JP2003512442A - 癌の治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍の治療方法であって、EGRの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬物、またはEGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物を被験体に投与することによって、血管形成が抑制されることを特徴とする、この治療を必要とする被験体の血管形成を抑制することを含んでなる方法に関する。本発明は血管形成を抑制する薬物のスクリーニング方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は癌の治療のための組成物および方法に関する。

【０００２】発明の背景 癌 癌は合衆国において1998年だけでも50万人を超える死亡、あるいは全死亡のお
よそ23％の原因となった（Landisら、1998）。心血管疾患のみが確実により多く
の人命を奪う（Cotranら、1999）。

【０００３】 腫瘍の成長の基礎となる細胞および分子機序には単に腫瘍細胞の増殖および移
動のみが関与するのではないという証拠が増えてきている。重要なことは、腫瘍
の成長および転移が、新しい血管形成の過程である進行中の血管形成（angiogen
esis）に決定的に依存することである（Crystal, 1999）。（新血管新生(neovas
cularrisation)としても知られている）血管形成は、現存する血管から派生する
血管内皮細胞の移動および成長によって仲介され、微小管のネットワークが増大
するが、これによって成長する腫瘍に生体栄養素が供給される。原発固形腫瘍は
活発な血管形成がなければ直径1〜2 mmより大きくなることができない（Harris,
1998）。

【０００４】 抗新生物薬の評価のためのモデル癌細胞系として、ヒトHepG2肝細胞癌細胞が
使用されてきた（Yangら、1997）。これらの細胞は基本的に、および誘導的に、
前初期遺伝子および転写レギュレーター、初期成長応答因子-1（EGR-1）を発現
する（Kosakiら、1995）。

【０００５】初期成長応答タンパク質（EGR-1） 初期成長応答因子-1（EGR-1、またEgr-1、NGFI-A、zif268、krox24およびTIS8
としても知られている）は前初期遺伝子および亜鉛フィンガーファミリーの転写
レギュレーターの始原型メンバーの産物である（Cashlerら、1995）。Egr-1はア
テローム性動脈硬化症および再狭窄の発生機序に関与する一連の遺伝子のプロモ
ーターに結合する。これらとして以下のものが含まれる：血小板由来成長因子（
PDGF）A鎖（Khachigianら、1995）、PDGF-B（Khachigianら、1996）、トランス
フォーミング成長因子β₁（Liuら、1996, 1998）、繊維芽細胞成長因子-2（FGF-
2）（Huら、1994；Biesiadaら、1996）、膜タイプ1マトリックスメタロプロテイ
ナーゼ（Haasら、1999）、組織因子（Cuiら、1996）および細胞内付着分子-1（M
alzinanら、1996）。EGR-1はまた、ヒトアテローム性動脈硬化プラーク中の内皮
細胞および平滑筋細胞に局在するものとされた（MacCaffreyら、2000）。配列特
異的触媒性DNAを使用するEgr-1遺伝子誘導の抑制は、バルーン血管形成術後のラ
ット頚動脈内の血管内膜肥厚を抑制する（Santiagoら、1999a）。

【０００６】DNAザイム ヒト遺伝子治療において、遺伝子の発現が疾病の原因であることにより、その
発現が望ましくない遺伝子を不活性化するために、アンチセンス核酸技法が最善
の主要な手段の１つとされてきた。このアンチセンス手法では、望ましくない遺
伝子をコードするmRNA分子に相補的で、したがってこれとハイブリダイズする核
酸分子の１つを利用する。こうしたハイブリダイゼーションの結果として遺伝子
発現の抑制が導かれる。

【０００７】 アンチセンス技法はある種の欠点が避けられない。アンチセンスハイブリダイ
ゼーションの結果、DNA/標的mRNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖
はRNアーゼHに仲介される標的mRNA成分の分解の１基質として作用する。ここでD
NAアンチセンス分子は、内在性RNアーゼH酵素によって要求される切断を単に助
長するという、受動的様相で作用する。このRNアーゼHへの依存性は、それらの
標的mRNAと安定なヘテロ二本鎖を形成するための化学構造および能力に基づくア
ンチセンス分子の設計に制限を与える。アンチセンスDNA分子には非特異的活性
および、さらには高濃度における毒性に関係する問題もある。標的mRNA発現のア
ンチセンス抑制の別の機序の１例は、mRNA上の翻訳機能部の運動の立体的抑制で
ある。

【０００８】 アンチセンス分子の代替物として、触媒性核酸分子が遺伝子発現の抑制のため
の治療薬として有望であることが示され、文献中で広範に考察されている（Hase
loff(1988)；Breaker(1994)；Koizumi(1989)；Otsuka；Kashani-Sabet(1992)；R
aillard(1996)；およびCarmi(1996)）。これによると、従来のアンチセンス分子
とは異なって、触媒性核酸分子はその標的mRNA分子に単に結合するのではなく、
これの現実の切断によって機能する。触媒性核酸分子は、標的核酸配列が一定の
最低要件にかなう場合にのみ、その標的配列を切断することができる。その標的
配列は触媒性核酸のハイブリダイズ性アームに相補的でなければならず、またそ
の標的は切断の部位に特定の配列を含んでいなければならない。

【０００９】 触媒性RNA分子（「リボザイム」）は詳細に報告されており（Haseloff(1988)
；Symonds(1992)；およびSun(1997)）、またRNA（Haseloff(1988)）およびDNA（
Raillard(1996)）分子の両方を切断する能力があることが示された。実際、in v
itro選別および進化技術の発達によって、出発点として既知のリボザイムのラン
ダム変異体またはランダム配列RNAのいずれかを使用して、既知の基質に対する
新規なリボザイムを取得することが可能になった（Pan(1992)；Tsang(1994)；お
よびBreaker(1994)）。

【００１０】 しかし、リボザイムはそれらの機能を実行しようとする細胞内で酵素による加
水分解を非常に受けやすい。このため、それらの医薬としての適用には限界があ
る。

【００１１】 最近、「DNAザイム(DNAzyme)」と称される新しいクラスの触媒性分子が創出さ
れた（Breaker and Joyce(1995)；Santoro(1997)）。DNAザイムは一本鎖であり
、RNA（Breaker(1994)；Santoro(1997)）およびDNA（Carmi(1996)）の両方を切
断する。DNAザイムの一般的なモデルが提案されたが、これは「10-23」モデルと
して知られている。単純化して「10-23 DNAザイム」とも称される「10-23」モデ
ルにしたがうDNAザイムは、それぞれ7〜9デオキシリボヌクレオチドからなる2つ
の基質認識ドメインに隣接した15デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを持
っている。in vitro分析から、このタイプのDNAザイムは生理学的条件下でその
基質RNAをプリン：ピリミジン連結部で効果的に切断することができることが示
されている。

【００１２】 DNAザイムは治療薬としての有望性を示している。しかし、既知のmRNA分子の
存在に起因する疾病に対するDNAザイムの成果は予測し得るものではない。この
予測不能性は部分的には2つの要因による。第１に、ある種のmRNA二次構造がDNA
ザイムのその標的mRNAへの結合および切断能力を妨害することがある。第2に、
標的mRANAを発現する細胞によるDNAザイムの取り込みが、治療的に意味がある結
果を可能にするのに十分有効でないことがある。

【００１３】発明の概要 本発明は、EGR-1が血管内皮細胞の複製および移動において重要であること、
ならびにEGR-1を標的とするDNAに基づく特異的触媒性分子が培養物中の悪性腫瘍
細胞の成長を抑制することを確定した。これらの知見は、EGRもしくは関連するE
GRファミリーメンバーのインヒビターが腫瘍の治療において有用であること、そ
して2つの別の作用機序が関与しているらしいことを示している。特定すると、E
GRファミリーメンバーのインヒビターは、血管形成を抑制することによって間接
的に、かつ／または腫瘍細胞中のEGRファミリーメンバーを妨害することによっ
て直接的に、腫瘍の成長を抑制するらしい。

【００１４】 本明細書で使用する際の用語「EGR」とは、EGRファミリーのメンバーを称する
。EGRファミリーのメンバーはGashlerら、1995に記載されているが、EGR-1からE
GR-4までが含まれる。現状ではEGRファミリーメンバーがEGR-1の場合が好ましい
。

【００１５】 したがって、第１の態様において本発明は、腫瘍の治療方法であって、この治
療を必要とする被験体に、EGRの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬
物、またはEGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物を投与することを含ん
でなる方法を提供する。

【００１６】 第2の態様において本発明は、腫瘍細胞の成長もしくは増殖を抑制するための
方法であって、EGRの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬物、または
EGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物と腫瘍細胞を接触させることを含
んでなる方法を提供する。

【００１７】 第3の態様において本発明は、(i)EGRの誘導を抑制する薬物、(ii)EGRの発現を
減少させる薬物、または(iii)EGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物を含
むかあるいはこれをコードする１核酸分子を細胞中に導入することによって形質
転換させた腫瘍細胞を提供する。

【００１８】 第4の態様において本発明は、血管形成を抑制する薬物のスクリーニング方法
であって、EGRの誘導の抑制、EGRの発現の減少、またはEGRの核内蓄積もしくは
活性の低下の能力について、推定される薬物を試験することを含んでなる方法を
提供する。

【００１９】 本発明の好ましい１実施形態において、薬物はEGRアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、EGRを標的とするリボザイム、EGR dsDNAを標的とするssDNAであって、s
sDNAがEGR-1 dsDNAと三本鎖を形成し得るもの、ならびにEGRを標的とするDNAザ
イムからなる群から選択される。

【００２０】発明の詳細な説明 第１の態様において本発明は、腫瘍の治療方法であって、この治療を必要とす
る被験体に、EGRの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬物、またはEG
Rの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物を投与することを含んでなる方法を
提供する。

【００２１】 第1の態様の方法には、血管形成を抑制することによる腫瘍増殖の間接的抑制
、および／または腫瘍細胞中のEGRを妨害することによる直接抑制を伴うもので
あってよい。

【００２２】 第１の態様の好ましい１実施形態において、腫瘍は固体腫瘍である。腫瘍は限
定するわけではないが、前立腺腫瘍、肝細胞癌、皮膚癌または乳房腫瘍から選択
することができる。

【００２３】 この分野の当業者には認識されるであろうが、本発明の方法を達成する手段は
多数ある。

【００２４】 本発明の好ましい１実施形態において、EGRはEGR-1である。

【００２５】 １実施形態においては、ssDNA分子がdsDNAに結合して転写を妨害する三重ヘリ
ックス（三本鎖）法を用いて、直接EGR遺伝子を標的とすることによって、本方
法を達成する。

【００２６】 別の実施形態においては、核酸転写のデコイを使用し、EGR遺伝子の転写を抑
制することによって、本方法を達成する。所与の転写因子に対する結合部位をコ
ードする部分的な分子内二本鎖を形成するように、直鎖配列を設計することがで
きる。EGR転写がSP1、AP1もしくは血清応答因子のプロモーター領域への結合に
依存することが証拠に基づいて示唆されている。これらのうち１種以上の転写因
子のそのような結合が抑制されることによって、EGR遺伝子の転写を抑制するで
あろうと考えられる。

【００２７】 別の実施形態においては、RNアーゼHの基質として作用するのではなく、遺伝
子発現を立体的に妨害することによって作用する、合成アンチセンスDNA分子を
使用して、EGR mRNAの翻訳を抑制することによって、本方法を達成する。

【００２８】 別の実施形態においては、合成アンチセンスDNA分子を用いてmRNAを不安定化
させ（これは、アンチセンスDNAとmRNAとの間で形成されるヘテロ二本鎖に存在
するEGR mRNAをRNアーゼHによって分解させることによって実施することができ
る）、EGR mRNAの翻訳を抑制することによって、本方法を達成する。

【００２９】 本発明の好ましい１実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 (i) ACA CTT TTG TCT GCT（配列番号４）および (ii) CTT GGC CGC TGC CAT（配列番号２）、 からなる群から選択される配列を持つ。

【００３０】 別の実施形態においては、配列特異的ハンマーヘッドリボザイムおよびハンマ
ーヘッドリボザイムの誘導体を用いてmRNAを開裂することによるEGR mRNAの翻訳
の抑制によって、本方法を達成する。そのような配列特異的ハンマーヘッドリボ
ザイムおよびその誘導体としては、例えばMinizymeもしくはMini-リボザイム、
または以下のものに由来するリボザイムがある： (i) ヘアピンリボザイム、 (ii) テトラヒメナ(Tetrahymena)のグループＩイントロン、 (iii) 肝炎δウイロイド(Hepatitis Delta Viroid)のリボザイム、もしくは (iv) ニューロスポラ(Neurospera)のリボザイム。

【００３１】 当業者には、リボザイムの構成が以下の通りであることが理解されるであろう
。

【００３２】 (i) 全体がRNAの構成、 (ii) RNA塩基とDNA塩基とからなる構成、または (iii) RNAもしくはDNAおよび修飾塩基、糖ならびに骨格鎖からなる構成。

【００３３】 本発明の内容において、リボザイムは以下のいずれかであってもよい。

【００３４】 (i) 全体を合成したもの、あるいは、 (ii) ウイルス由来のベクターまたは発現プラスミドに入れて送達される遺伝
子、患者のゲノム中に相同的もしくは非相同的に組み込まれるか、または患者の
細胞を再導入する前にその細胞内に上記の方法のいずれかを使用してex vivo送
達される合成遺伝子、からの転写物中に含まれるもの。

【００３５】 別の実施形態においては、アンチセンスEGR-1 mRNAの発現によってEGR遺伝子
のその標的DNAへの結合能を抑制することにより、本方法を達成する。

【００３６】 別の実施形態においては、転写デコイ法を使用して、転写因子としてのEGRの
活性を抑制することによって、本方法を達成する。

【００３７】 別の実施形態においては、GC含量が多い配列に対する選択性を有する薬物によ
って、EGR遺伝子のその標的DNAへの結合能を抑制することにより、本方法を達成
する。こうした薬物として、ノガラマイシン、ヘダマイシンおよびクロモマイシ
ンA3が含まれる（Chiangら、J.Biol.Chem.1996;271:23999）。

【００３８】 好ましい１実施形態においては、配列特異的DNAザイムによるEGR mRNAの開裂
によって、本方法を達成する。さらに好ましい１実施形態においては、DNAザイ
ムは以下の(i)〜(iii)を含む。

【００３９】 (i) プリン：ピリミジン開裂部位でmRNAを開裂する触媒性ドメイン； (ii) 触媒性ドメインの5'末端に隣接する第1結合ドメイン；および (iii) 触媒性ドメインの3'末端に隣接する第2結合ドメイン、 この(i)〜(iii)において、これらの結合ドメインは、配列番号１５に示すヌクレ
オチド168-332に相当するEGR mRNAの領域内の、プリン：ピリミジン開裂部位に
直接隣接する2つの領域に十分相補的であることによって、DNAザイムがEGR mRNA
を開裂し得るようにするものである。

【００４０】 本明細書で使用する「DNAザイム」とは、DNAもしくはRNAのいずれかであり得
る、独特の標的核酸配列を特異的に認識して開裂するDNA分子を意味する。

【００４１】 好ましい１実施形態においては、DNAザイムの結合ドメインは開裂部位に直接
隣接する領域に相補的である。しかし、EGR mRNAに結合して開裂するためには、
DNAザイムについて厳密な相補性が必要ではないことは、当業者が理解するとこ
ろであろう。

【００４２】 （本明細書中で「アーム長」とも称される）結合ドメイン長は、どんな組合せ
でもよく、また同一でも異なっていてもよい。好ましい１実施形態において、結
合ドメイン長は少なくとも6ヌクレオチドである。好ましくは、両結合ドメイン
は合計の長さが少なくとも14ヌクレオチドである。2つの結合ドメインの長さは
、7＋7、8＋8および9＋9などの各種の組合せが想定される。

【００４３】 本発明のDNAザイムの触媒性ドメインは好適ないかなる触媒性ドメインでもよ
い。好適な触媒性ドメインの例がSantoroおよびJoyce, 1997ならびに米国特許第
5,807,718号に記載されている。好ましい１実施形態において、触媒性ドメイン
はヌクレオチド配列 GGCTAGCTACAACGA（配列番号５）を有する。

【００４４】 本発明の内容において、ヌクレオチド168-332に相当するEGR mRNAの領域内の
好ましい開裂部位は以下の通りである： (i) ヌクレオチド198-199に相当するGU部位； (ii) ヌクレオチド200-201に相当するGU部位； (iii) ヌクレオチド264-265に相当するGU部位； (iv) ヌクレオチド271-272に相当するAU部位； (v) ヌクレオチド292-293に相当するAU部位； (vi) ヌクレオチド301-302に相当するAU部位； (vii) ヌクレオチド303-304に相当するGU部位；および (viii)ヌクレオチド316-317に相当するAU部位。

【００４５】 さらに好ましい１実施形態において、DNAザイムは以下の群から選択される配
列を持つ： (i) 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg（配列番号３） 標的はGU（bp198, 199）；アームはbp189-207とハイブリダイズする (ii) 5'-tgcaggggaGGCTAGCTACAACGAaccgttgcg（配列番号６） 標的はGU（bp200, 201）；アームはbp191-209とハイブリダイズする (iii) 5'-catcctggaGGCTAGCTACAACGAgagcaggct（配列番号７） 標的はGU（bp264, 265）；アームはbp255-273とハイブリダイズする (iv) 5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga（配列番号８） 標的はAU（bp271, 272）；アームはbp262-280とハイブリダイズする (v) 5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt（配列番号９） 標的はAU（bp271, 272）；アームはbp262-280とハイブリダイズする (vi) 5'-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat（配列番号１０） 標的はAU（bp301, 302）；アームはbp292-310とハイブリダイズする (vii) 5'-cagcggggaGGCTAGCTACAACGAatcagctgc（配列番号１１） 標的はGU（bp303, 304）；アームはbp294-312とハイブリダイズする (viii)5'-ggtcagagaGGCTAGCTACAACGActgcagcgg（配列番号１２） 標的はAU（bp316, 317）；アームはbp307-325とハイブリダイズする。

【００４６】 特に好ましい１実施形態においては、DNAザイムはヌクレオチド198-199に相当
するGU部位、ヌクレオチド271-272に相当するAU部位またはヌクレオチド301-302
に相当するAU部位を標的とする。

【００４７】 さらに好ましい１実施形態においては、DNAザイムは以下の配列を持つ： 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg（配列番号３）、 5'-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat（配列番号１０）、 5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga（配列番号８）または 5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt（配列番号９）。

【００４８】 DNAザイムに基づく治療を適用する場合、DNAザイムが細胞内環境における分解
に対してできるだけ安定であることが望ましい。これを達成するための１つの手
段は、DNAザイムの１以上の末端において3'-3'逆位を組み込むことによるもので
ある。さらに具体的には、3'-3'逆位（本明細書中で単に「逆位」とも称する）
とは、末端ヌクレオチドとそれに隣接するヌクレオチドの3'炭素間のリン酸共有
結合を意味する。このタイプの結合は、隣接するヌクレオチドの3'炭素と5'炭素
との間の通常のリン酸結合とは反対になるため、「逆位」と称する。したがって
、好ましい１実施形態においては、触媒性ドメインの3'末端に隣接する構成ドメ
イン中では、3'末端ヌクレオチド残基は逆位である。逆位の他に、本発明のDNA
ザイムに修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。修飾ヌクレオチドとしては、例
えばN3'-P5'ホスホロアミデート結合物、およびペプチド-核酸結合物が含まれる
。これらは当分野で周知である。

【００４９】 特に好ましい１実施形態において、DNAザイムは3'位置に逆位のTを含む。

【００５０】 被験体はどんな動物でもヒトでもよいが、被験体がヒトの場合が好ましい。

【００５１】 本発明の内容において、EGR抑制性薬物を単独で、または１種以上のさらなる
抗癌剤と組み合わせて、投与することができるが、これは当業者には公知である
。

【００５２】 抑制性薬物の投与は、当業者には公知の各種の方法および送達システムの任意
のものを使用して、達成または実施することができる。例えば、静脈内、経口、
インプラント経由、経粘膜、経皮、局所、筋内、皮下もしくは体外から投与を実
施することができる。さらに、本発明の医薬組成物は理想的には１種以上の製薬
上許容される常用の担体を含む。こうした担体は当業者には周知である。多数の
常用の担体を使用する以下の送達システムは、本発明の組成物を投与するために
想定される多くの実施形態の代表例にすぎない。１実施形態において、送達ビヒ
クルはMg²⁺または有効なDNAザイムの生物活性を得るための補因子として作用す
るその他のカチオン（類）を含む。

【００５３】 経皮送達システムとして、パッチ、ゲル、テープおよびクリームが含まれ、そ
れらには可溶化剤、浸透強化剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコ
ールおよびアミノ酸）、親水性ポリマー（例えばポリカルボフィルおよびポリビ
ニルピロリドン）、ならびに接着剤および粘着付与剤（例えばポリイソブチレン
、シリコンベースの接着剤、アクリレートおよびポリブテン）などの賦形剤を含
ませることができる。

【００５４】 経粘膜送達システムとして、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲルおよびク
リームが含まれ、それらには可溶化剤および相乗剤（例えばプロピレングリコー
ル、胆汁酸塩およびアミノ酸）、ならびにその他のビヒクル（例えばポリエチレ
ングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤を含ませ
ることができる。

【００５５】 経口送達システムとして錠剤およびカプセルが含まれる。これらに結合剤（例
えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、その他のセ
ルロース性物質およびスターチ）、希釈剤（例えばラクトースおよびその他の糖
類、スターチ、リン酸二カルシウムならびにセルロース性物質）、崩壊剤（例え
ばスターチポリマーおよびセルロース性物質）ならびに潤滑剤（例えばステアレ
ートおよびタルク）などの賦形剤を含ませることができる。

【００５６】 再構成可能な送達システムのための溶液、懸濁液および粉末には、懸濁化剤（
例えばガム、ザンタン、セルロース類および糖類）、湿潤剤（例えばソルビトー
ル）、可溶化剤（例えばエタノール、水、PEGおよびプロピレングリコール）、
界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム、Span、Tweenおよびセチルピリジ
ン）、保存剤および抗酸化剤（例えばパラベン、ビタミンEおよびC、ならびにア
スコルビン酸）、抗凝結剤、コーティング剤ならびにキレート剤（例えばEDTA）
などのビヒクルを含ませる。

【００５７】 局所送達システムとして例えばゲルおよび溶液が含まれ、それらには可溶化剤
、浸透強化剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコールおよびアミノ
酸）ならびに親水性ポリマー（例えばポリカルボフィルおよびポリビニルピロリ
ドン）などの賦形剤を含ませることができる。好ましい１実施形態において、製
薬上許容される担体はリポソームまたは生体分解性ポリマーである。本発明にお
いて使用することができる担体の例として以下のものが含まれる：(1) Fugene6
（登録商標）（Roche）；(2) SUPERFECT（登録商標）（Qiagen）；(3) Lipofect
amine 2000（登録商標）（GIBCO BRL）；(4) CellFectin, カチオン性脂質 N,N
I,NII,NIII-テトラメチル-N,NI,NII,NIII-テトラパルミチルスペルミンとジオレ
オイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)との1:1.5(M/M)リポソーム製剤（
GIBCO BRL）；(5) Cytofectin GSV, カチオン性脂質とDOPEとの2:1(M/M)リポソ
ーム製剤（Glen Research）；(6) DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)-N,N,N-
トリメチル-アンモニウムメチルスルフェート）（Boehringer Manheim）；なら
びに(7)Lipofectamine, ポリカチオン性脂質 DOSPAと中性脂質 DOPEとの3:1(M/M
)リポソーム製剤（GIBCO BRL）。

【００５８】 好ましい１実施形態においては、固体腫瘍内またはその近傍に薬物を注入する
。注射用薬物送達システムとして、溶液、懸濁液、ゲル、ミクロスフェアおよび
ポリマー性注射剤が含まれ、溶解度変更剤（例えばエタノール、プロピレングリ
コールおよびショ糖）ならびにポリマー（例えばポリカプリルラクトンおよびPL
GA）などの賦形剤を含ませることができる。インプラント用システムとして、ロ
ッドおよびディスクが含まれ、PLGAおよびポリカプリルラクトンなどの賦形剤を
含ませることができる。

【００５９】 記載した核酸薬物の送達は、限定するわけではないが、以下の例に挙げられる
１種以上のビヒクルを介して達成することもできる： (a) リポソームおよびリポソーム-タンパク質コンジュゲートならびに混合物
； (b) 非リポソーム脂質およびカチオン性脂質製剤； (c) 活性化デンドリマー製剤； (d) プルロニックゲルなどのポリマー製剤またはエチレンビニルアセテートコ
ポリマー（EVAc）内に含有させる。このポリマーは管腔内送達することができる
； (e) センダイウイルスなどのウイルス-リポソーム複合体内に含有させる；ま
たは (f) ペプチド-DNAコンジュゲートとする。

【００６０】 慣用のコンピューターによる方法を使用して、動物データに基づき、本発明の
医薬組成物の予防上有効な用量を決定することができる。１実施形態においては
、予防上有効な用量は約0.1 mg〜約1 gの本発明のDNAザイムを含有する。別の実
施形態においては、予防上有効な用量は約1 mg〜約100 mgの本発明のDNAザイム
を含有する。さらに別の実施形態においては、予防上有効な用量は約10 mg〜約5
0 mgの本発明のDNAザイムを含有する。また別の実施形態においては、予防上有
効な用量は約25 mgの本発明のDNAザイムを含有する。

【００６１】 EGRを標的とする核酸薬剤を細胞懸濁物のex vivoトランスフェクションによっ
て投与し、それによって腫瘍の増殖、分化および／または転移を抑制することも
想定される。

【００６２】 第2の態様において本発明は、腫瘍細胞の成長もしくは増殖を抑制するための
方法であって、EGRの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬物、または
EGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物と、腫瘍細胞とを接触させること
を含んでなる方法を提供する。

【００６３】 第3の態様において本発明は、(i)EGRの誘導を抑制する薬物、(ii)EGRの発現を
減少させる薬物、または(iii)EGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物、を
含むかあるいはこれをコードする核酸分子を腫瘍細胞中に導入することによって
形質転換させた腫瘍細胞を提供する。

【００６４】 第3および第4の態様の好ましい１実施形態において、前記薬物はEGRアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドまたはmRNA、EGRを標的とする配列特異的リボザイム、E
GR dsDNAを標的とするssDNA、ならびにEGRを標的とする配列特異的DNAザイムか
らなる群から選択される。

【００６５】 第4の態様において本発明は、血管形成を抑制する薬物のスクリーニング方法
であって、EGRの誘導の抑制、EGRの発現の減少、またはEGRの核内蓄積もしくは
活性の低下を生ずる能力について、推定される薬物を試験することを含んでなる
方法を提供する。

【００６６】 任意の好適な手段によって、EGRを抑制する能力について推定上の薬物を試験
することができる。例えば、その試験は、EGRを発現する細胞と推定上の薬物と
を接触させ、EGR mRNAの生成をモニターしたり（例えばノーザンブロット分析に
よって）、EGRタンパク質の生成をモニターしたり（例えば免疫組織化学的分析
もしくはウエスタンブロット分析によって）することを含む。その他の好適な試
験は当業者には公知であろう。

【００６７】 参照のため、以下の表１にマウス、ラットおよびヒト EGR-1のDNA配列間の比
較を示す。

【００６８】

【表1】 実験の詳細 実施例1 内皮細胞の増殖および移動におけるEGR-1の役割 材料と方法 オリゴヌクレオチドおよび薬品 Egr-1 mRNAの翻訳開始部位を含んでいる領域に
対するホスホロチオエートを連結させたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、商
業的に合成され(Genset Pacific)、それを高速液体クロマトグラフィーで精製し
た。標的配列であるAS2(5'-CsTsTsGsGsCsCsGsCsTsGsCsCsAsT-3')(配列番号16)は
マウス、ラット、およびヒトのEgr-1 mRNA中で保存されている。対照として、本
発明者らはAS2C(5'-GsCsAsCsTsTsCsTsGsCsTsGsTsCsC-3')(配列番号17)を用いた
が、これはサイズを一致させたホスホロチオエートを連結させたAS2の対応物で
類似の塩基組成を有している。ホルボール-12-ミリステート 13-アセテート(PMA
)および線維芽細胞増殖因子-2はSigma-Aldrichから購入した。

【００６９】細胞培養 ウシ大動脈内皮細胞はCell Applications, Inc.から入手し、継代5〜
9の間のものを用いた。その内皮細胞を10%のウシ胎児血清を含有し、50μg/mLの
ストレプトマイシンおよび50 IU/mLのペニシリンを補足したDulbecco改変Eagle
培地(Life Technologies), pH 7.4中で増殖させた。細胞をトリプシン/EDTAを用
いて通常どおり継代し37℃で5%CO₂/95%空気の湿潤雰囲気で維持した。

【００７０】一過性トランスフェクション分析およびCATアッセイ 内皮細胞を100mmのシャー
レで60〜70%コンフルエントとなるまで増殖させ、10μgの示されたクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をベースとするプロモーターリポー
ター構築物をFuGENE6(Roche)を用いて一過性にトランスフェクトした。その細胞
を0.25%FBS中で48時間インキュベートすることによって増殖を静止させた状態と
し、採取してCAT活性を評価する24時間前に種々のアゴニストで刺激した。既に
報告されている方法で(Khachigianら, 1999)、CAT活性を測定し溶解物中のタン
パク質濃度(Biorad Protein Assayで測定)で標準化した。

【００７１】ノーザンブロット分析 あらかじめ種々のアゴニストに1時間曝露させた、増殖
を停止した内皮細胞(TRIzol試薬(Life Technologies)を製造者の使用説明書に従
って用いて調製)の総RNA(12μg/ウエル)を変性1%アガロース-ホルムアルデヒド
ゲル上で電気泳動して分離した。Hybond-N＋ナイロン膜(Amersham)へ一晩かけて
転写した後、ブロットをNick Translation Kit(Roche)を用いて、³²P標識Egr-1
cDNAと一晩ハイブリダイズさせた。その膜を洗い、放射活性を既に報告されてい
る方法で(Khachigianら, 1995)、オートラジオグラフィーで可視化した。

【００７２】RT-PCR 逆転写はM-MLV逆転写酵素を用いて8μgの総RNAで行った。Egr-1 cDNA(3
34bp産物(Delbridgeら, 1997))をTaqポリメラーゼを用いて増幅し、その増幅は9
4℃で1分間加熱、次いで94℃1分間、94℃1分間、55℃1分間、および72℃1分間の
サイクルで行った。30サイクルを行った後、72℃での5分間の伸長を行った。サ
ンプルを臭化エチジウム含有の1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、紫外光下で
撮影した。β-アクチン増幅(690bp産物)を本質的には上記と同様に行った。プラ
イマーの配列は以下のものであった：Egr-1フォワードプライマー(5'-GCA CCC A
AC AGT GGC AAC-3')(配列番号18)、Egr-1リバースプライマー(5'-GGG ATC ATG G
GA ACC TGG-3')(配列番号19)、β-アクチンフォワードプライマー(5'-TGA CGG G
GT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3')(配列番号20)、およびβ-アクチンリバー
スプライマー(5'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG-3')(配列番号21)
。

【００７３】アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達とウエスタンブロット分析 100mmのシ
ャーレに入れた増殖を停止した細胞を示されたオリゴヌクレオチドと培地の初回
交換後24時間および48時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドを再度添加
する際に、この細胞を種々の濃度のインスリンとインキュベートし、その1時間
後に採取した。その細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS), pH 7.4で洗い、RIPA
バッファー(150mM NaCl, 50mM Tris-HCl,pH7.5, 1% デオキシコール酸ナトリウ
ム、0.1% SDS, 1% Triton X-100, 5mM EDTA, 1% トラジロール, 10μg/mL ロイ
ペプチン, 1% アプロチニン, 2μM PMSF)で可溶化した。溶解物を8%の変性SDS-
ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動で分離し、PDVFナイロン膜(NEN-DuPont)
に転写し、スキムミルク粉末でブロッキングし、次いで、Egr-1に対するポリク
ローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)および西洋ワサビペルオキシダ
ーゼを連結させたモノクローナルマウス抗ウサギIg二次抗体とインキュベートし
、次いで化学発光での検出(NEN-DuPont)を行った。

【００７４】DNA中への ³ H-チミジンの取り込み 96ウエルのプレート中で90%コンフルエント
とした増殖を停止した内皮細胞をインスリン添加前に該オリゴヌクレオチドと2
回インキュベートした。実験にシグナル伝達の阻害剤(PD98059、SB202190、ワー
トマニン)を用いた場合には、これらの薬剤をインスリン添加の2時間前に添加し
た。インスリンに18時間曝露した後、細胞を200,000 cpm/ウエルのメチル-³H-チ
ミジン(NEN-DuPont)で6時間、パルスした。溶解物をまず最初に冷PBS, pH7.4で
洗い、次いで冷トリクロロ酢酸で固定し、冷エタノールで洗い、0.1M NaOH中で
可溶化することで調製した。溶解物中の³H-チミジンをβ-シンチレーションカウ
ンター(Packard)を用いてACSIIシンチラントで定量した。

【００７５】in vitroでの傷害 90%コンフルエントとした増殖を停止した細胞を上述のとお
りアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび種々の濃度のインスリンとインキュベ
ートし、次いで滅菌済の木製楊枝で単層を引いて掻き取った(Khachigianら, 199
6)。48〜72時間後に、細胞を4%ホルマリンで固定し、ヘマトキシリン/エオシン
で染色し、撮影した。

【００７６】HMEC-1培養および増殖アッセイ SV40で形質転換したHMEC-1細胞を10% FBSを含
有のMCDB 131培地にEGF(10ng/mL)およびヒドロコーチゾン(1μg/mL)を補足した
ものの中で増殖させた。補足物を加えていない無血清培地中でのインキュベーシ
ョンの48時間後、その細胞を示されたDNAエンザイム(0.4μM)でトランスフェク
トし、培地交換の72時間後の10%血清が添加された際に再度トランスフェクトし
た。細胞はコールターカウンターで血清添加の24時間後に計数した。

【００７７】アンチセンスEgr-1 mRNAの過剰発現 ウシ大動脈内皮細胞もしくはラット血管平
滑筋細胞を96ウエルのプレート中で60%コンフルエントとなるまで増殖させ、次
いで3μgの構築物pcDNA3-A/SEgr-1(この構築物中ではEgr-1 cDNA(732-869)の137
bpの断片がpcDNA3のBamHI/EcoRI部位中にアンチセンスの方向でクローン化され
ていた)で、もしくはpcDNA3単独で、Fugene6を製造者の使用説明書に従って用い
てトランスフェクトした。増殖停止細胞を5%FBSを含むWaymouth培地(SMC)もしく
はDMEM(EC)でインキュベートし、3日後にトリプシン処理し、その後コールター
カウンターで細胞数を計数した。

【００７８】結果と考察 インスリンは血管内皮細胞でのEgr-1活性を刺激するが、ブドウ糖は刺激しない 高濃度のブドウ糖は、マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ活性と前
初期遺伝子の発現とを刺激することによって、正常状態では静止している血管内
皮細胞を活性化することができる(Frodinら、1995; Kangら, 1999)。これらのシ
グナル伝達および転写の事象は、今度は他の遺伝子の発現を誘導し、その産物が
次に内皮の表現型を変え、病変の進展を促進することができる。血管内皮細胞の
Egr-1活性に及ぼすブドウ糖の影響を調べるために、本発明者らはpEBS1³foscat
でトランスフェクトした内皮細胞で一過性トランスフェクション分析を行った。
このpEBS1³foscatはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を
ベースとしたリポーターベクターで、c-fosのTATAボックスの上流に置かれた3カ
所の高親和性Egr-1結合部位によって駆動される(Gashlerら, 1993)。増殖を停止
した内皮細胞を種々の濃度(5〜30mM)のブドウ糖に24時間以上曝露してもEgr-1結
合活性は増加しなかった(図1)。しかし、Egr-1結合活性はインスリン(100nM)に
曝露させた細胞では増加を示した(図1)。リポーター活性も、血管内皮細胞のEgr
-1転写および結合活性の誘導因子として知られるFGF-2とインキュベートすると
増加を示した(Santiagoら, 1999b)(図1)。

【００７９】インスリンとFGF-2は血管内皮細胞におけるEgr-1 mRNA発現を誘導する リポー
ター遺伝子分析を用いた上述の知見は、インスリンに曝露された内皮細胞中での
Egr-1発現の増加についての証拠を提供した。本発明者らは次いで、逆転写ポリ
メラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)およびノーザンブロット分析を用いて、インスリン
のEgr-1 mRNAレベルを増加させる能力を直接的に示した。RT-PCRにより、Egr-1
は増殖を静止させた内皮細胞中で弱く発現されていることが示された(データは
ここには示していない)。インスリンはFGF-2と同様に、アゴニストへの1時間以
内の曝露でEgr-1発現を増加させた。これに対して、β-アクチン mRNAレベルは
変化がなかった。ノーザンブロット分析により、インスリン、FGF-2、およびEgr
-1発現の別の強力な誘導因子であるホルボール12-ミリステート 13-アセテート(
PMA)(Khachigianら, 1995)は、リボソームの28Sおよび18S mRNAのレベルを増加
させることなく、定常状態のEgr-1 mRNAレベルを1時間以内に上昇させることを
示すことによって、上述の定性的データが確認された(データはここには示して
いない)。

【００８０】内皮細胞中でインスリンによって刺激されるEgr-1タンパク質合成はEgr-1 mRNA
を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される 本発明者ら
が示したインスリンで誘導されるEgr-1 mRNA発現と、転写因子の結合活性(図1)
とが一致したものであるか調べるために、本発明者らはウエスタンイムノブロッ
ト分析をEgr-1タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて行った。インス
リン(100nMと500nM)は、増殖を停止した内皮細胞において1時間以内にEgr-1タン
パク質合成を誘導した(データはここには示していない)。これらの知見は、併せ
て考慮すると、インスリンが血管内皮細胞中でEgr-1 mRNAタンパク質および結合
活性を増加させることを示している。

【００８１】 本発明者らは最近、Egr-1 mRNA中の翻訳開始部位を標的とするホスホロチオエ
ートをベースとしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発した(Santiagoら, 1
999c)。それらのオリゴヌクレオチドは非特異的な生物活性に関与するホスホロ
チオエートGカルテット配列を欠いている(Stein, 1997)。ウエスタンブロット分
析では増殖を停止した内皮細胞をあらかじめ0.8μMのアンチセンスEgr-1オリゴ
ヌクレオチド(AS2)とインキュベートしておくと、インスリンで誘導されるEgr-1
タンパク質の合成を、同じ量のタンパク質をローディングしたにもかかわらず、
阻害することが明らかにされた。同一濃度のAS2Cに対してその細胞を曝露した後
には、インスリン誘導性Egr-1タンパク質の減弱が起こらないことは、アンチセ
ンスEgr-1オリゴヌクレオチドに配列特異的な阻害効果があることを示している
。

【００８２】Egr-1 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される内 皮細胞でのDNA合成をインスリンは刺激する これらのオリゴヌクレオチド、そ
れらはEgr-1タンパク質の誘導を減弱させるものであるが、これらをインスリン
誘導性DNA合成におけるEgr-1の関与を調べるための³H-チミジン取り込みアッセ
イに用いた。このアッセイはトリクロロ酢酸(TCA)によって沈殿させることので
きるDNAへの³H-チミジンの取り込みを評価する(Khachigianら, 1992)。最初の実
験ではインスリン(100nM)に曝露された増殖停止内皮細胞では、DNA合成の程度が
100%増加したが、一方、500nMインスリンではDNA合成において200%の増加が生じ
た(図2A)。

【００８３】 次いで、本発明者らはインスリン誘導性内皮細胞DNA合成に対するAS2およびAS
2Cの影響を調べた。インスリンの添加がなければ、AS2(0.8μM)は、低濃度の血
清(0.25%, v/v)によって促進されるベースとなる内皮細胞のDNA合成を阻害した(
図2B)。これに対して、スクランブル化した対照(0.8μM)もしくは第3のオリゴヌ
クレオチドE3(0.8μM)(Egr-1 mRNAの別の領域に対してサイズを一致させたホス
ホロチオエート(Santiagoら, 1999c))はベースとなるDNA合成にほとんど影響を
及ぼさなかった(図2B)。さらに、AS2CおよびE3とは異なり、AS2はインスリン(50
0nMおよび1000nM)で誘導可能なDNA合成を有意に阻害した(図2B)。濃度依存的DNA
合成阻害を示すために、本発明者らはその内皮細胞を0.4μMおよび0.8μMのEgr-
1オリゴヌクレオチドとインキュベートした。このより低濃度のAS2による³H-チ
ミジンの取り込みの阻害はその効果がより低く(AS2Cに比較すると)、このことは
アンチセンスEgr-1オリゴヌクレオチドによる阻害が用量依存的で、かつ配列特
異的であることを示している(図2C)。従ってこれらの知見は、インスリンによっ
て誘導可能な内皮細胞のDNA合成においてEgr-1タンパク質の必要性を示している
。

【００８４】インスリンによって刺激される内皮細胞におけるDNA合成はPD98059およびワート マニンによって阻害されるがSB202190では阻害されない 誘導性Egr-1転写は細
胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)の活性によって制御され(Santiagoら, 1999b)、
このキナーゼはEgr-1プロモーター中の血清応答エレメントにおける因子をリン
酸化する(Gashlerら, 1995)。血管内皮細胞のインスリン誘導性増殖を介在する
シグナル伝達経路についてはほとんど知られていないため、本発明者らは特異的
MEK/ERK阻害剤であるPD98059を用いてこのプロセスにおけるMEK/ERKの関与を調
べた。この化合物は(10および30μMの濃度で)インスリン誘導性DNA合成を用量依
存的に阻害した(図3)。同様に、ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ阻害剤
でc-Jun N末端キナーゼ(JNK)(Ishizukaら, 1999; Dayら, 1999; Kumaharaら, 19
99)、ERK(Barryら, 1999)およびp38キナーゼ(Barryら, 1999)をも阻害するワー
トマニン(0.3および1μM)もDNA合成を用量依存的に阻害した(図3)。これに対し
て、p38キナーゼの特異的阻害剤であるSB202190(100および500nM)はDNA合成に影
響を及ぼさなかった(図3)。これらの知見はMEK/ERKの、およびおそらくはJNKの
、インスリン誘導性内皮細胞増殖における非常に重要な役割ならびにこのプロセ
スにp38キナーゼが関与していないことを示している。

【００８５】in vitroでの機械的損傷後の内皮細胞の再生を、インスリンはEgr-1依存的に刺
激する 培養物中の機械的に損傷を受けた血管内皮(および平滑筋)細胞は、創傷
の辺縁部における移動と増殖をもたらし、最終的には剥皮した領域の再被覆をも
たらす。本発明者らはインスリンが機械的損傷に対するこの細胞性応答を加速す
るのではないかとの仮説を立てた。増殖を静止させた(0.25%血清中で48時間イン
キュベートすることによって行われた)内皮細胞の単層を素早く掻き取ると明確
な創傷の辺縁が得られた(データはここには示していない)。その培養物を引き続
き、低濃度の血清を含有する培地中でさらに3日間インキュベートすると、剥皮
領域に弱い再生がもたらされるが、最適量の血清(10%)の存在下では再生は活発
であった。損傷を受けた時点でインスリン(500nM)を増殖静止培養物に添加する
と、剥皮領域における細胞数は有意に増加したが、予測に反してそれは10%の血
清の対照よりも効果的ではなかった。

【００８６】 損傷後にインスリンによって増強される内皮の再生におけるEgr-1の関与を調
べるために、本発明者らはその培養物を掻き取りの前、ならびに損傷とインスリ
ン添加時に再度、アンチセンスEgr-1オリゴヌクレオチドとともにインキュベー
トした。AS2(0.8μM)はインスリンによって刺激される内皮の再生を有意に阻害
した。これに対して、AS2C(0.8μM)の存在下での再生は、オリゴヌクレオチドを
用いなかった場合の培養物と有意な差異はなかった。同様な知見はAS2およびAS2
Cのより高い濃度(1.2μM)を用いた場合にも認められた。このように、インスリ
ンによって刺激される、損傷後の内皮の再生はEgr-1依存的に進行する。これら
の観察を図4に数量化している。

【００８７】 これらの結果はインスリンで誘導される、損傷後の増殖および再生はEgr-1の
活性化に高度に依存しているプロセスであることを示している。ノーザンブロッ
ト、RT-PCR、およびウエスタンイムノブロット分析ではインスリンがEgr-1 mRNA
およびタンパク質の発現を誘導することが示されている。インスリンで誘導され
るEgr-1タンパク質の合成を、配列特異的でかつ用量依存的にブロックするアン
チセンスオリゴヌクレオチドは、機械的損傷後の増殖および再生をも阻害する。
Egr-1を特異的に標的とする核酸を用いたこれらの所見は、この転写因子が内皮
の増殖に機能的に関与していることを示している。

【００８８】 インスリンのシグナル伝達には多数の前初期遺伝子および転写因子の活性化が
関与している。そのようなものとしては、c-fos(Mohnら, 1990; Jhunら, 1995;
Haradaら, 1995)、c-jun(Mohnら, 1990)、核因子-κB(nuclear factor-κB)(Ber
trandら, 1998)、SOCS3(Emanuelliら, 2000)、およびフォークヘッド転写因子FK
HR(Nakaeら, 1999)が含まれる。インスリンはメサンギウム細胞(Solowら, 1999)
、線維芽細胞(Jhunら, 1995)、脂肪細胞(Alexander-Bridgesら, 1992)、および
チャイニーズハムスター卵巣細胞中(Haradaら, 1996)でのEgr-1の発現をも誘導
する。この研究は血管内皮細胞においてインスリンによるEgr-1の誘導について
の最初の報告である。

【００８９】 インスリンはMAPキナーゼスーパーファミリー内の、ERK、JNK、およびp38キナ
ーゼを含むいくつかのサブクラスを活性化する(Guoら, 1998)。本発明者らの知
見は、MEKと結合しRafによるリン酸化を妨害する特異的ERK阻害剤であるPD98059
が、インスリン誘導性内皮細胞増殖を阻害することを示している。Egr-1の転写
はそれ自体、Egr-1プロモーター中の血清応答エレメント(SRE)での三成分複合因
子(Elk-1など)の活性化を介するERKのリン酸化活性に依存している。Egr-1プロ
モーターには6個のSREがあるが、c-fosプロモーターには1個のみである(Gashler
ら, 1995)。PD98059はインスリン誘導性Elk-1転写活性を血管細胞中のc-fos SRE
でブロックする(Xiら, 1997)。これらの既に公表されている知見は本明細書で示
したインスリン誘導性増殖におけるEgr-1の関与と一致している。

【００９０】 インスリンとは無関係に内皮の増殖がEgr-1依存的プロセスであることの証拠
を提示するために、本発明者らはヒト微小血管内皮細胞(HMEC-1)を、2種のDNA
エンザイム(DzAおよびDzF)(それぞれはヒトEGR-1 mRNAの異なる部位を標的とす
る)とともに別々に最終濃度0.4μMでインキュベートした。DzAおよびDzFは双方
とも5%の血清の存在下でHMEC-1複製(総細胞計数)を阻害した (図5)。これに対し
て、DzFscrは同じ濃度で増殖をモジュレートすることができなかった(図5)。DzF
scrはDzFと同じ活性のある15ntの触媒性ドメインを有し、ネット(net)の電荷も
同じであるが、スクランブル化されたハイブリダイズするアームを有している。
別の内皮細胞型を用いて得られたこれらのデータはヒトEGR-1を標的とする配列
特異的ストラテジーを用いて内皮増殖が阻害されることを示している。

【００９１】 最後に、本発明者らはCMVが介在するアンチセンスEgr-1 mRNAの過剰発現が内
皮細胞および平滑筋細胞の双方の増殖を阻害することを見出した。内皮細胞およ
び平滑筋細胞のpcDNA3-A/SEgr-1トランスフェクタントの双方の複製はバックボ
ーンベクターであるpcDNA3単独でトランスフェクトしたものの複製より有意に低
かった(データはここには示していない)。これらの知見は、アンチセンスEGR mR
NAストラテジーは動脈内皮細胞および少なくとも1種のその他の血管細胞型の増
殖を阻害することができることを示している。

【００９２】 腫瘍形成の臨床管理のために多数の化学療法剤が入手可能で臨床使用されては
いるが、西洋では固形腫瘍は依然として主な死因となっている。そのような腫瘍
を治療するために現在用いられている薬剤は、一般的には非腫瘍性組織に対して
も毒性を示しうる、非特異的な毒物であり、効力を示すには大きな投与量を必要
とする。腫瘍成長の基礎をなす細胞および分子機構が、単に腫瘍細胞増殖および
移動のみならず、その他のことにも関与していることを示す証拠が増えつつある
。さらに重要なことには、腫瘍成長および転移は進行しつつある血管形成、すな
わち新たな血管が形成されるプロセスに高度に依存している(Crystalら, 1999)
。本発明での知見は、Egr-1が血管内皮細胞の複製と移動にきわめて重要である
ことを示しているものだが、この転写因子が血管形成と腫瘍形成において重要な
調節因子として関係していることを強く示している。

【００９３】実施例2 ラットEgr-1(NGFI-A)を標的とするDNAザイムの特性決定 材料と方法 ODN合成 DNAザイムは商業的に合成されたもので(Oligos Etc.,Inc.)、それには
特に断らない限りは3'の位置に逆位にあるTを有する。開裂反応における基質は
そのような修飾をすることなく合成した。特記した場合にはODNは5'末端をγ³²P
-dATPおよびT4 ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)で標識した。
取り込まれなかった標識物はChromaspin-10 カラム(Clontech)で遠心することに
よって放射標識された分子種から分離した。

【００９４】in vitroでの転写および開裂実験 ³²P-標識した、206ntのNGFI-A RNA転写産物
をあらかじめBgI IIで切断したプラスミド構築物pJDM8(Milbrandt, 1987に報告
されているが、この文献内容の全体を本明細書に参照により組み入れることとす
る)のin vitroでの転写(T3 ポリメラーゼ)によって調製した。反応は総容量20μ
Lで行ったが、特に断らない限りはその総容量は10mM MgCl₂、5mM Tris pH7.5、1
50mM NaCl、4.8ピコモルのin vitroで転写させた、もしくは合成のRNA 基質、お
よび60ピコモルのDNAザイム(基質：DNAザイムの比は1:12.5)を含有している。反
応は37℃で示された時間行い、アリコートをホルムアミドローディングバッファ
ーを含有している試験管に移すことによって停止した(Sambrookら, 1989)。12%
の変性ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを泳動させ、−80℃で一晩オートラ
ジオグラフィーを行った。

【００９５】培養条件およびDNAザイムトランスフェクション 一次性ラット大動脈SMCはCell
Applications, Inc.から入手し、10% ウシ胎児血清(FBS)、50μg/mLのストレプ
トマイシン、および50 IU/mLのペニシリンを含有するWaymouth培地pH7.4中で37
℃で5%CO₂の湿潤雰囲気で増殖させた。SMCは継代3〜7の間のものを実験に用いた
。ラットの仔のSMC(WKY12-22(Lemireら, 1994中に記載されており、この文献の
全体を本明細書中に参照により組み入れることとする))を同様の条件下で増殖さ
せた。サブコンフルエント(60〜70%)なSMCを、無血清培地(SFM)中で6時間インキ
ュベートした後、Superfect(Qiagen)を製造者の使用説明書に従って用いてDNAザ
イム(もしくは特に記した場合にはアンチセンスODN)(0.1μM)をトランスフェク
トした。18時間後、その細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4で洗った後、5%
FBS中で2回目のトランスフェクションを行った。

【００９６】ノーザンブロット分析 総RNAをTRIzol試薬(Life Technologies)を用いて単離し
、25μgを電気泳動で分離した後、Hybond-N＋膜(NEN-DuPont)に転写した。プレ
ハイブリダイゼーション、α³²P-dCTP標識Egr-1もしくはβ-アクチンcDNAを用い
るハイブリダイゼーション、および洗浄は本質的には既に報告されているとおり
(Khachigianら, 1995)行った。

【００９７】ウエスタンブロット分析 100mmのプレート(Nunc-InterMed)中の増殖を静止させ
たSMCを、上述のとおりED5もしくはED5SCRを用いてトランスフェクトし、5%FBS
とともに1時間インキュベートした。その細胞を冷PBS, pH7.4で洗い、150mM NaC
l、50mM Tris-HCl, pH7.5、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、1% Tri
ton X-100、5mM EDTA、1% トラジロール、10μg/mLロイペプチン、1% アプロチ
ニン、および2mM PMSF中で抽出した。タンパク質を24μgのサンプルを10%の変性
SDS-ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、PVDFナイロン膜(NEN-DuPont)
の上にエレクトロブロットした。膜を風乾した後、無脂肪スキムミルク粉末を含
む0.05%(w/v) Tween 20含有のPBS中でブロッキングした。膜をEgr-1もしくはSp1
に対するウサギ抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)(1:1000)とインキュベー
トし、次いでHRPを連結させたマウス抗ウサギIg二次抗血清(1:2000)とインキュ
ベートした。マウスモノクローナルc-Fos(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)を
用いた場合には、検出はHRPを連結したウサギ抗マウスIgを用いて行った。タン
パク質は化学発光検出法(NEN-DuPont)で可視化した。

【００９８】細胞増殖のアッセイ 96ウエルのタイタープレート(Nunc-InterMed)中の増殖を
静止させたSMCを上述のとおりED5もしくはED5SCRを用いてトランスフェクトし、
次いで5% FBSに37℃で72時間曝露した。その細胞をPBS, pH7.4ですすぎ、トリプ
シン処理し、上清を自動コールターカウンターを用いて計数した。

【００９９】DNAザイムの安定性の評価 DNAザイムは5'末端をγ³²P-dATPで標識し遊離の標識
物とは遠心で分離した。放射性標識DNAザイムを5% FBS中、もしくは無血清培地
中で37℃で、示された時間、インキュベートした。反応物のアリコートをホルム
アミドローディングバッファーを含有している試験管に移すことによって停止し
た(Sambrookら, 1989)。サンプルを12%の変性ポリアクリルアミドゲルにアプラ
イし、−80℃で一晩オートラジオグラフィーを行った。

【０１００】SMC 創傷アッセイ チャンバースライド(Nunc-InterMed)中にコンフルエントな
増殖を静止させたSMCを、ED5もしくはED5SCRに18時間曝露した後に、滅菌済の楊
枝で1回掻き取った。損傷を与える前に細胞をマイトマイシンC(Sigma)(20μM)で
2時間処理した(Pitschら, 1996; HorodyskiとPowell, 1996)。損傷の72時間後に
、細胞をPBS, pH7.4で洗い、ホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン-エオ
シンで染色した。

【０１０１】ラット動脈結紮モデルと分析 成体の雄で体重が300〜350gのSprague Dawleyラ
ットをケタミン(60mg/kg、腹腔内)およびキシラジン(8mg/kg、腹腔内)で麻酔し
た。右総頸動脈を頸動脈分岐まで正中線頸部切開で露出させた。サイズ6/0で非
吸収性の縫合糸で総頸動脈の頸動脈分岐の近位で縛り、血流が遠位で停止するよ
うにした。500μgのDNAザイム(DEPC処理した水中)、1mM MgCl₂、30μLのトラン
スフェクト剤(Fugene6)、およびPluronicゲルP127(BASF)を含有する4℃の溶液20
0μLを、各群5匹のラットの血管の周囲にアプライし、結紮部から12〜15mm近位
側に伸展させた。これらの薬剤は37℃でゲルの固化を阻害しなかった。3日後、5
00μgのDNAザイムを含有している、もしくは含有していないビヒクルを再度投与
した。動物を結紮後18日目にフェノバルビトンの致死量を注射することで屠殺し
、120mmHgで灌流する10%(v/v)ホルムアルデヒドを用いて灌流固定した。次いで
双方の頸動脈を摘出し、10%ホルムアルデヒド中に置き、2mmの長さに切断し3%(w
/v)寒天中に包埋した後、パラフィンで固定した。5μmの切片を血管に沿って結
紮個所から250μm間隔で調製し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。ラット
1匹あたり、5つの連続した切片の新生内膜および内側の領域をカスタマイズした
ソフトウエアパッケージ(Magellan)(HalaszとMartin, 1984)を用いてデジタルで
測定し、1群5匹のラットの1群あたりの平均の比で表した。

【０１０２】結果と考察 元のDNAザイムの設計(SantoroとJoyce, 1997)において15ntのDNAザイム触媒性
ドメインに隣接する7x7 ntアームを、特異性を改善するために1アームあたり2nt
伸長した(L.Q.Sun, データはここに示していない)(図6)。この分子の3'末端を逆
位の3'-3'-連結チミジン(T)でキャップして3'->5'エキソヌクレアーゼ消化に対
する抵抗性を持たせた。ED5の双方のアームの配列を触媒性ドメインを変えるこ
となくスクランブル化して(SCR)、DNAザイムED5SCRを作製した(図6)。

【０１０３】 23ntを含んでいる合成RNA基質、これはNGFI-A mRNAのnt 805から827と一致す
るものであるが(図6)、この基質を用いてED5が標的RNAを開裂させる能力がある
か否かを決定した。ED5は³²P-5'-末端標識23-merを10分以内に開裂した(データ
はここに示していない)。12-mer産物はA(816)-U(817)ジャンクションとこの基質
の5'末端との間の長さに対応している(図6)。これに対して、ED5SCRはこの合成
基質に対する効果は認められなかった。ED5による特異的触媒作用はこのDNAザイ
ムのヒト等価物(hED5)がラットの基質を広範囲の化学量論的比率にわたっても開
裂させることができないことによってさらに示された(データはここに示してい
ない)。同様の結果はED5SCRを用いても得られた(データはここに示していない)
。hED5はラットのED5配列とはそのハイブリダイズするアームで18nt中3個が異な
る(表２)。次いでin vitroでの転写によって調製した天然のNGFI-A mRNAの³²P-
標識206nt断片に対してのED5の触媒効果を調べた。その開裂反応では163ntおよ
び43ntの長さの2つの放射標識分子種が産生され、これはDNAザイムのA(816)-U(8
17)ジャンクションでの開裂と一致する。別の実験ではED5は1960ntの長さの³²P
標識NGFI-A転写産物をも特異的でかつ時間依存的に開裂した(データはここには
示していない)。

【０１０４】 表2. mRNA中のDNAザイム標的部位 ED5もしくはhED5の18ntアームとラットNGFI-AもしくはヒトEGR-1(多数の転写
因子の中でも)のmRNAとの間の類似性を百分率で示している。NGFI-A mRNA中のED
5の標的配列は、5'-807-A CGU CCG GGA UGG CAG CGG-825-3'(配列番号22)(ラッ
トNGFI-A配列)で、EGR-1中のhED5の標的配列は5'-262-U CGU CCA GGA UGG CCG C
GG-280-3'(配列番号23)(ヒトEGR-1配列)である。下線を付したヌクレオチドはラ
ットとヒトの配列間のミスマッチを示している。データはGenbankおよびEMBLの
配列を用いたANGISのgap best fit検索で得られた。Sp1およびc-Fosのラットの
配列は報告されていない。

【０１０５】 遺伝子 受託番号 18ntを超える最良の相同性 (%) ED5 hED5 ラット NGFI-A M18416 100 84.2 ヒト EGR-1 X52541 84.2 100 マウス Sp1 AF022363 66.7 66.7 ヒト c-Fos K00650 66.7 66.7 マウス c-Fos X06769 61.1 66.7 ヒト Sp1 AF044026 38.9 28.9 内在性のNGFI-A mRNAのレベルに対するDNAザイムの影響を調べるために、増殖
を静止させたSMCをED5に曝露した後、血清で刺激した。ノーザンブロットおよび
デンシトメトリー分析では、ED5(1μM)が血清で誘導される定常状態のNGFI-A mR
NAのレベルを55%阻害するが(データはここには示していない)、ED5SCRでは影響
がない(データはここには示していない)ことが明らかとなった。ED5のNGFI-A合
成をタンパク質のレベルで阻害する能力をウエスタンブロット分析で評価した。
NGFI-A タンパク質の血清での誘導はED5によって抑制された。これに対して、ED
5SCRおよびEDC、これはED5およびED5SCRと同一の触媒ドメインを持っているがナ
ンセンスアームの近傍にあるDNAザイムだが、これらは双方ともNGFI-Aの誘導に
全く影響を及ぼさなかった(図7)。ED5は構成的に発現された、構造的に関連のあ
る亜鉛フィンガータンパク質であるSp1のレベルに影響を与えなかった(図7)。ED
5はまた、血清で誘導しうる前初期遺伝子産物であるc-Fosをブロックすることも
できなかったが(図7)、このc-FOSはその産生が、NGFI-Aと同様に、そのプロモー
ター中の血清応答エレメント、および 細胞外シグナルによって調節されるキナ
ーゼ(extracellular-signal regulated kinase)でメディエートされるリン酸化
に依存しているものである(Treisman, 1990, 1994, および1995; GashlerとSukh
atme, 1995)。これらの知見は、併せて考慮すると、ED5のNGFI-A mRNAおよびタ
ンパク質の遺伝子特異的で配列特異的な方法での産生阻害能を示しており、これ
はNGFI-A mRNAの標的部位とその他のmRNAとの間に顕著な相同性がないことと一
致している(表2)。

【０１０６】 次いでSMC複製に対するED5の影響を調べた。増殖を静止させたSMCをDNAザイム
とインキュベートした後、血清に曝露し、3日後に細胞数を調べた。ED5(0.1μM)
は血清によって刺激されるSMC増殖を70%阻害した(図8a)。これに対して、ED5SCR
はSMC増殖に影響を及ぼさなかった(図8a)。アンチセンスNGFI-A ODNであるAS2は
1μMではSMCの増殖を阻害することができたが、それより低い濃度では増殖を阻
害し得なかった(図8a)。追加の実験では、ED5が血清で誘導しうる^３H-チミジン
のDNA中への取り込みをブロックすることも明らかとなった(データはここには示
していない)。ED5の阻害作用は、形態学的には変化が認められず、血清の存在下
でトリパンブルーを取り込んでいる細胞の比率がどちらのDNAザイムでも影響を
受けなかったので(図8b)、細胞死の結果ではなかった。

【０１０７】 2週令のラット(WKY12-22)の大動脈由来の培養SMCは形態学的におよび表現型の
点から見て、バルーンで損傷させたラット動脈の新生内膜由来のSMCと類似して
いる(Seifertら, 1984; Majeskyら, 1992)。WKY12-22細胞および新生内膜細胞の
双方の上皮様の外観は、正常で静止している培地から由来したSMCの引き延ばさ
れた、二極性(Majeskyら, 1988)とは対照的である。WKY12-22細胞は内側のSMCよ
り迅速に増殖し非常に多数の増殖調節分子(Lemireら, 1994)、例えばNGFI-A(Raf
tyとKhachigian, 1998)などを過剰発現するが、このことは「合成」表現型と一
致するものである(Majeskyら, 1992; CampbellとCampbell, 1985)。ED5は血清で
誘導しうるWKY12-22増殖を約75%減弱させる(図8c)。ED5SCRは阻害作用を持たず
、驚くべきことに増殖を刺激しているように思われる(図8c)。トリパンブルーで
の排除試験を行うとDNAザイムの阻害が細胞傷害性の結果ではないことが明らか
となった(データはここには示していない)。

【０１０８】 ED5とED5SCRとの生物学的効果の相異が細胞内局在の違いの結果ではないこと
を確認するために、この2種のDNAザイムを蛍光性イソチオシアナート(FITC)で5'
末端を標識し、SMCとインキュベートした。蛍光顕微鏡観察でFITC-ED5およびFIT
C-ED5SCRの双方とも主として核内に局在していることが明らかとなった。この細
胞性コンパートメント内の点状の蛍光はDNAザイムの配列とは無関係であった。
蛍光は細胞質にもより弱いものの認められた。DNAザイムに曝露されなかった培
養物は自己蛍光を示さなかった。

【０１０９】 2種の分子の双方をγ^３２P-dATPで5'末端を標識し、培地中でインキュベート
してED5およびED5SCRの細胞性の応答がDNAザイムの安定性の相異の結果によるも
のか否かを確認した。^３２P-ED5および32P-ED5SCRは双方とも48時間後において
もそのままであった(データはここには示していない)。逆向きのTを3'末端に有
する^３２P-ED5に対して、正しい向きのTを3'末端に有する^３２P-ED5の分解は1時
間目に早くも観察された。無血清培地への曝露では48時間後においてもこの分子
の分解は見られなかった(データはここには示していない)。これらの知見は、DN
Aザイムの3'の塩基を逆向きにすることで血清中の成分による核酸分解性の（nuc
leolytic）開裂からこの分子が保護されることを示している。

【０１１０】 培養液中のSMCがうけた物理的外傷により、創傷の辺縁部から外側への移動が
生じ、また、剥皮した領域で増殖が起こる。我々は、増殖を静止させたSMCをDNA
ザイムもしくは増殖の阻害剤であるマイトマイシンC(Pitschら, 1996; Horodysk
iとPowell, 1996)のいずれかに曝露してから掻き取り、ED5がこの損傷に対する
応答を修飾しうるか調べた。DNAザイムの入っていない培養物は、剥皮した領域
全体を3日以内に再増殖させた。ED5はこの損傷に対する修復的応答を阻害し、6
日後においてもこの領域でさらに増殖が起こることを防止した(データはここに
は示していない)。また、ED5SCRがこの系で効果がないことは、ED5による配列特
異的阻害を示している。

【０１１１】 新生内膜形成へのED5の影響をラットモデルで調べた。右総頸動脈を頸動脈分
岐の近位で完全に結紮すると、SMCが中央から内膜へと移動し、それによって最
終的に増殖が新生内膜の形成を導く(KumarとLindner, 1997; Bhawanら, 1977; B
uck, 1961)。結紮の18日後の内膜の肥厚はED5によって50%阻害された(図9)。こ
れに対して、ED5のスクランブル化した対応物(図9)および対照としたヴィークル
(図9)はいずれも新生内膜形成に影響を及ぼさなかった。これらの知見はED5の血
管腔へのSMCの蓄積を特異的な方法で抑制する能力があることを示し、阻害が単
に「塊効果（mass effect）」の結果であるとする説(Kitzeら, 1998; Tharlowら
, 1996)に反するものである。ED5によって誘導しうるNGFI-Aタンパク質発現の配
列特異的な阻害および内膜の肥厚は、ラットの頸動脈バルーン損傷モデルでも観
察された(Santiagoら, 1999a)。

【０１１２】 さらに実験を行ったところ、hED5のEGR-1 RNA(ヒト)を開裂させる能力が明ら
かとなった。hED5はその基質を広範な化学量論的比率で用量依存性に開裂させた
。hED5は時間依存性で開裂させたのに対し、ED5のスクランブル化した対応物で
あるhED5SCRはそのような触媒特性を有していなかった(データはここには示して
いない)。

【０１１３】 本明細書で報告したアンチセンスEGR-1の特異的な、増殖阻害性を用いる方策
は、EGR-1阻害剤が、不適切なSMC増殖、内皮の増殖、及び腫瘍増殖が関与してい
る血管疾患の治療において治療用のツールとして有用であることを示唆している
。

【０１１４】 実施例３ 悪性細胞の増殖を阻害するためのDNAザイムの利用 材料及び方法 HepG2細胞は、抗生物質を補充した10%の胎児ウシ血清を含むpH7.4のDMEM中に
てルーチン的に増殖させた。この細胞をトリプシン化してから増殖培地に再懸濁
(10,000cells/200μlにする)し、続いて200μlを滅菌した96ウェルタイタープレ
ートに移した。続く二日後、180μlの培養上清を取り除いて細胞をPBS、pH7.4で
洗浄し、180μlの血清を含まない培地に再植え付けした。6時間後にDNAザイム（
2μg/200μl, 0.75μM）の最初のトランスフェクションを、1:3(μg:μl)の比率
でFuGENE6を用いる無血清培地を入れたチューブ内で行った。15分間室温でイン
キュベートした後、180μlの培養上清を180μlのトランスフェクション混合物と
置き換えた。24時間後、その180μlの上清を、180μlの新しい、ただしこの時点
では5%のPBS培地に入れたトランスフェクション混合物と置き換えた。3日後この
細胞をPBS、pH7.4で洗浄し、100μlのトリプシン-EDTA中でトリプシン化して再
懸濁した。その細胞を約5分間振盪させることによって、その細胞を懸濁液中で
安定なものにした。この全懸濁液を10mlのアイソトン(Isoton)IIに入れた。チュ
ーブからウェルにアイソトンII溶液を数回にわたってピペットで移すことにより
全ての細胞が確実に移された。アイソトンIIのみを用いることで、バックグラウ
ンドの細胞数を測定した。各サンプルは3回計数して平均の数とそれぞれの平均
の標準誤差とを計算するために用いた。

【０１１５】 結果及び考察 我々の結果は、血清が3日後にはHepG2細胞の増殖を刺激したことを示している
(図10)。増殖は、0.75μMのDzA(5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(配列番
号３)、大文字が触媒部位である)、DNAザイム標的ヒトEGR-1 mRNA(アームはnts
189-207にハイブリダイズしている)によってほとんど完全に抑えられた(図10)。
対照的に、HepG2細胞の増殖は、ED5SCRによっては阻害されなかった(図10)。ウ
ェスタンブロット分析は、DzAはHepG2細胞におけるEGR-1の発現を強く阻害した
が、これに対して、異なる配列(5'-tcagctgcaGGCTAGCTACAACGActcggcctt)(配列
番号２４)を持つ、大きさが同じDNAザイムには効果がなかった(データは示され
ていない)ことを示した。これらのデータは、このモデルのヒト悪性細胞系の誘
導性増殖がEGR-1 DNAザイムによって遮断されうることを示している。これらの
発見は、EGR阻害剤が、ヒトの癌を標的とする治療方法で臨床的に利用できる可
能性を示唆している。

【０１１６】 広範に記載されている本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく、特定の態
様で示されているように本発明に多数の変更及び/又は修正をなすことができる
ことを当業者なら理解するであろう。これらの態様はしたがって、全ての点にお
いて例示的であって、限定的ではないと考えるべきである。この出願を通し、種
々の刊行物が引用されている。これらの刊行物の開示は、この発明が属する技術
分野の段階をより充分に記述するため、参照により本明細書組み入れる。

【０１１７】 参照文献 Alexander-Bridges, M., Buggs, C., Giere, L., Denaro, M., Kahn, B., White
, M., Sukhatme, V. & Nasrin, N. 「代謝及び増殖応答性遺伝子に対するインシ
ュリンの作用モデル」(Models of insulin action on metabolic and growth re
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微粒子内のアラキドン酸は、プロテインキナーゼC/マイトジェン活性化プロテイ
ンキナーゼ依存性経路を経るシクロオキシゲナーゼ-2-依存性プロスタグランジ
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細胞におけるインシュリン誘導性egr-1及びc-fos発現は、インシュリン受容体、
Shu及びマイトジェン-活性化プロテインキナーゼを必要とするが、インシュリン
受容体基質-1及びホスファチジルイノシトール3-キナーゼ活性化は必須でない」
(Insulin-induced egr-1 and c-fos expression in 32D cells requires insuli
n receptor, Shc, and mitogen-activated protein kinase, but not insulin r
eceptor substrate-1 and phosphatidylinositol 3-kinase activation.) J. Bi
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性マスト細胞においてホスファチジルイノシトール3-キナーゼとカルシネウリン
によって特異に調節される」(Mitogen-activated protein kinase activation t
hrough Fc epsilon receptor I and stem cell factor receptor is differenti
ally regulated by phosphatidylinostol 3-kinase and calcineurin in mouse
bone marrow-derived mast cells.) J. Immunol. 162: 2087-2094 (1999). Jhun, B. H., Haruta, T., MeinKoth, J. L., Leitner, J. W., Draznin, B., S
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た腫瘍の増殖を阻害し、宿主の生存性を延長させる」(Norcantharidin inhibits
growth of human HepG2 cell-transplanted tumour in nude mice and prolong
s host survival.) Cancer Letters 117, 93-98.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 インスリンは血管内皮細胞中でEgr-1依存性遺伝子発現を刺激する。FuGENE6を
用いてpEBS1¹foscatであらかじめトランスフェクトした、成長阻害ウシ大動脈内
皮細胞を、前述のD-グルコース（5〜30 mM）、インスリン（100 nM）またはFGF-
2（25 ng/ml）とともに、細胞溶解物の調製前に24時間にわたり、インキュベー
トした。CAT活性を溶解液中のタンパク質の濃度に対して標準化した。

【図２】 大動脈内皮細胞内のインスリン誘導性DNA合成はEgr-1を標的とするアンチセン
スオリゴヌクレオチドによって妨害される。Ａ，インスリンはDNA合成を刺激す
る。成長阻害内皮細胞を、6時間にわたる³H-チミジンパルスの前に18時間かけて
、インスリン（100 nMもしくは500 nM）またはFBS（2.5％）とともに、インキュ
ベートした。Ｂ，アンチセンスEgr-1オリゴヌクレオチドはインスリン誘導性DNA
合成を抑制する。内皮細胞を、18時間のインスリン（500 nMもしくは1000 nM）
への曝露および6時間の³H-チミジンパルスの前に、0.8μMのAS2、AS2CもしくはE
3のいずれかとともに、インキュベートした。Ｃ，インスリン誘導性DNA合成の用
量依存的抑制、インスリン（500 nM）によって刺激されるDNA合成を、0.4μMま
たは0.8μMのAS2またはAS2Cとともにインキュベートした内皮細胞中で評価した
。βシンチレーションカウンターを使用して、DNA中へのTCA沈降性の³Hチミジン
取り込みを評価した。

【図３】 培養した大動脈内皮細胞中でのインスリン誘導性DNA合成はMEK/ERK依存性であ
る。成長休止期の内皮細胞を、インスリン（500 nM）の18時間にわたる添加およ
び³H-チミジンパルスの前に、PD98059（10μMもしくは30μM）、SB202190（100
nMもしくは500 nM）またはウォルトマンニン（300 nMもしくは1000 nM）のいず
れかとともに、2時間プレインキュベートした。βシンチレーションカウンター
を使用して、DNA中へのTCA沈降性の³Hチミジン取り込みを評価した。

【図４】 内皮の損傷後の創傷修復はインスリンによってEgr-1依存的様式で強化される
。各種グループ中の損傷後の表皮が剥がれたゾーン3d内の細胞集団を定量し、ヒ
ストダイアグラムによって示した。

【図５】 ヒト微小血管内皮細胞の増殖はヒトEGR-1を標的とするDNA酵素によって抑制さ
れる。EGF（10 ng/ml）およびヒドロコルチゾン（1μg/ml）を補充し、10％FBS
を含むMCDB 131培地中で、SV40で形質転換したHMEC-1細胞を増殖させた。補充物
を加えない無血清培地中でのインキュベーションの48時間後に、細胞を前述のDN
A酵素（0.4μM）でトランスフェクトし、培地を交換して10％血清を添加し、そ
の72時間後に再びトランスフェクトした。血清の添加の24時間後、Coulterカウ
ンターによって細胞を定量した。

【図６】 NGFI-A DNAザイム（ED5）、そのスクランブル(scramble)対照（ED5SCR）およ
び23 ntの合成ラット基質の配列を示す。翻訳開始部位に下線を付けている。

【図７】 NGFI-A DNAザイムは血清（FBS）によるNGFI-Aタンパク質の誘導を抑制する。N
GFI-A、Sp1またはc-Fosに対する抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を実
施した。クーマシーブルーで染色したゲルは、レーン毎に均一量のタンパク質が
ロードされたことを示している。EDCの配列は5'-CGC CAT TAG GCT AGC TAC AAC
GAC CTA GTG AT-3'（配列番号１）であり、3'のTが逆位になっている。SFMは無
血清培地を表す。

【図８】 SMC増殖はNGFI-A DNAザイムによって抑制される。ａ，Coulterカウンターによ
る総計細胞数の評価。血清および／またはDNAザイムに3日間曝露した成長阻害SM
Cをトリプシン化し、その後懸濁物を定量した。AS2の配列は5'-CTT GGC CGC TGC
CAT -3'（配列番号２）である。ｂ，血清および／またはDNAザイムへの曝露後
にトリパンブルーを取り込む細胞の割合。0.2％（w:v）トリパンブルー中、22℃
で5分間、細胞を染色インキュベートし、その後ブラインド法で血球計で定量し
た。ｃ，pup SMCの増殖に対するED5の影響。血清および／またはDNAザイムに3日
間曝露した成長阻害WKY12-22細胞を再懸濁し、Coulterカウンターによって数を
定量した。データは、2つの独立した実験を３回ずつ行ったものを表す。図中に
平均および平均の標準偏差を示す。^*は対照（FBSのみ）に比較してP＜0.05（ス
チューデントの両側t-検定）であることを示す。

【図９】 NGFI-A DNAザイムによるラット頚動脈内の新生内膜形成の抑制。新生内膜は右
総頚動脈の永久結紮後18日目に形成された。結紮時、さらに3日後に再度、DNAザ
イム（500μg）またはビヒクル単独を外膜から適用した。新生内膜形成の配列特
異的抑制である。各ラット（１グループあたり5匹のラット）について、結紮の
位置から250μm間隔で採取した連続した5つの切片の新生内膜および内側部分を
デジタル測定し、グループ毎の比率で示した。平均および平均の標準偏差を縦軸
で示す。^*は、片側検定データとして、ウィルコクスンの順位和検定を使用し、L
ig、Lig＋VehまたはLig＋Veh＋ED5SCRのグループと比較するとP＜0.05であるこ
とを表す。Ligは結紮を示す。Vehはビヒクルを示す。

【図１０】 HepG2細胞の増殖は0.75μMのDNAザイム DzAによって抑制される。Coulterカウ
ンターによる総細胞数の評価。血清および／またはDNAザイムに3日間曝露した成
長阻害細胞をトリプシン化し、その後懸濁物を定量した。DzAの配列は5'-cagggg
acaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg（配列番号３）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 AA11 CA02 CA05 CA11 CA12 DA02 HA11 HA17 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ20 QQ53 QQ79 QR77 QS36 QX01 QX02 4B065 AA90X AB01 BA01 CA44 4C084 AA02 AA13 AA17 AA20 BA02 BA08 BA16 BA17 BA18 CA53 CA56 CA59 DC01 MA02 NA05 NA14 ZB261 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZB26

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍の治療方法であって、該治療を必要とする被験体に、EG
   Rの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬物、またはEGRの核内蓄積も
   しくは活性を低下させる薬物を投与することを含んでなる方法。
2. 【請求項２】 薬物が血管形成を抑制する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 薬物が腫瘍細胞の増殖を直接抑制する、請求項１または２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 腫瘍が固形腫瘍である、請求項１〜３のいずれか１項に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 EGRがEGR-1である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 EGRの発現を減少させる、請求項１〜５のいずれか１項に記
   載の方法。
7. 【請求項７】 EGRアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によってEGRの発
   現を減少させる、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、 (i) ACA CTT TTG TCT GCT（配列番号４）および (ii) CTT GGC CGC TGC CAT（配列番号２）、 からなる群から選択される配列を持つ、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 配列特異的リボザイムによるEGR mRNAの開裂によって、EGR
   の発現を減少させる、請求項６に記載の方法。
10. 【請求項１０】 EGR dsDNAを標的とするssDNAの使用によってEGRの発現を
    減少させるものであって、ssDNA分子がdsDNAと三重ヘリックスを形成し得るもの
    から選択される、請求項６に記載の方法。
11. 【請求項１１】 核酸転写のデコイを使用し、EGR遺伝子の転写を抑制する
    ことによって、EGRの発現を減少させる、請求項６に記載の方法。
12. 【請求項１２】 アンチセンスEGR mRNAの発現によってEGRの発現を減少さ
    せる、請求項６に記載の方法。
13. 【請求項１３】 配列特異的DNAザイムによるEGR mRNAの開裂によって、EGR
    の発現を減少させる、請求項６に記載の方法。
14. 【請求項１４】 DNAザイムが、 (i) プリン：ピリミジン開裂部位でmRNAを開裂する触媒性ドメイン； (ii) 触媒性ドメインの5'末端に隣接する第1結合ドメイン；および (iii) 触媒性ドメインの3'末端に隣接する第2結合ドメイン、 を含み、これらの結合ドメインが、配列番号１５に示すヌクレオチド168-332に
    相当するEGR mRNAの領域内のプリン：ピリミジン開裂部位に直接隣接する2つの
    領域に十分相補的であることによって、DNAザイムがEGR mRNAを開裂し得るよう
    にした、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 触媒性ドメインがヌクレオチド配列 GGCTAGCTACAACGAを持
    つ、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 開裂部位が、 (i) ヌクレオチド198-199に相当するGU部位； (ii) ヌクレオチド200-201に相当するGU部位； (iii) ヌクレオチド264-265に相当するGU部位； (iv) ヌクレオチド271-272に相当するAU部位； (v) ヌクレオチド301-302に相当するAU部位； (vi) ヌクレオチド303-304に相当するGU部位；および (vii) ヌクレオチド316-317に相当するAU部位、 からなら群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 開裂部位が、ヌクレオチド198-199に相当するGU部位、ヌ
    クレオチド271-272に相当するAU部位またはヌクレオチド301-302に相当するAU部
    位である、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 DNAザイムが、 (i) 5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg（配列番号３）； (ii) 5'-tgcaggggaGGCTAGCTACAACGAaccgttgcg（配列番号６）； (iii) 5'-catcctggaGGCTAGCTACAACGAgagcaggct（配列番号７）； (iv) 5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga（配列番号８）； (v) 5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt（配列番号９）； (vi) 5'-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat（配列番号１０）； (vii) 5'-cagcggggaGGCTAGCTACAACGAatcagctgc（配列番号１１）；および (viii)5'-ggtcagagaGGCTAGCTACAACGActgcagcgg（配列番号１２）、 からなら群から選択される配列を持つ、請求項１６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 DNAザイムが、配列：5'-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgc
    ggg（配列番号３）または5'-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat（配列番号１
    ０）を持つ、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 DNAザイムが、配列：5'-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctgga
    cga（配列番号８）または5'-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt（配列番号９
    ）を持つ、請求項１８に記載の方法。
21. 【請求項２１】 DNAザイムの3'末端ヌクレオチド残基が触媒性ドメインの3
    '末端に隣接する結合性ドメイン中で逆位になっている、請求項１３〜１９のい
    ずれか１項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 １種以上の別の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求
    項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 腫瘍細胞の成長もしくは増殖を抑制するための方法であっ
    て、EGRの誘導を抑制する薬物、EGRの発現を減少させる薬物、またはEGRの核内
    蓄積もしくは活性を低下させる薬物と腫瘍細胞を接触させることを含んでなる方
    法。
24. 【請求項２４】 (i)EGRの誘導を抑制する薬物、(ii)EGRの発現を減少させ
    る薬物、または(iii)EGRの核内蓄積もしくは活性を低下させる薬物を含むか、あ
    るいはこれらをコードする核酸分子を腫瘍細胞中に導入することによって形質転
    換させた腫瘍細胞。
25. 【請求項２５】 血管形成を抑制する薬物のスクリーニング方法であって、
    EGRの誘導の抑制、EGRの発現の減少、またはEGRの核内蓄積もしくは活性の低下
    の能力について、推定される薬物を試験することを含んでなる方法。