WO1997027309A1 - Constructions d'adn et vecteurs d'expression derives du gene de l'arn va i d'adenovirus - Google Patents

Constructions d'adn et vecteurs d'expression derives du gene de l'arn va i d'adenovirus Download PDF

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WO1997027309A1
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adenovirus
sequence
gene
recombinant
rna
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PCT/FR1997/000103
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Marc Eloit
Micheline Adam
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Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A.
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Publication date
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Definitions

  • the invention relates to DNA constructs derived from the VA I gene of adenovirus and to their use for increasing the level of expression of genes of interest.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses; their genome, the complete sequence of which is for some of them known [cf. for example CHROBOEZEK et al. Virology, 186, 280-285 (1992)], comprises approximately 36,000 bp and has at its ends repeated inverted sequences (ITR).
  • the infection of a host cell by an adenovirus comprises two phases: - an early phase during which 4 transcription units, called E1, E2, E3 and E4, are expressed and in which the replication factors are synthesized in particular viral DNA, as well as proteins regulating the expression of certain viral and cellular genes; among the genes transcribed during the early phase, particular mention will be made of the El (E1A, and E1B) genes which are located at the left end (5 ′ end) of the adenovirus genome, and which are essential for viral replication ; - a late phase, during which the late LI to L5 genes are expressed; the genes coding for the virion structural proteins are transcribed under the control of the strong promoter MLP (Major Late Promoter). Whether during the early phase or during the late phase, most of the adenovirus genome is transcribed by RNA polymerase II of the host cell.
  • E1, E2, E3 and E4 4 transcription units, called E1, E2, E3 and E4 are expressed and in which the replication factors are
  • RNA polymerase III certain genes are transcribed by RNA polymerase III: in particular, two genes (VA I and VA II), which are located in the LI region ⁇ between nucleotides 10160 and 10574 in the case of the adenovirus Ad2), are transcribed essentially during the late phase of the infection, to give rise to RNAs called VA RNA (for "Virus Associated"), which accumulate in the cell in large quantities.
  • VA RNA for "Virus Associated"
  • the promoter sequences of these genes recognized by RNA polymerase III are intragenic, and are called box A and box B respectively.
  • RNA VA I of the adenovirus Ad2 is represented in FIG. 1 [according to the publication by MA and MATHEWS J. Virol. , 67, 6605-6617 (1993)].
  • This structure includes a terminal region (nucleotides 0 to 18 forming an imperfect duplex with nucleotides 138 to 160), and an apical region (nucleotides 42 to 90, also forming a duplex structure by hairpin folding of the nucleotide chain) , which are separated by a central domain (nucleotides 19 to 41 and 91 to 137).
  • VA RNA species The most represented VA RNA species is VA I RNA which is very actively synthesized during the late phase, and accumulates up to an amount greater than 10 8 molecules per cell.
  • the RNA VA II is synthesized in an amount approximately 10 times less. It has been shown that, in cells infected with adenoviruses, the RNA VA I was necessary to increase the translation of the mRNAs during the late phase of the infection.
  • RNA VA I could stimulate, even in the absence of adenoviral infection, the expression of reporter genes introduced into cells.
  • RNA VA I acts essentially by blocking the activation of the protein kinase PKR (also called DAI).
  • PKR protein kinase
  • PKR protein kinase
  • ds-RNA double-stranded RNA
  • This activation results in an autophosphorylation of the enzyme, then a phosphorylation of the initiation factor for translation eIF-2 (Eukaryotic Initiation Factor 2).
  • the phosphorylated eIF-2 factor cannot be recycled, which leads to inhibition of the initiation of translation.
  • VA I RNA When the VA I RNA is present in sufficient quantity in the cell, that is to say after the transition to the late phase of the viral cycle, PKR activation does not occur, and late viral mRNAs can be translated.
  • PKR through the tip of its apical region (nucleotides 54-77 in the adenovirus Ad2), and in a second step an interaction is created between the central domain of VA I and PKR, from which results l inhibition of PKR activation.
  • the adenoviruses can constitute functional vectors for the expression of genes of interest in animal cells, for example in cells of mammals, and also of birds, or of fish. Their use has thus been recommended for obtaining recombinant live vaccines, for gene therapy, and also for the production of heterologous proteins in cell cultures. Many expression systems using adenoviruses have thus been described.
  • heterologous DNA sequences which it is desired to express are inserted in place of genomic sequences of the adenovirus, or inside these sequences: the El regions ( E1A and E1B), E3, and E4, have in particular have been used for the insertion of heterologous sequences.
  • the adenoviruses can be replicated in any permissive cell line.
  • Permissive cell lines for adenoviruses are of human or animal origin (mammals, birds, fish).
  • the adenoviruses obtained are incapable of replication in the usual host cells, where they remain blocked in the early phase; such adenoviruses, called "defective", are devoid of pathogenic effects. Therefore they are particularly advantageous for use in gene therapy and for vaccine use.
  • the adenoviruses used as expression vectors comprise at least: the ITR sequences, located at each end of the viral genome (the left ITR sequence of Ad5 comprises, for example, nucleotides 1 to 103 of the genome) an packaging sequence, (called Psi sequence), located between the left ITR and the El region, at the same level as the signals activating the transcription of the ElA gene (Elt I and II).
  • the ITR sequences located at each end of the viral genome
  • Ad5 comprises, for example, nucleotides 1 to 103 of the genome
  • Psi sequence packaging sequence
  • Elt I and II the packaging sequence located between the left ITR and the El region
  • They may also comprise other sequences, the nature of which varies according to the use which is envisaged for the vector, and which are adenovirus sequences and / or heterologous sequences.
  • sequences generally include, in addition to the gene of interest which it is desired to express, signals for regulating the expression of said gene, and in particular promoters.
  • promoters can be used to control the expression of cloned heterologous genes in an adenovirus. They may be tissue-specific or non-inducible or non-inducible cellular promoters, viral adenovirus or other virus promoters, synthetic promoters, etc.
  • RNAs of interest in particular ribozymes and antisense RNAs
  • sequence of interest is preferably inserted inside the central domain, or in place of it, in order to inactivate the inhibitory function of PKR activation.
  • VA RNA I it has also been proposed to use VA RNA I to stimulate the expression of genes of interest, by increasing the translation of mRNAs.
  • the vector expressing the gene of interest is co-transfected with a vector expressing the intact VA RNA I (a vector of this type, called pAdVAntage TM, is for example marketed by the company PROMEGA).
  • pAdVAntage TM a vector of this type, called pAdVAntage TM, is for example marketed by the company PROMEGA.
  • the properties of VA RNA I have so far found no application in the case of defective adenovirus vectors used for gene therapy or vaccination; in fact, these vectors, which are blocked in the early phase of infection, cannot benefit from stimulation which occurs only in the late phase of the replication cycle.
  • RNA VA I which when they are introduced into the same cell as a heterologous gene coding for a protein of interest make it possible to increase the synthesis of said protein. They also obtained constructs of recombinant DNA making it possible to express the adenovirus VA I RNA at a high level from the early phase of viral infection.
  • the subject of the present invention is the use of a recombinant DNA construct derived from the gene of a VA RNA I, and which comprises at least block A and block B of a promoter recognized by polymerase III, and , under transcriptional control of said promoter, an S x sequence whose transcription product can form a structure identical or similar to that of the end of the apical duplex of a Adenovirus VA I RNA, and an S 2 sequence chosen so that the transcripts of said recombinant DNA constructs constitute VA I RNA mutants in which the central domain of VA I is at least partially deleted or substituted by a sequence different from the wild-type sequence, to stimulate the translation of mRNAs in a host cell hosting said construct.
  • Promoters recognized by polymerase III are for example the promoter of the gene for a VA RNA of adenovirus, the promoter of the gene for a transfer RNA, or else the promoter of the gene for an EBER RNA of Epstein virus -Barr.
  • sequence S x may for example comprise a sequence the transcript of which consists of nucleotides 54-72 of a VA I RNA of adenovirus Ad2, however, S x may also comprise any other sequence of which the transcript may adopt the same secondary structure than this portion of RNA VA I of adenovirus, or any structure allowing the fixation of the PKR.
  • said recombinant DNA constructs further comprise a DNA sequence which constitutes an end of transcription signal recognized by RNA polymerase III.
  • End of transcription signals recognized by DNA polymerase III which can be used to obtain these constructs are for example the end of transcription signals of transfer RNAs, or else those of RNAs VA I or VA II adenovirus, or the end of transcription signal of the EBER I gene of the Epstein-Barr virus.
  • said recombinant DNA constructs comprise, instead of or within the sequence of the central domain of VA I, a linker comprising at least one restriction site for cloning of a heterologous DNA sequence (for example the VAemp construct described below) under transcriptional control of the PolIII promoter. According to a preferred arrangement of this embodiment, it is a multisite linker.
  • constructions which can be used in accordance with the invention include:
  • the inventors have found that the increase in expression observed with constructs used in accordance with the invention could be significantly greater than that observed with endogenous wild type VA I.
  • endogenous VA RNA designates a VA I or VA II RNA resulting from the transcription of an unmodified VA I or VA II RNA gene, which is situated in its natural transcription context, at its position usual in the adenovirus genome, and which is flanked by the sequences which surround it naturally).
  • the inventors have observed an increase in the level of expression of the heterologous gene both in cases where the central domain of VA I is substituted by sequences unrelated to the initial functional domain (illustrated in the examples below by the forms VArib and VAie), only in the case of deletion of the central domain of VA I (illustrated in the examples below by the form VAemp) without the insertion of replacement sequences; in the latter case, the effect is less intense, and only manifests itself under certain conditions of co-transfection.
  • the inventors have moreover found that, surprisingly, the association of an element for activating transcription by polymerase II, with at least block A and block B of a promoter VA I recognized by polymerase III, makes it possible to express at a high level the sequences placed under the control of the chimeric promoter thus obtained, and in particular of the genes of wild VA RNA I or of derivatives of VA RNA I, from the early phase of viral infection.
  • Constructions derived from the gene of a VA I RNA obtained in this way are of particular interest, because they can be used to stimulate the translation of mRNAs, and therefore the expression of heterologous genes, via VA I RNA. , modified or not, during this early phase.
  • the present invention therefore also relates to recombinant DNA constructs comprising a chimeric promoter as defined above, and in particular a construct derived from the gene for a RNA VA I, and which comprises at least: a chimeric promoter recognized by polymerase III and constituted by the association of at least one DNA sequence which constitutes an activating element of transcription of a PolII promoter, and of a DNA sequence comprising at least block A and block B of a promoter recognized by polymerase III; and, under the transcriptional control of said promoter - at least one sequence S lt as defined above, the transcription product of which can form a structure identical or similar to that of the end of the apical duplex of an RNA VA I of adenovirus (it is in particular any sequence whose transcript can adopt the same structure as nucleotides 54-72 of the gene of a RNA VA I); and
  • RNA polymerase III at least one DNA sequence which constitutes an end of transcription signal recognized by RNA polymerase III.
  • the term "PolII transcription activating element” is understood to mean a sequence which usually activates transcription by polymerase II. Many activating elements of the PolII transcription are known in themselves; it can be, for example, elements activating the IE gene (immediate early) of CMV or other viral genes, or elements activating cellular genes (immunoglobulin, albumin, etc.)
  • DNA constructs may further comprise other sequences and in particular any sequence chosen so that the transcripts of said constructions are mutants of VA I RNAs in which the central domain of VA I is at less partially deleted or substituted by a sequence different from the wild-type sequence.
  • a recombinant DNA construct in accordance with the invention comprises: - nucleotides 0 to 352 of the Ad5 adenovirus or a region homologous to another human or animal adenovirus; nucleotides 1 to 77 of the VA I gene of the adenovirus Ad2, -
  • Constructions in accordance with the invention may in particular comprise one of the sequences represented in the annexed sequence list, under the numbers SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 2.
  • a DNA construct comprising said gene of interest under the control of an appropriate promoter is introduced and expressed simultaneously in said host cell.
  • plasmids for example transient expression plasmids, plasmids replicating in the extrachromosomal position (constitutive cell lines), plasmids capable of integrating into cell chromosomes, recombinant viruses, in particular adenoviruses, humans, animals, or mixed.
  • the construction of DNA comprising a gene of interest which it is desired to increase the level of expression, and the construction of DNA derived from the gene of a RNA VA I can be carried by the same vector, or by two vectors different.
  • the present invention also relates to the use of the recombinant DNA constructs derived from the gene of a VA I RNA, as defined above, for obtaining vectors making it possible to increase the expression of at least one protein of interest in a host cell, as well as recombinant vectors obtained in this way, and in particular the vectors comprising a DNA construct derived from the gene of a VA I RNA, as defined above, and a DNA construct comprising at least one gene of interest that the we wish to express, placed under the control of an appropriate promoter.
  • the present invention also includes recombinant adenoviruses obtained by insertion into an adenovirus of a DNA sequence comprising at least block A and block B of a promoter recognized by polymerase III, and, under transcriptional control of said promoter, a S x sequence as defined above, the transcription product of which forms a structure identical or similar to that of the end of the apical duplex of a VA I RNA of adenovirus.
  • a recombinant adenovirus in accordance with the present invention it further comprises an endogenous VA I gene.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention can be obtained from any type of adenovirus normally used for obtaining vectors, be it human adenoviruses 1, animals, or mixed.
  • these are recombinant adenoviruses defective for the El region, and therefore blocked in the early phase of the cycle (infection).
  • a DNA sequence constituting an activating element of transcription by polymerase II with the promoter PolIII of VA RNA one can express in the early phase of viral infection , any sequence placed under transcriptional control of said PolIII promoter, and in particular both wild type VA I RNA and RNA derived from VA I.
  • the DNA constructs derived from the gene of a VA I RNA, the vectors and the recombinant adenoviruses described above can be used to increase the expression of proteins of interest in host cells, both in vitro and in vivo.
  • the increase in expression is independent of the sequence of the gene of interest and of the nature of the 5 "and 3 'regulatory sequences associated with it.
  • the constructs as well as the vectors defined above can be used in combination with other means aimed at increasing or regulating the level of expression of the genes. For example, they can be associated with cloned genes under the control of tissue-specific promoters, or of inducible promoters.
  • the field of gene or cell therapy by adenovirus vector is a privileged, but not unique, field of application of the present invention.
  • the constructs as well as the recombinant vectors defined above can also be used to increase the level of expression of immunogenic proteins in the context of obtaining. vaccines, or for the in vitro production of proteins of interest in mammalian cells, or any other permissive cell for adenoviruses (bird cells, fish cells, etc.).
  • the adenoviruses were multiplied and titrated on human embryonic kidney cells 293. Different cells (simian Vero cells, human Hela cells) were also used to measure the level of expression of exogenous proteins.
  • Hela cells are from a line of human epithelial carcinoma; they have an ElA-like activity, and are therefore capable, at high multiplicity of infection, of partially complementing for the absent ElA gene.
  • Vero cells are from a line of monkey kidneys; they do not allow replication of viruses defective for the ElA region.
  • the plasmid pMLPluc comprises the luciferase gene preceded by the leader sequences of the late mRNAs of the adenovirus under the control of the MLP promoter of the adenovirus Ad2.
  • the plasmid pCMVcat expresses the CAT gene under the control of the promoter of the immediate early (IE) gene of the cytomegalovirus.
  • the adenoviruses carrying the various modified VA-RNAs were constructed by ligation between: 1) plasmids integrating the left ITR, the encapsidation signals and the activator signals of the ElA gene of the adenovirus Ad5 (nt 1-352) , as well as the modified VA I gene and
  • the ligation products were transfected into 293 cells.
  • the lysis plaques were isolated 10 to 15 days later.
  • the light DNA was extracted by the HIRT technique [GLUZMAN et al., J. Virology, 45, p. 91-103, (1983)] and the conformity of the construction was checked by restriction analysis.
  • these adenoviruses have an ElA-, E1B + phenotype.
  • the CAT activity assay was carried out by an ELISA test (BOEHRINGER).
  • the luciferase activity was assayed according to a standard procedure (Kit Luciferase Assay System, - PROMEGA BIOTECH) using a scintillation counter.
  • EXAMPLE 1 CONSTRUCTION OF THE PLASMID pVAemP AND OF THE VIRUS Ad-VAenrp.
  • the plasmid pVAemp was constructed as
  • a plasmid (pMLP-gl) similar to the plasmid pMLPIO-gD (ELOIT et al., J. Gen. Virol., 71, 2425-2431, 1990) was used.
  • the EcoRI site at position 0 of pMLP-gl was deleted by digestion, filling of the ends with the Klenow fragment of RNA polymerase II, and religation.
  • the sequences of this plasmid between the SacII site (nucleotide 352) and ClaI (nucleotide 2498) have been deleted.
  • the region 0-352 comprises the ITR and the packaging signals (nucleotides 0-352) of the Ad5 virus. The latter are inseparable from the activating signals of the transcription of the ElA gene (Elt I and
  • the 5 ′ part of the VA I gene (nucleotides 1 to 77), comprising the two intragenic promoter sequences A and B,
  • ITR left inverted terminal sequence of Ad5 Elt I, Elt II: signals activating the gene ElA AI to AV: packaging signals of adenovirus type 5 TTTT: end of transcription signal of the EBER I gene of the Epstein-Barr virus
  • the numbers without a circle correspond to the sequence of Ad5.
  • the circled figures refer to the sequence of VA I (nucleotide 1: initiation of transcription).
  • the plasmid pVAemp contained in the DH5 strain of E. coli was deposited on January 16, 1996, under number 1-1655 with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms) held by the INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Dondel Roux , in Paris.
  • Ad-VAemp virus was constructed by digestion of the plasmid pVAemp with Aatll and AccI and ligation with the right fragment of the adenovirus genome Ad-gD (ELOIT et al., J. Gen. Virol., 71, 2425-2431, 1990) digested at the Clal site.
  • the ligation product is transfected into 293 cells, and the recombinant viruses are isolated as described above, in the "Materials and Methods" section.
  • EXAMPLE 2 CONSTRUCTION OF p-VArib PLASMID AND Ad-VArib VIRUS
  • the plasmid p-VArib was constructed by cloning the sequence of a ribozyme of the mRNA of the CAT gene (represented in FIG. 3, as well as in the sequence list in the appendix, under the number SEQ ID NO: 1) at EcoRI-HindIII site of the pVAemp multi-site linker.
  • the Ad-VArib virus was constructed by digestion of the plasmid p-VArib with Narl-Dral, and ligation of the Narl-Dral fragment of 1061 bp with the right fragment of the Ad5 adenovirus genome digested at the ClaI site.
  • VArib RNA expression vector was verified by RT-PCR (back-transcription followed by PCR amplification) in HeLa cells infected with Ad-VArib.
  • Ad-gD virus As a control.
  • the latter virus is defective for the ElA gene, and furthermore integrates in the left part, (at the location where clones in Ad-VArib, the sequences derived from VA I are cloned), the gD gene of the pseudorabies virus.
  • the primers used are the following (these primers are also indicated in FIG. 3, and are respectively represented in the sequence list in the appendix, under the numbers SEQ ID NO: 3 for the left primer, and SEQ ID NO: 4 for primer right): Left: 5 'AGCGGGCACTCTTCCGTGGTCTG 3' Right: 5 'AAAACATGCCGACCACCAGGGGT 3'
  • Ad-VArib An amplification product of 198 bp is indeed observed for the recombinant Ad-VArib.
  • the Ad-gD virus gives a negative result.
  • a control produced by omitting the retrotranscription phase was also found to be negative, which makes it possible to verify that the signal obtained for Ad-VArib does not result from an amplification of the viral DNA sequences.
  • the plasmid p-VAie was constructed by cloning an antisense sequence of the mRNA of the gene IE (immediate early) of the Aujeszky's disease virus (represented in FIG. 3, as well as in the sequence list in the appendix, under the number SEQ ID NO: 2) between the SmaI and HindIII sites of the pVAemp multi-site linker.
  • the Ad-VAie virus was constructed by digestion of the plasmid p-VAie with AatlI-AccI and ligation of the AatlI-AccI fragment of 1204 bp with the right fragment of the Ad5 adenovirus genome digested at the ClaI site.
  • the level of expression of the CAT gene in cells infected with Ad-VArib was quantified. Since a cleavage of the synthesized CAT mRNA was initially expected after infection with the Ad-VArib virus, the following strategy was used: a Hela cell line expressing the CAT gene under the control of a promoter inducible, namely the murine metallothionine promoter (mMT) was constructed, and a hygromycin-resistant cell clone was isolated. Cells of this clone were trypsinized and then infected at a multiplicity of infection of 100 TCID 5 o / cell, either by Ad-VArib or by Ad-VAemp used as a control.
  • mMT murine metallothionine promoter
  • EXAMPLE 5 INCREASE IN THE LEVEL OF EXPRESSION OF HETEROLOGOUS GENES BY THE PVArib CONSTRUCTION OUTSIDE A VIRAL CONTEXT.
  • HeLa cells were cotransfected with the plasmid pMLP-luc containing the luciferase gene under the control of the MLP promoter, and the various plasmids pVArib, pVAemp, and pMLPCAT control title. 72 hours later, the cells were removed and the luciferase activity was quantified.
  • the inventors carried out comparative tests, using various constructions of different genotypes in co-infection with an adenovirus
  • 293 cells which allow replication of viruses defective for the ElA region (and normal expression of the endogenous VA I sequences of the different adenoviruses used)
  • Vero cells which do not allow not the replication of viruses defective for the ElA region, and in which the expression of the endogenous VA I sequences occurs only at a very low level.
  • Vero cells or 293 were either infected with 100 TCID50 of Ad-MLP-luc virus, or co-infected with 100 TCID 50 of Ad-MLP-luc virus and 100
  • TCID50 of one of the following viruses Ad-gD, Ad-VAemp,
  • Ad-VAie Ad-VArib Ad-VArib.
  • Ad-gD virus which has endogenous VA I sequences but is devoid of exogenous VA I sequences (the term "exogenous VA RNA" designates a VA I or VA II RNA resulting from the transcription of a modified VA gene, and / or located outside of its natural transcription context), makes it possible to evaluate the effect induced by the exogenous VA I.
  • the 293 cells were harvested 24 hours after infection, that is to say at a time when the cytopathic effect is complete. Vero cells were harvested 4 days after infection. The results obtained are presented in Table II below.
  • the signs + or - on the second and third lines of the table indicate the existence, in the transfected cells, of endogenous VA I or exogenous VA I.
  • the figures in the fourth and fifth lines indicate the quantity (in ng) of luciferase synthesized per 10 6 cells.
  • Ad-VAemp and AD-VAie allow a doubling of the synthesis of luciferase
  • the adenovirus is internalized by an endocytosis mechanism mediated by a receptor (integrins) which interacts with the penton-base protein. This mechanism is sufficient to allow the co-internalization of molecules (for example DNA) delivered in association with the adenovirus. It is therefore possible to envisage that the internalization of a virion would allow the internalization of other virions not linked directly to the cellular receptor.
  • the expression of the E1B gene could increase early phase transcription of the Endogenous VA I of the various viruses involved in co-infection experiments [SOLLERBRANT et al., J. Virol., 67, p. 4195-4204, (1993)].
  • the E1B protein would also stabilize the introduced DNA, with an indirect effect on the level of expression measured [HERRMANN and MATHEWS, Mol. Cell. Biol., 9, p. 5412-5423, (1989)].
  • RNA VA I is more effective when it is delivered in trans rather than in ci s.
  • the plasmid pCMV-CAT contains the CAT gene under the control of the promoter of the "immediate early" (IE) gene of the cytomegalovirus (and therefore in the absence of the adenovirus leader sequences).
  • 2x10 6 HeLa cells were cotransfected with the plasmid pCMV-CAT, and one of the plasmids pVArib, pVAemp, or as a control, pMLP- read. 72 hours later, the cells were removed and the luciferase activity was quantified.
  • mice were inoculated intramuscularly, or intravenously, with the adenovirus Ad-MLP-luc and, or else the adenovirus Ad-gD (control), indeed the adenovirus Ad-VAr.
  • Table IV The results of this experiment are summarized in Table IV below.
  • Ad-VAr has a marked positive effect on the synthesis of luciferase in the liver ( ⁇ 4600), and, with lower efficiency, in the lungs (x33), after joint inoculation by intravenous route with Ad-MLP-luc .
  • Ad-gD virus which includes the PRV gD gene and which is capable of protecting mice against infection by PRV [ELOIT and ADAM, Journal of General Virology, 75, p. 1583-1589, (1995), - GONIN et al., Vaccine, 14, p. 1083-1087, (1996)], was chosen.
  • Ad-gD 10 8 and 10 7 TCID 50 respectively
  • 10 9 TCID 50 from Ad-MLP-luc.
  • the dose of 10 9 TCID 50 was chosen in order to obtain a maximum probability of co-infection of the cells with these viruses.
  • the Ad-gD virus at a dose of 10 7 TCID 50 does not effectively protect the mice against infection (20% compared to 0% in the control mice).
  • the same dose injected at the same time as Ad-VAr protects 80% of the mice, which is identical to the level of protection induced by Ad-gD alone at a dose 10 times higher.
  • Ad-VAr is co-inoculated with a dose of Ad-gD of 10 th TCID 50 . Although it appears less clearly with regard to the level of protection conferred (100%) compared to the co-inoculation Ad-MLP-luc (80%), this effect is however clearly identifiable by the level of the antibody response. . In conclusion, it appears that Ad-VAr has made it possible to divide by 10 the dose of Ad-gD which is necessary to obtain protection when it is used intramuscularly.
  • GGCACTCTTC CGTGGTCTGG TGGATAAATT CGCAAGGGTA TCATGGCGGA CGACCGGGGT 60

Abstract

L'invention est relative à des constructions d'ADN comprenant des séquences dérivées du gène de l'ARN VA I d'adénovirus, ainsi qu'à des vecteurs recombinants comprenant lesdites constructions. Ces constructions et ces vecteurs sont utilisables pour augmenter la production de protéines d'intérêt dans des cellules-hôtes.

Description

CONSTRUCTIONS D'ADN ET VECTEURS D'EXPRESSION DERIVES DU GENE DE L'ARN VA I D'ADENOVIRUS.
L'Invention est relative a des constructions d'ADN dérivées du gène VA I d' adénovirus et à leur utilisation pour augmenter le niveau d'expression de gènes d'intérêt.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire ; leur génome, dont la séquence complète est pour certains d'entre eux, connue [cf. par exemple CHROBOEZEK et al. Virology, 186, 280-285 (1992)] , comprend à peu près 36000 pb et comporte à ses extrémités des séquences inversées répétées (ITR) .
L'infection d'une cellule-hôte par un adénovirus comprend deux phases : - une phase précoce au cours de laquelle sont exprimées 4 unités de transcription, dénommées El, E2, E3 et E4, et où sont synthétisés en particulier les facteurs de réplication de l'ADN viral, ainsi que des protéines régulant l'expression de certains gènes viraux et cellulaires ; parmi les gènes transcrits pendant la phase précoce, on mentionnera en particulier les gènes El (E1A, et E1B) qui sont situés à l'extrémité gauche (extrémité 5') du génome de l' adénovirus, et qui sont indispensables à la réplication virale ; - une phase tardive, au cours de laquelle sont exprimés les gènes tardifs LI à L5 ; les gènes codant pour les protéines de structure du virion sont transcrits sous contrôle du promoteur fort MLP (Major Late Promoter) . Que ce soit au cours de la phase précoce, ou au cours de la phase tardive, la plus grande partie du génome de 1 ' adénovirus est transcrite par l'ARN polymérase II de la cellule-hôte.
Cependant, certains gènes sont transcrits par l'ARN polymérase III : en particulier, deux gènes (VA I et VA II) , qui sont situés dans la région LI {entre les nucleotides 10160 et 10574 dans le cas de l'adénovirus Ad2) , sont transcrits essentiellement pendant la phase tardive de l'infection, pour donner naissance à des ARNs dénommés ARN VA (pour "Virus Associated"), qui s'accumulent dans la cellule en grande quantité. Les séquences promotrices de ces gènes reconnues par l'ARN polymérase III sont intragéniques, et sont dénommées respectivement boîte A et boîte B.
La structure de l'ARN VA I de l'adénovirus Ad2 est représentée à la Figure 1 [d'après la publication de MA et MATHEWS J. Virol. , 67, 6605-6617 (1993)] . Cette structure comprend une région terminale (nucleotides 0 à 18 formant un duplex imparfait avec les nucleotides 138 à 160) , et une région apicale (nucleotides 42 à 90, formant également une structure en duplex par repliement en épingle à cheveux de la chaîne nucleotidique) , qui sont séparées par un domaine central (nucleotides 19 à 41 et 91 à 137) .
L'espèce d'ARN VA la plus représentée est l'ARN VA I qui est synthétisé de manière très active pendant la phase tardive, et s'accumule jusqu'à une quantité supérieure à 108 molécules par cellule. L'ARN VA II est synthétisé en quantité environ 10 fois moindre. II a été montré que, dans des cellules infectées par les adénovirus, l'ARN VA I était nécessaire pour accroître la traduction des ARNm pendant la phase tardive de l'infection.
Il a également été observé dans le cadre d'expérimentations d'expression transitoire, que l'ARN VA I pouvait stimuler, même en l'absence d'infection adénovirale, l'expression de gènes rapporteurs introduits dans des cellules.
C'est ainsi qu'en 1985, SVENSSON et AKUSJÂRVI [EMBO J. 4, p. 957-964] ont démontré que l'augmentation d'efficacité d'expression ne se limite pas aux ARNm viraux : ces auteurs ont en particulier procédé à la co- transfection de cellules avec un plasmide porteur du gène CAT, et un plasmide porteur de la région VA I. Ils ont montré dans ces conditions une stimulation significative (6,5χ) dans les cellules 293, qui complementent en ùraπs pour le gène E1A, mais pas dans les cellules HeLa et CV-l (environ 2χ) . Selon ces auteurs, ces résultats seraient dus à une mauvaise efficacité de transcription du gène VA I dans ces deux derniers types cellulaires. KAUFMANN [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p.
689-693, (1985)] a également montré l'augmentation de l'expression d'un gène rapporteur par le gène VA I fourni en cis ou trans. Selon cet auteur, cet effet est surtout marqué pour des gènes rapporteurs placés sous le contrôle du MLP et de ses trois séquences leader non traduites situées en 5' du gène.
L'ARN VA I agit essentiellement en bloquant l'activation de la protéine-kinase PKR (également dénommée DAI) . [Pour revue, cf. MATHEWS M.B., Enzyme, 44, p. 250-264, (1990) ; MATHEWS et SHENK, J. Virol. , 65, p. 5657-5662, (1991) ] .
La PKR, dont la synthèse est induite par 1'interféron, est associée au ribosome, dans un complexe réunissant tous les facteurs de la traduction. Cette protéine-kinase est normalement activée par les ARN double brins (ARN-ds) présents en quantité importante dans la cellules du fait de l'infection virale. Cette activation se traduit par une autophosphorylation de l'enzyme, puis une phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF-2 (Eukaryotic Initiation Factor 2) . Le facteur eIF-2 phosphorylé ne peut être recyclé, ce qui conduit à une inhibition de l'initiation de la traduction.
Lorsque l'ARN VA I est présent en quantité suffisante dans la cellule, c'est à dire après la transition vers la phase tardive du cycle viral, l'activation de la PKR ne se produit pas, et les ARNm tardifs viraux peuvent être traduits.
Différents travaux ont permis de décrire le mécanisme d'interaction VA I-PKR et les sites impliqués [MELLITS et MATHEWS, EMBO J. 7, p. 2849-2859, (1988) ; MELLITS et al., Cell. 61, p. 843-852, (1990) ; MELLITS et al., J. Virol., 66, p. 2360-2377, (1992) ; MA et MATHEWS, 67, p. 6605-6617, (1993) ; PE•ERY et al., J. Virol. 67, p. 3534-3543, (1993) ] . Dans un premier temps, le VA I se fixe à la
PKR par l'intermédiaire de l'extrémité de sa région apicale (nucleotides 54-77 chez l'adénovirus Ad2) , et dans un deuxième temps se crée une interaction entre le domaine central du VA I et la PKR, d'où résulte l'inhibition de l'activation de la PKR.
Il a été montré que des mutations de l'ARN VA I qui altèrent l'extrémité apicale sans détruire sa structure secondaire ne détruisent pas sa fonction, mais qu'en revanche, les mutations qui affectent la structure du domaine central inactivent sa capacité à inhiber l'activation de la PKR.
Les adénovirus peuvent constituer des vecteurs fonctionnels pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cellules animales, par exemple dans des cellules de mammifères, et également d'oiseaux, ou de poissons. Leur emploi a ainsi été préconisé pour l'obtention de vaccins vivants recombinants, pour la thérapie génique, et également pour la production de protéines hétérologues dans des cultures cellulaires. De très nombreux systèmes d'expression utilisant les adénovirus ont ainsi été décrits.
Pour obtenir des vecteurs d'expression dérivés d'adénovirus, les séquences d'ADN hétérologue que l'on souhaite exprimer sont insérées à la place de séquences genomiques de l'adénovirus, ou à l'intérieur de ces séquences : les régions El (E1A et E1B) , E3, et E4, ont en particulier été utilisées pour l'insertion de séquences hétérologues.
Lorsque qu'une séquence hétérologue est insérée dans E3, qui n'est pas une région essentielle pour la réplication, les adénovirus peuvent être répliqués dans n'importe quelle lignée cellulaire permissive. Des lignées cellulaires permissives pour les adénovirus sont d'origine humaine ou animale (mammifères, oiseaux, poissons) . En revanche, si une séquence hétérologue est insérée dans la région El, les adénovirus obtenus sont incapables de réplication dans les cellules-hôte habituelles, où ils restent bloqués en phase précoce ; de tels adénovirus, dits "défectifs", sont dépourvus d'effets pathogènes. De ce fait ils sont particulièrement avantageux pour l'utilisation en thérapie génique et pour l'utilisation vaccinale.
La réplication de ces adénovirus défectifs doit être effectuée sur des cellules fournissant les fonctions manquantes ; à titre d'exemple, on citera les cellules 293 [GRAHAM et al. J. Gen. Virol., Vol. 36, p. 59-72 (1977)] : ces cellules sont issues d'une lignée de rein embryonnaire humain, dans le génome de laquelle est intégrée la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 ; elles complementent en trans pour la région El et permettent la réplication des virus défectifs pour cette région.
Généralement, les adénovirus utilisés comme vecteurs d'expression comprennent au moins : les séquences ITR, localisées à chaque extrémité du génome viral (la séquence ITR gauche de Ad5 comprend par exemple les nucleotides l à 103 du génome) une séquence d'encapsidation, (dénommée séquence Psi), située entre l'ITR gauche et la région El, au même niveau que les signaux activateurs de la transcription du gène ElA (Elt I et II) . Ils comprennent également les gènes essentiels pour la réplication de l'adénovirus, à moins que ceux-ci ne soient apportés par la lignée cellulaire hôte et/ou par un autre adénovirus utilisé comme auxiliaire.
Ils peuvent comprendre en outre d'autres séquences, dont la nature varie selon l'usage que l'on envisage pour le vecteur, et qui sont des séquences d'adénovirus et/ou des séquences hétérologues.
Ces autres séquences incluent généralement, outre le gène d'intérêt que l'on souhaite exprimer, des signaux de régulation de l'expression dudit gène, et en particulier des promoteurs.
Une grande variété de promoteurs est utilisable pour contrôler l'expression de gènes hétérologues clones dans un adénovirus. Il peut s'agir de promoteurs cellulaires tissu-spécifiques ou non, inductibles ou non, de promoteurs viraux d'adénovirus ou d'autres virus, de promoteurs synthétiques, etc.
Une grande variété d'adénovirus recombinants, conçus pour des usages divers, ont ainsi été obtenus ; on citera à titre d'illustration les vecteurs décrits dans les Demandes Internationales PCT publiées sous les numéros WO 94/08026 du 14 Avril 1995, au nom de RHONE- POULENC RORER S.A. et al.; WO 95/02697 du 26 Janvier 1995, au nom de RHONE-POULENC RORER S.A. ; WO 95/14101 du 26 Mai 1995, au nom de RHONE-POULENC RORER S.A. et al.; WO 95/16772 du 22 Juin 1995, au nom de CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC. US.
Il a également été proposé d'utiliser les promoteurs polIII d'adénovirus, tels que ceux des gènes des ARN VA, pour exprimer des ARN d'intérêt, en particulier des ribozymes et des ARN anti-sens [Demande EP 0647 716 au nom de UNIVERSITE DE NICE-SOPHIA ANTIPOLIS ; VENTURA et al., Nucl . Acid Res . 21, 14, 3249- 3255(1993)] . Dans ce cas, la séquence d'intérêt est insérée de préférence à l'intérieur du domaine central, ou à la place de celui-ci, afin d'inactiver la fonction inhibitrice de l'activation de la PKR.
Il a également été proposé d'utiliser l'ARN VA I pour stimuler l'expression de gènes d'intérêt, en augmentant la traduction des ARNm. Dans ce cas, le vecteur exprimant le gène d'intérêt est co-transfecté avec un vecteur exprimant l'ARN VA I intact (un vecteur de ce type, dénommé pAdVAntage™, est par exemple commercialisé par la société PROMEGA) . Cependant, les propriétés de l'ARN VA I n'avaient jusqu'à présent pas trouvé d'applications dans le cas des vecteurs adénovirus défectifs utilisés pour la thérapie génique ou la vaccination ; en effet, ces vecteurs qui sont bloqués en phase précoce de l'infection, ne peuvent pas bénéficier d'une stimulation qui n'intervient qu'en phase tardive du cycle de réplication.
D'autre part, aucun moyen d'augmenter l'efficacité de l'ARN VA I sur la stimulation de la traduction des ARNm n'avait été proposé auparavant.
Or, les Inventeurs ont maintenant obtenu des variants d'ARN VA I, qui lorsqu'ils sont introduits dans la même cellule qu'un gène hétérologue codant pour une protéine d'intérêt permettent d'augmenter la synthèse de ladite protéine. Ils ont en outre obtenu des constructions d'ADN recombinant permettant d'exprimer à un niveau élevé l'ARN VA I d'adénovirus dès la phase précoce de l'infection virale.
La présente Invention a pour objet l'utilisation d'une construction d'ADN recombinant dérivée du gène d'un ARN VA I, et qui comprend au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III, et, sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, une séquence Sx dont le produit de transcription peut former une structure identique ou similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus, et une séquence S2 choisie de manière à ce que les produits de transcription desdites constructions d'ADN recombinant constituent des mutants d'ARNs VA I dans lesquels le domaine central du VA I est au moins partiellement délété ou substitué par une séquence différente de la séquence de type sauvage, pour stimuler la traduction des ARNm dans une cellule-hôte hébergeant ladite construction.
Des promoteurs reconnus par la polymérase III sont par exemple le promoteur du gène d'un ARN VA d'adénovirus, le promoteur du gène d'un ARN de transfert, ou bien le promoteur du gène d'un ARN EBER du virus d'Epstein-Barr.
La séquence Sx peut par exemple comprendre une séquence dont le transcrit est constitué par les nucleotides 54-72 d'un ARN VA I d'adénovirus Ad2 cependant, Sx peut également comprendre toute autre séquence dont le transcrit peut adopter la même structure secondaire que cette portion d'ARN VA I d'adénovirus, ou toute structure permettant la fixation de la PKR.
Avantageusement, lesdites constructions d'ADN recombinant comprennent en outre une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription reconnu par l'ARN polymérase III. Des signaux de fin de transcription reconnus par l'ADN polymérase III, qui peuvent être employés pour l'obtention de ces constructions sont par exemple les signaux de fin de transcription d'ARNs de transfert, ou bien ceux des ARNs VA I ou VA II d'adénovirus, ou le signal de fin de transcription du gène EBER I du virus d'Epstein-Barr.
Selon un mode de mise en oeuvre de la présente invention, lesdites constructions d'ADN recombinant comprennent, à la place ou à l'intérieur de la séquence du domaine central du VA I, un lieur comprenant au moins un site de restriction pour le clonage d'une séquence d'ADN hétérologue (par exemple construction VAemp décrite ci-après) sous contrôle transcriptionnel du promoteur PolIII. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, il s'agit d'un lieur multisite.
A titre d'exemple, des constructions utilisables conformément à l'Invention, dénommées VArib et VAie, comprennent respectivement :
- la séquence représentée dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 1, qui contient la séquence d'un ribozyme de l'ARNm du gène CAT, et
- la séquence représentée dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 2, qui contient une séquence anti-sens de l'ARNm du gène IE (immédiate early) du virus de la maladie d'Aujeszky. Les séquences des constructions VArib et VAie correspondantes sont également représentées à la figure 3.
Lorsque des constructions d'ADN recombinant dérivées du gène d'un ARN VA I, telles que définies-ci dessus sont introduites dans la même cellule qu'un gène hétérologue codant pour une protéine d'intérêt, on peut obtenir, de manière similaire à ce qui a été observé avec les ARN VA I de type sauvage, l'augmentation de la synthèse de ladite protéine. Cet effet est inattendu, dans la mesure où l'intégrité du domaine central du VA I était généralement considéré comme indispensable pour l'inhibition de l'activation de la PKR.
Les Inventeurs ont constaté que l'augmentation de l'expression observée avec des constructions utilisées conformément à l'Invention pouvait être notablement plus importante que celle observée avec le VA I endogène de type sauvage. (on désigne par ARN VA "endogène" un ARN VA I ou VA II résultant de la transcription d'un gène d'ARN VA I ou VA II non-modifié, qui est situé dans son contexte naturel de transcription, à sa position habituelle dans le génome d'adénovirus, et qui est flanqué des séquences qui l'entourent naturellement).
En outre, les Inventeurs ont observé une augmentation du niveau d'expression du gène hétérologue aussi bien dans des cas où le domaine central du VA I est substitué par des séquences sans rapport avec le domaine fonctionnel initial (illustré dans les exemples ci-après par les formes VArib et VAie) , que dans le cas de la délétion du domaine central du VA I (illustré dans les exemples ci-après par la forme VAemp) sans l'insertion de séquences de remplacement ; dans ce dernier cas, l'effet est toutefois moins intense, et ne se manifeste que dans certaines conditions de co-transfection.
Les Inventeurs ont en outre constaté que, de façon surprenante, l'association d'un élément activateur de la transcription par la polymérase II, avec au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur VA I reconnu par la polymérase III, permet d'exprimer à un niveau élevé les séquences placées sous contrôle du promoteur chimérique ainsi obtenu, et en particulier des gènes de l'ARN VA I sauvage ou des dérivés d'ARN VA I, dès la phase précoce de l'infection virale.
Des constructions dérivées du gène d'un ARN VA I obtenues de la sorte présentent un intérêt tout particulier, car elles sont utilisables pour stimuler la traduction des ARNm, et donc l'expression de gènes hétérologues, par l'intermédiaire d'ARN VA I, modifié ou non, pendant cette phase précoce.
La présente Invention a en conséquence également pour objet des constructions d'ADN recombinant comprenant un promoteur chimérique tel que défini ci- dessus, et en particulier une construction dérivée du gène d'un ARN VA I, et qui comprend au moins : un promoteur chimérique reconnu par la polymérase III et constitué par l'association d'au moins une séquence d'ADN qui constitue un élément activateur de transcription d'un promoteur PolII, et d'une séquence d'ADN comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III ; et, sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur - au moins une séquence Sl t telle que définie ci-dessus, dont le produit de transcription peut former une structure identique ou similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus (il s'agit en particulier de toute séquence dont le transcrit peut adopter la même structure que les nucleotides 54-72 du gène d'un ARN VA I) ; et
- au moins une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription reconnu par l'ARN polymérase III. On entend par : "élément activateur de transcription PolII" une séquence qui active habituellement la transcription par la polymérase II. De nombreux éléments activateurs de la transcription PolII sont connus en eux-mêmes ; il peut s'agir par exemple d'éléments activateurs du gène IE (immédiate early) du CMV ou d'autres gènes viraux, ou bien d'éléments activateurs de gènes cellulaires (immunoglobuline, albumine, etc..)
Avantageusement, il s'agira d'un élément activateur de la transcription du gène ElA d'adénovirus.
Ces constructions d'ADN peuvent comprendre, en outre, d'autres séquences et en particulier toute séquence choisie de manière à ce que les produits de transcription desdites constructions soient des mutants d'ARNs VA I dans lesquels le domaine central du VA I est au moins partiellement délété ou substitué par une séquence différente de la séquence sauvage.
Par exemple, une construction d'ADN recombinant conforme à l'Invention comprend : - les nucleotides 0 à 352 de l'adénovirus Ad5 ou une région homologue d'un autre adénovirus humain ou animal; les nucleotides 1 à 77 du gène VA I de l'adénovirus Ad2 ,-
- le signal de fin de transcription du gène EBER I du virus d'Epstein-Barr.
Des constructions conformes à l'Invention peuvent comprendre en particulier l'une des séquences représentées dans la liste de séquences en annexe, sous les numéros SEQ ID NO: 1, et SEQ ID NO: 2.
Pour augmenter l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule-hôte, on introduit et on exprime simultanément dans ladite cellule-hôte une construction d'ADN comprenant ledit gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur approprié, et une construction d'ADN dérivée du gène d'un ARN VA I, telle que décrite ci-dessus.
Pour introduire et exprimer dans une cellule hôte les constructions dérivées du gène d'un ARN VA I décrites ci-dessus, ainsi que le ou les gène(s) d'intérêt dont on souhaite accroître le niveau d'expression, on peut utiliser différents types de vecteurs, tels que des plasmides, par exemple des plasmides d'expression transitoire, des plasmides réplicatifs en position extrachromosomique (lignées cellulaires constitutives) , des plasmides capables de s'intégrer aux chromosomes cellulaires, des virus recombinants, en particulier des adénovirus, humains, animaux, ou mixtes. La construction d'ADN comprenant un gène d'intérêt dont on souhaite accroître le niveau d'expression, et la construction d'ADN dérivée du gène d'un ARN VA I, peuvent être portées par le même vecteur, ou bien par deux vecteurs différents. La présente Invention a également pour objet l'utilisation des constructions d'ADN recombinant dérivées du gène d'un ARN VA I, telles que définies ci- dessus, pour l'obtention de vecteurs permettant d'augmenter l'expression d'au moins une protéine d'intérêt dans une cellule-hôte, ainsi que des vecteurs recombinants obtenus de la sorte, et en particulier les vecteurs comprenant une construction d'ADN dérivée du gène d'un ARN VA I, telle que définie ci-dessus, et une construction d'ADN comprenant au moins un gène d'intérêt que l'on souhaite exprimer, placé sous contrôle d'un promoteur approprié.
La présente Invention englobe également des adénovirus recombinants obtenus par insertion dans un adénovirus d'une séquence d'ADN comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III, et, sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, une séquence Sx telle que définie ci-dessus, dont le produit de transcription forme une structure identique ou similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus. Selon un mode de réalisation d'un adénovirus recombinant conforme à la présente Invention, il comprend en outre un gène VA I endogène.
Les adénovirus recombinants conformes à l'Invention peuvent être obtenus à partir de n'importe quel type d'adénovirus habituellement utilisable pour l'obtention de vecteurs, qu'il s'agisse d1adénovirus humains, animaux, ou mixtes.
Avantageusement il s'agit d'adénovirus recombinants défectifs pour la région El., et donc bloqués en phase précoce du cycle (infection). En effet, si l'on associe, conformément à l'Invention, une séquence d'ADN constituant un élément activateur de la transcription par la polymérase II avec le promoteur PolIII des ARN VA, on peut exprimer en phase précoce de l'infection virale, toute séquence placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur PolIII, et en particulier aussi bien des ARN VA I de type sauvage, que des ARN dérivés de VA I.
Conformément à l'invention, les constructions d'ADN dérivées du gène d'un ARN VA I, les vecteurs, et les adénovirus recombinants décrits ci-dessus sont utilisables pour augmenter l'expression de protéines d'intérêt dans des cellules-hôtes, aussi bien in vi tro qu ' in vivo .
L'augmentation de l'expression est indépendante de la séquence du gène d'intérêt et de la nature des séquences de régulation 5" et 3 ' qui lui sont associées.
Les Inventeurs ont vérifié que cette augmentation de l'expression se manifestait pour différents gènes hétérologues, variant aussi bien par les promoteurs utilisés, que par les régions codantes, ou les séquences en 5' non traduites de l'ARN messager, et «gaiement dans différentes lignées cellulaires (HeLa et Vero) . Conformément à l'Invention, les constructions ainsi que les vecteurs définis ci-dessus, peuvent être employés en association avec d'autres moyens visant à augmenter ou réguler le niveau d'expression des gènes. Par exemple, ils peuvent être associés avec des gènes clones sous contrôle de promoteurs tissu-spécifique, ou de promoteurs inductibles.
Le domaine de la thérapie génique ou cellulaire par vecteur adénovirus est un domaine privilégié, mais non unique, d'application de la présente Invention.
Conformément à l'Invention, les constructions ainsi que les vecteurs recombinants définis ci-dessus peuvent également être employés pour augmenter le niveau d'expression de protéines immunogènes dans le cadre de l'obtention de. vaccins, ou bien pour la production in vi tro de protéines d'intérêt en cellules de mammifères, ou toute autre cellule permissive pour les adénovirus (cellules d'oiseaux, de poissons, etc.).
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation de constructions d'ADN dérivées du gène VA I. CELLULES ET VIRUS UTILISES
Les adénovirus ont été multipliés et titrés sur cellules de rein embryonnaire humain 293. Différentes cellules (cellules simiennes Vero, cellules humaines Hela) ont d'autre part été employées pour mesurer le niveau d'expression de protéines exogènes.
Les cellules Hela sont issues d'une lignée de carcinome épithélial humain ; elles possèdent une activité ElA-like, et sont donc capables, à forte multiplicité d'infection, de complementer en partie pour le gène ElA absent.
Les cellules Vero sont issues d'une lignée de.rein de singe ; elles ne permettent pas la réplication des virus défectifs pour la région ElA.
Toutes ces cellules ont été entretenues en milieu de EAGLE modifié DULBECCO, additionné de 10% de sérum de veau foetal et d'antibiotiques. PLASMIDES
Les différents plasmides ont été construits suivant des procédures standard connues de l'homme du métier, telles que celles décrites par SAMBROOK et al. [Molecular cloning : A Laboratory Manual ; Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] .
Le plasmide pMLPluc comprend le gène luciférase précédé des séquences leader des ARNm tardifs de l'adénovirus sous le contrôle du promoteur MLP de 1'adénovirus Ad2. Le plasmide pCMVcat exprime le gène CAT sous le contrôle du promoteur du gène immédiate early (IE) du cytomégalovirus.
La construction des plasmides conformes à 1' Invention exprimant des séquences dérivées du VA I est décrite plus en détail dans les exemples qui suivent. CONSTRUCTION DES ADENOVIRUS RECOMBINANTS
Les adénovirus porteurs des différents ARN-VA modifiés ont été construits par ligation entre : 1) des plasmides intégrant l' ITR de gauche, les signaux d'encapsidation et les signaux activateurs du gène ElA de l'adénovirus Ad5 (nt 1-352), ainsi que le gène VA I modifié et
2) la partie droite du génome d'Ad5 digéré par 1'enzyme Clal. Cette partie comporte le gène de type sauvage de l'ARN VA I (également dénommé ci-après VA I endogène) .
Les produits de ligation ont été transfectés dans des cellules 293. Les plages de lyse ont été isolées 10 à 15 jours plus tard. Après amplification, le DNA léger a été extrait par la technique de HIRT [GLUZMAN et al., J. Virology, 45, p. 91-103, (1983)] et la conformité de la construction a été vérifiée par analyse de restriction. Par construction, ces adénovirus ont un phénotype ElA-, E1B+.
DOSAGES DES ACTIVITES LUCIFERASE ET CAT
Le dosage de l'activité CAT a été réalisé par un test ELISA (BOEHRINGER) . Le dosage de l'activité luciférase a été effectué suivant une procédure standard (Kit Luciférase Assay System ,- PROMEGA BIOTECH) en utilisant un compteur à scintillation. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE pVAemP ET DU VIRUS Ad-VAenrp.
Le plasmide pVAemp a été construit comme
Un plasmide (pMLP-gl) similaire au plasmide pMLPIO-gD (ELOIT et al., J. Gen. Virol., 71, 2425-2431, 1990) a été utilisé. Le site EcoRI en position 0 de pMLP- gl a été supprimé par digestion, remplissage des extrémités par le fragment de Klenow de l'ARN polymérase II, et religation. Les séquences de ce plasmide comprises entre le site SacII (nucléotide 352) et Clal (nucléotide 2498) ont été délétées. La région 0-352 comprend l'ITR et les signaux d'encapsidation (nucleotides 0-352) du virus de l'Ad5. Ces derniers sont indissociables des signaux activateurs de la transcription du gène ElA (Elt I et
II) .
En aval du site SacII ont été clones :
- la partie 5' du gène VA I (nucleotides 1 à 77) , comprenant les deux séquences promotrices intragéniques A et B,
- un polylinker et
- les signaux de fin de transcription du gène EBER I du virus Epstein-Barr. Ces séquences (222 pb) ont été isolées par clivage Nsil du plasmide VAplEBER (Origine : T. Ragot, Unité des virus oncogènes, CNRS, Villejuif ,• ce plasmide est similaire, en ce qui concerne la région comprenant les séquences EBER I, à celui décrit dans la publication de VENTURA et al., [Nucl . Acid Res. 21, 14,- 3249-3255(1993)]). Le plasmide pVAemp est schématisé à la
Figure 2.
Légende de la Figure 2 :
ITR : séquence terminale inversée gauche de l'Ad5 Elt I, Elt II : signaux activateurs du gène ElA AI à AV : signaux d'encapsidation de l'adénovirus type 5 TTTT : signal de fin de transcription du gène EBER I du virus Epstein-Barr
Les chiffres non entourés correspondent à la séquence de l'Ad5. Les chiffres entourés renvoient à la séquence du VA I (nucléotide 1 : initiation de la transcription) .
Le plasmide pVAemp contenu dans la souche DH5 de E. coli a été déposé le 16 Janvier 1996, sous le numéro 1-1655 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, à Paris.
Le virus Ad-VAemp a été construit par digestion du plasmide pVAemp par Aatll et AccI et ligation avec le fragment droit du génome d'adénovirus Ad-gD (ELOIT et al., J. Gen. Virol., 71, 2425-2431, 1990) digéré au site Clal. Le produit de ligation est transfecté dans des cellules 293, et les virus recombinants sont isolés comme décrit ci-dessus, à la partie "Matériels et Méthodes". EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE p-VArib ET DU VIRUS Ad-VArib
Le plasmide p-VArib a été construit en clonant la séquence d'un ribozyme de l'ARNm du gène CAT (représentée à la figure 3, ainsi que dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 1) au site EcoRI-HindIII du lieur multi-sites de pVAemp.
Le virus Ad-VArib a été construit par digestion du plasmide p-VArib par Narl-Dral, et ligation du fragment Narl-Dral de 1061 pb avec le fragment droit du génome d'adénovirus Ad5 digéré au site Clal. Légende de la Figure 3 :
Caractères gras : séquences insérées dans le lieur multi-site de pVAemp
Caractères italiques : séquences ou séquences complémentaires des amorces ayant servi à réaliser la RT- PCR de détection de l'expression du gène Boîtes A et B : séquences promotrices intragéniques du VA I
Les séquences des sites de restriction ayant servi pour la construction sont soulignées. La fonctionnalité du vecteur d'expression de l'ARN VArib a été vérifiée par RT-PCR (rétretranscription suivie d'amplification par PCR) dans les cellules HeLa infectées par Ad-VArib.
Un contrôle a été effectué en utilisant comme témoin le virus Ad-gD. Ce dernier virus est defectif pour le gène ElA, et en outre intègre en partie gauche, (à l'emplacement ou sont clonées chez Ad-VArib, les séquences dérivées de VA I) , le gène gD du virus de la pseudorage. Les amorces utilisées sont les suivantes (ces amorces sont également indiquées sur la figure 3, et sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe, sous les numéros SEQ ID NO: 3 pour l'amorce gauche, et SEQ ID NO: 4 pour l'amorce droite) : Gauche : 5' AGCGGGCACTCTTCCGTGGTCTG 3' Droite : 5' AAAACATGCCGACCACCAGGGGT 3'
Ces amorces permettent l'amplification de la totalité des 198 bases de l'ARN Varib.
Un produit d'amplification de 198 pb est en effet observé pour le recombinant Ad-VArib. Au contraire, le virus Ad-gD donne un résultat négatif. Un témoin réalisé en omettant la phase de rétrotranscription s'est également révélé négatif, ce qui permet de vérifier que le signal obtenu pour Ad-VArib ne résulte pas d'une amplification des séquences de l'ADN viral.
EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DU PLASMIDE P-VAiβ ET DU VIRUS Ad-VAie
Le plasmide p-VAie a été construit en clonant une séquence antisens de l'ARNm du gène IE (immédiate early) du virus de la maladie d'Aujeszky (représentée figure 3, ainsi que dans la liste de séquence en annexe, sous le numéro SEQ ID NO: 2) entre les sites Smal et HindiII du lieur multi-sites de pVAemp.
Le virus Ad-VAie a été construit par digestion du plasmide p-VAie par AatlI-AccI et ligation du fragment AatlI-AccI de 1204 pb avec le fragment droit du génome d' adénovirus Ad5 digéré au site Clal.
EXEMPLE 4 : AUGMENTATION DU NIVEAU D'EXPRESSION DE GENES HETEROLOGUES PAR LE VIRUS Ad-VArib
Dans une première étude, le niveau d'expression du gène CAT dans des cellules infectées par Ad-VArib a été quantifié. Dans la mesure où il était initialement attendu un clivage de l'ARNm de CAT synthétisé après l'infection par le virus Ad-VArib, la stratégie suivante a été utilisée : une lignée cellulaire Hela exprimant le gène CAT sous le contrôle d'un promoteur inductible, à savoir le promoteur de la métallothionine murine (mMT) a été construite, et un clone cellulaire résistant à 1 'hygromycine a été isolé. Des cellules de ce clone ont été trypsinées puis infectées à une multiplicité d'infection de 100 TCID5o/cellule, soit par Ad-VArib, soit par Ad-VAemp utilisé à titre de témoin.
Seize heures après l'infection (T0) , la synthèse de CAT a été induite par addition de métaux lourds (concentration finale : ZnCl2 100 μM, CdCL2 1 μM) .
La synthèse de CAT a été suivie au cours du temps et comparée à celle des mêmes cellules en l'absence d'infection virale. La figure 4 présente les résultats obtenus . II apparaît clairement une augmentation du niveau de synthèse de CAT de 12, 5χ dans les cellules infectées par Ad-VArib par rapport aux cellules non infectées. Dans les mêmes conditions, le virus Ad-VAemp, contenant uniquement les 77 premiers nucleotides du VA I provoque une augmentation de synthèse de 7,5χ. En l'absence d'induction de la synthèse de la CAT par les métaux lourds, les virus Ad-VArib et Ad-VAemp ont permis respectivement une augmentation de 29χ, et de 5χ du niveau de synthèse de la CAT. II est donc apparent que les virus Ad-VArib et, à moindre titre, Ad-VAemp, sont capables d'augmenter la synthèse de protéines.
EXEMPLE 5 : AUGMENTATION DU NIVEAU D'EXPRESSION DE GENES HETEROLOGUES PAR LA CONSTRUCTION PVArib EN DEHORS D'UN CONTEXTE VIRAL.
Pour déterminer les séquences nécessaires pour augmenter le niveau d'expression de gènes hétérologues, 2χl06 cellules HeLa ont été cotransfectées par le plasmide pMLP-luc contenant le gène luciférase sous le contrôle du promoteur MLP, et les différents plasmides pVArib, pVAemp, et à titre de contrôle pMLPCAT. 72 heures plus tard, les cellules ont été prélevées et l'activité luciférase a été quantifiée.
Les résultats sont présentés dans le Tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Figure imgf000023_0001
Ces résultats montrent une augmentation importante (3,2x) du niveau de synthèse de la luciférase par le plasmide pVArib, alors que le plasmide pVAemp induit un effet inhibiteur. EXEMPLE 6 : INFLUENCE DU VA I ENDOGENE ET DE SEQUENCES EXOGENES DE VA I SUR L'AUGMENTATION DE LA SYNTHESE DE PROTEINES
Les Inventeurs ont effectué des essais comparatifs, en utilisant diverses constructions de génotypes différents en co-infection avec un adénovirus
(Ad-MLP-luc) defectif pour la région E1A/E1B, et codant pour la luciférase sous le contrôle du promoteur MLP.
Pour cette expérimentation, deux types de cellules ont été utilisées : les cellules 293, qui permettent la réplication des virus défectifs pour la région ElA (et une expression normale des séquences VA I endogènes des différents adénovirus utilisés) , et des cellules Vero, ne permettant pas la réplication des virus défectifs pour la région ElA, et dans lesquelles l'expression des séquences VA I endogènes ne se produit qu'à un niveau très faible.
200 à 250000 cellules Vero ou 293 ont été soit infectées par 100 TCID50 de virus Ad-MLP-luc, soit co- infectées par 100 TCID50 de virus Ad-MLP-luc et 100
TCID50 de l'un des virus suivants : Ad-gD, Ad-VAemp,
Ad-VAie Ad-VArib.
Le virus Ad-gD, qui possède des séquences VA I endogènes mais est dépourvu de séquences VA I exogènes (on désigne par ARN VA "exogène" un ARN VA I ou VA II résultant de la transcription d'un gène VA modifié, et/ou situé hors de son contexte naturel de transcription) , permet d'évaluer l'effet induit par le VA I exogène.
Les cellules 293 ont été récoltées 24 h après l'infection, soit à un moment où l'effet cytopathique est complet. Les cellules Vero ont été récoltées 4 jours après l'infection. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Figure imgf000025_0001
Les signes + ou - sur la deuxième et la troisième ligne du tableau indiquent l'existence, dans les cellules transfectées, de VA I endogène ou de VA I exogène.
Les chiffres de la quatrième et de la cinquième ligne indiquent la quantité (en ng) de luciférase synthétisée pour 106 cellules.
Ces résultats montrent que :
* Dans les cellules 293, la présence des séquences VA I exogènes portées par les virus Ad-VAemp, Ad-VAie et Ad-VArib n'a pas d'effet positif sur la synthèse de luciférase. Ceci peut s'expliquer par le fait que le VA I endogène qui s'exprime essentiellement en phase tardive de l'infection, suffit à l'augmentation du niveau de traduction des ARNm.
Au contraire, les trois virus Ad-VAemp, Ad- VAie et Ad-VArib semblent avoir un effet négatif sur la production de luciférase (peut-être en raison d'une dérégulation des étapes du cycle viral) .
* Dans les cellules Vero, les séquences VA I exogènes portées par les virus Ad-VAemp, Ad-VAie et Ad- VArib ont un effet positif net sur l'expression de luciférase.
Les constructions Ad-VAemp et AD-VAie permettent un doublement de la synthèse de luciférase
(1,9 à 2,8χ) par rapport à Ad-gD. La comparaison des résultats entre le virus témoin Ad-gD et Ad-VArib montre une augmentation de la synthèse de luciférase d'environ 10 fois en faveur de ce dernier.
Il doit être noté que les résultats illustrant la co-infection Ad-MLP-luc + Ad-gD montrent déjà un effet positif sur la synthèse de luciférase, bien que les deux virus Ad-MLP-luc et Ad-MLP-gD possèdent strictement le même gène VA I, qui ne s'exprime que très faiblement en phase précoce. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cet effet :
La co-infection par les deux virus conduirait à une meilleure efficacité d' internalisation dans la cellule : en effet, l'adénovirus est internalisé par un mécanisme d'endocytose médié par un récepteur (intégrines) qui interagit avec la protéine penton-base. Ce mécanisme est suffisant pour permettre la co- internalisation de molécules (par exemple de l'ADN) délivrées en association avec l'adénovirus. Il est donc possible d'envisager que l' internalisation d'un virion permettrait l'internalisation d'autres virions non liés directement au récepteur cellulaire.
- Alternativement, l'expression du gène E1B (qui est fonctionnel dans les constructions Ad-gD, Ad- VArib, Ad-VAemp et Ad-Vaie mais délété dans la construction Ad-MLP-luc) pourrait augmenter la transcription en phase précoce du VA I endogène des différents virus impliqués dans les expériences de co- infection [SOLLERBRANT et al., J. Virol., 67, p. 4195- 4204, (1993)] . La protéine E1B stabiliserait également l'ADN introduit, avec un effet indirect sur le niveau d'expression mesuré [HERRMANN et MATHEWS, Mol. Cell. Biol., 9, p. 5412-5423, (1989)] . Par contre, la protéine E1B n'ayant pas d'effet activateur connu sur le MLP, il est peu probable que la transcription du gène luciférase ait été augmentée [HERRMANN et al., Oncogène, 2, p. 25-35 (1987)] .
- Enfin, il est possible que l'ARN VA I soit plus efficace lorsqu'il est délivré en trans plutôt qu'en ci s .
EXEMPLE 7 ; ETUDE DE L'INFLUENCE DU PROMOTEUR ET DES SEQUENCES LEADER SUR L'AUGMENTATION DE L'EXPRESSION D'UN GENE EN PRESENCE DE SEQUENCES DERIVEES D'ARN VA I
Les expérimentations relatées dans les exemples 4 à 6 ci-dessus permettent de conclure que l'effet d'augmentation de la synthèse de protéines ne dépend pas de la région codante puisque des résultats comparables ont été obtenus pour la luciférase et la CAT.
II a également été recherché si l'effet d'augmentation de la synthèse de protéines était dépendant du promoteur contrôlant la transcription du gène hétérologue et/ou de la présence des séquences leader non traduites dans les ARNm viraux tardifs.
Le plasmide pCMV-CAT contient le gène CAT sous le contrôle du promoteur du gène "immédiate early" (IE) du cytomégalovirus (et donc en l'absence des séquences leader de l'adénovirus) . 2xl06 cellules HeLa ont été cotransfectées par le plasmide pCMV-CAT, et l'un des plasmides pVArib, pVAemp, ou à titre de contrôle, pMLP- lue. 72 heures plus tard, les cellules ont été prélevées et l'activité luciférase a été quantifiée.
Les résultats sont présentés dans le tableau
III ci-dessous.
Tableau III
Figure imgf000027_0001
On observe une augmentation importante
(supérieure à 7,7χ) du niveau de synthèse de la protéine CAT par le plasmide pVArib, alors que le plasmide pVAemp induit un effet plus limité (2,8χ) . Ces résultats démontrent que l'effet observé avec le plasmide pVArib n'est pas dépendant de la présence du promoteur MLP ni de celle des trois séquences leader non traduites des ARNm tardifs de l'adénovirus.
EXEMPLE 8 : UTILISATIONS DES SEQUENCES DERIVEES D'ARN VA I POUR AUGMENTER L'EXPRESSION D'UN GENE IN VIVO CHEZ LA SOURIS
Afin de confirmer les résultats obtenus en culture cellulaire, les expérimentations ont été effectuées chez la souris, en inoculant conjointement un dérivé d'ARN VA I conforme à l'Invention, et un adénovirus recombinant exprimant le gène d'intérêt que l'on souhaitait exprimer. Dans une première expérience, les souris ont été inoculées par voie intramusculaire, ou intraveineuse, avec l'adénovirus Ad-MLP-luc et, ou bien l'adénovirus Ad- gD (témoin) , bien l'adénovirus Ad-VAr. Les résultats de cette expérience sont résumés dans le tableau IV ci- dessous.
Figure imgf000029_0001
On voit que Ad-VAr a un effet positif marqué sur la synthèse de luciférase dans le foie (χ4600) , et, avec une efficacité plus faible, dans les poumons (x33) , après inoculation conjointe par voie intraveineuse avec Ad-MLP-luc.
En revanche, l'effet observé est seulement marginal et probablement non significatif dans le muscle après inoculation intramusculaire (xi,96) . Il est supposé que cette différence reflète en grande partie la probabilité d'infection de la même cellule par un nombre suffisant des deux types de particules adénovirales, dans la mesure où il a été préalablement observé que cette probabilité était maximale dans le foie et à un degré moindre dans les poumons après inoculation intraveineuse du virus recombinant [OUALIKENE et al. , Journal of Virology, 69, p. 6518-6524, (1995)] . On sait d'autre part que la probabilité d'infection des cellules musculaires est relativement faible chez les souris adultes [ACSADI et al., Hum. Mol. Genêt. 3, p. 579-584, (1994)] . Il est supposé que la compétition entre les deux virus pour les récepteurs cellulaires des adénovirus masque un effet positif possible de Ad-VAr.
Dans une deuxième série d'expériences, une approche plus sensible a donc été utilisée pour évaluer l'efficacité de Ad-VAr quand celui-ci est inoculé par voie intramusculaire. Cette approche est basée sur l'évaluation de la réponse immunitaire contre le produit d'un gène étranger. Dans ce but, le virus Ad-gD, qui comprend le gène PRV gD et qui est capable de protéger les souris contre une infection par le PRV [ELOIT et ADAM, Journal of General Virology, 75, p. 1583-1589, (1995) ,- GONIN et al., Vaccine, 14, p. 1083-1087, (1996)], a été choisi.
Il a été supposé que si le niveau d'expression du gD pouvait être augmenté par Ad-VAr, la dose de Ad-gD ayant un effet protecteur serait abaissée. Des expériences préalables effectuées sur la souris avec Ad-gD ont démontré que la dose protégeant 100% des animaux par voie intramusculaire, dans le cas d'une infection standard (20-30 LD50 par voie intrapéritonéale) était égale à 109 TCID50.
Pour démontrer l'efficacité de Ad-VAr, des doses plus faibles de Ad-gD (respectivement 108 et 107 TCID50) ont été choisies, et inoculées par voie intramusculaire en même temps que 109 TCIDS0 de Ad-VAr, ou à titre de témoin, 109 TCID50 de Ad-MLP-luc. La dose de 109 TCID50 a été choisie afin d'obtenir une probabilité maximale de co-infection des cellules par ces virus.
Les résultats sont illustrés par le Tableau V ci-dessous.
TABLEAU V
Figure imgf000031_0001
Comme attendu, le virus Ad-gD à une dose de 107 TCID50, co-inoculé avec Ad-MLP-luc ne protège pas efficacement les souris contre l'infection (20% comparé à 0% chez les souris contrôle) . En revanche, la même dose injectée en même temps que Ad-VAr, protège 80% des souris, ce qui est identique au niveau de protection induit par Ad-gD seul à une dose 10 fois plus élevée.
Un effet positif est également observé lorsque Ad-VAr est co-inoculé avec une dose d'Ad-gD de 10e TCID50. Bien qu'il apparaisse moins distinctement en ce qui concerne le niveau de protection conféré (100%) par rapport à la co-inoculation Ad-MLP-luc (80%) , cet effet est toutefois nettement identifiable par le niveau de la réponse anticorps. En conclusion, il apparaît que Ad-VAr a permis de diviser par 10 la dose de Ad-gD qui est nécessaire pour obtenir une protection lorsqu'elle est utilisée par voie intramusculaire.
LISTE DE SEQUENCES
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 194 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GGCACTCTTC CGTGGTCTGG TGGATAAATT CGCAAGGGTA TCATGGCGGA CGACCGGGGT 60
TCGAACCCCG GATCCCCCGG GCAAAATTCG AGCAACTCTG ATGAGTCCGT GAGGACGAAA 120
CTGAAATGGA TCCTCTAGAG TCGACCTGGA GCCCAAGCTT ATCGATTTCG AACCCCTGGT 180
GGTCGGCATG TTTT 194
INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 217 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GGCACTCTTC CGTGGTCTGG TGGATAAATT CGCAAGGGTA TCATGGCGGA CGACCGGGGT 60 TCGAACCCCG GATCCCCCGA CTGCAGGCCG CGCGCCGGGA GCCCTGGCTG CCGCCGTCGG 120 GGCCGGACGC GATGCCCTCT TCCTCGGCCG GGGCGGCGGC CGCCAGGAGC TGGTTCGAAG 180 CTTATCGATT TCGAACCCCT GGTGGTCGGC ATGTTTT 217 INDICATIONS RELATIVES A UN MICRO-ORGANISME DEPOSE
(règle 136» du PCT)
I I
i — ι I I
la nature générale des indications
le
Figure imgf000034_0001
Formulaire PCT/RO/134 Ouillet 1992)

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'une construction d'ADN recom¬ binant dérivée du gène d'un ARN VA I, et qui comprend au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III, et, sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, une séquence Sx dont le produit de trans¬ cription peut former une structure identique ou similaire à celle de l'extrémité du duplex apical d'un ARN VA I d'adénovirus, et une séquence S2 choisie de manière à ce que les produits de transcription desdites constructions d'ADN recombinant constituent des mutants d'ARNs VA I dans lesquels le domaine central du VA I est au moins partiellement délété ou substitué par une séquence diffé¬ rente de la séquence de type sauvage, pour stimuler la traduction des ARNm dans une cellule-hôte hébergeant ladite construction.
2) Utilisation du bloc A et du bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III et de séquences Sx et S2 telles que définies dans la revendication 1, pour l'obtention d'une construction d'ADN recombinant destinée à stimuler la traduction des ARNm dans une cellule-hôte hébergeant ladite construction.
3) Utilisation selon une quelconque des revendications l ou 2 caractérisée en ce que ladite construction comprend en outre au moins un site de restriction pour le clonage d'une séquence d'ADN hétéro¬ logue sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur PolIII.
4) Utilisation selon une quelconque des revendications l à 3, caractérisée en ce que ladite cons¬ truction comprend en outre une séquence d'ADN qui consti¬ tue un signal de fin de transcription reconnu par l'ARN polymérase III.
5) Construction d'ADN recombinant caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - un promoteur chimérique reconnu par la poly¬ mérase III et constitué par l'association d'au moins une séquence d'ADN qui constitue un élément activateur de transcription d'un promoteur PolII, et d'une séquence d'ADN comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III ,• et, sous con¬ trôle transcriptionnel dudit promoteur
- au moins une séquence Si telle que définie dans la revendication 1, et - une séquence d'ADN qui constitue un signal de fin de transcription reconnu par l'ARN polymérase III.
6) Construction d'ADN recombinant selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant qu'élément activateur de transcription PolII, les signaux activateurs de la transcription du gène ElA d' adénovirus .
7) Construction d'ADN recombinant selon une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence S2 telle que défi- nie dans la revendication 1
8) Construction d'ADN recombinant selon une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins :
- les nucleotides 0 à 352 de l'adénovirus Ad5 - les nucleotides 1 à 77 du gène VA I de l'adénovirus Ad2 ;
- le signal de fin de transcription du gène EBER I du virus d'Epstein-Barr.
9) Construction d'ADN recombinant telle que définie dans une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences représentées dans la liste de séquences en annexe, sous les numéros SEQ ID NO: 1, et SEQ ID NO: 2. 10) Utilisation d'une construction d'ADN recombinant telle que définie dans une quelconque des revendications 1 à 9, pour l'obtention d'un vecteur per¬ mettant d'augmenter l'expression d'une protéine d'intérêt dans une cellule-hôte. il) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une construction d'ADN selon une quelcon¬ que des revendications 5 à 9.
12) Adénovirus recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu par insertion dans un adénovirus d'une séquence d'ADN comprenant au moins le bloc A et le bloc B d'un promoteur reconnu par la polymérase III et une séquence S^. telle que définie dans la revendication 1, placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
13) Adénovirus recombinant selon la revendica¬ tion 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un gène VA I endogène.
14) Adénovirus recombinant selon une quelcon¬ que des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que ledit adénovirus est defectif pour la région ElA et/ou E1B. 15) Utilisation d'une construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 9, d'un vecteur recombinant selon la revendication 11, ou d'un adénovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 14, pour l'obtention d'un médicament permettant d'augmenter l'expression d'au moins une protéine d'intérêt dans une cellule-hôte.
16) Utilisation d'une construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 9, d'un vecteur recombinant selon la revendication 11, ou d'un adénovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 14, pour l'obtention d'un vaccin.
17) Utilisation d'une construction d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 8, d'un vecteur recombinant selon la revendication 11, ou d'un adénovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 14, pour la production de protéines d'intérêt dans des cultures de cellules.
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