 1 ml de milieu, ou de 2,5.105 cellules /puits dans 2 ml. Le milieu de culture utilisé est le milieu DMEMTM (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 10% de sérum de veau. Les cultures cellulaires sont incubées dans une étuve à 37 C en atmosphère humide et sous pression partielle en CO2 de 5%. Les transfections sont effectuées environ 24 h après ensemencement lorsqu'une confluence de 50 à 80 % est obtenue.
Exemple 3.2: Transfection cellulaire réalisée à l'aide d'un lipofectant cationique Des solutions diluées d'ADN et de lipide cationique RPR 120535 (Bik G et al., J.Med.Chem 41 (1998) 224-235) sont préparées séparément en vue d'obtenir pour la transfection une concentration d'environ 6 nmoles de lipide RPR 120535 B/ g d'ADN. Chaque solution est d'abord diluée dans une solution de bicarbonate de sodium à 20 mM final dans du NaCI 150 mM final, et incubée pendant 10 minutes à température ambiante (T. A.). La solution de lipide cationique est ensuite distribuée, volume à volume, dans les solutions d'ADN. Une nouvelle incubation est réalisée pendant 10 min à T.A., et les complexes formés sont alors dilués au 1/10ème dans du milieu de culture supplémenté en sérum. Après une dernière incubation de 10 minutes, on élimine le milieu de culture dans les plaques et on distribue 1 ou 2 ml / puits de ces solutions selon que l'on utilise respectivement les plaques 24 ou 6 puits.
Exemple 3.3 : Mesure de l'activité luciférase L'activité luciférase est mesurée 24 h après la transfection. La luciférase catalyse l'oxydation de la luciférine, en présence d'ATP, de Mg2+, et d'02, avec production concomitante d'un photon. L'émission totale de lumière,
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mesurée par un luminomètre est proportionnelle à l'activité luciférase de l'échantillon.
Le milieu de culture est préalablement retiré, les cellules sont rincées deux fois avec du PBS, puis lysées pendant 15 min à température ambiante, par 200 l de Cell Lysis Buffer (Promega Corporation) par puits. Le kit Luciferase Assay SystemTM (Promega Corporation) est ensuite utilisé pour les mesures d'activité selon le protocole conseillé. L'activité luciférase est rapportée à la concentration en protéine des sumageants de lysats cellulaires. La mesure de la concentration protéique des extraits cellulaires est effectuée en utilisant la méthode BCA (Pierce) utilisant l'acide bicinchoninique (Wiechelman et al. , Anal Biochem, 175 (1998) 231-237.) Exemple 3.4 : Mesure de l'activité SeAP L'activité SeAP est mesurée sur les surnageants de culture 48h après la transfection, en utilisant le kit Phospha-LightTM (Tropix, Inc.).
Exemple 3.5 : Inhibition in vitro de l'expression des gènes rapporteurs SeAP (fig. 3A) ou de la luciferase (fig. 3B) par le transcrit inhibiteur de type antisens Les résultats des activités relatives de luciférase et SeAP dans les différentes conditions de transfection in vitro (figures 3A et 3B) montrent d'une part que les gènes rapporteurs de la luciférase et de la SeAP sont bien exprimés dans les cellules NIH 3T3 (colonnes 1 des figures 3A et 3B).
D'autre part, lorsque les cellules sont cotransfectées par les deux plasmides sens et antisens d'un même gène rapporteur, l'inhibition de l'expression est de l'ordre de 90% à partir d'un rapport sens/antisens de 1 (colonnes 2). Le taux d'inhibition est augmenté jusqu'à 95% et 97% lorsque l'on utilise un rapport antisens/sens de 2 (colonne 3) ou de 3 (colonne 4).
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Les colonnes 5 représentent le contrôle négatif dans lequel des plasmides sens codant pour la SeAP (figure 3A) et pour la luciférase (figure 3B) ne sont pas injectés.
Exemple 3.6 : Vérification de l'expression du transcrit inhibiteur de type antisens et du transcrit sens in vitro 48 heures après la transfection, les ARN totaux ont été préparés par la méthode Trizol (Gibco BRL) à partir des cellules NIH 3T3. Les produits de transcription des plasmides pXL3010 et pSeAPantisens, ont été mis en évidence par RT-PCR en utilisant les amorces 11 (5' CGATCATGTTCGACGACGCC 3') et 12 (5' CCAGGTCGCAGGCGGTGTAG 3') situées respectivement aux positions 1812-1831 et 2249-2230 sur le plasmide pXL3010 à l'aide du kit "one step RT-PCR system" (Gibco BRL) en suivant les instructions du fournisseur, et selon les conditions : 40 min à 50 C, puis 30 cycles (2 min à 94 C ; 1 min à 94 C ; 1 min à 55 C ; 1 min 30 à 72 C ; terminaison 3 min à 72 C).
Les produits de la RT-PCR ont été ensuite déposés sur gel d'agarose 0. 8%, et l'on peut observer la présence d'une bande à la taille attendue de 418 pb (piste 2, figure 4) qui reflète bien la transcription du gène SeAP sens (piste 3, figure 4), du sens SeAP et antisens SeAP dans différentes proportions 1 :1 (piste 4, figure 4), et 1 :3 5, figure 4).
Les pistes 6 à 8 correspondent à des contrôles négatifs de l'expérience dans lesquels une PCR sans reverse transcription préalable a été réalisée.
Exemple 3.7 : Spécificité des transcrits inhibiteur de type antisens Les résultats d'une série de cotransfections croisées d'un plasmide codant pour la SeAP (pXL3010) et d'un plasmide codant pour l'antisens de la SeAP (pSeAPantisens) ou de la Luciférase (pLucAntisens) et inversement des cotransfections d'un plasmide codant pour la luciférase (pXL3031) et d'un
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plasmide codant pour l'antisens de la SeAP (pSeAPantisens) ou de la Luciférase (pLucAntisens), sont présentés aux figures 5A et 5B.
Ces résultats démontrent clairement qu'il n'y a pas de réactions croisées aspécifiques, à savoir que l'antisens de la SeAP n'a pas d'effet sur l'expression de la luciférase, et de même que l'antisens de la luciférase n'a pas d'effet sur l'expression de la SeAP. Ces résultats montrent également que l'inhibition observée ne peut pas être attribuée à la coexpression de séquences sens et antisens quelconques, mais nécessite au contraire la coexpression d'un transcrit antisens pour une séquence sens spécifique.
EXEMPLE 4 : Absence d'inhibition in vivo de l'expression de la SeAP par l'antisens de SeAP lorsque celui-ci est injecté 22 jours après le gène rapporteur SeAP sens Exemple 4. 1 Electrotransfert dans le muscle squelettique Les souris SCID agées de 6 semaines sont d'abord anesthésiées par un mélange Kétamine/Xylazine (250 l/souris). Les différents plasmides en solution dans du NaCI 150mM, sont ensuite injectés en intramusculaire dans le muscle tibial cranial des souris. L'injection est suivie d'une série de pulses électriques : 8 pulses de 20 ms, 200 V/cm, 1 Hz (Mir et al., PNAS, 96 (1999) 4262-67). La quantité de SeAP circulante est suivie régulièrement par des prélèvements sanguins et dosages de l'activité phosphatase à l'aide du kit Phospha-Light (Tropix).
Exemple 4.2: Comparaison du pourcentage d'inhibition du transcrit inhibiteur de type antisens lorsque celui-ci est coinjecté avec le gène rapporteur SeAP ou postinjecté 22 jours après l'injection du gène SeAP Les résultats, rassemblés en figure 6, montrent que l'injection du plasmide pSeAPantisens ne conduit pas à une inhibition efficace du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) injecté 22 jours auparavant. En effet, plus de 20 jours
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après l'injection du transcrit antisens, l'expression observée de la SeAP n'a diminué que de 60% (lot 1, figure 6).
Ceci indique donc bien que le transcrit antisens ne peut inhiber efficacement le gène exogène SeAP préalablement administré, alors que ce dernier a été reconnu comme restant stable et fonctionnel pendant environ 9 mois après injection et électrotransfert in vivo (Mir et al., PNAS, 96 (8) (1999) 4262- 4267 ; Mir et al., C R Acad Sci III, 321(11) (1998) 893-899). Une expression résiduelle d'environ 30% du gène exogène de la SeAP est en effet observée.
Par contre, la figure 6 montre clairement qu'une coinjection du transcrit inhibiteur de type antisens et de la séquence sens du gène rapporteur exogène de la SeAP confère une très forte inhibition de l'expression de la SeAP, puisque l'on ne peut détecter aucune expression résiduelle de ce gène. La coexpression du gène sens et antisens de la SeAP permet d'abolir l'expression du gène rapporteur SeAP in vivo (lot 2, figure 6).
L'injection d'antisens seul en tant que contrôle ne confère aucune activité (lot 3, figure 6).
Exemple 4.3 : Vérification de l'expression in vivo des transcrits sens et antisens Les muscles des souris ont été prélevés, broyés, et les ARN totaux ont été extraits. Des réactions de RT-PCR ont été effectuées en suivant le protocole précédemment décrit à l'Exemple 3. 6. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel d'agarose et visualisés au bromure d'éthydium.
Une photographie de ce gel qui est présentée à la figure 7A, montre que les deux ARN sens et antisens sont exprimés dans les muscles de souris qui ont subi une première injection de plasmides pXL3010, et une injection ultérieure de plasmide portant la séquence du transcrit inhibiteur de type antisens pSeAPantisens (pistes 2 et 3)...
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Au contraire lorsque l'on a effectué une co-injection du pXL3010 et pSeAPantisens, seul l'ARN antisens est présent, l'ARNm de la SeAP n'est pas détecté (pistes 4 et 5). Ceci confirme bien l'efficacité de l'inhibition obtenue par co-injection de la séquence sens et de son transcrit inhibiteur antisens.
Lorsque l'on injecte le plasmide pSeAPantisens seul en tant que contrôle, l'ARN antisens de la SeAP est uniquement détecté (pistes 6 et 7).
Le gel d'agarose a été transféré sur membrane de nylon Hybond N+ (Amersham), et hybridé avec un oligonucléotide sonde marqué au 32P spécifique des transcrits sens et antisens du gène rapporteur de la SeAP.
La membrane est ensuite exposée sur un film d'autoradiographie, et le film est développé trois heures après. Une photographie de ce film qui est présentée à la figure 7B, confirme bien les résultats précédents. En effet, la présence d'un produit de transcription du gène rapporteur SeAP n'est pas détectée à la piste 4 qui correspond à la co-injection des plasmides comprenant la séquence sens du gène rapporteur (pXL3010) et la séquence antisens (pSeAPantisens), alors que le produit de transcription du gène rapporteur SeAP est détecté à la piste 2 qui correspond à l'expérience de post-injection de ces mêmes plasmides.
Exemple 4.4: Suivi de l'activité relative SeAP circulante in vivo après injection du plasmide comprenant la séquence sens du gène SeAP (pXL3010), suivie d'une post-injection du plasmide comprenant la séquence du transcrit inhibiteur de type antisens du gène rapporteur SeAP (pSeAPantisens) 50 souris SCID femelles de 6 semaines, divisées en 5 groupes de 10 et sont traitées comme précédemment décrit aux Exemples 3. 2 et 3.3.
Les résultats présentés figure 8, montrent clairement et de manière reproductible qu'aucun effet d'inhibition ne peut être mis en évidence lorsque l'on procède en injectant dans un premier temps la séquence codant
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pour le transcrit sens puis dans un deuxième temps pour le transcrit inhibiteur de type ARN antisens.
Exemple 4.5: Suivi de l'activité relative SeAP circulante in vivo après coinjection des plasmides pXL3010 et pSeAPantisens 50 souris SCID femelles de 6 semaines, divisées en 5 lots de 10 et sont traitées comme précédemment décrit aux Exemples 3. 2 et 3.3.
Les résultats, présentés à la figure 9, montrent bien que la coinjection de ces deux plasmides (lot 3) permet d'obtenir une expression très faible, voire nulle du gène rapporteur exogène SeAP, indiquant que le transcrit inhibiteur de type ARN antisens agit en inhibant fortement la transcription du gène rapporteur SeAP avec lequel il est coinjecté, et cela de manière constitutive sur une période de temps variable allant de 7 à 85 jours après la coinjection.
Les lots témoins 1, 2,4, et 5 qui correspondent à une injection du plasmide portant la séquence sens du gène rapporteur seul montrent une expression à des taux variables du gène pendant toute la période de l'évaluation.
EXEMPLE 5 : Fonctionnalité de l'inhibition du transcrit inhibiteur de type antisens lorsque celui-ci est placé sous le contrôle d'un promoteur répressible par la tétracycline, et mesure d'inhibition in vitro
Exemple 5.1 : Fonctionnalité in vitro du promoteur répressible par la tétracycline Les expériences ont été réalisées sur cellules NIH 3T3, avec les gènes rapporteurs SeAP et Luciférase, ces deux gènes rapporteurs ayant été précédemment décrits.
Exemple 5.2 : Régulation par un transcrit inhibiteur du type antisens du gène rapporteur SeAP in vitro
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Les résultats, présentés à la figure 10A, montrent que le transcrit inhibiteur de type antisens sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort CMV (pSeAPantisens) coexprimé avec la séquence sens du gène rapporteur SeAP dans une proportion de 0. 5 et 1 confère une inhibition de l'expression du gène in vitro respectivement de 70% à 83% (colonnes 2 et 3). Par contre, lorsque le transcrit inhibiteur de type antisens est placé sous contrôle du promoteur tétracycline (pTetSeAPantisens), l'inhibition in vitro est plus faible et incomplète de 45% à 60% respectivement dans les mêmes rapports (colonnes 4 et 6).
En présence d'agent répresseur externe tel que la tétracycline, une induction de l'expression de la SeAP est observée (colonnes 5 et 7).
Les résultats, présentés à la figure 10B, montrent une inhibition partielle du gène rapporteur de la SeAP lorsque celui-ci est coinjecté avec le plasmide comprenant la séquence du transcrit inhibiteur de type antisens du gène de la SeAP sous le contrôle du promoteur CMV (pSeAPantisens) en proportion 1:1 (colonne 2), ou sous le contrôle du promoteur répressible à la tétracycline (colonnes 3 et 6), par rapport au niveau d'expression du gène rapporteur de la SeAP mesuré après injection du plasmide comprenant la séquence sens de la SeAP (pXL3010) (colonnes 1 et 5).
L'administration de tétracycline permet de rétablir une expression très satisfaisante du gène rapporteur de la SeAP (colonnes 4 et 7).
Exemple 5.3 : Régulation par un transcrit inhibiteur de type antisens du gène rapporteur de la luciférase in vitro Les résultats présentés en figure 11, démontrent, en premier lieu, la fonctionnalité in vitro des plasmides comprenant les séquences sens et antisens du gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle du promoteur répressible par la tétracycline (pTetLucAntisens, pTetLuc et pTetSpliceAntisens).
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En l'absence de tétracycline, le transcrit inhibiteur de type antisens est exprimé et conduit à une inhibition imparfaite de 60-70 % (colonnes 3 et 6), alors que lorsque le transcrit inhibiteur de type antisens est placé sous le contrôle du promoteur CMV, l'inhibition est de l'ordre de 90%, en utilisant un rapport sens/antisens de 1:1 (colonne 2).
*En présence de tétracycline, l'expression du gène rapporteur luciférase est restaurée à un niveau satisfaisant (colonnes 4 et 7), par rapport au niveau de luciférase obtenu par transfection d'un seul plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la luciférase (pXL3031 )(colonne 1).
Ces résultats montrent bien qu'il est possible de réguler de manière indirecte l'expression de gènes rapporteurs exogènes en présence d'un agent répresseur externe du transcrit inhibiteur tel que la tétracycline.
EXEMPLE 6 : Mesure d'une forte inhibition in vivo par un transcrit inhibiteur de type antisens placé sous le contrôle d'un promoteur répressible 40 souris SCID ont été traitées comme précédemment décrit, en utilisant les plasmides utilisés sont pXL3010, pSeAPantisens, pTetSeAPantisens, et pTet-tTAk.
Les résultats, présentés à la figure 12A, montrent bien, contrairement aux résultats d'inhibition in vitro, et par rapport au niveau d'expression in vivo du gène rapporteur de la SeAP (lot 1), que l'on obtient une inhibition efficace de l'expression de la SeAP, lorsque l'on coinjecte et l'on coexprime le plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) ainsi que le plasmide comprenant la séquence antisens SeAP sous le contrôle d'un promoteur fort CMV (pSeAPantisens)(lot 2), ou encore en coinjectant et en coexprimant le plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) ainsi que le plasmide comprenant la séquence antisens de la SeAP sous le contrôle du promoteur répressible par la tétracycline (pTetSeAPantisens) (lot 3).
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EXEMPLE 7 : Régulation in vivo par un transcrit inhibiteur de type antisens placé sous le contrôle d'un promoteur répressible Les résultats présentés à la figure 12B, montrent, par ailleurs que la coinjection des plasmides portant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) et la séquence antisens du gène sous le contrôle du promoteur répressible à la tétracycline (pTetSeAPantisens) en présence d'un agent externe répresseur, tel que la tétracycline, permet d'obtenir un niveau biologique satisfaisant du gène rapporteur de la SeAP (lot 3, J8).
Une inhibition de l'expression du gène exogène rapporteur de la SeAP peut être à nouveau observée lorsque l'on arrête l'administration de tétracycline au 10lème jour (lot 3: J15 , J22, J30, et J63). Ces résultats confirment également que cette inhibition est réversible, puisque l'administration d'un agent répresseur analogue de la tétracycline, la doxyclycline, au 63ième jour permet de rétablir une expression du gène rapporteur de la SeAP (lot 3 : J70).
EXEMPLE 8 : Régulation par un transcrit inhibiteur de type ribozyme Comme précédemment décrit pour la construction des plasmides pTetSeAPantisens et pTetLucAntisens, on construit un plasmide, qui contient une séquence de ribozyme à tête de marteau, en clonant une séquence comprenant au moins un site GTC, choisi en positions 958,1058, 1127,1205, 1243,1600, 1620,1758, 1773,1880, 1901,1988, 2007,2085 et 2201 sur le plasmide pXL3010 (gène rapporteur SeAP), en aval du promoteur répressible par la tétracycline TetRS dans le plasmide pTet- Splice (Gibco BRL), préalablement digéré, pour donner le plasmide pTetSeAPribozyme.
30 souris SCID de 6 semaines sont traitées comme précédemment décrit dans l'Exemple 4, et sont divisées en trois groupes de 10.
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Le premier groupe est traité comme précédemment décrit avec le plasmide pXL3010.
Le second groupe reçoit en coinjection les plasmides pXL3010, pTet-tTAk, et pTetSeAPribozyme. Le troisième groupe est traité comme le groupe 2, et on donne aux souris une boisson contenant de la doxycycline (400 mg/l). Le taux de SeAP circulante est suivi comme précédemment décrit.
On observe dans le second groupe, après coinjection et électrotransfert, du plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) et du plasmide comprenant la séquence du transcrit inhibiteur ribozyme spécifique de la SeAP sous le contrôle d'un promoteur répressible par la tétracylcine (pTetSeAPribozyme), une inhibition efficace de l'expression de la SeAP, par rapport à l'expression observée du gène rapporteur de la SeAP dans le premier groupe de souris testées, indiquant que le transcrit inhibiteur de type ribozyme est capable d'inhiber fortement in vivo la transcription du gène exogène de la SeAP avec lequel il est coadministré.
L'administration par voie orale d'un analogue de la tétracycline, la doxycycline, en tant qu'agent répresseur, permet de restaurer l'expression de la SeAP.
EXEMPLE 9 : Régulation par un transcrit inhibiteur de type antisens comprenant une séquence aptamère Le plasmide pSeAPantisens (Figure 1 C) tel que décrit dans l'exemple 1. 3, est modifié afin d'insérer à l'extrémité 5' de la séquence du transcrit inhibiteur antisens, une séquence aptamère ligand-dépendante, de séquence 5' GGCCUGGGCGAGAAGUUUAGGCC 3' reconnue par la néomycine B telle que décrite par Cowan et al. (Nucleic Acids Res.
28 (15)(2000)2935-2942), pour donner le plasmide désigné pSeAPaptamèreAS
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30 souris SCID de 6 semaines sont traitées comme précédemment décrit dans l'exemple 4, et sont divisées en trois groupes de 10.
Le premier groupe est traité comme précédemment décrit avec le plasmide pXL3010. Le second groupe reçoit en coinjection suivie d'électrotransfert, les plasmides pXL3010, et pSeAPaptamèreAS. Le troisième groupe est traité comme le groupe 2, et reçoit en plus une injection IP de néomycine B à raison d'environ 500g/souris. Le taux de SeAP circulante est ensuite suivi comme précédemment décrit.
Alors que l'on décèle pour le premier groupe, une expression constante du gène rapporteur de la SeAP, on observe dans le second groupe une inhibition efficace du gène SeAP par le transcrit inhibiteur comprenant une séquence aptamère.
Une expression de la SeAP peut être restaurée dans le troisième groupe, auquel l'on administre une quantité efficace de néomycine B qui reconnaît la séquence aptamère portée par le plasmide pSeAPaptamèreAS. Une forte diminution du taux de SeAP circulante et donc une inhibition de l'expression du gène rapporteur de la SeAP peut être à nouveau observée lorsque l'on cesse l'administration de néomycine B.
Exemple 10 : Régulation par un transcrit inhibiteur de type ribozyme comprenant une séquence aptamère On construit un plasmide qui contient une séquence de ribozyme en tête de marteau, en clonant une séquence comprenant au moins un site GTC, choisi en positions 958,1058, 1127,1205, 1243, 1600, 1620, 1758,1773, 1880, 1901,1988, 2007,2085 et 2201 sur le plasmide pXL3010, en aval du promoteur CMV dans le plasmide pXL3296 (Soubrier et al.) préalablement digéré pour donner pSeAPribozyme. Ce dernier est ensuite modifié afin d'insérer à l'extrémité 5' de la séquence du transcrit inhibiteur de type ribozyme, un aptamère de séquence 5'GGUGAUCAGAUUCUGAUCCAAUGUUAUGCUUCUCUGCCUGGGAAC
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AGCUGCCUGAAGCUUUGGAUCCGUCGC 3', telle que décrite par Werstuck et al., Science, 282 (1998), 296-298, et reconnue par le colorant Hoechst 33258 (H33258), pour donner le plasmide désigné pSeAPaptazyme.
Trois groupes de 10 souris SCID de 6 semaines sont traitées : le premier groupe reçoit par injection suivie d'électrotransfert le plasmide pXL3010, le second groupe reçoit également par coinjection suivie d'électrotransfert, les plasmides pXL3010, et pSeAPaptazyme, et enfin, le troisième groupe est traité comme le groupe 2, mais reçoit en plus par l'eau de boisson, une quantité de colorant H33258 (400mg/l). Le suivi du taux de SeAP circulante montre une inhibition efficace in vivo de l'activité de la SeAP, qui est restaurée à un niveau significatif dans le troisième groupe de souris, qui reçoivent le ligand ou colorant H33258, spécifique de la séquence aptamère présente dans le plasmide pSeAPaptazyme.

Claims (102)

  1. REVENDICATIONS 1. Procédé de régulation in vitro de l'expression d'un transgène d'intérêt consistant à : - introduire simultanément dans un tissu ou une cellule cible, d'une part un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt, et d'autre part un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe, et - coexprimer lesdits acides nucléiques dans le tissu ou la cellule cible afin d'inhiber constitutivement l'activité du transcrit d'intérêt par le transcrit inhibiteur.
  2. 2. Procédé de régulation in vitro selon la revendication 1, consistant en outre à introduire dans un tissu ou des cellules cibles, un agent externe conduisant à inhiber l'activité dudit transcrit inhibiteur, en vue de restaurer l'activité du transcrit d'intérêt.
  3. 3. Procédé de régulation in vitro selon la revendication 1 ou 2, consistant également à introduire dans un tissu ou des cellules cibles, un agent externe conduisant à accroître l'activité dudit transcrit d'intérêt, en vue de restaurer l'activité du transcrit d'intérêt.
  4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur est sous le contrôle d'un promoteur répressible, et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
  5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur comprend une ou plusieurs répétitions de l'opérateur de réponse à la
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    tétracycline, et l'agent externe répresseur est la tétracycline ou un analogue.
  6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est un ligand spécifique activateur de l'aptamère.
  7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand- dépendante, et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
  8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que. la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt est placée sous le contrôle d'une promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
  9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARa, et l'agent externe est un ligand du PPARa tel qu'un fibrate ou un analogue.
  10. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARy, et l'agent externe est un ligand du PPARy tel qu'un acide gras ou un thiazolidinedione.
  11. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type
    Watson et Crick.
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  12. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie non codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
  13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie non codante à l'extrémité 5' de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
  14. 14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'ARN antisens a une longueur comprise d'au moins 10 ribonucléotides.
  15. 15. Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN capable de former une triple hélice avec une partie de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt.
  16. 16. Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ribozyme.
  17. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt code pour une protéine d'intérêt thérapeutique.
  18. 18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt est capable de corriger une anomalie ou d'une déficience génétique.
  19. 19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt code pour un activateur qui est impliqué dans l'expression d'un autre gène.
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  20. 20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt produit un transcrit d'intérêt ayant une activité thérapeutique.
  21. 21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont portés par un seul vecteur ou des vecteurs distincts.
  22. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites acides nucléiques sont portés par le même brin du même vecteur.
  23. 23. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel, ou tout
    ADN non encapsidé.
  24. 24. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que le vecteur est un virus recombinant.
  25. 25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que le virus est un adénovirus, un rétrovirus, un virus de l'herpès, un virus adéno-associé, un phage ou un dérivé de ceux-ci.
  26. 26. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que le vecteur est une bactérie ou parasite.
  27. 27. Procédé selon l'un des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont introduits dans le tissu ou la cellule cible par un procédé physique ou mécanique.
  28. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'on utilise les acides nucléiques sont introduits par coinjection, par technique balistique, par électroporation, par sonoporation, par l'intermédiaire d'un
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    champs électrique, de microondes, de la chaleur, de la pression, ou par l'intermédiaire une combinaison de ces techniques.
  29. 29. Procédé selon l'un des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont introduits dans le tissu ou la cellule cible par coinjection et électrotransfert.
  30. 30. Procédé selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont cointroduits dans le tissu ou la cellule cible sous forme complexée à un agent chimique ou biochimique.
  31. 31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'agent chimique ou biochimique est une protéine cationique choisie parmi une histone ou une protamine.
  32. 32. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'agent chimique ou biochimique est un polymère choisi parmi le DEAE-dextran, une polyamidoamine, une polylysine, un polyéthylènimine, un polyvinylpyrrolidone, ou un polyvinylalcool.
  33. 33. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont incorporés à des lipides sous forme brute ou sous forme de liposomes.
  34. 34. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que les acides nucléiques incorporés à des nanoparticules.
  35. 35. Procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule ou d'un tissu d'origine animale ou humaine.
  36. 36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule musculaire ou d'un tissu musculaire squelettique.
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  37. 37. Procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule ou d'un tissu d'origine végétale.
  38. 38. Utilisation d'une association pour la régulation d'un transgène d'intérêt in vitro, ladite association contenant un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et d'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant chacune placée sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
  39. 39. Utilisation selon la revendication 38 pour la régulation in vitro d'un transgène d'intérêt dans une cellule ou un tissu cible d'origine animale de préférence d'origine humaine.
  40. 40. Utilisation selon la revendication 39, caractérisée en ce que la cellule ou le tissu cible est musculaire.
  41. 41. Utilisation selon la revendication 38 pour la régulation d'un transgène d'intérêt dans une cellule ou un tissu cible d'origine végétale.
  42. 42. Association susceptible d'être mise en oeuvre dans le procédé tel que défini dans selon l'une des revendications 1 à 37, ladite association contenant un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et d'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, ladite association étant administrée in vivo, lesdites séquences étant chacune placées sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
    <Desc/Clms Page number 71>
  43. 43. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
  44. 44. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie non codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et
    Crick.
  45. 45. Association selon la revendication 44, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire à au moins une partie non codante en 5' de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson' et
    Crick.
  46. 46. Association selon l'une des revendications 43 à 45, caractérisée en ce que l'ARN antisens a une longueur d'au moins 10 ribonucléotides.
  47. 47. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN capable de former une triple hélice avec une partie de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt.
  48. 48. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ribozyme.
  49. 49. Association selon l'une des revendications 42 à 48, caractérisée en ce que la séquence codant pour le transcrit inhibiteur est sous le contrôle d'un promoteur répressible et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
    <Desc/Clms Page number 72>
  50. 50. Association selon la revendication 49, caractérisée en ce que le promoteur comprend une ou plusieurs répétitions de l'opérateur de réponse à la tétracycline, et l'agent répresseur externe est la tétracycline ou un analogue.
  51. 51. Association selon l'une des revendications 42 à 48, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est ligand spécifique activateur de l'aptamère.
  52. 52. Association selon l'une des revendications 42 à 48, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand-dépendante et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
  53. 53. Association selon l'une des revendications 42 à 52, caractérisée en ce que la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt est placée sous le contrôle d'une promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
  54. 54. Association selon la revendication 53, caractérisée en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARa, et l'agent externe est ligand du PPARa tel qu'un fibrate ou un analogue.
  55. 55. Association selon la revendication 53, caractérisée en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARy, et l'agent externe est ligand du PPARy tel qu'un acide gras ou un thiazolidinedione.
  56. 56. Association selon l'une des revendications 42 à 55, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt code pour une protéine d'intérêt thérapeutique.
    <Desc/Clms Page number 73>
  57. 57. Association selon l'une des revendications 42 à 56, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt permet de corriger une anomalie ou une déficience génétique.
  58. 58. Association selon l'une des revendications 42 à 57, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt code pour un activateur qui est impliqué dans l'expression d'un autre gène.
  59. 59. Association selon l'une des revendications 42 à 55, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt produit un transcrit d'intérêt ayant une activité thérapeutique.
  60. 60. Association selon l'une des revendications 42 à 59, caractérisée en ce que lesdits acides nucléiques sont portés sur un même vecteur ou des vecteurs distincts.
  61. 61. Association selon la revendication 60, caractérisée en ce que lesdits acides nucléiques sont portés sur un même brin du même vecteur.
  62. 62. Association selon la revendication 60 ou 61, caractérisée en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel, ou tout
    ADN non encapsidé.
  63. 63. Association selon la revendication 60 ou 61, caractérisée en ce que le vecteur est un virus recombinant.
  64. 64. Association selon la revendication 63, caractérisée en ce que le vecteur est choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, un virus de l'herpès, un virus adéno-associé, un phage, ou un dérivé de ceux-ci.
  65. 65. Association selon la revendication 60 ou 61, caractérisée en ce que le vecteur est une bactérie ou un parasite.
    <Desc/Clms Page number 74>
  66. 66. Association selon l'une des revendications 42 à 65, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme administrable in vivo par une technique physique ou mécanique.
  67. 67. Association selon la revendication 66, caractérisée en ce qu'elle est administrable par injection, par technique balistique, par électroporation, par sonoporation, par l'intermédiaire d'un champs électrique, de microondes, de la chaleur, de la pression, ou par une combinaison de ces techniques.
  68. 68. Association selon la revendication 66, caractérisée en ce qu'elle est administrable par injection et/ou électrotransfert.
  69. 69. Composition pharmaceutique comprenant l'association selon l'une des revendications 42 à 68 et un excipient pharmaceutiquement approprié..
  70. 70. Médicament comprenant l'association selon l'une des revendications 42 à 68 et un excipient approprié.
  71. 71. Médicament selon la revendication 70 susceptible d'être administré par voie systémique, par voie intra-artérielle, ou intra-veineuse.
  72. 72. Medicament selon la revendication 71, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être administré dans une cellule ou tissu cible d'origine animale et de préférence humaine.
  73. 73. Medicament selon la revendication 72, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule musculaire ou d'un tissu musculaire squelettique.
  74. 74. Médicament comprenant l'association selon l'une des revendications 42 à 68 et un excipient approprié, susceptible d'être administré par voie topique, cutanée, orale, vaginale, intranasale, sous cutanée,intra-oculaire, ou parentérale.
    <Desc/Clms Page number 75>
  75. 75. Médicament selon l'une des revendications 71 à 74, caractérisé en ce que l'excipient est un excipient approprié pour les différents modes d'administration.
  76. 76. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné à la correction d'une anomalie ou d'une déficience génétique.
  77. 77. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies génétiques mitochondriales.
  78. 78. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des myopathies.
  79. 79. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des ischémies et de la sténose.
  80. 80. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies lysosomales
  81. 81. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des troubles hormonaux.
  82. 82. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hémophilie.
    <Desc/Clms Page number 76>
  83. 83. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde.
  84. 84. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la ss- thalassémie.
  85. 85. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné à induire l'apoptose.
  86. 86. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement anticancéreux.
  87. 87. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégéneratives.
  88. 88. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension.
  89. 89. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hyperlipidémies telles que l'obésité.
  90. 90. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un vaccin.
  91. 91. Animal transgénique, caractérisé en ce qu'il porte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit
    <Desc/Clms Page number 77>
    d'intérêt, lesdites séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
  92. 92. Animal transgénique selon la revendication 91, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens génétique, d'un ARN capable de former une triple hélice, ou d'un ribozyme.
  93. 93. Animal transgénique selon la revendication 91 ou 92, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur est régulé négativement par l'intermédiaire d'un promoteur répressible, et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
  94. 94. Animal transgénique selon la revendication 91 ou 92, caractérisé en.ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est un ligand spécifique activateur de la séquence aptamère.
  95. 95. Animal transgénique selon la revendication 91 ou 92, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand-dépendante, et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
  96. 96. Animal transgénique selon l'une des revendications 91 à 95, caractérisé en ce que le transcrit d'intérêt est sous le contrôle d'un promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
  97. 97. Plante transgénique caractérisée en ce qu'elle porte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant sous le contrôle d'un promoteur
    <Desc/Clms Page number 78>
    transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
  98. 98. Plante transgénique selon la revendication 97, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens génétique, d'un ARN capable de former une triple hélice, ou d'un ribozyme.
  99. 99. Plante transgénique selon la revendication 97 ou 98, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur est régulé négativement par l'intermédiaire d'un promoteur répressible, et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
  100. 100. Plante transgénique selon la revendication 97 ou 98, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est un ligand spécifique de cette séquence aptamère.
  101. 101. Plante transgénique selon la revendication 97 ou 98, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand-dépendante, et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
  102. 102. Plante transgénique selon l'une des revendications 97 à 101, caractérisée en ce que le transcrit d'intérêt est sous le contrôle d'un promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
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