WO2002013758A2 - Systeme de regulation in vivo de l'expression d'un transgene par inhibition conditionnelle - Google Patents

Systeme de regulation in vivo de l'expression d'un transgene par inhibition conditionnelle Download PDF

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WO2002013758A2
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Definitions

  • the present invention relates to new compositions as well as a new method intended for controlling the expression in vivo of a transgene of therapeutic or experimental interest, by a conditional inhibition system.
  • the present invention is particularly useful for the generation of modified animals and plants as well as in gene therapy applications.
  • Gene therapy which consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) or even treating a pathology through the expression of a therapeutic transgene, is generally implemented by the introduction of a exogenous or transgene gene in the affected cell or tissue.
  • the transgene is placed under the control of a strong promoter, constitutive or inducible, in order to ensure quantitatively and qualitatively optimal expression in vivo.
  • the possibility of exercising effective control, particularly of inhibition, of the transgene of interest may prove to be decisive for the success of certain experiments or of therapy, in particular when the expression of the transgene is accompanied by effects.
  • secondary eg cytotoxicity.
  • cytokines such as TNF- ⁇ , IL-2, IL-4, 1L-12, IL-18, GM-CSF (Agha-Mohammadi, et al., J. Clin.Invest, 105 (2000) 1173-1176), anticoagulants, antibodies, certain enzymatic activators of active substances (Springer et al., J. Clin.Invest, 105 (2000) 1161-1167), cancerotoxic molecules or hormones.
  • LAP Lac Activator Protein
  • HSV herpes virus
  • LAP is in particular capable of activating, in the absence of isopropyi ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG) a minimum early promoter of SV40, comprising, upstream or downstream of the transcription unit, the sequences of the lac operator, then that in the presence of IPTG, the activation of the promoter is inhibited (Labow et al., Mol.Cell.Biol., 10 (1990) 3343-3356).
  • Another system uses a tetracycline-controlled transactivating protein, which was constructed by fusion of the E. coli Tet repressor with the VP16 transactivating domain of HSV, so as in particular to activate, in the absence of tetracycline, the transcription of a minimum promoter comprising the sequences of the tet operator of response to tetracycline, this activation being able to be inhibited in the presence of tetracycline of one of its derivatives (Gossen et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89, (1992) 5547-5551 ; Gossen et al, Science, 268 (1995) 1766-1769).
  • the applicants have finally discovered that the transgene could not only be effectively inhibited by its antisense RNA, but also that it was possible to restore a level of biologically effective expression of the transgene, and thus to control the expression of the latter by l 'through its specific inhibitory antisense transcript.
  • the subject of the present invention is a new method of in vivo regulation of the expression of a transgene of interest which consists in:
  • nucleic acid comprising the sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, as well as a nucleic acid comprising the sequence of an inhibiting transgene coding for an inhibitor transcript specific for said transcript of interest, said sequences each being under the control of a transcriptional promoter, and the activity of the inhibitor transcript and / or of the transcript of interest can be regulated by an external agent,
  • an external agent known as a repressor is administered to the target tissue or cell, resulting in inhibiting the activity of the inhibitory transcript and thus restoring an activity of the transcript of interest, in proportion to the amount of external repressor used.
  • an external agent known as an activator is administered to the target tissue or cell, leading to increasing the activity of the transcript of interest.
  • an activity of the transcript of interest can be restored in proportion to the amount of the external activating agent used.
  • the subject of the present invention is also a method of in vivo transfer of a transgene of interest, consisting in co-administering and coexpressing in a target tissue or cell, a nucleic acid comprising the sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, as well as a nucleic acid comprising the sequence of a transgene inhibitor encoding a transcript specific inhibitor of said transcript of interest.
  • the expression of the transgene of interest or the activity of the transcript of interest is inhibited constitutively, and can be restored by inhibiting the activity of the inhibiting transcript by the administration of an external repressing agent, and / or by administering an external agent capable of leading to the induction of the activity of the transcript of interest.
  • the present invention also relates to a method intended to reduce the residual expression of a transgene of interest in vivo, which consists in coinjecting and coexpressing the sequences coding for the transcript of interest and for its specific inhibitory transcript.
  • the present invention further relates to a new combination administered in vivo and capable of being used in the method according to the invention.
  • This comprises a nucleic acid comprising the sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, and a nucleic acid comprising a sequence of an inhibitory transgene coding for a transcript inhibitor specific for the transcript of interest, each of the sequences being under the control of a transcriptional promoter, and the activity of the transcript of interest and / or of the inhibitory transcript can be regulated by an external agent.
  • transgene of interest means any exogenous nucleic acid molecule, coding for a biological product, namely either a transcript of interest or useful such as an mRNA, an rRNA, a tRNA, a ribozyme, or an aptazyme. , either a protein, a polypeptide, or a peptide of therapeutic or experimental interest.
  • the transgene of interest includes a gDNA, a cDNA, DNAs which are natural or which are obtained totally or partially by chemical synthesis.
  • transcript of interest or useful transcript an RNA produced by transcription from the transgene of interest as defined above.
  • the transcript of interest may be in the form of a MRNA and be translated into a therapeutic protein or peptide with intracellular or secreted action.
  • the transcript of interest or useful transcript may be in the form of an RNA having an intrinsic biological activity such as an aptazyme, a ribozyme, an antisense RNA, or an RNA capable of interacting with the constituents of the cells.
  • transfected such as, for example, a ribosomal RNA (rRNA), a transfer RNA (tRNA), or an aptamer.
  • inhibitory transgene is understood to mean any exogenous nucleic acid molecule capable of producing by transcription an inhibitory transcript having as target the transcript of interest.
  • the inhibitory transgene includes a gDNA, a cDNA, natural DNA or DNA obtained totally or partially by chemical synthesis.
  • RNA which may be in the form of an antisense RNA, a ribozyme, an RNA capable of forming a triple helix, and which has a certain complementarity or specificity with the transcript d 'interest.
  • the transcript is said to be an inhibitor insofar as it is capable of effectively and constitutively inhibiting the transcript of interest, with which it is coexpressed in the target tissue or cell, either at the translational level, by blocking the translation of the transcript from mRNA type interest, either at the level of its biological activity, by blocking the interaction of the transcript of interest rRNA, tRNA, or aptamer with the cellular constituents, or by blocking the interaction of the transcript of interest type aptazyme, ribozyme , or antisense RNA with a target nucleic sequence, either by decreasing the concentration of the transcript of interest by enzymatic degradation.
  • This inhibitory transcript is also said to be repressible, that is to say that it can itself be subject to inhibition by means of an external repressing agent.
  • the activity of the transcript of interest is understood to mean either its translation into a protein or a peptide of therapeutic or experimental interest, when the transcript of interest is in the form of an mRNA, or its biological activity when the transcript of the interest is in the form of an aptazyme, a ribozyme, or an antisense RNA, that is to say its interaction with the cellular constituents, when the transcript of interest is in the form of a ribosomal RNA, a transfer RNA, or an aptamer.
  • external agent is intended to mean any chemical, and preferably pharmacological, or physical agent such as heat, which can be administered by enteral or parenteral routes, having a low toxicity, and having an activity of inhibition or activation of expression d 'a gene.
  • One of the advantageous characteristics of the method of regulation by reversible inhibition according to the present invention lies in its capacity to effectively block constitutively the expression of a transgene of interest in vivo or the activity of the transcript of interest or useful, and to restore this expression when it is desired for clinical or experimental reasons.
  • This system is based on the coinjection and coexpression of a transgene of interest and its specific inhibitory transcript in vivo, and the possibility of effectively regulating the transgene of interest, either by inhibition of its specific inhibitory transcript, or by activation of the transcript of interest, or again by activation of the transcript of interest and concomitant inhibition of its specific inhibitory transcript.
  • the inhibitory transcript is inhibited by an external repressor, in order to lift the inhibition of the transcript of interest and to indirectly restore the activity of the transcript of interest or a sufficient biological level of the transcript of interest.
  • Inhibition of the inhibitory transcript can be obtained by placing the sequence of the inhibitory transgene encoding the inhibitory transcript under the control of a repressible promoter or sensitive to an external repressor.
  • a repressible promoter or sensitive to an external repressor.
  • This system uses the affinity of the tet repressor (tetR) for the tet operator sequence (tetO), the affinity of tetR for tetracycline, as well as the ubiquitous activity of the herpes virus VP16 transactivator in eukaryotic cells.
  • This TrRS regulatory system therefore works thanks to a chimeric transactivator (tTA) which results from the fusion of the C-terminal end of VP 6 with the C-terminal end of the tetR protein.
  • the tetR part of the tTA transactivator binds to a regulatory sequence comprising for example repeat sequences (2, 7, or 10 repetitions) of the tetracycline operator, and placed upstream of a transcriptional promoter minimum for example of human Cytomegalovirus (hCMV), and activates the transcription of the inhibitory transgene and the production of the inhibitory transcript, ensuring an effective constitutive inhibition of the transcript of interest.
  • a regulatory sequence comprising for example repeat sequences (2, 7, or 10 repetitions) of the tetracycline operator
  • tetracycline In the presence of tetracycline, it binds to the tetR part of the chimeric transactivator tTA, causes a change in its conformation as well as a loss of affinity for the repeated sequences of the operator of response to tetracycline (tetO). This then results in an inhibition of the production of the inhibitory transcript from the inhibitory transgene and the reestablishment of a level of expression of the transgene of interest or of the activity of the transcript of interest.
  • the regulatory sequences comprising the tetO repeat sequences are advantageously integrated within a tissue-specific enhancer / promoter or can be used to replace certain enhancer sequences (Rose et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 4735 -4739; Agha-Mohammadi et al, Gene Ther, 5 (1998) 76-84).
  • This system gives thus not only a temporal targeting of the regulation of the transgene of interest, but also spatial.
  • the coding sequence for the tTA transactivator and the TrRS promoter driving the transcription of the inhibitory transcript are carried on a single nucleic acid molecule.
  • the latter can comprise, for example, the sequence coding for tTA under the control of a viral or tissue-specific promoter, then the cassette of the promoter repressible by tetracycline (TrRS) operably linked with the sequence coding for the inhibitory transcript (O 'Brien et al., Gene, 184 (1997) 115-120).
  • An alternative organization of bicistronic type comprising the TrRS expression cassette operably linked to the sequence coding for an inhibitory transcript, followed by an IRES sequence (Internai Ribosome Entry Site) and a coding sequence for tTA, or vice versa, can also be used.
  • Yet another example of organization includes a bidirectional promoter which drives the expression of tTA and the inhibitory transcript. In the absence of tetracycline, tTA is expressed and activates the transcription of the inhibitory transgene into an inhibitory transcript, which in turn inhibits the useful or of interest transcript (Liang et al., Gene Ther., 3 (1996) 350- 356).
  • the external repressor used according to this first embodiment can be tetracycline or one of its analogs such as doxycycline, anhydrotetracycline, or oxytetracycline (Agha-Mohammadi et al., Gene Ther, 4 ( 1997) 993-997) likely to lead to an inhibition of the transcription of the inhibiting transgene, and therefore of the activity of the inhibiting transcript.
  • tetracycline or one of its analogs makes it possible to lift the inhibition by the inhibitory transcript and thus to restore a biologically effective level of the transcript of interest.
  • the level of expression of the transcript of interest can be advantageously correlated with the quantity of tetracycline or of the analog administered, insofar as the properties pharmacokinetics and pharmacodynamics of tetracycline and its analogs are well known to those skilled in the art, and are found, among others, in Vidal, and in the chapter "Antimicrobial Agents: Tetracyclines" in: Goodman and Gilaman's The Pharmacological Basis of Therapeutics , 9 th Ed., Jo ⁇ l G. Hardman, Alfred Goodman Gilamn, Lee E. Limbird Ed.
  • tetracycline or an analog thereof can be used at low concentrations and therefore the side effects are minimal.
  • the inhibitory transgene sequence is placed under the control of a minimal promoter derived from the promoter of the thymidine kinase (TK) gene or from human CMV upstream of which is a regulatory sequence as described in particular in WO96 / 30512.
  • TK thymidine kinase
  • the inhibition of the inhibitory transcript can also be obtained by insertion within its sequence or of its 5 ′ or 3 ′ ends, of specific sequences such as the aptamers which are described in European application EP 99402552, and by Werstuck et al. (Science 282 (1998) 296-298) and exhibit an autocatalytic activity preferably in the presence of a ligand.
  • the inhibitory transcript acquires an autocatalytic activity, which can be activated in the presence of a specific ligand, when it is desired to restore a transcript activity of interest.
  • the aptamer nucleotide sequence which is used to inhibit the inhibitory transcript can be any sequence encoding an RNA having ligand-dependent autocatalytic activity.
  • RNAse P any artificially obtained functional derivative sequence
  • the size of the aptamer sequence can vary according to its nature and origin, but is preferably between 20 and 200 bp.
  • RNA fold The location of the insertion of aptamer sequences is generally determined using bioinformatics software such as "RNA fold" in order to ensure optimal stability and cleavage activity depending on the environment and the conformation.
  • the inhibition of the inhibitory transcript can finally be carried out by means of a ribozyme acting in trans which, because of its sequence specificity for part of the inhibitory transcript, is capable of recognizing and of hybridizing with the inhibitory transcript , and thus to degrade it.
  • the trans ribozyme is in the form of an allosteric ribozyme, that is to say that it has an Iigand-dependent catalytic activity, which is notably activated in the presence of a ligand.
  • allosteric ribozymes are well known to those skilled in the art and are in particular described by Soukup et al. (Structure 7 (1999) 783-791) and in WO94 / 13791.
  • the activating ligands used are, for example, nucleic acids, proteins, polysaccharides or sugars, or any organic or inorganic molecule capable of binding to the aptamer sequence of the inhibitory transcript or to a sequence of the allosteric ribozyme by a recognition mechanism. molecular, and thus activate the catalytic activity (Famulok M, Curr Opin Struc Biol 9 (1999) 324-329). These are well known to those skilled in the art and are in particular described, inter alia, by Cowan et al. (Nucleic Acids Res. 28 (15) (2000) 2935-2942) and by Werstuck et al. (Science, 282 (1998), 296- 298).
  • antibiotics such as doxycycline, pefloxacin, tobramycin, kanamycin, dyes such as the dyes Hoechst H33258 and H33342, mononucleotides such as FMN (flavin mononucleotide), ATP, cAMP, drugs such as theophylline, adjuvants, and substitutes.
  • antibiotics such as doxycycline, pefloxacin, tobramycin, kanamycin
  • dyes such as the dyes Hoechst H33258 and H33342
  • mononucleotides such as FMN (flavin mononucleotide), ATP, cAMP
  • drugs such as theophylline, adjuvants, and substitutes.
  • the transgene of interest is placed under the control of a functional constitutive promoter in the target tissue or cells, mammals and preferably humans.
  • the constitutive promoter driving the expression of the transcript of interest is preferably tissue-specific.
  • the transcript of interest is activated, while the activity of the inhibitory transcript is either kept constant, or inhibited concomitantly with the activation of the transcript of interest, in order to restore a sufficient level of expression or biological activity of the latter.
  • Activation of the transcript of interest can be obtained by placing the sequence of the transgene of interest encoding the transcript of interest under the control of an inducible promoter.
  • the transcript of interest can also be activated by acting on the stability of the latter.
  • the activity of the inhibitory transcript can then be kept constant, and in this case, the inhibitory transgene is placed under the control of a constitutive promoter, and is not subjected to any inhibition via an aptamer or a ribozyme with cis or trans ligand-dependent catalytic activity.
  • the activity of the inhibitory transcript is repressed, as previously described, concomitantly with the activation of the transcript of interest.
  • the constitutive or inducible promoters used in these embodiments are well known to those skilled in the art. It can thus be any promoter or derived sequence of different origin, heterologous or homologous, tissue-specific or not, strong or weak, functional in the tissue or the target cells and therefore capable of directing the transcription of a sequence functionally linked.
  • promoter sequences of eukaryotic or viral genes Mention may in particular be made of the promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • ubiquitous promoters can be used in particular (promoter of the HPRT genes, of phosphoglycerate kinase (PGK), ⁇ -actin, tubulin, of histones), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc.), the promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR, Factor VIII, IX, ApoAl, ApoAII, Albumin, Thymidine kinase, etc.
  • tissue-specific promoters promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, smooth muscle ⁇ -actin, specific promoters of endothelial cells such as the promoter of von Willebrand factor, specific promoters of myeloid cell lines , and hematopoietic, such as the IgG promoter, the neuronal specific enolase promoter (Forss-Petter et al., Neuron, 5 (1990) 187); etc), the promoter generating the V1 form of VAChT mRNA (acetylcholine transporter; Cervini et al., J. Biol. Chem.
  • the functional promoters in a hyperproliferative cell such as the promoter of the p53 gene, the promoter of the transferrin receptor or else the promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor , retinoic acid receptor, etc.).
  • the external agents are specific transcriptional activating factors capable of binding in trans, either directly or through nuclear receptors, on a response element (RE) of the inducible promoter which directs the expression of the transcript of interest.
  • the rapamycin regulatory system can also be used (Rivera et al., Nat. Med. 2 (1996) 1028-1032).
  • This uses a bipartite transcription factor comprising two chimeric peptides of human origin, namely a first chimeric DNA binding protein ZFHD1-FKBP12 and a second chimeric protein which results from the fusion of the truncated FRAP cellular protein. and of a sequence of 189 amino acids at the C-terminal of the protein NF-kB65.
  • the protein ZFHD1-FKBP12 binds to the chimeric protein FRAP-p65 which activates the dependent ZFHD1 promoter.
  • inert analogs of rapamycin are used as activating agent, which can be administered, for example, orally or intravenously (Ye et al., Science, 283 ( 1999) 88-91).
  • the inducible prorhotrice sequence of the transgene of interest is as described in French application FR 99 07957 or by Frohnert et al. (J. Biol. Chem. 274 (1999) 3970-3977) and includes one or more response elements (PPRE) linked to a minimal transcriptional promoter.
  • PPRE response elements
  • This system for activating the expression of the transgene of interest works with the PPAR ⁇ or ⁇ nuclear receptors (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) as transcriptional regulators.
  • the retinoid X receptors such as human RXR ⁇ , which are capable of heterodimerizing with PPARs and thus of synergizing the activation of the transgene of interest, are used as transcriptional co-regulator (Mangelsdorf et al.
  • a PPAR ⁇ or ⁇ in its native form, without modification of primary structure or a modified PPAR comprising one or more ligand binding sites or E / F domains, preferably between 2 to 4 (Schoonjans et al., Biochim Biophys Acta 1302 (1996) 93-109).
  • the boundaries of the E / F domains vary from one PPAR to another.
  • the E / F domain extends from amino acid 284 to amino acid 505.
  • PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 a transcriptional regulator of the expression in vivo of transgene of interest
  • PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 a transcriptional regulator of the expression in vivo of transgene of interest
  • PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 a transcriptional regulator of the expression in vivo of transgene of interest
  • PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 a transcriptional regulator of the expression in vivo of transgene of interest
  • PPAR ⁇ 2 ⁇ 2 that is to say a modified human PPAR ⁇ comprising two repeated domains E and F, the complete protein sequence of which is represented in the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the PPAR response element which is therefore a nucleic acid region capable of fixing a PPAR, and thus mediating a transcription activation signal of the transgene of interest, can comprise one or more sites. of PPAR.
  • sites are described in the prior art, as for example in different human promoters such as the promoter of the human apolipoprotein AH (Apoll) gene (Vu-Dac et al., J Clin Invest, 96 (2), (1995), 741-750).
  • the activating ligands of PPAR ⁇ are used, for example fibrates such as fibric acid and its analogs.
  • fibrates such as fibric acid and its analogs.
  • analogs of fibric acid mention may be made in particular of gemfibrozyl (Atherosclerosis 114 (1) (1995) 61), bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), ciprofibrate (BCE & M 9 (4) (1995) 825), clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301), fenofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), clinofibrate (Kidney International.
  • the external activating agents can also be chosen from the natural and synthetic ligands of PPAR ⁇ .
  • natural ligands there may be mentioned fatty acids and eicosanoids such as, for example, linoleic acid, linolenic acid, 9-HODE, 5-HODE, and as synthetic ligands, thiazolidinediones, such as in particular, may be mentioned.
  • rosiglitazone (BRL49653), pioglitazone or troglitazone (see for example Krey G. et al., Mol. Endocrinol., 11 (1997) 779-791 or Kliewer S. and Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev. 8 (1998) 576-581) or the compound RG12525.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, such as for example the promoters of the E1A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, or also the promoter of the LTR of RSV or of the MMTV, the promoter of the TK gene of the herpes virus, etc.
  • these promoter regions can be modified by addition or deletion of sequences.
  • the system according to the present invention ensures faster activation and subsequent inhibition of the exogenous gene and effective. Indeed, the method according to the present invention allows simultaneously the de-induction of the useful transcript, to lift the inhibition of the inhibiting transcript, and thus to reduce, more quickly and to a greatly lowered residual level, the expression d 'a transgene of interest.
  • the inhibitory transcript is in the form of an antisense RNA, and is called an inhibitory transcript of the antisense RNA type.
  • the latter generally comprises a nucleotide sequence complementary to at least part of the transcript of interest, and hybridizes selectively to the transcripts of interest by conventional Watson-Crick type interactions.
  • the antisense RNA-type inhibitory transcript can therefore bind to the transcript of interest and for example block access to the cellular translation machinery at the 5 ′ end of the transcript of interest when the latter is an mRNA, hampering its translation. in protein, and allow the suppression of the expression of the transgene of interest in vivo (Kumar et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev, 62 (1993) 1415-1434).
  • Such polynucleotides have for example been described in patents EP 92574 and EP 140308.
  • the inhibitory transcript When the inhibitory transcript is of the antisense RNA type, it can cover all or part of the coding sequence of the transcript of interest of mRNA type, or all or part of the non-coding sequence in 3 ′ or 5 ′.
  • the antisense inhibitory transcript is complementary to the ribosome binding and translation initiation sequence (Coleman J et al., Nature 315 (1990) 601-603).
  • the inhibitory transcript is at least 10 ribonucleotides in length.
  • the determination of the length and the sequence of the nucleic acid coding for the inhibitory transcript can be carried out by routine experimentation consisting in coinjecting and coexpressing the nucleic acids coding for the inhibitory transcript and for the transcript of interest, and to verify effective inhibition by various detection techniques known to those skilled in the art such as RT-PCR, the various assay techniques for the protein of interest, and detection on Western blot.
  • the nucleic acids coding for the transcript of interest and for the antisense inhibitory transcript advantageously comprise the signals allowing the transcription to be stopped as well as signals allowing its stabilization such as for example a 5 'cap and a polyadenylation site. in 3 ', and possibly an intron.
  • the antisense RNA-type inhibitory transcripts which are coexpressed with the transgene of interest in a tissue or target cells, are thus capable of effectively blocking the expression of the transgene of interest at the level translational, or the biological activity of the transcript of interest at the level of the target tissue or cells.
  • the inhibitory transcript can also be in the form of a catalytic RNA or ribozyme targeting the transcript of interest, and is designated an inhibitory transcript of the ribozyme type.
  • the ribozyme may for example be a cis ribozyme, that is to say acting at the intracellular level in cis (Cech TR, Biosci Rep, 10 (3) (1990), 239-261).
  • it is a trans ribozyme, that is to say capable of degrading several transcripts of interest into trans (Robertson et al., Nature 344 (1990) 467; Ellington et al.
  • the ribozyme inhibitory transcript generally has two distinct regions. A first region which has a certain specificity for the transcript of interest and is therefore capable of binding to the latter, while the second region confers on the ribozyme its catalytic activity of cleavage, ligation and splicing of the transcript of interest.
  • ribozymes can be used, such as hammerhead or circular ribozymes, hairpin ribozymes, lasso ribozymes, tetrahymena ribozymes, or RNAse P (Clouet- d'Orval B. et al. , Biochemistry, 34 (1995) 11186-90; Olive JE et al., EMBO J, 14 (1995) 3247-51; Rogers et al. J Mol Biol, 259 (1996), 916-25).
  • the ribozyme-type inhibitory transcript is allosteric, that is to say that its catalytic activity is regulated by a ligand (Szostak, TIBS, 10 (1992) 89).
  • Some allosteric ribozymes exhibit spontaneous target RNA cleavage activity, while others are activated or inhibited following a change in conformation or following a hybridization reaction.
  • Other allosteric ribozymes called aptazymes are endowed with a ligand-dependent autocleavage activity which is preferably activated by the binding of a ligand.
  • Such regulatable ribozymes which are described inter alia in international applications WO 94/13791 and WO96 / 21730, and generally have a ribozyme sequence as well as a ligand binding sequence which ensures the control of the cleavage activity.
  • the ribozyme-type inhibitory transcript used in the present invention is preferably inactivated by the binding of a ligand, that is to say that it exerts a constitutive catalytic activity against the transcript of interest in the absence of ligand, and can be inactivated by the administration of a ligand, in order to restore a biologically sufficient level of the transcript of interest. (Forter et al., Science, 249 (1990) 783-786).
  • the size of the ribozyme inhibitor transcript can vary depending on its nature and / or origin. It is generally between 10 and 500 base pairs, and preferably below 300 base pairs.
  • the nucleic acid coding for the inhibitor ribozyme transcript can, in particular, come from RNA sequences of natural origin or be obtained by chemical synthesis, for example using an automatic synthesizer.
  • the ligands used for the regulation of allosteric ribozymes are for example nucleic acids, proteins, polysaccharides or sugars, or any organic or inorganic molecules capable of binding to the ribozyme inhibitory transcript and of inhibiting the cleavage reaction of the transcript of interest, or else to bind to the inhibitory transcript aptazyme, and thus to activate the autocleavage reaction.
  • the ligand is an external agent such as a non-toxic agent or drug which can be administered in vivo by various external routes, and thus act at the level of the target cell or tissue in order to inhibit the allosteric ribozyme, and to restore sufficient concentration and activity of the transcript of interest. It is preferably an antibiotic such as tetracycline, doxycycline, or pefloxacin, or an adjuvant harmless to the organism to which it is administered.
  • the inhibitory ribozyme transcripts which are coexpressed with the transgene of interest in a tissue or target cells, are thus capable of effectively blocking the expression of the transgene of interest at the translational level.
  • the concentration of the transcript of interest by enzymatic degradation of the nuclease, transferase, and polymerase type, the biological activity of the transcript of interest at the level of the tissue or of the target cells, or else its interaction with the cellular constituents.
  • the inhibitory transcript is in the form of RNA forming triples helices, and capable of associating with the transgene of interest or transcript of interest with which it is coexpressed in vivo.
  • RNA is described inter alia, in application WO95 / 18223, by Giovannangeli et al., (J. Am. Chem. Soc, 113 (1991) 7775-7) and by Hélène et al. (CibaFound Symp. 209 (1997), 84-102).
  • composite RNAs comprising at least:
  • a first region capable of forming a double helix with the target single-stranded nucleic acid at the level of the sequence of the transgene of interest or with a part of it.
  • each of the regions can be continuous or interrupted.
  • the polynucleotide according to this particular embodiment has a length greater than 10 bases, and, more preferably, greater than 15 bases.
  • This length is adapted by a person skilled in the art as a function of the length of the nucleic acid of the targeted single-stranded transgene of interest or of the transcript of interest, so as to ensure the stability, the specificity and the selectivity of the transcribed inhibitor triple helix.
  • the method according to the present invention allows the transfer of foreign or exogenous genes and the control of their expression in an efficient and reversible manner.
  • This is advantageous when the therapeutic product of the transgene of interest has an optimal action within a certain well defined concentration range and becomes toxic outside this concentration range (Dranoff et al. Proc. Natl.Acad.Sci. (1993) 3539-3543; Schmidt et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 92 (1995) 4711-4714; Naffakh et al., Mol. Med. Today, 2 (1996) 343-348).
  • certain clinical applications require precise regulation of the expression of the transgene of interest at predefined biological or therapeutic levels, in order to optimize its activity in vivo.
  • the reversible negative regulation method according to the present invention is particularly useful when the expression of a transgene of interest or the activity of the transcript of interest must be kept to a minimum, or even even extinguished for long periods. and that rapid induction is required at specific times, whether for therapeutic or experimental needs.
  • the method for controlling the expression of an exogenous gene by reversible inhibition makes it possible to control the expression of any transgene having an experimental interest whose function is to be studied in vivo, the implication in molecular mechanisms or in cell signaling such as for example receptors, transcription factors, transporters, etc., or any transgene of interest coding in particular for a product of therapeutic interest, whether it is a peptide, polypeptide , protein, ribonucleic acid, etc.
  • the transgene of interest is a DNA sequence (cDNA, gDNA, synthetic DNA, human, animal, plant, etc.) coding for a protein product.
  • the transcript of interest can be an antisense sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can for example be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the transcript of interest can also be an RNA ligand (WO91 / 19813).
  • the present invention is particularly suitable for the expression of sequences coding for toxic factors. It may in particular be poisons for cells (diphtheria toxin, pseudomonas toxin, ricin A, etc.) of product inducing sensitivity to an external agent (suicide genes: Thymidine kinase, cytosine deaminase, etc.) or of genes capable of inducing cell death (Grb3 -3) (WO96 / 07981), anti-ras ScFv (W094 / 29446), etc).
  • This system is therefore particularly suitable for antitumor therapy strategies for example, for the expression of cytokines, interferons, TNF or TGF for example, the uncontrolled production of which can have very marked side effects.
  • This system is also particularly suitable for gene therapy strategies such as angiogenesis using a gene for a growth factor such as for example FGF or VEGF. It is suitable for controlling the expression of hormones such as erythropoietin or anti-cytokines such as the soluble TNF- ⁇ receptor used for the purposes of anti-inflammatory therapies.
  • hormones such as erythropoietin or anti-cytokines such as the soluble TNF- ⁇ receptor used for the purposes of anti-inflammatory therapies.
  • the combination of the nucleic acid comprising the sequence of the transgene of interest coding for the transcript of interest and the nucleic acid comprising the sequence coding for the inhibitory transcript is transferred simultaneously into the tissue or target cell to allow their coexpression.
  • Different physical or mechanical techniques exist for carrying out the transfer of these nucleic acids, such as for example injection, ballistic technique, electroporation, electropermeabilization, electrotransfer, sonoporation, techniques using electric fields, microwave, heat, hydrostatic pressure, or any suitable combination of these techniques (Budker et al., J. Gen. Medicine, 2 (2000) 76-88).
  • the association of nucleic acids is introduced by injection and electrotransfer, that is to say by the action of an electric field.
  • the electrotransfer technique is described in particular in applications WO99 / 01 57 and WO99 / 01158 and by Aihara et al., Nat. Biotechnol. 16 (9) (1998) 867-870; Mir et al., Proc. Natl. Acad. Sc, 96 (1999), 4262-4267; Rizzuto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96 (1999) 6417-6422.
  • the nucleic acid molecules which it is desired to transfer can be administered, for example, directly into the tissue or topically or systemically, then one or more electrical pulses of an intensity between 1 and 800 volts / cm, of preferably between 20 and 200 Volts / cm are applied.
  • the combination of nucleic acids according to the present invention can be injected in the form of naked DNA according to the technique described in application WO 90/11092. It can also be administered in complex form with a chemical or biochemical agent.
  • a chemical or biochemical agent mention may, for example, be made of lipofectamine, which associates with DNA by forming vesicles called lipoplexes, as well as other polymers such as DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • the nucleic acids can also be incorporated into lipids in raw form (Felgner et al., PNAS, 84 (1987) 7413) or even be incorporated into a vector such as a liposome (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) or a nanoparticle.
  • Liposomes are phospholipid vesicles with an internal aqueous phase in which nucleic acids can be encapsulated.
  • the synthesis of liposomes and their use for the transfer of nucleic acids is known in the prior art (WO91 / 06309, WO92 / 19752, WO92 / 19730).
  • Nanoparticles are small particles, generally less than 500 nm, capable of transporting or vectorizing an active ingredient (such as a nucleic acid) in cells or in the bloodstream.
  • the nanoparticles can consist of polymers comprising a majority of degradable units such as polylactic acid, optionally copolymerized with polyethylene glycol.
  • Other polymers which can be used in the production of nanoparticles have been described in the prior art (EP 275,796; EP 520,889).
  • nucleic acids which comprise a nucleic acid comprising the sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, as well as a nucleic acid comprising the sequence of a inhibitory transgene encoding a specific inhibitory transcript of the transcript of interest.
  • the nucleic acids can be carried by the same vector or by separate vectors. When they are carried on the same vector, they are preferably carried on the same strand.
  • the vector used can be of various origins, since it is capable of transforming plant and animal cells, and preferably human cells. It can also be a non-viral vector such as a plasmid, an episome, a cosmid, an artificial chromosome, or a viral vector.
  • a viral vector is used, which can be chosen from adenoviruses, retroviruses, adeno-associated viruses (AAV), herpes virus, cytomegalovirus, vaccinia virus, etc. It can also be a phage, an invasive bacteria or a parasite.
  • Vectors derived from adenoviruses, retroviruses, or AAVs incorporating heterologous nucleic acid sequences have been described in the literature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185,573; Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gai la Salle et al., Science, 259 (1993) 988; Roemer and Friedmann, Eur. J. Biochem, 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron, 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91 / 18088).
  • the recombinant virus according to the invention is a defective virus.
  • the term "defective virus” refers to a virus incapable of replicating in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the double-stranded nucleic acid sequence of the invention.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • the method according to the present invention uses in particular viral vectors containing the nucleic sequences of a transgene of interest and of the specific inhibitory transgene, without toxicity for the production cells, then then of inducing the expression of these toxic molecules selectively in target cells by dealing with the repressor.
  • the invention can be used to regulate the expression of a transgene of interest in different types of cells, tissues, or organs, in vivo.
  • it may be a cell, a tissue, or an organ of plant or animal origin, preferably mammalian, and even more preferably of human origin.
  • muscle cells or a muscle
  • hepatic cells or the liver
  • cardiac or heart, arterial or vascular wall
  • nerve or brain, marrow, etc.
  • tumor or tumor
  • the compositions, constructions and method according to the invention are used for the regulated expression of a transgene of interest in a muscle cell or a muscle in vivo.
  • the results presented in the examples particularly illustrate the advantages of the invention in vivo in this type of cells.
  • tissue of animal or vegetable origin capable of being obtained by the method as described above, and comprising a nucleic acid comprising the sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest, and a nucleic acid comprising the sequence of an inhibitory transgene coding for an inhibitory transcript specific for the transcript of interest.
  • the tissues according to the present invention are preferably tissues of animal or vegetable origin which are reconstituted ex vivo, to give, for example, organoids or neorganoids, the cells of which have been modified so as to express the biological product of the transgene of interest according to the control method of the present invention, and which can thus be reimplanted (Vandenburgh et al., Hum. Gen Ther. 9 (17) (1998) 2555-2564; Powell et al. Hum Gen Ther, 10 (4 ), (1999) 565-577; MacColl et al., J. Endochnol, 162 (1) (1999) 1-9).
  • compositions which can be administered in vivo comprising the nucleic sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful, the nucleic sequence of an inhibitory transgene coding for a inhibitory transcript specific to the transcript of interest, and an appropriate vehicle.
  • the present invention also relates to a composition which can be administered in vivo comprising at least one vector comprising the nucleic sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, the nucleic acid sequence of an inhibitory transgene coding for an inhibitory transcript specific for said transcript of interest, and an appropriate vehicle, the transcripts of interest and inhibitors being capable of being activated or inhibited by an agent external.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition intended for administration in vivo comprising at least one vector comprising the nucleic sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, and of a nucleic acid coding for an inhibitory transcript specific for said transcript of interest, and an appropriate vehicle, the transcripts of interest and inhibitors being capable of being activated or inhibited by an external agent.
  • the present invention also relates to a medicament comprising at least one vector comprising the nucleic sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest or useful transcript, the nucleic sequence of an inhibitory transgene coding for a specific inhibitory transcript of said transcript of interest, and an appropriate vehicle, the transcripts of interest and inhibitors being capable of being activated or inhibited by an external agent.
  • any vehicle suitable for administration for example by the topical, cutaneous, oral, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. route, is used.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle is used for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for any other administration.
  • injectable formulations in particular for a direct injection into the desired organ, or for any other administration.
  • They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • Concentrations of nucleic acids, including sequences of the transgene of interest coding for the transcript of interest and of the inhibitory transgene coding for the inhibitory transcript, used for the injection as well as the number of administrations and the volume of the injections can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the transgene of interest whose expression is to be regulated, or also according to the duration of the treatment sought.
  • transgenes of interest within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly the genes coding for - enzymes, such as ⁇ -1-antitrypsin, proteinases (metalloproteinases, urokinase, uPA, tPA, and streptokinase), proteases cleaving precursors to release active products (ACE, ICE) or their antagonists (T1MP-1, tissue plasminogen activator inhibitor PAI, TFPI);
  • ⁇ -1-antitrypsin proteinases (metalloproteinases, urokinase, uPA, tPA, and streptokinase), proteases cleaving precursors to release active products (ACE, ICE) or their antagonists (T1MP-1, tissue plasminogen activator inhibitor PAI, TFPI);
  • - blood derivatives such as the factors involved in coagulation: factors VII, VIII, IX, complement factors, thrombin;
  • hormones or the enzymes involved in the pathway for the synthesis of hormones, or the factors involved in controlling the synthesis or excretion or secretion of hormones, such as insulin, factors close to the insulin (IGF), or growth hormone, ACTH, enzymes that synthesize sex hormones;
  • - lymphokines and cytokines interleukins, chemokines (CXC and CC), interferons, TNF, TGF, chemotactic factors or activators such as M IF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin, LIF, etc. (French patent FR 2,688,514);
  • growth factors for example IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin;
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF vascular endothelial growth factor
  • angiopoietin 1 or 2 endothelin
  • neurotrophic factors in particular neurotrophic factors for the treatment of neurodegenerative diseases, traumas which have damaged the nervous system, or retinal degenerations, such as members of the neurotrophin family such as NGF, BDNF, NT3, NT4 / 5, NT6 their derivatives and related genes - members of the CNTF family such as CNTF, axokine, LIF and their derivatives - the IL6 and its derivatives - cardiotrophin and its derivatives - GDNF and its derivatives - members of the IGF family, such as IGF-1, PIFGF-2 and their derivatives - members of the FGF family, such as FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and their derivatives, TGF ⁇ ;
  • members of the neurotrophin family such as NGF, BDNF, NT3, NT4 / 5, NT6 their derivatives and related genes - members of the CNTF family such as CNTF, axokine, LIF and their derivatives - the IL6 and its derivatives
  • hematopoietic factors such as erythropoietin, GM-CSF, M-CSF, LIF, etc. ;
  • - cell architecture proteins such as dystrophin or a minidystrophin (French patent FR 2 681 786), suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase, cytochrome P450 enzymes), hemoglobin genes or other transporters protein; the genes corresponding to the proteins involved in lipid metabolism, of the apolipoprotein type chosen from the apolipoproteins Al, A-II, A-IV, B, Cl, C-ll, C-III, D, E, F, G, H, J and apo (a), metabolism enzymes such as, for example, lipases, lipoprotein lipase, hepatic lipase, lecithin cholesterol acyltransferase, 7 alpha cholesterol hydroxylase, phosphatidyl acid phosphatase, or also transfer protein lipids such as the cholesterol ester transfer protein and the phospholipid transfer protein, an HDL binding protein or a receptor chosen for example from LDL receptors,
  • factors regulating blood pressure such as the enzymes involved in the metabolism of NO, angiotensin, bradykinin, vasopressin, FACE, renin, enzymes coding for the mechanisms of synthesis or release of prostaglandins, thromboxane, or of fadenosine, fadenosine receptors, kallikreins and kallistatins, ANP, ANF, diuretic or antidiuretic factors, the factors involved in the synthesis, metabolism or release of mediators such as histamine, serotonin, cathecholamines, neuropeptides;
  • anti-angiogenic factors such as the ligand of Tie-1 and Tie-2, Fangiostatin, factor ATF, plasminogen derivatives, Fendothelin, thrombospondins 1 and 2, PF-4, Finterferon ⁇ or ⁇ , Finterieukine 12 , TNF ⁇ , the Furokinase receptor, fltl, KDR, PAU, PAI2, TIMP1, the prolactin fragment;
  • proteins capable of inducing cell death either active in themselves such as caspases, or of the "pro-drug” type requiring activation by other factors, or proteins activating prodrugs as an agent causing cell death , such as thymidine kinase from the herpes virus, deaminases, making it possible in particular to envisage anticancer therapies;
  • proteins involved in inter-cellular contacts and adhesion VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, integrins, catheni ⁇ es;
  • - transcription factors jun, fos, AP1, p53 and the proteins of the signaling cascade of p53;
  • - cell structure proteins such as intermediate filaments (vimentin, desmin, keratins), dystrophin, proteins involved in contractility and control of muscle contractility, in particular proteins involved in calcium metabolism and fluxes of calcium in cells (SERCA).
  • ligand for example FGF or VEGF
  • FGF-R for example FGF or VEGF
  • VEGF-R for example FGF or VEGF
  • the transgenes of interest coding for proteins or peptides written by the tissue it is important to underline the antibodies, the variable fragments of single chain antibody (ScFv) or any other fragment of antibody having recognition capacities.
  • ScFv single chain antibody
  • for its use in immunotherapy for example for the treatment of infectious diseases, tumors, autoimmune diseases such as multiple sclerosis (antiidiotype antibody), as well as the ScFv binding to the pro-inflammatory cytokines such as for example IL1 and TNF ⁇ for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • transgenes of interest used in the medicament according to the invention code, without limitation, for soluble receptors, such as for example the soluble CD4 receptor or the soluble TNF receptor for anti-HIV therapy, the TNF ⁇ receptor or the soluble IL1 receptor for the treatment of rheumatoid arthritis, the soluble acetylcholine receptor for the treatment of myasthenia gravis; peptides substrates or inhibitors of enzymes, or peptides agonists or antagonists of receptors or adhesion proteins such as for example for the treatment of asthma, thrombosis of restenosis, metastases or inflammation; artificial, chimeric or truncated proteins.
  • soluble receptors such as for example the soluble CD4 receptor or the soluble TNF receptor for anti-HIV therapy, the TNF ⁇ receptor or the soluble IL1 receptor for the treatment of rheumatoid arthritis, the soluble acetylcholine receptor for the treatment of myasthenia gravis
  • insulin in the case of diabetes, growth hormone and calcitonin. Mention may also be made of proteins capable of inducing anti-tumor immunity or stimulating the immune response (IL2, GM-CSF, IL12, etc.). Finally, mention may be made of cytokines which decrease the Tm response such as IL10, IL4 and IL13.
  • transgenes of interest can also be used in the compositions and the medicaments according to the present invention have been described in particular by McKusick, VA Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. edition, John Hopkins University Press (1988)), and in Stanbury, JB et al. (The metabolic basis of inherited disease, Fifth Edition. McGraw-Hill (1983)).
  • the transgenes of interest cover the proteins involved in the metabolism of amino acids, lipids and other constituents of the cell.
  • carbohydrates such as, for example, fructose-1-phosphate aldolase, fructose-1,6-diphosphat
  • lysosomal deficiencies such as lysosomal ⁇ -L-iduronidase, lysosomal iduronate sulfatase, heparan lysosomal N-sulfatase, N-acetayl- ⁇ -D-lysosomal glucosaminidase, acetyl-CoA: ⁇ -glucosamine N-acetyl lysosomal, N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine 6-lysosomal sulfatase, galactosamine 6-sulfate lysosomal sulfatase, lysosomal ⁇ -galactosidase, lysosomal arylsulfatase B, ⁇ -glucuronidase lysosomal, N-acetylglososylamidosidylsucosaminylase.
  • lysosomal ⁇ -neuraminidase lysosomal aspartylglycosaminidase, lysosomal ⁇ -L-fucosidase, lysosomal acid lipase, lysosomal acid ceramidase, lysosomal sphingomyelinase, lysosomal glucocerebrosidase and galactocerebrosidase lysosomiasis galactosidease.
  • lysosomal arylsulfatase A ⁇ -galactosidase A
  • ⁇ -galactosidase lysosomal acid ⁇ chain of lysosomal hexosaminidase A.
  • the present invention also relates to the use of the combination as described above for the preparation of a medicament intended for the treatment of certain genetic abnormalities or deficiencies, such as for example mitochondrial genetic diseases, hemophilia, and the ⁇ -thalassemia.
  • the combination according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of certain diseases such as for example ischemia, stenosis, myopathies , neurodegenerative diseases, metabolic diseases such as lysosomal diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, hormonal disorders such as diabetes, cardiovascular diseases such as hypertension, hyperlipidemias such as obesity.
  • certain diseases such as for example ischemia, stenosis, myopathies , neurodegenerative diseases, metabolic diseases such as lysosomal diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, hormonal disorders such as diabetes, cardiovascular diseases such as hypertension, hyperlipidemias such as obesity.
  • Another subject of the present invention is the use of the combination as described above for the preparation of an anticancer drug, or for the preparation of vaccines, for example anti-tumor DNA.
  • vaccines for example anti-tumor DNA.
  • transgenic animals which express a transgene of interest coding for or transcript of interest as well as an inhibitory transgene coding for a specific inhibitory transcript of the transcript of interest in one or more cell types.
  • the methods for generating transgenic animals, particularly transgenic mice, are now well known to those skilled in the art, and are in particular described by Hogan et al. (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory.
  • the nucleic acids previously described are transferred into non-human fertilized oocytes by microinjection, by implanting the oocyte in a carrier female, so that it develops.
  • the nucleic acids are integrated into the genome of the cell from which the transgenic animal develops and remain in the genome of the adult animal, so that an expression of the transgene of interest and of the inhibitory transgene in one or more cells or tissues of the transgenic animal can be observed.
  • Transgenic animals carrying the nucleic acid sequences of the transgene of interest and the inhibitory transgene can also be crossed with other transgenic animals carrying other transgenes.
  • transgenic animals thus produced, there may be mentioned for example a mouse, a goat, a sheep, a pig, a cow or any other domestic animal.
  • Such transgenic animals have a phenotype similar to wild animals, however the transgene or transcript of interest is restored when an external agent repressing the inhibitory transcript and / or an activating agent is administered to the animal. of the transcript of interest.
  • These transgenic animals are used to simulate the pathophysiology of certain human or animal diseases and therefore constitute experimental models of human or animal diseases.
  • the transgene of interest likely to be involved in a pathology can be cointroduced with its specific inhibitory transgene, without causing the appearance of a particular phenotype.
  • the expression of the transgene of interest studied can then be modulated by the administration of an external agent repressing the inhibiting transcript, and / or an external agent activating the transcript of interest, in order to determine the relationship which exists between the expression of this gene and the appearance of a pathological phenotype.
  • an external agent repressing the inhibiting transcript, and / or an external agent activating the transcript of interest, in order to determine the relationship which exists between the expression of this gene and the appearance of a pathological phenotype.
  • a final aspect of the present invention relates to plant cells and transgenic plants comprising in their genome a nucleic acid comprising the sequence of a transgene of interest coding for a transcript of interest and a nucleic acid comprising the sequence of an inhibitory transgene coding for an inhibitory transcript specific for the transcript of interest.
  • These plants can be obtained by the usual techniques of plant transgenesis. Plasmids carrying the nucleic acids coding for the transgene or the transcript of interest and for the inhibitory transcript placed under the control of transcription promoters which are naturally functional in plants are introduced for example into a strain of Agrobacterium tumefaciens. Plant transformation can then be performed using standard transformation and regeneration protocols (Deblaere et al., Nucleic Acid Research 13 (1985) 4777-4788; Dinant et al., European Journal of Plant Pathology 104 (1998) 377-382).
  • Constitutive promoters can be used, such as, for example, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (Odell et al., Nature 313 (1985) 810-812).
  • inducible promoters can be used, such as promoters inducible by glucocorticoids which is activated inter alia by dexamethasone (Aoyama et al., Plant J.
  • this regulatory system has a high basal level in the non-activated state, when it is used to drive the expression of a transgene of interest in coexpression with an inhibitory transcript thereof, according to the present invention, the basal level of the transgene of interest is greatly lowered.
  • a foreign cytotoxic or even lethal gene can be expressed in a punctual manner over a short period of time without inhibiting the regeneration of the transduced plant and by limiting cell death.
  • This reversible inhibition system for the expression of the transgene of interest is therefore extremely useful for certain applications. of plant production biotechnology and in the context of basic agricultural research.
  • the present invention is particularly useful for the study of genes whose overexpression or even basic expression has deleterious effects for the organism in which they are expressed.
  • an uncontrolled production of cytokines in a plant causes, for example, the appearance of abnormal phenotypes during development such as the absence of root, loss of apical dominance, sterility, or cellular toxicity. which blocks in the case of plants the regeneration of plant tissues or even leads to lethality problems.
  • the reversible inhibition method according to the present invention of exogenous genes may also prove useful for studying the stability of the product of the transgene of interest (Gil et al., EMBO J., 15 (1996), 1678 -1686), or the evaluation of the turnover of the product of an exogenous gene.
  • transgenic plants according to the present invention carrying the constructs of the transgene of interest coding for a transcript of interest and of the inhibitory transgene coding for a specific inhibitory transcript of the transcript of interest, according to the present invention, can also be used for the study. of certain molecular mechanisms and gene interactions. In fact, when the expression of certain genes leads to cell death, the transgenic lines carrying both the sequences of the transgene of lethal interest and of its inhibitory transcript can be used to isolate the mutants which make it possible to study by following the molecular interactions and mechanisms of cell death.
  • the system according to the present invention facilitates the functional analysis of certain genes and their intervention in the appearance of a phenotype, as well as their possible implications in certain signal transduction pathways.
  • the method according to the invention makes it possible to facilitate the study of plant genes which are capable of affecting the development of the plant in the early stages, but can play a role in later stages of development. Mutations in these genes affect the development of the plant, and therefore prevent the study of possible late functions of these genes. Plants transformed with the sequence carrying the transgene of interest and its inhibitory transcript can follow normal early development, and the administration of an appropriate external agent at a later stage of development advantageously makes it possible to restore the expression of the genes in question. and determine their late functions.
  • the plant chimeras according to the invention are therefore capable of providing new information, for example on the signaling mechanisms in plants.
  • Figures 1A to 1E Schematic representations of the plasmids pXL3031 (fig. 1A), pXL3010 (fig. 1B), pSeAPantisens (fig. 1C), pXL3296 (fig. 1D), and pLucAntisens (fig. 1E).
  • Figures 2A to 2E Schematic representations of the plasmids pTet-Splice (fig. 2A), pTetLucAntisens (fig. 2B), pTetLuc (fig. 2C), pTetSeAPantisens (fig. 2D) and pTet-tTAk (fig. 2E).
  • Figures 3A to 3D Schematic representations of the plasmids pGJA1 (fig.3A), pGJA2 (fig. 3B), pGJA3 (fig.3C) and pGJA9 (fig. 3D).
  • Figures 4A to 4D Schematic representations of the plasmids pGJA15-2 (fig.4A), pGJA15 (fig.4B), pGJA14 (fig 4C) and pGJA14-2 (fig.4D).
  • Figures 5A and 5B Schematic representations of the plasmids pRDA02 (5B) and pSG5-hPPAR ⁇ 2 (5A).
  • Figures 6A and 6B Schematic representation of the plasmids pIND (6A), pINDSeAP (6B), and PVgRXR.
  • Figure 8 shows a photograph of an electrophoresis gel illustrating the presence of sense and antisense RNA by RT-PCR in vitro.
  • Tracks 1 and 9 100 base pair marker (Gibco BRL)
  • Lane 2 PCR control using the plasmid pXL3010 as template.
  • Lane 3 RT-PCR on the total RNA extracted from the cells transfected with 0.25 ⁇ g of pXL3010 + 0.75 ⁇ g pXL3296.
  • Lane 4 RT-PCR on the RNA extracted from cells transfected with 0.25 ⁇ g of pXL3010 + 0.25 ⁇ g pSeAPantisens + 0.50 ⁇ g pXL3296.
  • Lane 5 RT-PCR on RNA extracted from cells transfected with
  • Tracks 6 to 8 PCR controls (without RT) carried out on the RNAs used in 3, 4 and 5 respectively.
  • Figure 9A illustrates the SeAP activities in vitro measured 24 hours after cotransfection of the following sets of plasmids: condition 1: 25% pXL3010 + 75% pXL3296 condition 3: 25% pXL3010 + 25% pSeAPantisens + 50% pXL3296 condition 5: 25% pXL3010 + 25% pLucAntisens + 50% pXL3296
  • Figure 9B illustrates the relative luciferase activities, measured 24 h following independent in vitro transfections of the following sets of plasmids: condition 2: 25% pXL3031 + 75% pXL3296 condition 4: 25% pXL3031 + 25% pLucantisens + 50% pXL3296 condition 6: 25% pXL3031 + 25% pSeAPantisens + 50% pXL3296
  • Figure 10 illustrates the relative levels of circulating SeAP measured after bilateral intramuscular injections in the cranial tibial skeletal muscle and electrotransfer of plasmids coding for the sense sequence (pXL3010) and the antisense sequence (pSeAPantisens) of the reporter gene for SeAP, ie simultaneously (lot 2) or 22 days apart (lot 1).
  • Lot 1 10 mice injected with 30 ⁇ g of plasmid pXL3010 + electrotransfer, then injection of 30 ⁇ g of pSeAPantisens + electrotransfer (2nd injection on day 22); Lot 2: 10 mice coinjected with 30 ⁇ g of a plasmid pXL3010 + 30 ⁇ g of a plasmid pSeAPantisens + electrotransfer (coinjection); Lot 3: 10 mice injected with 30 ⁇ g of a plasmid pSeAPantisens + electrotransfer (control group).
  • FIG. 11 A represents a photograph of an electrophoresis gel illustrating the presence of sense and antisense RNA of the reporter gene SeAP by
  • Lanes 1 and 13 100 bp DNA marker (Gibco); Tracks 2 and 3: sense and antisense RNA respectively, in muscles of lot 1 mice (pXL3010 then re-injection of pSeAPantisens 22 days later);
  • Lanes 4 and 5 sense and antisense RNA, respectively, in muscles of lot 2 mice (coinjection of pXL3010 and pSeAPantisens); Lanes 6 and 7: sense and antisense RNA, respectively, in muscles of lot 3 mice (pSeAPantisens only);
  • Lanes 8 to 10 PCR controls without RT of the RNAs used in lanes 2 to
  • Lane 11 control: PCR using the plasmid pXL3010 as template; Lane 12: plasmid pXL3010.
  • FIG. 11B represents a photograph of an autoradiography film obtained by transfer and hybridization on a nitroceliulose membrane of the agarose gel photographed in FIG. 11A in the presence of probe oligonucleotides labeled with 32 P specific for the sense sequence of the reporter gene SeAP (S) and the antisense sequence (AS).
  • S reporter gene
  • AS antisense sequence
  • Figure 12 Monitoring of the relative activity of circulating SeAP in the plasma of mice after bilateral intramuscular injections in the cranial tibial skeletal muscle and electrotransfer of the following plasmids at the time intervals described below: Lot 1: 10 mice injected with 15 ⁇ g of plasmid pXL3010 + electrotransfer;
  • Figure 13 Monitoring of the relative activity of circulating SeAP in the plasma of mice after coinjection and electrotransfer (ET) of the following plasmids: Lot 1: 9 mice injected with 30 ⁇ g of plasmid pXL3010 + ET; Lot 2: 9 mice injected with 30 ⁇ g of plasmid pXL3010 + ET; Lot 3: 9 mice coinjected with 30 ⁇ g of plasmid pXL3010 + 30 ⁇ g of pSeAPantisens + ET;
  • Lot 4 9 mice injected with 30 ⁇ g of plasmid pXL3010 + ET; Lot 5: 9 mice injected with 30 ⁇ g of plasmid pXL3010 + ET;
  • Figure 14A Relative activities of SeAP in vitro measured after transfection of NIH3T3 cells with the following plasmids with or without subsequent treatment with tetracycline:
  • Figure 14B Relative activities of SeAP in vitro measured after transfection of NIH3T3 cells with the following plasmids with or without subsequent treatment with tetracycline:
  • FIGURE 15 Relative activities of luciferase 24h after cotransfection of NIH 3T3 cells (80,000 cells per well) with the following plasmids (0.7 or 1.1 ⁇ g of DNA per well) with or without administration of tetracycline:
  • FIGURE 16A Relative levels of circulating SeAP in vivo after intramuscular coinjection of 6 week old female SCID mice of the following plasmids with or without administration of tetracycline at variable time intervals: Lot 1: 10 mice injected with 20 ⁇ g of plasmid pXL3010 + 40 ⁇ g pTet- tTAk; Lot 2: 10 mice injected with 20 ⁇ g of plasmid pXL3010 + 20 ⁇ g pTet-tTAk + 20 ⁇ g pSeAPantisens; Lot 3: 10 mice injected with 20 ⁇ g of plasmid pXL3010 +20 ⁇ g pTet- tTAk + 20 ⁇ g pTetSeAPantisens.
  • FIGURE 16B Relative levels of circulating SeAP in vivo after intramuscular coinjection of 6-week-old female SCID mice of the following plasmids, with or without administration of tetracycline at variable time intervals:
  • Lot 1 10 mice injected with 20 ⁇ g of plasmid pXL3010 + 20 ⁇ g pTet-tTAk + 20 ⁇ g pSeAPantisens;
  • Lot 2 10 mice injected with 20 ⁇ g of plasmid pXL3010 +20 ⁇ g pTet-tTAk + 20 ⁇ g pTetSeAPantisens; Lot 3: lot 2 + tetracycline drink (2mg / ml + 2 mg / ml sucrose) for 9 days. Then stop tetracycline at 10 ⁇ eme day. Rebates under tetracycline to 22 th day (IP injection every other day, 500 mg / mouse), and stop at the 30 th day. Doxycycline reach in the 63 th day (400 mg / l in the beverage).
  • FIGURE 17 Measurement of the expression of SeAP 48 hours after cotransfection of NIH3T3 cells with the following plasmids: T +: 1 ⁇ g pXL3010 + 1 ⁇ g pXL3296 T-: 1 ⁇ g pXL3010 + 1 ⁇ g pSeAPantisens
  • FIGURE 18 Measurement of the expression of SeAP measured 48 hours after cotransfection of NIH3T3 cells with the following plasmids:
  • FIG. 19 summary table of the inhibitions of expression of SeAP obtained by the transfection into the NIH3T3 cells of the plasmids pGJA1, pGJA2, pGJA3 and pGJA9, compared with the inhibition produced by the plasmid comprising Fantisens SeAPantisens.
  • Figure 20 Monitoring of the relative activity of circulating SeAP in the plasma of mice after bilateral intramuscular injections in the cranial tibial skeletal muscle and electrotransfer of the following plasmids, followed by the administration of doxycycline at the following time intervals: Lot 3: one batch of mice injected with 20 ⁇ g pXL3010 + 20 ⁇ g pTet-tTAk + 20 ⁇ g pTetSeAPantisens, and doxycycline at 400 mg / l added only on day 170;
  • Lot 4 a lot of mice injected with 20 ⁇ g pXL3010 + 20 ⁇ g pTet-tTAk + 20 ⁇ g pTetSeAPantisens, and doxycycline at 400 mg / l for durations of 7 days at the periods indicated.
  • Figure 21 measurement of the expression of SeAP measured 48 hours after transfection of NIH3T3 cells with the following plasmids, for a number of copies equivalent to 1 ⁇ g pXL3010, qs pXL3296: Column 1: pGJA14; Column 2: pGJA14-2; Column 3: pGJA15; and Column 4: pGJA 15-2.
  • Figure 22 measurement of the expression of SeAP 24 hours after cotransfection of NIH3T3 cells with the following plasmids, for a number of copies equivalent to 0.5 ⁇ g pXL3010, qsp pXL3296:
  • Figure 24 measurement of the expression of SeAP 5 days after transfection in C2C12 cells with the following plasmids, with and without chemical inducer BRL49653 at 10-7 M final:
  • Lot 4 lot 3 + 50 ng pSeAPAS (column 3: without BRL49653; column 4: with BRL49653); Lot 5: lot 3 + 100 ng pSeAPAS (column 5: without BRL49653; column 6: with BRL49653);
  • Lot 6 lot 3 + 250 ng pSeAPAS (column 7: without BRL49653; column 8: with BRL49653); Lot 7: lot 3 + 500 ng pSeAPAS
  • Figure 25 measurement of the expression of SeAP 48 hours after transfection of NIH3T3 cells with the following plasmids, with and without chemical inducer of the ecdysone system, Ponasterone or Pon ( Figure 26; No et al., PNAS, 1996, pp 3346 -3351).
  • Figure 26 Representation of Ponasterone (pon).
  • Lot 1 a lot of mice injected with 20 ⁇ g pXL3010 + 20 ⁇ g pcDNA;
  • Lot 2 a lot of mice injected with 20 ⁇ g pGJA14 + 20 ⁇ g pTet-tTAk;
  • Lot 3 a lot of mice injected with 20 ⁇ g pGJA14 + 20 ⁇ g pTet-tTAk + 400 mg / ml of doxycycline in the drink;
  • Lot 4 a lot of mice injected with 20 ⁇ g pGJA15-2 + 20 ⁇ g pTet-tTAk;
  • Lot 5 a lot of mice injected with 20 ⁇ g pGJA15-2 + 20 ⁇ g pTet-tTAk + 400mg / ml of doxycycline in the drink.
  • the plasmid pXL3031 is also a plasmid pCOR described in pCOR (Soubrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488) and comprises in particular the luciferase reporter under the control of the CMV promoter.
  • pCOR Sudbrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488
  • a schematic representation of this plasmid is presented in Figure 1A.
  • the plasmid pXL3010 was ligated in an Mlul / SalI fragment of pGL3-basic (Promega), of an Mlul / SphI fragment of pCDNA3-basic (Invitrogen) containing the early promoter of human cytomegalovirus (hCMV-IE) SeAP gene extracted from pSeAP-basic (Clontech) with Sphl / Clal and a Clal / Sall fragment containing the late polyadenylation signal of the simian virus (polyA SV40) amplified from pGL3-basic by a polymerase chain reaction with the following primers (5'- ATGCATCGATGGCCGCTTCGAGCAGACATG-3 'and 5'-ATGCGTCGACTCTA GCCGATTTTACCACATTTGTAGAGG-3').
  • a schematic representation of this plasmid is presented in Figure 1B.
  • a DNA fragment containing the SeAP gene is prepared by PCR using the plasmid pXL3010 as template and the oligonucleotides 1 (5 'CGAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC 3') and 2 (5 'GGGTCTA GATTAACCCGGGTGCGCGGCGTCGGT 3'). These oligonucleotides are located respectively at positions 765-797 and 2290-2267 on the plasmid pXL3010.
  • This fragment was then digested by the restriction enzymes Xbal and Sphl, purified on 0.8% agarose gel, extracted using the Jetsorb kit, then cloned in antisense orientation relative to the CMV promoter in the plasmid pXL3296, previously digested with Sphl and Xbal, to obtain the plasmid pSeAPantisens.
  • a schematic representation of this plasmid is presented in Figure 1C.
  • the plasmid pXL3296 is a plasmid pCOR (Soubrier et al., Get7 Ther, 6, (1999) 1482-1488) and comprises the ori ⁇ of R6K, the expression cassette of the suppressor tRNA Phenylalanine (sup Phe), as well as a -522 / + 72 part of the enhancer / early promoter of the CMV virus.
  • a schematic representation of this plasmid is presented in Figure 1 D.
  • pLucAntisens plasmid (antisense luciferase plasmid in pCOR)
  • the plasmid pXL3031 was digested with HindIII and treated with the Klenow fragment in order to make the ends blunt. After precipitation with ethanol, the fragment was digested with Xbal at 37 ° C for 2 hours. After purification on 0.8% agarose gel, the fragment of approximately 1.6 kb containing the luciferase gene was extracted using the Jetsorb kit.
  • Plasmid pGJA1 Plasmid 5 ′ end SeAPantisens
  • the plasmid pGJA1 was constructed by removing most of the 5 ′ gene SeAPantisens from the plasmid pSeAPantisens (Example 1.3 and FIG. 1 C) by means of the restriction enzymes Dralll and Sphl The ends have summer joined by ligation after treatment with the Klenow enzyme making the ends blunt. The eliminated fragment corresponds to the portion between positions 737 and 2139 of the SeAPantisens gene.
  • the remaining portion comprises the first 125 5 ′ bases of the SeAPantisens gene, between positions 612 and 737 (125 nucleotides), therefore the end of the 3 ′ end of the SeAP gene placed under the control of the CMV promoter.
  • a schematic representation of this plasmid is given in FIG. 3A.
  • Plasmid pGJA2 (5 'end plasmid SeAPantisens) The plasmid pGJA2 was constructed by removing most of the 3' SeAPantisens gene from the plasmid pSeAPantisens using the restriction enzymes Sphl and Nae1. The ends were joined by ligation
  • the eliminated fragment corresponds to the portion between positions 647 and 2139 of the SeAPantisens gene.
  • the remaining portion therefore includes the
  • Plasmid pGJA3 (3 'end plasmid SeAPantisens)
  • the plasmid pGJA3 was constructed by removing most of the SeAPantisens gene from the plasmid pSeAPantisens 5 'using the restriction enzymes Xbal and Pvull. The ends were joined by ligation after treatment with the Klenow enzyme making the ends blunt. The eliminated fragment corresponds to the portion between positions 1 and 1936 of the SeAPantisens gene. The remaining portion comprises the last 203 bases in 3 ′ of the SeAPantisens gene, between positions 1936 and 2139 (203 nucleotides), placed under the control of the CMV promoter. A schematic representation of this plasmid is given in FIG. 3C.
  • Plasmid pGJA9 Plasmid ends 5 'and 3' SeAPantisens
  • Plasmid pGJA9 was constructed by removing the intermediate portion between the 5 'and 3' ends of the SeAPantisens gene from the plasmid pSeAPantisens using the restriction enzymes Dralll and Pvull. The ends were joined by ligation after treatment with the Klenow enzyme making the ends blunt. The eliminated fragment corresponds to the portion between positions 737 and 1936 of the SeAPantisens gene.
  • the remaining portion therefore comprises the 5 ′ end and the 3 ′ end of the SeAPantisens gene, respectively between positions 612 and 737 (the first 125 nucleotides in 5 ′ of the antisense SeAP gene) and 1936 and 2139, (the last 203 nucleotides 3 ′ of the antisense SeAP gene), these two portions being placed together under the control of the CMV promoter.
  • a schematic representation of this plasmid is given in Figure 3D.
  • Example 4 Construction of plasmids allowing the simultaneous production of a transcript and its antisense transcript.
  • plasmid (a single SeAP coding sequence surrounded by a constitutive promoter and a conditional promoter in opposite direction in 3 ′)
  • the plasmid was constructed by insertion of the tetracycline repressible promoter (Tetp) into the plasmid pXL 3010 at the Eco47 III restriction site, after the polyA sequence.
  • Tetp tetracycline repressible promoter
  • the Tetp promoter was placed in the opposite direction to that of the CMV promoter which is located upstream of the SeAP gene. In this way, the CMV promoter induces the synthesis of the SeAP transcript in a constitutive manner, and the Tetp promoter placed head to tail induces, in the absence of tetracycline, the production of an antisense transcript. In the absence of tetracycline, SeAP activity is inhibited.
  • FIG. 4A A schematic representation of this plasmid is given in FIG. 4A.
  • PGJA15 plasmid (a single SeAP coding sequence surrounded by a constitutive promoter and a conditional promoter in the same direction) This plasmid was constructed by inserting the same Tetp promoter in the same location as for the plasmid PGJA 15-2, but in the same direction as the CMV promoter which is located upstream of the SeAP gene. This plasmid serves as a control to verify that the Tetp promoter oriented in this way must not modify the expression of SeAP. A schematic representation of this plasmid is given in FIG. 4B.
  • PGJA14 plasmid (constitutive promoter - SeAP and reverse conditional promoter - SeAPantisens, placed in opposite directions) This plasmid was constructed by inserting a set of "Tetp promoter + SeAP antisense gene sequence" in the plasmid pXL3010, in the same place as for the plasmid PGJA 15, in contrast to the whole “CMV promoter + SeAP sequence”.
  • the CMV promoter induces the synthesis of the SeAP transcript in a constitutive manner
  • the Tetp promoter placed in the opposite direction induces, in the absence of tetracycline, the production of the antisense transcript included in the set "Tetp promoter + antisense SeAP sequence" .
  • the SeAP activity is inhibited, in the absence of tetracycline.
  • FIG. 4C A schematic representation of this plasmid is given in FIG. 4C.
  • This plasmid was constructed by inserting a set "Tetp promoter + sequence of the antisense SeAP gene" into the plasmid pXL3010, in the same location as for the plasmid PGJA 15, and in the same direction as the set "CMV promoter + sequence SEAP ”.
  • the CMV promoter induces the synthesis of the SeAP transcript in a constitutive manner
  • the Tetp promoter induces, in the absence of tetracycline, the production of the antisense transcript included in the set "Tetp promoter + SeAP antisense sequence”.
  • the SeAP activity is inhibited.
  • a schematic representation of this plasmid is given in FIG. 4D.
  • Plasmid pSG5-hPPARv2 (human transactivating plasmid PPAR ⁇ 2)
  • the plasmid pSG5-hPPAR ⁇ 2 comprises the gene for the transactivator of human origin hPPAR ⁇ 2, having the ability to activate a minimal promoter comprising upstream the J region of the human apolipoprotein Ail (ApoAII) promoter repeated 10 times in reverse (JxIOAS), when it is coexpressed with the plasmid pVgRXR (FIG. 6C) coding for the retinoid receptor RXR.
  • the transactivator is under the control of the SV40 promoter.
  • Plasmid pRDA02 (SeAP plasmid under the control of the inducible promoter JxIOAS)
  • the plasmid pRDA02 comprises the reporter gene SeAP placed under the control of a CMV promoter comprising upstream a JxIOAS region inducible by the product of the hPPAR ⁇ 2 gene.
  • the SeAP gene is flanked in its 3 ′ part of a termination sequence of the polyA transcription of the SV40 virus. A schematic representation of this plasmid is given in FIG. 5B.
  • pINDSeAP plasmid promoter comprising the SeAP gene under the control of the PHSP promoter inducible by ecdysone
  • the plasmid pINDSeAP was constructed by inserting the gene coding for SeAP between the EcoRI and Xhol restriction sites in the cloning site multiple of the pIND vector ( Figure 6A; InVitrogen).
  • Gene expression coding for SeAP is therefore under the control of the system ecdysone uses a heterodimer of the ecdysone receptor (VgECR) and of the retinoid X receptor (RXR).
  • This heterodimer binds on an element of response to ecdysone (E / GRE on the plasmid IND).
  • the PHSP promoter is a Drosophila Minimal Heat Shock Promoter (No et al, PNAS 1996, pages 3346-3351). A schematic representation of this plasmid is given in FIG. 6B.
  • VgRXR Plasmid pVgRXR (FIG. 6C; InVitrogen)
  • the plasmid VgRXR therefore codes on the one hand the RXR receptor, and on the other hand a VP16 / ECR fusion protein.
  • a heterodimer containing VP16 can be formed which will activate transcription in the presence of ecdysone or its analogs, such as for example Ponasterone A (Pon; Figure 26) (No et al, PNAS 1996, pages 3346-3351) .
  • EXAMPLE 7 Functionality of the plasmids comprising a sequence coding for an inhibitory transcript of antisense type in vitro
  • the cells used are murine fibroblasts NIHT3T3 (ATCC: CRL-1658). These cells are seeded 24 h before transfection, in 6 or 24 well plates, at a density of 5.10 4 cells / well in 1 ml of medium, or 2.5 ⁇ 10 5 cells / well in 2 ml.
  • the culture medium used is DMEM TM medium (Life Technologies Inc.) supplemented with 10% calf serum.
  • the cell cultures are incubated in an oven at 37 ° C. in a humid atmosphere and under partial pressure of CO 2 of 5%.
  • the transfections are carried out approximately 24 h after seeding when a confluence of 50 to 80% is obtained.
  • C2C12 cells are murine myoblastic cells (ATCC: CRL1772) are cultured on a DMEM TM medium (Life Technologies Inc.) supplemented with 10% fetal calf serum supplemented with L- 2mM final glutamine and antibiotics, 50 final units of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • Example 7.2 Cell Transfection Carried Out Using a Cationic Lipofectant Diluted solutions of DNA and cationic lipid RPR 120535 (Bik G et al., J. Med. Chem 41 (1998) 224-235) are prepared separately with a view to obtaining for the transfection a concentration of approximately 6 nmol of lipid RPR 120535 B / ⁇ g of DNA. Each solution is first diluted in a solution of sodium bicarbonate at 20 mM final in 150 mM NaCl final, and incubated for 10 minutes at room temperature (RT). The cationic lipid solution is then distributed, volume to volume, in the DNA solutions.
  • RT room temperature
  • a new incubation is carried out for 10 min at RT, and the complexes formed are then diluted 1/10 th in culture medium supplemented with serum. After a final incubation of 10 minutes, the culture medium is eliminated in the plates and 1 or 2 ml / well of these solutions are distributed depending on whether the 24 or 6 well plates are used respectively.
  • Example 7.3 Measurement of the luciferase activity The luciferase activity is measured 24 h after the transfection. Luciferase catalyzes the oxidation of luciferin in the presence of ATP, Mg 2+ , and ⁇ 2 , with the concomitant production of a photon. The total light emission, measured by a luminometer, is proportional to the luciferase activity of the sample. The culture medium is removed beforehand, the cells are rinsed twice with PBS, then lysed for 15 min at room temperature, with 200 ⁇ l of Cell Lysis Buffer (Promega Corporation) per well. The Luciférase Assay System TM kit (Promega Corporation) is then used for activity measurements according to the recommended protocol.
  • Luciferase activity is measured 24 h after the transfection. Luciferase catalyzes the oxidation of luciferin in the presence of ATP, Mg 2+ , and ⁇ 2 , with the concomitant production of
  • the luciferase activity is related to the protein concentration of the cell lysate supernatants. Measuring the protein concentration of cell extracts is performed using the BCA method (Pierce) using bicinchoninic acid (Wiechelman et al., Anal Biochem, 175 (1998) 231-237.)
  • Example 7.4 Measurement of the SeAP activity The SeAP activity is measured on the culture supernatants 48 hours after the transfection, using the Phospha-Light TM kit (Tropix, Inc.).
  • Example 7.5 Inhibition in vitro of the expression of the reporter genes SeAP (fia. 7A) or of luciferase (FIG. 7B) by the inhibitory transcript of antisense type
  • RNAs were prepared by the Trizol method (Gibco BRL) from NIH 3T3 cells.
  • RT-PCR products were then deposited on 0.8% o agarose gel, and we can observe the presence of a band with the expected size of 418 bp (lane 2, FIG. 8) which reflects well the transcription of the SeAP sense gene (lane 3, FIG. 8), of the SeAP sense and SeAP antisense in different proportions 1: 1 (lane 4, FIG. 8), and 1: 3 (lane 5, FIG. 8). Lanes 6 to 8 correspond to negative controls of the experiment in which a PCR without prior reverse transcription was carried out.
  • Example 8.2 Comparison of the percentage inhibition of the antisense inhibitory transcript when it is coinjected with the reporter gene SeAP or post-injected 22 days after the injection of the SeAP gene The results, gathered in FIG. 10, show that the injection of the plasmid pSeAPantisens does not lead to effective inhibition of the reporter gene for SeAP (pXL3010) injected 22 days previously. Indeed, more than 20 days after the injection of the antisense transcript, the observed expression of SeAP only decreased by 60% (lot 1, Figure 10).
  • FIG. 10 clearly shows that a coinjection of the inhibitory transcript of the antisense type and of the sense sequence of the exogenous reporter gene for SeAP confers a very strong inhibition of the expression of SeAP, since it cannot be detected no residual expression of this gene.
  • the coexpression of the sense and antisense gene of SeAP makes it possible to abolish the expression of the reporter gene SeAP in vivo (lot 2, FIG. 10).
  • the injection of antisense alone as a control does not confer any activity (lot 3, FIG. 10).
  • RT-PCR reactions were carried out following the protocol previously described in Example 3.6.
  • the reaction products were separated on an agarose gel and visualized with ethydium bromide.
  • a photograph of this gel which is presented in FIG. 11 A, shows that both sense and antisense RNA are expressed in the muscles of mice which have undergone a first injection of plasmids pXL3010, and a subsequent injection of plasmid carrying the sequence of the transcript pSeAPantisens antisense inhibitor (tracks 2 and 3).
  • the membrane is then exposed on an autoradiography film, and the film is developed three hours later.
  • a photograph of this film which is presented in FIG. 11B, confirms the previous results well. Indeed, the presence of a transcript of the SeAP reporter gene is not detected in lane 4 which corresponds to the co-injection of the plasmids comprising the sense sequence of the reporter gene (pXL3010) and the antisense sequence (pSeAPantisens) , while the transcript of the gene SeAP reporter is detected in lane 2 which corresponds to the post-injection experience of these same plasmids.
  • Example 8.4 Monitoring of the Relative SeAP Activity Circulating in Vivo After Injection of the Plasmid Comprising the Meaning Sequence of the SeAP Gene (pXL3010), followed by a Post-Injection of the Plasmid Comprising the Sequence of the Antisense-type Inhibitor Transcript of the SeAP Reporter Gen (pSeAPantisens) 50 female SCID mice of 6 weeks, divided into 5 groups of 10 and are treated as previously described in Examples 3.2 and 3.3.
  • Example 8.5 Monitoring of the relative circulating SeAP activity in vivo after coinjection of the plasmids pXL3010 and pSeAPantisens
  • results, presented in FIG. 14B, show a partial inhibition of the SeAP reporter gene when it is coinjected with the plasmid comprising the sequence of the antisense inhibitor transcript of the SeAP gene under the control of the CMV promoter (pSeAPantisens ) in a 1: 1 proportion (column 2), or under the control of the tetracycline repressible promoter (columns 3 and 6), relative to the level of expression of the reporter gene for SeAP measured after injection of the plasmid comprising the sense sequence SeAP (pXL3010) (columns 1 and 5).
  • the administration of tetracycline makes it possible to restore very satisfactory expression of the reporter gene for SeAP (columns 4 and 7).
  • results presented in FIG. 15 demonstrate, in the first place, the in vitro functionality of the plasmids comprising the sense and antisense sequences of the reporter gene for luciferase under the control of the promoter repressible by tetracycline (pTetLucAntisens, pTetLuc and pTetSpliceAntisens).
  • the antisense inhibitor transcript In the absence of tetracycline, the antisense inhibitor transcript is expressed and leads to an imperfect inhibition of 60-70% (columns 3 and 6), whereas when the antisense inhibitor transcript is placed under the control of the CMV promoter , the inhibition is of the order of 90%, using a sense / antisense ratio of 1: 1 (column 2).
  • EXAMPLE 10 Measurement of a strong inhibition in vivo by an inhibitory transcript of the antisense type placed under the control of a repressible promoter
  • results presented in FIG. 16B show that the coinjection of the plasmids carrying the sense sequence of the reporter gene for SeAP (pXL3010) and the antisense sequence of the gene under the control of the tetracycline repressible promoter (pTetSeAPantisens) in the presence of an agent external repressor, such as tetracycline, makes it possible to obtain a satisfactory biological level of the reporter gene for SeAP (lot 3, J8). Inhibition of the expression of exogenous reporter gene SeAP can again be observed when one stops the administration of tetracycline on the 10th day (lot 3: J15, J22, J30 and J63). These results also confirm that this inhibition is reversible, since the administration of a similar repressor agent tetracycline, doxycycline, at day 63 ⁇ eme resets a reporter gene expression of SeAP (lot 3: J70).
  • a plasmid is constructed, which contains a hammerhead ribozyme sequence, by cloning a sequence comprising at least one GTC site, chosen in positions 958, 1058, 1127, 1205, 1243, 1600, 1620, 1758, 1773, 1880, 1901, 1988, 2007, 2085 and 2201 on the plasmid pXL3010 (reporter gene SeAP), downstream of the promoter repressible by the tetracycline TetRS in the plasmid pTetSplice (Gibco BRL), previously digested, to give the plasmid pTetSeAPribozyme.
  • the first group is treated as previously described with the plasmid pXL3010.
  • the second group co-injected the plasmids pXL3010, pTet-tTAk, and pTetSeAPribozyme.
  • the third group is treated as group 2, and the mice are given a drink containing doxycycline (400 mg / l). The circulating SeAP level is monitored as previously described.
  • a plasmid comprising the sense sequence of the reporter gene for SeAP (pXL3010) and a plasmid comprising the sequence of the ribozyme inhibitor transcript specific for SeAP under the control of a promoter repressible by tetracylcine (pTetSeAPribozyme), an effective inhibition of the expression of SeAP, compared to the observed expression of the reporter gene for SeAP in the first group of mice tested, indicating that the inhibitory transcript of the ribozyme type is capable of strongly inhibit in transcription of the exogenous SeAP gene with which it is co-administered.
  • Oral administration of a tetracycline analog, doxycycline, as a repressant restores the expression of SeAP.
  • EXAMPLE 13 Regulation by an Antisense-type Inhibitor Transcript Including an aptamer Sequence
  • the plasmid pSeAPantisens (FIG. 1C) as described in Example 1.3 is modified in order to insert at the 5 ′ end of the sequence of the transcript antisense inhibitor, a ligand-dependent aptamer sequence, of sequence 5 'GGCCUGGGCGAGAAGUUUAGGCC 3' recognized by neomycin B as described by Cowan et al. (Nucleic Acids Res. 28 (15) (2000) 2935-2942), to give the plasmid designated pSeAPaptamereAS.
  • mice 30 6 week SCID mice are treated as previously described in Example 4, and are divided into three groups of 10.
  • the first group is treated as previously described with the plasmid pXL3010.
  • the second group receives in coinjection followed by electrotransfer, the plasmids pXL3010, and pSeAPaptamereAS.
  • the third group is treated like group 2, and receives an IP injection of neomycin B at the rate of approximately 500 ⁇ g / mouse.
  • the circulating SeAP level is then monitored as previously described. While we detect for the first group, a constant expression of the reporter gene for SeAP, we observe in the second group an effective inhibition of the SeAP gene by the inhibitory transcript ⁇ comprising an aptamer sequence.
  • SeAP SeAP
  • an effective amount of neomycin B which recognizes the aptamer sequence carried by the plasmid pSeAPaptamereAS.
  • a sharp decrease in the circulating SeAP level and therefore an inhibition of the expression of the SeAP reporter gene can again be observed when the administration of neomycin B is stopped.
  • a plasmid which contains a hammerhead ribozyme sequence, by cloning a sequence comprising at least one GTC site, chosen in positions 958, 1058, 1127, 1205, 1243, 1600, 1620, 1758, 1773, 1880, 1901 , 1988, 2007, 2085 and 2201 on the plasmid pXL3010, downstream of the CMV promoter in the plasmid pXL3296 (Soubrier et al.) digested to give pSeAPribozyme.
  • Three groups of 10 6 week SCID mice are treated: the first group receives by injection followed by electrotransfer the plasmid pXL3010, the second group also receives by coinjection followed by electrotransfer, the plasmids pXL3010, and pSeAPaptazyme, and finally, the third group is treated like group 2, but receives an additional amount of dye H33258 (400mg / l) through drinking water.
  • Monitoring the level of circulating SeAP shows an effective in vivo inhibition of the activity of SeAP, which is restored to a significant level in the third group of mice, which receive the ligand or dye H33258, specific for the aptamer sequence present in the plasmid pSeAPaptazyme.
  • Example 15.1 Inhibition obtained with the plasmids pGJA pGJA2 and pGJA3 (fragments of transcripts containing respectively, the 125, the first 35 bases in 5 'of the sequence of the SeAPantisens gene, and the last 203 bases in 3' of the sequence of the sequence SeAPantisens gene) Measuring the SeAP activity under the different transfection conditions in vitro makes it possible to compare the inhibitory effect of the sub-fragments of the SeAPantisens transcript with that of the entire SeAPantisens transcript. The results of FIG.
  • Example 15.2 Inhibition obtained with the plasmid pGJA9 (fragments of transcripts each containing the two 5 'and 3' ends of the SeAPantisens transcript)
  • the inhibition caused by the fusion of the two 3 '(203 nucleotides) and 5' ends (125 nucleotides) of the antisense SeAP transcript is represented in columns 7 and 8 of FIG. 18.
  • This transcript is produced from the plasmid pGJA9. It significantly inhibits the SeAP activity measured in the cells, in comparison with the maximum inhibition achieved by the entire SeAPantisens transcript (columns 5 and 6).
  • Example 16 In vivo regulation kinetics by the inhibitory transcript of the SeAPantisens type placed under the control of a promoter repressible by doxycycline.
  • mice were treated as previously described.
  • the induction of the expression of the exogenous reporter gene for SeAP is obtained on two time scales.
  • the mice drink water except on day 170 when they drink doxycycline.
  • the expression of SeAP is zero in the absence of doxycycline, and a very small increase in this expression is observed after taking a day of doxycycline.
  • the mice drink doxycycline for 7 days, then take breaks of 20, 30, or 40 days. Taking doxycycline for a week this time causes considerable increases in the expression of SeAP, which regress significantly during periods of water intake.
  • Example 17 Verification of the functionality of the plasmids pGJA14, pGJA14-2, pGJA15 and pGJA15-2 to express the SeAP.
  • Example 18 Regulation of the expression of SeAP by the plasmids pGJ14, pGJ15 and pGJA15-2 coinjected with the plasmid pTet-tTAk.
  • Example 18.1 Regulation of the expression of SeAP by the plasmids PGJA15 and pGJA15-2 coinjected with the plasmid pTet-tTAk.
  • the results presented in FIG. 22 evaluate the inhibition of the expression of SeAP on cells cotransfected with the plasmid pTet-tTAk and, respectively, the plasmids pGJA15 and pGJA15-2.
  • the plasmid pGJA 15 in which the orientation of the pTet promoter does not allow the synthesis of the antisense SeAP transcript, no inhibition is observed, as much in the presence as in the absence of tetracycline.
  • the plasmid pGJA15-2 in which the inducible promoter pTet is functionally linked to the antisense SeAP gene, produces a significant inhibition of the expression of SeAP in the absence of tetracycline.
  • plasmid pGJA15-2 can be used for a strategy of regulation of the expression of an exogenous reporter gene based on the coinjection of two plasmids, where Fantisens and sense are carried by the same plasmid and are produced at from the same sequence on the same plasmid.
  • Example 18.2 Regulation of the expression of SeAP by the plasmid pGJA14 coinjected with the plasmid pTet-tTAk
  • Example 16.1 The same experiment as that described in Example 16.1 was carried out on cells cotransfected with the plasmids pGJA14 and pTet-tTAk ( Figure 23). The expression of SeAP is inhibited in the absence of tetracycline, in comparison with the constitutive expression of column 5.
  • the data presented in FIG. 24 show that the expression of the exogenous reporter gene SeAP (plasmid pRDA02) in the presence of the transactivator hPPAR ⁇ 2 (plasmid pSG5-hPPAR ⁇ 2), but in the absence of the BRL fibrate (RPR131300A at 10 '2 M in water) is not zero (column 1).
  • the data in the following columns shows that this base level can be reduced by adding increasing amounts of antisense transcripts obtained by transfecting the plasmid pSeAPAS.
  • the presence of the antisense transcript does not prevent a certain inducibility of the expression of SeAP by fibrate (reports in columns 3 and 4; 5 and 6; 7 and 8; respectively).
  • the combined system of the three plasmids pRDA02, pSG5-hPPAR ⁇ 2 and pSeAPAS therefore allows control of the expression of the exogenous reporter gene SeAP while minimizing the expressions of residual leakage in the absence of the inducing agent, such as fibrate.
  • Figure 25 shows, in columns 1 and 2, the level of expression of the SeAP gene carried by the plasmid pINDSeAP, in the absence and in the presence of an inducer of the ecdysone system, ponasterone ( Figure 26; No et al., PNAS , 1996, pp 3346-3351).
  • Figure 26 the level of expression is low, but not zero. This level is reduced to zero when the plasmid pSeAPAS, expressing the antisense transcript of SeAP, is cotransfected with the plasmid pINDSeAP (column 3).
  • the combined system from three plasmids pINDSeAP, pVgRXR, and pSeAPAS therefore allows control of the expression of the exogenous reporter gene SeAP while eliminating the expressions of residual leakage observed in the absence of the ecdysone inducer.
  • Example 21 In vivo regulation kinetics by the inhibitory transcript of the SeAPantisens type placed under the control of a promoter repressible by doxycycline.
  • mice 30 6 week SCID mice are treated as previously described and are divided into 5 lots.
  • the first batch of mice (batch 1; Figure 27) is treated with the plasmid pXL3010.
  • a residual expression of the SeAP gene is noted when it is placed under the control of the constitutive promoter CMV.
  • the second batch of mice (batch 2; Figure 27) receives in coinjection followed by electrotransfer, the plasmids pGJA14 and pTet-tTAk.
  • the results presented in FIG. 27 clearly show that a residual expression of the SeAP gene is zero in vivo, in the absence of doxycycline.
  • the third batch of mice receives in coinjection followed by electrotransfer the plasmids pGJA14 and pTet-tTAk and doxycycline in the drinking water.
  • the expression of the SeAP gene measured on the 8 th day, is then significantly activated in the presence of doxycycline, at a level much higher than the level of expression constituting the SeAP obtained for batch 1.
  • the fourth batch of mice receives in coinjection followed by electrotransfer, the plasmids pGJA15-2 and pTet-tTAk. In the absence of doxycycline, the residual expression of SeAP is greatly reduced compared to the constitutive expression observed in lot 1, but not zero.

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles constructions, compositions et un nouveau procédé pour la régulation de l'expression d'un transgène d'intérêt in vivo par inhibition conditionnelle, ainsi que leurs utilisations dans les domaines expérimentaux, cliniques, thérapeutiques, ou pour la production d'animaux ou végétaux. Plus particulièrement, le nouveau procédé de régulation repose sur la coexpression d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, de sorte à obtenir une inhibition constitutive de l'activité du transcrit d'intérêt, et à pouvoir assurer une régulation efficace du transcrit d'intérêt, soit par inhibition de son transcrit inhibiteur, soit par activation du transcrit d'intérêt, soit encore par activation du transcrit d'intérêt et inhibition concomitante de son transcrit inhibiteur.

Description

SYSTEME DE REGULATION IN VIVO DE L'EXPRESSION D'UN TRANSGENE PAR INHIBITION CONDITIONNELLE
La présente invention concerne de nouvelles compositions ainsi qu'un nouveau procédé destiné au contrôle de l'expression in vivo d'un transgène d'intérêt thérapeutique ou expérimental, par un système d'inhibition conditionnelle. La présente invention est particulièrement utile pour la génération d'animaux et de végétaux modifiés ainsi que dans les applications de thérapie génique.
La thérapie génique, qui consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante etc.) ou encore à traiter une pathologie grâce à l'expression d'un transgène thérapeutique, est généralement mise en oeuvre par l'introduction d'un gène exogène ou transgène dans la cellule ou le tissu affecté. Le transgène est placé sous le contrôle d'un promoteur fort, constitutif ou inductible, afin d'assurer une expression quantitativement et qualitativement optimale in vivo.
Toutefois, si ces systèmes d'expression constitutive permettent d'obtenir de bons niveaux d'expression d'un transgène d'intérêt transféré, ils n'offrent pas la possibilité de moduler le niveau d'expression du transgène. Par ailleurs, dans le cas des systèmes inductibles actuels, l'on observe généralement une expression résiduelle souvent trop élevée du transgène d'intérêt, qui peut provoquer une certaine toxicité, incompatible avec une application thérapeutique ou expérimentale.
Or, la possibilité d'exercer un contrôle efficace, particulièrement d'inhibition, du transgène d'intérêt peut s'avérer déterminante pour le succès de certaines expérimentations ou de la thérapie, notamment lorsque l'expression du transgène s'accompagne d'effets secondaires, par exemple de cytotoxicité. C'est notamment le cas de certaines cytokines, comme le TNF-α, IL-2, IL-4, 1L-12, IL-18, GM-CSF (Agha-Mohammadi, et al., J.Clin.Invest, 105 (2000) 1173-1176), des anticoagulants, des anticorps, de certains activateurs enzymatiques de substances actives (Springer et al., J.Clin.Invest, 105 (2000) 1161-1167), des molécules cancerotoxiques ou encore des hormones.
Différents systèmes artificiels de contrôle de l'expression ont été conçus dans l'art antérieur. Un premier système utilise une protéine régulatrice désignée LAP (Lac Activator Protein) construite par fusion du répresseur Lac de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 du virus de l'herpès (HSV). LAP est notamment susceptible d'activer, en absence d'isopropyi β-D-thiogalactoside (IPTG) un promoteur minimum précoce de SV40, comprenant en amont ou en aval de l'unité de transcription, les séquences de l'opérateur lac, alors qu'en présence d'IPTG, l'activation du promoteur est inhibée (Labow et al., Mol.Cell.Biol., 10 (1990) 3343-3356).
Un autre système utilise une protéine transactivatrice contrôlée par la tétracycline, qui a été construite par fusion du répresseur Tet de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 de HSV, de sorte notamment à activer, en absence de tétracycline, la transcription d'un promoteur minimum comprenant les séquences de l'opérateur tet de réponse à la tétracycline, cette activation pouvant être inhibée en présence de tétracycline d'un de ses dérivés (Gossen et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89, (1992) 5547-5551 ; Gossen et al, Science, 268 (1995) 1766-1769).
Ces systèmes de régulation négative souffrent néanmoins d'une expression résiduelle encore trop élevée à l'état inhibé, qui limite leur efficacité ainsi que leurs utilisations in vivo. De plus, ces systèmes nécessitent l'apport d'un agent répresseur, tel que la tétracycline ou l'IPTG, ce qui est contraignant lorsque seule une expression périodique du transgène d'intérêt est requise.
D'autres systèmes d'inhibition de l'expression de gènes qui utilisent des acides nucléiques recombinants, tels que des oligonucléotides antisens (WO83/01451) ou des ARN antisens complémentaires d'un gène endogène cible (McCall, Biochim Biophys Acta, 1397(1) (1998), 65-72) ont été développés.
Ceux-ci ont été jusqu'à présent uniquement utilisés pour la régulation de gènes endogènes. Bien qu'ils permettent d'obtenir une inhibition d'environ 60 à 90% lorsqu'ils sont testés in vitro, ils sont largement inefficaces pour la régulation de gènes endogènes in vivo, de sorte que leur développement a été mis de côté, malgré leur faible toxicité et l'absence d'immunogénicité.
De manière surprenante, les demandeurs ont découvert que si, l'inhibition d'un gène exogène ou transgène par un ARN antisens complémentaire in vitro était du même ordre que celle obtenue par un ARN antisens complémentaire d'un gène endogène, c'est à dire très insatisfaisante, l'inhibition de ce même gène exogène par son transcrit antisens complémentaire devenait particulièrement forte lorsqu'elle était réalisée in vivo.
Les demandeurs, ont par ailleurs découvert, que cette inhibition n'était pas reproduite en injectant et en exprimant dans un premier temps le transgène seul, puis en injectant dans un second temps, la séquence codant pour son transcrit inhibiteur, mais qu'il était au contraire nécessaire de coinjecter et de coexprimer les acides nucléiques comprenant les séquences du transcrit antisens inhibiteur et du transgène afin d'obtenir une inhibition efficace de ce dernier in vivo.
Les demandeurs ont enfin découvert que le transgène pouvait non seulement être efficacement inhibé par son ARN antisens, mais également qu'il était possible de rétablir un niveau d'expression biologiquement efficace du transgène, et ainsi de contrôler l'expression de ce dernier par l'intermédiaire de son transcrit inhibiteur spécifique de type antisens. . La présente invention a pour objet un nouveau procédé de régulation in vivo de l'expression d'un transgène d'intérêt qui consiste à :
- introduire simultanément dans un tissu ou une cellule cible, un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant chacune sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe,
- coexprimer lesdits acides nucléiques dans le tissu ou la cellule cible afin de permettre l'inhibition constitutive de l'activité du transcrit d'intérêt par le transcrit inhibiteur.
Dans une étape supplémentaire du procédé selon l'invention, l'on administre au tissu ou à la cellule cible, un agent externe dit répresseur, conduisant à inhiber l'activité du transcrit inhibiteur et ainsi à restaurer une activité du transcrit d'intérêt, proportionnellement à la quantité de l'agent répresseur externe utilisé.
De manière alternative ou additionnelle, l'on administre au tissu ou à la cellule cible, un agent externe dit activateur, conduisant à accroître l'activité du transcrit d'intérêt. Ainsi, une activité du transcrit d'intérêt peut être restaurée proportionnellement à la quantité de l'agent activateur externe utilisé.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de transfert in vivo d'un transgène d'intérêt, consistant à coadministrer et coexprimer dans un tissu ou une cellule cible, un acide nucléique comprenant la séquence d'jjn transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt. Selon cette méthode, l'expression du transgène d'intérêt ou l'activité du transcrit d'intérêt est inhibée de manière constitutive, et peut être restaurée en inhibant l'activité du transcrit inhibiteur par l'administration d'un agent externe répresseur, et/ou en administrant un agent externe susceptible de conduire à l'induction de l'activité du transcrit d'intérêt.
La présente invention a également pour objet une méthode destinée à réduire l'expression résiduelle d'un transgène d'intérêt in vivo, qui consiste à coinjecter et à coexprimer les séquences codant pour le transcrit d'intérêt et pour son transcrit inhibiteur spécifique.
La présente invention a en outre pour objet une nouvelle association administrée in vivo et susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'invention. Celle-ci comporte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, et un acide nucléique comprenant une séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, chacune des séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit d'intérêt et/ou du transcrit inhibiteur pouvant être régulée par un agent externe.
On entend par transgène d'intérêt, toute molécule d'acide nucléique exogène, codant pour un produit biologique, à savoir soit un transcrit d'intérêt ou utile tel qu'un ARNm, un ARNr, un ARNt, un ribozyme, ou un aptazyme, soit une protéine, un polypeptide, ou un peptide d'intérêt thérapeutique ou expérimental. Selon l'invention, le transgène d'intérêt inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique.
On entend par transcrit d'intérêt ou transcrit utile, un ARN produit par transcription à partir du transgène d'intérêt comme défini précédemment. Le transcrit d'intérêt peut se présenter sous la forme d'un ARNm et être traduit en une protéine ou un peptide thérapeutique à action intracellulaire ou sécrétée. Alternativement, le transcrit d'intérêt ou transcrit utile peut se présenter sous la forme d'un ARN ayant une activité biologique intrinsèque tel qu'un aptazyme, un ribozyme, un ARN antisens, ou un ARN capable d'interagir avec les constituants des cellules transfectées, comme par exemple un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), ou un aptamère.
On entend par transgène inhibiteur, toute molécule d'acide nucléique exogène, susceptible de produire par transcription, un transcrit inhibiteur ayant pour cible le transcrit d'intérêt. Selon l'invention, le transgène inhibiteur inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique.
On entend par transcrit inhibiteur spécifique, un ARN qui peut se présenter sous la forme d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le transcrit d'intérêt.
Le transcrit est dit inhibiteur dans la mesure où il est capable d'inhiber efficacement et constitutivement le transcrit d'intérêt, avec lequel il est coexprimé dans le tissu ou la cellule cible, soit au niveau traductionnel, en bloquant la traduction du transcrit d'intérêt de type ARNm, soit au niveau de son activité biologique, en bloquant l'interaction du transcrit d'intérêt ARNr, ARNt, ou aptamère avec les constituants cellulaires, soit en bloquant l'interaction du transcrit d'intérêt de type aptazyme, ribozyme, ou ARN antisens avec une séquence nucléique cible, soit encore en diminuant la concentration du transcrit d'intérêt par dégradation enzymatique. Ce transcrit inhibiteur est par ailleurs dit répressible, c'est à dire qu'il peut faire lui-même l'objet d'une inhibition par l'intermédiaire d'un agent répresseur externe. On entend par activité du transcrit d'intérêt, soit sa traduction en une protéine ou un peptide d'intérêt thérapeutique ou expérimental, lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un ARNm, soit son activité biologique lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un aptazyme, d'un ribozyme, ou d'un ARN antisens, soit encore son interaction avec les constituants cellulaires, lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un ARN ribosomique, d'un ARN de transfert, ou d'un aptamère.
On entend par agent externe, tout agent chimique, et de préférence pharmacologique, ou physique tel que la chaleur, administrable par voies entérales ou parentérales, ayant une faible toxicité, et présentant une activité d'inhibition ou d'activation de l'expression d'un gène.
Une des caractéristiques avantageuses du procédé de régulation par inhibition réversible selon la présente invention réside dans sa capacité à bloquer efficacement de manière constitutive l'expression d'un transgène d'intérêt in vivo ou l'activité du transcrit d'intérêt ou utile, et à rétablir cette expression lorsque cela est souhaité pour des raisons cliniques ou expérimentales. Ce système repose sur la coinjection et la coexpression d'un transgène d'intérêt et de son transcrit inhibiteur spécifique in vivo, et la possibilité de réguler efficacement le transgène d'intérêt, soit par inhibition de son transcrit inhibiteur spécifique, soit par activation du transcrit d'intérêt, soit encore par activation du transcrit d'intérêt et inhibition concomitante de son transcrit inhibiteur spécifique.
Selon un premier mode de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur est inhibé par un agent répresseur externe, afin de lever l'inhibition du transcrit d'intérêt et de rétablir indirectement l'activité du transcrit d'intérêt ou un niveau biologique suffisant du transcrit d'intérêt.
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut être obtenue en plaçant la séquence du transgène inhibiteur codant pour le transcrit inhibiteur sous le contrôle d'un promoteur répressible ou sensible à un agent répresseur externe. On peut utiliser par exemple le système de répression par la tétracycline (TrRS) qui dérive de l'opéron de résistance à la tétracycline de E.coli (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89 (1992), 5547-5551 ). Ce système utilise l'affinité du répresseur tet (tetR) pour la séquence de l'opérateur tet (tetO), l'affinité du tetR pour la tétracycline, ainsi que l'activité ubiquitaire du transactivateur du virus de l'herpès VP16 dans les cellules eucaryotes. Ce système de régulation TrRS fonctionne donc grâce à un transactivateur (tTA) chimérique qui résulte de la fusion de l'extrémité C- terminale de VP 6 avec l'extrémité C-terminale de la protéine tetR.
En absence de tétracycline, la partie tetR du transactivateur tTA se fixe sur une séquence de régulation comprenant par exemple des séquences répétées (2, 7, ou 10 répétitions) de l'opérateur de la tétracycline, et placé en amont d'un promoteur transcriptionnel minimum par exemple du Cytomegalovirus humain (hCMV), et active la transcription du transgène inhibiteur et la production du transcrit inhibiteur, assurant une inhibition constitutive efficace du transcrit d'intérêt. En présence de tétracycline, celle-ci se fixe sur la partie tetR du transactivateur chimérique tTA, provoque un changement de sa conformation ainsi qu'une perte d'affinité pour les séquences répétées de l'opérateur de réponse à la tétracycline (tetO). Il en résulte alors une inhibition de la production du transcrit inhibiteur à partir du transgène inhibiteur et le rétablissement d'un niveau d'expression du transgène d'intérêt ou de l'activité du transcrit d'intérêt.
Les séquences régulatrices comprenant les séquences répétées de tetO sont avantageusement intégrées au sein d'un amplificateur/promoteur tissu-spécifique ou peuvent être utilisées en remplacement de certaines séquences amplificatrices (Rose et al., J.Biol.Chem. 272 (1997) 4735-4739 ; Agha-Mohammadi et al, Gène Ther, 5(1998) 76-84). Ce système confère ainsi non seulement un ciblage temporel de la régulation du transgène d'intérêt, mais également spatial.
De préférence, la séquence codante pour le transactivateur tTA et le promoteur TrRS conduisant la transcription du transcrit inhibiteur sont portés sur une seule molécule d'acide nucléique. Cette dernière peut comprendre par exemple la séquence codant pour tTA sous le contrôle d'un promoteur viral ou tissu-spécifique, puis la cassette du promoteur répressible par la tétracycline (TrRS) liée de manière fonctionnelle avec la séquence codant pour le transcrit inhibiteur (O'Brien et al., Gène, 184 (1997) 115-120).
Une organisation alternative de type bicistronique comprenant la cassette d'expression TrRS liée fonctionnellement à la séquence codant pour un transcrit inhibiteur, suivie d'une séquence IRES (Internai Ribosome Entry Site) et d'une séquence codante pour le tTA, ou vice versa, peut être également utilisée. Encore un autre exemple d'organisation comprend un promoteur bidirectionnel qui conduit l'expression du tTA est du transcrit inhibiteur. En absence de tétracycline, le tTA est exprimé et active la transcription du transgène inhibiteur en un transcrit inhibiteur, qui vient à son tour inhiber le transcrit utile ou d'intérêt (Liang et al., Gène Ther., 3 (1996) 350-356).
L'agent répresseur externe utilisé selon ce premier mode de réalisation, peut être la tétracycline ou l'un de ses analogues tels que la doxycycline, l'anhydrotétracycline, ou l'oxytétracycline (Agha-Mohammadi et al., Gène Ther, 4 (1997) 993-997) susceptibles de conduire à une inhibition de la transcription du transgène inhibiteur, et donc de l'activité du transcrit inhibiteur. L'administration de tétracycline ou d'un de ses analogues permet de lever l'inhibition par le transcrit inhibiteur et ainsi de rétablir un niveau biologiquement efficace du transcrit d'intérêt. Le niveau d'expression du transcrit d'intérêt peut être avantageusement corrélé avec la quantité de tétracycline ou de l'analogue administrée, dans la mesure où les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la tétracycline et de ses analogues sont bien connues de l'homme du métier, et se trouvent entre autres détaillées dans le Vidal, et dans le chapitre "Antimicrobial Agents : Tetracyclines" dans :Goodman and Gilaman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9eme Ed., Joël G. Hardman, Alfred Goodman Gilamn, Lee E. Limbird Ed.
Par ailleurs, du fait de la forte affinité de la tétracycline pour la protéine tetR, la tétracycline ou un analogue de celle-ci peut être utilisé à de faibles concentrations et par conséquent les effets secondaires sont minimes.
De manière encore plus préférentielle, la séquence du transgène inhibiteur est placé sous le contrôle d'un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) ou du CMV humain en amont duquel se trouve une séquence régulatrice telle que décrite notamment dans WO96/30512.
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut également être obtenue par insertion au sein de sa séquence ou de ses extrémités 5' ou 3', de séquences particulières telles que les aptamères qui sont décrits dans la demande européenne EP 99402552, et par Werstuck et al. (Science 282 (1998) 296-298) et présentent une activité autocatalytique de préférence en présence d'un ligand. Ainsi, par insertion d'une séquence aptamère, le transcrit inhibiteur acquiert une activité autocatalytique, qui peut être activée en présence d'un ligand spécifique, lorsque l'on souhaite rétablir une activité de transcrit d'intérêt. La séquence nucléotidique de l'aptamère qui est utilisée pour inhiber le transcrit inhibiteur peut être toute séquence codant pour un ARN ayant une activité autocatalytique ligand-dépendant. Il s'agit par exemple des ribozymes à tête de marteau, des ribozymes du virus de l'hépatite delta, des ribozymes VS Neurospora, des ribozymes en tête d'épingles, des introns du groupe I et II, et de la RNAse P, ou toute séquence dérivée fonctionnelle artificiellement obtenue (Clouet-d'Orval et al., Biochemistry 34 (1995)11186-11190 ; Olive et al.., EMBO J 14 (1995)3247-3251 ; Rogers et al., J. Mol Biol 259 (1996) 916-925). La taille de la séquence aptamère peut varier selon sa nature et son origine, mais est de préférence comprise entre 20 et 200 pb. La localisation de l'insertion des séquences aptamères est généralement déterminée à l'aide de logiciels de bioinformatique tels que " RNA fold " afin d'assurer une stabilité ainsi qu'une activité de clivage optimales en fonction de l'environnement et de la conformation (Zuker M, Method Mol Biol 25 (1994) 267-94 ;Stage- Zimmermann TK, RNA 4 (1998) 875-889).
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut enfin être réalisée par l'intermédiaire d'un ribozyme agissant en trans qui, du fait de sa spécificité de séquence pour une partie du transcrit inhibiteur, est capable de reconnaître et de s'hybrider avec le transcrit inhibiteur, et ainsi de le dégrader. De préférence, le ribozyme trans se présente sous la forme d'un ribozyme allosterique, c'est à dire qu'il présente une activité catalytique Iigand-dépendante, qui est notamment activée en présence d'un ligand. De tels ribozymes allostériques sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits par Soukup et al., (Structure 7 (1999) 783-791 ) et dans WO94/13791.
Les ligands activateurs utilisés sont par exemple des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides ou des sucres, ou encore toutes molécules organiques ou inorganiques capables de se fixer sur la séquence aptamère du transcrit inhibiteur ou sur une séquence du ribozyme allosterique par un mécanisme de reconnaissance moléculaire, et ainsi d'activer l'activité catalytique (Famulok M, Curr Opin Struc Biol 9 (1999) 324-329). Ceux-ci sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits entre autres par Cowan et al. (Nucleic Acids Res. 28(15)(2000)2935-2942) et par Werstuck et al. (Science, 282 (1998), 296- 298). A titre d'exemples, on peut citer les antibiotiques, tels que la doxycycline, la pefloxacine, la tobramycine, la kanamycine, les colorants tels que les colorants Hoechst H33258 et H33342, des mononucléotides tels que le FMN (flavine mononucléotide), l'ATP, l'AMPc, les drogues telles que la théophylline, les adjuvants, et les substituts.
Selon ce mode de réalisation, le transgène d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fonctionnel dans le tissu ou les cellules cibles, de mammifères et de préférence humaines. Le promoteur constitutif conduisant l'expression de transcrit d'intérêt est de préférence tissu- spécifique.
Selon un deuxième mode de réalisation de la présente invention, le transcrit d'intérêt est activé, alors que l'activité du transcrit inhibiteur est soit maintenue constante, soit inhibée de manière concomitante à l'activation du transcrit d'intérêt, afin de rétablir un niveau d'expression ou d'activité biologique suffisant de ce dernier.
L'activation du transcrit d'intérêt peut être obtenue en plaçant la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur inductible. Le transcrit d'intérêt peut être également activé en agissant sur la stabilité de ce dernier.
L'activité du transcrit inhibiteur peut alors être maintenue constante, et dans ce cas, le transgène inhibiteur est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, et n'est soumis à aucune inhibition par l'intermédiaire d'un aptamère ou d'un ribozyme à activité catalytique cis ou trans ligand- dépendante.
Selon un mode de réalisation préférentiel, l'activité du transcrit inhibiteur est réprimée, comme précédemment décrit, de manière concomitante à l'activation du transcrit d'intérêt. Les promoteurs constitutifs ou inductibles utilisés dans ces modes de réalisation, sont bien connus de l'homme du métier. Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée d'origine différente, hétérologue ou homologue, tissu-spécifique ou non, fort ou faible, fonctionnel dans le tissu ou les cellules cibles et donc capable de diriger la transcription d'une séquence liée fonctionnellement.
On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier les promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, de la phosphoglycérate kinase (PGK), α-actine, tubuline, des histones), les promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), les promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, IX, ApoAl, ApoAII, Albumine, Thymidine kinase, etc), les promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, de la villine, de la protéine intestinale de liaison des acides gras, de l'α-actine du muscle lisse, les promoteurs spécifiques de cellules endothéliales comme le promoteur du facteur de Willebrand, les promoteurs spécifiques des cellules de lignées myéloïdes, et hématopoïétiques, tels que le promoteur des IgG, le promoteur de l'énolase spécifique neuronale (Forss-Petter et al., Neuron, 5 (1990) 187); etc), le promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la VAChT (transporteur de l'acétylcholine ; Cervini et al., J.Biol.Chem. 270 (1995) 24654), les promoteurs fonctionnels dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc), tel que le promoteur du gène p53, le promoteur du récepteur de la transferrine ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). Dans le cas de ces derniers, les agents externes sont des facteurs activateurs transcriptionnels spécifiques capables de se fixer en trans, soit directement, soit par l'intermédiaire de récepteurs nucléaires, sur un élément de réponse (RE) du promoteur inductible qui dirige l'expression du transcrit d'intérêt.
L'on peut également utiliser le système de régulation par la rapamycine (PRS) (Rivera et al., Nat. Med. 2(1996) 1028-1032). Celui-ci utilise un facteur de transcription bipartie comprenant deux peptides chimériques d'origine humaine, à savoir une première protéine chimérique de ZFHD1-FKBP12 de liaison à l'ADN et une deuxième protéine chimérique qui résulte de la fusion de la protéine cellulaire FRAP tronquée et d'une séquence de 189 acides aminés en C-terminal de la protéine NF-kB65. En présence de rapamycine, la protéine ZFHD1-FKBP12 se fixe sur la protéine chimérique FRAP-p65 qui active le promoteur ZFHD1 dépendant. De préférence, on utilise pour l'activation du promoteur, en tant qu'agent externe activateur, des analogues inertes de la rapamycine, qui peuvent être administrés par exemple par voie orale ou par voie intraveineuse (Ye et al., Science, 283 (1999) 88-91 ).
De préférence, la séquence inductible prorhotrice du transgène d'intérêt est telle que décrite dans la demande française FR 99 07957 ou par Frohnert et al. (J. Biol. Chem. 274 (1999) 3970-3977) et comprend un ou plusieurs éléments de réponse (PPRE) lié à un promoteur transcriptionnel minimal. Ce système d'activation de l'expression du transgène d'intérêt fonctionne avec les récepteurs nucléaires PPAR α ou γ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) en tant que régulateurs transcriptionnels. Avantageusement, on utilise en tant que corégulateur transcriptionnel, les récepteurs rétinoïdes X (RXR), tel que le RXRα humain, qui sont capables de s'heterodimériser avec les PPAR et ainsi de synergiser l'activation du transgène d'intérêt (Mangelsdorf et al., Nature 345 (1990) 224-229 ; Mangelsdorf et al., Gènes Dev 6 (1992) 329-344 ; Mangelsdorf et al., Cell 83 (1995) 841-851 ; Wilson et al., Curr Op Chem Biol 1 (1997) 235- 241 ; Schulman et al., Mol and Cell Biol 18 (1998) 3483-3494 ; Mukherjee et al., Arterioscler Thromb Vase Biol 18 (1998) 272-276). On peut utiliser un PPAR α ou γ dans sa forme native, sans modification de structure primaire ou un PPAR modifié comprenant un ou plusieurs sites de liaison au ligand ou domaines E/F, de préférence compris entre 2 à 4 (Schoonjans et al., Biochim Biophys Acta 1302 (1996) 93-109). Les limites des domaines E/F varient d'un PPAR à l'autre. A titre d'exemple, pour l'isoforme PPARγ2 humaine, le domaine E/F s'étend de l'acide aminé 284 à l'acide aminé 505. On utilise avantageusement, en tant que régulateur transcriptionnel de l'expression in vivo du transgène d'intérêt, le PPARγ2γ2, c'est à dire un PPAR γ humain modifié comprenant deux domaines E et F répétés dont la séquence protéique complète est représentée sur la séquence SEQ ID NO : 1.
SEQ ID NO : 1
MGETLGDSPIDPESDSFTDTSI^ISQEMMVDTEMPF P FGISSVDLSVMEDHSHSFDI KPFTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYD LQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYN KPHEEPSNSIMAIEŒVCGDKΑSGFHYGVHA-CEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKS R KCQYCRFQKCI_AVGMSHAIRFGRMPQAEKEKL^
SYIKSFPLTKAKΆRAILTGKTTDKSPFVIYDMNSIMGEDKIKFHITPLQEQSKEVAIRIF QGCQFRSVFAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVΉEIIY LASLJ^ QGFMTREFL SLRKPFGDFEPKFEFAVKFNALELDDSDAIFIAVIILSGDRPGIJIRVKPI EDIQDLSΠLQALELQLKI-IRAPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPL QEIYKD YAAILTGKTTDKSPFVIYDT^SL MGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGC QFRSVEAVQEITEYASIPGFVNLDLDQVT KYGVΗEIIYTMLASL KDGVLISEGQGF MTREFLKSLR PFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLVKPIEDI QDLΠ^LQALE QLKLHPESSQLFAKLLQIOITDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQE IYKDLY
Par ailleurs, l'élément de réponse au PPAR (PPRE) qui est donc une région d'acide nucléique capable de fixer un PPAR, et ainsi médier un signal d'activation de transcription du transgène d'intérêt, peut comprendre un ou plusieurs sites de liaison du PPAR. De tels sites sont décrits dans l'art antérieur, comme par exemple dans différent promoteurs humains tels que le promoteur du gène de l'apolipoprotéine AH (Apoll) humain (Vu-Dac et al., J Clin Invest, 96(2), (1995), 741-750). On peut également utiliser des sites construits artificiellement correspondant notamment à la région J du promoteur de l'ApoAII humain localisé par exemple au niveau des nucléotides -734 à -716, par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, de séquence TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID NO : 2) ou tout autre variant fonctionnel de cette séquence. On peut encore utiliser comme site de liaison au PPAR, une séquence correspondant à la région consensus DR1 de séquence AGGTCAAAGGTCA (SEQ ID NO : 3).
En tant qu'agent externe activateur, on utilise les ligands activateurs des PPARα, par exemple les fibrates tels que l'acide fibrique et ses analogues. Comme analogues de l'acide fibrique on peut mentionner notamment le gemfibrozyl (Atherosclerosis 114(1) (1995) 61), le bezafibrate (Hepatology 21 (1995) 1025), le ciprofibrate (BCE&M 9(4) (1995) 825), le clofibrate (Drug Safety 11 (1994) 301), le fénofibrate (Fenofibrate Monograph, Oxford Clinical Communications, 1995), le clinofibrate (Kidney International. 44(6) (1993) 1352), l'acide pirinixique (Wy-14,643) ou l'acide 5,8,11 ,14-eicosatetranoique (ETYA). Ces différents composés sont compatibles avec une utilisation biologique et/ou pharmacologique in vivo. Les agents externes activateurs peuvent également être choisis parmi les ligands naturels et synthétiques des PPARγ. Comme ligands naturels, on peut mentionner les acides gras et les eicosanoïdes tels que par exemple l'acide linoléique, l'acide linolénique, le 9-HODE, le 5-HODE, et comme ligands synthétiques on peut mentionner les thiazolidinediones, telles que notamment la rosiglitazone (BRL49653), la pioglitazone ou la troglitazone (voir par exemple Krey G. et coll., Mol. Endocrinol., 11 (1997) 779-791 ou Kliewer S. et Willson T., Curr. Opin. in Gen. Dev. 8 (1998) 576-581) ou le composé RG12525.
De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, telles que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, le promoteur du gène TK du virus de l'herpès, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition ou délétion de séquences.
Contrairement aux systèmes inductibles connus, qui présentent des périodes de dé-induction du gène exogène, c'est à dire de retour de l'expression à un taux de base, assez longues du fait de la durée de vie et/ou de la difficulté de diffusion des facteurs d'induction, le système selon la présente invention assure une activation et une inhibition consécutive du gène exogène plus rapides et efficaces. En effet, le procédé selon la présente invention permet simultanément à la dé-induction du transcrit utile, de lever l'inhibition du transcrit inhibiteur, et ainsi de réduire, de manière plus rapide et à un niveau résiduel fortement abaissé, l'expression d'un transgène d'intérêt.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens, et est dit transcrit inhibiteur de type ARN antisens. Ce dernier comprend généralement une séquence nucléotidique complémentaire d'au moins une partie du transcrit d'intérêt, et s'hybride de manière sélective aux transcrits d'intérêt par des interactions de type Watson-Crick classique. Le transcrit inhibiteur de type ARN antisens peut donc se fixer au transcrit d'intérêt et par exemple bloquer l'accèέ à la machinerie cellulaire de traduction à l'extrémité 5' du transcrit d'intérêt lorsque ce dernier est un ARNm, gêner sa traduction en protéine, et permettre la suppression de l'expression du transgène d'intérêt in vivo (Kumar et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev, 62 (1993) 1415-1434). De tels polynucleotides ont été par exemple décrits dans les brevets EP 92574 et EP 140308.
Lorsque le transcrit inhibiteur est de type ARN antisens, il peut couvrir toute ou partie de la séquence codante du transcrit d'intérêt de type ARNm, ou toute ou partie de la séquence non codante en 3' ou en 5'. De préférence, le transcrit inhibiteur antisens est complémentaire de la séquence de fixation du ribosome et d'initiation de la traduction (Coleman J et al., Nature 315 (1990) 601-603). De préférence, le transcrit inhibiteur a une longueur d'au moins 10 ribonucléotides. La détermination de la longueur et de la séquence de l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur peut être effectuée par une expérimentation de routine consistant à coinjecter et coexprimer les acides nucléiques codant pour le transcrit inhibiteur et pour le transcrit d'intérêt, et à vérifier une inhibition efficace par diverses techniques de détection connues de l'homme du métier que sont par exemples la RT-PCR, les diverses techniques de dosage de la protéine d'intérêt, et de détection sur Western blot.
Les acides nucléiques codant pour le transcrit d'intérêt et pour le transcrit inhibiteur de type antisens comprennent avantageusement les signaux permettant l'arrêt de la transcription ainsi que des signaux permettant sa stabilisation tels que par exemple une coiffe en 5' et un site de polyadénylation en 3', et éventuellement un intron.
Selon ce mode de réalisation particulier, les transcrits inhibiteurs de type ARN antisens, qui sont coexprimes avec le transgène d'intérêt dans un tissu ou des cellules cibles, sont ainsi capables de bloquer de manière efficace l'expression du transgène d'intérêt au niveau traductionnel, ou l'activité biologique du transcrit d'intérêt au niveau du tissu ou des cellules cibles.
Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le transcrit inhibiteur peut également se présenter sous la forme d'un ARN catalytique ou ribozyme ayant pour cible le transcrit d'intérêt, et est désigné transcrit inhibiteur de type ribozyme. Le ribozyme peut être par exemple un cis ribozyme, c'est à dire agir au niveau intracellulaire en cis (Cech TR, Biosci Rep, 10(3)(1990), 239-261 ). De préférence, il s'agit d'un trans ribozyme, c'est à dire capable de dégrader plusieurs transcrits d'intérêt en trans (Robertson et al., Nature 344 (1990) 467 ; Ellington et al. Nature, 346 (1990) 818 ; Piccirilli et al., Science 256 (1992) 1420 ; Noller et al., Science, 256 (1992), 1416 ; Ellington et al. Nature, 355 (1992) 850 ; Bock et al. 355 (1992) 564 ; Beaudry et al., Science 257 (1992) 635).
Le transcrit inhibiteur de type ribozyme présente généralement deux régions distinctes. Une première région qui présente une certaine spécificité pour le transcrit d'intérêt et est donc capable de se lier à ce dernier, alors que la deuxième région confère au ribozyme son activité catalytique de clivage, ligation et epissage du transcrit d'intérêt. Divers types de ribozymes peuvent être utilisés comme par exemples les ribozymes à tête de marteau ou ribozymes circulaires, les ribozymes en épingles à cheveux, les ribozymes en lasso, les ribozymes tétrahymena, ou RNAse P (Clouet- d'Orval B. et al., Biochemistry, 34 (1995) 11186-90; Olive J.E. et al., EMBO J, 14 (1995) 3247-51 ; Rogers et al. J Mol Biol, 259 (1996), 916-25).
De préférence, le transcrit inhibiteur de type ribozyme est allosterique, c'est à dire que son activité catalytique est régulée par un ligand (Szostak, TIBS, 10 (1992) 89). Certains ribozymes allostériques présentent une activité de clivage spontanée d'ARN cibles, alors que d'autres sont activés ou inhibés suite à un changement de conformation ou suite à une réaction d'hybridation. D'autres ribozymes allostériques dit aptazymes sont doués d'une activité d'autoclivage ligand-dépendante qui est de préférence activée par la fixation d'un ligand. De tels ribozymes régulables qui sont décrits entre autres dans les demandes internationales WO 94/13791 et WO96/21730, et présentent généralement une séquence ribozyme ainsi qu'une séquence de liaison à un ligand qui assure le contrôle de l'activité de clivage. Le transcrit inhibiteur de type ribozyme utilisé dans la présente invention est de préférence inactivé par la fixation d'un ligand, c'est à dire qu'il exerce une activité catalytique constitutive à rencontre du transcrit d'intérêt en absence de ligand, et peut être inactivé grâce à l'administration d'un ligand, afin de rétablir un niveau biologiquement suffisant du transcrit d'intérêt. (Forter et al., Science, 249 (1990) 783-786). La taille du transcrit inhibiteur ribozyme peut varier selon sa nature ou/et son origine. Elle est généralement comprise entre 10 et 500 paires de base, et de préférence au dessous de 300 paires de base. L'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur de type ribozyme peut, en particulier, provenir de séquences d'ARN d'origine naturelle ou être obtenu par synthèse chimique par exemple à l'aide de synthétiseur automatique.
Les ligands utilisés pour la régulation des ribozymes allostériques sont par exemple des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides ou des sucres, ou encore toutes molécules organiques ou inorganiques capables de se fixer sur le transcrit inhibiteur ribozyme et d'inhiber la réaction de clivage du transcrit d'intérêt, ou bien de se fixer sur le transcrit inhibiteur aptazyme, et ainsi d'activer la réaction d'autoclivage. De préférence, le ligand est un agent externe tel qu'un agent ou une drogue non toxique qui peut être administrée in vivo par diverses voies externes, et ainsi agir au niveau de la cellule ou du tissu cible afin d'inhiber le ribozyme allosterique, et de restaurer une concentration et une activité suffisantes du transcrit d'intérêt. Il s'agit de préférence d'un antibiotique tel que la tétracycline, la doxycycline, ou la pefloxacine, ou bien d'un adjuvant inoffensif pour l'organisme auquel il est administré.
Selon ce mode de réalisation particulier, les transcrits inhibiteurs de type ribozyme, qui sont coexprimes avec le transgène d'intérêt dans un tissu ou des cellules cibles, sont ainsi capables de bloquer de manière efficace l'expression du transgène d'intérêt au niveau traductionnel, de diminuer la concentration du transcrit d'intérêt par dégradation enzymatique de type nuclease, transférase, et polymérase, l'activité biologique du transcrit d'intérêt au niveau du tissu ou des cellules cibles, ou encore son interaction avec les constituants cellulaires.
Encore selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN formant des triples hélices, et capable de s'associer au transgène d'intérêt ou transcrit d'intérêt avec lequel il est coexprimé in vivo. Un tel ARN est décrit entre autres, dans la demande W095/18223, par Giovannangeli et al., (J. Am. Chem. Soc, 113 (1991) 7775-7) et par Hélène et al. (CibaFound Symp. 209 (1997), 84- 102)., et code plus particulièrement pour des ARN composites comprenant au moins :
- une première région capable de former une double-hélice avec l'acide nucléique simple-brin ciblé au niveau de la séquence du transgène d'intérêt ou avec une partie de celui-ci.
- une deuxième région capable de former une triple-hélice avec la double- helice ainsi formée ou avec une partie de celle-ci, et
- un ou deux bras reliant les deux régions, chacune des régions pouvant être continue ou interrompue.
De préférence le polynucléotide selon ce mode de réalisation particulier possède une longueur supérieure à 10 bases, et, plus préférentiellement, supérieure à 15 bases. Cette longueur est adaptée par l'homme du métier en fonction de la longueur de l'acide nucléique du transgène d'intérêt ciblé en simple-brin ou du transcrit d'intérêt, de manière à assurer la stabilité, la spécificité et la sélectivité du transcrit inhibiteur triple hélice.
Comme précédemment décrit, le procédé selon la présente invention permet le transfert de gènes étrangers ou exogènes et le contrôle de leur expression de manière efficace et réversible. Ceci est avantageux lorsque le produit thérapeutique du transgène d'intérêt a une action optimale dans une certaine plage de concentration bien définie et devient toxique au dehors de cette plage de concentration (Dranoff et al. Proc. Natl.Acad.Sci. (1993) 3539-3543 ; Schmidt et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 92 (1995) 4711- 4714 ; Naffakh et al., Mol. Med. Today, 2 (1996) 343-348). Par ailleurs, certaines applications cliniques nécessitent une régulation précise de l'expression du transgène d'intérêt à des niveaux biologiques ou thérapeutiques prédéfinis, en vue d'optimiser son activité in vivo.
De plus, le procédé de régulation négative réversible selon la présente invention est particulièrement utile lorsque l'expression d'un transgène d'intérêt ou l'activité du transcrit d'intérêt doit être maintenue à son minimum, voire même éteinte sur de longues périodes et qu'une induction rapide est requise à des moments précis, que ce soit pour des besoins thérapeutiques ou expérimentaux.
Le procédé de contrôle de l'expression d'un gène exogène par inhibition réversible selon l'invention permet de contrôler l'expression de tout transgène ayant un intérêt expérimental dont on souhaite étudier la fonction in vivo, l'implication dans les mécanismes moléculaires ou dans la signalisation cellulaire tels que par exemple des récepteurs, des facteurs de transcription, des transporteurs, etc, ou encore tout transgène d'intérêt codant notamment pour un produit d'intérêt thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, le transgène d'intérêt est une séquence d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain, animal, végétal, etc.) codant pour un produit protéique.
Le transcrit d'intérêt peut être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le transcrit d'intérêt peut être également un ARN ligand (W091/19813).
La présente invention est particulièrement adaptée à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3) (WO96/07981 ), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Ce système est donc particulièrement adapté à des stratégies de thérapies antitumorales par exemple, pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple, dont la production incontrôlée peut avoir des effets secondaires très marqués.
Ce système est aussi particulièrement adapté pour des stratégies de thérapies geniques telles que l'angiogenèse utilisant un gène d'un facteur de croissance comme par exemple le FGF ou le VEGF. Il est adapté pour le contrôle de l'expression d'hormone telle que erythropoiétine ou encore d'anti-cytokines telles que le récepteur soluble du TNF-α utilisé à des fins de thérapies anti-inflammatoires.
Selon le procédé de la présente invention, l'association de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt et de l'acide nucléique comprenant la séquence codant pour le transcrit inhibiteur est transférée simultanément dans le tissu ou la cellule cible pour permettre leur coexpression. Différentes techniques physiques ou mécaniques existent pour effectuer le transfert de ces acides nucléiques, telles que par exemples l'injection, la technique balistique, l'électroporation, l'électroperméabilisation, l'électrotransfert, la sonoporation, les techniques utilisant les champs électriques, les microondes, la chaleur, la pression hydrostatique, ou toute combinaison appropriée de ces techniques (Budker et al., J.Gen. Medicine, 2 (2000) 76-88). De préférence, l'association des acides nucléiques est introduite par injection et électrotransfert, c'est à dire par l'action d'un champ électrique. La technique d'électrotransfert est notamment décrite dans les demandes WO99/01 57 et WO99/01158 et par Aihara et al., Nat. Biotechnol. 16 (9) (1998) 867-870 ; Mir et al., Proc. Natl. Acad. Sc , 96 (1999), 4262-4267 ; Rizzuto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96 (1999) 6417-6422. Les molécules d'acides nucléiques que l'on souhaite transférer peuvent être administrées par exemple par voie directe dans le tissu ou par voie topique ou systémique, puis une ou plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre 1 et 800 Volts/cm, de préférence entre 20 et 200 Volts/cm sont appliquées.
Alternativement, l'association des acides nucléiques selon la présente invention peut être injectée sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrée sous forme complexée avec un agent chimique ou biochimique. En tant qu'agent chimique ou biochimique, on peut citer par exemple la lipofectamine, qui s'associe avec l'ADN en formant des vésicules appelées lipoplexes, ainsi que d'autres polymères tels que le DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891 ), la polyamidoamine (PAMAM), la polylysine, le polyéthylenimine (PEI), le polyvinylpyrrolidone (PVP), et le polyvinylalcool (PVA), etc, voire les protéines virales qui s'associent pour former des virosomes (Schoen et al., Gen Ther, 6 (1999), 5424-5431 ), ou les molécules dérivées des protéines virales (Kichler et al., J Virol, 74 (2000) 5424-5431). On peut également citer les protéines cationiques telles que les histones (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375) et les protamines. Les acides nucléiques peuvent en outre être incorporés à des lipides sous forme brute(Felgner et al., PNAS, 84 (1987) 7413) ou encore être incorporés dans un vecteur tel qu'un liposome (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) ou une nanoparticule. Les liposomes sont des vésicules phospholipidiques comportant une phase aqueuse interne dans laquelle les acides nucléiques peuvent être encapsulés. La synthèse de liposomes et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques est connue dans l'art antérieur (WO91/06309, W092/19752, WO92/19730). Les nanoparticules sont des particules de petite dimension, généralement inférieure à 500 nm, capables de transporter ou de vectoriser un principe actif (tel qu'un acide nucléique) dans les cellules ou dans la circulation sanguine. Les nanoparticules peuvent être constituées par des polymères comportant une majorité de motifs dégradables tels que l'acide polylactique, éventuellement copolymérisé à du polyéthylène glycol. D'autres polymères utilisables dans la réalisation de nanoparticules ont été décrits dans l'art antérieur (EP 275 796 ; EP 520 889).
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à des vecteurs qui comportent un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt. Les acides nucléiques peuvent être portés par le même vecteur ou par des vecteurs distincts. Lorsqu'ils sont portés sur le même vecteur, ils sont portés de préférence portés sur le même brin.
L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'efficacité de transfert dans les cellules cibles, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. Par ailleurs, l'emploi de vecteurs permet également de cibler certaines populations de cellules dans lesquelles les molécules thérapeutiques doivent être produites.
Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules végétales et animales, et de préférence les cellules humaines. Il peut s'agir aussi bien d'un vecteur non viral tel qu'un plasmide, un épisome, un cosmide, un chromosome artificiel, ou d'un vecteur viral. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV), le virus de l'herpès, le cytomegalovirus, le virus de la vaccine, etc. Il peut également s'agir d'un phage, d'une bactérie invasive ou d'un parasite. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224 ; Stratford- Perricaudet et al., Human Gène Therapy 1 (1990) 241 ; EP 185 573 ; Levrero et al., Gène 101 (1991) 195 ; Le Gai la Salle et al., Science, 259 (1993) 988 ; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem, 208 (1992) 211 ; Dobson et al., Neuron, 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 ; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238 ; WO91/18088).
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif. Le terme " virus défectif " désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence de l'acide nucléique double-brin de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Le procédé selon la présente invention utilise des vecteurs notamment viraux contenant les séquences nucléiques d'un transgène d'intérêt et du transgène inhibiteur spécifique, sans toxicité pour les cellules de production, puis ensuite d'induire l'expression de ces molécules toxiques sélectivement dans des cellules cibles en traitant avec l'agent répresseur.
L'invention peut être utilisée pour réguler l'expression d'un transgène d'intérêt dans différents types de cellules, de tissus, ou d'organes, in vivo. En particulier, il peut s'agir d'une cellule, d'un tissu, ou d'un organe d'origine végétale ou animale, de préférence mammifère, et encore plus préférentiellement d'origine humaine. A titre illustratif, on peut citer les cellules musculaires (ou un muscle), hépatiques (ou le foie), cardiaques (ou le coeur, la paroi artérielle ou vasculaire), nerveuses (ou le cerveau, la moelle, etc) ou tumorales (ou une tumeur). Préférentiellement, les compositions, constructions et procédé selon l'invention sont utilisés pour l'expression régulée d'un transgène d'intérêt dans une cellule musculaire ou un muscle in vivo. Les résultats présentés dans les exemples illustrent particulièrement les avantages de l'invention in vivo dans ce type de cellules.
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à des cellules ou des tissus d'origine animale ou végétale, susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que décrit précédemment, et comprenant un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt, et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt. Les tissus selon la présente invention sont de préférence des tissus d'origine animale ou végétale qui sont reconstitués ex vivo, pour donner par exemples des ' organoïdes ou néorganoïdes, dont les cellules ont été modifiées de façon à exprimer le produit biologique du transgène d'intérêt selon le procédé de contrôle de la présente invention, et qui peuvent être ainsi réimplantés (Vandenburgh et al., Hum. Gen Ther. 9(17) (1998) 2555- 2564 ; Powell et al. Hum Gen Ther, 10(4), (1999) 565-577 ;MacColl et al., J.Endochnol, 162(1) (1999) 1-9) .
Encore un autre aspect de la présente invention se rapporte à une composition administrable in vivo comprenant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou utile, la séquence nucléique d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié.
La présente invention se rapporte également à une composition administrable in vivo comprenant au moins un vecteur comportant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, la séquence nucléique d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié, les transcrits d'intérêt et inhibiteurs étant susceptibles d'être activés ou inhibés par un agent externe.
La présente invention se rapporte également à une composition pharmaceutique destinée à être administrée in vivo comprenant au moins un vecteur comportant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, et d'un acide nucléique codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié, les transcrits d'intérêt et inhibiteurs étant susceptibles d'être activés ou inhibés par un agent externe.
La présente invention se rapporte également à médicament comprenant au moins un vecteur comportant la séquence nucléique d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, la séquence nucléique d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, et un véhicule approprié, les transcrits d'intérêt et inhibiteurs étant susceptibles d'être activés ou inhibés par un agent externe.
L'on utilise selon la présente invention tout véhicule approprié à une administration par exemple par voie topique, cutanée, orale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intra- oculaire, transdermique, etc.
De préférence, un véhicule pharmaceutiquement acceptable est utilisé pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour toute autre administration. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les concentrations d'acides nucléiques, comprenant les séquences du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt et du transgène inhibiteur codant pour le transcrit inhibiteur, utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations et le volume des injections peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du transgène d'intérêt dont on veut réguler l'expression, ou encore en fonction de la durée du traitement recherchée.
Parmi les transgènes d'intérêt au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour - les enzymes, comme l'α-1-antitrypsine, les proteinase (métalloproteinases, urokinase, uPA, tPA, et streptokinase), les protéases clivant des précurseurs pour libérer des produits actifs (ACE, ICE) ou leurs antagonistes (T1MP-1 , tissue plasminogen activator inhibitor PAI, TFPI) ;
- les dérivés sanguins comme les facteurs impliqués dans la coagulation : facteurs VII, VIII, IX, les facteurs du complément, la thrombine ;
- les hormones, ou les enzymes impliquées dans la voie de synthèse des hormones, ou les facteurs impliqués dans le contrôle de la synthèse ou de l'excrétion ou de la sécrétion des hormones, telles que l'insuline, les facteurs proches de l'insuline (IGF), ou l'hormone de croissance, l'ACTH, les enzymes de synthèse des hormones sexuelles ;
- les lymphokines et cytokines : interleukines, chemokines (CXC et CC), interférons, TNF, TGF, facteurs chimiotactiques ou activateurs comme M IF, MAF, PAF, MCP-1, l'eotaxine, LIF, etc. (brevet français FR 2 688 514) ;
- les facteurs de croissance, par exemple les IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferine ;
- les facteurs angiogéniques tels que les VEGF ou FGF, angiopoietine 1 ou 2, l'endothéline ;
- les enzymes de synthèse de neurotransmetteurs ;
- les facteurs trophiques, en particulier neurotrophiques pour le traitement des maladies neurodegenératives, des traumatismes ayant endommagé le système nerveux, ou des dégénérescences rétiniennes, tels que les membres de la famille des neurotrophines tels que le NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6 leurs dérivés et gènes apparentés - les membres de la familles du CNTF tels que le CNTF, l'axokine, le LIF et leurs dérivés - l'IL6 et ses dérivés - la cardiotrophine et ses dérivés - le GDNF et ses dérivés - les membres de la famille des IGF, tels que l'IGF-1 , PIFGF-2 et leurs dérivés - les membres de la famille de FGF, tels que le FGF 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et leurs dérivés, le TGFβ ;
- les facteurs de croissance osseuse ;
- les facteurs hématopoïétiques, comme erythropoietine, les GM-CSF, M- CSF, LIF, etc. ;
- les protéines de l'architecture cellulaire comme la dystrophine ou une minidystrophine (brevet français FR 2 681 786), les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine désaminase, enzymes à cytochrome P450), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques ; - les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-l, A-Il, A-IV, B, C-l, C-ll, C-lll, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple les lipases, la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidyl acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaison des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs aux LDL, les récepteurs des chylomicrons et les récepteurs scavenger, et la leptine pour le traitement de l'obésité ;
- les facteurs régulant la pression sanguine, comme les enzymes impliquées dans le métabolisme du NO, l'angiotensine, la bradykinine, vasopressine, FACE, la rénine, les enzymes codant pour les mécanismes de synthèse ou de relargage des prostaglandines, du thromboxane, ou de Fadénosine, les récepteurs de Fadénosine, les kallikréines et kallistatines, ANP, ANF, les facteurs diurétiques ou antidiurétiques, les facteurs impliqués dans la synthèse, le métabolisme ou le relargage des médiateurs comme l'histamine, la sérotonine, les cathécholamines, les neuropeptides ;
- les facteurs anti-angiogéniques comme le ligand de Tie-1 et de Tie-2, Fangiostatine, le facteur ATF, les dérivés du plasminogène, Fendothéline, les thrombospondines 1 et 2, le PF-4, Finterferon α ou β, Finterieukine 12, le TNFα, le récepteur de Furokinase, fltl , KDR, PAU , PAI2, TIMP1 , le fragment prolactine ;
- les facteurs protégeant contre l'apoptose, comme la famille AKT ;
- les protéines susceptibles d'induire une mort cellulaire, soit actives en elles-mêmes comme les caspases, soit de type "pro-drogues" nécessitant une activation par d'autres facteurs, soit les protéines activant des prodrogues en agent provoquant une mort cellulaire, comme la thymidine kinase du virus herpétique, les désaminase, permettant en particulier d'envisager des thérapies anticancéreuses ; - les protéines impliquées dans les contacts et l'adhésion inter-cellulaires : VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, intégrines, cathéniηes ;
- les protéines de la matrice extra-cellulaire ;
- les protéines impliquées dans la migration des cellules ;
- les protéines de type transduction du signal, type FAK, MEKK, p38 kinase, tyrosines kinases, serines- thréonines kinases ;
- les protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (p21 , p16, cyclines) ainsi que les protéines mutantes ou dérivées dominant négatif bloquant le cycle cellulaire et pouvant le cas échéant induire l'apoptose ;
- les facteurs de transcription : jun, fos, AP1 , p53 et les protéines de la cascade de signalisation de p53 ;
- les protéines de structure de la cellule, comme les filaments intermédiaires (vimentine, desmine, kératines), la dystrophine, les protéines impliquées dans la contractilité et le contrôle de la contractilité musculaire, en particulier les protéines impliquées dans le métabolisme calcique et les flux de calcium dans les cellules (SERCA). Dans les cas de protéines fonctionnant par des systèmes ligands et récepteurs, il est envisageable d'utiliser le ligand (par exemple le FGF ou le VEGF) ou le récepteur (FGF-R, VEGF-R). On peut également citer des gènes codant pour des fragments ou des mutants de protéines de ligands ou de récepteurs, notamment des protéines précitées, présentant soit une activité supérieure à la protéine entière, soit une activité antagoniste, voire même de type "dominant négatif par rapport à la protéine initiale (par exemples, des fragments de récepteurs inhibant la disponibilité de protéines circulantes, associés ou non avec des séquences induisant une sécrétion de ces fragments par rapport à un ancrage dans la membrane cellulaire, ou d'autres systèmes de modification du trafic intracellulaire de ces systèmes ligand-récepteurs de façon à détourner la disponibilité d'un des éléments) soit même possédant une activité propre distincte de celle de la protéine totale (ex. ATF).
Parmi les transgènes d'intérêt codant pour des protéines ou peptides s'écrétés par le tissu, il est important de souligner les anticorps, les fragments variables d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance pour son utilisation en immunothérapie, par exemple pour le traitement des maladies infectieuses, des tumeurs, des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques (anticorps antiidiotype), ainsi que les ScFv se fixant sur les cytokines pro-inflammatoires telles que par exemple IL1 et TNFα pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde. D'autres transgènes d'intérêt utilisés dans le médicament selon l'invention codent, de façon non limitative, pour des récepteurs solubles, comme par exemple le récepteur CD4 soluble ou le récepteur soluble du TNF pour la thérapie anti-HIV, le récepteur TNFα ou le récepteur soluble IL1 pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde, le récepteur soluble de l'acétylcholine pour le traitement de la myasthénie ; des peptides substrats ou inhibiteurs d'enzymes, ou bien des peptides agonistes ou antagonistes de récepteurs ou de protéines d'adhésion comme par exemple pour le traitement de l'asthme, de la thrombose de la resténose, des métastases ou de l'inflammation ; des protéines artificielles, chimériques ou tronquées. Parmi les hormones d'intérêt essentiel, on peut citer l'insuline dans le cas du diabète, l'hormone de croissance et la calcitonine. On peut citer encore des protéines capables d'induire une immunité antitumorale ou stimuler la réponse immunitaire (IL2, GM-CSF, IL12, etc.). Enfin on peut citer les cytokines qui diminuent la réponse Tm telles que IL10, IL4 et IL13.
D'autres transgènes présentant un intérêt peuvent également être utilisés dans les compositions et les médicaments selon la présente invention ont été notamment décrits par McKusick, V.A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal récessive, and X-linked phenotypes. Eighth édition. John Hopkins University Press (1988)), et dans Stanbury, J.B. et al. (The metabolic basis of inherited disease, Fifth Edition. McGraw-Hill (1983)). Les transgènes d'intérêt recouvrent les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants de la cellule.
On peut ainsi citer de manière non limitative les gènes associés aux maladies du métabolisme des carbohydrates comme par exemple fructose-1 -phosphate aldolase, fructose-1,6-diphosphatase, glucose-6-phosphatase, α-1 ,4-glucosidase lysosomale, amylo-1 ,6- glucosidase, amylo-(1 ,4 :1 ,6)-transglucosidase, phosphorylase musculaire, phosphofructokinase musculaire, phosphorylase-b-kinase, galactose-1- phosphate uridyl transférase, toutes les enzymes du complexe pyruvate déshydrogénase, pyruvate carboxylase, 2-oxoglutarate glyoxylase carboxylase, D-glycérate déhydrogénase. On peut également citer : - les gènes associés avec des maladies du métabolisme des amino- acides comme par exemple phénylalanine hydroxylase, dihydrobioptérine synthétase, tyrosine aminotransférase, tyrosinase, histidinase, fumarylacéto- acétase, glutathion synthétase, γ-glutamylcystéine synthétase, omithine-δ- aminotransférase, carbamoylphosphate synthétase, ornithine carbamoyltransférase, argininosuccinate synthétase, argininosuccinate lyase, arginase, L-lysine dehydrogenase, L-lysine kétoglutarate réductase, valine transaminase, leucine isoleucine transaminase, décarboxylase des 2- céto-acides à chaîne ramifiée, isovaléryl-CoA dehydrogenase, acyl-CoA dehydrogenase, 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA lyase, acétoacétyl-CoA 3- kétothiolase, propionyl-CoA carboxylase, méthylmalonyl-CoA mutase, ATP :cobalamine adénosyltransférase, dihydrofolate réductase, méthylène tétrahydrofolate réductase, cystathionine β-synthétase, le complexe sarcosine deshydrogenase, les protéines appartenant au système de clivage de la glycine, β-alanine transaminase, camosinase sérique, homocamosinase cérébrale.
- Les gènes associés avec des maladies du métabolisme des graisses et des acides gras, comme par exemple lipoprotéine lipase, apolipoprotéine C-ll, apolipoprotéine E, d'autres apolipoprotéines, lécithine cholestérolacyltransférase, récepteur des LDL, stérol hydroxylase du foie, " acide phytanique " α-hydroxylase.
- Les gènes associés avec des déficiences lysosomales, comme par exemple α-L-iduronidase lysosomale, iduronate sulfatase lysosomale, héparan N-sulfatase lysosomale, N-acétayl-α-D-glucosaminidase lysosomale, acétyl-CoA : α-glucosamine N-acétyltransférase lysosomale, N- acétyl-α-D-glucosamine 6-sulfatase lysosomale, galactosamine 6-sulfate sulfatase lysosomale, β-galactosidase lysosomale, arylsulfatase B lysosomale, β-glucuronidase lysosomale, N-acétylglucosaminyl- phosphotransferase, α-D-mannosidase lysosomale, α-neuraminidase lysosomale, aspartylglycosaminidase lysosomale, α-L-fucosidase lysosomale, lipase acide lysosomale, céramidase acide lysosomale, sphingomyelinase lysosomale, glucocérébrosidase lysosomale et galactocérébrosidase lysosomale, galactosylcéramidase lysosomale, arylsulfatase A lysosomale, α-galactosidase A, β-galactosidase acide lysosomale, chaîne α de l'hexosaminidase A lysosomale.
On peut également citer, de façon non restrictive, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des stéroïdes et des lipides, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des purines et des pyrimidines, les gènes associés à des maladies du métabolisme de la porphyrine et de l'hème, les gènes associés à des maladies du métabolisme du tissu conjonctif, des et des os ainsi que les gènes associés avec des maladies du sang et des organes hématopoïétiques, des muscles (myopathie), du système nerveux (maladies neurodegenératives) ou de l'appareil circulatoire (traitement des ischémies et de la sténose par exemple) et les gènes impliqués dans les maladies génétiques mitochondriales.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation de l'association telle que précédemment décrite pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de certaines anomalies ou déficiences génétiques, telles que par exemple les maladies génétiques mitochondriales, l'hémophilie, et la β-thalassémie.
En outre, elle a pour objet l'utilisation de l'association selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de certaines maladies telles que par exemple l'ischémie, la sténose, les myopathies, les maladies neurodegenératives, les maladies du métabolisme telles que les maladies lysosomales, les maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïdes, les troubles hormonaux tels que le diabète, les maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension, les hyperlipidémies telles que l'obésité.
La présente invention a encore pour objet l'utilisation de l'association telle que précédemment décrite pour la préparation d'un médicament anticancéreux, ou pour la préparation de vaccins, par exemple ADN antitumoral. Les nombreux exemples qui précèdent et ceux qui suivent illustrent l'étendue potentielle du champ d'application de la présente invention.
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à des animaux transgéniques qui expriment un transgène d'intérêt codant pour ou transcrit d'intérêt ainsi qu'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt dans un ou plusieurs types cellulaires. Les méthodes de génération d'animaux transgéniques particulièrement de souris transgéniques, sont maintenant bien connues de l'homme du métier, et sont notamment décrites par Hogan et al. (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory.
Selon la présente invention, les acides nucléiques précédemment décrits sont transférés dans des ovocytes fertilisés non humains par microinjection, en implantant l'ovocyte chez une femelle porteuse, afin que celui-ci se développe. Généralement, les acides nucléiques sont intégrés dans le génome de la cellule à partir de laquelle l'animal transgénique se développe et restent dans le génome de l'animal adulte, de sorte qu'une expression du transgène d'intérêt et du transgène inhibiteur dans une ou plusieurs cellules ou tissus de l'animal transgénique peut être observée. Les animaux transgéniques portant les séquences nucléiques du transgène d'intérêt et du transgène inhibiteur peuvent être également être croisés à d'autres animaux transgéniques portant d'autres transgènes.
Comme animaux transgéniques ainsi produits, on peut citer par exemple une souris, une chèvre, un mouton, un cochon, une vache ou tout autre animal domestique. De tels animaux transgéniques ont un phénotype semblable aux animaux sauvages, toutefois le transgène ou transcrit d'intérêt est restauré lorsque l'on administre à l'animal un agent externe répresseur du transcrit inhibiteur et/ou d'un agent activateur de l'activité du transcrit d'intérêt. Ces animaux transgéniques sont utilisés pour simuler la physiopathologie de certaines maladies humaines ou animales et constituent donc des modèles expérimentaux des maladies humaines ou animales. Par exemple, chez un animal hôte, le transgène d'intérêt susceptible d'être impliqué dans une pathologie peut être cointroduit avec son transgène inhibiteur spécifique, sans provoquer l'apparition d'un phénotype particulier. L'expression du transgène d'intérêt étudié peut ensuite être modulée par l'administration d'un agent externe répresseur du transcrit inhibiteur, et/ou d'un agent externe activateur du transcrit d'intérêt, afin de déterminer la relation qui existe entre l'expression de ce gène et l'apparition d'un phénotype pathologique. Une telle approche présente un certain avantage sur la technique usuelle d'invalidation ( knock out) puisque les animaux transgéniques selon la présente invention permettent non seulement une inactivation totale d'un transgène d'intérêt, mais également réversible ainsi que la possibilité de réguler son expression de manière plus efficace.
Un dernier aspect de la présente invention se rapporte à des cellules végétales et des plantes transgéniques comprenant dans leur génome un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt. Ces plantes peuvent être obtenues par les techniques habituelles de transgénèse végétale. Des plasmides portant les acides nucléiques codant pour le transgène ou le transcrit d'intérêt et pour le transcrit inhibiteur placés sous le contrôle de promoteurs de transcription naturellement fonctionnels chez les plantes sont introduits par exemple dans une souche d'Agrobacterium tumefaciens. La transformation des plantes peut être ensuite réalisée en utilisant les protocoles de transformation et de régénération standard (Deblaere et al., Nucleic Acid Research 13 (1985) 4777-4788 ; Dinant et al., European Journal of Plant Pathology 104 (1998) 377-382).
On peut utiliser des promoteurs constitutifs tels que par exemple le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleurs (CaMV) (Odell et al., Nature 313 (1985) 810-812). Pour diriger l'expression du transcrit d'intérêt, on peut utiliser des promoteurs inductibles, tels que les promoteurs inductibles par les glucocorticoïdes qui est activé entre autres par la dexaméthasone (Aoyama et al., Plant J. 11 (1997) 605-612 ; Aoyama et al., Gène Expression in Plants (1999) 44-59), le système inductible par l'éthanol (Caddick et al., Nat Biotechnol, 16 (1998) 177-180), les systèmes d'activation transcriptionnel par les hormones stéroïdiennes telles que le β- estradiol (Bruce et al., Plant Cell 12 (2000) 65-80). Alternativement, on utilise un système transcriptionnel inductible à l'ecdysone tel que décrit par Martinez et al. (Plant J, 19 (1999) 97-106) qui fonctionne avec un activateur hybride contenant les séquences de transactivation de récepteur des glucocorticoïdes (GR) et de VP16, le domaine de liaison à l'ADN du GR, et le domaine de régulation hormone-dépendant du récepteur à l'ecdysone. Ce dernier système peut être activé entre autres par un agoniste non stéroïdien de l'ecdysone, le RH5992, et permet donc de restaurer un niveau d'expression du transgène d'intérêt à l'état activé. Toutefois, alors que ce système de régulation présente à l'état non activé un niveau basai élevé, lorsqu'il est utilisé pour conduire l'expression d'un transgène d'intérêt en coexpression avec un transcrit inhibiteur de celui-ci, selon la présente invention, le niveau basai du transgène d'intérêt est fortement abaissé.
Selon ce dernier aspect, un gène étranger cytotoxique, voire même létal peut être exprimé de manière ponctuelle sur un laps de temps court sans inhiber la régénération de la plante transduite et en limitant la mort cellulaire. Ce système d'inhibition réversible de l'expression du transgène d'intérêt est par conséquent extrêmement utile pour certaines applications de biotechnologie de production de plantes et dans le cadre de la recherche fondamentale agronomique.
Ainsi, la présente invention est particulièrement utile pour l'étude de gènes dont la surexpression ou même une expression de base a des effets délétères pour l'organisme dans lequel ils sont exprimés. A titre d'exemples, une production non contrôlée de cytokines chez une plante provoque par exemple l'apparition de phénotypes anormaux au cours du développement tel que l'absence de racine, la perte de la dominance apicale, la stérilité, ou une toxicité cellulaire qui bloque dans le cas des plantes la régénération des tissus végétaux ou entraîne même des problèmes de létalité.
Le procédé d'inhibition réversible selon la présente invention de gènes exogènes peut par ailleurs s'avérer utile pour l'étude de la stabilité du produit du transgène d'intérêt (Gil et al., EMBO J., 15(1996), 1678-1686), ou l'évaluation le turnover du produit d'un gène exogène.
Les plantes transgéniques selon la présente invention portant les constructions du transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et du transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, selon la présente invention, peuvent également servir à l'étude de certains mécanismes moléculaires et d'interactions des gènes. En effet, lorsque l'expression de certains gènes conduit à la mort cellulaire, les lignées transgéniques portant à la fois les séquences du transgène d'intérêt létal et de son transcrit inhibiteur peuvent être utilisées pour isoler les mutants qui permettent d'étudier par la suite les interactions et mécanismes moléculaires de la mort cellulaire. Outre le contoumement du phénotype létal, le système selon la présente invention facilite l'analyse fonctionnelle de certains gènes et de leur intervention dans l'apparition d'un phénotype, ainsi que leurs implications éventuelles dans certaines voies de transduction des signaux. Egalement, le procédé selon l'invention permet de faciliter l'étude de gènes végétaux qui sont susceptibles d'affecter le développement du végétal aux stades précoces, mais peuvent jouer un rôle à des stades plus tardifs du développement. Des mutations de ces gènes affectent le développement de la plante, et par conséquent empêchent l'étude des fonctions tardives éventuelles de ces gènes. Des plantes transformées avec la séquence portant le transgène d'intérêt et son transcrit inhibiteur peuvent suivre un développement précoce normal, et l'administration d'un agent externe approprié à un stade de développement ultérieur permet avantageusement de restaurer l'expression des gènes en question et de déterminer leurs fonctions tardives. Les chimères végétales selon l'invention sont donc susceptibles de fournir de nouvelles informations, par exemple sur les mécanismes de signalisation chez les plantes.
La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figures 1A à 1E : Représentations schématiques des plasmides pXL3031 (fig. 1A), pXL3010 (fig. 1B), pSeAPantisens (fig. 1C), pXL3296(fig. 1D), et pLucAntisens (fig. 1E).
Figures 2A à 2E : Représentations schématiques des plasmides pTet- Splice (fig. 2A), pTetLucAntisens (fig. 2B), pTetLuc (fig. 2C), pTetSeAPantisens (fig. 2D) et pTet-tTAk (fig. 2E).
Figures 3A à 3D : Représentations schématiques des plasmides pGJA1 (fig.3A), pGJA2 (fig. 3B), pGJA3 (fig.3C) et pGJA9 (fig. 3D). Figures 4A à 4D : Représentations schématiques des plasmides pGJA15-2 (fig.4A), pGJA15 (fig.4B), pGJA14 (fig 4C) et pGJA14-2 (fig.4D).
Figures 5A et 5B : Représentations schématiques des plasmides pRDA02 (5B) et pSG5-hPPARγ2 (5A).
Figures 6A et 6B : Représentation schématique des plasmides pIND (6A), pINDSeAP (6B), et PVgRXR.
Figure 7 (A) : illustre l'activité de la SeAP mesurée 48h après cotransfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants :
1 : 0.25 μg de pXL3010 (S) + 0.75 μg pXL3296 (V) ;
2 : 0.25 μg de pXL3010 (S) + 0.25 μg pSeAPantisens (A) + 0.50 μg pXL3296.(V) ; 3 : 0.25 μg de pXL3010 (S) + 0.50 μg pSeAPantisens (A) + 0.25 μg pXL3296(V) ;
4 : 0.25 μg de pXL3010 (S) + 0.75 μg pSeAPantisens (A) ; et
5 : 0.25 μg pSeAPantisens (A) + 0.75 μg pXL3296 (V).
Figure 7(B) : illustre les activités relatives luciférase mesurée 24 h après cotransfection des plasmides suivants :
1 : 0.125 μg de pXL3031 + 0.75 μg pXL3296.
2 : 0.125 μg de pXL3031 + 0.125 μg pLucAntisens + 0.25 μg pXL3296.
3 : 0.125 μg de pXL3031 + 0.25 μg pLucAntisens + 0.125 μg pXL3296. 4 : 0.125 μg de pXL3031 + 0.375 μg pLucAntisens.
5 : 0.125 μg pLucAntisens + 0.375 μg pXL3296.
Figure 8: représente une photographie d'un gel d'électrophorèse illustrant la présence des ARN sens et antisens par RT-PCR in vitro. Pistes 1 et 9 : marqueur 100 paires de bases (Gibco BRL) Piste 2 : témoin PCR en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice. Piste 3: RT-PCR sur les ARN totaux extraits des cellules transfectées par 0.25 μg de pXL3010 + 0.75 μg pXL3296. Piste 4: RT-PCR sur les ARN extraits des cellules transfectées par 0.25 μg de pXL3010 + 0.25 μg pSeAPantisens + 0.50 μg pXL3296. Piste 5: RT-PCR sur les ARN extraits des cellules transfectées par
0.25 μg de pXL3010 + 0.75 μg pSeAPantisens. Pistes 6 à 8: contrôles PCR (sans RT) effectuées sur les ARN utilisés respectivement en 3, 4 et 5.
Figure 9A: illustre les activités SeAP in vitro mesurées 24h après cotransfection des jeux de plasmides suivants : condition 1 : 25% pXL3010 + 75% pXL3296 condition 3 : 25% pXL3010 + 25% pSeAPantisens + 50% pXL3296 condition 5 : 25% pXL3010 + 25% pLucAntisens + 50% pXL3296
Figure 9B : illustre les activités relatives de luciférase, mesurées 24h suite à des transfections indépendantes in vitro des jeux de plasmides suivants : condition 2 : 25% pXL3031 + 75% pXL3296 condition 4 : 25% pXL3031 + 25% pLucantisens + 50% pXL3296 condition 6 : 25% pXL3031 + 25% pSeAPantisens + 50% pXL3296
Figure 10 : illustre les taux relatifs de la SeAP circulante mesurés après injections bilatérales intramusculaires dans le muscle squelettique tibial cranial et électrotransfert de plasmides codant pour la séquence sens (pXL3010) et la séquence antisens (pSeAPantisens) du gène rapporteur de la SeAP, soit simultanément (lot 2) soit à 22 jours d'intervalle (lot 1). Lot 1 : 10 souris injectées avec 30μg d'un plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 30μg de pSeAPantisens + électrotransfert (2eme injection au jour 22) ; Lot 2 : 10 souris coinjectées avec 30μg d'un plasmide pXL3010 + 30μg d'un plasmide pSeAPantisens + électrotransfert (coinjection) ; Lot 3: 10 souris injectées avec 30μg d'un plasmide pSeAPantisens + électrotransfert (groupe témoin).
Figure 11 A: représente une photographie d'un gel d'électrophorèse illustrant la présence d'ARN sens et antisens du gène rapporteur SeAP par
RT-PCR in vivo des lots 1 à 3 de la figure 6.
Pistes 1 et 13 : marqueur d'ADN 100 bp (Gibco) ; Pistes 2 et 3 : ARN sens et antisens respectivement, dans des muscles des souris du lot 1 (pXL3010 puis réinjection de pSeAPantisens 22 jours après) ;
Pistes 4 et 5 : ARN sens et antisens, respectivement, dans des muscles des souris du lot 2 (coinjection de pXL3010 et de pSeAPantisens) ; Pistes 6 et 7 : ARN sens et antisens, respectivement, dans des muscles des souris du lot 3 (pSeAPantisens seul) ;
Pistes 8 à 10 : contrôles PCR sans RT des ARN utilisés dans les pistes 2 à
7 ;
Piste 11 : contrôle : PCR en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice ; Piste 12 : plasmide pXL3010.
Figure 11B : représente une photographie d'un film d'autoradiographie obtenu par transfert et hybridation sur membrane de nitroceliulose du gel d'agarose photographié à la figure 11A en présence d'oligonucléotides sondes marqués au 32P spécifiques de la séquence sens du gène rapporteur SeAP (S) et de la séquence antisens (AS).
Figure 12: Suivi de l'activité relative de SeAP circulante dans le plasma de souris après injections bilatérales intramusculaires dans le muscle squelettique tibial cranial et électrotransfert des plasmides suivants aux intervalles de temps décrits ci-dessous : Lot 1 : 10 souris injectées avec 15 μg de plasmide pXL3010 + électrotransfert ;
Lot 2 : 10 souris injectées avec 15 μg de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 45 μg de pXL3296 + électrotransfert 21 jours après ;
Lot 3 : 10 souris injectées avec 15 μg de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 15 μg de pSeAPantisens + 30 μg de pXL3296 + électrotransfert 21 jours après ;
Lot 4 : 10 souris injectées avec 15 μg de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 30 μg de pSeAPantisens + 15 μg de pXL3296 + électrotransfert 21 jours après ;
Lot 5 : 10 souris injectées avec 15 μg de plasmide pXL3010 + électrotransfert, puis injection de 45 μg de pSeAPantisens + électrotransfert 21 jours après.
Figure 13: Suivi de l'activité relative de SeAP circulante dans le plasma de souris après coinjection et electrotransfert (ET) des plasmides suivants : Lot 1 : 9 souris injectées avec 30 μg de plasmide pXL3010 + ET; Lot 2 : 9 souris injectées avec 30 μg de plasmide pXL3010 + ET; Lot 3 : 9 souris coinjecteés avec 30 μg de plasmide pXL3010 + 30 μg de pSeAPantisens + ET;
Lot 4 : 9 souris injectées avec 30 μg de plasmide pXL3010 + ET; Lot 5 : 9 souris injectées avec 30 μg de plasmide pXL3010 + ET;
Figure 14 A: Activités relatives de la SeAP in vitro mesurées après transfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants avec ou sans traitement ultérieur de tétracycline:
Colonne 1 : 1 μg pXL3010 + 1 μg pXL3296 (vide)
Colonne 2 : 1 μg pXL3010 + 0.5 μg pXL3296 (vide) + 0.5 μg pSeAPantisens ;
Colonne 3 : 1 μg pXL3010 + 1 μg pSeAPantisens ; Colonne 4: 1 μg pXL3010 + 0.5 μg pTetSeAPantisens + 0.5 μg pTet-tTAk sans tétracycline ; Colonne 5 : 1 μg pXL3010 + 0.5 μg pTetSeAPantisens + 0.5 μg pTet-tTAk avec tétracycline (1 mg/ml) ; Colonne 6 : 1 μg pXL3010 + 1 μg pTetSeAPantisens + 0.5 μg pTet-tTAk sans tétracycline ; Colonne 7 : 1 μg pXL3010 + 1 μg pTetSeAPantisens + 0.5 μg pTet-tTAk avec tétracycline (1 mg/ml).
Figure 14B: Activités relatives de la SeAP in vitro mesurées après transfection des cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants avec ou sans traitement ultérieur de tétracycline:
Colonne 1 : 0.5 μg pXL3010 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pXL3296 (vide) ; Colonne 2 : 0.5 μg pXL3010 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pSeAPantisens ; Colonne 3 : 0.5 μg pXL3010 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pTetSeAPantisens sans tétracycline ; Colonne 4 : 0.5 μg pXL3010 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pTetSeAPantisens avec tétracycline (1 mg/ml) ; Colonne 5 : 0.5 μg pXL3010 + 2.5 μg pXL3296 (vide) ; Colonne 6 : 0.5 μg pXL3010 + 0.5 μg pTet-tTAk + 2.5 μg pTetSeAPantisens sans tétracycline ; Colonne 7 : 0.5 μg pXL3010 + 0.5 μg pTet-tTAk + 2.5 μg pTetSeAPantisens avec tétracycline (1 mg/ml).
FIGURE 15 : Activités relatives de la luciférase 24h après cotransfection des cellules NIH 3T3 (80000 cellules par puits) avec les plasmides suivants (0.7 ou 1.1 μg d'ADN par puits) avec ou sans administration de tétracycline:
1 : 0.1 μg pXL3031 + 0.3 μg pTet-tTAk + 0.3 μg pXL3296 ;
2 : 0.1 μg pXL3031 + 0.3 μg pTet-tTAk + 0.3 μg pLucAntisens ; 3 : 0.1 μg pXL3031 + 0.3 μg pTet-tTAk + 0.3 μg pTetLucAntisens sans tétracycline ;
4 : 0.1 μg pXL3031 + 0.3 μg pTet-tTAk + 0.3 μg pTetLucAntisens avec tétracycline (1 mg/ml) ; 5 : 1 μg pXL3031 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pXL3296 ;
6 : 0.1 μg pXL3031 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pTetLucAntisens sans tétracycline ; 7 : 0.1 μg pXL3031 + 0.5 μg pTet-tTAk + 0.5 μg pTetLucAntisens avec tétracycline (1 mg/ml).
FIGURE 16A : Taux relatifs de SeAP circulante in vivo après coinjection en intramusculaire de souris SCID femelles de 6 semaines des plasmides suivants avec ou sans administration de tétracycline à des intervalles de temps variables : Lot 1 : 10 souris injectées avec 20 μg de plasmide pXL3010 + 40 μg pTet- tTAk; Lot 2 : 10 souris injectées avec 20 μg de plasmide pXL3010 + 20 μg pTet- tTAk + 20μg pSeAPantisens ; Lot 3 : 10 souris injectées avec 20 μg de plasmide pXL3010 +20 μg pTet- tTAk + 20 μg pTetSeAPantisens.
FIGURE 16B : Taux relatifs de SeAP circulante in vivo après coinjection en intramusculaire de souris SCID femelles de 6 semaines des plasmides suivants, avec ou sans administration de tétracycline à des intervalles de temps variables :
Lot 1 : 10 souris injectées avec 20 μg de plasmide pXL3010 + 20 μg pTet- tTAk + 20μg pSeAPantisens ;
Lot 2 : 10 souris injectées avec 20 μg de plasmide pXL3010 +20 μg pTet- tTAk + 20 μg pTetSeAPantisens ; Lot 3 : lot 2 + boisson à la tétracycline (2mg/ml + 2 mg/ml de sucrose) pendant 9 jours. Puis arrêt de la tétracycline au 10ιeme jour. Remises sous tétracycline au 22eme jour (injection IP tous les deux jours, 500 μg/souris), et arrêt au 30eme jour. Remises sous doxycycline au 63ième jour (400 mg/l dans la boisson).
FIGURE 17: Mesure de l'expression de la SeAP 48h après cotransfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants : T+ : 1 μg pXL3010 + 1 μg pXL3296 T- : 1 μg pXL3010 + 1 μg pSeAPantisens
1 : 1μg pXL3010 + 1 μg pGJAI
2 : 1μg pXL3010 + 1 μg pGJA2
3 : 1μg pXL3010 + 1 μg pGJA3
FIGURE 18: Mesure de l'expression de la SeAP mesurée 48h après cotransfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants :
Colonnes 1 et 2 : contrôle de cellules non transfectées, deux expériences distinctes nommées 4 et 5;
Colonnes 3 et 4 : T+ : 1μg pXL3010 + 1 μg pXL3296, expériences 4 et 5, respectivement;
Colonnes 5 et 6 : T- : 1μg pXL3010 + 1 μg pSeAPantisens, expériences 4 et
5, respectivement;
Colonnes 7 et 8 : PGJA9 : 1μg pXL3010 + 1μg pXL3296 + 1μg pXGJA9, expériences 4 et 5, respectivement.
Figure 19: tableau récapitulatif des inhibitions d'expression de la SeAP obtenues par la transfection dans les cellules NIH3T3 des plasmides pGJA1 , pGJA2, pGJA3 et pGJA9, comparées à l'inhibition produite par le plasmide comportant Fantisens SeAPantisens entier. Figure 20: Suivi de l'activité relative de SeAP circulante dans le plasma de souris après injections bilatérales intramusculaires dans le muscle squelettique tibial cranial et électrotransfert des plasmides suivants, suivi de l'administration de doxycycline aux intervalles de temps suivants : Lot 3 : un lot de souris injectées avec 20 μg pXL3010 + 20 μg pTet-tTAk + 20 μg pTetSeAPantisens, et doxycycline à 400mg/l ajoutée uniquement au jour 170;
Lot 4 : un lot de souris injectées avec 20 μg pXL3010 + 20 μg pTet-tTAk + 20 μg pTetSeAPantisens, et doxycycline à 400mg/l pendant des durées de 7 jours aux périodes indiquées.
Figure 21 : mesure de l'expression de la SeAP mesurée 48h après transfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants, pour un nombre de copies équivalant à 1μg pXL3010, qsp pXL3296: Colonne 1 : pGJA14; Colonne 2 : pGJA14-2; Colonne 3 : pGJA15; et Colonne 4 : pGJA 15-2.
Figure 22: mesure de l'expression de la SeAP 24h après cotransfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants, pour un nombre de copies équivalant à 0,5 μg pXL3010, qsp pXL3296:
Colonne 1 : pGJA15;
Colonne 2 : pGJA15 + pTet-tTAk; Colonne 3 : pGJA15 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final ;
Colonne 4 : pGJA15-2 ;
Colonne 5 : pGJA15-2 + pTet-tTAk;
Colonne 6 : pGJA15-2 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final. Figure 23: mesure de l'expression de la SeAP 48h après transfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants, pour un nombre de copies équivalant à 0,5 μg pXL3010, qsp pXL3296:
Colonne 1 : pXL3010; Colonne 2 : pXL3010 + pSeAPantisens;
Colonne 3 : pXL3010 + pTet-tTAk;
Colonne 4 : pXL3010 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final;
Colonne 5 : pGJA14;
Colonne 6 : pGJA14 + pTet-tTAk; Colonne 7 : pGJA14 + pTet-tTAk + tétracycline 1 μg /ml final;
Colonne 8 : pGJA14.2;
Colonne 9 : pGJA14.2 + pTet-tTAk;
Colonne 10 : pGJA14.2 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final;
Colonne 11 : pGJA15; Colonne 12 : pGJA15 + pTet-tTAk;
Colonne 13 : pGJA15 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final;
Colonne 14 : pGJA15.2;
Colonne 15 : pGJA15.2 + pTet-tTAk;
Colonne 16 : pGJA15.2 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final; Colonne 17 : pGJA10;
Colonne 18 : pGJA10 + pTet-tTAk;
Colonne 19 : pGJA10 + pTet-tTAk + tétracycline 1μg /ml final;
Figure 24: mesure de l'expression de la SeAP 5 jours après transfection dans les cellules C2C12 avec les plasmides suivants, avec et sans inducteur chimique BRL49653 à 10-7 M final :
Lot 3 : 500 ng de pRDA02 + 500 ng pSG5- hPPARγ2 +pXL3296 (colonne
1 : sans BRL49653 ; colonne 2 : avec BRL49653) ;
Lot 4 : lot 3 + 50 ng pSeAPAS (colonne 3 : sans BRL49653 ; colonne 4 : avec BRL49653) ; Lot 5 : lot 3 + 100 ng pSeAPAS (colonne 5 : sans BRL49653 ; colonne 6 : avec BRL49653) ;
Lot 6 : lot 3 + 250 ng pSeAPAS (colonne 7 : sans BRL49653 ; colonne 8 : avec BRL49653) ; Lot 7 : lot 3 + 500 ng pSeAPAS
Figure 25: mesure de l'expression de la SeAP 48h après transfection des cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants, avec et sans inducteur chimique du système ecdysone, la Ponastérone ou Pon (Figure 26; No et al., PNAS, 1996, pp 3346-3351).
Colonne 1 : 0,5 μg de chaque plasmide pVgRXR, pIND, pINDSeAP, sans inducteur chimique;
Colonne 2 : 0,5 μg de chaque plasmide pVgRXR, pIND, pINDSeAP, avec inducteur chimique; Colonne 3 : 0,5 μg de chaque plasmide pVgRXR, pINDSeAP, pSeAPantisens, sans inducteur chimique; ,
Colonne 4 : 0,5 μg de chaque plasmide pVgRXR, pINDSeAP, pSeAPantisens, avec inducteur chimique.
Figure 26: Représentation de la Ponastérone (pon).
Figure 27: Suivi de l'activité relative de SeAP circulante, dosée par le kit
Phospha Light (Tropix) dans le plasma de souris après injections bilatérales intramusculaires dans le muscle squelettique tibial cranial et électrotransfert des plasmides suivants, avec ou sans administration de doxycycline dans l'eau de boisson:
Lot 1 : un lot de souris injectées avec 20μg pXL3010 + 20μg pcDNA;
Lot 2: un lot de souris injectées avec 20μg pGJA14 + 20μg pTet-tTAk;
Lot 3: un lot de souris injectées avec 20μg pGJA14 + 20μg pTet-tTAk + 400mg/ml de doxycycline dans la boisson; Lot 4: un lot de souris injectées avec 20μg pGJA15-2 + 20μg pTet-tTAk; Lot 5: un lot de souris injectées avec 20μg pGJA15-2 + 20μg pTet-tTAk + 400mg/ml de doxycycline dans la boisson.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Construction des plasmides portant Pamplificateur/promoteur précoce du Cytomegalovirus (CMV)
1.1 Plasmide PXL3031 (plasmide luciférase)
Le plasmide pXL3031est également un plasmide pCOR décrit dans pCOR (Soubrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488) et comprend notamment le rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1A.
1.2 Plasmide pXL3010 (plasmide SeAP)
Le plasmide pXL3010 a été construit par ligation dans un fragment Mlul/Sall de pGL3-basic (Promega), d'un fragment Mlul/SphI de pCDNA3-basic (Invitrogen) contenant le promoteur précoce du cytomegalovirus humain (hCMV-IE), le gène SeAP extrait de pSeAP-basic (Clontech) avec Sphl/Clal et un fragment Clal/Sall contenant le signal de poly-adénylation tardif du virus simian (polyA SV40) amplifié à partir de pGL3-basic par une réaction de polymérisation en chaîne avec les amorces suivantes (5'- ATGCATCGATGGCCGCTTCGAGCAGACATG-3' et 5'-ATGCGTCGACTCTA GCCGATTTTACCACATTTGTAGAGG-3'). Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1B.
1.3 Plasmide pSeAPantisens (plasmide SeAP antisens dans pCOR)
Un fragment d'ADN contenant le gène de la SeAP est préparé par ACP en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice et les oligonucléotides 1 (5' CGAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC 3') et 2 (5' GGGTCTA GATTAACCCGGGTGCGCGGCGTCGGT 3') comme amorces. Ces oligonucléotides sont situés respectivement aux positions 765-797 et 2290-2267 sur le plasmide pXL3010. Ce fragment a été ensuite digéré par les enzymes de restriction Xbal et Sphl, purifié sur gel d'agarose 0.8%, extrait à l'aide du kit Jetsorb, puis clone en orientation antisens par rapport du promoteur CMV dans le plasmide pXL3296, préalablement digéré par Sphl et Xbal, pour obtenir le plasmide pSeAPantisens. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1C.
1.4 Plasmide pXL3296 (plasmide pCOR vide)
Le plasmide pXL3296 est un plasmide pCOR (Soubrier et al., Get7 Ther, 6, (1999) 1482-1488) et comporte l'ori γ de R6K, la cassette d'expression de l'ARNt suppresseur Phénylalanine (sup Phe), ainsi qu'une partie -522/+72 du enhancer/promoteur précoce du virus CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 D.
1.5 Plasmide pLucAntisens (plasmide luciférase antisens dans pCOR) Le plasmide pXL3031 a été digérée par Hindlll et traité par le fragment de Klenow afin de rendre les extrémités franches. Après précipitation à l'éthanol, le fragment a été digéré par Xbal à 37°C pendant 2 heures. Après purification sur gel d'agarose 0.8%, le fragment de environ 1.6 kb contenant le gène luciférase a été extrait à l'aide du kit Jetsorb. Le fragment Xbal de 1.6Kb du gène de la luciférase a été ensuite clone, en orientation antisens par rapport au promoteur CMV, dans le plasmide pXL3296 préalablement digéré par Xhol, et traité par le fragment de Klenow en présence de déoxynucléotides triphosphates à 37 °C pendant 30 minutes afin de rendre l'extrémité franche, pour obtenir le plasmide pLucAntisens. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 E.
EXEMPLE 2 : Construction de plasmides portant le promoteur répressible par la tétracycline (TrRS)
2.1 Plasmide pTetLucAntisens (plasmide luciférase antisens dans pTet- Splice) et plasmide pTetLuc (plasmide luciférase dans pTet-Splice) Le fragment Hindlll et Xbal d'environ 1.7 kb, contenant le gène de la luciférase, a été digéré à partir du plasmide pXL3031 , traité par le fragment de Klenow pour remplir les extrémités, et clone en orientation sens et antisens, dans le plasmide pTetSplice (Gibco BRL; Figure 2A), préalablement digéré par EcoRI, traité par le fragment de Klenow et déphosphorylé, afin d'obtenir respectivement les plasmides pTetLuc et pTetLucAntisens. Une représentation schématique de ces deux plasmides est présentée respectivement dans les figures 2C et 2B.
2.2 Plasmide pTetSeAPantisens (plasmide SeAP antisens dans pTetSplice)
Le fragment Clal et EcoRV d'environ 1.6 kb, contenant le gène de la SeAP a été digéré à partir du plasmide pXL3010 et clone dans le plasmide pTetSplice, dont la carte est donnée à la figure 2A (Gibco BRL), préalablement digéré par Clal et EcoRV, pour donner pTetSeAPantisens. Une ( représentation schématique de ce plasmide est présentée à la Figure 2D.
2.3 Plasmide pTet-tTAk
Le fragment contenant la séquence du transactivateur tTA obtenu à partir du plasmide pUHD15-1 tel que décrit par Gossen et al. (Proc NatI Acad Sci, 89 (1992) 5547-5551) et clone dans le plasmide pTet-Splice, (figure 2A) (Gibco BRL), préalablement digéré par Hindlll et Spel, pour donner pTet-tTAk. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la Figure 2E.
Exemple 3: Construction des plasmides comportant des fragments plus courts du gène SeAPantisens
3.1 Plasmide pGJA1 (plasmide extrémité 5' SeAPantisens) Le plasmide pGJA1 a été construit en retirant la plus grande partie 5' du gène SeAPantisens du plasmide pSeAPantisens (Exemple 1.3 et Figure 1 C) au moyen des enzymes de restriction Dralll et Sphl Les extrémités ont été solidarisées par ligation après un traitement avec l'enzyme Klenow rendant les extrémités franches. Le fragment éliminé correspond à la portion comprise entre les positions 737 et 2139 du gène SeAPantisens. La portion restante comprend les 125 premières bases 5' du gène SeAPantisens , entre les positions 612 et 737 (125 nucléotides), donc la fin de l'extrémité 3' du gène SeAP placée sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 3A.
3.2 Plasmide pGJA2 (plasmide extrémité 5' SeAPantisens) Le plasmide pGJA2 a été construit en retirant la plus grande partie 3' du gène SeAPantisens du plasmide pSeAPantisens au moyen des enzymes de restriction Sphl et Nae1. Les extrémités ont été solidarisées par ligation
_ après un traitement avec l'enzyme Klenow rendant les extrémités franches.
Le fragment éliminé correspond à la portion comprise entre les positions 647 et 2139 du gène SeAPantisens. La portion restante comprend donc les
35 premiers bases 5' du gène SeAPantisens, entre les positions 612 et 647
(35 nucléotides), placée sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 3B.
3.3 Plasmide pGJA3 (plasmide extrémité 3' SeAPantisens)
Le plasmide pGJA3 a été construit en retirant la plus grande partie 5' du gène SeAPantisens du plasmide pSeAPantisens au moyen des enzymes de restriction Xbal et Pvull. Les extrémités ont été solidarisées par ligation après traitement avec l'enzyme Klenow rendant les extrémités franches. Le fragment éliminé correspond à la portion comprise entre les positions 1 et 1936 du gène SeAPantisens. La portion restante comprend les 203 dernières bases en 3' du gène SeAPantisens, entre les positions 1936 et 2139 (203 nucléotides), placée sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 3C.
3.4 Plasmide pGJA9 (plasmide extrémités 5' et 3' SeAPantisens) Le plasmide pGJA9 a été construit en retirant la partie intermédiaire comprise entre les extrémités 5' et 3' du gène SeAPantisens du plasmide pSeAPantisens au moyen des enzymes de restriction Dralll et Pvull. Les extrémités ont été solidarisées par ligation après traitement avec l'enzyme Klenow rendant les extrémités franches. Le fragment éliminé correspond à la portion comprise entre les positions 737 et 1936 du gène SeAPantisens. La portion restante comprend donc l'extrémité 5' et l'extrémité 3' du gène SeAPantisens, respectivement entre les positions 612 et 737 (les 125 premiers nucléotides en 5' du gène de la SeAP antisens) et 1936 et 2139, (les derniers 203 nucléotides en 3' du gène de la SeAP antisens), ces deux portions étant placées ensemble sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 3D.
Exemple 4: Construction de plasmides permettant la production simultanée d'un transcrit et de son transcrit antisens.
4.1 Plasmide PGJA 15-2 (une seule séquence codante SeAP entourée d'un promoteur constitutif et d'un promoteur conditionnel en sens opposé en 3') Le plasmide a été construit par insertion du promoteur répressible par la tétracycline (Tetp) dans le plasmide pXL 3010 au site de restriction Eco47 III, après la séquence polyA. Le promoteur Tetp a été placé dans le sens opposé de celui du promoteur CMV qui est situé en amont du gène SeAP. De cette façon, le promoteur CMV induit la synthèse du transcrit SeAP de manière constitutive, et le promoteur Tetp placé tête-bêche induit, en absence de tétracycline, la production d'un transcrit antisens. En l'absence de tétracycline, l'activité SeAP est inhibée. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 4A.
4.2 Plasmide PGJA15 (une seule séquence codante de la SeAP entourée d'un promoteur constitutif et d'un promoteur conditionnel dans le même sens) Ce plasmide a été construit par insertion du même promoteur Tetp au même endroit que pour le plasmide PGJA 15-2, mais dans le même sens que le promoteur CMV qui est situé en amont du gène SeAP. Ce plasmide sert de contrôle pour vérifier que le promoteur Tetp orienté de cette manière ne doit pas modifier l'expression de la SeAP. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 4B.
4.3 Plasmide PGJA14 (promoteur constitutif - SeAP et promoteur conditionnel inversé- SeAPantisens, placés en sens opposés) Ce plasmide a été construit par insertion d'un ensemble « promoteur Tetp + séquence du gène SeAP antisens » dans le plasmide pXL3010, au même endroit que pour le plasmide PGJA 15, de manière opposée à l'ensemble « promoteur CMV + séquence SeAP ». De cette façon, le promoteur CMV induit la synthèse du transcrit SeAP de manière constitutive, et le promoteur Tetp placé en sens opposé induit, en absence de tétracycline, la production du transcrit antisens compris dans l'ensemble « promoteur Tetp + séquence SeAP antisens». Dans ces conditions, l'activité SeAP est inhibée, en l'absence de tétracycline. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 4C.
4.4 Plasmide PGJA14-2 (promoteur constitutif - SeAP et promoteur conditionnel inversé- SeAPantisens, placés dans le même sens)
Ce plasmide a été construit par insertion d'un ensemble « promoteur Tetp + séquence du gène SeAP antisens » dans le plasmide pXL3010, au même endroit que pour le plasmide PGJA 15, et dans le même sens que l'ensemble « promoteur CMV + séquence SeAP ». De cette façon, le promoteur CMV induit la synthèse du transcrit SeAP de manière constitutive, et le promoteur Tetp induit, en absence de tétracycline, la production du transcrit antisens compris dans l'ensemble « promoteur Tetp + séquence SeAP antisens». En l'absence de tétracycline, l'activité SeAP est inhibée. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 4D.
Exemple 5: Construction de plasmides inductibles par hPPARγ2 5.1 : Plasmide pSG5-hPPARv2 (plasmide transactivateur humain PPARγ2) Le plasmide pSG5-hPPARγ2 comporte le gène du transactivateur d'origine humaine hPPARγ2, ayant la faculté d'activer un promoteur minimal comprenant en amont la région J du promoteur de l'apolipoprotéine Ail (ApoAII) humaine répétée 10 fois en sens inversé (JxIOAS), lorsqu'il est coexprime avec le plasmide pVgRXR (figure 6C) codant pour le récepteur rétinoide RXR. Le transactivateur est sous le contrôle du promoteur SV40. Il est flanqué dans sa partie 5' d'un intron de la rb-globine (lapin) et dans sa partie 3' d'une séquence de terminaison de la transcription polyA du virus SV40. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 5A.
5.2 : Plasmide pRDA02 (plasmide SeAP sous contrôle du promoteur inductible JxIOAS)
Le plasmide pRDA02 comporte le gène rapporteur SeAP placé sous le contrôle d'un promoteur CMV comprenant en amont une région JxIOAS inductible par le produit du gène hPPARγ2. Le gène SeAP est flanqué dans sa partie 3' d'une séquence de terminaison de la transcription polyA du virus SV40. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 5B.
Exemple 6: Construction de plasmides inductibles par l'ecdysone
6.1 : Plasmide pINDSeAP (promoteur comportant le gène SeAP sous contrôle du promoteur PHSP inductible par l'ecdysone) Le plasmide pINDSeAP a été construit par l'insertion du gène codant pour la SeAP entre les sites de restriction EcoRI et Xhol dans le site de clonage mutliple du vecteur pIND (figure 6A; InVitrogen) . L'expression du gène codant pour la SeAP se trouve donc sous le contrôle du système ecdysone utilise un hétérodimère du récepteur de l'ecdysone (VgECR) et du récepteur rétinoide X (RXR). Cet hétérodimère se lie sur un élément de réponse à l'ecdysone (E/GRE sur le plasmide IND). Le promoteur PHSP est un promoteur Minimal Heat Shock Promoter de la drosophile (No et al, PNAS 1996, pages 3346-3351). Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en figure 6B.
6.2 : Plasmide pVgRXR (figure 6C; InVitrogen) Le plasmide VgRXR code donc d'une part le récepteur RXR, et d'autre part une protéine de fusion VP16/ECR. Ainsi, on peut former un hétérodimère contenant VP16 qui va activer la transcription en présence d'ecdysone ou de ses analogues, tel que par exemple la Ponastérone A (Pon; Figure 26) (No et al, PNAS 1996, pages 3346-3351).
EXEMPLE, 7 : Fonctionnalité des plasmides comprenant une séquence codant pour un transcrit inhibiteur de type antisens in vitro
Exemple 7.1 Culture cellulaire
Les cellules utilisées sont des fibroblastes murins NIHT3T3 (ATCC : CRL- 1658). Ces cellules sont ensemencées 24 h avant la transfection, en plaques de 6 ou 24 puits, à une densité de 5.104 cellules/puits dans 1 ml de milieu, ou de 2,5.105 cellules /puits dans 2 ml. Le milieu de culture utilisé est le milieu DMEM™ (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 10% de sérum de veau. Les cultures cellulaires sont incubées dans une étuve à 37°C en atmosphère humide et sous pression partielle en CO2 de 5%. Les transfections sont effectuées environ 24 h après ensemencement lorsqu'une confluence de 50 à 80 % est obtenue.
Les cellules C2C12 sont des cellules myoblastiques murines (ATCC: CRL1772) sont cultivées sur un milieu DMEM™ (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal complété avec de la L- glutamine 2mM final et des antibiotiques, 50 unités finales de pénicilline et 50μg/ml de streptomycine.
Exemple 7.2 : Transfection cellulaire réalisée à l'aide d'un lipofectant cationique Des solutions diluées d'ADN et de lipide cationique RPR 120535 (Bik G et al., J.Med.Chem 41 (1998) 224-235) sont préparées séparément en vue d'obtenir pour la transfection une concentration d'environ 6 nmoles de lipide RPR 120535 B / μg d'ADN. Chaque solution est d'abord diluée dans une solution de bicarbonate de sodium à 20 mM final dans du NaCI 150 mM final, et incubée pendant 10 minutes à température ambiante (TA.). La solution de lipide cationique est ensuite distribuée, volume à volume, dans les solutions d'ADN. Une nouvelle incubation est réalisée pendant 10 min à T.A., et les complexes formés sont alors dilués au 1/10eme dans du milieu de culture supplémenté en sérum. Après une dernière incubation de 10 minutes, on élimine le milieu de culture dans les plaques et on distribue 1 ou 2 ml / puits de ces solutions selon que l'on utilise respectivement les plaques 24 ou 6 puits.
Exemple 7.3 : Mesure de l'activité luciférase L'activité luciférase est mesurée 24 h après la transfection. La luciférase catalyse l'oxydation de la luciférine, en présence d'ATP, de Mg2+, et d'θ2, avec production concomitante d'un photon. L'émission totale de lumière, mesurée par un luminomètre est proportionnelle à l'activité luciférase de l'échantillon. Le milieu de culture est préalablement retiré, les cellules sont rincées deux fois avec du PBS, puis lysées pendant 15 min à température ambiante, par 200 μl de Cell Lysis Buffer (Promega Corporation) par puits. Le kit Luciférase Assay System™ (Promega Corporation) est ensuite utilisé pour les mesures d'activité selon le protocole conseillé. L'activité luciférase est rapportée à la concentration en protéine des surnageants de lysats cellulaires. La mesure de la concentration protéique des extraits cellulaires est effectuée en utilisant la méthode BCA (Pierce) utilisant l'acide bicinchoninique (Wiechelman et al. , Anal Biochem, 175 (1998) 231-237.)
Exemple 7.4 : Mesure de l'activité SeAP L'activité SeAP est mesurée sur les surnageants de culture 48h après la transfection, en utilisant le kit Phospha-Light ™ (Tropix, Inc.).
Exemple 7.5 : Inhibition in vitro de l'expression des gènes rapporteurs SeAP (fia. 7A) ou de la luciférase (fig. 7B) par le transcrit inhibiteur de type antisens
Les résultats des activités relatives de luciférase et SeAP dans les différentes conditions de transfection in vitro (figures 7A et 7B) montrent d'une part que les gènes rapporteurs de la luciférase et de la SeAP sont bien exprimés dans les cellules NIH 3T3 (colonnes 1 des figures 7A et 7B). D'autre part, lorsque les cellules sont cotransfectées par les deux plasmides sens et antisens d'un même gène rapporteur, l'inhibition de l'expression est de l'ordre de 90% à partir d'un rapport sens/antisens de 1 (colonnes 2). Le taux d'inhibition est augmenté jusqu'à 95% et 97% lorsque l'on utilise un rapport antisens/sens de 2 (colonne 3) ou de 3 (colonne 4). Les colonnes 5 représentent le contrôle négatif dans lequel des plasmides sens codant pour la SeAP (figure 7A) et pour la luciférase (figure 7B) ne sont pas injectés.
Exemple 7.6 : Vérification de l'expression du transcrit inhibiteur de type antisens et du transcrit sens in vitro
48 heures après la transfection, les ARN totaux ont été préparés par la méthode Trizol (Gibco BRL) à partir des cellules NIH 3T3. Les produits de transcription des plasmides pXL3010 et pSeAPantisens, ont été mis en évidence par RT-PCR en utilisant les amorces 11 (5* CGATCATGTTCGACGACGCC3') et 12 (5' CCAGGTCGCAGGCGGTGTAG 3') situées respectivement aux positions 1812-1831 et 2249-2230 sur le plasmide pXL3010 à l'aide du kit "one step RT-PCR System" (Gibco BRL) en suivant les instructions du fournisseur, et selon les conditions : 40 min à 50°C, puis 30 cycles (2 min à 94°C ; 1 min à 94°C ; 1 min à 55°C ; 1 min 30 à 72°C ; terminaison 3 min à 72°C). Les produits de la RT-PCR ont été ensuite déposés sur gel d'agarose 0.8%o, et l'on peut observer la présence d'une bande à la taille attendue de 418 pb (piste 2, figure 8) qui reflète bien la transcription du gène SeAP sens (piste 3, figure 8), du sens SeAP et antisens SeAP dans différentes proportions 1 :1 (piste 4, figure 8), et 1:3 (piste 5, figure 8). Les pistes 6 à 8 correspondent à des contrôles négatifs de l'expérience dans lesquels une PCR sans reverse transcription préalable a été réalisée.
Exemple 7.7 : Spécificité des transcrits inhibiteur de type antisens
Les résultats d'une série de cotransfections croisées d'un plasmide codant pour la SeAP (pXL3010) et d'un plasmide codant pour Fantisens de la SeAP (pSeAPantisens) ou de la Luciférase (pLucAntisens) et inversement des cotransfections d'un plasmide codant pour la luciférase (pXL3031) et d'un plasmide codant pour Fantisens de la SeAP (pSeAPantisens) ou de la Luciférase (pLucAntisens), sont présentés aux figures 9A et 9B. Ces résultats démontrent clairement qu'il n'y a pas de réactions croisées aspécifiques, à savoir que Fantisens de la SeAP n'a pas d'effet sur l'expression de la luciférase, et de même que Fantisens de la luciférase n'a pas d'effet sur l'expression de la SeAP. Ces résultats montrent également que l'inhibition observée ne peut pas être attribuée à la coexpression de séquences sens et antisens quelconques, mais nécessite au contraire la coexpression d'un transcrit antisens pour une séquence sens spécifique.
EXEMPLE 8 : Absence d'inhibition in vivo de l'expression de la SeAP par l'antisens de SeAP lorsque celui-ci est injecté 22 jours après le gène rapporteur SeAP sens
Exemple 8.1 Electrotransfert dans le muscle sguelettigue Les souris SCID âgées de 6 semaines sont d'abord anesthésiées par un mélange Kétamine/Xylazine (250μl/souris). Les différents plasmides en solution dans du NaCI 150mM, sont ensuite injectés en intramusculaire dans le muscle tibial cranial des souris. L'injection est suivie d'une série de puises électriques : 8 puises de 20 ms, 200 V/cm, 1 Hz (Mir et al., PNAS, 96 (1999) 4262-67). La quantité de SeAP circulante est suivie régulièrement par des prélèvements sanguins et dosages de l'activité phosphatase à l'aide du kit Phospha-Light (Tropix).
Exemple 8.2 : Comparaison du pourcentage d'inhibition du transcrit inhibiteur de type antisens lorsgue celui-ci est coinjecté avec le gène rapporteur SeAP ou postinjecté 22 jours après l'injection du gène SeAP Les résultats, rassemblés en figure 10, montrent que l'injection du plasmide pSeAPantisens ne conduit pas à une inhibition efficace du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) injecté 22 jours auparavant. En effet, plus de 20 jours après l'injection du transcrit antisens, l'expression observée de la SeAP n'a diminué que de 60% (lot 1 , figure 10).
Ceci indique donc bien que le transcrit antisens ne peut inhiber efficacement le gène exogène SeAP préalablement administré, alors que ce dernier a été reconnu comme restant stable et fonctionnel pendant environ 9 mois après injection et électrotransfert in vivo (Mir et al., PNAS, 96(8) (1999) 4262- 4267 ; Mir et al., C R Acad Sci III, 321(11) (1998) 893-899). Une expression résiduelle d'environ 30% du gène exogène de la SeAP est en effet, observée. Par contre, la figure 10 montre clairement qu'une coinjection du transcrit inhibiteur de type antisens et de la séquence sens du gène rapporteur exogène de la SeAP confère une très forte inhibition de l'expression de la SeAP, puisque l'on ne peut détecter aucune expression résiduelle de ce gène. La coexpression du gène sens et antisens de la SeAP permet d'abolir l'expression du gène rapporteur SeAP in vivo (lot 2, figure 10). L'injection d'antisens seul en tant que contrôle ne confère aucune activité (lot 3, figure 10).
Exemple 8.3 : Vérification de l'expression in vivo des transcrits sens et antisens
Les muscles des souris ont été prélevés, broyés, et les ARN totaux ont été extraits. Des réactions de RT-PCR ont été effectuées en suivant le protocole précédemment décrit à l'Exemple 3.6. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel d'agarose et visualisés au bromure d'éthydium. Une photographie de ce gel qui est présentée à la figure 11 A, montre que les deux ARN sens et antisens sont exprimés dans les muscles de souris qui ont subi une première injection de plasmides pXL3010, et une injection ultérieure de plasmide portant la séquence du transcrit inhibiteur de type antisens pSeAPantisens (pistes 2 et 3). Au contraire lorsque l'on a effectué une co-injection du pXL3010 et pSeAPantisens, seul l'ARN antisens est présent, ARNm de la SeAP n'est pas détecté (pistes 4 et 5). Ceci confirme bien l'efficacité de l'inhibition obtenue par co-injection de la séquence sens et de son transcrit inhibiteur antisens. Lorsque l'on injecte le plasmide pSeAPantisens seul en tant que contrôle, l'ARN antisens de la SeAP est uniquement détecté (pistes 6 et 7). Le gel d'agarose a été transféré sur membrane de nylon Hybond N+ (Amersham), et hybride avec un oligonucléotide sonde marqué au 32P spécifique des transcrits sens et antisens du gène rapporteur de la SeAP. La membrane est ensuite exposée sur un film d'autoradiographie, et le film est développé trois heures après. Une photographie de ce film qui est présentée à la figure 11B, confirme bien les résultats précédents. En effet, la présence d'un produit de transcription du gène rapporteur SeAP n'est pas détectée à la piste 4 qui correspond à la co-injection des plasmides comprenant la séquence sens du gène rapporteur (pXL3010) et la séquence antisens (pSeAPantisens), alors que le produit de transcription du gène rapporteur SeAP est détecté à la piste 2 qui correspond à l'expérience de post-injection de ces mêmes plasmides.
Exemple 8.4 : Suivi de l'activité relative SeAP circulante in vivo après injection du plasmide comprenant la séguence sens du gène SeAP (pXL3010), suivie d'une post-injection du plasmide comprenant la séguence du transcrit inhibiteur de type antisens du gène rapporteur SeAP (pSeAPantisens) 50 souris SCID femelles de 6 semaines, divisées en 5 groupes de 10 et sont traitées comme précédemment décrit aux Exemples 3.2 et 3.3.
Les résultats présentés figure 12, montrent clairement et de manière reproductible qu'aucun effet d'inhibition ne peut être mis en évidence lorsque l'on procède en injectant dans un premier temps la séquence codant pour le transcrit sens puis dans un deuxième temps pour le transcrit inhibiteur de type ARN antisens.
* Exemple 8.5 : Suivi de l'activité relative SeAP circulante in vivo après coinjection des plasmides pXL3010 et pSeAPantisens
50 souris SCID femelles de 6 semaines, divisées en 5 lots de 10 et sont traitées comme précédemment décrit aux Exemples 3.2 et 3.3.
Les résultats, présentés à la figure 13, montrent bien que la coinjection de ces deux plasmides (lot 3) permet d'obtenir une expression très faible, voire nulle du gène rapporteur exogène SeAP, indiquant que le transcrit inhibiteur de type ARN antisens agit en inhibant fortement la transcription du gène rapporteur SeAP avec lequel il est coinjecté, et cela de manière constitutive sur une période de temps variable allant de 7 à 85 jours après la coinjection. Les lots témoins 1 , 2, 4, et 5 qui correspondent à une injection du plasmide portant la séquence sens du gène rapporteur seul montrent une expression à des taux variables du gène pendant toute la période de l'évaluation. EXEMPLE 9 : Fonctionnalité de l'inhibition du transcrit inhibiteur de type antisens lorsque celui-ci est placé sous le contrôle d'un promoteur répressible par la tétracycline, et mesure d'inhibition in vitro
Exemple 9.1 : Fonctionnalité in vitro du promoteur répressible par la tétracycline
Les expériences ont été réalisées sur cellules NIH 3T3, avec les gènes rapporteurs SeAP et Luciférase, ces deux gènes rapporteurs ayant été précédemment décrits.
Exemple 9.2 : Régulation par un transcrit inhibiteur du type antisens du gène rapporteur SeAP in vitro
Les résultats, présentés à la figure 14A, montrent que le transcrit inhibiteur de type antisens sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort CMV (pSeAPantisens) coexprime avec la séquence sens du gène rapporteur SeAP dans une proportion de 0.5 et 1 confère une inhibition de l'expression du gène in vitro respectivpment de 70% à 83% (colonnes 2 et 3). Par contre, lorsque le transcrit inhibiteur de type antisens est placé sous contrôle du promoteur tétracycline (pTetSeAPantisens), l'inhibition in vitro est plus faible et incomplète de 45% à 60% respectivement dans les mêmes rapports (colonnes 4 et 6).
En présence d'agent répresseur externe tel que la tétracycline, une induction de l'expression de la SeAP est observée (colonnes 5 et 7).
Les résultats, présentés à la figure 14B, montrent une inhibition partielle du gène rapporteur de la SeAP lorsque celui-ci est coinjecté avec le plasmide comprenant la séquence du transcrit inhibiteur de type antisens du gène de la SeAP sous le contrôle du promoteur CMV (pSeAPantisens) en proportion 1 :1 (colonne 2), ou sous le contrôle du promoteur répressible à la tétracycline (colonnes 3 et 6), par rapport au niveau d'expression du gène rapporteur de la SeAP mesuré après injection du plasmide comprenant la séquence sens de la SeAP (pXL3010) (colonnes 1 et 5). L'administration de tétracycline permet de rétablir une expression très satisfaisante du gène rapporteur de la SeAP (colonnes 4 et 7).
Exemple 9.3: Régulation par un transcrit inhibiteur de type antisens du gène rapporteur de la luciférase in vitro
Les résultats présentés en figure 15, démontrent, en premier lieu, la fonctionnalité in vitro des plasmides comprenant les séquences sens et antisens du gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle du promoteur répressible par la tétracycline (pTetLucAntisens, pTetLuc et pTetSpliceAntisens).
En l'absence de tétracycline, le transcrit inhibiteur de type antisens est exprimé et conduit à une inhibition imparfaite de 60-70 % (colonnes 3 et 6), alors que lorsque le transcrit inhibiteur de type antisens est placé sous le contrôle du promoteur CMV, l'inhibition est de l'ordre de 90%, en utilisant un rapport sens/antisens de 1:1 (colonne 2).
En présence de tétracycline, l'expression du gène rapporteur luciférase est restaurée à un niveau satisfaisant (colonnes 4 et 7), par rapport au niveau de luciférase obtenu par transfection d'un seul plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la luciférase (pXL3031)(colonne 1 ). Ces résultats montrent bien qu'il est possible de réguler de manière indirecte l'expression de gènes rapporteurs exogènes en présence d'un agent répresseur externe du transcrit inhibiteur tel que la tétracycline.
EXEMPLE 10 : Mesure d'une forte inhibition in vivo par un transcrit inhibiteur de type antisens placé sous le contrôle d'un promoteur répressible
40 souris SCID ont été traitées comme précédemment décrit, en utilisant les , plasmides pXL3010, pSeAPantisens, pTetSeAPantisens, et pTet-tTAk. Les résultats, présentés à la figure 16A, montrent bien, contrairement aux résultats d'inhibition in vitro, et par rapport au niveau d'expression in vivo du gène rapporteur de la SeAP (lot 1), que l'on obtient une inhibition efficace de l'expression de la SeAP, lorsque l'on coinjecté et l'on coexprime le plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) ainsi que le plasmide comprenant la séquence antisens SeAP sous le contrôle d'un promoteur fort CMV (pSeAPantisens)(lot 2), ou encore en coinjectant et en coexprimant le plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) ainsi que le plasmide comprenant la séquence antisens de la SeAP sous le contrôle du promoteur répressible par la tétracycline (pTetSeAPantisens) (lot 3).
EXEMPLE 11 : Régulation in vivo par un transcrit inhibiteur de type antisens placé sous le contrôle d'un promoteur répressible
Les résultats présentés à la figure 16B montrent que la coinjection des plasmides portant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) et la séquence antisens du gène sous le contrôle du promoteur répressible à la tétracycline (pTetSeAPantisens) en présence d'un agent externe répresseur, tel que la tétracycline, permet d'obtenir un niveau biologique satisfaisant du gène rapporteur de la SeAP (lot 3, J8). Une inhibition de l'expression du gène exogène rapporteur de la SeAP peut être à nouveau observée lorsque l'on arrête l'administration de tétracycline au 10ième jour (lot 3 : J15 , J22, J30, et J63). Ces résultats confirment également que cette inhibition est réversible, puisque l'administration d'un agent répresseur analogue de la tétracycline, la doxyclycline, au 63ιeme jour permet de rétablir une expression du gène rapporteur de la SeAP (lot 3 : J70).
EXEMPLE 12 : Régulation par un transcrit inhibiteur de type ribozyme
Comme précédemment décrit pour la construction des plasmides pTetSeAPantisens et pTetLucAntisens, on construit un plasmide, qui contient une séquence de ribozyme à tête de marteau, en clonant une séquence comprenant au moins un site GTC, choisi en positions 958, 1058, 1127, 1205, 1243, 1600, 1620, 1758, 1773, 1880, 1901, 1988, 2007, 2085 et 2201 sur le plasmide pXL3010 (gène rapporteur SeAP), en aval du promoteur répressible par la tétracycline TetRS dans le plasmide pTetSplice (Gibco BRL), préalablement digéré, pour donner le plasmide pTetSeAPribozyme.
30 souris SCID de 6 semaines sont traitées comme précédemment décrit dans l'Exemple 4, et sont divisées en trois groupes de 10.
Le premier groupe est traité comme précédemment décrit avec le plasmide pXL3010. Le second groupe reçoit en coinjection les plasmides pXL3010, pTet-tTAk, et pTetSeAPribozyme. Le troisième groupe est traité comme le groupe 2, et on donne aux souris une boisson contenant de la doxycycline (400 mg/l). Le taux de SeAP circulante est suivi comme précédemment décrit. On observe dans le second groupe, après coinjection et éiectrotransfert, du plasmide comprenant la séquence sens du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) et du plasmide comprenant la séquence du transcrit inhibiteur ribozyme spécifique de la SeAP sous le contrôle d'un promoteur répressible par la tétracylcine (pTetSeAPribozyme), une inhibition efficace de l'expression de la SeAP, par rapport à l'expression observée du gène rapporteur de la SeAP dans le premier groupe de souris testées, indiquant que le transcrit inhibiteur de type ribozyme est capable d'inhiber fortement in vivo la transcription du gène exogène de la SeAP avec lequel il est coadministré. L'administration par voie orale d'un analogue de la tétracycline, la doxycycline, en tant qu'agent répresseur, permet de restaurer l'expression de la SeAP.
EXEMPLE 13 : Régulation par un transcrit inhibiteur de type antisens comprenant une séquence aptamère Le plasmide pSeAPantisens (Figure 1C) tel que décrit dans l'exemple 1.3, est modifié afin d'insérer à l'extrémité 5' de la séquence du transcrit inhibiteur antisens, une séquence aptamère ligand-dépendante, de séquence 5' GGCCUGGGCGAGAAGUUUAGGCC 3' reconnue par la néomycine B telle que décrite par Cowan et al. (Nucleic Acids Res. 28(15)(2000)2935-2942), pour donner le plasmide désigné pSeAPaptamereAS.
30 souris SCID de 6 semaines sont traitées comme précédemment décrit dans l'exemple 4, et sont divisées en trois groupes de 10. Le premier groupe est traité comme précédemment décrit avec le plasmide pXL3010. Le second groupe reçoit en coinjection suivie d'électrotransfert, les plasmides pXL3010, et pSeAPaptamereAS. Le troisième groupe est traité comme le groupe 2, et reçoit en plus une injection IP de néomycine B à raison d'environ 500μg/souris. Le taux de SeAP circulante est ensuite suivi comme précédemment décrit. Alors que l'on décèle pour le premier groupe, une expression constante du gène rapporteur de la SeAP, on observe dans le second groupe une inhibition efficace du gène SeAP par le transcrit inhibiteur ςomprenant une séquence aptamère.
Une expression de la SeAP peut être restaurée dans le troisième groupe, auquel l'on administre une quantité efficace de néomycine B qui reconnaît la séquence aptamère portée par le plasmide pSeAPaptamereAS. Une forte diminution du taux de SeAP circulante et donc une inhibition de l'expression du gène rapporteur de la SeAP peut être à nouveau observée lorsque l'on cesse l'administration de néomycine B.
Exemple 14: Régulation par un transcrit inhibiteur de type ribozyme comprenant une séquence aptamère
On construit un plasmide qui contient une séquence de ribozyme en tête de marteau, en clonant une séquence comprenant au moins un site GTC, choisi en positions 958, 1058, 1127, 1205, 1243, 1600, 1620, 1758, 1773, 1880, 1901 , 1988, 2007, 2085 et 2201 sur le plasmide pXL3010, en aval du promoteur CMV dans le plasmide pXL3296 (Soubrier et al.) préalablement digéré pour donner pSeAPribozyme. Ce dernier est ensuite modifié afin d'insérer à l'extrémité 5' de la séquence du transcrit inhibiteur de type ribozyme, un aptamère de séquence 5'GGUGAUCAGAUUCUGAU CCAAUGUUAUGCUUCUCUGCCUGGGAACAGCUGCCUGAAGCUUUGG AUCCGUCGC 3', telle que décrite par Werstuck et al., Science, 282 (1998), 296-298, et reconnue par le colorant Hoechst 33258 (H33258), pour donner le plasmide désigné pSeAPaptazyme.
Trois groupes de 10 souris SCID de 6 semaines sont traitées : le premier groupe reçoit par injection suivie d'électrotransfert le plasmide pXL3010, le second groupe reçoit également par coinjection suivie d'électrotransfert, les plasmides pXL3010, et pSeAPaptazyme, et enfin, le troisième groupe est traité comme le groupe 2, mais reçoit en plus par l'eau de boisson, une quantité de colorant H33258 (400mg/l). Le suivi du taux de SeAP circulante montre une inhibition efficace in vivo de l'activité de la SeAP, qui est restaurée à un niveau significatif dans le troisième groupe de souris, qui reçoivent le ligand ou colorant H33258, spécifique de la séquence aptamère présente dans le plasmide pSeAPaptazyme.
Exemple 15: inhibition in vitro de l'expression des gènes rapporteurs SeAP par des fragments plus courts du transcrit inhibiteur SeAPantisens.
Exemple 15.1 : Inhibition obtenue avec les plasmides pGJA pGJA2 et pGJA3 (fragments de transcrits contenant respectivement, les 125, les 35 premières bases en 5' de la séquence du gène de la SeAPantisens, et les 203 dernières bases en 3' de la séquence du gène de la SeAPantisens) La mesure de l'activité SeAP dans les différentes conditions de transfection in vitro permet de comparer l'effet inhibiteur des sous-fragments du transcrit SeAPantisens avec celui du transcrit SeAPantisens entier. Les résultats de la Figure 17 montrent que sans atteindre l'inhibition observée pour le transcrit antisens pSeAPantisens entier (colonne 2), les fragments de 125 ou 35 nucléotides de l'extrémité 5' du transcrit SeAPantisens portés par les plasmides pGJA1 et pGJA2, ainsi que le fragment de 203 nucléotides de l'extrémité 3' du transcrit SeAPantisens porté par le plasmide pGJA3, produisent une inhibition significative de l'activité SeAP mesurée dans . les cellules NIH3T3 (colonnes 3, 4 et 5 de la figure 17, respectivement).
Exemple 15.2: Inhibition obtenue avec le plasmide pGJA9 (fragments de transcrits contenant chacune des deux extrémités 5' et 3' du transcrit SeAPantisens) L'inhibition causée par la fusion des deux extrémités 3' (203 nucléotides) et 5' (125 nucléotides) du transcrit SeAP antisens est représentée en colonnes 7 et 8 de la figure 18. Ce transcrit est produit à partir du plasmide pGJA9. Il inhibe significativement l'activité SeAP mesurée dans les cellules, par comparaison avec l'inhibition maximale atteinte par le transcrit SeAPantisens entier (colonnes 5 et 6). Les résultats obtenus avec les fragments plus courts, soit du début (pGJA1 et pGJA2) soit de la fin, (pGJA3), soit de la fusion de la séquence de début et de la fin du gène SeAP antisens (pGJA9) montrent clairement des taux d'inhibition significatifs de l'activité du transgène SeAP peuvent être obtenus au moyen de portions plus courtes du transcrit inhibiteur. Un tableau récapitulatif des pourcentages d'inhibition obtenus au moyen des quatre plasmides pGJA1 , pGJA2, pGJA3 et pGJA9 est fourni en figure 19.
Exemple 16 : Cinétique de régulation in vivo par le transcrit inhibiteur de type SeAPantisens placé sous le contrôle d'un promoteur répressible par la doxycycline.
Les résultats présentés sur la figure 20 établissent l'efficacité d'un système de régulation analogue à celui décrit par l'exemple 7, où la tétracycline a été remplacée par un analogue, la doxycycline. Les souris SCID ont été traitées comme précédemment décrit. L'induction de l'expression du gène exogène rapporteur de la SeAP est obtenue sur deux échelles de temps. Dans le cas du lot 3, les souris boivent de l'eau sauf au jour 170 où elles boivent de la doxycycline. L'expression de la SeAP est nulle en l'absence de doxycycline, et une augmentation très faible de cette expression est observée après la prise d'une journée de doxycycline. Dans le lot 4, les souris boivent de la doxycycline pendant 7 jours, puis font des pauses de 20, 30, ou 40 jours. Les prises de doxycycline pendant une semaine provoquent cette fois des augmentations considérables de l'expression de la SeAP, qui régressent significativement pendant les périodes de prise d'eau.
Exemple 17: Vérification de la fonctionnalité des plasmides pGJA14, pGJA14-2, pGJA15 et pGJA15-2 pour exprimer la SeAP.
L'expression de la SeAP par les transcrits codés par chacun des plasmides pGJA14, pGJA14-2, pGJA15 et pGJA15-2 a été évaluée par une série d'expériences menées en l'absence du transactivateur tTA. La figure 21 montre les niveaux d'expression de la SeAP comparés avec ceux produits par le plasmide pXL3010. L'expression est notable, supérieure à celle de la SeAP contenue par le plasmide pXL3010. Les plasmides permettent bien l'expression de la SeAP.
Exemple 18 : régulation de l'expression de la SeAP par les plasmides pGJ14, pGJ15 et pGJA15-2 coinjectés avec le plasmide pTet-tTAk.
Exemple 18.1 : Régulation de l'expression de la SeAP par les plasmides PGJA15 et pGJA15-2 coinjectés avec le plasmide pTet-tTAk.
Les résultats présentés sur la figure 22 évaluent l'inhibition de l'expression de la SeAP sur des cellules cotransfectées avec le plasmide pTet-tTAk et, respectivement, les plasmides pGJA15 et pGJA15-2. Dans le cas du plasmide pGJA 15, dans lequel l'orientation du promoteur pTet ne permet pas la synthèse du transcrit SeAP antisens, aucune inhibition n'est observée, autant en présence qu'en absence de tétracycline. En revanche, le plasmide pGJA15-2, dans lequel le promoteur inductible pTet est relié fonctionnellement au gène de la SeAP antisens, produit une inhibition significative de l'expression de la SeAP en absence de tétracycline. En présence de tétracycline, une restauration partielle de la SeAP est observée. Ces résultats montrent que le plasmide pGJA15-2 peut être utilisé pour une stratégie de régulation de l'expression d'un gène exogène rapporteur fondée sur la coinjection de deux plasmides, où Fantisens et le sens sont portés par le même plasmide et sont produits à partir de la même séquence sur le même plasmide.
Exemple 18.2 : Régulation de l'expression de la SeAP par le plasmide pGJA14 coinjecté avec le plasmide pTet-tTAk
La même expérience que celle décrite dans l'exemple 16.1 a été conduite sur des cellules cotransfectées avec les plasmides pGJA14 et pTet-tTAk (Figure 23). L'expression de la SeAP est inhibée en l'absence de tétracycline, par comparaison avec l'expression constitutive de la colonne 5.
Cette inhibition est partiellement levée par l'ajout de tétracycline qui empêche le transactivateur tTA d'activer le promoteur pTet. Ces expériences révèlent donc un autre système de régulation fondé sur la coinjection de deux plasmides, où Fantisens et le sens sont portés par le même plasmide, mais produits à partir de deux séquences distinctes.
Exemple 19 : Réduction de l'expression résiduelle du gène SeAP dans le cadre du système inductible hPPARγ2 par l'ajout de transcrits antîsens du gène SeAP antisens
Les données présentées sur la figure 24 montrent que l'expression du gène exogène rapporteur SeAP (plasmide pRDA02) en présence du transactivateur hPPARγ2 (plasmide pSG5-hPPARγ2), mais en l'absence du fibrate BRL (RPR131300A à 10'2M dans de l'eau) n'est pas nulle (colonne 1). Les données des colonnes suivantes (colonnes 3, 5, 7) montrent que ce niveau de base peut être réduit par l'ajout de quantités croissantes de transcrit antisens obtenues en transfectant le plasmide pSeAPAS. Par ailleurs, la présence du transcrit antisens n'empêche pas une certaine inductibilité de l'expression de la SeAP par le fibrate (rapports des colonnes 3 et 4; 5 et 6; 7 et 8; respectivement). Le système combiné des trois plasmides pRDA02, pSG5-hPPARγ2 et pSeAPAS autorise donc un contrôle de l'expression du gène exogène rapporteur SeAP tout en minimisant les expressions de fuite résiduelle en l'absence de l'agent inducteur, tel que le fibrate.
Exemple 20 : Réduction de l'expression résiduelle du gène SeAP dans le cadre d'un système inductible par l'ecdysone au moyen de l'ajout de transcrits antisens
La figure 25 montre, en colonnes 1 et 2, le niveau d'expression du gène SeAP porté par le plasmide pINDSeAP, en absence et en présence d'un inducteur du système ecdysone, la ponastérone (Figure 26; No et al., PNAS, 1996, pp 3346-3351). En l'absence d'inducteur ecdysone le niveau d'expression est faible, mais pas nul. Ce niveau est ramené à zéro lorsque le plasmide pSeAPAS, exprimant le transcrit antisens de SeAP, est cotransfecté avec le plasmide pINDSeAP (colonne 3). Le système combiné dès trois plasmides pINDSeAP, pVgRXR, et pSeAPAS autorise donc un contrôle de l'expression du gène exogène rapporteur SeAP tout en éliminant les expressions de fuite résiduelle observées en l'absence d'inducteur ecdysone.
Exemple 21 : Cinétique de régulation in vivo par le transcrit inhibiteur de type SeAPantisens placé sous le contrôle d'un promoteur répressible par la doxycycline.
30 souris SCID de 6 semaines sont traitées comme précédemment décrit et sont divisées en 5 lots. Le premier lot de souris (lot 1; Figure 27) est traité avec le plasmide pXL3010. On note une expression résiduelle du gène SeAP lorsque celui-ci est placé sous le contrôle du promoteur constitutif CMV. Le second lot de souris (lot 2; Figure 27) reçoit en coinjection suivie d'électrotransfert, les plasmides pGJA14 et pTet-tTAk. Les résultats présentés à la Figure 27 montrent bien qu'une expression résiduelle du gène SeAP nulle in vivo, en l'absence de doxycycline. Ceci établit l'efficacité de l'inhibition du gène SeAP résultant de l'utilisation d'un plasmide tel que pGJA14, qui contient le gène de la SeAP sous le contrôle du promoteur constitutif CMV et la séquence codant pour la SeAP antisens sous le contrôle d'un promoteur conditionnel Tetp en sens opposés sur un même vecteur.
Le troisième lot de souris (lot 3; Figure 27) reçoit en coinjection suivie d'électrotransfert les plasmides pGJA14 et pTet-tTAk et de la doxycycline dans l'eau de boisson. L'expression du gène SeAP, mesurée au 8ιeme jour, se trouve alors significativement activée en présence de doxycycline, à un niveau bien supérieur du niveau d'expression constitutif de la SeAP obtenu pour le lot 1. Le quatrième lot de souris (lot 4; Figure 27) reçoit en coinjection suivie d'électrotransfert, les plasmides pGJA15-2 et pTet-tTAk. En l'absence de doxycycline, l'expression résiduelle de la SeAP est fortement abaissée par rapport à l'expression constitutive observée dans le lot 1 , mais pas nulle. En effet, on observe une expression résiduelle de la SeAP en coexprimant sur des brins complémentaires du même vecteur, le gène de la SeAP et la séquence du transcrit antisens par rapport à l'utilisation d'un plasmide contenant les deux séquences sur le même brin du même vecteur (lot 2). Le cinquième lot de souris (lot 5; Figure 27) reçoit en coinjection suivie d'électrotransfert les plasmides pGJA15-2 et pTet-tTAk et de la doxycycline dans l'eau de boisson. Comme pour le lot 3, en présence de doxycycline, l'expression de la SeAP mesurée au 8lθ e jour se trouve significativement activée. Ces résultats montrent bien que l'on peut obtenir une inhibition de l'expression du gène de la SeAP, lorsque celui est administré sur le même vecteur que la séquence du transcrit inhibiteur antisens, que ce soit sur le même brin ou sur des brins complémentaires. Cette inhibition est par ailleurs bien réversible lors de l'administration d'un agent externe inhibiteur du transcrit antisens.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de régulation de l'expression d'un transgène d'intérêt in vivo consistant à :
- introduire simultanément dans un tissu animal non humain ou une cellule cible, d'une part un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt, et d'autre part un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe, et
- coexprimer lesdits acides nucléiques dans le tissu ou la cellule cible afin d'inhiber constitutivement l'activité du transcrit d'intérêt par le transcrit inhibiteur.
2. Procédé de régulation selon la revendication 1 , consistant en outre à administrer au tissu animal non humain ou aux cellules cibles, un agent externe conduisant à inhiber l'activité dudit transcrit inhibiteur, en vue de restaurer l'activité du transcrit d'intérêt.
3. Procédé de régulation selon la revendication 1 ou 2, consistant également à administrer au tissu animal non humain ou aux cellules cibles, un agent externe conduisant à accroître l'activité dudit transcrit d'intérêt, en vue de restaurer l'activité du transcrit d'intérêt.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur est sous le contrôle d'un promoteur répressible, et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur comprend une ou plusieurs répétitions de l'opérateur de réponse à la tétracycline, et l'agent externe répresseur est la tétracycline ou un analogue.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est un ligand spécifique activateur de l'aptamère.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand-dépendante, et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence codant pour le transcrit d'intérêt est placée sous le contrôle d'une promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARα, et l'agent externe est un ligand du PPARα tel qu'un fibrate ou un analogue.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARγ, et l'agent externe est un ligand du PPARγ tel qu'un acide gras ou un thiazolidinedione.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type
Watson et Crick.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie non codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie non codante à l'extrémité 5' de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'ARN antisens a une longueur comprise d'au moins 10 ribonucléotides.
15. Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN capable de former une triple hélice avec une partie de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt.
16. Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ribozyme.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt code pour une protéine d'intérêt thérapeutique.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt permet de corriger une anomalie ou d'une déficience génétique.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt code pour un activateur qui est impliqué dans l'expression d'un autre gène.
20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt produit un transcrit d'intérêt ayant une activité thérapeutique.
21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont portés par un seul vecteur ou des vecteurs distincts.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites acides nucléiques sont portés par le même brin du même vecteur.
23. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel, ou tout
ADN non encapsidé.
24. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que le vecteur est un virus recombinant.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que le virus est un adénovirus, un rétrovirus, un virus de l'herpès, un virus adéno-associé, un phage ou un dérivé de ceux-ci.
26. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que le vecteur est une bactérie ou parasite.
27. Procédé selon l'un des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont introduits dans le tissu ou la cellule cible par un procédé physique ou mécanique.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'on utilise les acides nucléiques sont introduits par coinjection, par technique balistique, par électroporation, par sonoporation, par l'intermédiaire d'un champs électrique, de microondes, de la chaleur, de la pression, ou par l'intermédiaire une combinaison de ces techniques.
29. Procédé selon l'un des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont introduits dans le tissu ou la cellule cible par coinjection et électrotransfert.
30. Procédé selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont cointroduits dans le tissu ou la cellule cible sous forme complexée à un agent chimique ou biochimique.
31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'agent chimique ou biochimique est une protéine cationique choisie parmi une histone ou une protamine.
32. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'agent chimique ou biochimique est un polymère choisi parmi le DEAE-dextran, une polyamidoamine, une polylysine, un polyéthylènimine, un polyvinylpyrrolidone, ou un polyvinylalcool.
33. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont incorporés à des lipides sous forme brute ou sous forme de liposomes.
34. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que les acides nucléiques incorporés à des nanoparticules.
35. Procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule ou d'un tissu d'origine animale ou humaine.
36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule musculaire ou d'un tissu musculaire squelettique.
37. Procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule ou d'un tissu d'origine végétale.
38. Procédé selon l'une des revendications 27 à 37, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont injectés par voie systémique.
39. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont injectés par voie intra-artérielle ou intra-veineuse.
40. Procédé selon l'une des revendications 27 à 37, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont injectés par voie parentérale, topique, cutanée, vaginale, intranasale, sous cutanée, intra-oculaire.
41. Procédé selon l'une des revendications 39 ou 40, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont présents dans une composition contenant en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables pour les différents modes d'administration.
42. Association susceptible d'être mise en oeuvre dans le procédé tel que défini dans selon l'une des revendications 1 à 41 , ladite association contenant un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et d'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, ladite association étant administrée in vivo, lesdites séquences étant chacune placée sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
43. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
44. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire d'au moins une partie non codante de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
45. Association selon la revendication 44, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens complémentaire à au moins une partie non codante en 5' de l'ARNm du transgène d'intérêt, et est capable de former avec ce dernier une liaison de type Watson et Crick.
46. Association selon l'une des revendications 43 à 45, caractérisée en ce que l'ARN antisens a une longueur d'au moins 10 ribonucléotides.
47. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN capable de former une triple hélice avec une partie de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt.
48. Association selon la revendication 42, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ribozyme.
49. Association selon l'une des revendications 42 à 48, caractérisée en ce que la séquence codant pour le transcrit inhibiteur est sous le contrôle d'un promoteur répressible et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
50. Association selon la revendication 49, caractérisée en ce que le promoteur comprend une ou plusieurs répétitions de l'opérateur de réponse à la tétracycline, et l'agent répresseur externe est la tétracycline ou un analogue.
51. Association selon l'une des revendications 42 à 48, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est ligand spécifique activateur de l'aptamère.
52. Association selon l'une des revendications 42 à 48, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand-dépendante et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
53. Association selon l'une des revendications 42 à 52, caractérisée en ce que la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt est placée sous le contrôle d'une promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
54. Association selon la revendication 53, caractérisée en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARα, et l'agent externe est ligand du PPARα tel qu'un fibrate ou un analogue.
55. Association selon la revendication 53, caractérisée en ce que le promoteur inductible comprend un élément de réponse au PPARγ, et l'agent externe est ligand du PPARγ tel qu'un acide gras ou un thiazolidinedione. ,
56. Association selon l'une des revendications 42 à 55, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt code pour une protéine d'intérêt thérapeutique.
57. Association selon l'une des revendications 42 à 56, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt permet de corriger une anomalie ou une déficience génétique.
58. Association selon l'une des revendications 42 à 57, caractérisée en ce que le transgène d'intérêt code pour un activateur qui est impliqué dans l'expression d'un autre gène.
59. Association selon l'une des revendications 42 à 55, caractérisé en ce que le transgène d'intérêt produit un transcrit d'intérêt ayant une activité thérapeutique.
60. Association selon l'une des revendications 42 à 59, caractérisée en ce que lesdits acides nucléiques sont portés sur un même vecteur ou des vecteurs distincts.
61. Association selon la revendication 60, caractérisée en ce que lesdits acides nucléiques sont portés sur un même brin du même vecteur.
62. Association selon la revendication 60 ou 61 , caractérisée en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel, ou tout ADN non encapsidé.
63. Association selon la revendication 60 ou 61, caractérisée en ce que le vecteur est un virus recombinant.
64. Association selon la revendication 63, caractérisée en ce que le vecteur est choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, un virus de l'herpès, un virus adéno-associé, un phage, ou un dérivé de ceux-ci.
I
65. Association selon la revendication 60 ou 61 , caractérisée en ce que le vecteur est une bactérie ou un parasite.
66. Association selon l'une des revendications 42 à 65, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme administrable in vivo par technique physique ou mécanique.
67. Association selon la revendication 66, caractérisée en ce qu'elle est administrable par injection, par technique balistique, par électroporation, par sonoporation, par l'intermédiaire d'un champs électrique, de microondes, de la chaleur, de la pression, ou par une combinaison de ces techniques.
68. Association selon la revendication 66, caractérisée en ce qu'elle est administrable par injection et/ou électrotransfert.
69. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68 pour la régulation d'un transgène d'intérêt dans une cellule ou un tissu cible.
70. Utilisation selon la revendication 69, caractérisée en ce que la cellule ou le tissu cible est d'origine animale non humaine.
71. Utilisation selon la revendication 70, caractérisée en ce que la cellule ou le tissu cible est musculaire.
72. Utilisation selon la revendication 69, caractérisée en ce que la cellule ou le tissu cible est d'origine végétale.
73. Composition pharmaceutique comprenant l'association selon l'une des revendications 42 à 68 et un excipient pharmaceutiquement approprié.
74. Médicament comprenant l'association selon l'une des revendications 42 à 68 et un excipient approprié.
75. Médicament selon la revendication 74 susceptible d'être injecté dans le muscle, ou par voie systémique, ou par voie intra-artérielle, ou intraveineuse.
76. Médicament comprenant l'association selon l'une des revendications 42 à 68 et un excipient approprié, susceptible d'être administré par voie topique, cutanée, orale, vaginale, intranasale, sous cutanée ou parentérale.
77. Médicament selon l'une des revendications 74 à 76, caractérisé en ce que l'excipient est un excipient approprié pour les différents modes d'administration.
78. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné à la correction d'une anomalie ou d'une déficience génétique.
79. Utilisation de l'association selon la revendication 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies génétiques mitochondriales.
80. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des myopathies.
81. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des ischémies et de la sténose.
82. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies lysosomales
83. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des troubles hormonaux.
84. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hémophilie.
85. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde.
86. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la β- thalassémie.
87. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné à induire l'apoptose.
88. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement anticancéreux.
89. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodegenératives.
90. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension.
91. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hyperlipidémies telles que l'obésité.
92. Utilisation de l'association selon l'une quelconque des revendications 42 à 68, pour la fabrication de vaccins.
93. Animal transgénique, caractérisé en ce qu'il porte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et un acide nucléique codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
94. Animal transgénique selon la revendication 93, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens génétique, d'un ARN capable de former une triple hélice, ou d'un ribozyme.
95. Animal transgénique selon la revendication 93 ou 94, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur est régulé négativement par l'intermédiaire d'un promoteur répressible, et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
96. Animal transgénique selon la revendication 93 ou 94, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est un ligand spécifique activateur de la séquence aptamère.
97. Animal transgénique selon la revendication 93 ou 94, caractérisé en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand-dépendante, et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
98. Animal transgénique selon l'une des revendications 93 à 97, caractérisé en ce que le transcrit d'intérêt est sous le contrôle d'un promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
99. Plante transgénique caractérisée eh ce qu'elle porte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt et un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe.
100. Plante transgénique selon la revendication 99, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur se présente sous la forme d'un ARN antisens génétique, d'un ARN capable de former une triple hélice, ou d'un ribozyme.
101. Plante transgénique selon la revendication 99 ou 100, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur est régulé négativement par l'intermédiaire d'un promoteur répressible, et l'agent externe conduit à l'inhibition dudit promoteur.
102. Plante transgénique selon la revendication 99 ou 100, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence aptamère autocatalytique activable, et l'agent externe est un ligand spécifique de cette séquence aptamère.
103. Plante transgénique selon la revendication 99 ou 100, caractérisée en ce que le transcrit inhibiteur comprend en outre une séquence susceptible d'être reconnue par un ribozyme à activité ligand- dépendante, et l'agent externe est un ligand activateur de l'activité catalytique du ribozyme.
104. Plante transgénique selon l'une des revendications 99 à 103, caractérisée en ce que le transcrit d'intérêt est sous le contrôle d'un promoteur inductible, et l'agent externe conduit à l'activation dudit promoteur.
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