FR2687411A1 - Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn. - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un vecteur recombinant comportant une cassette de transcription par l'ARN polymérase III, constituée par un gène viral transcrit pra l'ARN polymérase III dans lequel on a inséré un oligonucléotide fragment d'ADN entre ou à l'extérieur des boîtes A et B constituant ledit promoteur du gène viral. La présente invention a également pour objet un procédé de production intracellulaire d'un fragment d'ARN in vitro ou in vivo dans lequel on transfecte ou infecte des cellules eucaryotes comportant de l'ARN polymérase III avec un vecteur selon l'invention, comportant comme oligonucléotides un fragment d'ADN correspondant au transcrit inverse dudit ARN et en ce que l'on cultive dans un milieu de culture approprié les cellules eucaryotes ainsi transfectées ou infectées. Enfin, la présente invention concerne également l'utilisation des vecteurs à titre de médicament.

Description

La présente invention concerne des vecteurs d'ADN recombinants, notamment de type plasmidique ou viral, comportant une cassette de transcription par 1'ARN polymérase III constituée par un gène viral transcrit naturellement par L'ART polymérase III.

La présente invention concerne aussi des cellules eucaryotes transfectées ou infectées par des vecteurs selon l'invention.

La présente invention concerne également un procédé de production intracellulaire d'un fragment d'ARN in vitro ou in vivo par culture de cellules eucaryotes transfectées ou infectées par les vecteurs selon l'invention.

La présente invention concerne également l'utilisation de vecteurs selon l'invention à titre de médicament.

Les molécules antisens sont des séquences d'ARN qui s'hybrident de manière sélective aux ARN messagers dont elles sont complémentaires et bloquent ainsi l'expression du gène considéré (maturation de 1'ARN, traduction). Les travaux réalisés depuis le début des années 80 attestent de l'efficacité d'un tel système pour réprimer de nombreuses fonctions cellulaires ou virales (1,2).

Les perspectives d'applications potentielles de ces molécules antisens sont importantes en recherche fondamentale. L'utilisation des antisens pour corriger l'expression de certains phénotypes "anormaux" ou pour lutter efficacement contre des virus pour lesquels les approches classiques (vaccination, chimiothérapie...) s'avère délicate, comme cela est le cas pour le virus de l'Immunodéficience Humaine (HIV).

Un des problèmes posés par l'utilisation des antisens réside dans le fait que ces molécules sont efficaces à des concentrations intracellulaires importantes bien largement supérieures à celles de leur substrat. La concentration intracellulaire de molécules antisens étant le résultat de la différence entre la synthèse et la dégradation, on a recherché selon l'invention des solutions favorisant la synthèse et la stabilité des produits formés. Dans cette optique, l'efficacité de fonctionnement de la molécule antisens vis à vis de sa cible est un paramètre important puisque plus une molécule sera "puissante" moins elle nécessitera une concentration élevée pour obtenir un effet maximum.

L'ARN polymérase III est chez les eucaryotes l'enzyme responsable de la synthèse d'une grande variété de petits ARN cytoplasmiques ou nucléaires. Les principaux représentants étant les ARN de transfert (tRNA) ou les ARN ribosomiques de type 5S (3).

L'ARN polymérase III est capable de transcrire efficacement en système acellulaire des fragments d'ADN clonés. Ceci est possible à la condition que ces fragments d'ADN contiennent les régions promoteur spécifiques à la transcription par la polymérase III. Ces régions promoteur sont à présent bien caractérisées (4) et sont avant tout constituées par des régions intragéniques disposées de manière discontinue. Dans le cas des gènes de type tRNA, il s'agit de deux régions d'ADN: la "box A" et la "box
B" chacune formée par Il nucléotides (séquence consensus) et espacées par une région intermédiaire de taille variable (4).

Les ARN transcrits par la polymérase III sont remarquables par leur petite taille et surtout par leur conformation dans l'espace. Ainsi la structure en feuille de trèfle des tRNA est particulièrement bien connue.

Cette structure secondaire assure vraisemblablement aux tRNA stabilité mais surtout fonctionnalité. Les séquences présentes au niveau des boucles (anticodon) sont libres de s'hybrider sur un ARN complémentaire. Cotten et
Birnstiel ont en 1989 (5) proposé d'insérer une séquence "ribozyme/antisens" dans le gène tRNAmet de Xenopus. L'oligonucléotide a été inséré dans la région intermédiaire située entre les box A et box B des régions promoteur de façon à être correctement présenté au niveau de l'anticodon (ribtRNAmet référence 2).

Certains virus (Adénovirus, Epstein Barr virus, Herpes virus) sont dotés de gènes transcrits par L'ART polymérase III. En particulier, les
Adénovirus sont dotés de deux gènes, d'organisation similaires, appelés VAI et VAII (VA : Virus Associated) codant pour deux VA-ARN diférents
VA-ARNI et VA-ARNII (6). Les gènes VA sont naturellement clonés et fonctionnels dans le génome des Adénovirus. On trouve plus de molécules VA-ARN dans une cellule infectée par un Adénovirus. Ces petits
ARN, comportant 150 nucléotides, sont transcrits à partir d'un promoteur comportant deux régions distinctes (box A et box B) localisées dans la région L1 du génome de l'Adénovirus (7).Les VA-ARN exercent un effet au niveau de la traduction : les mutants d'Adénovirus défectifs en VA-ARNI expriment normalement leurs ARN messagers mais sont incapables de les faire traduire efficacement. L'explication de ce phénomène est que la protéine kinase DAI induite par l'interféron est inhibée par la VA-AR NI, ce qui permet à son substrat eIF-2 d'échapper à la phosphorylation et donc à l'inactivation (9) (le facteur eIF-2 étant nécessaire à l'initiation de la traduction). L'interaction entre le VA-ARNI et la kinase a été bien documentée (10,11). Ils ont décrit deux régions distinctes de l'ARN, l'une étant impliquée dans la liaison de L'ART avec la protéine DAI (nucléotides 93 à 136) et l'autre dans l'inhibition de l'activité kinasique (nucléotides 54 à 77).

Jennings et Molloy (12) ont montré qu'il était possible de réprimer l'expression d'un réplicon du virus SV40, dans les cellules COSI, grâce à un antisens anti SV40 de 163 pb (antigène T) greffé à l'extréminité 3' du gène VAI. Après transfection des cellules COS1 par diverses constructions (sens, antisens), les auteurs montrent sur un système d'expression transitoire que l'antigène T est réprimé à 50%.

On a, selon la présente invention, inséré une courte séquence antisens à l'intérieur du gène VA, dans le but d'obtenir un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire conservant la structure partiellement double brin du gène VA et sa conformation à boucle, du type épingle à cheveux, qui interagit avec la protéine kinase. Ce maintien de la configuration structurelle se traduit par une plus grande stabilité intracellulaire, d'une part et une conservation de la fonctionnalité du gène VA, d'autre part.

On a en effet, selon la présente invention, découvert que l'efficacité remarquable du fonctionnement de ces petits ARN dans leur rôle d'inhibition de l'activité de la protéine kinase DAI peut être utilisée en le détournant de sa vocation première et en le dirigeant vers une autre cible par le biais des antisens ou des ribozymes. Selon l'invention, on utilise donc ces gènes VA comme système navette, en particulier pour le développement d'une nouvelle famille de molécules d'ARN antisens exprimées chez les eucaryotes et potentiellement utilisables pour une large gamme drapplications.

On a, selon la présente invention, développpé un modèle de gène "cassettes" permettant l'insertion aisée d'oligonucléotides antisens ou de ribozymes dans le gène VA sans en affecter le taux de transcription et on a pu mesurer l'efficacité relative de ces constructions en matière d'inhibition de la réplication du virus HIV en culture. La présente invention repose en effet sur l'utilisation de L'ART Polymérase III pour transcrire efficacement des gènes clonés (VAI) porteurs de séquences antisens ou ribozymes (sous forme de fragments d'ADN exogènes de petites tailles -15 à 25 nucléotides- insérés dans le gène considéré).

Dans son aspect le plus général, la présente invention a pour objet un vecteur d'ADN recombinant comportant une cassette de transcription par 1'ARN polymérase III, constitué par un gène viral transcrit par ltARN polymérase III dans lequel on a inséré un oligonucléotide, fragment d'ADN, entre ou à l'extérieur des boîtes A et B constituant ledit promoteur du gène viral.

Le taux de transcription des gènes VA par la polymérase III est très important. Cet enzyme est bien conservé chez la plupart des eucaryotes et de ce fait adaptable à de nombreux modèles cellulaires ou animaux, la représentation ubiquitaire de cet enzyme dans tous les tissus ne pose pas de limitation tissulaire spécifique.

L'utilisation de ces gènes viraux transcrits en grande quantité, stables et fonctionnels, en fait donc des systèmes de production in situ d'ARN particulièrement efficaces.

L'organisation des gènes transcrits par cet enzyme est intéressante de par l'absence de séquences d'ADN régulatrices en position "extragénique", ce qui simplifie le schéma de régulation de la transcription et assure un compactage de l'information génétique. La position intragénique des promoteurs évite d'avoir à manipuler des régions non transcrites, ce qui permet de manipuler de petits gènes faciles à cloner. Enfin, les gènes viraux selon l'invention, tels que VA, offrent de nombreuses possibilités d'insertion d'oligonucléotides sans affecter leur taux de transcription et la structure secondaire de L'ART transcrit.

Dans un mode de réalisation approprié, le gène viral est un gène VA d'un adénovirus, ou un gène EBR d'un virus Epstein Barr ou un gène viral transcrit par L'ART polymérase III d'un virus Herpès.

En particulier, on peut citer le gène VAI ou VAII d'un
Adénovirus, notamment l'Adenovirus 2.

Le gène VAI des Adénovirus a été choisi comme système pilote, à titre d'exemple de réalisation de l'invention, car il est particulièrement bien décrit dans la littérature. Cependant, l'ensemble des gènes viraux semblables au VAI transcrits par 1'ARN Polymérase III peut également convenir.

Comme vecteur approprié selon l'invention, on peut citer un vecteur réplicatif plasmidique ou épisomique ou un vecteur viral.

En particulier, on utilisera un vecteur épisomique portant l'origine de réplication du virus Epstein Barr (oriP), ainsi que les séquences codantes pour la protéine EBNA-1.

S'agissant du choix du vecteur, il est en effet, préférable de rester le plus proche possible du système "naturel" en le perturbant le moins possible. Pour cette raison, on fait utiliser un vecteur se répliquant de manière autonome (épisome). Le recours à un vecteur à réplication épisomique peut être un bon moyen pour exprimer des antisens dans des cellules eucaryotes et tout particulièrement dans le lymphocyte T. Le clonage des gènes VA/antisens dans des vecteurs se répliquant sous forme épisomique en système eucaryote est particulièrement approprié. Ces vecteurs portent l'origine de réplication du virus Epstein Barr (OriP) ainsi que des séquences codantes pour la protéine Ebnal strictement nécessaire à la réplication de la molécule d'ADN portant Ori P.

On note une plus grande efficacité de fonctionnement de la polymérase III sur des épisomes ainsi qu'une stimulation de l'activité transcriptionnelle en présence de la protéine Ela. Ces propriétés sont mises à profit pour améliorer le système proposé.

Le vecteur viral selon l'invention est de préférence un virus à
ADN, mais peut également être un vecteur rétroviral à ARN ; il comportera alors le transcrit ARN de la cassette de transcription selon l'invention.

Compte tenu du fait que l'infection d'une cellule par un rétrovirus entraîne la production d'un ADN proviral circularisé, c'est cet ADN proviral qui sera à son tour transcrit par 1'ARN polymérase III conformément à l'invention, ceci n'excluant pas le fonctionnement de la construction génétique utilisée une fois que le DNA rétroviral est intégré.

Dans un mode de réalisation approprié selon l'invention, l'oligonucléotide est inséré dans les régions intermédiaires situées entre les boîtes A et B du gène VA.

Pour une application thérapeutique, de préférence, le gène VA est inactivé en ce qui concerne l'inhibition de l'action de l'interféron, par délétion ou mutation dans le gène VA des éléments de séquence critiques pour l'inactivation de la protéine kinase, DAI, induite par l'interféron.

Cette inactivation peut se faire par insertion directe de l'oligonucléotide dans les régions responsables de l'activité de l'inhibition de l'action de l'interféron, région décrite pour être contrôlée dans le gène
VA (entre et y compris les nucléotides 10672 et 10745). Par ce biais également, on optimise l'affinité de l'oligonucléotide pour la séquencecible, compte tenu de la configuration spatiale de cette région en forme de boucle.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'oligonucléotide est inséré au niveau du nucléotide 10711 du gène VAI de l'Adénovirus 2 représenté Figure 1.

De préférence, l'oligonucléotide selon l'invention comportera de 15 à 40 nucléotides, de préférence encore 15 à 25.

Dans le cadre d'une application thérapeutique, l'oligonucléotide pourra correspondre à une molécule ARN anti-sens ou à une structure d'ARN ribozymique.

Dans le but d'améliorer l'efficacité d'hybridation entre la molécule ARN antisens et son substrat, de nombreux travaux sont actuellement orientés vers la recherche de séquences cibles correctement définies en termes de paramètres d'hybridation (affinité, accessibilité).

Les séquences ribozymiques (25) sont des séquences consensus minimales requises pour qu'une molécule d'ARN soit capable d'hdrolyser une autre molécule d'ARN suivant un mode catalytique. Ces ribonucléotides à activité catalytique (ribozymes) sont capables de cliver un ARN cible sur lequel ils sont hybridés de manière spécifique (grâce à deux séqueces de 15 nucléotides complémentaires à L'ART cible et placées de part et d'autre de la séquence catalytique). Ces séquences ribozymiques comparables à de "super antisens" peuvent être utilisées avec profit dans notre système en augmentant l'efficacité fonctionnelle de l'ensemble.

La présente invention a également pour objet un procédé de production intracellulaire d'un fragment d'ARN in vitro ou in vivo dans lequel on transfecte ou infecte des cellules eucaryotes comportant de 1'ARN polymérase III avec un vecteur réplicatif selon l'invention, comportant comme oligonucléotide un fragment d'ADN correspondant au transcrit inverse dudit ARN et en ce que l'on cultive dans un milieu de culture approprié les cellules eucaryotes ainsi transfectées ou infectées.

La présente invention a en outre également pour objet, comme on l'a vu, l'utilisation à titre de médicament, d'un vecteur selon l'invention, dans lequel l'oligonucléotide est transcrit en une molécule ARN "antisens" ou une molécule d'ARN ribozymique bloquant l'expression d'un gène impliqué dans une pathologie en s'hybridant et, le cas échéant, en coupant son ARN messager d'origine cellulaire virale, bactérienne ou parasitaire.

Le médicament selon l'invention peut être utilisé comme agent antiviral, antitumoral, antibiotique ou antiparasitaire, ou dans toute pathologie où un gène est anormalement exprimé soit par mutation, soit par dérégulation.

Dans ses applications thérapeutiques in vivo ou ex-vivo, on utilisera de façon tout à fait appropriée un vecteur viral ou rétroviral qui pénétrera dans la cellule par transfection ou infection. En particulier à titre de médicament selon l'invention, on utilisera un vecteur constitué par un vecteur viral défectif tel qu'un adénovirus ou un vecteur rétroviral défectif tel qu'un rétrovirus murin.

En effet, le vecteur utilisé pour véhiculer la construction génique selon l'invention vers sa cible théorique, peut être un vecteur rétroviral avec transport de la construction recombinante par une capside d'emprunt et insertion du matériel génétique dans le DNA de la cellule haute.

Les virus viraux à ADN, tels que les adénovirus, peuvent également convenir à cette approche, bien que, dans ce cas, le maintien du
DNA à l'état épisomique sous forme de réplicon autonome soit la situation la plus probable.

Il va de soi que l'utilisation dtun vecteur virus, provenant d'un
Adénovirus, est particulièrement adaptée lorsque le gène viral est un gène d'Adénovirus.

L'utilisation de virus modifiés génétiquement comme système navette pour transporter le matériel génétique modifié permet non seulement de faire pénétrer le matériel génétique dans la cellule récipiente par le biais de l'utilisation d'une capside virale d'emprunt, mais permet également de traiter de manière simultanée, et sur une courte période de temps, un grand nombre de cellules ; ceci ouvre la voie à des approches curatives s'adressant in vitro à des cellules déjà infectées par le virus à inhiber, mais permet également le traitement thérapeutique appliqué à l'organisme entier.

Selon l'invention, on peut utiliser des transactivateurs viraux.

En particulier, la protéine Ela d'Adénovirus stimule l'activité transcriptionnelle de la polymérase III (23), notamment en mobilisant le facteur
TFIIIC limitant. Cet effet potentialisateur de la polymérase III est surtout observé si l'ADN porteur du gène VA est sous forme épisomique (cas fréquent pour les Adénovirus). On peut utiliser cette propriété de la protéine E1A pour stimuler l'efficacité du système "VA-ARN polymérase III" surtout au cours d'expériences d'expression transitoire, soit avec le gène
Ela cloné en cis du gène VA-ARN, soit en trans par cotransfection.

Egalement, la protéine Tat du HIV pourrait stimuler l'activité transcriptionnelle de la polymérase III.

L'utilisation des transactivateurs viraux couplée avec la vectorisation de l'antisens peut être mise à profit selon l'invention, en matière de spécifité d'action vis à vis de cellules infectées par le HIV (ou d'autres virus pathogènes). Deux stratégies complémentaires peuvent être appliquées: - Dans le but de conférer une "immunité cellulaire" à des cellules
permissives à l'infection HIV (CD4+), le traitement est réalisé "ex-vivo"
par le prélèvement de cellules souches issues de la moelle, leur tri et leur modification génétique "ex-vivo" ; - Une stratégie "curative" est également possible grâce à l'instauration
d'une dépendance de la réplication du vecteur pour la présence de la
protéine Tat du HIV. Cette dépendance permet de répliquer efficacement
le vecteur uniquement dans des cellules infectées par le virus.

La mise au point et le développement de cassettes antisens selon l'invention, adaptables à de nombreux sujets de recherche sont envisagés dans de très nombreux domaines dont notamment l'oncologie moléculaire, le déterminisme cellulaire.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée du mode de réalisation suivant.

La Figure 1 représente la séquence nucléotidique du gène VAI de l'Adénovirus 2.

LEGENDE de la figure 1:

Gène VA1-ARN (Région transcrite)
Oligonucléotides en 5' et 3' du gène VAI servant d'amorces pour la P.C.R.

Séquences des Box A et B nécessaires à la transcrition du gène VA1-ARN par la polymérase m
Site d'insertion de séquences exogènes
La Figure 2 représente des séquences antisens et random insérées au nucléotide 10711 du gène VAI.

La Figure 3 représente l'analyse sur gel d'acrylamide/urée des produits de transcription acellulaire des constructions PVV2/VAI/antisens.

La Figure 4 représente la cinétique d'infection par HIV de
CEM transfectées ou non par un antisens.

La Figure 5 représente le dosage des antigènes HIV présents dans les surnageants des cellules CEM transfectées par des constructions antisens.

Les dosages d'antigènes HIV ont été effectués 5 heures après renouvellement du surnageant de culture et 24 jours après le début de l'infection.

La Figure 6 représente les structures secondaires des VA-ARN : la structure VA-ARNI (A) et deux structures possibles pour les VA-ARNIl (B et C) d'après la référence 13.

La Figure 7 représente le schéma d'insertion d'un oligonucléotide par méthode PCR "overlap".

La Figure 8 représente l'expression du VA-antisens dans la population AS10
piste a : ARN de cellules de la population AS10
piste b : ARN de cellules de la lignée HepG2 infectée par
l'Adénovirus de type 2.

1) Clonage du gène VAI
Le gène choisi pour les expériences proposées ci-après est le gène VA-ARNI de l'Adénovirus 2. La séquence de l'Adénovirus est disponibles dans la banque de données : Genbank - réf.: ADBVAI, séquences transcrites du nucléotide 10610 au nucléotide 10769 (la figure 1 présente les éléments de séquence concernés). La conformation de L'ART en solution est publiée et présentée dans la Figure 6 (13,14).

Le clonage du gène VAI recombinant est réalisé dans un vecteur plasmidique de type PVV2 (15) porteur en cis du gène de résistance à la généticine (sous dépendance du promoteur TK) ou dans un vecteur à réplication autonome en système eucaryote du type pCEP-4 (commercialisé par Invitrogen) ou encore pHEBo (aimablement fourni par R.P. SEKALY, laboratoire d'Immunologie, Montréal). Ces derniers vecteurs sont porteurs des régions OriP et Ebna-l et ils portent également le gène de résistance à l'hygromycine (16,17).

Le gène VAI de l'Adénovirus 2 a été cloné après une étape d'amplification par PCR. Les oligonucléotides servant à cette PCR ont été choisis du coté 5' en amont du site de début de transcription du gène VAI et du coté 3' en aval du site TTTT de terminaison (Fig. 1). Les extrémités 5' de chaque oligonucléotide sont dotées du site de coupure enzymatique Clal, site unique sur le plasmide pVV2, ou bien du site HindIII pour le clonage sur le plasmide pHEBo. La transformation de bactéries par des constructions "pVV2-VAI" a permis d'obtenir plusieurs clones recombinants.

2) Insertion et clonage des séquences antisens
Pour le HIV, la séquence des oligonucléotides à insérer a été déterminée dans un premier temps conformément aux séquences antisens déjà publiées par d'autres auteurs : anti-rev (18) ou anti-tat (19) et séquence aléatoire servant de contrôle spécifique (voir Fig. 2) (les protéines tat et rev sont deux protéines virales dont le rôle régulateur est critique pour la réplication du virus).

Le recours à des séquences de type ribozyme, est actuellement en cours, avec clonage des recombinants porteurs de séquences ribozymiques publiées par Goodchild & Kohli en 1991 (20).

L'utilisation de la PCR "overlap" (voir Figure 7) a permis d'insérer des oligonucléotides de taille variable dans le gène VAI. Les antisens "anti-rev", "anti-tat" et "random" ont été insérés au niveau du nucléotide 10711 de la séquence du VA-ARNI (Fig. 2). Les gènes VAI ainsi modifiés par l'insertion de la séquence antisens sont clonés dans le site
ClaI du plasmide pVV2 comme décrit précédemment.

Les constructions obtenues ont toutes été séquencées (sur 200 nucléotides) puis testées en système de transcription acellulaire pour s assurer de la fonctionnalité ainsi que de l'efficacité relative de transcription de chaque construction. Pour la mise au point des transcriptions in vitro, le protocole suivi est celui décrit par Wu (21) et Weil (22).

Brièvement, 3llg d'ADN à tester sont incubés 90 min à 29"C en présence d'extraits cellulaires contenant l'activité polymérase III et de nucléotides dont notamment de alpha-P32-dGTP. Après synthèse, les produits de la réaction sont analysés sur gel d'acrylamide (la Figure 3 présente le type de résultats obtenus). Les tailles observées correspondent bien aux tailles attendues pour chaque construction, à savoir VA-ARNI natif 160 nucléotides, VA-ARNI/anti-rev 188, VA-ARNI/anti-tat 190. Les autres constructions VA-ARNI/ribozymes ne sont pas encore analysées.

I1 est bien vérifié que l'insertion de séquence exogènes dans le gène VA n'affecte pas son taux de transcrition par la Polymérase III.

3) Inhibition de la réplication virale
La mise au point et le développement des outils antisens sont réalisés, dans le cas d'antisens antiviraux, sur les lignées cellulaires permissives pour la réplication du virus étudié. Par exemple, pour les antisens anti-HIV, les lignées lymphoblastoîdes CEM ou MOLT-4, toutes deux bonnes productrices de virus, sont choisies.

Les cellules de la lignée CEM (débarrassées de mycoplasmes) ont été transfectées par les différents plasmides recombinants (pVV2/VAI/ anti-rev, pVV2/VAI/anti-tat, pVV2/VAI et pVV2 témoin. Les techniques de transfection cellulaire utilisées dépendent du modèle cellulaire étudié.

Pour les cellules en suspension, on a utilisé préférentiellement l'électro
de type Gene Pulser(R) poration (Appareil de type Gene Pulser(R), Biorad, les chocs électriques sont produits à 200V et 960 uF).

Après transfection, les cellules transduites sont réparties dans 96 puits de culture indépendants et sélectionnées par action des antibiotiques généticine 1.5 mg/ml (plasmide pVV2) ou hygromycine 400 uglml (plasmide pHEBo). Le maintien de la pression de sélection reste nécessaire tout au long des expériences. A ce jour, en utilisant l'électroporation, la lignée CEM a été transfectée par des constructions recombinantes du plasmide pVV2/anti-rev, pVV2/anti-tat, pVV2/VAI et pVV2.

Des populations cellulaires non clonales, résistantes à la généticine, issues de puits de culture différents, sont sélectionnées sur la base d'une bonne multiplication cellulaire avec un faible taux de mortalité.

Les populations cellulaires issues de la transfection avec des plasmides "anti-sens" sont numérotées AS indice X (AS : AntiSens, X n" du puits de sélection).

Chaque population est infectée par du surnageant infectieux provenant de cellules chroniquement infectées par le virus HIV (surnageant riche en particules), la souche utilisée ne présente pas d'effet cytopathique sur les cellules utilisées (souche LAV/BRU, JC Cherman, Marseille). La cinétique de réplication virale montre que, dans les conditions habituelles, plus de 95% des CEM produisent des particules virales 7 à 8 jours après l'infection (Figure 4).

La mesure de la réplication virale est estimée par immunofluorescence indirecte. Brièvement, 5000 cellules sont fixées sur lames de verre et incubées 30 min. en présence d'un sérum anti-HIV provenant d'un patient séropositif dilué au 1/40. La révélation est effectuée grâce à l'utilisation d'un deuxième anticorps, spécifique pour les immunoglobines humaines, conjugué à lisothiocyanate de fluorescéïne (FITC).

La réplication virale peut être également mesurée par le dosage de la concentration d'antigènes HlV-l présents dans le surnageant de culture (dosage réalisé avec le kit HIVAG-I(R) de ABBOT). Les cinétiques d'infection sont réalisées de manière simultanée sur les cellules transfectées par les différents plasmides et issues de la sélection par la généticine.

La Figure 4 présente les résultats obtenus en infectant de manière comparative la lignée CEM servant de témoin positif, la lignée
CEM résistante à la généticine (CEM.gén.r.) transfectée par le pVV2), 2 populations "anti-tat" (AS1 et AS2) et 2 populations "anti-rev" (AS3 et AS4). La mesure de la réplication virale a été suivie par l'observation et le comptage du nombre de cellules positives HIV détectées par immunofluorescence indirecte à différents jours après l'infection
La superposition des courbes "CEM" et "CEM gén.r." montre que la présence de généticine dans le milieu n'affecte pas l'infection des cellules CEM par le virus HIV.Il apparaît que les 4 populations "antisens" testées présentent un retard significatif pour le démarrage de l'infection, la période d'éclipse est prolongée de 2 jours pour AS1 et jusqu'à 6 jours dans le cas de AS3. De plus, un faible pourcentage de cellules sont infectées pour certaines lignées (AS2, AS3, AS4) (25 à 60%) même tardivement après l'infection traduisant la résistance à l'infection virale d'un grand nombre de cellules au sein de ces populations non clonées. Ceci n'est pas le cas de la lignée AS1 qui présente plus de 95% de cellules positives 10 jours après le début de l'infection.

La Figure 5 présente les résultats obtenus au cours d'une expérience du même type, mais réalisée avec un pannel plus large de populations ASX et quantifiée par la mesure des antigènes HIV-1 présents dans les surnageants à différents jours après l'infection par HIV. Seuls sont présentés les résultats obtenus au jour 24 (ceux-ci étant représentatifs des résultats obtenus aux autres jours). Afin d'éviter l'accumulation des particules virales et de fausser les mesures comparatives, les surnageants sont collectés 5 heures après le changement de milieu précédent.

Les populations "VAI/anti-tat" correspondent aux conditions
ASI, AS2, AS6, AS7 et AS8, et les populations "VAI/anti-rev" aux conditions
AS3, AS4, AS9, AS10 et AS12.

I1 apparaît que la plupart des populations "antisens" présentent une diminution significative de la quantité d'antigènes HIV-1 mesurée dans les surnageants, pour 8 lignées sur 10 (AS2, AS3, AS4, AS6,
AS8, AS9, AS10 et AS12), on mesure moins de 20% de production d'antigènes viraux comparativement au contrôle, 2 populations atteignent 70% du niveau contrôle (AS1 et AS7).

Les résultats obtenus pour les populations AS1,2,3 et AS4 selon 2 techniques de mesure de la réplication virale Immunofluorescence (Figure 4) et concentrations en antigènes (Figure 5) sont concordants. Dans les Figures 4 et 5, les populations AS1, AS2, AS3 et AS4 sont identiques.

4) Mesure du taux d'expression du VA-ARNI:
I1 est possible de caractériser l'expression des ARN antisens grâce aux techniques de Northen-blot ou bien d'hybridation en milieu liquide. Les ANR sont préparés suivant le protocole suivant : 25.106 sont rincées deux fois par du tampon salin, les cellules sont lysées à 4"C par M choc hypotonique (Tris 10 mM ph 7,4, NaCI 10 m , MgC12, 3 mM) et par action de NP 40 1% ; après centrifugation (10.000 rpm, 10 minutes), le surnageant contenant les ARN cytoplasmiques est débarrassé des protéines résiduelles par 3 extractions au phénol-chloroforme et les ARN sont concentrés à l'éthanol. 10 pg d'ARN sont analysés par Northern-blot et hybridés avec une sonde monobrin spécifique de la région 3' du gène VA.

Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 8. Les résultats présentés ici illustrent le fait que in vivo les constructions testées (ici AS10, "VA/anti-reu") sont exprimées et que le produit de transcription obtenu a bien la taille attendue.

REFERENCES
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Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Vecteur d'ADN recombinant comportant une cassette de transcription par L'ART polymérase III, constituée par un gène viral transcrit par 1'ARN polymérase III dans lequel on a inséré un oligonucléotide, fragment d'ADN, entre ou à l'extérieur des boites A et B constituant ledit promoteur du gène viral.

2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène viral est un gène VA d'un adénovirus, un gène EBER d'un virus Epstein

Barr ou un gène viral transcrit par l'ADN polymérase III d'un virus Herpès.

3. Vecteur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le gène est le gène VA I ou VA II de l'Adénovirus.

4. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur réplicatif plasmidique, épisomique ou un vecteur viral.

5. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur épisomique portant l'origine de réplication du virus Epstein Barr (oriP), ainsi que les séquences codantes pour la protéine EBNA1.

6. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est inséré dans la région intermédiaire située entre les boîtes A et B.

7. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide comporte de 15 à 40 nucléotides, de préférence 15 à 25.

8. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène viral est un gène d'Adénovirus inactivé, par délétion ou mutation, en ce qui concerne l'inhibition de l'action de l'interféron.

9. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est inséré à l'intérieur de la région responsable de l'activité d'inhibition de l'action de l'interféron.

10. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est inséré au nucléotide 10711 du gène VA I de l'Adénovirus 2 représenté Figure 1.

11. Vecteur rétroviral à ARN, caractérisé en ce qu'il comporte le transcrit d'ARN de la cassette de transcription selon l'une des revendications 1 à 10.

12. Cellules infectées ou transfectées par un vecteur, selon l'une des revendications 1 à 11.

13. Procédé de production intracellulaire d'un fragment d'ARN in vitro ou in vivo dans lequel on transfecte ou infecte des cellules eucaryotes comportant de L'ART polymérase III avec un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11, comportant comme oligonucléotides un fragment d'ADN correspondant au transcrit inverse dudit ARN et en ce que l'on cultive dans un milieu de culture approprié les cellules eucaryotes ainsi transfectées ou infectées.

14. A titre de médicament, un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11 utilisable notamment comme agent antiviral, antitumoral, antibiotique ou antiparasitaire, ou dans toute pathologie où un gène est anormalement exprimé soit par mutation, soit par dérégulation.

15. A titre de médicament, selon la revendication 14, un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel l'oligonucléotide est transcrit en une molécule ARN "antisens" ou une molécule d'ARN ribozymique bloquant l'expression d'un gène impliqué dans une pathologie en s'hybridant et, le cas échéant, en coupant son ARN messager d'origine cellulaire virale, bactérienne ou parasitaire.

16. A titre de médicament selon la revendication 14 ou 15, un vecteur constitué par un vecteur viral défectif tel qu'un adénovirus ou un vecteur rétroviral défectif tel qu'un rétrovirus murin.

17. A titre de médicament pour le traitement du SIDA, selon l'une des revendictions 14 à 16, un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11, comportant à titre d'oligonucléotide une séquence antisens notamment anti-rev ou anti-tat.