WO2004080378A2 - Methodes et outils pour le criblage d’arn actifs in cellulo - Google Patents

Methodes et outils pour le criblage d’arn actifs in cellulo Download PDF

Info

Publication number
WO2004080378A2
WO2004080378A2 PCT/FR2004/000499 FR2004000499W WO2004080378A2 WO 2004080378 A2 WO2004080378 A2 WO 2004080378A2 FR 2004000499 W FR2004000499 W FR 2004000499W WO 2004080378 A2 WO2004080378 A2 WO 2004080378A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
cells
random
sequence
library
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/000499
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004080378A3 (fr
Inventor
Sylvie Barcellini-Couget
Alain Doglio
Original Assignee
Biointerference
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biointerference filed Critical Biointerference
Priority to EP04716629A priority Critical patent/EP1599604A2/fr
Priority to US10/547,489 priority patent/US20070122798A1/en
Publication of WO2004080378A2 publication Critical patent/WO2004080378A2/fr
Publication of WO2004080378A3 publication Critical patent/WO2004080378A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules

Definitions

  • the present invention relates to methods and compositions for screening and selection of active RNA in cellulo. It relates in particular to methods of preparing and producing banks of AKN expression cassettes or banks of cells encoding random RNAs, as well as their uses for the selection of active RNAs capable of producing or altering a cell phenotype d 'interest.
  • the invention also relates to the use of the active RNAs identified for the purpose of discovery of new genes (“drug discovery”), validation of gene function, development of pharmacological tools, diagnosis or for therapeutic purposes with in particular the possibility of correcting, thanks to RNAs, the expression of pathogenic phenotypes in a cell in vitro, ex vivo or in vivo, particularly in human and animal cells.
  • the possibility of acting or of specifically interfering with biological targets can have multiple applications, in particular in the therapeutic, diagnostic, vaccine or experimental fields.
  • the ability to regulate the expression of a gene can make it possible to block or restore activity in a cell and / or to correct a pathology.
  • the ability to block the expression of pathogen genes can stop their development, etc.
  • the expression of a gene results from the superposition of several stages including the synthesis of messenger RNA, the intracellular metabolism of this RNA, the production of the protein and finally the stability and activity of this protein. Inhibiting the expression of a gene therefore consists in acting on one of these stages.
  • other metabolites, signaling pathways or cellular components can be targeted such as sugars, lipids, nucleosides, etc.
  • RNAs appear as powerful tools capable of acting effectively, specifically and in a discriminating manner on most stages of gene expression or on biological targets.
  • plasticity structural RNA generates a variety of structural motifs capable of binding with most biological targets, and in particular of organic molecules present in cells (RNA, DNA, proteins and various metabolites such as lipids, sugars, etc.).
  • the interactions involved are generally very specific, which gives RNA a high selectivity with respect to its target, and the intracellular accumulation of RNA is neither toxic nor immunogenic.
  • RNAs are selective and non-toxic for the organism.
  • Different strategies have been envisaged in the prior art for identifying or manufacturing such RNAs. Mention may in particular be made of the SELEX technology, intended for manufacturing and selecting in vitro random structural RNAs (Gold, 1995). Mention may also be made of approaches aimed at expressing banks of antisense RNA or of ribozymes in cells, in order to test their biological activity (WO99 / 41371, WO99 / 32618, WO98 / 32880).
  • the present application overcomes the drawbacks of the prior art.
  • the present application now provides new methods and new tools for the production, expression and selection in cells, in particular of mammals, of so-called "active" RNA sequences.
  • the present invention resides in particular in the development of specific conditions for the preparation and screening of active RNAs, making it possible to select particularly advantageous candidate compounds.
  • the invention is based in particular on the use of specific constructions, allowing the RNA sequences to be expressed and localized inside the cell, in an active and stable conformation, and in selected compartments.
  • the invention is also based on the design and use of specific expression cassettes ensuring high expression efficiency in mammalian cells and having an inducible character.
  • the invention further describes the construction of improved viral vectors, allowing efficient and large-scale selection of active RNAs, and the production of products which can be directly used for therapeutic applications.
  • the active RNA motifs are thus selected directly in the cell, using innovative approaches, and in particular according to the approach designated by the name "SECAR" ("Selective Enrichment of Cellular Aptamer RNA").
  • a first aspect of the invention therefore relates to methods of selection, identification or optimization in cellulo of active RNA.
  • the methods of the invention can be adapted for the selection in cellulo of active RNA capable of conferring on a cell a desired phenotype, including active RNA capable of altering the activity of a determined biological target.
  • the methods of the invention more particularly include:
  • each species of retrovirus comprising an expression cassette derived from a VA gene of an adenovirus, optionally made inducible, expressing a separate random structural RNA, or part thereof, with a population of cells under conditions allowing the infection of said cells by said recombinant retroviruses,
  • VA RNA stable RNA structure
  • aptRNA composed of a part common to all the aptRNAs (the VA shuttle) which is used to stabilize, present and transport the active motif in the cell.
  • This type of intracellular vehicle for aptamer is innovative and makes it possible to considerably improve the intracellular production of RNA aptamers compared to the techniques of the prior art.
  • the direct production and selection, in cells, of active RNA stabilized according to the invention is advantageous because it makes it possible to select molecules already found in an active intracellular conformation.
  • steps 1) to 3) can be repeated one or more times from the cassettes or active RNAs identified in step 3), in order to improve, as and measurement of cycles, selection and / or quality of active RNAs, and / or of adapting or modulating their properties.
  • the starting nucleic acid bank may be more or less complex and more or less constrained.
  • it may be an unconstrained random library, or a library produced from the sequence of a given target gene or comprising imposed motifs or residues, depending on the profile of the active RNA sought.
  • RNAs pre-selected in vitro can also be a bank pre-selected in vitro, in particular a bank encoding RNAs pre-selected in vitro, for example a bank produced from the RNA sequence selected in vitro for a particular property (for example their ability to bind to a target of interest).
  • the advantage of a method is to select, not an RNA structural motif considered in isolation outside the context of its intracellular expression, but a global molecular entity, aptRNA, having an affinity for a pre-identified target and already in a conformation conforming to that of its intracellular expression.
  • step 3) of the last cycle carried out (or possibly of one or more or of any intermediate cycle), an additional step 4) can be implemented, in order to confirm the biological activity of the selected active RNA (s).
  • the invention therefore proposes an innovative combination of particular genetic elements, according to a particular selection methodology, thus forming a global, integrated and simplified concept of phenotypic screening.
  • the tools and methods described in the present application have numerous advantages.
  • the invention shows that expression cassettes derived from an adenovirus VA gene can be integrated and expressed in the context of a retroviral vector.
  • Retroviral transfer is very efficient and allows the number of integrated copies per cell to be controlled, and the constructed cassettes, derived from VA genes, form integrated cassettes, that is to say containing all the information necessary for efficient transcription (promoter , Stop signal, structure responsible for the stability of RNA in the cell, structure responsible for the export of RNA to the cytoplasm, various possibilities for the insertion of exogenous sequences and fairly wide tolerance with respect to the promoter).
  • the invention further shows that the genetic structure of the constructs can be modified to direct and determine the intracellular localization of the RNA produced (nucleus, cytoplasm) and to make expression inducible in a simple manner.
  • retroviral transfer and a cassette derived from a VA gene therefore makes it possible to obtain high and controlled levels of expression in most cell lines and to use identical RNA constructs in vitro and in cellulo. , thus ensuring a more efficient selection of active molecules and faster validation of the identified active cassettes.
  • the invention is applicable in many fields, and in particular to validate the function of a gene, to search for new targets involved in a cellular function, to find and produce new molecules for diagnosis, pharmacology or therapeutics, etc.
  • a particular object of the invention relates to a library of nucleic acids characterized in that it comprises a plurality of species of recombinant viruses, each species of virus comprising an expression cassette expressing a random RNA (and / or active) distinct under the control of a promoter transcribed by RNA polymerase III, in particular derived from the sequence of a VA gene of adenovirus.
  • the RNA may be a random structural RNA or one of defined sequence.
  • the viruses are recombinant retroviruses.
  • RNA expression cassettes comprising a sequence encoding said RNA inserted into a promoter derived from a VA gene of an adenovirus, said promoter being able to further comprise a sequence conferring a inducibility and / or a modification which makes it possible to retain the RNA in the nucleus.
  • the invention also relates to any vector comprising such an expression cassette, as well as recombinant cells containing them.
  • the subject of the invention is also any composition comprising an active RNA, a cassette, a vector or a cell as defined above and or identified or produced by the selection process described in the invention.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising an active RNA, a cassette, a vector or a cell as defined above, and a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises an active RNA, said active RNA comprising an active sequence inserted into a
  • Modified VA RNA said modified VA RNA comprising an RNA motif ensuring its localization in the cell nucleus and / or a sequence conferring an inducible character.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises the active RNA sequence or the active motif identified within the active RNA.
  • This active RNA sequence or this isolated RNA active motif can also be subsequently modified chemically, for example so as to improve its stability in solution.
  • the invention also relates to tools, constructions, lines, etc., useful for the production of the compositions defined above, in particular modified VA genes, modified tRNA genes, modified U6 cassettes, vectors or cells comprising them, and their uses.
  • the invention further relates to methods of producing pharmaceutical compositions, comprising (i) screening a library of random RNAs as described above, making it possible to obtain an expression cassette for an active RNA and (ii ) packaging the cassette or the active RNA sequence in any pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the invention is useful for the identification, production, expression and / or selection of any RNA active on cells, in particular of mammals. It allows the preparation of compounds active in different situations, in particular for the production of therapeutic agents, in particular anti-infectives, anti-cancer, acting on the metabolism of the cell, acting on the differentiation processes of the cell, on the growth capacity of the cell, etc. As indicated above, the invention offers numerous advantages compared to the prior art, and in particular allows the direct, rapid and simple selection of active RNA molecules in cells.
  • FIG. 1 describes the VA1 gene of the adenovirus type 2 as well as its transcript.
  • FIG. 1A represents the nucleotide sequences of the VA1 -RNA gene (transcribed region) (SEQ ID NO: 1).
  • the underlined nucleotides 93 to 118, corresponding to the sequence of loop IV, are deleted in the construction VA ⁇ IV (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 1B represents the secondary structure of the VA1 RNA of PAdenovirus type 2, obtained according to the Mac DNASIS Pro V3.6 software. The deleted part in the RNA
  • VA ⁇ TV is indicated by two arrows (nucleotides 93 to 118). Nucleotide 120 is mutated in the VA ⁇ IV construct (C is mutated to T).
  • FIG. 2 represents the comparative study of the production and of the cellular localization of the RNA VAl, VA ⁇ IVSrf and VATAR *.
  • FIG. 2A TAR * sequence (SEQ ID NO: 23) inserted into the Srfl restriction site of the VA ⁇ IVSrf gene to generate the VATAR * gene.
  • the TAR * oligonucleotide is derived from the TAR sequence of the Human Immunodeficiency Virus (HTV-1) (Yamamoto et al., 2000).
  • Figure 2B Analysis of the expression of RNA VAl, VA ⁇ IVSrf and VATAR * by Northern Blot. The different RNAs are extracted from cells 293, 48 hours after transfection of these cells with plasmids containing the VAl, VA ⁇ IVSrf and VATAR * ' genes.
  • Figure 2C Study of the cellular localization of the RNAs VAl, VA ⁇ IVSrf and VATAR * in human cells 293.
  • the RNAs are visualized by in situ hybridization, 48 hours after transfection of these cells with plasmids containing the genes VAl, VA ⁇ IVSrf and VATAR *.
  • FIG. 3 represents the promoter of the human U6 snRNA gene (Genebank access: X07425).
  • the elements required for the recruitment and activity of RNA polymerase. type III are the DSE (Distal Element Sequence: nucleotides -221 to -216), the PSE (Proximal Element Sequence: nucleotides -64 to -46) and the TATA box (TATA Box: nucleotides -31 to -24).
  • TATA Box nucleotides -31 to -24.
  • GTCGAC Sal I restriction site
  • G the first nucleotide transcribed being the first nucleotide of this site
  • FIG. 4 represents the secondary structure of the VA ⁇ IV RNA obtained with the Mac DNASIS Pro V3.6 software.
  • FIG. 5 represents the secondary structure of the VA ⁇ IVSrf RNA obtained with the Mac DNASIS Pro V3.6 software.
  • FIG. 6 describes the characteristics of the nVA ⁇ IVSrf RNA (nuclear localization).
  • Figure 6A Sequence of the gene encoding the RNA . nVA ⁇ IVSrf (SEQ ID NO: 4).
  • the nucleotides noted in bold, from 13 to 24 and from 59 to 68, representing respectively box A and box B, are the elements necessary for the transcription of the VA1 gene by RNA polymerase type III.
  • Nucleotides 138 to 141 (TTTT), noted in bold, represent the signal to stop transcription of polymerase III.
  • the restriction site Srf I (93 to 100) appears underlined.
  • Nucleotides 120, 121 and 122 written in lowercase represent the mutations introduced into the VA ⁇ IVSrf RNA to alter the terminal helix and give this RNA a nuclear localization.
  • Figure 6B Diagram of the secondary structure of the nVA ⁇ IVSrf RNA obtained with the DNASIS Pro V3.6 software.
  • Figure 6C Study of the cellular localization of nVA ⁇ IVSrf RNAs.
  • the RNAs are visualized by in situ hybridization, 48 hours after transfection of the 293 cells with a plasmid containing the VA ⁇ IVSrf gene.
  • FIG. 7 shows the different inducible VA genes (VAi): their sequences, the sequences of the different DNA oligonucleotides which were used for their construction as well as the study of their level of cellular expression. .
  • Figure 7A Sequences of the VAiO (SEQ ID NO: 15), OVAi (SEQ ID NO: 16) and OVAiO (SEQ ID NO: 17) genes. The sequences are numbered from point +1 of transcription; the sequences located upstream are numbered negatively. The sequences of Boxes A and B, as well as the transcription stop signal, are noted in bold. The operating sequence TetOl is underlined; the Srfl cloning site is noted in italics.
  • Figure 7B Sequences of the oligonucleotides used to construct the VAi genes by primer extension reaction or by polymerization chain reaction.
  • the sequences of Boxes A and B as well as the transcription stop signal are noted in bold.
  • the TetOl operating sequences are underlined; the Srfl and PvuII cloning sites are noted in italics.
  • the complementary regions between the oligonucleotides VAi up (SEQ ID NO: 18) and VAi down (SEQ ID NO: 19) appear in lowercase letters.
  • VAi PvuII (VAi PvuII 5 '(SEQ ID NO: 20), VAi PvuII 3' (SEQ ID NO: 22) or OVAi PvuII 5 '(SEQ ID NO: 21)) with the coding regions VAi genes are also shown in lower case.
  • FIG 7C Analysis of the expression of VAi RNA in Hela T-Rex cells after induction by doxycycline (Dox).
  • the different VAi genes OVAi, VaiO and OVAiO
  • the cells of the packaging line 293GP were used for the production of the BabeVAi recombinant retroviruses.
  • the Hela T-Rex cells Invitrogen ref: R714-07 which express the TetR repressor were transduced by the various recombinant retroviruses babeVAi.
  • VAi genes were activated by the addition of Doxycycline (Dox: 1.5 ⁇ g / ml).
  • Dox 1.5 ⁇ g / ml
  • the RNAs were extracted at the times indicated and the expression of the VAi RNAs was analyzed by Northern blot.
  • Figure 8 shows the secondary structure of the VAiO RNA obtained with the DNASIS Pro V3.6 Mac software. The region corresponding to the tetOl sequence is limited by arrows.
  • FIG. 9 represents the secondary structure of the h9U6, h20U6 and nh20U6 RNAs obtained with the Mac program DNASIS Pro V3.6.
  • the . RNA schematized in this figure represent the invariant basic structures of these RNA (shuttle part).
  • the active RNA motif is cloned into the Sfr I site indicated by an arrow.
  • FIG. 10 represents the retroviral vector pBabe (Morgenstern and Land,. 1990).
  • the Nhe I site corresponds to the cloning site of the various expression cassettes of the active RNAs.
  • Figure 11 shows the relationship that may exist between the level of expression of an active RNA and its biological activity.
  • the active RNA used here is the TAR * aptamer described in FIG. 2B.
  • This TAR * motif corresponds to an RNA motif capable of repressing the replication of the human immunodeficiency virus (HIV).
  • This TAR * motif was cloned into the Sfr I site of the VA ⁇ IVSfr cassette.
  • the VATAR * construct was inserted into the Nhel cloning site of the pBabe retroviral vector (see FIG. 10).
  • the cells of the 293 GP packaging line were used for the production of the Babe and Babe / VATAR * recombinant retroviruses.
  • the anti-HIV efficacy of VATAR * was measured using the P4 indicator cells which constitute a system commonly used to study the multiplication of HIV (Chameau et al., 1994).
  • the P4 cells were transduced by the Babe and Babe / VATAR * retroviruses and selected by the addition of puromycin.
  • the level of expression of VATAR * RNA was analyzed by Northern-blot within the selected P4 cell population (parental population), as well as in 2 independent cell clones (clones 1 and 4) isolated from this population.
  • the infection of these different cellular systems by HIV-1 demonstrates that clone 1 expressing a high level of VATAR * RNA more effectively resists the multiplication of HIV.
  • the HIV-1 infection rate is estimated by measuring the activity of the reporter gene ⁇ -galactosidase contained in the P4 cells and the results are presented as a percentage of the maximum infection.
  • Figure 12 depicts an application of the method for selecting active RNA from a library of random RNA expression cassettes cloned into the retroviral vector pBabe.
  • FIG 12A The different stages of synthesis of the library of random sequences.
  • the library of single-stranded DNA oligonucleoties comprises from 5 'to 3': 8 fixed bases highlighted (run A), 26 random bases then 8 fixed bases highlighted (run B).
  • the run A oligonucleotide, complementary to Run B, is hybridized with the library of single-stranded DNA oligonucleotides and extended thanks to Kleenow's DNA polymerase fragment. This neosynthesized double-stranded DNA is called a random double-stranded DNA library.
  • Figure 12 B Random Babe VA vector library.
  • the library of random Babe VA recombinant retroviral vectors is generated by cloning the library of random double-stranded DNA into the Srf I site of the VA ⁇ IV Srf gene.
  • This library therefore consists of a collection of VA ⁇ IV Srf RNA expression cassettes, each containing a random motif and cloned into the retroviral vector pBabe.
  • Figure 12 C Method for selecting clones of Hela cells resistant to staurosporine.
  • the random Babe VA vector library is transfected into packaging cells of the 293GP line to produce the random VA retrovirus library.
  • This retroviral library is used to transduce the library of random cassettes in the cells of the Hela line so that each transduced cell contains on average a single random VA cassette.
  • cell papoptosis is induced by adding staurosporine (0.8 ⁇ M - 6 h).
  • Staurosporin-resistant cells are amplified as cell clones and cassettes of expression of the active RNAs present in each of the clones are analyzed. At this stage,
  • Figure 12D Validation of the anti-apoptotic activity of the RNAs identified using the SECAR selection process.
  • the selected active RNA expression cassettes (in Figure 12C) were cloned into the plasmid pBabe. These recombinant plasmids were used to produce recombinant retroviruses by transfection of the cells of the packaging line 293GP.
  • Two different cell lines (Hela and Jurkat) were independently transduced with the different retroviral supernatants (clone 2, 5, 9, 11, 13, 14, 15 16, C, J, L, and N) and selected by puromycin.
  • the total cellular RNAs from these different populations of transduced cells were extracted and then analyzed by Northern blot.
  • Figure 12 E Individual validation of the anti-apoptotic activity of the RNAs identified using the SECAR process.
  • the populations of Hela and Jurkat cells expressing the active RNAs selected in FIG. 12C were subjected to tests for resistance to staurosporine (0.8 ⁇ M for 6 hours).
  • Hela cells The results presented in the histogram reflect the number of cells resistant to staurosporine (Arbitrary unit).
  • Jurkat cells The results presented in the histogram correspond to the percentage of cells resistant to staurosporine (Measurement of mitochondrial membrane permeability).
  • Figure 13 illustrates the process of the invention with a constrained library pre-selected in vitro (iv SECAR). Use of inducible expression cassettes.
  • Figure 13 A Construction of a library of random VAiO transcription cassettes.
  • Step 1 the Sens bank and Antisens iv bank oligonucleotides are hybridized and then extended by DNA polymerase Kleenow fragment to generate the library of random VAiO fragment.
  • Step 2 the library of random VAiO expression cassettes is obtained by chain polymerization reaction thanks to the use of a Taq DNA polymerase using for matrix the library of random VAiO fragment and sense oligonucleotides VAi5 'and antisense VAi end Bank.
  • Step 3 the library of random T7 VAiO transcription cassettes is obtained by chain polymerization reaction thanks to the use of a Taq DNA polymerase using the library of random VAiO transcription cassettes and the oligonucleotides VApT7 in 5 ′ and VA end in 3 '.
  • the RNAs are synthesized in vitro using the DNA polymerase of bacteriophage T7, then are visualized on agarose gel after staining with Ethidium Bromide (200 ng per lane).
  • FIG. 13C Obtaining transcription cassettes derived from the VA gene from RNAs synthesized in vitro.
  • An RT-PCR reaction is carried out using different RNA substrates synthesized in vitro using the oligonucleotides VapT7 and VA end.
  • the transcription cassettes corresponding to the various VA RNAs were obtained: VA ⁇ IV Srf expression cassette obtained from the VA ⁇ IV Srf RNAs; VATAR * expression cassette obtained from VATAR * RNAs; random VAiO expression cassette obtained from random VAiO RNAs.
  • VA ⁇ IV Srf, VATAR * and VAiO random allows an equimolecular mixture of the corresponding cassettes to be obtained.
  • the RT-PCR reaction products are visualized on 2% agarose gel after staining with Ethidium Bromide.
  • Figure 14 provides an example of U6 / VA hybrid gene construction.
  • the first step consisted in introducing the promoter of the murine U6 gene into the Nhel site of the plasmid pBabe.
  • the murine U6 gene promoter (mU6) was obtained by chain polymerization reaction using the primers mU6 upstream and mU6 downstream.
  • the primer mU6 downstream four bases have been added (in italics, bold and underlined). The addition of these bases made it possible to generate the Pmel site indicated in the pBabe mU6 / VAiO construction.
  • the four underlined AAAC bases correspond to the last four bases of the U6 promoter and to the first four bases of the restriction site Pme I (GTTTAAAC).
  • the matrix used corresponds to the genomic DNA of murine cells.
  • the product of this polymerase chain reaction was purified, then ligated into the plasmid pBabe digested with Nhe I.
  • the ligation product is called pBabe mU6.
  • the second step consisted in inserting the VAiO gene into the Pmel site of the plasmid pBabe mU6.
  • the VAiO gene was produced by a polymerase chain reaction using the primers VAiO Start and VAiO End Nhel, the template being the plasmid pBabe VAiO.
  • the VAiO End Nhel primer contains the Nhel restriction site marked in bold and underlined.
  • the product of this reaction was purified and then ligated into the plasmid pBabe mU6 digested with Pmel.
  • the ligation product is called pBabe mU6 / VAiO.
  • FIG. 15 provides a general description of the active RNA screening strategies according to the invention.
  • Panel A Process for the selection of inducible active RNA (SECAR) expression cassettes: This process allows the selection in cellulo of RNA capable of conferring on a cell a given phenotype.
  • the phenotypic screening presented in this panel is carried out through the use of inducible expression cassettes; it is carried out in six stages.
  • Step 1 The library of random RNA expression cassettes is transferred to the cells of interest, via a retroviral vector. The transfer is thus optimized: it is suitable for all cell types and allows you to control the number of cassettes inserted per cell.
  • Step 2 The cells that have integrated the new genetic material (random RNA expression cassette) are selected using a selection gene present in the retroviral vector.
  • Step 3 Thanks to the use of inducible expression cassettes, the expression of the cassettes is induced in order to activate the transcription of the random RNAs.
  • Step 4 The selection of cells which express the active RNAs and which have the phenotype of interest is carried out. These cells are amplified.
  • Step 5 (optional): The active RNA expression cassettes present in the cells selected in this step can be copied and transferred again to the cells of interest. Thus steps 1 to 4 can be repeated as many times as necessary.
  • Step 6 In the cell clones obtained at the end of step 4 or 5, the activity of the cassettes is validated by comparison of the induced or repressed states.
  • RNA was validated as an 5 active RNA when the desired cell phenotype is observed only in the condition for which the expression cassette is induced. On the contrary, RNA is not validated as active RNA when the desired cell phenotype is observed regardless of the conditions: induced expression cassette or repressed expression cassette.
  • Panel B Method for selecting active RNA expression cassettes after prior enrichment in active sequences (ivSECAR for "in vitro Selective Enrichment of Cellular Aptamer RNA”)
  • This method allows the selection in cellulo of RNA capable of conferring on a cell a given phenotype.
  • the screening is carried out using a library of random RNAs, enriched in RNA capable of binding a given target.
  • the first stages of screening are carried out in vitro, using a random RNA bank; the RNAs used for in vitro screening have a structure identical to those which will be expressed in cellulo in the subsequent steps.
  • Step 1 From a library of random RNA transcription cassettes, the random RNA library is produced in vitro.
  • RNAs thus synthesized in vitro have the same structural properties as the RNAs which are synthesized in cellulo, from a library of random RNA expression cassettes.
  • Step 2 The random RNA bank is contacted with the target of interest.
  • Step 3 The RNA capable of binding the target are retained using an appropriate process.
  • Step 4 The RNAs retained at the end of step 3 are used to produce a new library of random RNA transcription cassettes, enriched with active sequences. Steps 1 to 4 are thus repeated at will. At the end of step 4, a “restricted” library of active RNA expression cassettes is obtained. Step 5: This restricted library is subsequently used in cellular tests according to the SECAR method described in panel A. Detailed Description of the Invention
  • the invention relates, in general, to tools and methods for in cellulo selection of active RNA capable of conferring on a cell a desired phenotype, as well as the use of these active RNA or of any DNA coding in the experimental field or pharmaceutical, for example.
  • the invention uses, in a particularly advantageous manner, the combination of retroviral vectors and cassettes derived from VA genes, allowing a simple, effective and predictive screening, in vitro as in vivo.
  • the present invention is suitable for the production, expression and / or selection of any active RNA molecule, that is to say RNA molecules capable of interacting with and / or altering the activity of biological components, and / or of conferring on a cell a given phenotype.
  • active RNA includes in particular structural RNA (such as aptamers) and non-structural RNA, such as antisense, ribozymes or interfering RNA (siRNA, miRNA or their precursors).
  • the active RNAs can be of variable length, typically between 8 and 500 bases, more preferably between 8 and 200, in particular between 8 and 150.
  • the active RNAs are generally synthesized in the form of single-stranded molecules, even if they can subsequently adopt three-dimensional loop-type structures, double-strand regions, helices, etc.
  • the active RNA is a structural RNA, in particular an aptamer (Famulok and Verma, 2002) (Hermann and Patel, 2000). Aptamers are oligonucleotides capable of specifically binding a target molecule.
  • the active RNA is an interfering RNA (siRNA, mi RNA or their precursors) (McManus and Sharp, 2002) (Scherr et al., 2003) (Famulok and Verma, 2002) or an antisense RNA.
  • the present application is in fact particularly suited to the design and screening of RNA whose activity requires a particular spatial configuration.
  • the methods described in the present application make it possible to select active RNAs from collections or banks of random sequences, general or restricted, which may comprise a very large number of distinct random sequences.
  • the random sequences can be any DNA or RNA molecule comprising at least one element of sequence which is not known, more precisely of which at least part of the sequence is random.
  • the selection of the active RNAs according to the invention is carried out in cellulo, by means of the insertion of the random sequences in expression cassettes and under specific conditions.
  • One of the main advantages of selection in cellulo is that the target of the active RNA is not necessarily chosen a priori; moreover the active RNA selected is really effective under the conditions of cellular use.
  • a characteristic of the invention resides in the use of specific expression cassettes, allowing the production in cellulo of active RNA, in optimal configurations.
  • constructs, compositions and methods of the invention use a promoter derived from the sequence of a VA gene from adenovirus.
  • VA1 gene for expressing in the cell ribozymes, aptamers or antisense, including the sequence was perfectly defined (Medina and Joshi, 1999) (Barcellini et al., 1998) (Bertrand et al., 1999) (Cagnon et al., 1995) (Gwizdek et al., 2001).
  • the present application demonstrates for the first time the possibility and the efficiency of using this type of construction for the production and screening of random RNA banks (or constrained banks) in cellulo, in particular in a retroviral context. It also describes various modifications in the VA gene in order to generate improved cassettes conferring better control of the expression parameters.
  • the sequences encoding the active RNAs can thus be cloned in the cassette, mainly in the central domain of the gene. The positioning of the active sequence within the central domain does not modify the level of production, and the location of the chimeric RNA in the cell (FIG. 2).
  • the use of such a promoter is particularly advantageous for the expression of structural active RNA, in particular aptamers.
  • the adenovirus genome contains two small genes that are transcribed by RNA polymerase III, the VA1 and VA2 genes (Mathews and Shenk, 1991).
  • VAl RNA and to a lesser extent VA2 RNA, are abundantly produced during the replication cycle of the adenovirus.
  • PLR or p68 kinase a cellular kinase
  • the adenovirus VAl gene codes for a short RNA (VAnt 160nt RNA) characterized by a secondary structure rich in a double-stranded region.
  • VAnt 160nt RNA a short RNA
  • the genetic organization of this gene transcribed by RNA polymerase III is simple and includes a short promoter region in the intragenic position (box A and box B) and a transcription stop signal (see FIG. 1A).
  • the secondary structure of VAl RNA is well known ( Figure 1B).
  • the sequence of the VA1 gene of the adenovirus type 2 is represented in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
  • the sequence of the corresponding coded RNA is given below.
  • Boxes A and B correspond to nucleotides 11-24 and 59-68 in bold, respectively, and the central domain containing loop IV corresponds to nucleotides 93 to 118.
  • the cassette comprises the sequence of a VA1 adenovirus gene deleted from all or a functional part of the IV loop, in which the sequence encoding the active RNA is inserted.
  • the central domain containing loop IV corresponds to nucleotides 93 to 118 of the VA gene.
  • SEQ ID NO: 2 (VA ⁇ IV): 1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
  • the sequence SEQ ID NO: 2 (VA ⁇ IV) is derived from VAl Ad2 by deletion of the central domain from 93 to 118.
  • the nucleotide 94 120 in VAl has been mutated so as to create an EcoRV cloning site (in italics underlined) .
  • the EcoRV cut-off site is between 92 and 93.
  • the sequence SEQ ID NO: 3 (VA ⁇ IVSrf). above, is derived from VA ⁇ IV after insertion of the sequence of the Srfl site into the EcoRV site (in italics underlined).
  • the Srfl cutoff site is located between 96 and 97.
  • the term double helix of the VA1 gene is altered. This alteration makes it possible to control the cellular localization of the synthesized RNA (Gwizdek et al., 2001).
  • the RNA synthesized is naturally found essentially in the cytoplasm. This location is suitable for screening for active RNAs on biological targets present essentially in this cell compartment.
  • the synthesized RNA is essentially located in the nucleus. This location is suitable for screening for RNAs active on essentially nuclear biological targets.
  • the terminal helix is formed essentially by the pairing between the first 20 and the last 20 nucleotides of the RNA sequence encoded by the VA1 gene.
  • the alteration of the helix can be obtained by various modifications introduced within these sequence elements, in particular by mutation, deletion and / or insertion, preferably by mutation.
  • the helix sequence is less than about 15 bases, the helix is functionally altered and the VA1 RNA is retained in the nucleus.
  • the double helix is mutated so as to introduce a succession of unpaired nucleotides which form an opening within the helix (bubble), the latter is functionally altered and the RNA is retained in the nucleus.
  • RNA transcribed by an expression cassette according to the invention comprising the sequence of a VA gene deleted from loop IV and an altered terminal double helix is provided below (SEQ ID NO: 4):
  • the sequence SEQ ID NO: 4 (nVA ⁇ IVSrf) is derived from VA ⁇ lVSrf by mutation of nucleotides 120 to 122 (lowercase) and deletion of nucleotide 136..
  • the VA1 gene comprises a sequence conferring an inducible character.
  • active RNA antisense, ribozyme, aptamer, siRNA, miRNA and their precursors
  • the control of its expression is a determining element.
  • the present invention shows, for the first time, that the structure of the VA1 genes can be modified so as to make their expression inducible, while also retaining the characteristics described above (high level of expression, localization control , possibility of insertion of active sequences in the central domain).
  • an inducible VA gene can be constructed by inserting one or more sequences conferring an inducible character, typically between the boxes A and B of the gene and / or upstream of the gene, preferably as a replacement of all or part of the sequences normally present.
  • this new sequence is found in a region of the VAl RNA which is transcribed, and therefore causes alterations in the native secondary structure of the VAl RNA capable of make it less stable.
  • compensatory mutations can be introduced within the VAl sequence, so as to correct these structural defects and thus recreate the natural pairings of the VAl RNA.
  • the invention therefore relates to a nucleic acid comprising the sequence of a VA gene from an adenovirus, modified by insertion of one or more sequences conferring an inducible character, preferably between boxes A and B and / or upstream of the gene, more preferably in replacement of all or part of the native sequences.
  • the sequence conferring an inducible character can be any sequence conferring sensitivity to a factor acting in trans. It may preferably be a site for binding a transcriptional factor or a repressor, or any other agent or molecule. In a preferred embodiment, it is one or more operating sequences of a regulated bacterial promoter, for example the tefracycline promoter.
  • the promoter of the bacterial tet genes contains two types of operator sequences O1 and O2 which serve as a binding site for the TetR repressor (Hillen and Berens, 1994). Each of the tetOl and tetO2 sites binds a TetR homodimer. Studies have shown that the tetO2 binding site has a three to five times greater affinity for the TetR phomodimer than tetOl (Hillen and Berens, 1994).
  • the tetO1 operator sequences have thus been inserted into eukaryotic heterologous promoter sequences in order to obtain a eukaryotic expression system regulable by tefracycline (Gossen and Bujard, 1992). However, such a modification or application has never been envisaged from the VA1 gene of the adenoviruses, the manipulation of which is particularly delicate taking into account the presence of the promoter in the transcribed sequences.
  • the invention therefore relates to a nucleic acid comprising the sequence of the VA1 gene of an adenovirus, modified by insertion of one or more sequences operators serving as a fixation site for the TetR repressor.
  • the operator sequence (s) are inserted between boxes A and B of the VA gene sequence and / or placed upstream of the gene, more preferably as a replacement for all or part of the native sequences.
  • the invention also relates to any expression cassette comprising a sequence coding for an active RNA inserted under the control of an inducible VA promoter (VAi) in particular by tefracycline.
  • VAi inducible VA promoter
  • the sequence of specific examples of inducible VA genes constructed according to the invention is represented in the sequences SEQ ID NO: 15 (VaiO), SEQ ID NO: 16 (OVAi) and SEQ ID NO: 17 (OVAiO).
  • cassettes derived from the VA gene sequence and allowing the expression of random or active RNA are described in the examples, which represent particular objects of the invention. We can thus cite the cassettes VA ⁇ IVSrf, nVA ⁇ IVSrf, VAi and nVAi.
  • the expression cassettes of the invention comprise, in addition to the promoter derived from the VA gene of an adenovirus, a second transcriptional promoter, different from the VA promoter.
  • a second transcriptional promoter different from the VA promoter.
  • the active RNA configured in the VA sequence can be expressed under the control of a second promoter, which can be of various nature and origin.
  • the second promoter is a promoter transcribed by RNA polymerase type III, and which is functional in the cell type concerned, in particular an extra-gene promoter.
  • the expression cassette derived from the VA gene is cloned (VA ⁇ IV, VA ⁇ IV Srf, nVA ⁇ IV, VAi or any other cassette derived from the VA gene).
  • the promoter of the U6 gene is chosen as the second promoter allowing active transcription of the VA gene thus cloned.
  • a particular object of the invention thus resides in a hybrid expression cassette comprising an expression cassette derived from a VA gene from an adenovirus, optionally made inducible, expressing an active RNA (aptamer, antisense, ribozyme, RNA interfere: If RNA, miRNA or their precursors), placed downstream of a second transcriptional promoter.
  • an active RNA aptamer, antisense, ribozyme, RNA interfere: If RNA, miRNA or their precursors
  • RNA Polymerase III for the expression of active RNAs. It can be a promoter located inside the transcribed sequences (intragenic), such as the promoter of the tRNA genes. U can also be a promoter located upstream of the transcribed sequences (extragenic), such as the promoters of the U6 type encoding the small nuclear RNA U6 (snRNAU6). In addition, the promoter used can be made inducible.
  • hU6 human U6 gene
  • snU6 RNA small nuclear RNA
  • ribonucleoprotein complex responsible for splicing RNA
  • the main advantage of this is that it imposes few sequence constraints on the transcribed region of the cassette (Bertrand et al., 1997). Indeed, the second transcribed nucleotide corresponds to the first nucleotide provided by the exogenous sequence and the last nucleotides correspond to the stop signal ( Figure 3).
  • RNA antisense, ribozymes, aptamers, interfering RNA: siRNA, miRNA and their precursors
  • RNAs generated as well as their cellular localization various expression cassettes using a U6 promoter have been constructed by the inventors. These cassettes allow the expression of cytoplasmic or nuclear RNA, structural or non-structural, constrained or unconstrained. Modifications have thus been made to the U6 promoter, in order to facilitate the cloning of active sequences, control the transcribed sequences from point +1 of transcription, stabilize the active sequences and control the intracellular localization of these sequences.
  • a sequence serving as a structural base for the active RNA is placed downstream of the U6 promoter.
  • This structuring sequence more preferably contains a sequence capable of generating a (short) RNA helix (more or less stable and more or less long), and / or a straight edge cloning site and / or a transcription stop signal (for example TTTTT).
  • the sequence allowing the formation of an RNA helix typically comprises two complementary regions spaced apart by a hinge region. This type of cassette is especially useful for the intracellular expression of structural RNA motifs.
  • the structuring sequence preferably comprises a short shuttle motif (typically from 5 to 12 bases).
  • the structuring sequence preferably comprises a long shuttle motif, typically comprising from 12 to 20 bases.
  • This motif can be structured to form a perfect helix ensuring the RNA produced a cytoplasmic localization or else be structured to form a disturbed helix in order to obtain a nuclear localization of the generated RNA.
  • a sequence forming a short hairpin structure is placed downstream of the U6 promoter (and, where appropriate, of the structuring sequence). This sequence forms a stable RNA structure placed at the 3 'end of the synthesized active or random RNA, thus protecting the RNA produced from degradation by RNAses. Downstream of this stabilization structure is the polymerase III transcription stop signal: TTTTT.
  • the cassette comprises the U6 promoter to which the sequence encoding the active RNA is directly linked.
  • a cassette makes it possible to express RNAs whose sequence is chosen from point +1 of transcription.
  • the cassette comprises a U6 promoter as defined above and one or more sequences conferring an inducible character, as described previously.
  • the sequence or sequences conferring the inducible character can be placed for example upstream of the promoter sequence.
  • the promoter transcribed by RNA polymerase III is derived from a promoter of the tRNA genes.
  • these promoters can be modified to give them an inducible character.
  • the expression cassettes according to the invention are typically cloned or included in vectors, for cloning and / or for expression.
  • vectors can be of varied nature and / or origin, such as plasmids, recombinant viruses, viral vectors, episomes, artificial chromosomes, phages, etc.
  • the vectors are of the plasmid, viral or episomal type.
  • a particular object of the invention resides in a vector comprising at least one expression cassette as defined above.
  • the vector When the vector is of the plasmid type, it can come from different known or commercial plasmids. It typically includes an origin of replication compatible with the desired use. It may further comprise a selection gene and, optionally, an integration sequence in the chromosome.
  • plasmids which can be used for the production of vectors of the invention are in particular the plasmids pUC, pcDNA, pW2, plasmids with episomal replication derived from the Epstein-Bar virus of the OriP type.
  • the vector is of the viral type. It can be a recombinant virus, that is to say a recombinant viral particle comprising a genome recombinant viral in which at least one cassette as defined above is inserted. It can also be a viral vector, that is to say a genetic construction comprising a recombinant viral genome into which is inserted at least one cassette as defined above.
  • the vector is a retroviral vector or a recombinant retrovirus.
  • the present application indeed shows that the transfer of a cassette of the invention into target cells is very effective after cloning of this cassette into a retroviral vector.
  • the present application notably shows unexpectedly that the cassettes derived from the VA1 genes can be efficiently transduced in the target cells, in a retroviral context.
  • the level of expression of the chimeric RNA is high and the properties of the cassette are preserved.
  • Viruses have been used to vectorize nucleic acids in vitro or in vivo. Different approaches have been described for the production of recombinant viruses, typically leading to the production of viruses defective for replication, comprising an exogenous nucleic acid segment encoding a desired product. Such viruses have been constructed from retroviruses (MLV, lentiviruses, etc.), adenoviruses (Ad5, Ad2, CAV, etc.), AAV, herpes virus, etc. In each of these approaches, a viral vector is constructed comprising the sequences necessary in cis for the packaging of a nucleic acid in a viral particle and, optionally, complementary regulatory or coding sequences.
  • refroviruses In the case of refroviruses, numerous constructions have been described, in which all or part of the gag, pol and / or env genes are deleted, and in which a nucleic acid of interest is introduced. The latter can be inserted as a replacement for deleted sequences, or in other regions, such as for example in an LTR.
  • Viral vectors known to those skilled in the art include MFG, pBABE, etc.
  • a retroviral vector of the invention therefore comprises the LTR terminal regions, the packaging sequence, a selection gene and the nucleic acid encoding the active RNA, according to the invention.
  • Such a vector viral can be constructed from different types of retroviruses, and used to produce recombinant viruses by introduction into an packaging line expressing the viral proteins GAG, POL and ENV.
  • packaging line expressing the viral proteins GAG, POL and ENV.
  • Such lines have been described in the previous part (PsiCRIP, PA317, Gpenv, 293GP etc.).
  • a particular object of the invention resides in a retroviral vector defective for replication, comprising an LTR sequence, a retroviral packaging sequence and at least one expression cassette as defined above.
  • the vectors of the invention may comprise one or more RNA expression cassettes, identical or different.
  • multi-cassette vectors can be constructed, into which cassettes can be inserted, for example in tandem.
  • the possibility of cloning several cassettes in the same vector can relate to a single active RNA sequence, or to several different active RNA sequences.
  • the same cassette is copied several times before being inserted into the vector; in the second case, the different cassettes are placed one next to the other and inserted into the vector, or cloned sequentially, at sites distinct from the vector.
  • the vectors can be constructed by known techniques of molecular biology, in particular by cloning, ligation, amplification, etc.
  • the combined use of a retroviral vector and sequences derived from the VA gene of an adenovirus makes it possible to provide an integrated system, simple and predictive of the activity of Random RNAs, both in vitro and in vivo.
  • compositions comprising a vector as defined above.
  • the composition can be a pharmaceutical composition, as will be described in more detail below.
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising a plurality of vectors as defined above.
  • the composition can be a bank, as will be described in more detail later in the text.
  • the term bank designates a complex product or composition comprising a plurality or a multitude of components or members, which may be present in mixture (s) or in separate compartments.
  • the libraries according to the invention typically comprise a plurality of active RNAs, or cassettes encoding such active RNAs, which can be cloned into vectors, in particular plasmids, viral vectors, viruses, and / or into cells.
  • all the cassettes and / or vectors of the same bank have substantially the same structure, these components differing from one another by nature (eg, length, origin, type, etc.) and / or the structure (eg, sequence) of the coded active RNAs.
  • a bank generally includes several copies of each component or member.
  • the complexity of the bank can vary to a large extent.
  • a library can be composed of two components comprising distinct active RNA expression cassettes, preferably at least 10, even more preferably at least 20.
  • Typical libraries include more than 100, 500 or 1000 separate components, for example up to 10 9 or more.
  • the precise composition eg, the sequence
  • the components of the library eg, cassettes, vectors, cells, etc.
  • the bank generally comprises a physical support containing the various members of the bank, which may be in mixture (s), at least partial (s), or separated.
  • the support can thus include one or more physically separate compartments, such as flanges, tubes, bottles, multi-well plates, etc.
  • the bank can be kept in various forms, in particular in liquid or frozen suspension, replicated, etc., in whole or in part.
  • the libraries of the invention typically comprise a plurality of vectors each comprising a cassette for expression of a random RNA as described above, the vectors being at least partly in the form of a mixture.
  • the library comprises at least 50, 100 or 200 vectors encoding a distinct random RNA. It can include up to several billion distinct molecular species.
  • the random sequences can be any DNA or RNA molecule comprising at least one unknown sequence element, more precisely any DNA or RNA molecule of which at least part of the sequence is random.
  • Such random nucleic acids can typically comprise a random region bordered, at one or both ends, by a region of defined sequence.
  • the random region can comprise for example from 8 to 50 bases, and the defined region or regions from 2 to 10 bases.
  • the random nucleic acid can be a single-stranded RNA, produced by chemical synthesis, or by amplification or mutagenesis from any biological matrix, or by expression of a corresponding DNA.
  • the nucleic acid can also be DNA, in particular a random double-stranded DNA encoding a random RNA.
  • Such a random double-stranded DNA can be prepared from a population of synthetic single-stranded DNAs of synthesis or obtained by amplification and / or mutagenesis techniques, by synthesis of a complementary second strand according to techniques. known to those skilled in the art.
  • a particular object of the invention resides in a library of nucleic acids, characterized in that it comprises a plurality of species of recombinant retroviruses, each species of retrovirus comprising an expression cassette derived from a VA1 gene from an adenovirus expressing a distinct random structural RNA.
  • Another particular object concerns a nucleic acid library, characterized in that it comprises a plurality of recombinant refrovirus species, each retrovirus species comprising an expression cassette comprising a distinct random RNA under the control of a U6 promoter .
  • Another particular object relates to a nucleic acid library, characterized in that it comprises a plurality of species of recombinant retroviruses, each species of retrovirus comprising an expression cassette comprising a distinct random RNA under the control of a tRNA promoter .
  • a particular object of the invention resides in a library of nucleic acids, characterized in that it comprises a plurality of distinct random RNAs encoded by distinct expression cassettes derived from a VA1 gene from an adenovirus.
  • a particular object of the invention resides in a library of nucleic acids, characterized in that it comprises a plurality of expression cassettes each comprising a sequence encoding a distinct random structural RNA placed under the control of a promoter transcribed by RNA polymerase III (in particular expression cassettes derived from a VA1 gene from an adenovirus), each random coded structural RNA having the capacity in vitro to bind a target of interest.
  • nucleic acid libraries as defined above in which the expression cassettes comprise an inducible VA promoter.
  • nucleic acid libraries as defined above, in which the expression cassettes comprise a second transcriptional promoter, distinct and placed upstream of the VA promoter.
  • the invention relates, in general, to methods of selection in cellulo, from banks of random nucleic acids, of active RNA capable of conferring on a cell a desired phenotype.
  • the methods of the invention generally comprise: a) the supply of a nucleic acid library comprising a plurality of distinct expression cassettes each comprising a nucleic sequence coding for a random RNA placed under the control of a promoter transcribed by RNA polymerase III, b) placing in contact with said bank or a part thereof with a population of cells under conditions allowing the transfer of nucleic acid into said cells, c) selection of one or more cells having the desired phenotype, and d ) the identification of the cassette (s) contained in the selected cell (s), or of the active RNAs which they express.
  • the bank implemented in step a) is a general random bank, that is to say comprising a plurality of totally random sequences.
  • the use of this type of library is particularly advantageous for the selection of active RNA capable of conferring a desired phenotype on a cell, without a priori knowledge of the targeted biological target or of the targeted metabolic pathway.
  • the bank implemented in step a) is a restricted random bank, that is to say comprising a plurality of sequences whose randomness presents a certain level of restriction.
  • the restricted library can be a library derived from the sequence of a given target gene, comprising a multitude of sequences complementary to one or more regions of this gene.
  • the restricted library can also be a random library in which one or more residues, or one or more sequence motifs are imposed within the random region.
  • the restricted library can also be a library of random mutants of a given target sequence or a library encoding RNAs preselected for a particular property.
  • the use of restricted random banks is particularly advantageous for the selection of active RNA capable of altering a determined biological target or a determined metabolic pathway.
  • the bank implemented in step a) is a restricted random bank encoding random RNAs pre-selected for a particular property, for example for their ability to bind, in vitro, a target of interest (for example a protein, a polypeptide, a peptide, a nucleic acid, a cell, a lipid, etc.) or for their affinity for this target, for its own property, for the presence of a specific structural motif or sequence, etc.
  • a target of interest for example a protein, a polypeptide, a peptide, a nucleic acid, a cell, a lipid, etc.
  • a particular object of the invention relates to a method of selection, optimization or identification of active RNA, comprising: la) the preparation of a library of nucleic acids comprising a plurality of distinct expression cassettes comprising a nucleic sequence coding for a random RNA placed under the control of a promoter transcribed by RNA polymerase III, the coded random RNA sequences or the complete RNAs containing these random sequences having been pre-selected in vitro for their capacity to bind ( or for their affinity for) a target of interest, lb) bringing this bank or a part of this bank into contact with a population of cells under conditions allowing the transfer of nucleic acid into said cells,
  • the libraries can be produced by any technique known to a person skilled in the art, in particular by synthesis, amplification, mutagenesis, etc., or combinations of these methods. It may be a bank of synthetic DNA or produced by recombinant or genetic means, from artificial or synthetic matrices, such as genomic banks, from RNA of sequences obtained by the SELEX method, or by any technique of mutagenesis or directed evolution, etc.
  • the DNA library coding for random RNAs is prepared by: synthesis of a single-stranded DNA library comprising a random region framed by one or two regions of defined sequence, synthesis of a second strand using DNA polymerase and in the presence of a primer complementary to the defined sequence of the first strand, or a part thereof, to produce a double-stranded DNA library comprising a random region, and cloning of the double-stranded DNA library into a vector, under the control of the chosen promoter.
  • This method can include an additional step of expression and selection in vitro of the RNAs encoded by the library having the capacity to interact with a biological target of interest.
  • the DNA library encoding random RNAs is prepared from a collection of random RNA sequences by: reverse transcription to produce a single-stranded DNA library comprising a random region framed by a or two regions of defined sequence, - synthesis of a second strand by means of a DNA polymerase and in the presence of a primer complementary to the defined sequence of the first strand, or of a part thereof, to produce a double-stranded DNA library comprising a random region, and cloning of the double-stranded DNA bank into a vector, under the control of the chosen promoter.
  • the vector is a viral vector, in particular a retroviral vector.
  • the method advantageously further comprises a step of transfection of said vector into an encapsidation cell line, to produce a library of viruses, in particular of recombinant retroviruses.
  • the DNA library codes for random RNAs pre-selected in vitro (see FIG. 15B).
  • the method can include the following steps:
  • Step A the in vitro synthesis of a bank of expression cassettes (db DNA) using the polymerase III system.
  • db DNA a bank of expression cassettes
  • the cassettes can be synthesized, for example, from sb DNA oligonucleotides, by means of primer extension and / or PCR amplification reactions;
  • - Step B in vitro expression of the cassette bank or a part thereof, producing in vitro a bank of random RNAs
  • - Step C in vifro selection of RNAs for their binding capacity or for their affinity for a given target
  • Step D production of a library of restricted expression cassettes comprising RNA expression cassettes thus selected.
  • the in vitro expression of the cassette bank can be carried out in two phases, a phase of production of transcription cassettes and a phase of transcription proper.
  • a bank of in vifro transcription cassettes can be synthesized from the banks of expression cassettes, completely in vitro, using oligonucleotides sb DNA and by PCR reaction.
  • the db DNA matrix being constituted by the bank of expression cassettes, the 5 ′ oligonucleotide used in the PCR reaction makes it possible to provide a promoter suitable for in vitro transcription (e.g. SP6, T7, T3, ... ).
  • the production of the random RNA bank can then be carried out by in vifro transcription from the bank of transcription cassettes, using a suitable RNA polymerase (purified protein or preparation which contains the required activity: SP6, T7, T3 , ).
  • the production of the restricted expression cassette bank can be accomplished in different ways.
  • the selected active RNAs (or a part of them) are used to generate the corresponding transcription cassettes, for example by RT-PCR reaction.
  • the new cassettes banks thus obtained are used either to carry out new iterations of the process (return to step B), or for in cellulo tests.
  • the in cellulo tests can relate to a few identified cassettes or, more generally, this restricted expression cassette bank can be used as starting material for the selection in cellulo (step 1b).
  • a particular subject of the invention also resides in a process for the selection of active RNA, comprising (i) the in vitro synthesis of a bank of expression cassettes (db DNA) encoding random RNA under the control of a polymerase III promoter, (ii) in vitro expression of the cassette bank or a part thereof, producing in vitro a random RNA bank and (iii) in vitro selection of RNAs for their binding capacity or for their affinity for a given target.
  • the method comprises producing a library of restricted expression cassettes comprising RNA expression cassettes thus selected.
  • the library (or a part thereof) is brought into contact with a population of cells.
  • the cells used can be of varied nature and origin, and chosen according to the properties sought for the active RNA.
  • the method of the invention can be implemented in particular with a population of cells comprising animal (for example mammal), birds, fish, amphibians, plants, insects, yeast or bacterial. They are preferably cells from mammals, in particular human or animals (rodents, cattle, horses, monkeys, etc.).
  • the cells can be primary cultures or lines. They can be embryonic or somatic pluripotent cells, differentiated or not, proliferative or quiescent, etc.
  • Mention may be made, for example, of stem cells, fibroblasts, hepatocytes, epithelial, muscular, renal, nervous, cardiac cells, or belonging to the hematopoietic lineage (B, T, NK lymphocytes, mast cells, dendritic cells, resident or circulating macrophages, etc., etc.
  • the cells used can moreover be modified or treated beforehand, for example to contain a reporter gene system, a marker, etc., or to present a pathological phenotype which it is desired to correct.
  • the selection process is typically carried out in vifro, in any suitable type of support, such as flask, flask, multi-well plate, etc.
  • the bank in order to be able to measure or observe, on each cell, the effect of a limited number of random RNAs from the bank, the bank is preferably brought into contact with the population of cells under conditions allowing the transfer of '' a limited number of cassettes per cell.
  • the bank being typically composed of a mixture of distinct components, it is preferred that each cell of the population is modified by a restricted number of these components for better appreciate its properties. Therefore, it is not necessary that the components of the library are separated from each other, or that the population of cells is distributed in supports with several compartments, which constitutes an important advantage of the invention.
  • the bank is a virus bank, it is preferred to incubate the cells at a low MOI, typically less than 5, preferably less than 3, 2 or 1.
  • the contacting can be carried out in the presence of agents facilitating the transfection, such as polymers, cationic lipids, peptides, etc.
  • agents facilitating the transfection such as polymers, cationic lipids, peptides, etc.
  • viruses in particular retroviruses
  • such agents are generally not necessary, given the effectiveness of infection.
  • the cells can be cultured or stored for a certain time after contacting, before carrying out step c). This duration can be adjusted by a person skilled in the art according to the phenotype sought, the type of vector, the quantity of cells, etc. Furthermore, following contacting, it is possible to carry out a step of selecting cells into which one or more cassettes have actually been transferred. This selection can be carried out by any means known to those skilled in the art, in particular by using a marker gene inserted into the vector. In addition, the cells can also be subjected to specific treatment or conditions, in particular to reveal the phenotype of interest (e.g., addition of a substrate, of a reagent, lysis of the cells, etc.)
  • the phenotype of interest can be any activity, property, morphology, etc. It can be the expression of an endogenous or exogenous gene, a marker, the expression of a surface protein, a property of migration, differentiation, growth, resistance, etc.
  • the desired phenotype is chosen from an ability or an incapacity for growth, apoptosis, differentiation, migration, resistance to a toxic agent, resistance to an infectious agent, or metabolic action (eg, the cell has become able to modify its metabolic environment).
  • the desired phenotype is the activity of a specific biological target or a specific metabolic pathway. Mention may in particular be made of the expression or the activity of a protein, for example an enzyme (eg kinase, protease, etc.), a transcription factor, etc.
  • the population of cells comprises cells infected with a virus and the desired phenotype is resistance to said virus.
  • the virus can be any known virus, such as a hepatitis virus (B, C, delta %), influenza, HIV, various herpes, papilloma viruses, etc.
  • the cell population includes tumor cells and the desired phenotype is loss of tumorigenicity.
  • the cell population comprises undifferentiated embryonic stem cells and the desired phenotype is the control of their differentiation.
  • the cell population comprises cells capable of acting on a natural metabolic process (for example: blood coagulation, regulation of the level of glucose, of lipids, cholesterol, etc.) and the desired phenotype is the control of this metabolic process.
  • a natural metabolic process for example: blood coagulation, regulation of the level of glucose, of lipids, cholesterol, etc.
  • the cell population comprises bacterial cells and the desired phenotype is sensitivity to a toxic agent.
  • the population of cells comprises cells expressing a determined biological target (eg a protein, a variant of a protein, a nucleic acid, a lipid, a receptor, etc.) and the desired phenotype is the modification of the activity (including expression) of this biological target.
  • a determined biological target eg a protein, a variant of a protein, a nucleic acid, a lipid, a receptor, etc.
  • the cells expressing the desired phenotype can be selected by a person skilled in the art by any conventional biology technique (molecular modification, survival, expression of a marker, cell sorting, etc.). Also, when the cassette is inducible, RNA activity can be validated directly in cellulo, by comparing induced and repressed states ( Figure 15A). For this, the cells having the desired phenotype are selected, optionally amplified, preferably individually, and their phenotype is analyzed in parallel under conditions of induction and repression of the expression of the cassette. This additional step makes it possible to identify the RNAs whose activity is directly involved in the desired phenotype.
  • Step d) comprises the identification of the cassette or cassettes contained in the selected cell or cells, or of the active RNAs which they express.
  • These cassettes or RNA are responsible for the phenotype produced and can therefore be used for any application aimed at reproducing this phenotype.
  • the cassette, or the RNA can be extracted from the cells and isolated by conventional methods of molecular biology (lysis of the cells, amplification or hybridization, etc.).
  • the sequence of the cassette (s) is determined, to allow the corresponding product to be produced synthetically or recombinantly.
  • the properties of the cassette or of the RNA can be confirmed in any suitable biological system or model.
  • the bank used in step a) is complex (ie, comprises a large number of distinct components, for example greater than 100), it is preferable to repeat steps b) to d) of the method in order to select the most suitable agents. more active.
  • the DNA of the expression cassettes of the selected cells is amplified to produce a restricted library, and the steps b) -d) of the method are repeated at least once with said restricted library.
  • Carrying out several cycles has several advantages: firstly, it makes it possible to start from very complex banks, used in the form of a mixture. In addition, it gradually increases the efficiency of active RNA. Furthermore, it can make it possible to select active RNAs having a determined profile, by selecting the cassettes on cells or under distinct conditions according to the cycles.
  • a particular object of the invention resides in a method for selecting active RNA capable of conferring on a cell a desired phenotype, comprising: a) the supply of a nucleic acid library comprising a plurality of vectors comprising cassettes of 'distinct expression each comprising a nucleic sequence encoding a random RNA placed under the control of a promoter transcribed by RNA polymerase III, b) bringing said library, or a part thereof, into contact with a population of cells under conditions allowing transfer of nucleic acid into said cells, c) selection of cells having the desired phenotype, d) extraction or amplification of the sequence of cassettes contained in said cells, e) cloning of the sequences obtained in d) into a vector to generate a restricted library and, f) the repetition at least once of steps b) to d
  • the nucleic acid library is a library encoding random RNAs preselected in vifro, and / or the vector is a recombinant virus, more preferably a recombinant retrovirus.
  • the promoter transcribed by RNA polymerase III is a promoter derived from the sequence of a VA gene from an adenovirus.
  • the cell population includes mammalian cells.
  • a more particular embodiment of the invention comprises: a) the supply of a nucleic acid library comprising a plurality of species of recombinant retroviruses, each species of retrovirus comprising an expression cassette derived from a VA gene an adenovirus expressing a distinct random structural RNA, b) bringing said library or a part thereof into contact with a population of mammalian cells under conditions allowing the infection of said cells by said recombinant refroviruses, c) the selection of cells having the desired phenotype, d) the extraction or amplification of the sequence of cassettes contained in said cells, e) the cloning of the sequences obtained in d) in a vector to generate a restricted library and, f) repeating steps b) to d) at least once with said restricted bank.
  • Another particular object of the invention resides in a method for selecting active RNAs on a determined biological target, comprising: a) the supply of a nucleic acid library comprising a plurality of vectors comprising distinct expression cassettes each comprising a nucleic sequence coding for a RNA constrained (or predefined) to act on said determined target, placed under the control of a promoter transcribed by RNA polymerase III, b) contacting said library, or a part thereof, with a population of cells expressing or containing the biological target, under conditions allowing the transfer of nucleic acid into said cells, c) selection of cells having the desired phenotype, d) extraction or l amplification of the sequence of cassettes contained in said cells and, optionally, e) cloning the sequences obtained in d) into a vector to generate a rest library reinte and, f) repeating at least once steps b) to d) with said restricted bank.
  • RNA sequence may be derived from the sequence of the biological target (in particular in the case of antisense, RNAi (siRNA, miRNA or their precursors), ribozymes) or else be preselected to interact structurally with the target biological (especially in the case of aptamers).
  • the identified active RNAs, the identified active sequences or the expression cassettes of these active RNAs can be used as molecular tools capable of acting in the cell to interfere (inhibition, activation) with a biological activity or the expression of a specific phenotype ("target identification”). As such, they constitute useful products for studying a cellular process and identifying new targets or for exploring the function of a gene in the case where the target is known (“target validation”). Their action in a cell can make it possible to modify the cell so that said cell has new properties. The cell thus modified can then be considered as a new biotechnology tool usable for research purposes or for therapeutic applications.
  • RNAs identified and, more generally, the expression cassettes identified can be used directly as pharmaceutical products.
  • pharmaceutical includes any use in the medical, therapeutic, preventive or curative, veterinary, agronomic, diagnostic, cosmetic, etc. fields.
  • one aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an expression cassette, a vector or a cell as defined above, and a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises an active RNA, said active RNA comprising an active sequence inserted into a modified VA RNA, said modified VA RNA optionally comprising an altered terminal propeller and / or a sequence conferring an inducible character.
  • the invention further relates to methods of producing pharmaceutical compositions, comprising (i) screening a library of random RNAs as described above, making it possible to obtain an expression cassette for an active RNA and (ii) packaging the expression cassette or the active RNA sequence in any pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition for the treatment of a pathogen infection in a human patient, comprising (i) screening a library of Random RNAs as described above, the population of cells used being infected with the pathogenic agent and the RNAs selected for their capacity to reduce or block the infectious cycle, making it possible to obtain a cassette for expression of an active RNA and (ii) packaging the expression cassette or the active RNA sequence in any pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the invention also relates to the use of an active RNA, an expression cassette, a vector or a recombinant cell as defined above, for the preparation of a medicament intended for the delivery implementation of a method of therapeutic treatment of the human body.
  • the drug can be used for the treatment of cancers, infections, neurodegenerative diseases, etc.
  • the invention further relates to a method of treating a patient, comprising administering an effective amount of an active RNA, an active sequence, an expression cassette, a vector or a recombinant cell as defined above to a patient.
  • the administration can be carried out by different routes, in particular by iv, ip, im, se, local or general, in particular infratumoral or systemic route.
  • VA1 RNA viral gene
  • VA1 RNA viral gene
  • the RNA produced is very structured, its size is 160 bases.
  • the cellular localization of this RNA is cytoplasmic.
  • the IV loop (which interacts with the protein kinase p68) was deleted in this construction and the EcoRV restriction site was inserted: construction VA ⁇ IV (Barcellini et al., 1998) and (Gwizdek et al., 2001).
  • the VA ⁇ TV RNA has a size of 134 bases, it is rich in secondary structures ( Figure 4) and has a cytoplasmic localization (Barcellini et al., 1998) (Gwizdek et al., 2001). Its sequence is represented by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • VA ⁇ IV cassette cytoplasmic ⁇ and nVA ⁇ IV (nuclear !.
  • This example describes the construction of cassettes allowing the expression of the active motifs integrated in the VA ⁇ IV RNA, and the localization of which is mainly cytoplasmic.
  • the VA ⁇ IVSrf cassette was generated by inserting the Srfl site in the form of a double-stranded DNA octanucleotide (5'GCCCGGGC3 ') inside the EcoRV restriction site (position 90-96 in the VA ⁇ IV).
  • the transcribed RNA has 142 bases (FIG. 5) and a cytoplasmic localization (FIG. 2C), SEQ ID NO: 3. This RNA allows the optimized expression of active RNA sequences (FIG. 2B).
  • This example describes the construction of cassettes making it possible to express active RNA sequences integrated into the VA ⁇ IVSrf RNA, and the localization of which remains nuclear.
  • the double helix structure containing the 5 'and 3' ends is the sequence responsible for transporting this RNA from the nucleus to the cytoplasm. This structure is called the terminal helix (Gwizdek et al., 2001). It has been mapped: bases 1 to 20 and bases 136 to 155. If the double helix structure is disturbed, the RNA is retained in the cytoplasm.
  • the 3 ′ part of the VA ⁇ IV gene was thus modified in order to create a rupture in the terminal double helix of the RNA according to the approach proposed in Gwizdek et al., 2001.
  • the 5 ′ sequences of the VA ⁇ IV gene were modified from nucleotide 93 and replaced by the following double-stranded DNA sequence (SEQ ID NO: 5):
  • This example describes the construction of cassettes making it possible to express active motifs integrated into an expression cassette inducible by tetracycline.
  • the VA ⁇ IV gene has been modified in order to integrate an operating sequence tetOl between Boxes A and B of the VA gene and / or upstream of the site of initiation of the transcription of this gene (FIG. 7).
  • the tetOl sequence therefore replaces the native sequences of the VA gene either between boxes A and B (position 24 to 59 in the VAiO gene) or upstream of the transcribed sequences (position - 29 to - 50 in the OVAi gene), or at the level of the two positions (extragenic and intragenic: OVAiO gene).
  • the VAi cassettes are obtained synthetically using 4 single-stranded DNA oligonucleotides.
  • the first two oligonucleotides of single-stranded DNA VAi up and VAi down (SEQ ID NOs: 18 and 19, FIG. 7B) are used to generate all of the transcribed sequences of the neogen VAi as well as part of the adjacent sequences in 5 'and in 3 '. Thanks to a sequence of 20 complementary bases, these oligonucleotides are hybridized and then used to generate double-stranded DNA in the presence of PADN polymerase fragment from Kleenow.
  • the two external oligonucleotides VAi PvuII 5 '(SEQ ID NO: 20) and VAi PvuII 3' (SEQ ID NO: 22) are used to add the upstream and downstream sequences of the VA gene using a PCR reaction.
  • the two PvuII restriction sites placed at the 5 ′ and 3 ′ ends of the VAiO gene make it possible to clone it in any DNA vector.
  • the two oligonucleotides VAiO2PvuII 5 'and VAiPvuII 3' are used to add the tetOl sequence upstream of the VA ⁇ IVSrf gene or of the VaiO gene in order to generate the OVAi and OVAiO genes respectively.
  • the VAiO transcribed RNA has 142 bases, its secondary structure is presented in FIG. 8.
  • This example describes the construction of cassettes making it possible to express active motifs integrated into an expression cassette inducible by tetracycline.
  • the localization of this motif must be mainly nuclear.
  • the principle of retention of this RNA in the nucleus is the same as for the nVA ⁇ IVSrf expression cassette (see above).
  • the 3 ′ part of the various VAi genes is therefore modified in the same way as for the nVA ⁇ IVSrf gene in order to create a rupture in the terminal double helix of the RNA.
  • the promoter sequence of the human U6 gene is in the extragenic position.
  • the RNA generated therefore corresponds to the sequences which we have chosen to clone downstream of the promoter (from point +1 of transcription). This type of promoter therefore makes it possible to express fully synthetic RNAs as opposed to the VA system which requires preserving promoter sequences positioned within the transcribed sequences.
  • RNA transcribed by these cassettes have a nuclear or cytoplasmic localization, depending on the constructions.
  • the objective of these cassettes is the intracellular expression of structural RNA motifs.
  • a sequence serving as a structural base for the RNA to be inserted is placed downstream of the U6 promoter. It contains: a sequence capable of generating a short RNA helix (more or less stable and more or less long), a clear edge cloning site (Srfl: 5'GCCCGGGC3 ') as well as the transcription stop signal TTTTT.
  • RNA shuttle which supports the active motif has a clean and stable structure in the form of a helix.
  • This example describes the construction of three types of shuttle derived from U6: when the active motif is itself structured in the form of a helix, we use a cassette with a short shuttle motif (helix 9: h9U6), when the active motif is not structured in a helix or very short, we use a cassette allowing the expression of a shuttle formed by the pairing of about twenty nucleotides (helix 20 h20U6).
  • h20U6 also makes it possible to modify the terminal rod of the export motif shuttle and to generate a nuclear localized shuttle (nh20U6).
  • h9U6 (SEQ ID NO: 6)
  • h20U6 (SEQ ID NO: 8)
  • nh20U6 (SEQ ID NO: 10) 5 'TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTTC 3'
  • RNA corresponding to a helix structure on 18 bases, with a helix interruption on 6 bases. Its sequence is indicated below (SEQ ID NO: 11)
  • the objective of this cassette is to express RNAs whose sequence is chosen from point +1 of transcription.
  • the restriction site with cohesive ends Sal I is replaced by the restriction site with free edges Srfl.
  • the U6 promoter is modified by PCR reaction with the U6 cassette described above as a matrix.
  • the 5 'primer is a plasmid sequence located upstream of the promoter and the 3 'primer makes it possible to modify the sequences near the +1 transcription site:
  • sequence Srfl GCCCGGGC replaces the sequence CACCGTCG present in the original gene (Bertrand et al., 1997) (5 'CACCGTCG 3' of the original cassette has been changed by the site Srfl 5 'GCCCGGGC 3 '(the underlined sequences represent the beginning of the transcribed sequences).
  • the size of the transcribed RNA is a function of the sequence cloned downstream of the promoter, inside the Srfl site. Likewise, the cellular localization of the transcribed RNA is a function of the sequence of the latter.
  • RNA sequences aptamer, antisense, ribozyme, RNAi: siRNA or miRNA
  • RNA Downstream of the U6 promoter, inside the so-called SalI restriction, is cloned a sequence called terminal stem. It generates a hairpin structure at the 3 'end of the RNA, thus avoiding degradation by the RNAses.
  • Upstream of this terminal rod is the GTCGAC sequence which reconstitutes a SalI restriction site, in order to represent the site for cloning of the antisense sequences.
  • Downstream of the terminal rod is the polymerase III transcription stop signal: TTTTT.
  • Terminal stem sequence (SEQ ID NO: 13) 5 'GCGGACTTCGGTCCGCTTTTT 3' The underlined sequences form the RNA helix
  • the sequence transcribed in this cassette is (SEQ ID NO: 14)
  • This example illustrates the construction of a hybrid gene which can be used in particular in murine lines.
  • the VA1 gene as well as the expression cassettes derived from this gene, are not expressed in murine lines.
  • the promoter of the murine U6 gene is used to transcribe the expression cassettes derived from the VA1 gene.
  • the mU6 / VAiO construction was carried out in two stages: the first consisted in inserting the promoter U6 of the murine gene (mU6) in the retroviral vector pBabe and the second consisted in inserting the VAiO gene downstream of the promoter mU6.
  • Step 1 Cloning of mU6 in pBabe ( Figure 14)
  • the murine U6 gene was copied by polymerase chain reaction using the primers mU6 upstream and mU6 downstream. At 3 'of the downstream mU6 primer, 4 additional bases were added in order to integrate a restriction site.
  • the restriction site chosen is the Pme I site of sequence GTTTAAAC. This restriction site has two advantages: it allows i) to keep intact the last bases of the murine U6 promoter (GTTT) and ii) to integrate a free edge cut site usable in step N ° 2 (insertion of the VAiO gene ).
  • the polymerase chain reaction was carried out using a genomic DNA matrix extracted from murine cells. The reaction product was purified and then inserted into the retroviral vector pBabe at the Nhel restriction site (FIG. 10) to generate the plasmid pBabe mU6.
  • Step 2 Cloning mU6 into pBabe mU6 ( Figure 14)
  • the VAiO gene obtained by polymerase chain reaction, was cloned into the plasmid pBabe mU6 at the Pmel restriction site previously introduced.
  • the oligonucleotides used to obtain the VAiO gene are VAiO 5 ′ and VAiO End Nhel, an Nhe I restriction site being introduced 3 ′ of the VaiO End Nhel primer.
  • the DNA template used was the plasmid pBabe VaiO.
  • the retroviral vector chosen is the pBabe vector (Morgenstern and Land, 1990).
  • the insertion site chosen is the Nhel site which is located in the 3 'LTR (FIG. 10). This integration site has several advantages:
  • the 3 'LTR is the one which is copied to generate the two new LTRs of the integrated provirus. It is therefore responsible for the activity of the viral promoter in a situation of integration into cellular DNA.
  • the fact of integrating an exogenous sequence inside this LTR does not disturb the production of the recombinant viruses by the packaging cells, but makes it possible to inactivate the viral promoter in a situation integrated in the transduced cells.
  • the integration of such sequences into a cell genome therefore does not involve the activation of the genes located downstream of the insertion. This type of construction is particularly advantageous from the point of view of use for gene or cell therapy projects.
  • the cassettes constructed are thus transferred into the pBabe vector at the Nhel insertion site (inside the 3 'LTR).
  • Any other vector or means making it possible to penetrate the expression cassettes into the cell is also envisaged: transfection, fransduction or the like.
  • any vectorization intended to make the cell penetrate not the cassette expression, but active RNA is also envisaged.
  • all vectors and methods facilitating the introduction of RNA into cells will be used.
  • RNA expression library was generated from single stranded DNA fragments having a size of 42 bases. These fragments are broken down into three parts: from 5 'to 3' there is a known sequence of 8 bases (runA), then a random sequence of 26 bases (chemically synthesized in a perfectly random manner by a DNA synthesis machine), finally, a second known sequence of 8 bases (runB).
  • runA the sequence of 8 bases
  • runB the sequence of 8 bases
  • the single-stranded DNA fragments have the sequence 5 'ATGAACGC (N) 26 GCGTTCAT 3', in which N represents any base (A, T, G or C).
  • the random part therefore contains 26 variable positions.
  • oligonucleotide primer complementary to runB was used as primer for Kleenow's RNA polymerase, which synthesizes the DNA strand complementary to the entire sequence.
  • the primer complementary to runB has the sequence 5 'ATGAACGC 3'.
  • random sequence bank a population of double-stranded DNA with blunt ends is obtained.
  • This bank of random sequences is then cloned into an expression cassette as described in Examples A and B above.
  • the random sequences can be inserted into the two types of cassettes derived from VA1 or U6.
  • the plasmids or viral vectors for example, pBabe in the case of retroviral vectors
  • the random sequence bank (double stranded DNA with free edges) is cloned by competitive ligation, in the presence of the restriction enzyme Srfl.
  • each vector therefore integrates a double stranded DNA fragment containing a different random sequence.
  • the heterogeneous population of plasmids or vectors obtained after insertion of the random sequences is called "bank of random plasmids or bank of random vectors".
  • These libraries constitute random RNA expression libraries, within the meaning of the invention, which can be used directly for the in cellulo selection of active RNA.
  • the expression library used is a viral, in particular refroviral, expression library.
  • a viral, in particular refroviral, expression library can be constructed from a library of random viral vectors, as described below.
  • the random vector bank is introduced into the cells of an packaging line (here the line 293GP (Burns et al., 1993)) by transfection with calcium phosphate.
  • the library is simultaneously transfected with an expression vector encoding the envelope glycoprotein G of the vesicular stomatitis virus (VSV-G).
  • VSV-G vesicular stomatitis virus
  • This protein is reputed to be very effective for the functionality (stability, infectivity) of retroviral viruses produced after transfection.
  • the “Random virus bank” is then removed, purified and concentrated. Its infectious titre or MOI (number of infectious recombinant retroviral particles per milliliter) can then be determined according to the methods known to those skilled in the art.
  • MOI number of infectious recombinant retroviral particles per milliliter
  • the expression libraries described in Examples C and D can be used for the in cellulo selection of active RNAs.
  • the “Random virus bank” it is possible to transfer the random RNA expression cassettes into the cells to be studied.
  • the objective is to obtain a bank of random cells in which each cell expresses one, or more, different random RNA (s).
  • the cells used can be those of a reference line, such as for example 293 cells (ATCC N ° CRL 1573), Jurkat A3 cells (ATCC N ° CRL-2570) or HELA cells (ATCC N ° CCL 2)
  • the cells to be infected have a particular nature in the sense that they have a specific activity on which we want to act (growth, differentiation, infection ).
  • the “random virus bank” makes it possible to transduce cells of any line as well as cells in primary culture.
  • the infection of the cells is thus done using a viral supernatant having an MOI of less than 1.
  • the selection of the transduced cells is carried out by virtue of the presence of the puromycin resistance gene in the recombinant pBabe retroviruses. After the action of the selection agent, the cell population obtained therefore consists of all the cells which have received one or more copies of the retroviral genome and therefore containing one or more copies of pol III expression cassette, each coding for a different random RNA. .
  • the bank's cells are available for a first series of tests.
  • the target on which we wish to act thanks to the active RNA can be known (a protein, an RNA, a DNA ...) or can represent an enzymatic activity, a metabolic pathway, a process of proliferation or differentiation, a resistance to a drug or pathogen, etc.
  • the selection test must be adapted to each case.
  • the selection of cells containing an RNA acting on the target is carried out by virtue of the positive selection of cells having acquired the required phenotype and having a selective advantage.
  • the selection of an RNA active against an infectious agent is carried out by virtue of the positive selection of cells which have become resistant to the multiplication of this virus.
  • the selection of an active RNA capable of protecting cells against a process of programmed cell death (apoptosis) is carried out through the selection of cells that have become resistant to the addition of a signal triggering Papoptosis.
  • the positive selection of the cells of interest may also include a direct selection of the cells by direct observation (overgrowth, change in molecular status, altered differentiation, expression of a fluorescent membrane marker, etc.).
  • the colonies of cells of interest are removed by microdissection using an automated device allowing laser microdissection of the groups of cells of interest (Simone et al., 1998) or else by a positive sorting based on the selection. cells of interest marked with antico ⁇ s.
  • the cells potentially containing an active RNA are isolated: they constitute the first generation of selected cells.
  • the selected cells can be amplified naturally thanks to their proliferation.
  • the cells can be cloned if they appear as independent clones, each comprising several thousand cells.
  • cells can be globally brought together to form a population of first-round cells. In all cases, the cells can be preserved by freezing.
  • This first generation of selected cells (population or independent clones) is directly usable for carrying out a second selection round then, several selection rounds in an iterative mode, with the possibility of varying the selection parameters.
  • the mode of selection and / or the mode of analysis of the selected cells may require working on dead cells because they are fixed by a fixing agent such as, for example, formaldehyde.
  • a fixing agent such as, for example, formaldehyde.
  • the selection mode requires marking of the cells using antico ⁇ s.
  • the natural amplification of cells by growth is not possible and an additional step of amplification by PCR of cassettes containing active RNA is carried out to carry out a second round of selection.
  • the genomic DNA of cells from the first "selection round” is extracted and purified. From this DNA, molecular biology techniques make it possible to specifically amplify by PCR the DNA sequences corresponding to the random RNA expression cassettes contained in the selected cells. A first generation of expression cassettes containing sequences potentially active on the target is thus obtained. This first generation is known as the “restricted first-round cassette bank”.
  • the restricted bank of cassettes from the first round is treated in the same way as the random starting bank. It is cloned into the retroviral vector pBabe at the level of the 3 'LTR. After this new cloning step, a first restricted bank of viral vectors is obtained. The infectious forms of these viral vectors are obtained in the same way as before by transfection of the packaging cells to arrive at a first restricted library of refrovirus, used to infect, in turn, the cell type studied. The MOI is again adjusted to be less than 1 copy of virus per cell. The cells thus transduced are again selected according to the same rules as those which govern the selection of the first round, or according to other parameters. This leads to the establishment of a limited bank of cassettes for the second round.
  • This second round of selection enriches the restricted bank of the first round with active sequences.
  • the iterative succession of rounds based on the principle of selection for the desired phenotype makes it possible to enrich, at each round, the restricted bank in sequence of active cassettes.
  • the desired phenotype seems to be finally stabilized, that is to say when all of the cells having received a recombinant viral vector present the desired phenotype (usually after 5 to 6 rounds of selection), it is considered that selection cassettes in the cells is completed.
  • genomic DNA is extracted and purified. Then PCR amplification provides the last restricted bank of active cassettes.
  • the cloning of these cassettes in the cloning vectors allows their physical separation thanks to the propagation of these vectors in bacteria forming isolated colonies.
  • the sequencing of the cassettes found in the different bacterial colonies (usually around thirty colonies are analyzed) makes it possible to know the most frequent random sequences or to determine a motif contained in the random sequences which has been particularly preserved during the selection process. Knowledge of this motif makes it possible to define and construct, by molecular biology, one or more cassettes containing this motif.
  • the cassette or cassettes thus defined can, at this stage, be analyzed individually to validate their effectiveness in acting on the target.
  • the cassette is cloned into the vector pBabe, the homogeneous retroviral vectors obtained are then used individually to produce recombinant viruses which in turn serve to infect the cells studied.
  • the comparison of the relative efficiency of the different cassettes analyzed makes it possible to choose the cassette (s) best suited to act on the target.
  • This screening method was used to identify active RNA capable of rendering the Hela line cells resistant to staurosporine-induced cell papoptosis (0.8 ⁇ M - 6 hours).
  • various cell clones resistant to staurosporine were selected (FIG. 12C) and the expression cassettes which they contain were identified: clones 2, 5, 9, 11, 13, 14, 15, 16, C, J, L and N.
  • the validation of the active RNAs thus identified was carried out according to the mode indicated above in the Hela cells as well as in the Jurkat cells (with a multiplicity of infection less than 1). In each of the cell populations, the level of expression of the active RNAs was evaluated by Northern blot (FIG. 12D).
  • RNA clones 5, 9 13, 15 and 16 exhibit significant activity in Jurkat cells (RNA clone 9 being the most active) while only clone 9 exhibits anti-apoptotic activity in Hela cells ( Figure 12E).
  • the use of an inducible system such as the VAi system can facilitate the various steps described in this process in order to validate the active RNA directly in the cells in which they have been selected (direct elimination of false positives, Figure 15 Panel A)).
  • the VAi system is for this purpose validated in the cells of the Hela T-Rex line (invitrogen ref: R714-07) which constitutively express the TetR transgene of the bacterial repressor of the Tefracycline gene (FIG. 7C).
  • the first step is to hybridize and lengthen two strands of DNA in order to reconstitute a library of fragments of the VA gene into which a random sequence is inserted.
  • This fragment then serves as a matrix for a polymerization chain reaction which makes it possible to obtain the library of random VA expression cassette in its entirety (2 nd step).
  • 3 ⁇ eme step consists in adding, upstream cassettes random VA expression sequences of a promoter operable to effect in vitro transcription. From this random VA transcription library, an in vitro transcription step makes it possible to obtain the random VA RNA library.
  • the single-stranded DNA fragments from the first step are as follows: sense strand: sense bank
  • the random sequence is represented by a 30 base fragment flanked upstream and downstream of two constant 5 base sequences, capable of forming a double helix structure in the final RNA molecule.
  • This structure is positioned at a level which is equivalent to the insertion of the random sequences into the Srfl site of the VAiO inducible expression cassette (see FIG. 7).
  • the two oligonucleotides are extended by DNA polymerase Kleenow fragment which produces the random double-stranded VAiO fragment (FIG. 13 A).
  • the second step consists in constructing from the random double-stranded VAiO fragment the library of full size random VAiO inducible expression cassettes. This step was carried out by a chain polymerization reaction using the following oligonucleotides: sense oligo: VAi5 '
  • the promoter of bacteriophage T7 was added upstream of each random VAiO inducible expression cassette to generate the library of random VAiO inducible transcription cassettes. This step was carried out by polymerase chain reaction using the oligonucleotides VApT7:
  • the library of random T7 VAiO transcription cassettes thus obtained was used to generate in vitro a library of random VAiO RNA thanks to the use of bacteriophage T7 RNA polymerase ( Figure 13B). In these experiments several tens of micrograms of RNA were obtained.
  • the random VA RNA library is used to select RNAs capable of binding a specific subsfrat in vifro.
  • the active RNAs selected by any suitable method known to those skilled in the art serve as a matrix for generating, by a reverse transcription step followed by an amplification step (RT-PCR reaction), the corresponding expression cassettes.
  • This mixture of active RNA expression cassettes is then cloned into a vector suitable for gene transfer and then used as starting material for the in cellulo selection of active RNA (library of random RNA expression cassettes enriched with Active RNAs).
  • the random VA ⁇ IV Srf, VA TAR * or VAiO RNAs were used to obtain the corresponding transcription cassettes.
  • the RT-PCR reaction was carried out in the presence of suitable primers: VApT7 and VAend ( Figure 13 C).
  • suitable primers VApT7 and VAend
  • FIG. 13 C shows that under the conditions under which frois matrix RNA are mixed (VA ⁇ TV Srf RNA VATAR * RNA and VAiO RNA random) equimolecularly (1/3; 1/3; l / 3) the RT-PCR reaction produces three cassettes whose respective quantities reflect the initial quantities of each of the substrate RNAs. So under conditions where the library of random VAiO RNA is used as substrate, the products of the RT-PCR reaction are representative of a library of expression cassettes.
  • constructs of the invention can also be used to test defined active sequences, and / or to express such sequences in biological tissues.
  • the active sequence to be inserted is in the form of double-stranded DNA, the sequence of which has been chosen to generate an effective active RNA (of antisense, ribozyme, interfering RNA type (siRNA, miRNA or their precursors) or RNA aptamer).
  • Double stranded DNA can be obtained by various techniques such as hybridization between two complementary oligonucleotides, purification of restriction fragments, copying of a matrix by PCR, etc.
  • a vector as described in Example B, containing an expression cassette is digested with the appropriate restriction enzyme and the cloning of the active sequence is carried out in this restriction site by conventional cloning techniques.
  • Vectors can thus be produced, whether they are plasmid or viral vectors, for example.
  • recombinant viruses can also be generated, as described in Example C.
  • the recombinant refroviruses produced are then used to infect cells whose phenotype is to be altered.
  • the infection is preferably made with a high multiplicity of infection in order to integrate a high number of cassettes of expression of active RNA in the cell genome. Indeed, the activity of the active sequence is strongly dependent on its level of expression ( Figure 11).
  • the presence of the puromycin resistance gene in the pBabe retroviruses allows rapid selection of the cells which have been infected and which contain the transduced sequence.
  • vectors can also be purified and packaged in any acceptable vehicle or excipient, to produce administrable compositions, for example in mammalian organisms, in particular human.
  • RNA therapeutic molecule determines the functional activity of ribozymes in mammalian cells by controlling their intracellular localization. Rna 3, 75-88 75-88. Bertrand, E., Gwizdek, C, Fenard, D., and Doglio, A. (1999). RNA therapeutic molecule? towards a rational conception of the development of antisense RNA, ribozymes and RNA aptamers. Medicine / Science 15, 677-681.
  • Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped refroviral vectors concenfration to very high titer and efficient gene fransfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad SciU S A 90, 8033-7.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des méthodes et compositions pour le criblage d'ARN actifs in cellulo. Elle concerne notamment des procédés de préparation et de sélection d'ARN aléatoires conférant à une cellule un phénotype désiré, des banques d'ARN aléatoires et leur production, ainsi que des populations cellulaires transformées par ces banques. Elle concerne également l'utilisation des ARN actifs identifiés à des fins de recherche ou thérapeutiques, pour induire un phénotype désiré dans une cellule in vitro, ex vivo ou in vivo, notamment dans des cellules humaines.

Description

Méthodes et Outils pour le criblage d'AKN actifs in cellulo
Introduction
La présente invention concerne des méthodes et compositions pour le criblage et la sélection d'ARN actifs in cellulo. Elle concerne notamment des procédés de préparation et de production de banques de cassettes d'expression d'AKN ou de banques de cellules codant des ARN aléatoires, ainsi que leurs utilisations pour la sélection d'ARN actifs capables de produire ou altérer un phenotype cellulaire d'intérêt. L'invention concerne également l'utilisation des ARN actifs identifiés à des fins de découverte de nouveaux gènes (« drug discovery »), de validation de la fonction de gènes, de développement d'outils pharmacologiques, de diagnostic ou à des fins thérapeutiques avec notamment la possibilité de corriger, grâce aux ARN, l'expression de phénotypes pathogènes dans une cellule in vitro, ex vivo ou in vivo, particulièrement dans des cellules humaines et animales.
Domaine de l'invention
La possibilité d'agir ou d'interférer de manière spécifique avec des cibles biologiques peut avoir de multiples applications, notamment dans les domaines thérapeutique, diagnostique, vaccinal ou expérimental. Ainsi, la capacité de réguler l'expression d'un gène peut permettre de bloquer ou de restaurer une activité dans une cellule et/ou de corriger une pathologie. La faculté de bloquer l'expression de gènes de pathogènes peut permettre de stopper leur développement, etc. L'expression d'un gène résulte de la superposition de plusieurs étapes comprenant la synthèse de l'ARN messager, le métabolisme intracellulaire de cet ARN, la production de la protéine et enfin la stabilité et l'activité de cette protéine. Inhiber l'expression d'un gène consiste donc à agir sur une de ces étapes. Par ailleurs, d'autres métabolites, voies de signalisation ou composants cellulaires peuvent être ciblés comme des sucres, lipides, nucléosides, etc. Dans cette perspective, les ARN apparaissent comme de puissants outils capables d'agir efficacement, spécifiquement et de façon discriminante sur la plupart des étapes de l'expression génique ou sur des cibles biologiques. En effet, la plasticité structurale de l'ARN génère une diversité de motifs structuraux capables de se lier avec la plupart des cibles biologiques, et notamment de molécules organiques présentes dans les cellules (ARN, ADN, protéines et divers métabolites tels que lipides, sucres, etc). Les interactions mises en jeu sont généralement très spécifiques, ce qui confère à l'ARN une forte sélectivité vis-à-vis de sa cible, et l'accumulation intracellulaire d'ARN n'est ni toxique, ni immunogène.
La possibilité de développer, sélectionner et exploiter le potentiel des ARN permettrait donc d'envisager de nombreuses approches thérapeutiques avantageuses, car sélectives et non toxiques pour l'organisme (Famulok and Verma, 2002). Différentes stratégies ont été envisagées dans l'art antérieur pour identifier ou fabriquer de tels ARN. On peut citer notamment la technologie SELEX, destinée à fabriquer et sélectionner in vitro des ARN structuraux aléatoires (Gold, 1995). On peut également citer des approches visant à exprimer des banques d'ARN antisens ou de ribozymes dans des cellules, afin de tester leur activité biologique (WO99/41371, WO99/32618, WO98/32880). Néanmoins, à ce jour, aucune approche de l'art antérieur ne permet de produire ou de sélectionner des ARN actifs in cellulo, dans des conditions optimales et dans une configuration active. Ainsi, les approches in vitro ne sont pas prédictives des propriétés des molécules in vivo, car elles ne permettent pas de présager de leur pénétration cellulaire, de leur localisation cellulaire, de leur stabilité, de leur résistance aux nucléases, et de leur activité biologique. De même, les approches décrites dans les demandes citées précédemment ne sont pas directement exploitables pour l'expression d'ARN structuraux, qui sont actifs dans des configurations particulières, ou pour l'expression efficace d'ARN actifs dans les cellules. De même, la demande n° WO00/58455 propose des approches pour le criblage d'ARN, mais dont les conditions de mise en oeuvre ne permettent pas une exploitation efficace du potentiel de ces agents. Ainsi, les outils, vecteurs et constructions mentionnés dans cette demande impliquent des étapes répétées de sélection in vitro, imposent une sélection individuelle in cellulo des constructions, et ne permettent donc pas une sélection rapide et simple de banques d'ARN dans des configurations actives dans les cellules. Résumé de l'Invention
La présente demande permet de remédier aux inconvénients dé l'art antérieur. La présente demande fournit maintenant de nouvelles méthodes et de nouveaux outils pour la production, l'expression et la sélection dans les cellules, notamment de mammifères, de séquences d'ARN dites « actives ».
La présente invention réside notamment dans la mise au point de conditions particulières de préparation et de criblage des ARN actifs, permettant de sélectionner des composés candidats particulièrement avantageux. L'invention repose notamment, sur l'utilisation de constructions particulières, permettant aux séquences ARN d'être exprimées et localisées à l'intérieur de la cellule, dans une conformation active et stable, et dans des compartiments choisis. L'invention repose également sur la conception et l'utilisation de cassettes d'expression particulières assurant une grande efficacité d'expression dans les cellules de mammifères et ayant un caractère inductible. L'invention décrit en outre la construction de vecteurs viraux améliorés, permettant une sélection efficace et à grande échelle des ARN actifs, et la production de produits directement utilisables pour des applications thérapeutiques. Les motifs actifs ARN sont ainsi sélectionnés directement dans la cellule, à l'aide d'approches innovantes, et notamment selon l'approche désignée par l'appellation «SECAR» («Sélective Enrichment ofCellular Aptamer RNA»).
Un premier aspect de l'invention concerne donc des procédés de sélection, identification ou optimisation in cellulo d'ARN actifs. Les procédés de l'invention peuvent être adaptés pour la sélection in cellulo d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phenotype désiré, y compris d'ARN actifs capables d'altérer l'activité d'une cible biologique déterminée. Les procédés de l'invention comprennent, plus particulièrement :
1) la mise en contact d'une banque d'acides, nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus, éventuellement rendue inductible, exprimant un ARN structural aléatoire distinct, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits rétrovirus recombinants,
2) la sélection des cellules possédant le phenotype désiré, et
3) l'identification de la ou des cassette(s) contenue(s) dans la ou lesdites cellules, ou de l'ARN qu'elles expriment, ledit ARN étant capable de conférer le phenotype désiré à ladite population de cellules.
L'insertion d'un motif actif au sein d'une structure ARN stable (ARN VA) permet de concevoir une entité moléculaire globale, désignée par les inventeurs par le terme "aptARN", composée d'une partie commune à tous lés aptARN (la navette VA) qui sert à stabiliser, présenter et transporter le motif actif dans la cellule. Ce type de véhicule intracellulaire pour aptamère est innovant et permet d'améliorer considérablement la production intracellulaire d'aptamères ARN par rapport aux techniques de l'art antérieur.
La possibilité d'induire l'expression des cassettes au cours des étapes de sélection permet de valider directement l'effet de l'ARN actif dans les cellules sélectionnées grâce à la simple comparaison des phénotypes cellulaires observés en comparant les états réprimés et induits (figure 15, panneau A). Ce procédé simplifie donc considérablement les étapes de criblage phénotypique sur cellules de mammifères pour l'identification in cellulo d'ARN actifs, il constitue de ce fait une amélioration notable de ce type d'approche par rapport à l'art antérieur.
La production et la sélection directes, dans les cellules, des ARN actifs stabilisés selon l'invention est avantageuse car elle permet de sélectionner des molécules se trouvant déjà dans une conformation active intracellulaire.
Comme il sera décrit en détails dans la suite du texte, les étapes 1) à 3) peuvent être répétées une ou plusieurs fois à partir des cassettes ou ARN actifs identifiés à l'étape 3), afin d'améliorer, au fur et à mesure des cycles, la sélection et/ou la qualité des ARN actifs, et/ou d'adapter ou de moduler leurs propriétés. Par ailleurs, selon l'application envisagée, la banque d'acides nucléiques de départ peut être plus ou moins complexe et plus ou moins contrainte. Ainsi, il peut s'agir d'une banque aléatoire non contrainte, ou d'une banque produite à partir de la séquence d'un gène cible donné ou comprenant des motifs ou des résidus imposés, selon le profil des ARN actifs recherchés. Il peut également s'agir d'une banque pré-sélectionnée in vitro, notamment d'une banque codant des ARN pré-sélectionnés in vitro, par exemple d'une banque produite à partir de la séquence d'ARN sélectionnés in vitro pour une propriété particulière (par exemple leur capacité de liaison à une cible d'intérêt).
Par rapport aux approches existantes du type SELEX, l'avantage d'un procédé est de sélectionner, non pas un motif structural ARN considéré isolément en dehors du contexte de son expression intracellulaire, mais une entité moléculaire globale, l'aptARN, présentant une affinité pour une cible pré-identifiée et déjà dans une conformation conforme à celle de son expression intracellulaire.
D'autre part, à l'issue de l'étape 3) du dernier cycle réalisé (ou éventuellement d'un ou plusieurs ou de tout cycle intermédiaire), une étape supplémentaire 4) peut être mise en œuvre, afin de confirmer l'activité biologique du ou des ARN actifs sélectionnés.
De manière avantageuse, l'invention propose donc une combinaison innovante d'éléments génétiques particuliers, selon une méthodologie de sélection particulière, formant ainsi un concept global, intégré et simplifié de criblage phénotypique. Par rapport aux techniques proposées dans l'art antérieur, les outils et méthodes décrites dans la présente demande présentent de nombreux avantages. Ainsi, l'invention montre que des cassettes d'expression dérivées d'un gène VA d'adénovirus peuvent être intégrées et exprimées dans un contexte de vecteur rétroviral. Le transfert rétroviral est très efficace et permet de maîtriser le nombre de copies intégrées par cellules, et les cassettes construites, dérivées de gènes VA forment des cassette intégrées, c'est-à-dire contenant toutes les informations nécessaires à une transcription efficace (promoteur, signal Stop, structure responsable de la stabilité de l'ARN dans la cellule, structure responsable de l'export des ARN vers le cytoplasme, possibilités diverses d'insertion de séquences exogènes et tolérance assez large par rapport au promoteur). L'invention montre en outre que la structure génétique des constructions peut être modifiée pour diriger et déterminer la localisation intracellulaire de l'ARN produit (noyau, cytoplasme) et pour rendre l'expression inductible de manière simple. La combinaison du transfert rétroviral et d'une cassette dérivée d'un gène VA permet donc d'obtenir des niveaux d'expression élevés et contrôlés dans la plupart des lignées cellulaires et d'utiliser des constructions d'ARN identiques in vitro et in cellulo, assurant ainsi une sélection plus efficace de molécules actives et une validation plus rapide des cassettes actives identifiées.
L'invention est applicable dans de nombreux domaines, et notamment pour valider la fonction d'un gène, rechercher de nouvelles cibles impliquées dans une fonction cellulaire, trouver et produire de nouvelles molécules pour le diagnostic, la pharmacologie ou la thérapeutique, etc.
Un autre aspect de l'invention réside dans des banques d'acides nucléiques aléatoires et/ou actifs, éventuellement contenus dans des cassettes et/ou vecteurs. Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne une banque d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de virus recombinants, chaque espèce de virus comprenant une cassette d'expression exprimant un ARN aléatoire (et/ou actif) distinct sous contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, en particulier dérivé de la séquence d'un gène VA d'adénovirus. L'ARN peut être un ARN structural aléatoire ou de séquence définie. De préférence, les virus sont des rétrovirus recombinants.
Un autre objet de l'invention réside dans des cassettes d'expression d'ARN actifs, comprenant une séquence codant ledit ARN insérée dans un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, ledit promoteur pouvant comprendre en outre une séquence conférant un caractère inductible et/ou une modification qui permet de retenir l'ARN dans le noyau.
L'invention concerne également tout vecteur comprenant une telle cassette d'expression, ainsi que des cellules recombinantes les contenant. L'invention a encore pour objet toute composition comprenant un ARN actif, une cassette, un vecteur ou une cellule tels que définis ci-avant et ou identifiés ou produits par le procédé de sélection décrit dans l'invention.
L'invention a encore pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un ARN actif, une cassette, un vecteur ou une cellule tels que définis ci-avant, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un ARN actif, ledit ARN actif comprenant une séquence active insérée dans un
ARN VA modifié, ledit ARN VA modifié comprenant un motif ARN assurant sa localisation dans le noyau de la cellule et/ou une séquence conférant un caractère inductible.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence ARN active ou le motif actif identifié au sein de l'ARN actif. Cette séquence ARN active ou ce motif actif ARN isolé peut en outre être ultérieurement modifié chimiquement par exemple de façon à améliorer sa stabilité en solution.
L'invention concerne également des outils, constructions, lignées, etc., utiles pour la production des compositions définies ci-dessus, notamment des gènes VA modifiés, des gènes tRNA modifiés, des cassettes U6 modifiées, des vecteurs ou cellules les comprenant, et leurs utilisations.
L'invention concerne encore des procédés de production de compositions pharmaceutiques, comprenant (i) le criblage d'une banque d'ARN aléatoires comme décrit ci-avant, permettant d'obtenir une cassette d'expression d'un ARN actif et (ii) le conditionnement de la cassette ou de la séquence ARN active dans tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention est utile pour l'identification, la production, l'expression et/ou la sélection de tout ARN actif sur des cellules, notamment de mammifères. Elle permet la préparation de composés actifs dans différentes situations, notamment pour la production d'agents thérapeutiques, en particulier anti-infectieux , anti-cancéreux, agissant sur le métabolisme de la cellule, agissant sur les processus de différenciation de la cellule, sur la capacité de croissance de la cellule, etc. Comme indiqué précédemment, l'invention offre de nombreux avantages par rapports à l'art antérieur, et permet notamment la sélection directe, rapide et simple de molécule d'ARN actives dans les cellules.
Légende des Figures
La figure 1 décrit le gène VAl de l'adenovirus de type 2 ainsi que son produit de transcription.
La figure 1A représente les séquences nucléotidiques du gène VAl -RNA (région transcrite) (SEQ ID NO : 1). Les nucléotides notés en gras, de 13 à 24 et de 59 à 68, représentant respectivement la boite A et la boite B, sont les éléments nécessaires à la transcription du gène VAl par l'ARN polymérase de type III. Les nucléotides 157 à 160
(TTTT), notés en gras, représentent le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III.
Les nucléotides 93 à 118 soulignés, correspondant à la séquence de la boucle IV, sont délétés dans la construction VAΔIV (SEQ ID NO : 2).
La figure 1B représente la structure secondaire de l'ARN VAl de PAdénovirus de type 2, obtenue d'après le logiciel Mac DNASIS Pro V3.6. La partie délétée dans l'ARN
VAΔTV est indiquée par deux flèches (nucléotides 93 à 118). Le nucléotide 120 est muté dans la construction VAΔIV (C est muté en T).
La figure 2 représente l'étude comparative de la production et de la localisation cellulaire des ARN VAl , VAΔIVSrf et VATAR*.
Figure 2A : Séquence TAR* (SEQ ID NO : 23) insérée dans le site de restriction Srfl du gène VAΔIVSrf pour générer le gène VATAR*. L'oligonucléotide TAR* est dérivé de la séquence TAR du Virus de PImmunodéficience Humaine (HTV-l) (Yamamoto et al., 2000). Figure 2B : Analyse de l'expression des ARN VAl, VAΔIVSrf et VATAR* par Northern Blot. Les différents ARN sont extraits des cellules 293, 48h après transfection de ces cellules par des plasmides contenant les gènes VAl, VAΔIVSrf et VATAR*'.
Figure 2C : Etude de la localisation cellulaire des ARN VAl, VAΔIVSrf et VATAR* dans les cellules humaines 293. Les ARN sont visualisés par hybridation in situ, 48h après transfection de ces cellules par des plasmides contenant les gènes VAl, VAΔIVSrf et VATAR*.
La figure 3 représente le promoteur du gène U6 snRNA humain (Genebank access : X07425) . Les éléments requis pour le recrutement et l'activité de l'ARN polymérase. de type III sont le DSE (Distal Séquence Elément : nucléotides -221 à -216 ), le PSE (Proximal Séquence Elément : nucléotides -64 à -46) et la boite TATA (TATA Box : nucléotides -31 à -24). Au niveau du site +1 de transcription se trouve le site de restriction Sal I (GTCGAC), le premier nucléotide transcrit étant le premier nucléotide de ce site (G).
La figure 4 représente la structure secondaire de l'ARN VAΔIV obtenue avec le logiciel Mac DNASIS Pro V3.6.
La figure 5 représente la structure secondaire de l'ARN VAΔIVSrf obtenue avec le logiciel Mac DNASIS Pro V3.6. Le site de clonage Srfl, qui permet l'insertion des séquences exogènes dans l'ARN VAΔIV Srf, est indiqué par une flèche.
La figure 6 décrit les caractéristiques de l'ARN nVAΔIVSrf (localisation nucléaire).
Figure 6A : Séquence du gène codant l'ARN. nVAΔIVSrf (SEQ ID NO : 4). Les nucléotides notés en gras, de 13 à 24 et de 59 à 68, représentant respectivement la boite A et la boite B, sont les éléments nécessaires à la transcription du gène VAl par l'ARN polymérase de type III. Les nucléotides 138 à 141 (TTTT), notés en gras, représentent le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III. Le site de restriction Srf I (93 à 100) apparaît souligné. Les nucléotides 120, 121 et 122 écrits en minuscule représentent les mutations introduites dans l'ARN VAΔIVSrf pour altérer l'hélice terminale et conférer à cet ARN une localisation nucléaire. Figure 6B : Schéma de la structure secondaire de l'ARN nVAΔIVSrf obtenue avec le logiciel DNASIS Pro V3.6. Le site de clonage Srfl, qui permet l'insertion des séquences exogènes dans l'ARN nVAΔIV Srf, est indiqué par une flèche.
Figure 6C : Etude de la localisation cellulaire des ARN nVAΔIVSrf. Les ARN sont visualisés par hybridation in situ, 48h après transfection des cellules 293 par un plasmide contenant le gène VAΔIVSrf.
La figure 7 présente les différents gènes VA inductibles (VAi) : leurs séquences, les séquences des différents oligonucléotides ADN qui ont été utilisés pour leur construction ainsi que l'étude de leur niveau d'expression cellulaire. .
Figure 7A : Séquences des gènes VAiO (SEQ ID NO : 15), OVAi (SEQ ID NO : 16) et OVAiO (SEQ ID NO : 17). La numérotation des séquences s'effectue à partir du point +1 de transcription ; les séquences situées en amont sont numérotées négativement. Les séquences des Boites A et B, ainsi que le signal d'arrêt de transcription, sont notées en gras. La séquence opératrice TetOl est soulignée ; le site de clonage Srfl est noté en italique.
Figure 7B : Séquences des oligonucléotides ayant servi à la construction des gènes VAi par réaction d'élongation d'amorce ou par réaction de polymérisation en chaîne. Les séquences des Boites A et B ainsi que le signal d'arrêt de transcription sont notées en gras. Les séquences opératrices TetOl sont soulignées ; les sites de clonage Srfl et PvuII sont notés en italique. Les régions complémentaires entre les oligonucléotides VAi up (SEQ ID NO : 18) et VAi down (SEQ ID NO : 19) apparaissent en lettres minuscules. Les zones d'hybridation des oligonucléotides VAi PvuII (VAi PvuII 5' (SEQ ID NO : 20), VAi PvuII 3' (SEQ ID NO : 22) ou OVAi PvuII 5' (SEQ ID NO : 21)) avec les régions codantes des gènes VAi sont également représentées en minuscule.
Figure 7C : Analyse de l'expression des ARN VAi dans les cellules Hela T-Rex après induction par la doxycycline (Dox). Les différents gènes VAi (OVAi, VaiO et OVAiO) ont été clones dans le site Nhel du plasmide pBabe (voir Figure 10). Les cellules de la lignée d'encapsidation 293GP ont été utilisées pour la production des rétrovirus recombinants BabeVAi. Puis les cellules Hela T-Rex (Invitrogen ref : R714-07) qui expriment le répresseur TetR ont été transduites par les différents rétrovirus recombinants babeVAi. Après sélection des cellules transduites par la puromycine (gène de sélection de pBabe), les différents gènes VAi ont été activés grâce à l'ajout de Doxycycline (Dox : l,5μg/ml). Les ARN ont été extraits aux temps indiqués et l'expression des ARN VAi a été analysée par Northern blot.
La figure 8 représente la structure secondaire de l'ARN VAiO obtenue avec le logiciel Mac DNASIS Pro V3.6. La région correspondant à la séquence tetOl est limitée par des flèches.
La figure 9 représente la structure secondaire des ARN h9U6, h20U6 et nh20U6 obtenue avec le programme Mac DNASIS Pro V3.6. Les . ARN schématisés sur cette figure représentent les structures de base invariantes de ces ARN (partie navette). Le motif actif de l'ARN est clone dans le site Sfr I indiqué par une flèche.
La figure 10 représente le vecteur rétroviral pBabe (Morgenstern et Land, .1990). Le site Nhe I correspond au site de clonage des différentes cassettes d'expression des ARN actifs.
La figure 11 montre la relation qui peut exister entre le niveau d'expression d'un ARN actif et son activité biologique. A titre d'exemple, l'ARN actif utilisé ici est l'aptamère TAR* décrit dans la figure 2B. Ce motif TAR* correspond à un motif ARN capable de réprimer la réplication du virus de Pimmunodéficience humaine (HIV). Ce motif TAR* a été clone dans le site Sfr I de la cassette VAΔIVSfr. La construction VATAR* a été insérée dans le site de clonage Nhel du vecteur rétroviral pBabe (voir figure 10). Les cellules de la lignée d'encapsidation 293 GP ont été utilisées pour la production des rétrovirus recombinants Babe et Babe/VATAR*. L'efficacité anti-HIV de VATAR* a été mesurée en utilisant les cellules indicatrices P4 qui constituent un système couramment utilisé pour étudier la multiplication du HIV (Chameau et al., 1994). Les cellules P4 ont été transduites par les rétrovirus Babe et Babe/VATAR* et sélectionnées par l'ajout de puromycine. Le niveau d'expression de l'ARN VATAR* a été analysé par Northern-blot au sein de la population de cellules P4 sélectionnée (population parentale), ainsi que dans 2 clones cellulaires indépendants (clones 1 et 4) isolés à partir de cette population. L'infection de ces différents systèmes cellulaires par le HIV-1 démontre que le clone 1 exprimant un important niveau d'ARN VATAR* résiste plus efficacement à la multiplication du HIV. Le taux d'infection par le HIV-1 est estimé grâce à la mesure de l'activité du gène rapporteur β-galactosidase contenue dans les cellules P4 et les résultats sont présentés en pourcentage du maximum d'infection.
La Figure 12 décrit une application du procédé de sélection d'ARN actifs à partir d'une librairie de cassettes d'expression d'ARN aléatoires clonée dans le vecteur rétroviral pBabe.
Dans cette application, les ARN actifs ont été sélectionnés pour leur capacité à rendre des cellules Hela résistantes à Papoptose induite par la Staurosporine. Figure 12A : Les différentes étapes de synthèse de la librairie de séquences aléatoires. La librairie d'oligonucléoties ADN simple brin comprend de 5' vers 3' : 8 bases fixes surlignées (run A), 26 bases aléatoires puis 8 bases fixes surlignées (run B). L'oligonucléotide run A, complémentaire à Run B est hybride avec la librairie d'oligonucléotides ADN simple brin et allongé grâce à PADN polymérase fragment de Kleenow. Cet ADN double brin néosynthétisé est appelé librairie d'ADN double brin aléatoire.
Figure 12 B : Librairie de vecteurs Babe VA aléatoire. La librairie de vecteurs rétroviraux recombinants Babe VA aléatoire est générée par clonage de la librairie d'ADN double brin aléatoire dans le site Srf I du gène VAΔIV Srf. Cette librairie est donc constituée d'une collection de cassettes d'expression d'ARN VAΔIV Srf contenant chacun un motif aléatoire et clone dans le vecteur rétroviral pBabe.
Figure 12 C : Procédé de sélection des clones de cellules Hela résistantes à la staurosporine. La librairie de vecteurs Babe VA aléatoire est transfectée dans les cellules d'encapsidation de la lignée 293GP pour produire la librairie de rétrovirus VA aléatoires. Cette librairie rétrovirale est utilisée pour transduire la librairie de cassettes aléatoires dans les cellules de la lignée Hela de façon à ce que chaque cellule transduite contienne en moyenne une seule cassette VA aléatoire. Après sélection des cellules transduites, Papoptose cellulaire est induite par ajout de staurosporine (0,8 μM - 6h). Les cellules résistantes à la staurosporine sont amplifiées sous forme de clone cellulaire et les cassettes d'expression des ARN actifs présentes dans chacun des clones sont analysées. A ce stade,
12 cassettes ont été sélectionnées et leur activité anti-apoptotique a été étudiée (Figure 12D).
Figure 12 D : Validation de l'activité anti-apoptotique des ARN identifiés grâce au procédé de sélection SECAR. Les cassettes d'expression d'ARN actifs sélectionnés (en Figure 12C) ont été clonées dans le plasmide pBabe. Ces plasmides recombinants ont été utilisés pour produire des rétrovirus recombinants grâce à la transfection des cellules de la lignée d'encapsidation 293GP. Deux lignées cellulaires différentes (Hela et Jurkat) ont été transduites indépendamment avec les différents surnageants rétroviraux (clone 2, 5, 9, 11, 13, 14, 15 16, C, J, L, et N) et sélectionnées par la puromycine. Les ARN cellulaires totaux issus de ces différentes populations de cellules transduites ont été extraits, puis analysés par Northern blot.
Figure 12 E : Validation individuelle de l'activité anti-apoptotique des ARN identifiés grâce au procédé SECAR. Les populations de cellules Hela et Jurkat exprimant les ARN actifs sélectionnés en Figure 12C ont été soumises à des tests de résistance à la staurosporine (0,8μM pendant 6heures).
Cellules Hela : Les résultats présentés dans l'histogramme reflètent le nombre de cellules résistantes à la staurosporine (Unité arbitraire).
Cellules Jurkat : Les résultats présentés dans l'histogramme correspondent au pourcentage de cellules résistantes à la staurosporine (Mesure de la perméabilité membranaire mitochondriale).
La Figure 13 illustre le procédé de l'invention avec une librairie contrainte pré-sélectionnée in vitro (iv SECAR). Utilisation des cassettes d'expression inductibles.
Figure 13 A : Construction d'une librairie de cassettes de transcription VAiO aléatoire.
Etape 1 : les oligonucléotides banque Sens et banque iv Antisens sont hybrides puis allongés par PADN polymérase fragment de Kleenow pour générer la librairie de fragment VAiO aléatoire. Etape 2 : la librairie de cassettes d'expression VAiO aléatoire est obtenue par réaction de polymérisation en chaîne grâce à l'utilisation d'une Taq DNA polymérase en utilisant pour matrice la librairie de fragment VAiO aléatoire et les oligonucléotides sens VAi5' et antisens VAi end Banque.
Etape 3 : la librairie de cassettes de transcription T7 VAiO aléatoire est obtenue par réaction de polymérisation en chaîne grâce à l'utilisation d'une Taq DNA polymérase en utilisant pour matrice la librairie de cassettes de transcription VAiO aléatoire et les oligonucléotides VApT7 en 5' et VA end en 3'.
Figure 13 B % Production d'ARN dérivés du gène VA : ARN VAΔIV Srf, ARN VA TAR*, librairie d'ARN VAiO aléatoire. Les ARN sont synthétisés in vitro grâce à l'utilisation de PADN polymérase du bactériophage T7, puis sont visualisés sur gel d'agarose après coloration au Bromure d'Éthidium (200 ng par piste).
Figure 13 C : Obtention des cassettes de transcription dérivées du gène VA à partir des ARN synthétisés in vitro. Une réaction de RT-PCR est réalisée à partir de différents substrats ARN synthétisés in vitro en utilisant les oligonucléotides VapT7 et VA end. Les cassettes de transcription correspondant aux différents ARN VA ont été obtenues : cassette d'expression VAΔIV Srf obtenue à partir des ARN VAΔIV Srf; cassette d'expression VATAR* obtenue à partir des ARN VATAR* ; cassette d'expression VAiO aléatoire obtenue à partir des ARN VAiO aléatoire. De même un mélange équimoléculaire des trois types d'ARN (VAΔIV Srf, VATAR* et VAiO aléatoire) permet l'obtention d'un mélange équimoléculaire des cassettes correspondantes. Les produits des réactions de RT-PCR sont visualisés sur gel d'agarose 2% après coloration au Bromure d'Éthidium.
La figure 14 fournit un exemple de construction de gène hybride U6/VA.
Il s'agit ici de mettre le gène VAiO sous le contrôle du promoteur du gène murin U6 : gène mU6/VAiO.
La première étape a consisté à introduire le promoteur du gène U6 murin dans le site Nhel du plasmide pBabe. Le promoteur du gène U6 murin (mU6) a été obtenu par réaction de polymérisation en chaîne en utilisant les amorces mU6 amont et mU6 aval. Dans l'amorce mU6 aval, quatre bases ont été ajoutées (en italique, gras et souligné). L'ajout de ces bases a permis de générer le site Pmel indiqué dans la construction pBabe mU6/VAiO. Dans l'amorce mU6 aval, les quatre bases AAAC soulignées correspondent aux quatre dernières bases du promoteur U6 et aux quatre premières bases du site de restriction Pme I (GTTTAAAC). Dans la réaction de polymérisation en chaîne, la matrice utilisée correspond à PADN génomique de cellules murines. Le produit de cette réaction de polymérisation en chaîne a été purifié, puis ligué dans le plasmide pBabe digéré par Nhe I. Le produit de ligation est appelé pBabe mU6.
La deuxième étape a consisté à insérer le gène VAiO dans le site Pmel du plasmide pBabe mU6. Le gène VAiO a été produit par une réaction de polymérisation en chaîne utilisant les amorces VAiO Start et VAiO End Nhel, la matrice étant le plasmide pBabe VAiO. L'amorce VAiO End Nhel contient le site de restriction Nhel noté en gras et souligné. Le produit de cette réaction a été purifié puis ligué dans le plasmide pBabe mU6 digéré par Pmel. Le produit de ligation est appelé pBabe mU6/VAiO.
La figure 15 fournit une description générale des stratégies de criblage d'ARN actifs selon l'invention.
Panneau A : Procédé de sélection des cassettes d'expression d'ARN actif inductibles (SECAR) : Ce procédé permet la sélection in cellulo d'ARN capables de conférer à une cellule un phenotype donné. Le criblage phénotypique présenté dans ce panneau est effectué grâce à l'utilisation de cassettes d'expression inductibles ; il s'effectue en six étapes. Étape 1 : La librairie de cassettes d'expression d'ARN aléatoires est transférée sur les cellules d'intérêt, via un vecteur rétroviral. Le transfert est ainsi optimisé : il est adapté à tout type cellulaire et permet de contrôler le nombre de cassettes insérées par cellule. Étape 2 : Les cellules ayant intégré le nouveau matériel génétique (cassette d'expression d'ARN aléatoire) sont sélectionnées grâce à un gène de sélection présent dans le vecteur rétroviral.
Étape 3 : Grâce à l'utilisation de cassettes d'expression inductibles, l'expression des cassettes est induite afin d'activer la transcription des ARN aléatoires. Etape 4 : La sélection des cellules qui expriment les ARN actifs et qui présentent le phenotype d'intérêt est effectuée. Ces cellules sont amplifiées. Étape 5 (facultative) : Les cassettes d'expression des ARN actifs présentes dans les cellules sélectionnées à cette étape peuvent être copiées et à nouveau transférées dans les cellules d'intérêt. Ainsi les étapes 1 à 4 peuvent être répétées autant que nécessaire. Étape 6 : Dans les clones cellulaires obtenus en fin d'étape 4 ou 5, l'activité des cassettes est validée par comparaison des états induits ou réprimés. L'ARN est validé en tant qu5 ARN actif quand le phenotype cellulaire recherché est observé dans la seule condition pour laquelle la cassette d'expression est induite. Au contraire, l'ARN n'est pas validé en tant qu'ARN actif quand le phenotype cellulaire recherché est observé quelles que soient les conditions : cassette d'expression induite ou cassette d'expression réprimée.
Panneau B : Procédé de sélection des cassettes d'expression d'ARN actif après enrichissement préalable en séquences actives (ivSECAR pour «in vitro Sélective Enrichment of Cellular Aptamer RNA») Ce procédé, comme le procédé SECAR, permet la sélection in cellulo d'ARN capables de conférer à une cellule un phenotype donné. Dans ce cas, le criblage est effectué en utilisant une librairie d'ARN aléatoires, enrichie en ARN capables de lier une cible donnée. Les premières étapes du criblage sont effectuées in vitro, à partir d'une banque d'ARN aléatoires ; les ARN utilisés pour le criblage in vitro ont une structure identique à ceux qui seront exprimés in cellulo dans les étapes ultérieures. Étape 1 : A partir d'une librairie de cassettes de transcription d'ARN aléatoires, la librairie d'ARN aléatoire est produite in vitro. Les ARN ainsi synthétisés in vitro ont les mêmes propriétés structurales que les ARN qui sont synthétisés in cellulo, à partir d'une banque de cassettes d'expression d'ARN aléatoires. Étape 2 : La banque d'ARN aléatoire est mise en contact avec la cible d'intérêt. Étape 3 : Les ARN capables de lier la cible sont retenus grâce à un procédé approprié.
Étape 4 : Les ARN retenus en fin d'étape 3 sont utilisés pour produire une nouvelle librairie de cassette de transcription d'ARN aléatoires, enrichie en séquences actives. Les étapes 1 à 4 sont ainsi renouvelées à volonté. En fin d'étape 4, une librairie « restreinte » de cassettes d'expression d'ARN actifs est obtenue. Étape 5 : Cette librairie restreinte est par la suite utilisée dans des essais cellulaires selon le procédé SECAR décrit dans le panneau A. Description Détaillée de l'Invention
L'invention concerne, de manière générale, des outils et procédés de sélection in cellulo d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phenotype désiré, ainsi que l'utilisation de ces ARN actifs ou de tout ADN codant dans le domaine expérimental ou pharmaceutique, par exemple. Comme indiqué précédemment, l'invention utilise, de manière particulièrement avantageuse, la combinaison de vecteurs rétroviraux et de cassettes dérivées de gènes VA, permettant un criblage simple, efficace et prédictif, in vitro comme in vivo.
ARN actifs
La présente invention est adaptée à la production, l'expression et/ou la sélection de toute molécule d'ARN active, c'est-à-dire de molécules d'ARN capables d'interagir avec et/ou d'altérer l'activité de composants biologiques, et/ou de conférer à une cellule un phenotype donné. Le terme ARN actif inclut notamment des ARN structuraux (tels que les aptamères) et des ARN non-structuraux, tels que des antisens, des ribozymes ou des ARN interférants (siARN, miARN ou leurs précurseurs ). Les ARN actifs peuvent être de longueur variable, comprise typiquement entre 8 en 500 bases, plus préférentiellement entre 8 et 200, notamment entre 8 et 150. Les ARN actifs sont généralement synthétisés sous forme de molécules simple-brin, même s'ils peuvent ultérieurement adopter des structures tri- dimensionnelles de type boucle, régions double-brins, hélices, etc.
Dans un mode spécifique et préféré de l'invention, l'ARN actif est un ARN structural, notamment un aptamère (Famulok and Verma, 2002) (Hermann and Patel, 2000). Les aptamères sont des oligonucléotides capables de lier spécifiquement une molécule cible. Dans un autre mode spécifique de l'invention, l'ARN actif est un ARN interférant (siARN, mi ARN ou leurs précurseurs) (McManus and Sharp, 2002) (Scherr et al., 2003) (Famulok and Verma, 2002) ou un ARN antisens.
La présente demande est en effet particulièrement adaptée à la conception et au criblage d'ARN dont l'activité requiert une configuration spatiale particulière.
Les procédés décrits dans la présente demande permettent de sélectionner des ARN actifs à partir de collections ou banques de séquences aléatoires, générales ou restreintes, pouvant comprendre un très grand nombre de séquences aléatoires distinctes. Comme il sera décrit plus en détails dans la suite du texte, les séquences aléatoires peuvent être toute molécule d'ADN ou d'ARN comprenant au moins un élément de séquence non connu, plus précisément dont une partie au moins de la séquence est aléatoire. La sélection des ARN actifs selon l'invention est réalisée in cellulo, grâce à l'insertion des séquences aléatoires dans des cassettes d'expression et dans des conditions particulières. Un des avantages principaux de la sélection in cellulo est que la cible de l'ARN actif n'est pas forcément choisie à priori ; de plus l'ARN actif sélectionné est réellement efficace dans les conditions d'utilisation cellulaire.
Promoteur dérivé du gène VA d'un adénovirus
Comme indiqué ci-avant, une caractéristique de l'invention réside dans l'utilisation de cassettes d'expression particulières, permettant la production in cellulo d'ARN actifs, dans des configurations optimales.
En particulier, d'une manière particulièrement avantageuse, les constructions, compositions et méthodes de l'invention utilisent un promoteur dérivé de la séquence d'un gène VA d'adénovirus.
Plusieurs travaux, dont ceux des inventeurs, ont démontré l'utilité du gène VAl pour exprimer dans la cellule des ribozymes, des aptamères ou des antisens, dont la séquence était parfaitement définie (Médina and Joshi, 1999) (Barcellini et al., 1998) (Bertrand et al., 1999) (Cagnon et al., 1995) (Gwizdek et al., 2001).
La présente demande démontre pour la première fois la possibilité et l'efficacité d'utiliser ce type de construction pour la production et le criblage de banques d'ARN aléatoires (ou de banques contraintes) in cellulo, notamment dans un contexte rétroviral. Elle décrit également différentes modifications dans le gène VA afin de générer des cassettes améliorées conférant un meilleur contrôle des paramètres d'expression. Les séquences codant pour les ARN actifs peuvent ainsi être clonées dans la cassette, principalement dans le domaine central du gène. Le positionnement de la séquence active au sein du domaine central ne modifie pas le niveau de production, et la localisation de l'ARN chimérique dans la cellule (figure 2). L'utilisation d'un tel promoteur est particulièrement avantageuse pour l'expression d'ARN actifs structuraux, notamment d' aptamères.
Le génome des adénovirus contient deux petits gènes qui sont transcrits par l'ARN polymérase III, les gènes VAl et VA2 (Mathews and Shenk, 1991). L'ARN VAl, et à un moindre degré l'ARN VA2, sont abondamment produits pendant le cycle de réplication de l'adenovirus. L'interaction entre l'ARN VAl et une kinase cellulaire (PKR ou p68 kinase) bloque l'effet antiviral induit par les interférons et facilite la production de nouveaux virus (Mathews and Shenk, 1991).
Le gène VAl des adénovirus code pour un ARN court (ARN VAl 160nt) caractérisé par une structure secondaire riche en région double brin. L'organisation génétique de ce gène transcrit par l'ARN polymérase III est simple et comprend une courte région promoteur en position intragénique (boite A et boite B) et un signal d'arrêt de transcription (voir figure 1A). La structure secondaire de l'ARN VAl est bien connue (figure 1B). La séquence du gène VAl de l'adenovirus de type 2 est représentée sur la figure 1A (SEQ ID NO :1). La séquence de l'ARN codé correspondant est donnée ci-dessous.
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGj CCCC GGAUCCGGCC GUCCGCCGUG AUCCAUGCGG UUACCGCCCG CGUGUCGAAC CCAGGUGUGC GACGUCAGAC AACGGGGGAG CGCUCCUUUU -160
Les boîtes A et B correspondent aux nucléotides 11-24 et 59-68 en gras, respectivement, et le domaine central contenant la boucle IV correspond aux nucléotides 93 à 118.
Dans un premier mode de réalisation particulier de l'invention, la cassette comprend la séquence d'un gène VAl d'adénovirus délété de tout ou une partie fonctionnelle de la boucle IV, dans laquelle la séquence codant l'ARN actif est insérée. Comme indiqué ci- dessus, le domaine central contenant la boucle IV correspond aux nucléotides 93 à 118 du gène VA. La séquence d'ARN transcrits par des cassettes d'expression selon l'invention comprenant la séquence d'un gène VA délété de la boucle IV est fournie ci-après :
SEQ ID NO : 2 (VAΔIV): 1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC GUCCGCCGUG AKAiJCCAGGU GUGCGACGUC AGACAACGGG GGAGCGCUCC UUUU -134
La séquence SEQ ID NO : 2 (VAΔIV) est dérivée de VAl Ad2 par délétion du domaine central de 93 à 118. Le nucléotide 94 (120 dans VAl) a été muté de façon à créer un site de clonage EcoRV (en italique souligné). Le site de coupure EcoRV se situe entre 92 et 93.
SEQ ID NO : 3 (VAΔIVSrf) 1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC GUCCGCCGUG ROGCCCGGGC AUCCAGGUGU GCGACGUCAG ACAACGGGGG AGCGCUCCUU UU -142 (SEQ IDNO: 3)
La séquence SEQ ID NO : 3 (VAΔIVSrf). ci-dessus, est dérivée de VAΔIV après insertion de la séquence du site Srfl dans le site EcoRV (en italique souligné). Le site de la coupure Srfl se situe entre 96 et 97. Dans un autre mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec le précédent, la double-hélice termmale du gène VAl est altérée. Cette altération permet de contrôler la localisation cellulaire de l'ARN synthétisé (Gwizdek et al., 2001). Ainsi, lorsque l'hélice terminale du gène VAl est intacte, l'ARN synthétisé se trouve de façon naturelle essentiellement dans le cytoplasme. Cette localisation est adaptée pour cribler des ARN actifs sur des cibles biologiques présentes essentiellement dans ce compartiment cellulaire. De manière alternative, lorsque l'hélice terminale du gène VAl est altérée, l'ARN synthétisé se trouve essentiellement localisé dans le noyau. Cette localisation est adaptée pour cribler des ARN actifs sur des cibles biologiques essentiellement nucléaires. L'hélice terminale est formée essentiellement par l'appariement entre les 20 premiers et les 20 derniers nucléotides de la séquence de l'ARN codé par le gène VAl. L'altération de l'hélice peut être obtenue par différentes modifications introduites au sein de ces éléments de séquence, notamment par mutation, délétion et/ou insertion, de préférence par mutation. Lorsque la séquence de l'hélice est inférieure à environ 15 bases, l'hélice est altérée fonctionnellement et l'ARN VAl est retenu dans le noyau. Egalement, lorsque la double hélice est mutée de manière à introduire une succession de nucléotides non appariés qui forment une ouverture au sein de l'hélice (bulle), cette dernière est altérée fonctionnellement et l'ARN est retenu dans le noyau.
La séquence d'un ARN transcrit par une cassette d'expression selon l'invention comprenant la séquence d'un gène VA délété de la boucle IV et une double-hélice terminale altérée est fournie ci-après (SEQ ID NO : 4) :
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG ΑVGCCCGGGC AUCCAGGUGU GCGACGUCAa uaAACGGGGG AGCGCCCUUU U -141
La séquence SEQ ID NO : 4 (nVAΔIVSrf) est dérivée de VAΔlVSrf par mutation des nucléotides 120 à 122 (minuscules) etdélétion du nucléotide 136. . Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, qui peut être combiné avec l'un ou les précédents, le gène VAl comprend une séquence conférant un caractère inductible. Quelle que soit l'utilisation faite de l'ARN actif (antisens, ribozyme, aptamère, siARN, miARN et leurs précurseurs) exprimé au sein d'une cellule, le contrôle de son expression est un élément déterminant. Dans cet objectif, la présente invention montre, pour la première fois, que la structure des gènes VAl peut être modifiée de manière à rendre leur expression inductible, tout en conservant par ailleurs les caractéristiques décrites précédemment (niveau d'expression élevé, contrôle de localisation, possibilité d'insertion de séquences actives dans le domaine central). Ces résultats sont particulièrement inattendus compte tenu de la structure intragénique du promoteur VA, et permettent la conception de cassettes d'expression ayant des propriétés remarquables pour le criblage d'ARN actifs in cellulo (voir Figure 15A). Ainsi, l'invention propose et permet, pour la première fois, la validation in cellulo de l'activité des cassettes sélectionnées par comparaison des états induits et réprimés. Cette approche permet de réduire le nombre de faux positifs et de simplifier et d'accélérer l'identification des ARN d'intérêt.
Plus particulièrement, la présente invention montre qu'un gène VA inductible peut être construit par insertion d'une ou plusieurs séquences conférant un caractère inductible, typiquement entre les boîtes A et B du gène et/ou en amont du gène, de préférence en remplacement de tout ou partie des séquences normalement présentes. Dans le cas où la séquence est insérée entre les boite A et B, cette nouvelle séquence se retrouve dans une région de l'ARN VAl qui est transcrite, et provoque donc des altérations de la structure secondaire native de l'ARN VAl susceptibles de le rendre moins stable. Afin de corriger ces altérations, des mutations compensatrices peuvent être introduites au sein de la séquence VAl, de manière à corriger ces défauts de structure et à recréer ainsi les appariements naturels de l'ARN VAl. Ces cassettes optimisées permettent de contrôler l'expression des ARN actifs dans les cellules, et d'améliorer les conditions d'un criblage, ou de l'utilisation en recherche ou en thérapeutique.
Dans un mode particulier, l'invention concerne donc un acide nucléique comprenant la séquence d'un gène VA d'un adénovirus, modifié par insertion d'une ou plusieurs séquences conférant un caractère inductible, de préférence entre les boîtes A et B et/ou en amont du gène, plus préférentiellement en remplacement de tout ou partie des séquences natives.
La séquence conférant un caractère inductible peut être toute séquence conférant une sensibilité à un facteur agissant en trans. Il peut s'agir de préférence d'un site de liaison d'un facteur transcriptionnel ou d'un répresseur, ou de tout autre agent ou molécule. Dans un mode de réalisation préféré, il s'agit d'une ou plusieurs séquences opératrices d'un promoteur bactérien régulé, par exemple du promoteur de la téfracycline.
Le promoteur des gènes bactériens tet contient deux types de séquences opératrices Ol et O2 qui servent de site de fixation pour le répresseur TetR (Hillen et Berens, 1994). Chacun des sites tetOl et tetO2 lie un homodimère de TetR. Des études ont montré que le site de fixation tetO2 avait une affinité pour Phomodimère TetR trois à cinq fois plus importante que tetOl (Hillen et Berens, 1994). Les séquences opératrices tetOl ont ainsi été insérées à l'intérieur de séquences promotrices hétérologues eucaryotes afin d'obtenir un système d'expression eucaryote régulable par la téfracycline (Gossen and Bujard, 1992). Cependant, une telle modification ou application n'a jamais été envisagée à partir du gène VAl des adénovirus, dont la manipulation est particulièrement délicate compte tenu de la présence du promoteur dans les séquences transcrites.
Nous avons inséré une ou deux séquences tetOl en amont du gène VAl afin de rendre son expression inductible par ajout de téfracycline. Ainsi, les séquences situées entre les Boite A et B ou placées en amont du premier nucléotide transcrit du gène VAl ont été remplacées par des séquences tetOl. En absence de téfracycline, l'expression du gène VAl modifié peut ainsi être réprimée par la liaison des homodimères de TetR sur les séquences cis- régulatrices. L'ajout de téfracycline permet de libérer le répresseur de sa fixation sur les séquences tetO, et au gène VAl d'être normalement exprimé.
Dans un mode particulier, l'invention concerne donc un acide nucléique comprenant la séquence du gène VAl d'un adénovirus, modifié par insertion d'une ou plusieurs séquences opératrices servant de site de fixation pour le répresseur TetR. De préférence, la ou les séquences opératrices sont insérées entre les boîtes A et B de la séquence du gène VA et/ou placées en amont du gène, plus préférentiellement en remplacement de tout ou partie des séquences natives. L'invention concerne également toute cassette d'expression comprenant une séquence codant un ARN actif insérée sous contrôle d'un promoteur VA inductible, (VAi) notamment par la téfracycline. La séquence d'exemples spécifiques de gènes VA inductibles construits selon l'invention est représentée dans les séquences SEQ ID NO: 15 (VaiO), SEQ ID NO: 16 (OVAi) et SEQ ID NO: 17 (OVAiO).
Des cassettes spécifiques dérivées de la séquence de gènes VA et permettant l'expression d'ARN aléatoires ou actifs sont décrites dans les exemples, qui représentent des objets particuliers de l'invention. On peut ainsi citer les cassettes VAΔIVSrf, nVAΔIVSrf, VAi et nVAi.
D'autre part, dans un mode de mise en oeuvre particulier, les cassettes d'expression de l'invention comprennent, en plus du promoteur dérivé du gène VA d'un adénovirus, un second promoteur transcriptionnel, différent du promoteur VA. L'utilisation de telles constructions hybrides est notamment intéressante lorsque le promoteur dérivé du gène VA n'est pas fonctionnel dans un type cellulaire particulier. Dans ce cas, l'ARN actif et configuré dans la séquence VA peut être exprimé sous contrôle d'un second promoteur, qui peut êfre de nature et d'origine variées. Avantageusement, le second promoteur est un promoteur transcrit par l'ARN polymérase de type III, et qui est fonctionnel dans le type cellulaire concerné, notamment un promoteur extra-génique. En aval de ce second promoteur, au niveau du site +1 de transcription, est clonée la cassette d'expression dérivée du gène VA (VAΔIV, VAΔIV Srf, nVAΔIV, VAi ou toute autre cassette dérivée du gène VA). Selon un mode préféré, le promoteur du gène U6 est choisi en tant que second promoteur permettant une transcription active du gène VA ainsi clone.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une cassette d'expression hybride comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus, éventuellement rendue inductible, exprimant un ARN actif (aptamère, antisens, ribozyme, ARN interfèrent : Si ARN, miARN ou leurs précurseurs), placée en aval d'un second promoteur transcriptionnel. La construction de ce type de cassettes hybrides est détaillée dans les exemples (voir exemple A-3) et dans les figures.
Promoteurs dépendants de l'ARN Polymérase III
Dans certains modes de réalisation particuliers de l'invention, par exemple pour les cassettes hybrides, il peut être possible d'utiliser d'autres promoteurs dépendants de l'ARN Polymérase III pour l'expression des ARN actifs. Il peut s'agir d'un promoteur localisé à l'intérieur des séquences transcrites (intragénique), comme le promoteur des gènes tRNA. U peut également s'agir d'un promoteur localisé en amont des séquences transcrites (extragénique), comme les promoteurs du type U6 codant le petit ARN nucléaire U6 (snRNAU6). En outre, le promoteur utilisé peut êfre rendu inductible.
La transcription du gène U6 humain (hU6) génère un petit ARN nucléaire (ARN snU6) intégré dans un complexe ribo-nucléoprotéique responsable de l'épissage des ARN (Gmeiner, 2002). Le promoteur hU6 est placé en amont de la séquence transcrite, et les séquences correspondant à ce promoteur ne sont donc pas produites dans la cellule. Cela a pour avantage principal de n'imposer que peu de contraintes de séquence dans la région transcrite de la cassette (Bertrand et al., 1997). En effet, le deuxième nucléotide transcrit correspond au premier nucléotide apporté par la séquence exogène et les derniers nucléotides correspondent au signal stop (figure 3). Il est donc possible, grâce à ce type de cassette, de produire dans la cellule des ARN artificiels (antisens, ribozymes, aptamères, ARN interférents : siARN, miARN et leurs précurseurs) dont on contrôle la quasi-totalité de la séquence transcrite.
Afin de contrôler la stabilité des ARN générés ainsi que leur localisation cellulaire, différentes cassettes d'expression utilisant un promoteur U6 ont été construites par les inventeurs. Ces cassettes permettent l'expression d'ARN cytoplasmiques ou nucléaires, structuraux ou non structuraux, contraints ou non-contraints. Des modifications ont ainsi été apportées au promoteur U6, dans le but de faciliter le clonage des séquences actives, de maîtriser les séquences transcrites dès le point +1 de transcription, de stabiliser les séquences actives et de maîtriser la localisation intracellulaire de ces séquences.
Dans un premier mode de réalisation, une séquence servant de base structurale pour l'ARN actif est placée en aval du promoteur U6. Cette séquence de structuration contient plus préférentiellement une séquence capable de générer une (courte) hélice ARN (plus ou moins stable et plus ou moins longue), et/ou un site de clonage bord franc et/ou un signal d'arrêt de transcription (par exemple TTTTT). La séquence permettant la formation d'une hélice ARN comprend typiquement deux régions complémentaire espacées par une région charnière. Ce type de cassette est surtout utile pour l'expression intracellulaire de motifs d'ARN structuraux. Lorsque le motif actif est lui-même structuré sous la forme d'une hélice, la séquence de structuration comprend de préférence un motif navette court (typiquement de 5 à 12 bases). Lorsque le motif actif n'est pas structuré en hélice ou très court, la séquence de structuration comprend de préférence un motif navette long, comprenant typiquement de 12 à 20 bases. Ce motif peut être structuré pour former une hélice parfaite assurant à l'ARN produit une localisation cytoplasmique ou bien être structuré pour former une hélice perturbée afin d'obtenir une localisation nucléaire de l'ARN généré.
Dans un autre mode de réalisation, qui peut être combiné au précédent, une séquence formant une courte structure en épingle à cheveux est placée en aval du promoteur U6 (et, le cas échéant, de la séquence de structuration). Cette séquence forme une structure ARN stable placée à l'extrémité 3' de l'ARN actif ou aléatoire synthétisé, protégeant ainsi l'ARN produit de la dégradation par des RNAses. En aval de cette structure de stabilisation se trouve le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III : TTTTT.
Dans un mode de réalisation alternatif, la cassette comprend le promoteur U6 auquel est directement liée la séquence codant l'ARN actif. Une telle cassette permet d'exprimer des ARN dont la séquence est choisie dès le point +1 de transcription.
Selon un mode particulier, la cassette comprend un promoteur U6 tel que défini ci-dessus et une ou plusieurs séquences conférant un caractère inductible, comme décrites précédemment. La ou les séquences conférant le caractère inductible peuvent être placées par exemple en amont de la séquence du promoteur.
Des cassette spécifiques dérivées du promoteur U6 et permettant l'expression d'ARN aléatoires ou actifs sont décrites dans les exemples, qui représentent des objets particuliers de l'invention. On peut ainsi citer les cassettes U6hélices, U6Srf, U6Tt, etc.
Dans d'autres modes de mise en œuvre particuliers, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est issu d'un promoteur des gènes ARNt. En outre, ces promoteurs peuvent êfre modifiés pour leur conférer un caractère inductible.
Vecteurs
Les cassettes d'expression selon l'invention sont typiquement clonées ou comprises dans des vecteurs, de clonage et/ou d'expression. De tels vecteurs peuvent être de nature et/ou d'origine variée, comme des plasmides, virus recombinants, vecteurs viraux, épisomes, chromosomes artificiels, phages, etc. De préférence, les vecteurs sont de type plasmide, viral ou épisomiques.
Ainsi, un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie précédemment.
Lorsque le vecteur est de type plasmide, il peut être issu de différents plasmides connus ou commerciaux. Il comporte typiquement une origine de réplication compatible avec l'utilisation désirée. Il peut comprendre en outre un gène de sélection et, éventuellement, une séquence d'intégration dans le chromosome. Des exemples de plasmides utilisables pour la production de vecteurs de l'invention sont notamment les plasmides pUC, pcDNA, pW2, plasmides à réplication épisomique dérivés du virus Epstein-Bar du type OriP.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, le vecteur est de type viral. Il peut s'agir d'un virus recombinant, c'est-à-dire d'une particule virale recombinante comprenant un génome viral recombinant dans lequel est insérée au moins une cassette telle que définie précédemment. Il peut également s'agir d'un vecteur viral, c'est-à-dire d'une construction génétique comprenant un génome viral recombinant dans lequel est insérée au moins une cassette telle que définie précédemment.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le vecteur est un vecteur rétroviral ou un rétrovirus recombinant. La présente demande montre en effet que le transfert d'une cassette de l'invention dans des cellules cibles est très efficace après clonage de cette cassette dans un vecteur rétroviral. La présente demande montre notamment de manière inattendue que les cassettes dérivées des gènes VAl peuvent êfre transduites efficacement dans les cellules cibles, dans un contexte rétroviral. En particulier, après intégration du vecteur rétroviral contenant la cassette dans le génome de ces cellules, le niveau d'expression de l'ARN chimérique est important et les propriétés de la cassette sont conservées.
Les virus ont été utilisés pour vectoriser des acides nucléiques in vitro ou in vivo. Différentes approches ont été décrites pour la production de virus recombinants, conduisant typiquement à la production de virus défectifs pour la réplication, comprenant un segment d'acide nucléique exogène codant une produit désiré. De tels virus ont été construits à partir de rétrovirus (MLV, lentivirus, etc.), d'adénovirus (Ad5, Ad2, CAV, etc.), d'AAV, de virus de l'herpès, etc. Dans chacune de ces approches, un vecteur viral est construit comprenant les séquences nécessaires en cis à l'encapsidation d'un acide nucléique dans une particule virale et, éventuellement, des séquences régulatrices ou codantes complémentaires.
Dans le cas des réfrovirus, de nombreuses constructions ont été décrites, dans lesquelles tout ou partie des gènes gag, pol et/ou env sont délétées, et dans lesquelles un acide nucléique d'intérêt est introduit. Ce dernier peut être inséré en remplacement des séquences délétées, ou dans d'autres régions, comme par exemple dans un LTR. Des vecteurs viraux connus de l'homme du métier sont notamment MFG, pBABE, etc. Typiquement, un vecteur rétroviral de l'invention comprend donc les régions terminales LTR, la séquence d'encapsidation, un gène de sélection et l'acide nucléique codant l'ARN actif, selon l'invention. Un tel vecteur viral peut être construit à partir de différents types de rétrovirus, et utilisé pour produire des virus recombinants par introduction dans une lignée d'encapsidation exprimant les protéines virales GAG, POL et ENV. De telles lignées ont été décrites dans Part antérieur (PsiCRIP, PA317, Gpenv, 293GP etc.).
Un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur rétroviral défectif pour la réplication, comprenant une séquence LTR, une séquence d'encapsidation rétro virale et au moins une cassette d'expression telle que définie précédemment.
Les vecteurs de l'invention peuvent comprendre une ou plusieurs cassettes d'expression d'ARN, identiques ou différentes. Ainsi, des vecteurs multi-cassettes peuvent être construits, dans lesquels des cassettes peuvent être insérées, par exemple en tandem. La possibilité de cloner plusieurs cassettes dans un même vecteur peut concerner une seule séquence ARN active, ou plusieurs séquences d'ARN actifs différents. Dans le premier cas, la même cassette est recopiée plusieurs fois avant d'être insérée dans le vecteur ; dans le deuxième cas, les différentes cassettes sont placées les unes à coté des autres et insérées dans le vecteur, ou clonées séquentiellement, en des sites distincts du vecteur.
Les vecteurs peuvent êfre construits par des techniques connues de biologie moléculaire, notamment par clonage, ligation, amplification, etc.
Comme indiqué précédemment, l'utilisation combinée d'un vecteur rétroviral et de séquences dérivées du gène VA d'un adénovirus, selon les méthodes décrites dans la présente demande, permet de fournir un système intégré, simple et prédictif de l'activité d'ARN aléatoires, in vitro comme in vivo.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un vecteur tel que défini précédemment. La composition peut être une composition pharmaceutique, comme il sera décrit plus en détail dans la suite du texte. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une pluralité de vecteurs tels que définis précédemment. La composition peut être une banque, comme il sera décrit plus en détail dans la suite du texte.
Banque
Au sens de l'invention, le terme banque (ou librairie) désigne un produit ou une composition complexe comprenant une pluralité ou une multitude de composants ou de membres, qui peuvent êfre présents en mélange(s) ou dans des compartiments séparés. Les banques selon l'invention comprennent typiquement une pluralité d'ARN actifs, ou de cassettes codant de tels ARN actifs, qui peuvent être clonées dans des vecteurs, notamment des plasmides, vecteurs viraux, virus, et/ou dans des cellules. Typiquement, bien que cela ne soit pas obligatoire, toutes les cassettes et/ou vecteurs d'une même banque ont sensiblement la même structure, ces composants différant les uns des autres par la nature (e.g., longueur, origine, type, etc.) et/ou la structure (e.g., séquence) des ARN actifs codés. En oufre, une banque comprend généralement plusieurs copies de chaque composant ou membre. La complexité de la banque peut varier dans une large mesure. Ainsi, une banque peut êfre composée de deux composants comprenant des cassettes d'expression d'ARN actifs distincts, de préférence de 10 au moins, encore plus préférentiellement de 20 au moins. Des banques typiques comprennent plus de 100, 500 ou 1000 composants distincts, par exemple jusqu'à 109 ou plus encore. S 'agissant de banques de cassettes d'expression d'ARN aléatoires, il est clair que la composition précise (e.g., la séquence) des composants de la banque est généralement et par principe non connue, au moins en partie. Les composants de la banque (e.g., cassettes, vecteurs, cellules, etc.) peuvent êfre présents sous des formes diverses, comme sous forme liquide, gel, lyophilisée, etc. Ils peuvent être immobilisés sur un support ou en suspension, sous forme soluble. La banque comprend généralement un support physique contenant les différents membres de la banque, qui peuvent êfre en mélange(s), au moins partiel(s), ou séparés. Le support peut ainsi comprendre un ou plusieurs compartiments séparés physiquement, tels que des flasques, tubes, bouteilles, plaques multi-puits, etc. La banque peut être conservée sous différentes formes, notamment en suspension liquide ou congelée, répliquée, etc., en tout ou en partie. Les banques de l'invention comprennent typiquement une pluralité de vecteurs comprenant chacun une cassette d'expression d'un ARN aléatoire comme décrit précédemment, les vecteurs étant au moins en partie sous forme de mélange. De préférence, la banque comprend au moins 50, 100 ou 200 vecteurs codant un ARN aléatoire distinct. Elle peut comprendre jusqu'à plusieurs milliards d'espèces moléculaires distinctes.
Les séquences aléatoires peuvent être toute molécule d'ADN ou d'ARN comprenant au moins un élément de séquence non connu, plus précisément toute molécule d'ADN ou d'ARN dont une partie au moins de la séquence est aléatoire. De tels acides nucléiques aléatoires peuvent typiquement comprendre une région aléatoire bordée, à l'une ou aux deux extrémités, d'une région de séquence définie. La région aléatoire peut comprendre par exemple de 8 à 50 bases, et la ou les régions définies de 2 à 10 bases. L'acide nucléique aléatoire peut être un ARN simple-brin, produit par synthèse chimique, ou par amplification ou mutagénèse à partir de toute matrice biologique, ou par expression d'un ADN correspondant. L'acide nucléique peut également êfre un ADN, notamment un ADN double-brin aléatoire codant un ARN aléatoire. Un tel ADN double-brin aléatoire peut êfre préparé à partir d'une population d'ADNs simple-brins aléatoires de synthèse ou obtenus par des techniques d'amplification et/ou de mutagénèse, par synthèse d'un second brin complémentaire selon des techniques connues de l'homme du métier.
Un objet particulier de l'invention réside dans une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VAl d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire distinct.
Un autre objet particulier concerne une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de réfrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression comprenant un ARN aléatoire distinct sous contrôle d'un promoteur U6. Un autre objet particulier concerne une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression comprenant un ARN aléatoire distinct sous contrôle d'un promoteur tRNA.
Un objet particulier de l'invention réside dans une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'ARN aléatoires distincts codés par des cassettes d'expression distinctes dérivées d'un gène VAl d'un adénovirus.
Un objet particulier de l'invention réside dans une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité de cassettes d'expression comprenant chacune une séquence codant un ARN structural aléatoire distinct placé sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III (notamment des cassettes d'expression dérivées d'un gène VAl d'un adénovirus), chaque ARN structural aléatoire codé ayant la capacité in vitro de lier une cible d'intérêt.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans des banques d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les cassettes d'expression comprennent un promoteur VA inductible.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans des banques d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les cassettes d'expression comprennent un second promoteur transcriptionnel, distinct et placé en amont du promoteur VA.
Sélection in Cellulo
Comme indiqué, l'invention concerne, de manière générale, des procédés, de sélection in cellulo, à partir de banques d'acides nucléiques aléatoires, d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phenotype désiré.
Les procédés de l'invention comprennent, de manière générale : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de celle-ci avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection d'une ou plusieurs cellules possédant le phenotype désiré, et d) l'identification de la ou des cassettes contenues dans la ou les cellules sélectionnées, ou des ARN actifs qu'elles expriment.
Dans un premier mode de réalisation, la banque mise en œuvre dans l'étape a) est une banque aléatoire générale, c'est-à-dire comprenant une pluralité de séquences totalement aléatoires. L'utilisation de ce type de banque est particulièrement intéressante pour la sélection d'ARN actifs capables de conférer un phenotype désiré à une cellule, sans connaissance a priori de la cible biologique visée ou de la voie métabolique ciblée.
Dans un autre mode de réalisation, la banque mise en œuvre dans l'étape a) est une banque aléatoire restreinte, c'est-à-dire comprenant une pluralité de séquences dont le caractère aléatoire présente un certain niveau de restriction. Ainsi, la banque restreinte peut être une banque dérivée de la séquence d'un gène cible donné, comprenant une multitude de séquences complémentaires d'une ou plusieurs régions de ce gène. La banque restreinte peut également être une banque aléatoire dans laquelle un ou plusieurs résidus, ou un ou plusieurs motifs de séquence sont imposés au sein de la région aléatoire. La banque restreinte peut également êfre une banque de mutants aléatoires d'une séquence cible donnée ou une banque codant des ARN présélectionnés pour une propriété particulière. L'utilisation de banques aléatoires restreintes est particulièrement intéressante pour la sélection d'ARN actifs capables d'altérer une cible biologique déterminée ou une voie métabolique déterminée.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la banque mise en œuvre dans l'étape a) est une banque aléatoire restreinte codant des ARN aléatoires pré-sélectionnés pour une propriété particulière, par exemple pour leur capacité à lier, in vitro, une cible d'intérêt (par exemple une protéine, un polypeptide, un peptide, un acide nucléique, une cellule, un lipide, etc.) ou pour leur affinité pour cette cible, pour une propriété propre, pour la présence d'un motif structural ou d'une séquence spécifique, etc. Dans ce contexte, un objet particulier de l'invention concerne un procédé de sélection, optimisation ou identification d'ARN actifs, comprenant : la) la préparation d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de cassettes d'expression distinctes comprenant une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, les séquences d'ARN aléatoires codées ou les ARN complets contenant ces séquences aléatoires ayant été pré-sélectionnés in vitro pour leur capacité à lier (ou pour leur affinité pour) une cible d'intérêt, lb) la mise en contact de cette banque ou d'une partie de cette banque, avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules,
2) la sélection d'une ou plusieurs cellules possédant le phenotype désiré, et
3) l'identification de la ou des cassette(s) contenue(s) dans la ou lesdites cellules, ou de(s) l'ARN(s) actif(s) qu'elles expriment.
Les banques peuvent êfre produites par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par synthèse, amplification, mutagénèse, etc., ou des combinaisons de ces méthodes. Il peut s'agir d'une banque d'ADN synthétiques ou produits par voie recombinante ou génétique, à partir de matrices artificielles ou synthétiques, comme des banque génomique, d'ARN de séquences obtenues par la méthode SELEX, ou par toute technique de mutagénèse ou d'évolution dirigée, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, la banque d'ADN codant des ARN aléatoires est préparée par : synthèse d'une banque d'ADN simple-brin comprenant une région aléatoire encadrée par une ou deux régions de séquence définie, synthèse d'un deuxième brin au moyen d'une ADN polymérase et en présence d'une amorce complémentaire de la séquence définie du premier brin, ou d'une partie de celle-ci, pour produire une banque d'ADN double-brin comprenant une région aléatoire, et clonage de la banque d'ADN double-brin dans un vecteur, sous contrôle du promoteur choisi.
Ce procédé peut comprendre une étape supplémentaire d'expression et de sélection in vitro des ARN codés par la banque ayant la capacité d'interagir avec une cible biologique d'intérêt.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la banque d'ADN codant des ARN aléatoires est préparée à partir d'une collection de séquences ARN aléatoires par : transcription inverse pour produire une banque d'ADN simple-brin comprenant une région aléatoire encadrée par une ou deux régions de séquence définie, - synthèse d'un deuxième brin au moyen d'une ADN polymérase et en présence d'une amorce complémentaire de la séquence définie du premier brin, ou d'une partie de celle-ci, pour produire une banque d'ADN double-brin comprenant une région aléatoire, et clonage de la banque d'ADN double-brin dans un vecteur, sous contrôle du promoteur choisi.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, le vecteur est un vecteur viral, notamment rétroviral. Dans ce cas, le procédé comprend avantageusement en outre une étape de transfection dudit vecteur dans une lignée cellulaire d'encapsidation, pour produire une banque de virus, notamment de rétrovirus recombinants.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la banque d'ADN code des ARN aléatoires pré-sélectionnés in vitro (voir Figure 15B). Dans ce mode de réalisation, le procédé peut comprendre les étapes suivantes:
- Etape A : la synthèse in vitro d'une banque de cassettes d'expression (ADN db) utilisant le système polymérase III. A cet effet, on peut par exemple introduire la séquence active aléatoire à l'intérieur d'une cassette d'expression telle que définie précédemment. Les cassettes peuvent être synthétisées par exemple à partir d'oligonucléotides ADN sb, grâce à des réactions d'élongation d'amorce et/ou d'amplification par PCR;
- Etape B : l'expression in vitro de la banque de cassettes ou d'une partie de celle-ci, produisant in vitro une banque d'ARN aléatoires ; - Etape C : la sélection in vifro des ARN pour leur capacité de liaison ou pour leur affinité pour une cible donnée; et
- Etape D : la production d'une banque de cassette d'expression restreinte comprenant des cassettes d'expression d'ARN ainsi sélectionnés.
L'expression in vitro de la banque de cassettes peut êfre réalisée en deux phases, une phase de production de cassettes de transcription et une phase de transcription proprement dite. Pour cela, une banque de cassettes de transcription in vifro peut être synthétisée à partir des banques de cassettes d'expression, totalement in vitro, en utilisant des oligonucléotides ADN sb et par réaction PCR. La matrice ADN db étant constituée par la banque de cassettes d'expression, l'oligonucléotide en 5' utilisé dans la réaction PCR permet d'apporter un promoteur adapté à la transcription in vitro (ex : SP6, T7, T3,...). La production de la banque d'ARN aléatoires peut ensuite êfre effectuée par transcription in vifro à partir de la banque de cassettes de transcription, en utilisant une ARN polymérase adaptée (protéine purifiée ou préparation qui contient l'activité requise : SP6, T7, T3, ...).
La production de la banque de cassette d'expression restreinte peut être réalisée de différentes façons. D'une manière pratique, les ARN actifs sélectionnés (ou une partie de ceux-ci) sont utilisés pour générer les cassettes de transcription correspondantes, par exemple par réaction de RT-PCR. Les nouvelles banques de cassettes ainsi obtenues sont utilisées soit pour effectuer de nouvelles itérations du procédé (retour à l'étape B), soit pour des tests in cellulo. Les tests in cellulo peuvent concerner quelques cassettes identifiées ou de façon plus globale cette banque de cassette d'expression restreinte peut être utilisée comme matériel de départ de la sélection in cellulo (étape 1b).
Un objet particulier de l'invention réside également dans un procédé de sélection d'ARN actifs, comprenant (i) la synthèse in vitro d'une banque de cassettes d'expression (ADN db) codant pour des ARN aléatoires sous contrôle d'un promoteur polymérase III, (ii) l'expression in vitro de la banque de cassettes ou d'une partie de celle-ci, produisant in vitro une banque d'ARN aléatoires et (iii) la sélection in vitro des ARN pour leur capacité de liaison ou pour leur affinité pour une cible donnée. Dans une étape supplémentaire facultative, le procédé comprend la production d'une banque de cassettes d'expression restreinte comprenant des cassettes d'expression d'ARN ainsi sélectionnés.
Lors de l'étape b) du procédé de l'invention, la banque (ou une partie de celle-ci) est mise en contact avec une population de cellules. Les cellules utilisées peuvent êfre de nature et d'origine variées, et choisies en fonction des propriétés recherchées pour l'ARN actif. Ainsi, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre notamment avec une population de cellules comprenant des cellules animales (par exemple de mammifère), d'oiseaux, de poissons, de batraciens, de plante, d'insecte, de levure ou bactériennes. Il s'agit de préférence de cellules de mammifères, notamment humaines ou d'animaux (rongeurs, bovins, équins, singes, etc.). Les cellules peuvent être des cultures primaires ou des lignées. Il peut s'agir de cellules pluripotentes embryonnaires ou somatiques, différenciées ou non, prolifératives ou quiescentes, etc. On peut citer par exemple des cellules souches, des fibroblastes, des hépatocytes, des cellules épithéliales, musculaires, rénales, nerveuses, cardiaques, ou appartenant au lignage hématopoiétique (lymphocytes B, T, NK, mastocytes, cellules dendritiques, macrophages résidants ou circulants, etc), etc. Les cellules utilisées peuvent par ailleurs être modifiées ou traitées préalablement, par exemple pour contenir un système de gène rapporteur, un marqueur, etc., ou pour présenter un phenotype pathologique que l'on souhaite corriger.
Le procédé de sélection est typiquement réalisé in vifro, dans tout type de support adapté, tel que fiole, flasque, plaque multi-puits, etc. A cet effet, afin de pouvoir mesurer ou observer, sur chaque cellule, l'effet d'un nombre restreint d'ARN aléatoires de la banque, la banque est préférentiellement mise en contact avec la population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'un nombre restreint de cassettes par cellule. En effet, la banque étant typiquement composée d'un mélange de composants distincts, on préfère que chaque cellule de la population soit modifiée par un nombre restreint de ces composants pour mieux en apprécier les propriétés. De ce fait, il n'est pas nécessaire que les constituants de la banque soient séparés les uns des autres, ou que la population de cellules soit répartie en supports à plusieurs compartiments, ce qui constitue un avantage important de l'invention. A titre indicatif, lorsque la banque est une banque de virus, on préfère incuber les cellules à une MOI faible, typiquement inférieure à 5, de préférence inférieure à 3, 2 ou 1.
La mise en contact peut être réalisée en présence d'agents facilitant la transfection, comme des polymères, lipides cationiques, peptides, etc. Lorsque la banque comprend des virus, notamment des rétrovirus, de tels agents ne sont généralement pas nécessaires, compte tenu de l'efficacité d'infection.
Les cellules peuvent être cultivées ou conservées un certain temps après la mise en contact, avant de réaliser l'étape c). Cette durée peut êfre ajustée par l'homme du métier selon le phenotype recherché, le type de vecteur, la quantité de cellules, etc. Par ailleurs, consécutivement à la mise en contact, il est possible de réaliser une étape de sélection des cellules dans lesquelles une ou plusieurs cassettes ont effectivement été transférée. Cette sélection peut êfre effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment en utilisant un gène marqueur inséré sur le vecteur. En outre, les cellules peuvent également être soumises à des traitement ou conditions particulières, notamment pour révéler le phenotype d'intérêt (e.g., ajout d'un substrat, d'un réactif, lyse des cellules, etc.)
Le phenotype d'intérêt peut être toute activité, propriété, morphologie, etc. Il peut s'agir de l'expression d'un gène endogène ou exogène, d'un marqueur, de l'expression d'une protéine de surface, d'une propriété de migration, différentiation, croissance, résistance, etc. Dans un mode de mise en œuvre particulier, le phenotype désiré est choisi parmi une capacité ou une incapacité de croissance, d'apoptose, de différentiation, de migration, de résistance à un agent toxique, de résistance à un agent infectieux, ou d'action métabolique (e.g., la cellule est devenue capable de modifier son environnement métabolique). Dans un autre mode de réalisation, le phenotype désiré est l'activité d'une cible biologique déterminée ou d'une voie métabolique déterminée. On peut citer notamment l'expression ou l'activité d'une protéine, par exemple d'une enzyme (e.g. kinase, protéase, etc.), d'un facteur de transcription, etc.
Dans un premier mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules infectées par un virus et le phenotype désiré est la résistance audit virus. Le virus peut êfre tout virus connu, comme un virus de l'hépatite (B, C, delta...), de la grippe, le VIH, les différents herpès, les virus des papillomes, etc.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules tumorales et le phenotype désiré est la perte de tumorigénicité.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules souches embryonnaires non différenciées et le phenotype désiré est le contrôle de leur différenciation.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules capables d'agir sur un processus métabolique naturel (par exemple : coagulation sanguine, régulation du taux de glucose, de lipides, cholestérol...) et le phenotype désiré est le contrôle de ce processus métabolique.
Selon une autre variante, la population de cellules comprend des cellules bactériennes et le phenotype désiré est la sensibilité à un agent toxique.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules exprimant une cible biologique déterminée (e.g. une protéine, un variant d'une protéine, un acide nucléique, un lipide, un récepteur, etc.) et le phenotype désiré est la modification de l'activité (y compris de l'expression) de cette cible biologique.
Les cellules exprimant le phenotype désiré peuvent être sélectionnées par l'homme du métier par toute technique classique de biologie (modification moφhologique, survie, expression d'un marqueur, tri cellulaire, etc.). En outre, lorsque la cassette est inductible, l'activité de l'ARN peut êfre validée directement in cellulo, en comparant les états induits et réprimés (Figure 15A). Pour cela, les cellules présentant le phenotype désiré sont sélectionnées, éventuellement amplifiées, de préférence de manière individuelle, et leur phenotype est analysé en parallèle en conditions d'induction et de répression de l'expression de la cassette. Cette étape supplémentaire permet d'identifier les ARN dont l'activité est directement impliquée dans le phenotype recherché.
L'étape d) comprend l'identification de la ou des cassettes contenues dans la ou les cellules sélectionnées, ou des ARN actifs qu'elles expriment. Ces cassettes ou ARN sont responsables du phenotype produit et peuvent donc être utilisés pour toute application visant à reproduire ce phenotype. La cassette, ou l'ARN peuvent êfre extraits des cellules et isolés par des méthodes classiques de biologie moléculaire (lyse des cellules, amplification ou hybridation, etc.). Dans un mode de mise en œuvre préféré, la séquence de la ou des cassettes est déterminée, pour permettre de produire par voie synthétique ou recombinante le produit correspondant. Bien entendu, les propriétés de la cassette ou de l'ARN peuvent être confirmées dans tout système ou modèle biologique approprié.
Préférentiellement, lorsque la banque utilisée dans l'étape a) est complexe (i.e., comprend un nombre élevé de composants distincts, par exemple supérieur à 100), on préfère répéter les étapes b) à d) du procédé afin de sélectionner des agents les plus actifs. Dans ce cas, PADN des cassettes d'expression des cellules sélectionnées est amplifié pour produire une banque restreinte, et les étapes b)-d) du procédé sont répétées une fois au moins avec ladite banque restreinte. La réalisation de plusieurs cycles présente plusieurs avantages : tout d'abord, elle permet de partir de banques très complexes, utilisées sous forme de mélange. De plus, elle permet d'augmenter progressivement l'efficacité des ARN actifs. Par ailleurs, elle peut permettre de sélectionner des ARN actifs présentant un profil déterminé, en sélectionnant les cassettes sur des cellules ou dans des conditions distinctes selon les cycles. Ainsi, la répétition de cycles peut permettre de contrôler la spécificité d'un ARN actif ou au contraire de vérifier son efficacité sur plusieurs cibles ou plusieurs types cellulaires. Un objet particulier de l'invention réside dans un procédé de sélection d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phenotype désiré, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phenotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
Dans un mode préféré, la banque d'acide nucléiques est une banque codant des ARN aléatoires pré-sélectionnés in vifro, et/ou le vecteur est un virus recombinant, plus préférentiellement un rétrovirus recombinant. De manière particulièrement préférée, le promoteur franscrit par l'ARN polymérase III est un promoteur dérivé de la séquence d'un gène VA d'un adénovirus. Dans un mode spécifique, la population de cellules comprend des cellules de mammifère.
Un mode de réalisation plus particulier de l'invention comprend : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire distinct, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de celle-ci avec une population de cellules de mammifères dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits réfrovirus recombinants, c) la sélection des cellules possédant le phenotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans un procédé de sélection d'ARN actifs sur une cible biologique déterminée, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN contraint (ou prédéfini) pour agir sur ladite cible déterminée, placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules exprimant ou contenant la cible biologique, dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phenotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules et, de manière facultative, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
La séquence des ARN codés peut-être dérivée de la séquence de la cible biologique (notamment dans le cas des antisens, ARNi (siARN, miARN ou leurs précurseurs), ribozymes) ou bien être pré-sélectionnée pour interagir de manière structurale avec la cible biologique (notamment dans le cas des aptamères). . Applications pour la recherche en biotechnologie
Les ARN actifs identifiés, les séquences actives identifiées ou les cassettes d'expression de ces ARN actifs peuvent être utilisés comme des outils moléculaires capables d'agir dans la cellule pour interférer (inhibition, activation) avec une activité biologique ou l'expression d'un phenotype déterminé (« target identification »). A ce titre, ils constituent des produits utiles pour étudier un processus cellulaire et identifier de nouvelles cibles ou pour explorer la fonction d'un gène dans le cas où la cible est connue (« target validation »). Leur action dans une cellule peut permettre de modifier la cellule de façon à ce que ladite cellule soit dotée de propriétés nouvelles. La cellule ainsi modifiée peut alors être considérée comme un nouvel outil en biotechnologie utilisable à des fins de recherche ou pour des applications thérapeutiques.
Applications pharmaceutiques
Les ARN actifs identifiés et, plus généralement, les cassettes d'expression identifiées, sont utilisables directement comme produits pharmaceutiques. Dans le contexte de l'invention, le terme « pharmaceutique » inclut toute utilisation dans le domaine médical, thérapeutique, préventif ou curatif, vétérinaire, agronomique, diagnostique, cosmétique, etc.
Ainsi, un aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule tels que définis ci-avant, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un aufre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ARN actif, ledit ARN actif comprenant une séquence active insérée dans un ARN VA modifié, ledit ARN VA modifié comprenant éventuellement une hélice teπninale altérée et/ou une séquence conférant un caractère inductible.
L'invention concerne encore des procédés de production de compositions pharmaceutiques, comprenant (i) le criblage d'une banque d'ARN aléatoires comme décrit ci-avant, permettant d'obtenir une cassette d'expression d'un ARN actif et (ii) le conditionnement de la cassette d'expression ou de la séquence ARN active dans tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, l'invention concerne un procédé de production d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une infection par un agent pathogène chez un patient humain, comprenant (i) le criblage d'une banque d'ARN aléatoires comme décrit ci-avant, la population de cellules utilisées étant infectée par l'agent pathogène et les ARN sélectionnés pour leur capacité à réduire ou bloquer le cycle infectieux, permettant d'obtenir une cassette d'expression d'un ARN actif et (ii) le conditionnement de la cassette d'expression ou de la séquence ARN active dans tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un ARN actif, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule recombinante tels que définis ci-avant, pour la préparation d'un médicament destiné à la mise en œuvre d'une méthode de traitement thérapeutique du corps humain. Selon les propriétés de l'ARN actif, le médicament peut êfre utilisé pour le traitement de cancers, infections, maladies neurodégénératives, etc.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un ARN actif, d'une séquence active, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule recombinante tels que définis ci-avant à un patient. L'administration peut être réalisée par différentes voies, notamment par voie iv, ip, im, se, locale ou générale, notamment infra-tumorale ou systémique.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES
oA. CONSTRUCTION DES CASSETTES DΕXPMESSION
A-l. CASSETTES DERIVEES DU GENE VAl DES ADENOVIRUS.
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant l'expression et la diffusion intracellulaire (en cellules de mammifères) de motifs d'ARN actifs (ARN structuraux = aptamères, antisens, ribozymes, ARNi (siARN ou miARN) ou motifs actifs). La base de ces cassettes est le gène viral VAl RNA de l'adenovirus de type 2. Ce gène est efficacement transcrit par l'ARN polymérase III cellulaire. L'ARN produit est très structuré, sa taille est de 160 bases. La localisation cellulaire de cet ARN est cytoplasmique.
Afin d'éliminer la partie physiologiquement active de l'ARN VAl, la boucle IV (qui interagit avec la protéine kinase p68) a été supprimée dans cette construction et le site de restriction EcoRV a été inséré : construction VAΔIV (Barcellini et al., 1998) et (Gwizdek et al., 2001).
L'ARN VAΔTV a une taille de 134 bases, il est riche en structures secondaires (figure 4) et a une localisation cytoplasmique (Barcellini et al., 1998) (Gwizdek et al., 2001). Sa séquence est représentée par la séquence SEQ ID NO : 2.
A-l -a. Modification de la cassette VAΔIV : Cassette VAΔIV (cytoplasmique^ et nVAΔIV (nucléaire!.
Cassette VAΔIVSrf :
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant l'expression des motifs actifs intégrés dans l'ARN VAΔIV, et dont la localisation soit principalement cytoplasmique. Dans le domaine central du gène VAl, au niveau de la délétion de la boucle IV, le site de clonage Srfl, plus adapté, a été introduit en remplacement du site EcoRV. La cassette VAΔIVSrf a été générée en insérant le site Srfl sous la forme d'un octanucléotide ADN double brin (5'GCCCGGGC3') à l'intérieur du site de restriction EcoRV (position 90-96 dans le VAΔIV). L'ARN franscrit possède 142 bases (figure 5) et une localisation cytoplasmique (figure 2C), SEQ ID NO : 3. Cet ARN permet l'expression optimisée de séquences ARN actives (figure 2B).
Cassette nVAAIVSrf :
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant d'exprimer des séquences d'ARN actives intégrées dans l'ARN VAΔIVSrf, et dont la localisation reste nucléaire. Dans l'ARN VAl natif, la structure en double hélice contenant les extrémités 5' et 3' est la séquence responsable du transport de cet ARN du noyau vers le cytoplasme. Cette structure est appellée l'hélice terminale (Gwizdek et al., 2001). Elle a été cartographiée : bases 1 à 20 et bases 136 à 155. Si la structure en double hélice est perturbée, l'ARN est retenu dans le cytoplasme. La partie 3' du gène VAΔIV a ainsi été modifiée afin de créer une rupture dans la double hélice terminale de l'ARN selon l'approche proposée dans Gwizdek et al., 2001. Pour cela, les séquences 5' du gène VAΔIV ont été modifiées à partir du nucléotide 93 et remplacées par la séquence ADN double brin suivante (SEQ ID NO : 5) :
5'GCCCGGGCATCCAGGTGTGCGACGTCAATAAACGGGGGAGCGCCCTTTT3'.
On peut noter que le site de restriction Srfl, en italique et souligné, est directement intégré dans cette séquence (figure 6A). L'ARN franscrit dont les caractéristiques sont présentées dans la figure 6B possède 141 bases et une structure secondaire proche de celle de l'ARN VAl, sa localisation est nucléaire (figure 6C), SEQ ID NO : 4. A-l-b. Inductibilité de la cassette VAΔIV : Cassettes VAi (cytoplasmique et nVAi (nucléaire .
Cassettes VAi :
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant d'exprimer des motifs actifs intégrés dans une cassette d'expression inductible par la tétracycline. Premièrement, le gène VAΔIV a été modifié afin d'intégrer une séquence opératrice tetOl entre les Boite A et B du gène VA et/ou en amont du site d'initiation de la transcription de ce gène (figure 7). La séquence tetOl remplace donc les séquences natives du gène VA soit entre les boite A et B (position 24 à 59 dans le gène VAiO) soit en amont des séquences transcrites (position - 29 à - 50 dans le gènes OVAi), soit au niveau des deux positions (extragénique et intragénique : gène OVAiO). Deuxièmement, dans le domaine central de ce nouveau gène VA se trouve le site de clonage Srfl. Et troisièmement, dans le but de recréer une structure secondaire proche de celle de l'ARN VA natif, des séquences partiellement complémentaires à la séquence tetOl remplacent les séquences centrales du gène (VAiO et OVAiO). Afin d'obtenir un ARN VAi cytoplasmique tout est fait pour conserver l'hélice terminale responsable du transport de l'ARN vers le cytoplasme. La séquence complète des gènes OVAi (SEQ ID NO : 16), OVAiO (SEQ ID NO : 17) et VAiO (SEQ ID NO : 15) est indiquée dans la figure 7A.
Les cassettes VAi sont obtenues de manière synthétique en utilisant 4 oligonucléotides d'ADN simple brin. Les deux premiers oligonucléotides d'ADN simple brin VAi up et VAi down (SEQ ID NOs : 18 et 19, figure 7B) sont utilisés pour générer la totalité des séquences transcrites du néogène VAi ainsi qu'une partie des séquences adjacentes en 5' et en 3'. Grâce à une séquence de 20 bases complémentaires ces oligonucléotides sont hybrides puis utilisés pour générer un ADN double brin en présence de PADN polymérase fragment de Kleenow. Les deux oligonucléotides externes VAi PvuII 5' (SEQ ID NO : 20) et VAi PvuII 3' (SEQ ID NO : 22) (figure 7B) sont utilisés pour ajouter les séquences amont et aval du gène VA grâce à une réaction de PCR. Les deux sites de restriction PvuII placés aux deux extrémités 5' et 3' du gène VAiO permettent de le cloner dans un veteur ADN quelconque. De même, les deux oligonucléotides VAiO2PvuII 5' et VAiPvuII 3' sont utilisés pour ajouter la séquence tetOl en amont du gène VAΔIVSrf ou du gène VaiO afin de générer respectivement les gènes OVAi et OVAiO.
L'ARN franscrit VAiO possède 142 bases, sa structure secondaire est présentée en figure 8.
Cassette nVAi :
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant d'exprimer des motifs actifs intégrés dans une cassette d'expression inductible par la tétracycline. La localisation de ce motif doit être principalement nucléaire. Le principe de la rétention de cet ARN dans le noyau est le même que pour la cassette d'expression nVAΔIVSrf (voir ci-dessus). La partie 3' des différents gènes VAi est donc modifiée de la même façon que pour le gène nVAΔIVSrf afin de créer une rupture dans la double hélice terminale de l'ARN.
A-2. CASSETTES DERIVEES DU GENE HUMAIN hU6
La séquence promotrice du gène U6 humain est en position extragénique. L'ARN généré correspond donc aux séquences que l'on a choisi de cloner en aval du promoteur (à partir du point +1 de transcription). Ce type de promoteur permet donc d'exprimer des ARN entièrement synthétiques par opposition au système VA qui impose de conserver des séquences promotrices positionnées au sein des séquences transcrites.
Cet exemple décrit plusieurs modifications du gène U6+1 (décrit initialement par (Bertrand et al., 1997)). Ces modifications permettent de faciliter le clonage des séquences actives, de maîtriser les séquences transcrites dès le point +1 de transcription, de stabiliser les séquences actives et de maîtriser la localisation intracellulaire de ces séquences. Les séquences promotrices utilisées dans les cassettes vont de 1 à 266. Au niveau du site +1 de transcription (nu.266), un site de clonage à bouts collants a été placé : Sali (5OTCGAC3') (Bertrand et al, 1997).
A-2-a. Cassettes hélice U6 (U6h9. U6h20 et nU6h20
Les ARN transcrits par ces cassettes ont une localisation nucléaire ou cytoplasmique, en fonction des constructions. L'objectif de ces cassettes est l'expression intracellulaire de motifs d'ARN structuraux.
Une séquence servant de base structurale pour l'ARN à insérer est placée en aval du promoteur U6. Elle contient : une séquence capable de générer une courte hélice ARN (plus ou moins stable et plus ou moins longue), un site de clonage bord franc (Srfl : 5'GCCCGGGC3') ainsi que le signal d'arrêt de transcription TTTTT.
Dans les cellules de mammifères, l'accumulation d'ARN double brin (d'une longueur supérieure à 40 nucléotides environ) déclenche la production d'interféron et la mort des cellules par apoptose. Cependant il est nécessaire que la navette ARN qui supporte le motif actif possède une structure propre et stable en forme d'hélice. Cet exemple décrit la construction de frois types de navette dérivées de U6 : lorsque le motif actif est lui même structuré sous la forme d'une hélice, nous utilisons une cassette possédant un court motif navette (hélice 9 : h9U6), lorsque le motif actif n'est pas structuré en hélice ou très court, nous utilisons une cassette permettant l'expression d'une navette formé par Pappariement d'une vingtaine de nucléotides (hélice 20 h20U6). h20U6 permet également de modifier la tige terminale de la navette motif d' export et de générer une navette à localisation nucléaire (nh20U6).
Différents fragments d'ADN double brin sont insérés à l'intérieur du site de restriction Sali grâce à des extrémités Sali compatibles. h9U6 : (SEQ ID NO : 6)
5' TCGAGCCCGGGCTCGACTTTTTC 3'
3' CGGGCCCGAGCTGAAAAAGAGCT 5' Séquence transcrite du gène h9U6 : (SEQ ID NO : 7) GTCGAGCCCGGGCTCGACTTTTT
h20U6: (SEQ ID NO : 8)
5' TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGTCGATATCCTCGACTTTTTC 3'
3' CCTATAGCTGACGGGCCCGTCAGCTATAGGAGCTGAAAAAGAGCT 5' Séquence transcrite du gène h9U20 : (SEQ ID NO : 9)
GTCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGTCGATATCCTCGACTTTTT
nh20U6 : (SEQ ID NO : 10) 5' TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTTC 3'
3 'CCTATAGCTGACGGGCCCGTCTCTATTCCAGCTGAAAAAGAGCT 5' L'ARN correspondant à une structure en hélice sur 18 bases, avec une interruption d'hélice sur 6 bases. Sa séquence est indiquée ci-dessous (SEQ ID NO : 11)
GTCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTT
La structure secondaire des hélice U6 est présentée dans la figure 9.
A-2-b. Cassette U6 Srf
L'objectif de cette cassette est d'exprimer des ARN dont la séquence est choisie dès le point +1 de transcription.
Dans cette cassette, le site de restriction à exfrémités cohésives Sal I est remplacé par le site de restriction à bords francs Srfl. Pour cela, le promoteur U6 est modifié par réaction PCR avec pour matrice la cassette U6 décrite précédemment. Dans cette réaction, l'amorce 5' est une séquence plasmidique située en amont du promoteur et l'amorce 3' permet de modifier les séquences à proximité du site +1 de transcription :
5'GTGGGCCATGGGTGÇÇÇGβGÇTTTCGTCCTTTCCACAAG3' (SEQ ID NO :12).
Dans cet oligo, la séquence Srfl GCCCGGGC remplace la séquence CACCGTCG présente dans le gène d'origine (Bertrand et al., 1997) (5' CACCGTCG 3' de la cassette d'origine a été changée par le site Srfl 5' GCCCGGGC 3' (les séquences soulignées représentent le début des séquences transcrites).
La taille de l'ARN transcrit est fonction de la séquence clonée en aval du promoteur, à l'intérieur du site Srfl. De même, la localisation cellulaire de l'ARN franscrit est fonction de la séquence de ce dernier.
A-2-c. Cassette U6Tt
L'Objectif de cette cassette est d'exprimer des séquences d'ARN actif (aptamère, antisens, ribozyme, ARNi : siARN ou miARN) qui ne soient pas dégradés par les RNAses cellulaires.
En aval du promoteur U6, à l'intérieur du dite de restriction Sali, est clonée une séquence appelée tige terminale. Elle génère une structure en épingle à cheveux à l'extrémité 3' de l'ARN, évitant ainsi la dégradation par les RNAses. En amont de cette tige terminale se trouve la séquence GTCGAC qui reconstitue un site de restriction Sali, afin de représenter le site de clonage des séquences antisens. En aval de la tige terminale se trouve le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III : TTTTT.
Séquence de la tige terminale (SEQ ID NO : 13) 5' GCGGACTTCGGTCCGCTTTTT 3' Les séquences soulignées forment l'hélice ARN La séquence transcrite dans cette cassette est (SEQ ID NO : 14)
5' G//TCGACCCATGCTAGAGCGGACTTCGGTCCGCTTTTT // représente le site d'insertion Sali pour les séquences actives.
Les séquences en gras représentent la tige terminale. A-3. CASSETTES HYBRIDES U6/VA
Cet exemple illustre la construction d'un gène hybride utilisable en particulier dans les lignées murines. En effet, le gène VAl, ainsi que les cassettes d'expression dérivées de ce gène, ne s'exprime pas dans les lignées murines. Pour pallier ce manque d'expression, le promoteur du gène U6 murin est utilisé pour transcrire les cassettes d'expression dérivées du gène VAl.
La construction mU6/VAiO a été effectuée en deux étapes : la première a consisté à insérer le promoteur U6 du gène murin (mU6) dans le vecteur rétroviral pBabe et la deuxième a consisté à insérer le gène VAiO en aval du promoteur mU6.
Étape N°l : Clonage de mU6 dans pBabe (Figure 14)
Le gène U6 murin a été copié par réaction de polymérisation en chaîne grâce aux amorces mU6 amont et mU6 aval. En 3' de l'amorce mU6 aval, 4bases supplémentaires ont été ajoutées afin d'intégrer un site de restriction. Le site de restriction choisi est le site Pme I de séquence GTTTAAAC. Ce site de restriction présente deux avantages : il permet i) de conserver intactes les dernières bases du promoteur U6 murin (GTTT) et ii) d'intégrer un site de coupure bord franc utilisable dans l'étape N°2 (insertion du gène VAiO). La réaction de polymérisation en chaîne a été effectuée avec pour matrice de PADN génomique extrait de cellules murines. Le produit de réaction a été purifié puis inséré dans le vecteur rétroviral pBabe au niveau du site de restriction Nhel (figure 10) pour générer le plasmide pBabe mU6.
Étape N°2 : Clonage de mU6 dans pBabe mU6 (Figure 14)
Le gène VAiO, obtenu par réaction de polymérisation en chaîne, a été clone dans le plasmide pBabe mU6 au niveau du site de restriction Pmel précédemment introduit. Les oligonucléotides utilisés pour l'obtention du gène VAiO sont VAiO 5' et VAiO End Nhel, un site de restriction Nhe I étant introduit en 3' de l'amorce VaiO End Nhel. La matrice d'ADN utilisée était le plasmide pBabe VaiO.
B. CLONAGE DES CASSETTES D'EXPRESSION DANS UN VECTEUR
B-l . VECTEUR RETROVIRAL p Babe
Le vecteur rétroviral choisi est le vecteur pBabe (Morgenstern and Land, 1990). Le site d'insertion choisi est le site Nhel qui est localisé dans le LTR 3' (figure 10). Ce site d'insertion présente plusieurs avantages :
- Au cours du cycle viral, le LTR 3' est celui qui est copié pour générer les deux nouveaux LTR du provirus intégré. Il est donc responsable de l'activité du promoteur viral en situation d'intégration dans PADN cellulaire. Le fait d'intégrer une séquence exogène à l'intérieur de ce LTR ne perturbe pas la production des virus recombinants par les cellules d'encapsidation, mais permet d'inactiver le promoteur viral en situation intégrée dans les cellules transduites. L'intégration de telles séquences dans un génome cellulaire n'entraîne donc pas l'activation des gènes situés en aval de l'insertion. Ce type de construction est particulièrement avantageux dans l'optique d'une utilisation pour des projets de thérapie génique ou cellulaire.
- Une des conséquences de la duplication du LTR 3' est aussi la duplication de la séquence insérée dans ce LTR. Il y a donc deux copies des cassettes d'expression par intégration.
Les cassettes construites sont ainsi transférées dans le vecteur pBabe au niveau du site d'insertion Nhel (à l'intérieur du LTR 3 ').
B-2. AUTRES VECTEURS
Tout autre vecteur ou moyen permettant de faire pénétrer les cassettes d'expression dans la cellule est également envisagé : transfection, fransduction ou autre. De plus, toute vectorisation ayant pour but de faire pénétrer dans la cellule non pas la cassette d'expression, mais l'ARN actif est aussi envisagée. En particulier, tous les vecteurs et procédés facilitant l'introduction d'ARN dans les cellules seront utilisés.
C. PRODUCTION DE BANQUES D'EXPRESSION D'ARN ALEATOIRES
Une banque d'expression d'ARN aléatoires a été générée à partir de fragments d'ADN simple brin ayant une taille de 42 bases. Ces fragments se décomposent en trois parties : de 5 ' vers 3' on trouve une séquence connue de 8 bases (runA), puis une séquence aléatoire de 26 bases (synthétisée chimiquement de manière parfaitement aléatoire par un automate de synthèse d'ADN), pour finir, une deuxième séquence connue de 8 bases (runB). Les séquences runA et runB sont complémentaires. Dans un exemple spécifique, les fragments d'ADN simple-brin présentent la séquence 5' ATGAACGC (N)26 GCGTTCAT 3', dans laquelle N représente toute base (A, T, G ou C). La partie aléatoire contient donc 26 positions variables.
Un oligonucléotide amorce complémentaire à runB a été utilisé comme amorce pour l'ARN polymérase de Kleenow, qui synthétise le brin d'ADN complémentaire à la totalité de la séquence. Dans le cas de l'exemple spécifique, l'amorce complémentaire à runB présente la séquence 5 ' ATGAACGC 3 ' .
A l'issue de cette étape de synthèse, on obtient une population d'ADN double brin présentant des extrémités franches appelée « banque de séquences aléatoires».
5 '- ATGAACGC (N)26 GCGTTCAT- 3 ' ADN double brin : «banque de séquences aléatoires» 3 ' - TACTTGCG (N)26 CGCAAGTA -5 '
Cette banque de séquences aléatoires est ensuite clonée dans une cassette d'expression telle que décrite dans les exemples A et B ci-dessus. Selon le type d'expression recherché et/ou les besoins, les séquences aléatoires peuvent être insérées dans les deux types de cassettes dérivées de VAl ou U6. Pour cela les plasmides ou vecteurs viraux (par exemple, pBabe dans le cas des vecteurs rétroviraux) contenant les cassettes d'expression sont digérés par l'enzyme de restriction Srfl puis purifiés. La banque de séquences aléatoire (ADN double brin à bords francs) est clonée grâce à une ligation compétitive, en présence de l'enzyme de restriction Srfl. Statistiquement, chaque vecteur intègre donc un fragment d'ADN double brin contenant une séquence aléatoire différente. La population hétérogène des plasmides ou vecteurs obtenus après insertion des séquences aléatoires est appelée «banque de plasmides aléatoires ou banque de vecteurs aléatoires». Ces banques constituent des banques d'expression d'ARN aléatoires, au sens de l'invention, utilisables directement pour la sélection in cellulo d'ARN actifs.
D. PRODUCTION D'UNE BANQUE DE RETROVIRUS ALEATOIRES
Dans un mode de mise en œuvre préféré, la banque d'expression utilisée est une banque d'expression virale, notamment réfrovirale. Une telle banque peut êfre construite à partir d'une banque de vecteurs viraux aléatoires, comme décrit ci-après.
La banque de vecteurs aléatoires est introduite dans les cellules d'une lignée d'encapsidation (ici la lignée 293GP (Burns et al., 1993)) par transfection au phosphate de calcium. La banque est simultanément fransfectée avec un vecteur d'expression codant la glycoprotéine G d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G). Cette protéine est réputée être très efficace pour la fonctionnalité (stabilité, infectivité) des virus rétroviraux produits après transfection. Quelques jours après la transfection, les cellules produisent des réfrovirus pBabe recombinants. La «Banque de virus aléatoire» est alors prélevée, purifiée et concenfrée. Son titre infectieux ou MOI (nombre de particules rétrovirales recombinantes infectieuses par millilitre) peut alors êfre déterminé suivant les méthodes connues par l'homme de métier. E. SELECTION CELLULO
Les banques d'expression décrites dans les exemples C et D peuvent être utilisées pour la sélection in cellulo d'ARN actifs. Ainsi par exemple, avec la «Banque de virus aléatoires», il est possible de transférer les cassettes d'expression d'ARN aléatoires dans les cellules à étudier. L'objectif est d'obtenir une banque de cellules aléatoires dans laquelle chaque cellule exprime un, ou plusieurs, ARN aléatoire(s) différent(s). Les cellules utilisées peuvent être celles d'une lignée de référence, comme par exemple les cellules 293 (ATCC N° CRL 1573), les cellules Jurkat A3 (ATCC N° CRL-2570) ou les cellules HELA (ATCC N° CCL 2).Dans une autre situation, les cellules à infecter ont une nature particulière dans le sens qu'elles présentent une activité spécifique sur laquelle on veut agir (croissance, différenciation , infection...). Dans tous les cas, on obtient une «banque de cellules aléatoiresqui peut êfre conservée et peφétuée à l'infini pour êfre utilisée dans différentes applications. La «banque de virus aléatoires» permet de transduire les cellules d'une lignée quelconque ainsi que des cellules en culture primaire. Pour construire une «Banque de cellules aléatoires, standard ou spécifique», le principe est d'obtenir un maximum de cellules transduites ayant intégré chacune d'elle un nombre minimum de cassettes d'expression. L'objectif étant de se rapprocher de la valeur d'une seule séquence aléatoire intégrée par génome cellulaire. L'infection des cellules se fait ainsi en utilisant un surnageant viral ayant une MOI inférieure à 1. La sélection des cellules transduites s'effectue grâce à la présence du gène de résistance à la puromycine dans les rétrovirus pBabe recombinants. Après action de l'agent de sélection, la population de cellules obtenue est donc constituée par toutes les cellules ayant reçu une ou plusieurs copies du génome rétroviral et contenant donc une ou plusieurs copies de cassette d'expression pol III codant chacune un ARN aléatoire différent.
Les cellules de la banque sont disponibles pour une première série de tests. La cible sur laquelle nous souhaitons agir grâce à l'ARN actif peut être connue (une protéine, un ARN, un ADN...) ou peut représenter une activité enzymatique, une voie métabolique, un processus de prolifération ou de différenciation, une résistance à une drogue ou à un agent pathogène, etc. Le test de sélection doit être adapté à chaque cas. Dans un mode préféré de l'invention, au sein de la banque de cellules aléatoires la sélection des cellules contenant un ARN agissant sur la cible est réalisée grâce à la sélection positive des cellules ayant acquis le phenotype requis et présentant un avantage sélectif. Dans un premier exemple, la sélection d'un ARN actif contre un agent infectieux, tel qu'un virus cytopathogène (HIV), est réalisée grâce à la sélection positive des cellules devenues résistantes à la multiplication de ce virus. Dans un autre exemple, la sélection d'un ARN actif capable de protéger les cellules contre un processus de mort cellulaire programmée (apoptose) est réalisée au travers de la sélection des cellules devenues résistantes à l'ajout d'un signal déclenchant Papoptose. La sélection positive des cellules d'intérêts peut également comprendre une sélection directe des cellules par observation directe (suφrolifération, changement de statut moφhologique, différenciation altérée, expression d'un marqueur membranaire fluorescent...). Les colonies de cellules d'intérêts sont prélevées par microdissection à l'aide d'un automate permettant la microdissection au laser des groupes de cellules d'intérêts (Simone et al., 1998) ou bien grâce à un tri positif basé sur la sélection des cellules d'intérêts marquées avec des anticoφs. Après ce premier «tour de sélection », les cellules contenant potentiellement un ARN actif sont isolées : elles constituent la première génération de cellules sélectionnées. A ce stade, les cellules sélectionnées peuvent êfre amplifiées naturellement grâce à leur prolifération. Après une croissance suffisante, les cellules peuvent êfre clonées dans le cas où elles apparaissent sous forme de clones indépendants comprenant chacun plusieurs milliers de cellules. Alternativement, les cellules peuvent être globalement réunies pour former un population de cellules du premier tour. Dans tous les cas, les cellules peuvent êfre conservées grâce à une congélation. Cette première génération de cellules sélectionnées (population pu clones indépendants) est directement utilisable pour effectuer un deuxième tour de sélection puis, plusieurs tours de sélection selon un mode itératif, avec la possibilité de faire varier les paramètres de sélection.
Dans certains cas, le mode de sélection et/ou le mode d'analyse des cellules sélectionnées peut nécessiter de travailler sur des cellules mortes car fixées par un agent fixateur comme par exemple le formaldéhyde. C'est notamment le cas où le mode de sélection impose un marquage des cellules à l'aide d'anticoφs. Dans ce cas, l'amplification naturelle des cellules par croissance n'est pas possible et une étape supplémentaire d'amplification par PCR des cassettes contenant l'ARN actif est réalisée pour effectuer un deuxième tour de sélection.
L'ADN génomique des cellules issues du premier « tour de sélection » est extrait et purifié. A partir de cet ADN, les techniques de biologie moléculaire permettent d'amplifier spécifiquement par PCR les séquences d'ADN correspondant aux cassettes d'expression d'ARN aléatoires contenues dans les cellules sélectionnées. On obtient ainsi une première génération de cassettes d'expression contenant des séquences potentiellement actives sur la cible. Cette première génération est dite « banque restreinte de cassettes du premier tour ».
F. SELECTION DES CASSETTES ACTIVES SUIVANT UN PROCEDE ITERATIF
La banque restreinte de cassettes du premier tour est traitée de la même manière que la banque aléatoire de départ . Elle est clonée dans le vecteur rétroviral pBabe au niveau du LTR 3'. Après cette nouvelle étape de clonage, on obtient une première banque restreinte de vecteurs viraux. Les formes infectieuses de ces vecteurs viraux sont obtenues à l'identique que précédemment par transfection des cellules d'encapsidation pour aboutir à une première banque restreinte de réfrovirus, utilisée pour infecter, à son tour, le type cellulaire étudié. La MOI est à nouveau ajustée pour être inférieure à 1 copie de virus par cellule. Les cellules ainsi transduites sont à nouveau sélectionnées suivant les mêmes règles que celles qui régissent la sélection du premier tour, ou suivant d'autres paramètres. On aboutit ainsi à l'établissement d'une banque restreinte de cassettes du second tour. Ce deuxième tour de sélection permet d' enrichir la banque restreinte du premier tour en séquences actives. La succession itérative des tours basés sur le principe d'une sélection pour le phenotype désiré permet d'enrichir, à chaque tour, la banque restreinte en séquence de cassettes actives. Lorsque le phenotype désiré semble êfre enfin stabilisé, c'est-à-dire lorsque que l'ensemble des cellules ayant reçu un vecteur viral recombinant présente le phenotype désiré (habituellement après 5 à 6 tours de sélection), il est considéré que la sélection des cassettes dans les cellules est achevée. G. IDENTIFICATION DES CASSETTES ACTIVES ET TEST DE LEUR FONCTIONALITE.
A partir des cellules sélectionnées, de préférence au cours du dernier tour de sélection, PADN génomique est extrait et purifié. Puis une amplification par PCR permet d'obtenir la dernière banque restreinte de cassettes actives. Le clonage de ces cassettes dans les vecteurs de clonage permet leur séparation physique grâce à la propagation de ces vecteurs dans des bactéries formant des colonies isolées. Le séquençage des cassettes retrouvées dans les différentes colonies bactériennes (habituellement une trentaine de colonies sont analysées) permet de connaître les séquences aléatoires les plus fréquentes ou de déterminer un motif contenu dans les séquences aléatoires qui a été particulièrement conservé au cours du processus de sélection. La connaissance de ce motif permet de définir et de construire par biologie moléculaire une ou plusieurs cassettes contenant ce motif.
La ou les cassettes ainsi définies peuvent, à ce stade, être analysée(s) de manière individuelle afin de valider leur efficacité pour agir sur la cible. Pour cela, la cassette est clonée dans le vecteur pBabe, les vecteurs rétroviraux homogènes obtenus sont alors utilisés individuellement pour produire des virus recombinants qui servent à leur tour à infecter les cellules étudiées. La comparaison de l'efficacité relative des différentes cassettes analysées permet de choisir la ou les cassettes les mieux adaptées pour agir sur la cible.
Ce procédé de criblage a été utilisé afin d'identifier des ARN actifs capables de rendre les cellules de la lignée Hela résistantes à Papoptose cellulaire induite par la staurosporine (0,8 μM - 6 heures). A l'issue d'un premier tour de sélection différents clones cellulaires résistants à la staurosporine ont été sélectionnés (Figure 12C) et les cassettes d'expression qu'ils contiennent ont été identifiées : clones 2, 5, 9, 11, 13, 14, 15, 16, C, J, L et N. La validation des ARN actifs ainsi identifiés a été effectuée selon le mode indiqué ci-dessus dans les cellules Hela ainsi que dans les cellules Jurkat (avec une multiplicité d'infection inférieure à 1). Dans chacune des populations cellulaires, le niveau d'expression des ARN actifs a été évalué par Northern blot (Figure 12D). Dans cette figure, nous observons que le niveau d'expression de chacun des ARN est comparable d'une lignée cellulaire à l'autre (Hela versus Jurkat). De nouveaux tests de résistance à Papoptose induite par la staurosporine ont été effectués sur les populations de cellules Hela ou Jurkat exprimant chacune d'elle l'un des ARN actifs. Sur les 12 ARN étudiés, seuls certains présentent une activité significative de résistance à la Staurosporine, les autres sont de faux positifs. Les résultats obtenus dans ces deux lignées cellulaires indiquent que le taux de résistance des cellules à Papoptose varie en fonction de l'ARN exprimé. Parmi les ARN sélectionnés, les clones 5, 9 13, 15 et 16 présentent une activité significative dans les cellules Jurkat (l'ARN clone 9 étant le plus actif) alors que seul le clone 9 présente une activité anti-apoptotique dans les cellules Hela (Figure 12E). Le recours à un système inductible tel que le système VAi peut faciliter les différentes étapes décrites dans ce procédé afin de valider les ARN actifs directement dans les cellules dans lesquelles ils ont été sélectionnés (élimination directe des faux positifs, Figure 15 Panneau A)). Le système VAi est dans cet objectif validé dans les cellules de la lignée Hela T-Rex (invitrogen ref : R714-07) qui expriment constitutivement le transgène TetR du répresseur bactérien du gène de la Téfracycline (Figure 7C).
H - CONSTRUCTION DE LIBRAIRIES DE CASSETTES D'EXPRESSION ADAPTÉES À L'EXPRESSION IN VITRO
Une librairie de cassettes aléatoires a été générée in vifro à partir de fragment d'ADN simple brin en trois étapes (Figure 13A).
La première étape consiste à hybrider et allonger deux brins d'ADN afin de reconstituer une librairie de fragments du gène VA dans lequel est insérée une séquence aléatoire.
Ce fragment sert alors de matrice à une réaction de polymérisation en chaîne qui permet d'obtenir la librairie de cassette d'expression VA aléatoire dans sa totalité (2ιeme étape). La 3ιeme étape consiste à ajouter, en amont des cassettes d'expression VA aléatoire, les séquences d'un promoteur utilisable pour effectuer une transcription in vitro. A partir de cette librairie de transcription VA aléatoire, une étape de transcription in vitro permet l'obtention de la librairie d'ARN VA aléatoire.
Dans un exemple spécifique, les fragments d'ADN simple brin de la première étape sont les suivants : brin sens : banque Sens
5'GCGACCGGGGTTCGAACCCCGGAATAACTCTATCAATGATATGCCCAGCCC3' brin antisens : banque Antisens 5'-CGAACTTCTTGATGCCCTGCCC(N)303' dans lequel N représente une base aléatoire : A ou T ou G ou C
Dans cet exemple, la séquence aléatoire est représentée par un fragment de 30 bases flanqué en amont et en aval de deux séquences constantes de 5 bases, capables de former une structure en double hélice dans la molécule d'ARN finale. Cette structure se trouve positionnée à un niveau qui équivaut à l'insertion des séquences aléatoires dans le site Srfl de la cassette d'expression inductible VAiO (voir figure 7). Après une étape d'hybridation, les deux oligonucléotides sont allongés par PADN polymérase fragment de Kleenow qui produit le fragment VAiO aléatoire double brin (Figure 13 A). La deuxième étape consiste à construire à partir du fragment VAiO aléatoire double brin la librairie de cassettes d'expression inductible VAiO aléatoire de pleine taille. Cette étape a été réalisée par une réaction de polymérisation en chaîne à l'aide des oligonucléotides suivants : oligo sens : VAi5'
5'GGGCACTCTTCCGTGGTCTGGTGGATAAACTCTATCATTGATAGAGTTATGCG ACCGGGGTTCGAACCCCGG 3' oligo antisens : VAi end banque 5-AAAAGGAGCGCTCCCCCGTTGTCTGACGTCGAACTTCTTGATGCCCTGCCC -3' utilisant une Taq DNA polymérase (Figure 13 A). Au cours de la troisième étape, le promoteur du bactériophage T7 a été rajouté en amont de chaque cassette d'expression inductible VAiO aléatoire pour générer la librairie de cassettes de transcription inductibles VAiO aléatoires. Cette étape a été réalisée par réaction de polymérisation en chaîne en utilisant les oligonucléotides VApT7 :
5' -AAATTAATACGACTCACTATAGGGCACTCTTCCGTGGTCTGG -3' en amont et VA end :
5' -AAAAGGAGCGCTCCCCCGTTG -3' en aval.
La librairie de cassettes de transcription T7 VAiO aléatoire ainsi obtenue a été utilisée pour générer in vitro une librairie d'ARN VAiO aléatoire grâce à l'utilisation de l'ARN polymérase du bactériophage T7 (Figure 13 B). Dans ces expériences plusieurs dixaines de microgrammes d'ARN ont été obtenues.
I - CRIBLAGE IN VITRO D'ARN ACTIFS ET OBTENTION DE LIBRAIRIES RESTREINTES DE CASSETTES D'EXPRESSION
La librairie d'ARN VA aléatoires est utilisée pour sélectionner des ARN capables de lier in vifro un subsfrat spécifique. Les ARN actifs sélectionnés par toute méthode adaptée, connue de l'homme du métier, servent de matrice pour générer par une étape de transcription réverse suivie d'une étape d'amplification (réaction de RT-PCR) les cassettes d'expression correspondantes . Ce mélange de cassettes d'expression d'ARN actifs est alors clone dans un vecteur adapté au transfert de gènes puis utilisé comme matériel de départ pour la sélection in cellulo d'ARN actifs (librairie de cassettes d'expression d'ARN aléatoires enrichie en ARN actifs).
Dans un exemple spécifique, les ARN VAΔIV Srf, VA TAR* ou VAiO aléatoires ont été utilisés pour obtenir les cassettes de transcription correspondantes. La réaction de RT-PCR a été effectuée en présence des amorces adaptées :VApT7 et VAend (Figure 13 C). D'autre part, afin de monfrer que le produit de la réaction de RT-PCR (est bien représentatif de la diversité du substrat, des mélanges d'ARN ont été utilisés comme matrice. La figure 13 C montre que dans les conditions dans lesquelles frois ARN matrice sont mélangés (ARN VAΔTV Srf ARN VATAR* et ARN VAiO aléatoires ) de façon équimoléculaire (1/3 ; 1/ 3 ; l/3)la réaction de RT-PCR produit trois cassettes dont les quantités respectives reflètent les quantités initiales de chacun des ARN substrat. Ainsi dans les conditions où la librairie d'ARN VAiO aléatoire est utilisée comme substrat, les produits de la réaction de RT-PCR sont représentatifs d'une librairie de cassettes d'expression.
J - EXPRESSION D9AMN ACTIFS DE SEQUENCE DETERMINEE
Les constructions de l'invention peuvent également êfre utilisées pour tester des séquences actives définies, et/ou exprimer de telles séquences dans des tissus biologiques.
Dans ce cas, la séquence active à insérer se présente sous la forme d'ADN double brin dont la séquence à été choisie pour générer un ARN actif efficace (de type antisens, ribozyme, ARN interférant (siARN, miARN ou leurs précurseurs) ou ARN aptamère). L'ADN double brin peut être obtenu par différentes techniques comme l'hybridation entre deux oligonucléotides complémentaires, la purification de fragments de restriction, la copie d'une matrice par PCR, etc. Un vecteur tel que décrit dans l'exemple B, contenant une cassette d'expression, est digéré par l'enzyme de restriction adaptée et le clonage de la séquence active s'effectue dans ce site de restriction par des techniques classiques de clonage.
Des vecteurs peuvent ainsi être produits, qu'il s'agisse de vecteurs plasmidiques ou viraux, par exemple. D'autre part, des virus recombinants peuvent également être générés, comme décrit dans l'exemple C. Les réfrovirus recombinants produits servent alors à infecter les cellules dont on souhaite altérer le phenotype. L'infection est faite préférentiellement avec une forte multiplicité d'infection afin d'intégrer un nombre élevé de cassettes d'expression d'ARN actif dans le génome cellulaire. En effet, l'activité de la séquence active est fortement dépendante de son niveau d'expression (figure 11). La présence du gène de résistance à la puromycine dans les rétrovirus pBabe permet une sélection rapide des cellules qui ont été infectées et contenant la séquence transduite.
Ces vecteurs peuvent également être purifiés et conditionnés dans tout véhicule ou excipient acceptable, pour produire des compositions administrables, par exemple chez des organismes mammifères, notamment humain. REFERENCES
Barcellini, C. S., Fenard, D., Bertrand, E., Singer, R. H., Lefebvre, J. C, and Doglio, A. (1998). 3'-End modification of the adenoviral VAl gène affects its expression in human cells: conséquences for the design of chimeric VAl RNA ribozymes [In Process Citation]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 8, 379-90 379-90.
Bertrand, E., Castanotto, D., Zhou, C, Carbonnelle, C, Lee, N. S., Good, P., Chatterjee, S., Grange, T., Pictet, R., Kohn, D., Engelke, D., and Rossi, J. J. (1997). The expression cassette détermines the functional activity of ribozymes in mammalian cells by controlling their intracellular localization. Rna 3, 75-88 75-88. Bertrand, E., Gwizdek, C, Fenard, D., and Doglio, A. (1999). L'ARN molécule thérapeutique ? vers une conception rationnelle du développement des ARN antisens, des ribozymes et des aptamères d'ARN. Médecine/Sciences 15, 677-681.
Burns, J. C, Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., and Yee, J. K. (1993). Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped refroviral vectors: concenfration to very high titer and efficient gène fransfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad SciU S A 90, 8033-7.
Cagnon, L., Cucchiarini, M., Lefebvre, J. C, and Doglio, A. (1995). Protection of a T-cell line from human immunodeficiency virus réplication by the stable expression of a short antisense RNA séquence carried by a shuttle RNA molécule. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Refrovirol 9, 349-58 349-58. Chameau, P., Mirambeau, G., Roux, P., Paulous, S., Bue, H., and Clavel, F. (1994). HIV-1 reverse transcription. A termination step at the center of the génome. J Mol Biol 241, 651- 62.
Famulok, M., and Verma, S. (2002). In vivo-applied functional RNAs as tools in proteomics and genomics research. Trends Biotechnol 20, 462-6.
Gmeiner, W. H. (2002). The structure and dynamics of the U4 U6 snRNP: implications for pre-mRNA splicing and use as a model System to investigate the RNA-mediated effects of (5F)Ura. J Biomol Struct Dyn 19, 853-62.
Gold, L. (1995). The SELEX process: a suφrising source of therapeutic and diagnostic compounds. Harvey Lect 91, 7-57
47-57. Gossen, M., and Bujard, H. (1992). Tight control of gène expression in mammalian cells bt tetracycline-responsivepromoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551.
Gwizdek, C, Bertrand, E., Dargemont, C, Lefebvre, J. C, Blanchard, J. M., Singer, R. H., and Doglio, A. (2001). Terminal minihelix, a novel RNA motif that directs polymérase III transcripts to the cell cytoplasm. Terminal minihelix and RNA export. J Biol Chem 276, 25910-8.
Hermann, T., and Patel, D. J. (2000). Adaptive récognition by nucleic acid aptamers. Science 287, 820-5.
Hillen, W., and Berens, C. (1994). Mechanisms underlying expression of TnlO encoded téfracycline résistance. Annu Rev Microbiol 48, 345-69. Mathews, M. B., and Shenk, T. (1991). Adenovirius-associated RNA and franslation control. J. Viral. 65, 5657 - 5662.
McManus, M. T., and Shaφ, P. A. (2002). Gène silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genêt 3, 737-47.
Médina, M. F., and Joshi, S. (1999). RNA-polymerase III-driven expression cassettes in human gène therapy. Curr Opin Mol Ther 1, 580-94.
Morgenstern, J. P., and Land, H. (1990). Advanced mammalian gène transfer: high titre refroviral vectors with multiple drug sélection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res 18, 3587-96.
Paule, M. R., and hite, R. J. (2000). Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids Res 28, 1283-98.
Scherr, M., Morgan, M. A., and Eder, M. (2003). Gène Silencing Mediated by Small Interfering RNAs in Mammalian Cells. Curr Med Chem 10, 245-56.
Simone, N. L., Bonner, R. F., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R., and Liotta, L. A. (1998). Laser-capture microdissection: opening the microscopic frontier to molecular analysis. Trends Genêt 14, 272-6.
Yamamoto, R., Katahira, M., Nishikawa, S., Baba, T., Taira, K., and Kumar, P. K. (2000). A novel RNA motif that binds efficiently and specifically to the Ttat protein of HIV and inhibits the trans-activation by Tat of transcription in vitro and in vivo. Gènes Cells 5, 371- 88.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de sélection in cellulo d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phenotype désiré, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire disctinct, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de cellule-ci avec une population de cellules dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits rétrovirus recombinants, c) la sélection des cellules possédant le phenotype désiré, et d) l'identification de la ou des cassette(s) contenue(s) dans la ou lesdites cellules, ou de l'ARN actif qu'elles expriment.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cassette comprend la séquence d'un gène VAl d'adénovirus délété de tout ou une partie fonctionnelle de la boucle IV, dans laquelle la séquence de l'ARN structural aléatoire est insérée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la double-hélice terminale du gène VA est altérée.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène VA comprend une séquence conférant un caractère inductible, de préférence entre les boîtes A et B et/ou en amont du gène, plus préférentiellement en remplacement de tout ou partie des séquences natives.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence conférant un caractère inductible est une séquence conférant une sensibilité à un facteur agissant en frans, de préférence un site de liaison d'un facteur transcriptionnel ou d'un répresseur.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence conférant un caractère inductible est représentée par une ou plusieurs séquences opératrices d'un promoteur bactérien régulé, de préférence du promoteur de la téfracycline.
7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la cassette d'expression inductible est choisie parmi les cassettes OVAi (SEQ ID NO: 16), VAiO (SEQ ID NO: 15) et OVAiO (SEQ ID NO: 17).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cassette comprend en oufre un second promoteur franscriptionnel, en amont du promoteur
VA.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ARN actif est un ARN structural.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'ARN actif est un ARN interférant (siARN, miARN ou leurs précurseurs) ou antisens.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque est mise en contact avec la population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'un nombre restreint de cassettes par cellule, de préférence à une MOI inférieure à 1.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque d'acides nucléiques est préparée par : synthèse d'une banque d'ADN simple-brins comprenant une région aléatoire encadrée par une ou deux régions de séquence définie, synthèse d'un deuxième brin au moyen d'une ADN polymérase et en présence d'une amorce complémentaire de la séquence définie du premier brin, ou d'une partie de celle-ci, pour produire une banque d'ADN double-brins comprenant une région aléatoire, clonage de la banque d'ADN double-brins dans un vecteur rétroviral, sous contrôle d'un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, et transfection dudit vecteur dans une lignée cellulaire d'encapsidation, pour produire une banque de rétrovirus recombinants.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque mise en œuvre dans l'étape a) est une banque aléatoire restreinte codant des ARN aléatoires pré-sélectionnés pour une ou des propriétés particulières, de préférence pour leur capacité de liaison et/ou pour leur affinité pour une cible, pour la présence d'un motif structural et/ou d'une séquence spécifique.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la banque mise en œuvre dans l'étape a) est une banque de mutants aléatoires d'un gène cible particulier.
15. Procédé selon la revendication 13, comprenant : la) la préparation d'une banque de rétrovirus recombinants comprenant une cassette d'expression comprenant une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, les ARN aléatoires codés ayant été pré-sélectionnés in vifro pour leur capacité à lier et/ou pour leur affinité pour une cible d'intérêt, lb) la mise en contact de cette banque ou d'une partie de cette banque, avec une population de cellules dans des conditions permettant le fransfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, 2) la sélection d'une ou plusieurs cellules possédant le phenotype désiré, et
3) l'identification de la ou des cassette(s) contenue(s) dans la ou lesdites cellules, ou de(s) l'ARN(s) actif(s) qu'elles expriment.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la banque de rétrovirus recombinants codant des ARN aléatoires présélectionnés est préparée par: - synthèse in vitro d'une banque de cassettes d'expression (ADN db) comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus et, le cas échéant, d'un promoteur supplémentaire;
- expression in vitro de la banque de cassettes ou d'une partie de celle-ci, produisant in vitro une banque d'ARN aléatoires;
- sélection in vitro des ARN pour leur capacité de liaison ou pour leur affinité pour une cible donnée; et
- production d'une banque restreinte de rétrovirus recombinants comprenant des cassettes d'expression d'ARN ainsi sélectionnés.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'expression in vifro de la banque de cassettes est réalisée en deux étapes, une étape de production de cassettes de transcription et une étape de transcription proprement dite.
18. Procédé de sélection d'ARN actifs, comprenant (i) la synthèse in vifro d'une banque de cassettes d'expression (ADN db) codant pour des ARN aléatoires sous contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, (ii) l'expression in vitro de la banque de cassettes ou d'une partie de celle-ci, produisant in vifro une banque d'ARN aléatoires, et (iii) la sélection in vitro des ARN pour leur capacité de liaison ou pour leur affinité pour une cible donnée.
19. Procédé selon la revendication 18, comprenant en oufre une étape (iv) de production d'une banque de restreinte de rétrovirus recombinants comprenant des cassettes d'expression d'ARN sélectionnées à l'étape (iii).
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que PADN des cassettes d'expression des cellules sélectionnées est amplifié pour produire une banque restreinte, et en ce que les étapes b) et c) du procédé sont répétées une fois au moins avec ladite banque restreinte.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules animales (par exemple de mammifère), de levure, de plante, d'insecte ou bactériennes.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le phenotype désiré est choisi parmi une capacité ou une incapacité de croissance, d'apoptose, de différentiation, de migration, de résistance à un agent toxique, de résistance à un agent infectieux, ou d'action métabolique.
23. Procédé selon l'une des revendication 1 à 21, caractérisé en ce que le phenotype désiré est l'expression d'une cible biologique.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules infectées par un virus et le phenotype désiré est la résistance audit virus.
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules tumorales et le phenotype désiré est la perte de tumorigénicité.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules bactériennes et le phenotype désiré est la sensibilité à un agent toxique.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 26, caractérisé en ce que l'activité de l'ARN est sélectionnée en cultivant les cellules en condition d'induction de l'expression et, de préférence, validée en comparant l'état induit et l'état réprimé.
28. Procédé de sélection d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phenotype désiré, comprenant : a) la foxxrniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée de la séquence d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN aléatoire distinct, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits réfrovirus recombinants, c) la sélection de cellules possédant le phenotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
29. Procédé selon la revendication 28, dans lequel ladite banque d'acides nucléiques de l'étape a) code des ARN aléatoires pré-sélectionnés pour une propriété particulière, de préférence pour leur capacité à lier, in vitro, une cible d'intérêt.
30. Procédé de sélection d'ARN actifs sur une cible biologique déterminée, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes placées sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III et comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN contraint ou prédéfini pour agir sur une cible donnée, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules exprimant ou contenant la cible biologique, dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phenotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules et, de manière facultative, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
31. Banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de réfrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire disctinct.
32. Cassette d'expression d'un ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codant ledit ARN insérée dans un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, ledit promoteur comprenant en oufre une séquence conférant un caractère inductible.
33. Cassette selon la revendication 32 ou banque selon la revendication 31, caractérisée en ce que la double-hélice terminale du gène VA est altérée.
34. Cassette selon la revendication 32 ou 33, ou banque selon la revendication 31, caractérisée en ce que l'ARN est un ARN structural aléatoire ou de séquence définie.
35. Cassette selon l'une des revendications 32-34, ou banque selon la revendication 31, caractérisée en ce que la cassette comprend en outre un second promoteur transcriptionnel, localisé en amont du promoteur VA.
36. Vecteur comprenant une cassette selon l'une des revendications 32 à 35.
37. Cellule comprenant une cassette selon l'une des revendications 32 à 35 ou un vecteur selon la revendication 36.
38. Composition pharmaceutique ou formulation, caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette selon l'une des revendications 32 à 35, un vecteur selon la revendication 36, une . cellule selon la revendication 37 ou une cassette d'expression d'un ARN actif identifié ou produit par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 30, ou un ARN actif constitué uniquement par le motif actif isolé au sein de ladite cassette.
PCT/FR2004/000499 2003-03-04 2004-03-03 Methodes et outils pour le criblage d’arn actifs in cellulo WO2004080378A2 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04716629A EP1599604A2 (fr) 2003-03-04 2004-03-03 Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo
US10/547,489 US20070122798A1 (en) 2003-03-04 2004-03-03 Methods and tools for screening active rna in cellulo

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0302633A FR2852021B1 (fr) 2003-03-04 2003-03-04 Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo
FR03/02633 2003-03-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004080378A2 true WO2004080378A2 (fr) 2004-09-23
WO2004080378A3 WO2004080378A3 (fr) 2005-04-21

Family

ID=32865224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/000499 WO2004080378A2 (fr) 2003-03-04 2004-03-03 Methodes et outils pour le criblage d’arn actifs in cellulo

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20070122798A1 (fr)
EP (1) EP1599604A2 (fr)
FR (1) FR2852021B1 (fr)
WO (1) WO2004080378A2 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005073380A2 (fr) * 2004-01-23 2005-08-11 Cold Spring Harbor Laboratory Systemes d'expression regulee de la polymerase iii et methodes associees

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020211050B4 (de) 2020-09-02 2022-05-19 Volkswagen Aktiengesellschaft Antriebseinrichtung für ein Kraftfahrzeug
US20220135954A1 (en) * 2020-10-15 2022-05-05 Hoffmann-La Roche Inc. Nucleic acid constructs for va rna transcription

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027309A1 (fr) * 1996-01-23 1997-07-31 Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A. Constructions d'adn et vecteurs d'expression derives du gene de l'arn va i d'adenovirus
WO1998032880A1 (fr) * 1997-01-23 1998-07-30 Immusol Incorporated Analyse fonctionnelle et decouverte de genes a l'aide de banques de vecteurs de genes de ribozymes specifiques a une cible ou bien rendues aleatoires
WO1999041371A1 (fr) * 1998-02-13 1999-08-19 Genetrace Systems, Inc. Utilisation de ribozymes afin d'identifier la fonction de genes
WO2003022311A1 (fr) * 2001-09-13 2003-03-20 Genvec, Inc. Vecteur adenoviral, systeme correspondant et procedes de fabrication et d'utilisation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2687411A1 (fr) * 1992-02-13 1993-08-20 Nice Sophia Antipolis Universi Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn.
US5837503A (en) * 1993-07-07 1998-11-17 Universite De Nice-Sophia-Antipolis Vector containing viral gene transcribed by RNA polymerase III and methods for use
EP0716692A1 (fr) * 1993-09-03 1996-06-19 Chiron Corporation Procede de suppression de la reponse auto-immune
US6183959B1 (en) * 1997-07-03 2001-02-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method for target site selection and discovery
EP1554386A2 (fr) * 2002-07-24 2005-07-20 Immusol Incorporated Systeme a un seul promoteur pour la production de cassettes d'expression d'arnsi et genotheque d'expression reposant sur l'utilisation d'un lieur en epingle a cheveux d'amorce de polymerase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027309A1 (fr) * 1996-01-23 1997-07-31 Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A. Constructions d'adn et vecteurs d'expression derives du gene de l'arn va i d'adenovirus
WO1998032880A1 (fr) * 1997-01-23 1998-07-30 Immusol Incorporated Analyse fonctionnelle et decouverte de genes a l'aide de banques de vecteurs de genes de ribozymes specifiques a une cible ou bien rendues aleatoires
WO1999041371A1 (fr) * 1998-02-13 1999-08-19 Genetrace Systems, Inc. Utilisation de ribozymes afin d'identifier la fonction de genes
WO2003022311A1 (fr) * 2001-09-13 2003-03-20 Genvec, Inc. Vecteur adenoviral, systeme correspondant et procedes de fabrication et d'utilisation

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Geneseq [Online] 17 mai 1994 (1994-05-17), "Adenovirus 2 VA I gene with anti-Tat insert." XP002309698 extrait de EBI accession no. GSN:AAQ51311 Database accession no. AAQ51311 -& FR 2 687 411 A (NICE SOPHIA ANTIPOLIS UNIVERSI) 20 août 1993 (1993-08-20) *
DATABASE Geneseq [Online] 4 octobre 1995 (1995-10-04), "Adenovirus 2 (Ad2) VARNA1 promoter forward strand." XP002309697 extrait de EBI accession no. GSN:AAQ85743 Database accession no. AAQ85743 -& WO 95/06718 A (VIAGENE INC) 9 mars 1995 (1995-03-09) *
ELOIT M ET AL: "High level of transgene expression in cell cultures and in the mouse by replication-incompetent adenoviruses harboring modified VAI genes" JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 71, no. 7, 1997, pages 5375-5381, XP002269684 ISSN: 0022-538X *
GWIZDEK CAROLE ET AL: "Terminal minihelix, a novel RNA motif that directs polymerase III transcripts to the cell cytoplasm: Terminal minihelix and RNA export" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 28, 13 juillet 2001 (2001-07-13), pages 25910-25918, XP002269631 ISSN: 0021-9258 *
ILVES HEINI ET AL: "Retroviral vectors designed for targeted expression of RNA polymerase III-driven transcripts: A comparative study" GENE (AMSTERDAM), vol. 171, no. 2, 1996, pages 203-208, XP002269685 ISSN: 0378-1119 *
MEDINA M F C ET AL: "RNA POLYMERASE III-DRIVEN EXPRESSION CASSETTES IN HUMAN GENE THERAPY" CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS, CURRENT DRUGS, LONDON,, GB, vol. 1, no. 5, octobre 1999 (1999-10), pages 580-594, XP001055319 ISSN: 1464-8431 cité dans la demande *
YU M ET AL: "IN VITRO AND IN VIVO CHARACTERIZATION OF A SECOND FUNCTIONAL HAIRPIN RIBOZYME AGAINST HIV-1" VIROLOGY, ACADEMIC PRESS,ORLANDO, US, vol. 206, no. 1, 1995, pages 381-386, XP000652043 ISSN: 0042-6822 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005073380A2 (fr) * 2004-01-23 2005-08-11 Cold Spring Harbor Laboratory Systemes d'expression regulee de la polymerase iii et methodes associees
WO2005073380A3 (fr) * 2004-01-23 2005-10-13 Cold Spring Harbor Lab Systemes d'expression regulee de la polymerase iii et methodes associees

Also Published As

Publication number Publication date
FR2852021B1 (fr) 2007-12-07
WO2004080378A3 (fr) 2005-04-21
US20070122798A1 (en) 2007-05-31
EP1599604A2 (fr) 2005-11-30
FR2852021A1 (fr) 2004-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116590257B (zh) VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及其用途
DE60225586T2 (de) Sirna knockout prüfverfahren und konstrukte
Sumanas et al. Morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides in zebrafish: a recipe for functional genomics?
Silva et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes
US20040002077A1 (en) siRNA expression system and method for producing functional gene knock-down cell using the system
EP1462525B1 (fr) Systeme d'expression d'arnsi et procede de production de cellule knockdown a gene fonctionnel ou analogue utilisant ce systeme
FR3024464A1 (fr) Ciblage de vecteurs integratifs non-viraux dans les sequences d'adn nucleolaires chez les eucaryotes
FR2838442A1 (fr) Sirnas inhibiteurs de l'expression de genes responsables de l'inactivation de la p53 et leur utilisation dans le traitement des cancers
FR2882062A1 (fr) Vecteurs d'expression stable et de longue duree de sirna et leurs applications
KR20210126014A (ko) CRISPR-Cas로 표적화된 핵 RNA 분열 및 폴리아데닐화
EP1599604A2 (fr) Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo
US10941186B2 (en) Methods for expressing proteins in axons
US20230071834A1 (en) Exported rna reporters for live-cell measurement
FR3124522A1 (fr) Composition et méthode permettant l’édition génomique
JP4877835B2 (ja) Ｒｎａ干渉誘導エレメント及びその用途
WO2006111544A1 (fr) Methode d'inhibition de la traduction et/ou la replication d'une sequence d'arn par multimerisation d'une de ses regions d'arn non codant replie
EP1563080A1 (fr) Methode d'expression inductible d'arni dans des cellules, les molecules d'acide nucleique pour sa mise en oeuvre et les cellules transformees par ces molecules
Carmell The role of argonaute proteins in mammalian development
Staffa Post-transcriptional regulation in HIV-1 and human fibronectin: multiple CIS-acting elements
Siolas et al. Using RNA Interference to Reveal Genetic Vulnerabilities in Human Cancer Cells
Alexander The Roles of Forkhead Transcription Factors in Stem Cell and Myogensis
Wen-Hsin Lentiviral-based RNA interference of genes in leukaemic cells
WO2006006514A1 (fr) PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D’UNE BANQUE DE VECTEURS D’EXPRESSION DE L’ARNsi
WO2005026369A2 (fr) Vecteurs d’expression d’arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations.
FR2872171A1 (fr) Methode universelle d'extinction d'un transgene par arn interferent

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004716629

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007122798

Country of ref document: US

Ref document number: 10547489

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004716629

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10547489

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2004716629

Country of ref document: EP