FR2852021A1 - Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo - Google Patents
Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo Download PDFInfo
- Publication number
- FR2852021A1 FR2852021A1 FR0302633A FR0302633A FR2852021A1 FR 2852021 A1 FR2852021 A1 FR 2852021A1 FR 0302633 A FR0302633 A FR 0302633A FR 0302633 A FR0302633 A FR 0302633A FR 2852021 A1 FR2852021 A1 FR 2852021A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- rna
- cells
- sequence
- library
- active
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne des méthodes et compositions pour le criblage d'ARN actifs in cellule. Elle concerne notamment des procédés de préparation et de sélection d'ARN aléatoires conférant à une cellule un phénotype désiré, des banques d'ARN aléatoires et leur production, ainsi que des populations cellulaires transformées par ces banques. Elle concerne également l'utilisation des ARN actifs identifiés à des fins de recherche ou thérapeutiques, pour induire un phénotype désiré dans une cellule in vitro, ex vivo ou in vivo, notamment dans des cellules humaines.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
Méthodes et Outils pour le criblage d'ARN actifs in cellulo
Introduction La présente invention concerne des méthodes et compositions pour le criblage et la sélection d'ARN actifs in cellulo. Elle concerne notamment des procédés de préparation et de production de banques d'acides nucléiques ou de cellules codant des ARNs aléatoires, ainsi que leurs utilisations pour la sélection d'ARN actifs capables de produire ou altérer un phénotype cellulaire d'intérêt. L'invention concerne également l'utilisation des ARN actifs identifiés à des fins de diagnostic, de découverte de nouveaux gènes ( drug discovery ), de validation de la fonction de gènes, de développement d'outils pharmacologiques, ou à des fins thérapeutiques avec notamment la possibilité de corriger, grâce aux ARNs, l'expression de phénotypes pathogènes dans une cellule in vitro, ex vivo ou in vivo, particulièrement dans des cellules humaines et animales.
Introduction La présente invention concerne des méthodes et compositions pour le criblage et la sélection d'ARN actifs in cellulo. Elle concerne notamment des procédés de préparation et de production de banques d'acides nucléiques ou de cellules codant des ARNs aléatoires, ainsi que leurs utilisations pour la sélection d'ARN actifs capables de produire ou altérer un phénotype cellulaire d'intérêt. L'invention concerne également l'utilisation des ARN actifs identifiés à des fins de diagnostic, de découverte de nouveaux gènes ( drug discovery ), de validation de la fonction de gènes, de développement d'outils pharmacologiques, ou à des fins thérapeutiques avec notamment la possibilité de corriger, grâce aux ARNs, l'expression de phénotypes pathogènes dans une cellule in vitro, ex vivo ou in vivo, particulièrement dans des cellules humaines et animales.
Domaine de l'invention La possibilité d'agir ou d'interférer de manière spécifique avec des cibles biologiques peut avoir de multiples applications, notamment dans les domaines thérapeutique, diagnostique, vaccinal ou expérimental. Ainsi, la capacité de réguler l'expression d'un gène peut permettre de bloquer ou de restaurer une activité dans une cellule et/ou de corriger une pathologie. La faculté de bloquer l'expression de gènes de pathogènes peut permettre de stopper leur développement, etc.
L'expression d'un gène résulte de la superposition de plusieurs étapes comprenant la synthèse de l'ARN messager, le métabolisme intracellulaire de cet ARN, la production de la protéine et enfin la stabilité et l'activité de cette protéine. Inhiber l'expression d'un gène consiste donc à agir sur une de ces étapes. Par ailleurs, d'autres métabolites, voies de signalisation ou composants cellulaires peuvent être ciblés dans le cadre d'approches thérapeutiques, comme des sucres, lipides, nucléosides, etc. Dans cette perspective, les ARN apparaissent comme de puissants outils capables d'agir efficacement et spécifiquement sur la plupart des étapes de l'expression génique ou sur des cibles biologiques. En effet, la
<Desc/Clms Page number 2>
plasticité structurale de l'ARN génère une diversité de motifs structuraux capables de se lier avec la plupart des cibles biologiques, et notamment de molécules organiques présentes dans les cellules (ARN, ADN, protéines et divers métabolites tels que lipides, sucres, etc). Les interactions mises en jeu sont généralement très spécifiques, ce qui confère à l'ARN une forte sélectivité vis-à-vis de sa cible, et l'accumulation intracellulaire d'ARN n'est ni toxique, ni immunogène.
La possibilité de développer, sélectionner et exploiter le potentiel des ARN permettrait donc d'envisager de nombreuses approches thérapeutiques avantageuses, car sélectives et non toxiques pour l'organisme (Famulok and Verma, 2002). Différentes stratégies ont été envisagées dans l'art antérieur pour identifier ou fabriquer de tels ARNs. On peut citer notamment la technologie SELEX, destinée à fabriquer et sélectionner in vitro des ARN aléatoires (Gold, 1995). On peut également citer des approches visant à exprimer des banques d'ARN antisens ou de ribozymes dans des cellules, afin de tester leur activité biologique (W099/41371, W099/32618). Néanmoins, à ce jour, aucune approche de l'art antérieur ne permet de produire ou de sélectionner des ARN actifs in cellulo, dans des conditions optimales et dans une configuration active. Ainsi, les approches in vitro ne sont pas prédictives des propriétés des molécules in vivo, car elles ne permettent pas de présager de leur pénétration cellulaire, de leur localisation cellulaire, de leur stabilité, de leur résistance aux nucléases, et de leur activité biologique. De même, les approches décrites dans les demandes citées précédemment ne sont pas directement exploitables pour l'expression d'ARN structuraux, qui sont actifs dans des configurations particulières, ou pour l'expression efficace d'ARN actifs dans les cellules.
La présente demande permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur. La présente demande fournit maintenant de nouvelles méthodes et de nouveaux outils pour la production, l'expression et la sélection dans les cellules, notamment de mammifères, de séquences d'ARN dites actives .
<Desc/Clms Page number 3>
Résumé de l'Invention La présente invention réside notamment dans la mise au point de conditions particulières de préparation et de criblage des ARN actifs, permettant de sélectionner des composés candidats particulièrement avantageux. L'invention repose notamment sur l'utilisation de constructions particulières, permettant aux séquences ARN d'être exprimées et localisées à l'intérieur de la cellule, dans une conformation active et stable, et dans des compartiments choisis. L'invention repose également sur l'utilisation de cassettes d'expression transcrites par l'ARN polymérase III, assurant une grande efficacité d'expression dans les cellules de mammifères, et sur la construction de cassettes d'expression optimisées. L'invention décrit en outre la construction de vecteurs viraux améliorés, permettant une sélection efficace et à grande échelle des ARNs actifs, et la production de produits directement utilisables pour des applications thérapeutiques. Les motifs actifs ARN sont ainsi sélectionnés directement dans la cellule, à l'aide d'approches innovantes, et notamment selon l'approche désignée par l'appellation SECAR { Sélective Enrichment of Cellular Aptamer RNA ).
L'invention est applicable dans de nombreux domaines. L'interaction spécifique entre l'ARN actif et sa cible permet en effet de contrôler le niveau d'activité de la cible et d'agir sur de multiples mécanismes. L'invention peut ainsi être utilisée pour valider la fonction d'un gène, rechercher de nouvelles cibles impliquées dans une fonction cellulaire, trouver et produire de nouvelles molécules pour le diagnostic, la pharmacologie ou la thérapeutique, etc.
Un premier aspect de l'invention concerne donc des procédés de sélection, identification ou optimisation in cellulo d'ARN actifs. Les procédés de l'invention peuvent être adaptés pour la sélection in cellulo d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré, y compris d'ARN actifs capables d'altérer l'activité d'une cible biologique déterminée. Les procédés de l'invention comprennent, plus particulièrement :
1) la mise en contact d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III,
1) la mise en contact d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III,
<Desc/Clms Page number 4>
ou d'une partie de cette banque, avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules,
2) la sélection d'une ou plusieurs cellules possédant le phénotype désiré, et 3) l'identification de la ou des cassette (s) dans la ou lesdites cellules, ou de (s) l'ARN (s) actif (s) qu'elles expriment.
2) la sélection d'une ou plusieurs cellules possédant le phénotype désiré, et 3) l'identification de la ou des cassette (s) dans la ou lesdites cellules, ou de (s) l'ARN (s) actif (s) qu'elles expriment.
Comme il sera décrit en détails dans la suite du texte, les étapes 1) à 3) peuvent être répétées une ou plusieurs fois à partir des cassettes ou ARN actifs identifiés à l'étape 3), afin d'améliorer, au fur et à mesure des cycles, la sélection et/ou la qualité des ARNs actifs, et/ou d'adapter ou de moduler leurs propriétés.
Par ailleurs, selon l'application envisagée, la banque d'acides nucléiques de départ peut être plus ou moins complexe et plus ou moins contrainte. Ainsi, il peut s'agir d'une banque aléatoire non contrainte, ou d'une banque produite à partie de la séquence d'une gène cible donné ou comprenant des motifs ou des résidus imposés, selon le profil des ARNs actifs recherchés.
D'autre part, à l'issue de l'étape 3) du dernier cycle réalisé (ou éventuellement d'un ou plusieurs ou de tout cycle intermédiaire), une étape supplémentaire 4) peut être mise en #uvre, afin de confirmer l'activité biologique du ou des ARN actifs sélectionnés.
Un autre aspect de l'invention réside dans des banques d'acides nucléiques aléatoires et/ou actifs, éventuellement contenus dans des cassettes et/ou vecteurs. Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne une banque d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de virus recombinants, chaque espèce de virus comprenant une cassette d'expression exprimant un ARN aléatoire (et/ou actif) distinct sous contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III. L'ARN peut être un ARN structural aléatoire ou de séquence définie. De préférence, la cassette est dérivée d'un gène VA d'un adénovirus. De préférence, les virus sont des rétrovirus recombinants.
Un autre objet de l'invention réside dans des cassettes d'expression d'ARN actifs, comprenant une séquence codant ledit ARN sous contrôle d'un promoteur transcrit par
<Desc/Clms Page number 5>
l'ARN polymérase III, de préférence insérée dans un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, ledit promoteur pouvant comprendre en outre une séquence conférant un caractère inductible et/ou une modification qui permet de retenir l'ARN dans le noyau.
L'invention concerne également tout vecteur comprenant une telle cassette d'expression, ainsi que des cellules recombinantes les contenant.
L'invention a encore pour objet toute composition comprenant un ARN actif, une cassette, un vecteur ou une cellule tels que définis ci-avant et/ou identifiés ou produits par le procédé de sélection décrit dans l'invention.
L'invention a encore pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un ARN actif, une cassette, un vecteur ou une cellule tels que définis ci-avant, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un ARN actif, ledit ARN actif comprenant une séquence active insérée dans un ARN VA modifié, ledit ARN VA modifié comprenant un motif ARN assurant sa localisation dans le noyau de la cellule et/ou une séquence conférant un caractère inductible.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence ARN active ou le motif actif identifié au sein de l'ARN actif. Ce motif actif ARN isolé peut en outre être ultérieurement modifié chimiquement par exemple de façon à améliorer sa stabilité en solution.
L'invention concerne également des outils, constructions, lignées, etc., utiles pour la production des compositions définies ci-dessus, notamment des gènes VA modifiés, des gènes tRNA modifiés, des cassettes U6 modifiées, des vecteurs ou cellules les comprenant, et leurs utilisations.
L'invention concerne encore des procédés de production de compositions pharmaceutiques, comprenant (i) le criblage d'une banque d'ARN aléatoires comme décrit ci-avant,
<Desc/Clms Page number 6>
permettant d'obtenir une cassette d'expression d'un ARN actif et (ii) le conditionnement de la cassette ou de la séquence ARN active dans tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention est utile pour l'identification, la production, l'expression et/ou la sélection de tout ARN actif sur des cellules, notamment de mammifères. Elle permet la préparation de composés actifs dans différentes situations, notamment pour la production d'agents thérapeutiques, en particulier anti-infectieux , anti-cancéreux, agissant sur le métabolisme de la cellule, agissant sur les processus de différenciation de la cellule, sur la capacité de croissance de la cellule, etc.
Légende des Figures La figure 1 décrit le gène VA1 de l'adénovirus de type 2 ainsi que son produit de transcription.
La figure 1A représente les séquences nucléotidiques du gène VA1-RNA (région transcrite) (SEQ ID NO : 1). Les nucléotides notés en gras, de 13 à 24 et de 59 à 68, représentant respectivement la boite A et la boite B, sont les éléments nécessaires à la transcription du gène VA1 par l'ARN polymérase de type III. Les nucléotides 157 à 160 (TTTT), notés en gras, représentent le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III. Les nucléotides 93 à 118 soulignés, correspondant à la séquence de la boucle IV, sont délétés dans la construction VAAIV (SEQ ID NO : 2).
La figure 1B représente la structure secondaire de l'ARN VA1 de l'Adénovirus de type 2, obtenue d'après le logiciel Mac DNASIS Pro V3. 6. La partie délétée dans l'ARN VAAIV est indiquée par deux flèches (nucléotides 93 à 118). Le nucléotide 120 est muté dans la construction VAAIV (C est muté en T).
La figure 2 représente l'étude comparative de la production et de la localisation cellulaire des ARN VA1, VAAIVSrf et VATAR*.
Figure 2A : Séquence TAR* (SEQ ID NO : 23) insérée dans le site de restriction Srfl du gène VAAIVSrf pour générer le gène VATAR*. L'oligonucléotide TAR* est dérivé
<Desc/Clms Page number 7>
de la séquence TAR du Virus de l'Immunodéficience Humaine (HIV-1) (Yamamoto et al., 2000).
Figure 2B : des ARN VA 1, VAAIVSrf et VATAR* par Northern Blot. Les différents ARN sont extraits de cellules 293,48h après transfection par des plasmides contenant les gènes VA 1, VAAIVSrf et VATAR*.
Figure 2C : Etude de la localisation cellulaire des ARN VA1, VAAIVSrf et VATAR*. Les ARN sont visualisés par hybridation in situ, 48h après transfection des cellules 293 par des plasmides contenant les gènes VA1, VAAIVSrf et VATAR*.
La figure 3 représente le promoteur du gène U6 snRNA humain (Genebank access : X07425) . Les éléments requis pour le recrutement et l'activité de l'ARN polymérase de type III sont le DSE (Distal Séquence Elément : nucléotides-221 à-216 ), le PSE (Proximal Séquence Elément : nucléotides-64 à-46) et la boite TATA (TATA Box : nucléotides-31 à -24). Au niveau du site +1 de transcription se trouve le site de restriction Sal I (GTCGAC), le premier nucléotide transcrit étant le premier nucléotide de ce site (G).
La figure 4 représente la structure secondaire de l'ARN VAAIV obtenue avec le logiciel Mac DNASIS Pro V3.6.
La figure 5 représente la structure secondaire de l'ARN VAAIVSrf obtenue avec le logiciel Mac DNASIS Pro V3.6.
La figure 6 décrit les caractéristiques de l'ARN nVAAIVSrf.
Figure 6A : Séquence du gène codant l'ARN nVAAIVSrf (SEQ ID NO : 4). Les nucléotides notés en gras, de 13 à 24 et de 59 à 68, représentant respectivement la boite A et la boite B, sont les éléments nécessaires à la transcription du gène VA1 par l'ARN polymérase de type III. Les nucléotides 138 à 141 (TTTT), notés en gras, représentent le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III. Le site de restriction Srf 1 (93 à 100) apparaît souligné. Les nucléotides 120,121 et 122 écrits en minuscule représentent les mutations introduites dans l'ARN VAAIVSrf pour altérer l'hélice terminale et conférer à cet ARN une localisation nucléaire.
<Desc/Clms Page number 8>
Figure 6B : de la structure secondaire de l'ARN nVAIVSrf obtenue avec le logiciel DNASIS Pro V3.6 Figure 6C : de la localisation cellulaire des ARN nVAAIVSrf. Les ARN sont visualisés par hybridation in situ, 48h après transfection des cellules 293 par un plasmide contenant le gène VAAIVSrf.
La figure 7 décrit les séquences des différents gènes VA inductibles (VAi) et les séquences des différents oligonucléotides ADN qui ont été utilisés pour leur construction.
Figure 7A : Séquences des gènes VAiO (SEQ ID NO : 15), OVAi (SEQ ID NO : 16) et OVAiO (SEQ ID NO : 17). La numérotation des séquences s'effectue à partir du point +1 de transcription ; les séquences situées en amont sont numérotées négativement. Les séquences des Boites A et B, ainsi que le signal d'arrêt de transcription, sont notées en gras.
La séquence opératrice TetOl est soulignée ; le site de clonage Srfl est noté en italique.
Figure 7B : des oligonucléotides ayant servi à la construction des gènes VAi par réaction d'élongation d'amorce ou par réaction de polymérisation en chaîne. Les séquences des Boites A et B ainsi que le signal d'arrêt de transcription sont notées en gras.
Les séquences opératrices TetOl sont soulignées ; les sites de clonage Srfl et Pvull sont notés en italique. Les régions complémentaires entre les oligonucléotides VAi up (SEQ ID NO : 18) et VAi down (SEQ ID NO : 19) apparaissent en lettres minuscules. Les zones d'hybridation des oligonucléotides VAi Pvull (VAi Pvull 5' (SEQ ID NO : 20), VAi Pvull 3' (SEQ ID NO : 22) ou OVAi Pvull 5' (SEQ ID NO : 21)) avec les régions codantes des gènes VAi sont également représentées en minuscule.
La figure 8 représente la structure secondaire de l'ARN VAiO obtenue avec le logiciel Mac DNASIS Pro V3. 6. La région correspondant à la séquence tetOl est limitée par des flèches.
La figure 9 représente la structure secondaire des ARN h9U6, h20U6 et nh20U6 obtenue avec le programme Mac DNASIS Pro V3. 6. Les ARN schématisés sur cette figure représentent les structures de base invariantes de ces ARN (partie navette). Le motif actif de l'ARN est cloné dans le site Sfr 1 indiqué par une flèche.
<Desc/Clms Page number 9>
La figure 10 représente le vecteur rétroviral pBabe (Morgenstern et Land, 1990). Le site Nhe 1 correspond au site de clonage des différentes cassettes d'expression des ARN actifs.
La figure 11 montre la relation qui peut exister entre le niveau d'expression d'un ARN aptamère et son activité biologique. A titre d'exemple, l'aptamère utilisé ici est l'aptamère TAR* décrit dans la figure 2B. Ce motif TAR* correspond à un motif ARN capable de réprimer la réplication du virus de l'immunodéficience humaine (HIV). Ce motif TAR* a été cloné dans le site Sfr 1 de la cassette VAAIVSfr. La construction VATAR* a été insérée dans le site de clonage Nhel du vecteur rétroviral pBabe (voir figure 10). Les cellules de la lignée d'encapsidation 293GP ont été utilisées pour la production des retrovirus recombinants Babe et Babe/VATAR*.
L'efficacité anti-HIV de VATAR* a été mesurée en utilisant les cellules P4 qui constituent un système couramment utilisé pour étudier la multiplication du HIV (Chameau et al., 1994). Les cellules P4 ont été transduites par les rétrovirus Babe et Babe/VATAR* et sélectionnées par l'ajout de puromycine. Le niveau d'expression de l'ARN VATAR* a été analysé par Northern-blot au sein de la population totale de cellules P4 sélectionnée (population parentale), ainsi que dans 2 clones cellulaires indépendants (clones 1 et 4) isolés à partir de cette population. L'infection de ces différents systèmes cellulaires par le HIV-1 démontre que le clone 1 exprimant un important niveau d'ARN VATAR* résiste plus efficacement à la multiplication du HIV. Le taux d'infection par le HIV-1est estimé grâce à la mesure de l'activité du gène rapporteur B-galactosidase contenue dans les cellules P4 et les résultats sont présentés en pourcentage.
Description Détaillée de l'Invention L'invention concerne, de manière générale, des outils et procédés de sélection in cellulo d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré, ainsi que l'utilisation de ces ARNs actifs ou de tout ADN codant dans le domaine expérimental ou pharmaceutique, par exemple.
<Desc/Clms Page number 10>
ARN actifs La présente invention est adaptée à la production, l'expression et/ou la sélection de toute molécule d'ARN active, c'est-à-dire de molécules d'ARN capables d'interagir avec et/ou d'altérer l'activité de composants biologiques, et/ou de conférer à une cellule un phénotype donné.
Le terme ARN actif inclut notamment des ARN structuraux (tels que les aptamères) et des ARNs non-structuraux, tels que des antisens, des ribozymes ou des ARN interférants. Les ARNs actifs peuvent être de longueur variable, comprise typiquement entre 8 en 250 bases, plus préférentiellement entre 8 et 200, notamment entre 8 et 150. Les ARNs actifs sont généralement synthétisés sous forme de molécules simple-brin, même s'ils peuvent ultérieurement adopter des structures tri-dimensionnelles de type boucle, régions doublebrins, hélices, etc.
Dans un mode spécifique et préféré de l'invention, l'ARN actif est un ARN structural, notamment un aptamère (Famulok and Verma, 2002) (Hermann and Patel, 2000). Les aptamères sont des oligonucléotides capables de lier spécifiquement une molécule cible.
Dans un autre mode spécifique de l'invention, l'ARN actif est un ARN interférant (McManus and Sharp, 2002) (Scherr et al., 2003) (Famulok and Verma, 2002) ou un ARN antisens.
Les procédés décrits dans la présente demande permettent de sélectionner des ARN actifs à partir de collections ou banques de séquences aléatoires, générales ou restreintes, pouvant comprendre un très grand nombre de séquences aléatoires distinctes. Comme il sera décrit plus en détails dans la suite du texte, les séquences aléatoires peuvent être toute molécule d'ADN ou d'ARN comprenant au moins un élément de séquence non connu, plus précisément dont une partie au moins de la séquence est aléatoire. La sélection des ARNs actifs selon l'invention est réalisée non pas in vitro, mais in cellulo, grâce à l'insertion des séquences aléatoires dans des cassettes d'expression et dans des conditions particulières. Un des avantages principaux de la sélection in cellulo est que la cible de l'ARN actif n'est pas
<Desc/Clms Page number 11>
forcément choisie à priori ; de plus l'ARN actif sélectionné est réellement efficace dans les conditions d'utilisation cellulaire.
Promoteur Polymérase III Comme indiqué ci-avant, une caractéristique de l'invention réside dans l'utilisation de cassettes d'expression particulières, permettant la production in cellulo d'ARN actifs, dans des configurations optimales.
En particulier, les constructions, compositions et méthodes de l'invention utilisent un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III. La transcription par l'ARN polymérase III assure un fort niveau de transcription dans la plupart des systèmes eucaryotes. En effet, cet enzyme est responsable de la synthèse de nombreux petits ARN cellulaires qui s'accumulent d'une manière abondante dans tous les types cellulaires (ARN de transfert (ARNt), ARN ribosomique 5S, certains petits ARN nucléaires comme le snRNA U6, etc. ). En outre, la régulation de l'expression des gènes transcrits par la pol III est dépendante du cycle cellulaire, avec une activité fortement accrue au cours des phases S et Gl (Paule and White, 2000). L'utilisation de ce type de promoteur assure donc une grande efficacité d'expression in cellulo, augmentant les capacités de sélection et l'effet biologique, dans le cadre des applications thérapeutiques.
Dans une première variante préférée, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur localisé à l'intérieur des séquences transcrites (intragénique). Des exemples de tels promoteurs sont notamment les promoteurs du type VA d'un adénovirus ou tRNA.
Dans une autre variante préférée, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur localisé en amont des séquences transcrites (extragénique). Des exemples de tels promoteurs sont notamment les promoteurs du type U6.
En outre, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III peut être rendu inductible.
<Desc/Clms Page number 12>
Selon un premier mode de réalisation particulièrement préféré, le promoteur utilisé est dérivé d'un gène VA d'adénovirus.
Le génome des adénovirus contient deux petits gènes qui sont transcrits par l'ARN polymérase III, les gènes VA1 et VA2 (Mathews and Shenk, 1991). L'ARN VA 1, et à un moindre degré l'ARN VA2, sont abondamment produits pendant le cycle de réplication de l'adénovirus. L'interaction entre l'ARN VA1 et une kinase cellulaire (PKR ou p68 kinase) bloque l'effet antiviral induit par les interférons et facilite la production de nouveaux virus (Mathews and Shenk, 1991).
Le gène VA1 des adénovirus code pour un ARN court (ARN VA1 160nt) caractérisé par une structure secondaire riche en région double brin. L'organisation génétique de ce gène transcrit par l'ARN polymérase III est simple et comprend une courte région promoteur en position intragénique (boite A et boite B) et un signal d'arrêt de transcription (voir figure lA). La structure secondaire de l'ARN VA1est bien connue (figure 1B). La séquence du gène VA1de l'adénovirus de type 2 est représentée sur la figure lA (SEQ ID NO :1). La séquence de 1"ARN codé correspondant est donnés ci-dessous.
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUCCAUGCGG UUACCGCCCG CGUGUCGAAC
CCAGGUGUGC GACGUCAGAC AACGGGGGAG CGCUCCUUUU-160 Les boîtes A et B correspondent aux nucléotides 11-24 et 59-68 en gras, respectivement, et le domaine central contenant la boucle IV correspond aux nucléotides 93 à 118.
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUCCAUGCGG UUACCGCCCG CGUGUCGAAC
CCAGGUGUGC GACGUCAGAC AACGGGGGAG CGCUCCUUUU-160 Les boîtes A et B correspondent aux nucléotides 11-24 et 59-68 en gras, respectivement, et le domaine central contenant la boucle IV correspond aux nucléotides 93 à 118.
Plusieurs travaux, dont ceux des inventeurs, ont démontré l'utilité du gène VA1 pour exprimer dans la cellule des ribozymes, des aptamères ou des antisens, dont la séquence était parfaitement définie (Medina and Joshi, 1999) (Barcellini et al., 1998) (Bertrand et al., 1999) (Cagnon et al., 1995) (Gwizdek et al., 2001).
<Desc/Clms Page number 13>
La présente demande démontre pour la première fois la possibilité et l'efficacité d'utiliser ce type de construction pour la production et le criblage de banques d'ARNs aléatoires (ou de banques contraintes) in cellulo. Elle décrit également différentes modifications dans le gène VA afin de générer des séquences modifiées contenant des délétions et/ou de nouveaux sites de restriction, qui améliorent l'utilisation de ce gène en tant que cassette d'expression. Les séquences codant pour les ARN actifs peuvent ainsi être clonées dans la cassette, principalement dans le domaine central du gène. Le positionnement de la séquence active au sein du domaine central ne modifie pas le niveau de production, et la localisation de l'ARN chimérique dans la cellule (figure 2). L'utilisation d'un tel promoteur est particulièrement avantageuse pour l'expression d'ARN actifs structuraux, notamment d'aptamères.
Dans un premier mode de réalisation particulier de l'invention, la cassette comprend la séquence d'un gène VA1 d'adénovirus délété de tout ou une partie fonctionnelle de la boucle IV, dans laquelle la séquence codant l'ARN actif est insérée. Comme indiqué cidessus, le domaine central contenant la boucle IV correspond aux nucléotides 93 à 118du gène VA. La séquence d'ARNs transcrits par des cassettes d'expression selon l'invention comprenant la séquence d'un gène VA délété de la boucle IV est fournie ci-après : SEQ ID NO : 2 (VAAIV):
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUAUCCAGGU GUGCGACGUC AGACAACGGG
GGAGCGCUCC UUUU-134 La séquence SEQ ID NO : 2 (VAAIV) est dérivée de VA1Ad2 par délétion du domaine central de 93 à 118. Le nucléotide 94 (120 dans VA 1 ) a été muté de façon à créer un site de clonage EcoRV (en italique souligné). Le site de coupure EcoRV se situe entre 92 et 93.
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUAUCCAGGU GUGCGACGUC AGACAACGGG
GGAGCGCUCC UUUU-134 La séquence SEQ ID NO : 2 (VAAIV) est dérivée de VA1Ad2 par délétion du domaine central de 93 à 118. Le nucléotide 94 (120 dans VA 1 ) a été muté de façon à créer un site de clonage EcoRV (en italique souligné). Le site de coupure EcoRV se situe entre 92 et 93.
SEQ ID NO : 3 (VA#IVSrf)
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUGCCCGGGC AUCCAGGUGU GCGACGUCAG
ACAACGGGGG AGCGCUCCUU UU-142 (SEQ ID NO : 3)
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUGCCCGGGC AUCCAGGUGU GCGACGUCAG
ACAACGGGGG AGCGCUCCUU UU-142 (SEQ ID NO : 3)
<Desc/Clms Page number 14>
La séquence SEQ ID NO : 3 (VAAIVSrf), ci-dessus, est dérivée de VAAIV après insertion de la séquence du site Srfl dans le site EcoRV (en italique souligné). Le site de la coupure Srfl se situe entre 96 et 97.
Dans un autre mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec le précédent, la double-hélice terminale du gène VA est altérée. Cette altération permet de contrôler la localisation cellulaire de l'ARN synthétisé (Gwizdek et al., 2001). Ainsi, lorsque l'hélice terminale du gène VA1 est intacte, l'ARN synthétisé se trouve essentiellement dans le cytoplasme. Cette localisation est adaptée pour cribler des ARN actifs sur des cibles biologiques présentes essentiellement dans ce compartiment cellulaire. De manière alternative, lorsque l'hélice terminale du gène VA1 est altérée, l'ARN synthétisé se trouve essentiellement localisé dans le noyau. Cette localisation est adaptée pour cribler des ARN actifs sur des cibles biologiques essentiellement nucléaires. L'hélice terminale est formée essentiellement par l'appariement entre les 20 premiers et les 20 derniers nucléotides de la séquence de l'ARN codé par le gène VA1. L'altération de l'hélice peut être obtenue par différentes modifications introduites au sein de ces éléments de séquence, notamment par mutation, délétion et/ou insertion, de préférence par mutation. Lorsque la séquence de l'hélice est inférieure à environ 15 bases, l'hélice est altérée fonctionnellement et l'ARN VAest retenu dans le noyau. Egalement, lorsque la double hélice est mutée de manière à introduire une succession de nucléotides non appariés qui forment une ouverture au sein de l'hélice (bulle), cette dernière est altérée fonctionnellement et l'ARN est retenu dans le noyau.
La séquence d'un ARN transcrit par une cassette d'expression selon l'invention comprenant la séquence d'un gène VA délété de la boucle IV et une double-hélice terminale altérée est fournie ci-après (SEQ ID NO : 4) :
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUGCCCGGGC AUCCAGGUGU GCGACGUCAa uaAACGGGGG AGCGCCCUUU U-141
1- GGGCACUCUU CCGUGGUCUG GUGGAUAAAU UCGCAAGGGU
AUCAUGGCGG ACGACCGGGG UUCGAACCCC GGAUCCGGCC
GUCCGCCGUG AUGCCCGGGC AUCCAGGUGU GCGACGUCAa uaAACGGGGG AGCGCCCUUU U-141
<Desc/Clms Page number 15>
La séquence SEQ ID NO : 4 (nVAAIVSrf) est dérivée de VAAIVSrf par mutation des nucléotides 120 à 122 (minuscules) et délétion du nucléotide 136.
Dans un autre mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec l'un ou les précédents, le gène VA1 comprend une séquence conférant un caractère inductible. Quelle que soit l'utilisation faite de l'ARN actif (antisens, ribozyme ou aptamère) exprimé au sein d'une cellule, le contrôle de son expression est un élément déterminant. Dans cet objectif, les inventeurs ont modifié le gène VA de manière à rendre son expression inductible, conservant par ailleurs les caractéristiques décrites précédemment (niveau d'expression élevé, contrôle de localisation, possibilité d'insertion de séquences actives dans le domaine central).
Plus particulièrement, un gène VA inductible peut être construit par insertion d'une ou plusieurs séquences conférant un caractère inductible, typiquement entre les boîtes A et B du gène et/ou en amont du gène, de préférence en remplacement de tout ou partie des séquences normalement présentes. Dans le cas où la séquence est insérée entre les boite A et B, cette nouvelle séquence se retrouve dans une région de l'ARN VA1qui est transcrite, et provoque donc des altérations de la structure secondaire native de l'ARN VA1 susceptibles de le rendre moins stable. Afin de corriger ces altérations, des mutations compensatrices peuvent être introduites au sein de la séquence VA1, de manière à corriger ces défauts de structure et à recréer ainsi les appariements naturels de l'ARN VA 1. Ces cassettes optimisées permettent de contrôler l'expression des ARN actifs dans les cellules, et d'améliorer les conditions d'un criblage, ou de l'utilisation en recherche ou en thérapeutique.
Dans un mode particulier, l'invention concerne donc un acide nucléique comprenant la séquence d'un gène VA d'un adénovirus, modifié par insertion d'une ou plusieurs séquences conférant un caractère inductible, de préférence entre les boîtes A et B et/ou en amont du gène, plus préférentiellement en remplacement de tout ou partie des séquences natives.
La séquence conférant un caractère inductible peut être toute séquence conférant une sensibilité à un facteur agissant en trans. Il peut s'agir de préférence d'un site de liaison d'un
<Desc/Clms Page number 16>
facteur transcriptionnel ou d'un répresseur, ou de tout autre agent ou molécule. Dans un mode de réalisation préféré, il s'agit d'une ou plusieurs séquences opératrices d'un promoteur bactérien régulé, par exemple du promoteur de la tétracycline.
Le promoteur des gènes bactériens tet contient deux types de séquences opératrices 01 et 02 qui servent de site de fixation pour le répresseur TetR (Hillen et Berens, 1994). Chacun des sites tetOl et tet02 lie un homodimère de TetR. Des études ont montré que le site de fixation tet02 avait une affinité pour l'homodimère TetR trois à cinq fois plus importante que tetO1(Hillen et Berens, 1994). Les séquences opératrices tetO1ont ainsi été insérées à l'intérieur de séquences promotrices hétérologues eucaryotes afin d'obtenir un système d'expression eucaryote régulable par la tétracycline (Gossen and Bujard, 1992). Cependant, une telle modification ou application n'a jamais été envisagée à partir du gène VA1 des adénovirus, dont la manipulation est particulièrement délicate compte tenu de la présence du promoteur dans les séquences transcrites.
Dans le système d'expression d'ARN à partir de cassettes d'expression pol III décrit ciaprès, nous avons inséré une ou deux séquences tetOl en amont du gène VA1 afin de rendre son expression inductible par ajout de tétracycline. Ainsi, les séquences situées entre les Boite A et B ou placées en amont du premier nucléotide transcrit du gène VA1 ont été remplacées par une séquences tetOl. En absence de tétracycline, l'expression du gène VA1 modifié peut ainsi être réprimée par la liaison des homodimères de TetR sur les séquences cis-régulatrices. L'ajout de tétracycline permet de libérer le répresseur de sa fixation sur les séquence tetO, et au gène VA1d'être normalement exprimé.
Dans un mode particulier, l'invention concerne donc un acide nucléique comprenant la séquence du gène VA1d'un adénovirus, modifié par insertion d'une ou plusieurs séquences opératrices servant de site de fixation pour le répresseur TetR. De préférence, la ou les séquences opératrices sont insérées entre les boîtes A et B de la séquence du gène VA et/ou placées en amont du gène, plus préférentiellement en remplacement de tout ou partie des séquences natives. L'invention concerne également toute cassette d'expression comprenant
<Desc/Clms Page number 17>
une séquence codant un ARN actif insérée sous contrôle d'un promoteur VA inductible, (VAi) notamment par la tétracycline.
Des cassettes spécifiques dérivées de la séquence de gènes VA et permettant l'expression d'ARN aléatoires ou actifs sont décrites dans les exemples, qui représentent des objets particuliers de l'invention. On peut ainsi citer les cassettes VAAIVSrf, nVAAIVSrf, VAi et nVAi.
Comme indiqué précédemment, dans un autre mode particulier de l'invention, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur U6 ou dérivé du promoteur humain U6 codant le petit ARN nucléaire U6 (snRNAU6). L'utilisation d'un tel promoteur est particulièrement avantageuse pour l'expression d'ARN actifs non-structuraux, de type antisens, ribozymes ou ARNi. Des constructions particulières dérivées de ce promoteur, décrites dans la présente demande, permettent également l'expression d'ARN structuraux.
La transcription du gène U6 humain (hU6) génère un petit ARN nucléaire (ARN snU6) intégré dans un complexe ribo-nucléoprotéique responsable de l'épissage des ARN (Gmeiner, 2002). Le promoteur hU6 est placé en amont de la séquence transcrite, et les séquences correspondant à ce promoteur ne sont donc pas produites dans la cellule. Cela a pour avantage principal de n'imposer que peu de contraintes de séquence dans la région transcrite de la cassette (Bertrand et al., 1997). En effet, le deuxième nucléotide transcrit correspond au premier nucléotide apporté par la séquence exogène et les derniers nucléotides correspondent au signal stop (figure 3). Il est donc possible, grâce à ce type de cassette, de produire dans la cellule des ARN artificiels (antisens, ribozymes, aptamères) dont on contrôle la quasi-totalité de la séquence transcrite.
Afin de contrôler la stabilité des ARN générés ainsi que leur localisation cellulaire, différentes cassettes d'expression utilisant un promoteur U6 ont été construites par les inventeurs. Ces cassettes permettent l'expression d'ARN cytoplasmiques ou nucléaires, structuraux ou non structuraux, contraints ou non-contraints. Des modifications ont ainsi été apportées au promoteur U6, dans le but de faciliter le clonage des séquences actives, de
<Desc/Clms Page number 18>
maîtriser les séquences transcrites dès le point +1 de transcription, de stabiliser les séquences actives et de maîtriser la localisation intracellulaire de ces séquences.
Dans un premier mode de réalisation, une séquence servant de base structurale pour l'ARN actif est placée en aval du promoteur U6. Cette séquence de structuration contient plus préférentiellement une séquence capable de générer une (courte) hélice ARN (plus ou moins stable et plus ou moins longue), et/ou un site de clonage bord franc et/ou un signal d'arrêt de transcription (par exemple TTTTT). La séquence permettant la formation d'une hélice ARN comprend typiquement deux régions complémentaire espacées par une région charnière. Ce type de cassette est surtout utile pour l'expression intracellulaire de motifs d'ARN structuraux. Lorsque le motif actif est lui-même structuré sous la forme d'une hélice, la séquence de structuration comprend de préférence un motif navette court (typiquement de 5 à 12 bases). Lorsque le motif actif n'est pas structuré en hélice ou très court, la séquence de structuration comprend de préférence un motif navette long, comprenant typiquement de 12 à 20 bases. Ce motif peut être structuré pour former une hélice parfaite assurant à l'ARN produit une localisation cytoplasmique ou bien être structuré pour former une hélice perturbée afin d'obtenir une localisation nucléaire de l'ARN généré.
Dans un autre mode de réalisation, qui peut être combiné au précédent, une séquence formant une courte structure en épingle à cheveux est placée en aval du promoteur U6 (et, le cas échéant, de la séquence de structuration). Cette séquence forme une structure ARN stable placée à l'extrémité 3' de l'ARN actif ou aléatoire synthétisé, protégeant ainsi l'ARN produit de la dégradation par des RNAses. En aval de cette structure de stabilisation se trouve le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III : TTTTT.
Dans un mode de réalisation alternatif, la cassette comprend le promoteur U6 auquel est directement liée la séquence codant l'ARN actif. Une telle cassette permet d'exprimer des ARN dont la séquence est choisie dès le point +1 de transcription.
Selon un mode particulier, la cassette comprend un promoteur U6 tel que défini ci-dessus et une ou plusieurs séquences conférant un caractère inductible, comme décrites
<Desc/Clms Page number 19>
précédemment. La ou les séquences conférant le caractère inductible peuvent être placées par exemple en amont de la séquence du promoteur.
Des cassette spécifiques dérivées du promoteur U6 et permettant l'expression d'ARN aléatoires ou actifs sont décrites dans les exemples, qui représentent des objets particuliers de l'invention. On peut ainsi citer les cassettes U6hélices, U6Srf, U6Tt, etc.
Dans d'autres modes de mise en #uvre particuliers, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est issu d'un promoteur des gènes ARNt. En outre, ces promoteurs peuvent être modifiés pour leur conférer un caractère inductible.
Vecteurs Les cassettes d'expression selon l'invention sont typiquement clonées ou comprises dans des vecteurs, de clonage et/ou d'expression. De tels vecteurs peuvent être de nature et/ou d'origine variée, comme des plasmides, virus recombinants, vecteurs viraux, épisomes, chromosomes artificiels, phages, etc. De préférence, les vecteurs sont de type plasmide, viral ou épisomiques.
Ainsi, un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie précédemment.
Lorsque le vecteur est de type plasmide, il peut être issu de différents plasmides connus ou commerciaux. Il comporte typiquement une origine de réplication compatible avec l'utilisation désirée. Il peut comprendre en outre un gène de sélection et, éventuellement, une séquence d'intégration dans le chromosome. Des exemples de plasmides utilisables pour la production de vecteurs de l'invention sont notamment les plasmides pUC, pcDNA, pVV2, plasmides à réplication épisomique dérivés du virus Epstein-Bar du type OriP.
Dans un mode de mise en #uvre préféré, le vecteur est de type viral. Il peut s'agir d'un virus recombinant, c'est-à-dire d'une particule virale recombinante comprenant un génome viral
<Desc/Clms Page number 20>
recombinant dans lequel est insérée au moins une cassette telle que définie précédemment. Il peut également s'agir d'un vecteur viral, c'est-à-dire d'une construction génétique comprenant un génome viral recombinant dans lequel est insérée au moins une cassette telle que définie précédemment.
La présente demande montre maintenant que le transfert d'une cassette poIIII de l'invention dans des cellules cibles est très efficace après clonage de cette cassette dans un vecteur rétroviral. La présente demande concerne donc en particulier l'utilisation de ce type de vecteur pour transduire efficacement les cassettes dérivées des gènes VA ou U6 dans les cellules cibles. En particulier, après intégration du vecteur rétroviral contenant la cassette dans le génome de ces cellules, le niveau d'expression de l'ARN chimérique est important.
Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un vecteur rétroviral ou un rétrovirus recombinant.
Les virus ont été utilisés pour vectoriser des acides nucléiques in vitro ou in vivo.
Différentes approches ont été décrites pour la production de virus recombinants, conduisant typiquement à la production de virus défectifs pour la réplication, comprenant un segment d'acide nucléique exogène codant une produit désiré. De tels virus ont été construits à partir de rétrovirus (MLV, lentivirus, etc. ), d'adénovirus (Ad5, Ad2, CAV, etc. ), d'AAV, de virus de l'herpès, etc. Dans chacune de ces approches, un vecteur viral est construit comprenant les séquences nécessaires en cis à l'encapsidation d'un acide nucléique dans une particule virale et, éventuellement, des séquences régulatrices ou codantes complémentaires.
Dans le cas des rétrovirus, de nombreuses constructions ont été décrites, dans lesquelles tout ou partie des gènes gag, pol et/ou env sont délétées, et dans lesquelles un acide nucléique d'intérêt est introduit. Ce dernier peut être inséré en remplacement des séquences délétées, ou dans d'autres régions, comme par exemple dans un LTR. Des vecteurs viraux connus de l'homme du métier sont notamment MFG, pBABE, etc. Typiquement, un vecteur rétroviral de l'invention comprend donc les régions terminales LTR, la séquence d'encapsidation, un gène de sélection et l'acide nucléique codant l'ARN actif, selon l'invention. Un tel vecteur
<Desc/Clms Page number 21>
viral peut être construit à partir de différents types de rétrovirus, et utilisé pour produire des virus recombinants par introduction dans une lignée d'encapsidation exprimant les protéines virales GAG, POL et ENV. De telles lignées ont été décrites dans l'art antérieur (PsiCRIP, PAS 17, Gpenv, 293GP etc.).
Des constructions similaires ont été rapportées à partir de virus distincts, tels les adénovirus ou les AAV par exemple. Dans le cas des adénovirus, les régions El, E4, E3 et/ou E2 sont typiquement délétées et remplacées par une séquence exogène. Des lignées d'encapsidation connues sont par exemple les cellules 293 ou pER. C6. Pour les AAV, les régions virales délétées sont les régions REP et CAP.
Un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur rétroviral défectif pour la réplication, comprenant une séquence LTR, une séquence d'encapsidation rétrovirale et au moins une cassette d'expression telle que définie précédemment.
Les vecteurs de l'invention peuvent comprendre une ou plusieurs cassettes d'expression d'ARNs, identiques ou différentes. Ainsi, des vecteurs multi-cassettes peuvent être construits, dans lesquels des cassettes peuvent être insérées par exemple en tandem. La possibilité de cloner plusieurs cassettes dans un même vecteur peut concerner une seule séquence ARN active, ou plusieurs séquences d'ARN actifs différents. Dans le premier cas, la même cassette est recopiée plusieurs fois avant d'être insérée dans le vecteur ; dans le deuxième cas, les différentes cassettes sont placées les unes à coté des autres et insérées dans le vecteur, ou clonées séquentiellement, en des sites distincts du vecteur.
Les vecteurs peuvent être construits par des techniques connues de biologie moléculaire, notamment par clonage, ligation, amplification, etc.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un vecteur tel que défini précédemment. La composition peut être une composition pharmaceutique, comme il sera décrit plus en détail dans la suite du texte.
<Desc/Clms Page number 22>
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une pluralité de vecteurs tels que définis précédemment. La composition peut être une banque, comme il sera décrit plus en détail dans la suite du texte.
Banque Au sens de l'invention, le terme banque désigne un produit ou une composition complexe comprenant une pluralité ou une multitude de composants ou de membres, qui peuvent être présents en mélange (s) dans des compartiments séparés. Les banques selon l'invention comprennent typiquement une pluralité d'ARNs actifs, ou de cassettes codant de tels ARNs actifs, qui peuvent être clonées dans des vecteurs, notamment des plasmides, vecteurs viraux, virus, et/ou dans des cellules. Typiquement, bien que cela ne soit pas obligatoire, toutes les cassettes et/ou vecteurs d'une même banque ont sensiblement la même structure, ces composants différant les uns des autres par la nature (e. g., longueur, origine, type, etc.) et/ou la structure (e. g., séquence) des ARNs actifs codés. En outre, une banque comprend généralement plusieurs copies de chaque composant ou membre. La complexité de la banque peut varier dans une large mesure. Ainsi, une banque peut être composée de deux composants comprenant des cassettes d'expression d'ARNs actifs distincts, de préférence de
10 au moins, encore plus préférentiellement de 20 au moins. Des banques typiques comprennent plus de 100,500 ou 1000 composants distincts, par exemple jusqu'à 109 ou plus encore. S'agissant de banques de cassettes d'expression d'ARNs aléatoires, il est clair que la composition précise (e. g., la séquence) des composants de la banque est généralement et par principe non connue, au moins en partie. Les composants de la banque (e. g., cassettes, vecteurs, cellules, etc. ) peuvent être présents sous des formes diverses, comme sous forme liquide, gel, lyophilisée, etc. Ils peuvent être immobilisés sur un support ou en suspension, sous forme soluble. La banque comprend généralement un support physique contenant les différents membres de la banque, qui peuvent être en mélange(s), au moins partiel (s), séparés. Le support peut ainsi comprendre un ou plusieurs compartiments séparés physiquement, tels que des flasques, tubes, bouteilles, plaques multi-puits, etc. La banque peut être conservée sous différentes formes, notamment en suspension liquide ou congelée, répliquée, etc., en tout ou en partie.
10 au moins, encore plus préférentiellement de 20 au moins. Des banques typiques comprennent plus de 100,500 ou 1000 composants distincts, par exemple jusqu'à 109 ou plus encore. S'agissant de banques de cassettes d'expression d'ARNs aléatoires, il est clair que la composition précise (e. g., la séquence) des composants de la banque est généralement et par principe non connue, au moins en partie. Les composants de la banque (e. g., cassettes, vecteurs, cellules, etc. ) peuvent être présents sous des formes diverses, comme sous forme liquide, gel, lyophilisée, etc. Ils peuvent être immobilisés sur un support ou en suspension, sous forme soluble. La banque comprend généralement un support physique contenant les différents membres de la banque, qui peuvent être en mélange(s), au moins partiel (s), séparés. Le support peut ainsi comprendre un ou plusieurs compartiments séparés physiquement, tels que des flasques, tubes, bouteilles, plaques multi-puits, etc. La banque peut être conservée sous différentes formes, notamment en suspension liquide ou congelée, répliquée, etc., en tout ou en partie.
<Desc/Clms Page number 23>
Les banques de l'invention comprennent typiquement une pluralité de vecteurs comprenant chacun une cassette d'expression d'un ARN aléatoire comme décrit précédemment, les vecteurs étant au moins en partie sous forme de mélange. De préférence, la banque comprend au moins 50,100 ou 200 vecteurs codant un ARN aléatoire distinct. Elle peut comprendre jusqu'à plusieurs milliards d'espèces moléculaires distinctes.
Les séquences aléatoires peuvent être toute molécule d'ADN ou d'ARN comprenant au moins un élément de séquence non connu, plus précisément toute molécule d'ADN ou d'ARN dont une partie au moins de la séquence est aléatoire. De tels acides nucléiques aléatoires peuvent typiquement comprendre une région aléatoire bordée, à l'une ou aux deux extrémités, d'une région de séquence définie. La région aléatoire peut comprendre par exemple de 8 à 50 bases, et la ou les régions définies de 2 à 10 bases. L'acide nucléique aléatoire peut être un ARN simple-brin, produit par synthèse chimique, ou par amplification ou mutagénèse à partir de toute matrice biologique. L'acide nucléique peut également être un ADN, notamment un ADN double-brin aléatoire codant un ARN aléatoire. Un tel ADN double-brin aléatoire peut être préparé à partir d'une population d'ADNs simple-brins aléatoires de synthèse ou obtenus par des techniques d'amplification et/ou de mutagénèse, par synthèse d'un second brin complémentaire selon des techniques connues de l'homme du métier.
Un objet particulier de l'invention réside dans une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA1 d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire distinct.
Un autre objet particulier concerne une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression comprenant un ARN aléatoire distinct sous contrôle d'un promoteur U6.
<Desc/Clms Page number 24>
Un autre objet particulier concerne une banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression comprenant un ARN aléatoire distinct sous contrôle d'un promoteur tRNA.
Sélection in Cellulo Comme indiqué, l'invention concerne, de manière générale, des procédés de sélection in cellulo, à partir de banques d'acides nucléiques aléatoires, d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré.
Les procédés de l'invention comprennent, plus particulièrement : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de celle-ci avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection d'une ou plusieurs cellules possédant le phénotype désiré, et d) l'identification de la ou des cassettes contenues dans la ou les cellules sélectionnées, ou des ARNs actifs qu'elles expriment.
Dans un premier mode de réalisation, la banque mise en #uvre dans l'étape a) est une banque aléatoire générale, c'est-à-dire comprenant une pluralité de séquences totalement aléatoires. L'utilisation de ce type de banque est particulièrement intéressante pour la sélection d'ARN actifs capables de conférer un phénotype désiré à une cellule, sans connaissance a priori de la cible biologique visée ou de la voie métabolique ciblée.
Dans un autre mode de réalisation, la banque mise en #uvre dans l'étape a) est une banque aléatoire restreinte, c'est-à-dire comprenant une pluralité de séquences dont le caractère aléatoire présente un certain niveau de restriction. Ainsi, la banque restreinte peut être une
<Desc/Clms Page number 25>
banque dérivée de la séquence d'un gène cible donné, comprenant une multitude de séquences complémentaires d'une ou plusieurs régions de ce gène. La banque restreinte peut également être une banque aléatoire dans laquelle un ou plusieurs résidus, ou un ou plusieurs motifs de séquence sont imposés au sein de la région aléatoire. La banque restreinte peut également être une banque de mutants aléatoires d'une séquence cible donnée. L'utilisation de banques aléatoires restreintes est particulièrement intéressante pour la sélection d'ARN actifs capables d'altérer une cible biologique déterminée ou une voie métabolique déterminée.
Les banques peuvent être produites par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par synthèse, amplification, mutagénèse, etc., ou des combinaisons de ces méthodes. Il peut s'agir d'une banque d'ADN synthétiques ou produits par voie recombinante ou génétique, à partir de matrices artificielles ou synthétiques, comme des banque génomique, d'ARN de séquences obtenues par la méthode SELEX, ou par toute technique de mutagénèse ou d'évolution dirigée, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, la banque d'ADN codant des ARN aléatoires est préparée par : synthèse d'une banque d'ADN simple-brin comprenant une région aléatoire encadrée par une ou deux régions de séquence définie, synthèse d'un deuxième brin au moyen d'une ADN polymérase et en présence d'une amorce complémentaire de la séquence définie du premier brin, ou d'une partie de celle-ci, pour produire une banque d'ADN double-brin comprenant une région aléatoire, et clonage de la banque d'ADN double-brin dans un vecteur, sous contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la banque d'ADN codant des ARN aléatoires est préparée à partir d'une collection de séquences ARN aléatoires par : transcription inverse pour produire une banque d'ADN simple-brin comprenant une région aléatoire encadrée par une ou deux régions de séquence définie,
<Desc/Clms Page number 26>
synthèse d'un deuxième brin au moyen d'une ADN polymérase et en présence d'une amorce complémentaire de la séquence définie du premier brin, ou d'une partie de celle-ci, pour produire une banque d'ADN double-brin comprenant une région aléatoire, et clonage de la banque d'ADN double-brin dans un vecteur, sous contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III.
Dans un mode de mise en #uvre particulier, le vecteur est un vecteur viral, notamment rétroviral. Dans ce cas, le procédé comprend avantageusement en outre une étape de transfection dudit vecteur dans une lignée cellulaire d'encapsidation, pour produire une banque de virus, notamment de rétrovirus recombinants.
Lors de l'étape b) du procédé de l'invention, la banque (ou une partie de celle-ci) est mise en contact avec une population de cellules. Les cellules utilisées peuvent être de nature et d'origine variées, et choisies en fonction des propriétés recherchées pour l'ARN actif. Ainsi, le procédé de l'invention peut être mis en #uvre notamment avec une population de cellules comprenant des cellules animales (par exemple de mammifère), d'oiseaux, de poissons, de batraciens ou bactériennes de plante, d'insecte, de levure. Il s'agit de préférence de cellules de mammifères, notamment humaines ou d'animaux (rongeurs, bovins, équins, singes, etc.). Les cellules peuvent être des cultures primaires ou des lignées. Il peut s'agir de cellules pluripotentes embryonnaires ou somatiques, différenciées ou non, prolifératives ou quiescentes, etc. On peut citer par exemple des cellules souches, des fibroblastes, des hépatocytes, des cellules épithéliales, musculaires, rénales, nerveuses, cardiaques, ou appartenant au lignage hématopoiétique (lymphocytes B, T, NK, mastocytes, cellules dendritiques, macrophages résidants ou circulants, etc), etc. Les cellules utilisées peuvent par ailleurs être modifiées ou traitées préalablement, par exemple pour contenir un système de gène rapporteur, un marqueur, etc., ou pour présenter un phénotype pathologique que l'on souhaite corriger.
Le procédé de sélection est typiquement réalisé in vitro, dans tout type de support adapté, tel que fiole, flasque, plaque multi-puits, etc. A cet effet, afin de pouvoir mesurer ou observer, sur chaque cellule, l'effet d'un nombre restreint d'ARNs aléatoires de la banque, la banque
<Desc/Clms Page number 27>
est préférentiellement mise en contact avec la population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'un nombre restreint de cassettes par cellule. En effet, la banque étant typiquement composée d'un mélange de composants distincts, on préfère que chaque cellule de la population soit modifiée par un nombre restreint de ces composants pour mieux en apprécier les propriétés. De ce fait, il n'est pas nécessaire que les constituants de la banque soient séparés les uns des autres, ou que la population de cellules soit répartie en supports à plusieurs compartiments, ce qui constitue un avantage important de l'invention.
A titre indicatif, lorsque la banque est une banque de virus, on préfère incuber les cellules à une MOI faible, typiquement inférieure à 5.
La mise en contact peut être réalisée en présence d'agents facilitant la transfection, comme des polymères, lipides cationiques, peptides, etc. Lorsque la banque comprend des virus, notamment des rétrovirus, de tels agents ne sont généralement pas nécessaires, compte tenu de l'efficacité d'infection.
Les cellules peuvent être cultivées ou conservées un certain temps après la mise en contact, avant de réaliser l'étape c). Cette durée peut être ajustée par l'homme du métier selon le phénotype recherché, le type de vecteur, la quantité de cellules, etc. Par ailleurs, consécutivement à la mise en contact, il est possible de réaliser une étape de sélection des cellules dans lesquelles une ou plusieurs cassettes ont effectivement été transférée. Cette sélection peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment en utilisant un gène marqueur inséré sur le vecteur. En outre, les cellules peuvent également être soumises à des traitement ou conditions particulières, notamment pour révéler le phénotype d'intérêt (e. g., ajout d'un substrat, d'un réactif, lyse des cellules, etc.) Le phénotype d'intérêt peut être toute activité, propriété, morphologie, etc. Il peut s'agir de l'expression d'un gène endogène ou exogène, d'un marqueur, de l'expression d'une protéine de surface, d'une propriété de migration, différentiation, croissance, résistance, etc. Dans un mode de mise en #uvre particulier, le phénotype désiré est choisi parmi une capacité ou une incapacité de croissance, d'apoptose, de différentiation, de migration, de résistance à un agent toxique, de résistance à un agent infectieux, ou d'action métabolique (e.g., la cellule
<Desc/Clms Page number 28>
est devenue capable de modifier son environnement métabolique). Dans un autre mode de réalisation, le phénotype désiré est l'activité d'une cible biologique déterminée ou d'une voie métabolique déterminée. On peut citer notamment l'expression ou l'activité d'une protéine, par exemple d'une enzyme (e.g. kinase, protéase, etc. ), d'un facteur de transcription, etc.
Dans un premier mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules infectées par un virus et le phénotype désiré est la résistance audit virus. Le virus peut être tout virus connu, comme un virus de l'hépatite (B, C, delta...), de la grippe, le VIH, les différents herpès, les virus des papillomes, etc.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules tumorales et le phénotype désiré est la perte de tumorigénicité.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules souches embryonnaires non différenciées et le phénotype désiré est le contrôle de leur différenciation.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules capables d'agir sur un processus métabolique naturel (par exemple : coagulation sanguine, régulation du taux de glucose, de lipides, cholestérol...) et le phénotype désiré est le contrôle de ce processus métabolique.
Selon une autre variante, la population de cellules comprend des cellules bactériennes et le phénotype désiré est la sensibilité à un agent toxique.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprend des cellules exprimant une cible biologique déterminée (e. g. une protéine, un variant d'une protéine, un acide nucléique, un lipide, un récepteur, etc. ) et le phénotype désiré est la modification de l'activité (y compris de l'expression) de cette cible biologique.
<Desc/Clms Page number 29>
Les cellules exprimant le phénotype désiré peuvent être sélectionnées par l'homme du métier par toute technique classique de biologie (modification morphologique, survie, expression d'un marqueur, tri cellulaire, etc.) L'étape d) comprend l'identification de la ou des cassettes contenues dans la ou les cellules sélectionnées, ou des ARN actifs qu'elles expriment. Ces cassettes ou ARNs sont responsables du phénotype produit et peuvent donc être utilisés pour toute application visant à reproduire ce phénotype. La cassette, ou l'ARN peuvent être extraits des cellules et isolés par des méthodes classiques de biologie moléculaire (lyse des cellules, amplification ou hybridation, etc. ). Dans un mode de mise en #uvre préféré, la séquence de la ou des cassettes est déterminée, pour permettre de produire par voie synthétique ou recombinante le produit correspondant. Bien entendu, les propriétés de la cassette ou de l'ARN peuvent être confirmées dans tout système ou modèle biologique approprié.
Préférentiellement, lorsque la banque utilisée dans l'étape a) est complexe (i.e., comprend un nombre élevé de composants distincts, par exemple supérieur à 100), on préfère répéter les étapes b) à d) du procédé afin de sélectionner des agents les plus actifs. Dans ce cas, l'ADN des cassettes d'expression des cellules sélectionnées est amplifié pour produire une banque restreinte, et les étapes b)-d) du procédé sont répétées une fois au moins avec ladite banque restreinte. La réalisation de plusieurs cycles présente plusieurs avantages : tout d'abord, elle permet de partir de banques très complexes, utilisées sous forme de mélange.
De plus, elle permet d'augmenter progressivement l'efficacité des ARNs actifs. Par ailleurs, elle peut permettre de sélectionner des ARNs actifs présentant un profil déterminé, en sélectionnant les cassettes sur des cellules ou dans des conditions distinctes selon les cycles.
Ainsi, la répétition de cycles peut permettre de contrôler la spécificité d'un ARN actif ou au contraire de vérifier son efficacité sur plusieurs cibles ou plusieurs types cellulaires.
Un objet particulier de l'invention réside dans un procédé de sélection d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence
<Desc/Clms Page number 30>
nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phénotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
Dans un mode préféré, le vecteur est un virus recombinant, plus préférentiellement un rétrovirus recombinant.
De manière particulièrement préférée, le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur dérivé de la séquence d'un gène VA d'un adénovirus.
Dans un mode spécifique, la population de cellules comprend des cellules de mammifère.
Un mode de réalisation plus particulier de l'invention comprend : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire distinct, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de celle-ci avec une population de cellules de mammifères dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits rétrovirus recombinants, c) la sélection des cellules possédant le phénotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et,
<Desc/Clms Page number 31>
f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans un procédé de sélection d'ARNs actifs sur une cible biologique déterminée, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN contraint (ou prédéfini) pour agir sur ladite cible déterminée, placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules exprimant ou contenant la cible biologique, dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phénotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules et, de manière facultative, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
La séquence des ARN codés peut-être dérivée de la séquence de la cible biologique (notamment dans le cas des antisens , siRNA, ribozymes) ou bien être pré-sélectionnée pour interagir de manière structurale avec la cible biologique (notamment dans le cas des aptamères).
Applications pour la recherche en biotechnologie Les ARNs actifs identifiés, les séquences actives identifiées ou les cassettes d'expression de ces ARN actifs peuvent être utilisés comme des outils moléculaires capables d'agir dans la cellule pour interférer (inhibition, activation) avec une activité biologique ou l'expression d'un phénotype déterminé ( target identification ). A ce titre, ils constituent des produits utiles pour étudier un processus cellulaire et identifier de nouvelles cibles ou pour explorer la fonction d'un gène dans le cas où la cible est connue ( target validation ). Leur action
<Desc/Clms Page number 32>
dans une cellule peut permettre de modifier la cellule de façon à ce que ladite cellule soit dotée de propriétés nouvelles. La cellule ainsi modifiée peut alors être considérée comme un nouvel outil en biotechnologie utilisable à des fins de recherche ou pour des applications thérapeutiques.
Applications pharmaceutiques Les ARNs actifs identifiés et, plus généralement, les cassettes d'expression identifiées, sont utilisables directement comme produits pharmaceutiques. Dans le contexte de l'invention, le terme pharmaceutique inclut toute utilisation dans le domaine médical, thérapeutique, préventif ou curatif, vétérinaire, agronomique, diagnostique, cosmétique, etc.
Ainsi, un aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule tels que définis ci-avant, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ARN actif, ledit ARN actif comprenant une séquence active insérée dans un ARN VA modifié, ledit ARN VA modifié comprenant éventuellement une hélice terminale altérée et/ou une séquence conférant un caractère inductible.
L'invention concerne encore des procédés de production de compositions pharmaceutiques, comprenant (i) le criblage d'une banque d'ARN aléatoires comme décrit ci-avant, permettant d'obtenir une cassette d'expression d'un ARN actif et (ii) le conditionnement de la cassette d'expression ou de la séquence ARN active dans tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Dans un mode de mise en #uvre particulier, l'invention concerne un procédé de production d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une infection par un agent pathogène chez un patient humain, comprenant (i) le criblage d'une banque d'ARN aléatoires comme décrit ci-avant, la population de cellules utilisées étant infectée par l'agent
<Desc/Clms Page number 33>
pathogène et les ARN sélectionnés pour leur capacité à réduire ou bloquer le cycle infectieux, permettant d'obtenir une cassette d'expression d'un ARN actif et (ii) le conditionnement de la cassette d'expression ou de la séquence ARN active dans tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un ARN actif, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule recombinante tels que définis ci-avant, pour la préparation d'un médicament destiné à la mise en #uvre d'une méthode de traitement thérapeutique du corps humain. Selon les propriétés de l'ARN actif, le médicament peut être utilisé pour le traitement de cancers, infections, maladies neurodégénératives, etc.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un ARN actif, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule recombinante tels que définis ci-avant à un patient.
L'administration peut être réalisée par différentes voies, notamment par voie iv, ip, im, sc, locale ou générale, notamment intra-tumorale ou systémique.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
EXEMPLES #A. CONSTRUCTION DES CASSETTES D'EXPRESSION A-l. CASSETTES DERIVEES DU GENE VA1 DES ADENOVIRUS.
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant l'expression et la diffusion intracellulaire (en cellules de mammifères) de motifs d'ARN actifs (ARN structuraux = aptamères, antisens, ribozymes ou motifs actifs).
<Desc/Clms Page number 34>
La base de ces cassettes est le gène viral VA RNA de l'adénovirus de type 2. Ce gène est efficacement transcrit par l'ARN polymérase III cellulaire. L'ARN produit est très structuré, sa taille est de 160 bases. La localisation cellulaire de cet ARN est cytoplasmique.
Afin d'éliminer la partie physiologiquement active de l'ARN VA1, la boucle IV (qui interagit avec la protéine kinase p68) a été supprimée dans cette construction et le site de restriction Eco RV a été inséré : construction VAAIV (Barcellini et al., 1998) et (Gwizdek et al., 2001).
L'ARN VAAIV a une taille de 134 bases, il est riche en structures secondaires (figure 4) et a une localisation cytoplasmique (Barcellini et al., 1998) (Gwizdek et al., 2001). Sa séquence est représentée par la séquence SEQ ID NO : 2.
A-1-a. Modification de la cassette VAAIV : Cassette VAAIV (cytoplasmique) et nVA#IV (nucléaire).
Cassette VAAIVSrf : Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant l'expression des motifs actifs intégrés dans l'ARN VAAIV, et dont la localisation soit principalement cytoplasmique.
Dans le domaine central du gène VA1, au niveau de la délétion de la boucle IV, le site de clonage Srfl, plus adapté, a été introduit en remplacement du site EcoRV.
La cassette VAAIVSrf a été générée en insérant le site Srfl sous la forme d'un octanucléotide ADN double brin (5'GCCCGGGC3') à l'intérieur du site de restriction EcoRV (position 90-96 dans le VAAIV). L'ARN transcrit possède 142 bases (figure 5) et une localisation cytoplasmique (figure 2C), SEQ ID NO : 3. Cet ARN permet l'expression optimisée de séquences ARN actives (figure 2B).
Cassette nVAAIVSrf :
<Desc/Clms Page number 35>
Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant d'exprimer des séquences d'ARN actives intégrées dans l'ARN VAAIVSrf, et dont la localisation reste nucléaire.
Dans l'ARN VA1 natif, la structure en double hélice contenant les extrémités 5' et 3' est la séquence responsable du transport de cet ARN du noyau vers le cytoplasme. Cette structure est appellée l'hélice terminale (Gwizdek et al., 2001). Elle a été cartographiée : bases 1 à 20 et bases 136 à 155. Si la structure en double hélice est perturbée, l'ARN est retenu dans le cytoplasme. La partie 3' du gène VAAIV a ainsi été modifiée afin de créer une rupture dans la double hélice terminale de l'ARN selon l'approche proposée dans Gwizdek et al., 2001. Pour cela, les séquences 5' du gène VAAIV ont été modifiées à partir du nucléotide 93 et remplacées par la séquence ADN double brin suivante (SEQ ID NO : 5) : 5'GCCCGGGCATCCAGGTGTGCGACGTCAATAAACGGGGGAGCGCCCTTTT3'.
On peut noter que le site de restriction Srfl, en italique et souligné, est directement intégré dans cette séquence (figure 6A). L'ARN transcrit dont les caractéristiques sont présentées dans la figure 6B possède 141 bases et une structure secondaire proche de celle de l'ARN VA1, sa localisation est nucléaire (figure 6C), SEQ ID NO : 4.
A-l-b. Inductibilité de la cassette VAAIV : Cassettes VAi (cytoplasmique) et nVAi (nucléaire).
Cassettes VAi : Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant d'exprimer des motifs actifs intégrés dans une cassette d'expression inductible par la tétracycline.
Premièrement, le gène VAAIV a été modifié afin d'intégrer une séquence opératrice tetOI entre les Boite A et B du gène VA et/ou en amont du site d'initiation de la transcription de ce gène (figure 7). La séquence tetOl remplace donc les séquences natives du gène VA soit entre les boite A et B (position 24 à 59 dans le gène VAiO) soit en amont des séquences transcrites (position - 29 à - 50 dans le gènes OVAi), soit au niveau des deux positions
<Desc/Clms Page number 36>
(extragénique et intragénique : gèneOVAiO). Deuxièmement, dans le domaine central de ce nouveau gène VA se trouve le site de clonage Srfl. Et troisièmement, dans le but de recréer une structure secondaire proche de celle de l'ARN VA natif, des séquences partiellement complémentaires à la séquence tetO 1 remplacent les séquences centrales du gène (VAiO et OVAiO). Afin d'obtenir un ARN VAi cytoplasmique tout est fait pour conserver l'hélice terminale responsable du transport de l'ARN vers le cytoplasme. La séquence complète des gènes OVAi (SEQ ID NO : 16), OVAiO (SEQ ID NO : 17) et VAiO (SEQ ID NO : 15) est indiquée dans la figure 7A.
Les cassettes VAi sont obtenues de manière synthétique en utilisant 4 oligonucléotides d'ADN simple brin. Les deux premiers oligonucléotides d'ADN simple brin VAi up et VAi down (SEQ ID NOs : 18 et 19, figure 7B) sont utilisés pour générer la totalité des séquences transcrites du néogène VAi ainsi qu'une partie des séquences adjacentes en 5' et en 3'.
Grâce à une séquence de 20 bases complémentaires ces oligonucléotides sont hybridés puis utilisés pour générer un ADN double brin en présence de l'ADN polymérase fragment de Kleenow. Les deux oligonucléotides externes VAi PvuII 5' (SEQ ID NO : 20) et VAi Pvull 3' (SEQ ID NO : 22) (figure 7B) sont utilisés pour ajouter les séquences amont et aval du gène VA grâce à une réaction de PCR. Les deux sites de restriction PvuII placés aux deux extrémités 5' et 3' du gène VAiO permettent de le cloner dans un veteur ADN quelconque. De même, les deux oligonucléotides VAi02PvuII 5' et VAiPvuII 3' sont utilisés pour ajouter la séquence tetOI en amont du gène VAAIVSrf ou du gène VaiO afin de générer respectivement les gènes OVAi et OVAiO.
L'ARN transcrit VAiO possède 142 bases, sa structure secondaire est présentée en figure 8.
Cassette nVAi : Cet exemple décrit la construction de cassettes permettant d'exprimer des motifs actifs intégrés dans une cassette d'expression inductible par la tétracycline. La localisation de ce motif doit être principalement nucléaire. Le principe de la rétention de cet ARN dans le noyau est le même que pour la cassette d'expression nVAAIVSrf (voir ci-dessus).
<Desc/Clms Page number 37>
La partie 3' des différents gènes VAi est donc modifiée de la même façon que pour le gène nVA#IVSrf afin de créer une rupture dans la double hélice terminale de l'ARN.
A-2. CASSETTES DERIVEES DU GENE HUMAIN hU6 La séquence promotrice du gène U6 humain est en position extragénique. L'ARN généré correspond donc aux séquences que l'on a choisi de cloner en aval du promoteur (à partir du point +1 de transcription). Ce type de promoteur permet donc d'exprimer des ARN entièrement synthétiques par opposition au système VA qui impose de conserver des séquences promotrices positionnées au sein des séquences transcrites.
Cet exemple décrit plusieurs modifications du gène U6+1 (décrit initialement par (Bertrand et al., 1997)). Ces modifications permettent de faciliter le clonage des séquences actives, de maîtriser les séquences transcrites dès le point +1 de transcription, de stabiliser les séquences actives et de maîtriser la localisation intracellulaire de ces séquences.
Les séquences promotrices utilisées dans les cassettes vont de 1 à 266. Au niveau du site +1 de transcription (nu. 266), un site de clonage à bouts collants a été placé : Sali (5'GTCGAC3') (Bertrand et al., 1997).
A-2-a. Cassettes hélice U6 (U6h9, U6h20 et nU6h20) Les ARN transcrits par ces cassettes ont une localisation nucléaire ou cytoplasmique, en fonction des constructions. L'objectif de ces cassettes est l'expression intracellulaire de motifs d'ARN structuraux.
Une séquence servant de base structurale pour l'ARN à insérer est placée en aval du promoteur U6. Elle contient : une séquence capable de générer une courte hélice ARN (plus ou moins stable et plus ou moins longue), un site de clonage bord franc (Srfl : 5'GCCCGGGC3') ainsi que le signal d'arrêt de transcription TTTTT.
<Desc/Clms Page number 38>
Dans les cellules de mammifères, l'accumulation d'ARN double brin (d'une longueur supérieure à 40 nucléotides environ) déclenche la production d'interféron et la mort des cellules par apoptose. Cependant il est nécessaire que la navette ARN qui supporte le motif actif possède une structure propre et stable en forme d'hélice. Cet exemple décrit la construction de trois types de navette dérivées de U6 : le motif actif est lui même structuré sous la forme d'une hélice, nous utilisons une cassette possédant un court motif navette (hélice 9 : h9U6), lorsque le motif actif n'est pas structuré en hélice ou très court, nous utilisons une cassette permettant l'expression d'une navette formé par l'appariement d'une vingtaine de nucléotides (hélice 20 h20U6). h20U6 permet également de modifier la tige terminale de la navette motif d'export et de générer une navette à localisation nucléaire (nh20U6).
Différents fragments d'ADN double brin sont insérés à l'intérieur du site de restriction Sali grâce à des extrémités Sali compatibles. h9U6 :(SEQ ID NO : 6)
5' TCGAGCCCGGGCTCGACTTTTTC 3' 3' CGGGCCCGAGCTGAAAAAGAGCT 5' Séquence transcrite du gène h9U6 : (SEQ ID NO : 7)
GTCGAGCCCGGGCTCGACTTTTT h20U6 : (SEQ ID NO : 8) 5' TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGTCGATATCCTCGACTTTTTC 3' 3' CCTATAGCTGACGGGCCCGTCAGCTATAGGAGCTGAAAAAGAGCT 5' Séquence transcrite du gène h9U20 : ID NO : 9)
GTCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGTCGATATCCTCGACTTTTT nh20U6 : (SEQ ID NO : 10) 5' TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTTC 3'
5' TCGAGCCCGGGCTCGACTTTTTC 3' 3' CGGGCCCGAGCTGAAAAAGAGCT 5' Séquence transcrite du gène h9U6 : (SEQ ID NO : 7)
GTCGAGCCCGGGCTCGACTTTTT h20U6 : (SEQ ID NO : 8) 5' TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGTCGATATCCTCGACTTTTTC 3' 3' CCTATAGCTGACGGGCCCGTCAGCTATAGGAGCTGAAAAAGAGCT 5' Séquence transcrite du gène h9U20 : ID NO : 9)
GTCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGTCGATATCCTCGACTTTTT nh20U6 : (SEQ ID NO : 10) 5' TCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTTC 3'
<Desc/Clms Page number 39>
3'CCTATAGCTGACGGGCCCGTCTCTATTCCAGCTGAAAAAGAGCT5' L'ARN correspondant à une structure en hélice sur 18 bases, avec une interruption d'hélice sur 6 bases. Sa séquence est indiquée ci-dessous (SEQ ID NO : 11)
GTCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTT La structure secondaire des hélice U6 est présentée dans la figure 9.
GTCGAGGATATCGACTGCCCGGGCAGAGATAAGGTCGACTTTTT La structure secondaire des hélice U6 est présentée dans la figure 9.
A-2-b. Cassette U6 Srf L'objectif de cette cassette est d'exprimer des ARN dont la séquence est choisie dès le point +1 de transcription.
Dans cette cassette, le site de restriction à extrémités cohésives Sal 1 est remplacé par le site de restriction à bords francs Srfl.
Pour cela, le promoteur U6 est modifié par réaction PCR avec pour matrice la cassette U6 décrite précédemment. Dans cette réaction, l'amorce 5' est une séquence plasmidique située en amont du promoteur et l'amorce 3' permet de modifier les séquences à proximité du site +1 de transcription :
5'GTGGGCCATGGGTGCCCGGGCTTTCGTCCTTTCCACAAG3' (SEQ ID N0:12).
5'GTGGGCCATGGGTGCCCGGGCTTTCGTCCTTTCCACAAG3' (SEQ ID N0:12).
Dans cet oligo, la séquence Srf GCCCGGGC remplace la séquence CACCGTCG présente dans le gène d'origine (Bertrand et al., 1997) (5' CACCGTCG 3' de la cassette d'origine a été changée par le site Srfl 5' GCCCGGGC 3' (les séquences soulignées représentent le début des séquences transcrites).
La taille de l'ARN transcrit est fonction de la séquence clonée en aval du promoteur, à l'intérieur du site Srfl. De même, la localisation cellulaire de l'ARN transcrit est fonction de la séquence de ce dernier.
A-2-c. Cassette U6Tt
<Desc/Clms Page number 40>
L'Objectif de cette cassette est d'exprimer des séquences d'ARN antisens qui ne soient pas dégradés par les RNAses cellulaires.
En aval du promoteur U6, à l'intérieur du dite de restriction Sali, est clonée une séquence appelée tige terminale. Elle génère une structure en épingle à cheveux à l'extrémité 3' de l'ARN, évitant ainsi la dégradation par les RNAses. En amont de cette tige terminale se trouve la séquence GTCGAC qui reconstitue un site de restriction Sali, afin de représenter le site de clonage des séquences antisens. En aval de la tige terminale se trouve le signal d'arrêt de transcription de la polymérase III : TTTTT.
Séquence de la tige terminale (SEQ ID NO : 13) 5' GCGGACTTCGGTCCGCTTTTT 3' Les séquences soulignées forment l'hélice ARN La séquence transcrite dans cette cassette est (SEQ ID NO : 14) 5'G//TCGACCCATGCTAGAGCGGACTTCGGTCCGCTTTTT // représente le site d'insertion Sali pour les séquences antisens.
Les séquences en gras représentent la tige terminale.
B. CLONAGE ET EXPRESSION DES CASSETTES D'EXPRESSION DANS UN VECTEUR B-l. VECTEUR RETRO VIRAL pBABE Le vecteur rétroviral choisi est le vecteur pBABE (Morgenstern and Land, 1990). Le site d'insertion choisi est le site Nhel qui est localisé dans le LTR 3'(figure 10). Ce site d'insertion présente plusieurs avantages : - Au cours du cycle viral, le LTR 3' est celui qui est copié pour générer les deux nouveaux LTR du provirus intégré. Il est donc responsable de l'activité du promoteur viral en situation d'intégration dans l'ADN cellulaire. Le fait d'intégrer une séquence exogène à l'intérieur de ce LTR ne perturbe pas la production des virus recombinants par les cellules
<Desc/Clms Page number 41>
d'encapsidation, mais permet d'inactiver le promoteur viral en situation intégrée dans les cellules transduites. L'intégration de telles séquences dans un génome cellulaire n'entraîne donc pas l'activation des gènes situés en aval de l'insertion. Ce type de construction est particulièrement avantageux dans l'optique d'une utilisation pour des projets de thérapie génique.
- Une des conséquences de la duplication du LTR 3' est aussi la duplication de la séquence insérée dans ce LTR. Il y a donc deux copies des cassettes d'expression par intégration.
Les cassette construites sont ainsi transférées dans le vecteur pBabe au niveau du site d'insertion Nhel (à l'intérieur du LTR 3').
B-2. AUTRES VECTEURS Tout autre vecteur ou moyen permettant de faire pénétrer les cassettes d'expression dans la cellule est également envisagé : transfection, transduction ou autre. De plus, toute vectorisation ayant pour but de faire pénétrer dans la cellule non pas la cassette d'expression, mais l'ARN actif sont aussi envisagées.
C. PRODUCTION DE BANQUES D'EXPRESSION D'ARN ALEATOIRES Une banque d'expression d'ARNs aléatoires a été générée à partir de fragments d'ADN simple brin ayant une taille de 34 bases. Ces fragments se décomposent en trois parties : de 5 ' vers 3' on trouve une séquence connue de 8 bases (runA), puis une séquence aléatoire de 26 bases (synthétisée chimiquement de manière parfaitement aléatoire par un automate de synthèse d'ADN), pour finir, une deuxième séquence connue de 8 bases (runB). Les séquences runA et runB sont complémentaires. Dans un exemple spécifique, les fragments d'ADN simple-brin présentent la séquence 5' ATGAACGC (N) 26 GCGTTCAT 3', dans laquelle N représente toute base. La partie aléatoire contient donc 26 positions variables.
<Desc/Clms Page number 42>
Un oligonucléotide complémentaire à runB a été utilisé comme amorce pour l'ARN polymérase de Kleenow, qui synthétise le brin d'ADN complémentaire à la totalité de la séquence. Dans le cas de l'exemple spécifique, l'amorce complémentaire à runB présente la séquence 5' ATGAACGC 3'.
A l'issue de cette étape de synthèse, on obtient une population d'ADN double brin présentant des extrémités franches, et qui est représentative de la totalité des séquences aléatoires présentes. Cette population hétérogène d'ADN double brin obtenue est appelée banque de séquences aléatoires . Ces fragments d'ADN double brin sont prêts pour être insérés (clonés) dans les différentes cassettes d'expression dérivées des gènes VA1 et U6 décrites précédemment. Une fois transcrites, ces séquences génèrent des ARNs aléatoires ayant une structure en hélice/boucle : l'hélice étant formée grâce à la complémentarité entre runA et runB, la boucle ou toute autre structure secondaire étant constituée des 26 bases aléatoires.
Il est entendu que le principe de construction de la banque d'expression aléatoire reste le même quelle que soit la taille des fragment insérés dans les cassettes d'expression.
La banque de séquences aléatoires est ensuite clonée dans une cassette d'expression telle que décrite dans les exemples A et B ci-dessus. Selon le type d'expression recherché et/ou les besoins, les séquences aléatoires peuvent être insérées dans les deux types de cassettes dérivées de VA1 ou U6. Pour cela les plasmides ou vecteurs viraux (par exemple, pBabe dans le cas des vecteurs rétroviraux) contenant les cassettes d'expression sont digérés par l'enzyme de restriction Srfl puis purifiés. La banque de séquences aléatoire (ADN double brin à bords francs) est clonée grâce à une ligation compétitive, en présence de l'enzyme de restriction Srfl. Statistiquement, chaque vecteur intègre donc un fragment d'ADN double brin contenant une séquence aléatoire différente. La population hétérogène des plasmides ou vecteurs obtenus après insertion des séquences aléatoires est appelée banque de plasmides aléatoires ou banque de vecteurs aléatoires . Ces banques constituent des banques d'expression d'ARN aléatoires au sens de l'invention, utilisables directement pour la sélection in cellulo d'ARNs actifs.
<Desc/Clms Page number 43>
D. PRODUCTION D'UNE BANQUE DE RETROVIRUS ALEATOIRES Dans un mode de mise en #uvre préféré, la banque d'expression utilisée est une banque d'expression virale, notamment rétrovirale. Une telle banque peut être construite à partir d'une banque de vecteurs viraux aléatoires, comme décrit ci-après.
La banque de vecteurs aléatoires est introduite dans les cellules d'une lignée d'encapsidation (ici la lignée 293GP (Burns et al., 1993)) par transfection au phosphate de calcium. La banque est simultanément transfectée avec un vecteur d'expression codant la glycoprotéine G d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G). Cette protéine est réputée être très efficace pour la fonctionnalité (stabilité, infectivité) des virus rétroviraux produits après transfection. Quelques jours après la transfection, les cellules produisent des rétrovirus pBabe recombinants. La Banque de virus aléatoire est alors prélevée, purifiée et concentrée. Son titre infectieux ou MOI (nombre de particules rétrovirales recombinantes infectieuses par millilitre) peut alors être déterminé suivant les méthodes connues par l'homme de métier.
E. SELECTION IN CELLULO Les banques d'expression décrites dans les exemples C et D peuvent être utilisées pour la sélection in cellulo d'ARNs actifs. Ainsi par exemple, avec la Banque de virus aléatoires , il est possible de transférer les cassettes d'expression d'ARN aléatoires dans les cellules à étudier. L'objectif est d'obtenir une banque de cellules aléatoires dans laquelle chaque cellule exprime un, ou plusieurs, ARN aléatoire(s) différent(s). Les cellules utilisées peuvent être celles d'une lignée standard connue comme par exemple la cellule 293 (ATCC N CRL 1573) ou la cellule HELA (ATCC N CCL 2), on obtient alors une banque standard de cellules aléatoires qui peut être conservée et perpétuée à l'infini pour être utilisée dans différentes applications. Dans une autre situation, les cellules à infecter ont une nature
<Desc/Clms Page number 44>
particulière dans le sens qu'elles présentent une activité spécifique sur laquelle on veut agir (croissance, différenciation, infection...). Dans ce cas, on obtient alors une banque spécifique de cellules aléatoires .
La banque de virus aléatoires permet de transduire les cellules d'une lignée quelconque ainsi que des cellules en culture primaire. Pour construire une Banque de cellules aléatoires, standard ou spécifique , le principe est d'obtenir un maximum de cellules transduites ayant intégré chacune d'elle un nombre minimum de cassettes d'expression.
L'objectif étant de se rapprocher de la valeur d'une seule séquence aléatoire intégrée par génome cellulaire. L'infection des cellules se fait ainsi en utilisant un surnageant viral ayant une MOI comprise entre 1 et 5. La sélection des cellules transduites s'effectue grâce à la présence du gène de résistance à la puromycine dans les retrovirus pBabe recombinants.
Après action de l'agent de sélection, la population de cellules obtenue est donc constituée par toutes les cellules ayant reçu une ou plusieurs copies du génome rétroviral et contenant donc une ou plusieurs copies de cassette d'expression pol III codant chacune un ARN aléatoire différent.
Les cellules de la banque sont disponibles pour une première série de tests. La cible sur laquelle nous souhaitons agir grâce à l'ARN actif peut être connue (une protéine, un ARN, un ADN...) ou peut représenter une activité enzymatique, une voie métabolique, un processus de prolifération ou de différenciation, une résistance à une drogue, un agent pathogène, etc.
Le test de sélection doit être adapté à chaque cas. Dans un mode préféré de l'invention, au sein de la banque de cellules aléatoires la sélection des cellules contenant un ARN agissant sur la cible est réalisée grâce à la sélection positive des cellules ayant acquis le phénotype requis et présentant un avantage sélectif. Dans un premier exemple, la sélection d'un ARN actif contre un agent infectieux, tel qu'un virus cytopathogène (HIV), est réalisée grâce à la sélection positive des cellules devenues résistantes à la multiplication de ce virus. Dans un autre exemple, la sélection d'un ARN actif capable de protéger les cellules contre un processus de mort cellulaire programmée (apoptose) est réalisée au travers de la sélection des cellules devenues résistantes à l'ajout d'un signal déclenchant l'apoptose. La sélection positive des cellules d'intérêts peut également comprendre une sélection directe des cellules
<Desc/Clms Page number 45>
par observation directe (surprolifération, changement de statut morphologique, différenciation altérée, expression d'un marqueur membranaire fluorescent...). Les colonies de cellules d'intérêts sont prélevées par microdissection à l'aide d'un automate permettant la microdissection au laser des groupes de cellules d'intérêts (Simone et al., 1998) ou bien grâce à un tri positif basé sur la sélection des cellules d'intérêts marquées avec des anticorps. Après ce premier tour de sélection , les cellules contenant potentiellement un ARN actif sont isolées : elles constituent la première génération de cellules sélectionnées.
A ce stade, les cellules sélectionnées peuvent être amplifiées naturellement grâce à leur prolifération. Après une croissance suffisante, les cellules peuvent être clonées dans le cas où elles apparaissent sous forme de clones indépendants comprenant chacun plusieurs milliers de cellules. Alternativement, les cellules peuvent être globalement réunies pour former un population de cellules du premier tour. Dans tous les cas, les cellules peuvent être conservées grâce à une congélation.
Cette première génération de cellules sélectionnées (population ou clones indépendants) est directement utilisable pour effectuer un deuxième tour de sélection puis, plusieurs tours de sélection selon un mode itératif, avec la possibilité de faire varier les paramètres de sélection.
Dans certains cas, le mode de sélection et/ou le mode d'analyse des cellules sélectionnées peut nécessiter de travailler sur des cellules mortes car fixées par un agent fixateur comme par exemple le formaldéhyde. C'est notamment le cas où le mode de sélection impose un marquage des cellules à l'aide d'anticorps. Dans ce cas, l'amplification naturelle des cellules par croissance n'est pas possible et une étape supplémentaire d'amplification par PCR des cassettes contenant l'ARN actif est réalisée pour effectuer un deuxième tour de sélection.
L'ADN génomique des cellules issues du premier tour de sélection est extrait et purifié.
A partir de cet ADN, les techniques de biologie moléculaire permettent d'amplifier spécifiquement par PCR les séquences d'ADN correspondant aux cassettes d'expression d'ARN aléatoires contenues dans les cellules sélectionnées. On obtient ainsi une première génération de cassettes d'expression contenant des séquences potentiellement actives sur la cible. Cette première génération est dite banque restreinte de cassettes du premier tour .
<Desc/Clms Page number 46>
F. SELECTION DES CASSETTES ACTIVES SUIVANT UN PROCEDE ITERATIF La banque restreinte de cassettes du premier tour est traitée de la même manière que la banque aléatoire de départ . Elle est clonée dans le vecteur rétroviral pBabe au niveau du LTR 3'. Après cette nouvelle étape de clonage, on obtient une première banque restreinte de vecteurs viraux. Les formes infectieuses de ces vecteurs viraux sont obtenues à l'identique que précédemment par transfection des cellules d'encapsidation pour aboutir à une première banque restreinte de rétrovirus, utilisée pour infecter, à son tour, le type cellulaire étudié. La MOI est à nouveau ajustée pour être comprise entre 1 et 5 copies de virus par cellule. Les cellules ainsi transduites sont à nouveau sélectionnées suivant les mêmes règles que celles qui régissent la sélection du premier tour, ou suivant d'autres paramètres. On aboutit ainsi à l'établissement d'une banque restreinte de cassettes du second tour. Ce deuxième tour de sélection, permet d'enrichir la banque restreinte du premier tour en séquences actives.
La succession itérative des tours basés sur le principe d'une sélection pour le phénotype désiré permet d'enrichir, à chaque tour, la banque restreinte en séquence de cassettes actives.
Lorsque le phénotype désiré semble être enfin stabilisé, c'est-à-dire lorsque que l'ensemble des cellules ayant reçu un vecteur viral recombinant présente le phénotype désiré (habituellement après 5 à 6 tours de sélection), il est considéré que la sélection des cassettes dans les cellules est achevée.
G. IDENTIFICATION DES CASSETTES ACTIVES ET TEST DE LEUR FONCTIONALITE.
A partir des cellules sélectionnées, de préférence au cours du dernier tour de sélection, l'ADN génomique est extrait et purifié. Puis une amplification par PCR permet d'obtenir la dernière banque restreinte de cassettes actives. Le clonage de ces cassettes dans les vecteurs de clonage permet leur séparation physique grâce à la propagation de ces vecteurs dans des bactéries formant des colonies isolées. Le séquençage des cassettes retrouvées dans les différentes colonies bactériennes (habituellement une trentaine de colonies sont analysées) permet de connaître les séquences aléatoires les plus fréquentes ou de déterminer un motif contenu dans les séquences aléatoires qui a été particulièrement conservé au cours du
<Desc/Clms Page number 47>
processus de sélection. La connaissance de ce motif permet de définir et de construire par biologie moléculaire une ou plusieurs cassettes contenant ce motif.
La ou les cassettes ainsi définies peuvent, à ce stade, être analysée (s) manière individuelle afin de vérifier leur efficacité pour agir sur la cible. Pour cela, la cassette est clonée dans le vecteur pBabe, les vecteurs rétroviraux homogènes obtenus sont alors utilisés individuellement pour produire des virus recombinants qui servent à leur tour à infecter les cellules étudiées. La comparaison de l'efficacité relative des différentes cassettes analysées permet de choisir la ou les cassettes les mieux adaptées pour agir sur la cible. Le recours à un système inductible peut faciliter les différentes étapes décrites dans ce procédé afin de réduire la toxicité éventuelle des ARN exprimés en dehors des phases d'action sur la cible.
H - EXPRESSION D'ARNs ACTIFS DE SEQUENCE DETERMINEE Les constructions de l'invention peuvent également être utilisées pour tester des séquences actives définies, et/ou exprimer de telles séquences dans des tissus biologiques.
Dans ce cas, la séquence active à insérer se présente sous la forme d'ADN double brin dont la séquence à été choisie pour générer un ARN actif efficace (de type antisens, ribozyme, ARN interférant (ARNi) ou ARN structural). L'ADN double brin peut être obtenu par différentes techniques comme l'hybridation entre deux oligonucléotides complémentaires, la purification de fragments de restriction, la copie d'une matrice par PCR, etc.
Un vecteur tel que décrit dans l'exemple B, contenant une cassette d'expression, est digéré par l'enzyme de restriction adaptée et le clonage de la séquence active s'effectue dans ce site de restriction par des techniques classiques de clonage, en présence de l'enzyme de restriction correspondante (ligation compétitive). Il s'agit d'effectuer la ligation en présence de l'enzyme de restriction ayant servi à linéariser le plasmide. Ainsi, les plasmides qui se religuent sans avoir capté un insert sont à nouveau coupés par l'enzyme de restriction et donc disponibles pour une nouvelle ligation, alors que les plasmides ayant inséré une séquence ont perdu le site de restriction initial. Ces derniers ne seront donc pas digérés par l'enzyme de restriction et seront amplifiés par les cellules hôtes après transformation.
<Desc/Clms Page number 48>
Des vecteurs peuvent ainsi être produits, qu'il s'agisse de vecteurs plasmidiques ou viraux, par exemple. D'autre part, des virus recombinants peuvent également être générés, comme décrit dans l'exemple C. Les rétrovirus recombinants produits servent alors à infecter les cellules dont on souhaite altérer le phénotype. L'infection est faite préférentiellement avec une forte multiplicité d'infection afin d'intégrer un nombre élevé de cassettes d'expression d'ARN actif dans le génome cellulaire. En effet, l'activité de la séquence active est fortement dépendante de son niveau d'expression (figure 11). La présence du gène de résistance à la puromycine dans les retrovirus pBabe permet une sélection rapide des cellules qui ont été infectées et contenant la séquence transduite.
*Ces vecteurs peuvent également être purifiés et conditionnés dans tout véhicule ou excipient acceptable, pour produire des compositions administrables, par exemple chez des organismes mammifères, notamment humain.
<Desc/Clms Page number 49>
REFERENCES Barcellini, C. S., Fenard, D., Bertrand, E., Singer, R. H., Lefebvre, J. C., and Doglio, A. (1998). 3'-End modification of the adenoviral VA1 gène affects its expression in human cells: consequences for the design of chimeric VA1 RNA ribozymes [In Process Citation].
Antisense Nucleic Acid Drug Dev 8, 379-90 379-90.
Bertrand, E., Castanotto, D., Zhou, C., Carbonnelle, C., Lee, N. S., Good, P., Chatterjee, S., Grange, T., Pictet, R., Kohn, D., Engelke, D., and Rossi, J. J. (1997). The expression cassette détermines the functional activity of ribozymes in mammalian cells by controlling their intracellular localization. Rna 3,75-88 75-88.
Bertrand, E., Gwizdek, C., Fenard, D., and Doglio, A. (1999). L'ARN molécule thérapeutique ? vers une conception rationnelle du développement des ARN antisens, des ribozymes et des aptamères d'ARN. Médecine/Sciences 15, 677-681.
Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., and Yee, J. K. (1993). Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors : concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 8033-7.
Cagnon, L., Cucchiarini, M., Lefebvre, J. C., and Doglio, A. (1995). Protection of a T-cell line from human immunodeficiency virus replication by the stable expression of a short antisense RNA séquence carried by a shuttle RNA molécule. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 9, 349-58 349-58.
Chameau, P., Mirambeau, G., Roux, P., Paulous, S., Buc, H., and Clavel, F. (1994). HIV-1 reverse transcription. A termination step at the center of the genome. J Mol Biol 241, 651- 62.
Famulok, M., and Verma, S. (2002). In vivo-applied functional RNAs as tools in proteomics and genomics research. Trends Biotechnol 20,462-6.
Gmeiner, W. H. (2002). The structure and dynamics of the U4/U6 snRNP : for pre-mRNA splicing and use as a model system to investigate the RNA-mediated effects of (5F) Ura. J Biomol Struct Dyn 19, 853-62.
Gold, L. (1995). The SELEX process: a surprising source of therapeutic and diagnostic compounds. Harvey Lect 91, 47-57 47-57.
<Desc/Clms Page number 50>
Gossen, M., and Bujard, H. (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells bt tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551.
Gwizdek, C., Bertrand, E., Dargemont, C., Lefebvre, J. C., Blanchard, J. M., Singer, R. H., and Doglio, A. (2001). Terminal minihelix, a novel RNA motif that directs polymerase III transcripts to the cell cytoplasm. Terminal minihelix and RNA export. J Biol Chem 276, 25910-8.
Hermann, T., and Patel, D. J. (2000). Adaptive récognition by nucleic acid aptamers.
Science 287, 820-5.
Hillen, W., and Berens, C. (1994). Mechanisms underlying expression of TnlO encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol 48, 345-69.
Mathews, M. B., and Shenk, T. (1991). Adenovirius-associated RNA and translation control. J. Virol. 65, 5657 - 5662.
McManus, M. T., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet 3, 737-47.
Medina, M. F., and Joshi, S. (1999). RNA-polymerase III-driven expression cassettes in human gene therapy. Curr Opin Mol Ther 1, 580-94.
Morgenstern, J. P., and Land, H. (1990). Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug sélection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res 18, 3587-96.
Paule, M. R., and White, R. J. (2000). Survey and summary : by RNA polymerases 1 and III. Nucleic Acids Res 28, 1283-98.
Scherr, M., Morgan, M. A., and Eder, M. (2003). Gene Silencing Mediated by Small Interfering RNAs in Mammalian Cells. Curr Med Chem 10, 245-56.
Simone, N. L., Bonner, R. F., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R., and Liotta, L. A. (1998). Laser-capture microdissection : openingthe microscopic frontier to molecular analysis. Trends Genet 14, 272-6.
Yamamoto, R., Katahira, M., Nishikawa, S., Baba, T., Taira, K., and Kumar, P. K. (2000).
A novel RNA motif that binds efficiently and specifically to the Ttat protein of HIV and inhibits the trans-activation by Tat of transcription in vitro and in vivo. Genes Cells 5, 371- 88.
Claims (37)
- REVENDICATIONS 1. Procédé de sélection in cellulo d'un ARN actif capable de conférer à une cellule un phénotype désiré, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de celle-ci avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection des cellules possédant le phénotype désiré, et d) l'identification de la ou des cassette (s) dans la ou lesdites cellules, ou de l'ARN actifqu'elles expriment.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur localisé à l'intérieur des séquences transcrites (intragénique).
- 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est dérivé d'un gène VA d'un adénovirus.
- 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur localisé en amont des séquences transcrites (extragénique).
- 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur U6.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible.<Desc/Clms Page number 52>
- 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la cassette comprend la séquence d'un gène VA d'adénovirus délété de tout ou une partie fonctionnelle de la boucle IV, dans laquelle la séquence codant l'ARN est insérée.
- 8. Procédé selon la revendication 3 ou 7, caractérisé en ce que la double-hélice terminale du gène VA est altérée.
- 9. Procédé selon l'une des revendications 3,7 ou 8, caractérisé en ce que le gène VA comprend une séquence conférant un caractère inductible.
- 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ARN actif est un ARN structural.
- 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'ARN actif est un ARN interférant ou antisens.
- 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les cassettes d'expression sont contenues dans un virus recombinant, de préférence un rétrovirus recombinant, un adénovirus recombinant ou un virus recombinant épisomique.
- 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque est mise en contact avec la population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'un nombre restreint de cassettes par cellule.
- 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque d'acides nucléiques est préparée par : synthèse d'une banque d'ADN simple-brins comprenant une région aléatoire encadrée par une ou deux régions de séquence définie, synthèse d'un deuxième brin au moyen d'une ADN polymérase et en présence d'une amorce complémentaire de la séquence définie du premier brin, ou d'une partie de celle-ci, pour produire une banque d'ADN double-brins comprenant une région aléatoire, et<Desc/Clms Page number 53>clonage de la banque d'ADN double-brins dans un vecteur, sous contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III.
- 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur rétroviral, et en ce qu'il comprend en outre un étape de transfection dudit vecteur dans une lignée cellulaire d'encapsidation, pour produire une banque de rétrovirus recombinants.
- 16. Procédé de sélection in cellulo d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire disctinct, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de cellule-ci avec une population de cellules dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits rétrovirus recombinants, c) la sélection des cellules possédant le phénotype désiré, et d) l'identification de la ou des cassette (s) dans la ou lesdites cellules, ou de l'ARN actif qu'elles expriment.
- 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ADN des cassettes d'expression des cellules sélectionnées est amplifié pour produire une banque restreinte, et en ce que les étapes b) et c) du procédé sont répétées une fois au moins avec ladite banque restreinte.
- 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules animales (par exemple de mammifère), de levure, de plante, d'insecte ou bactériennes.
- 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le phénotype désiré est choisi parmi une capacité ou une incapacité de croissance, d'apoptose,<Desc/Clms Page number 54>de différentiation, de migration, de résistance à un agent toxique, de résistance à un agent infectieux, ou d'action métabolique.
- 20. Procédé selon l'une des revendication 1 à 18, caractérisé en ce que le phénotype désiré est l'expression d'une cible biologique.
- 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules infectées par un virus et le phénotype désiré est la résistance audit virus.
- 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules tumorales et le phénotype désiré est la perte de tumorigénicité.
- 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que la population de cellules comprend des cellules bactériennes et le phénotype désiré est la sensibilité à un agent toxique.
- 24. Procédé de sélection d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN aléatoire placée sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III, b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phénotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules,<Desc/Clms Page number 55>e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
- 25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel le vecteur est un virus recombinant, plus préférentiellement un rétrovirus recombinant, et/ou le promoteur transcrit par l'ARN polymérase III est un promoteur dérivé de la séquence d'un gène VA d'un adénovirus, et/ou la population de cellules comprend des cellules de mammifère.
- 26. Procédé de sélection d'ARN actifs capables de conférer à une cellule un phénotype désiré, comprenant: a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire distinct, b) la mise en contact de ladite banque ou d'une partie de cellule-ci avec une population de cellules de mammifères dans des conditions permettant l'infection desdites cellules par lesdits rétrovirus recombinants, c) la sélection des cellules possédant le phénotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules, et, de manière facultative, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
- 27. Procédé de sélection d'ARNs actifs sur une cible biologique déterminée, comprenant : a) la fourniture d'une banque d'acides nucléiques comprenant une pluralité de vecteurs comprenant des cassettes d'expression distinctes placées sous le contrôle d'un promoteur transcrit par l'ARN polymérase III et comprenant chacune une séquence nucléique codant un ARN contraint ou prédéfini pour agir sur une cible donnée,<Desc/Clms Page number 56>b) la mise en contact de ladite banque, ou d'une partie de celle-ci, avec une population de cellules exprimant ou contenant la cible biologique, dans des conditions permettant le transfert d'acide nucléique dans lesdites cellules, c) la sélection de cellules possédant le phénotype désiré, d) l'extraction ou l'amplification de la séquence de cassettes contenues dans lesdites cellules et, de manière facultative, e) le clonage des séquences obtenues en d) dans un vecteur pour générer une banque restreinte et, f) la répétition une fois au moins des étapes b) à d) avec ladite banque restreinte.
- 28. Banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression dérivée d'un gène VA d'un adénovirus exprimant un ARN structural aléatoire disctinct.
- 29. Banque d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une pluralité d'espèces de rétrovirus recombinants, chaque espèce de rétrovirus comprenant une cassette d'expression comprenant un ARN aléatoire disctinct sous contrôle du promoteur U6.
- 30. Cassette d'expression d'un ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codant ledit ARN insérée dans un promoteur dérivé d'un gène VA d'un adénovirus, ledit promoteur comprenant en outre une séquence conférant un caractère inductible.
- 31. Cassette selon la revendication 30, caractérisée en ce que la double-hélice terminale du gène VA est altérée.
- 32. Cassette selon la revendication 30 ou 31, caractérisée en ce que l'ARN est un ARN structural aléatoire ou de séquence définie.
- 33. Vecteur comprenant une cassette selon l'une des revendications 30 à 32.<Desc/Clms Page number 57>
- 34. Cellule comprenant une cassette selon l'une des revendications 30 à 32 ou un vecteur selon la revendication 33.
- 35. Composition pharmaceutique comprenant une cassette selon l'une des revendications 31 à 32, un vecteur selon la revendication 33 ou une cellule selon la revendication 34, et un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
- 36. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend un ARN actif, ledit ARN actif comprenant une séquence active insérée dans un ARN VA modifié, ledit ARN VA modifié comprenant une double-hélice terminale altérée et/ou une séquence conférant un caractère inductible.
- 37. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression d'un ARN actif identifié ou produit par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, ou un ARN actif constitué uniquement par le motif actif isolé au sein de ladite cassette.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0302633A FR2852021B1 (fr) | 2003-03-04 | 2003-03-04 | Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo |
| PCT/FR2004/000499 WO2004080378A2 (fr) | 2003-03-04 | 2004-03-03 | Methodes et outils pour le criblage d’arn actifs in cellulo |
| EP04716629A EP1599604A2 (fr) | 2003-03-04 | 2004-03-03 | Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo |
| US10/547,489 US20070122798A1 (en) | 2003-03-04 | 2004-03-03 | Methods and tools for screening active rna in cellulo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0302633A FR2852021B1 (fr) | 2003-03-04 | 2003-03-04 | Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2852021A1 true FR2852021A1 (fr) | 2004-09-10 |
| FR2852021B1 FR2852021B1 (fr) | 2007-12-07 |
Family
ID=32865224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0302633A Expired - Fee Related FR2852021B1 (fr) | 2003-03-04 | 2003-03-04 | Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070122798A1 (fr) |
| EP (1) | EP1599604A2 (fr) |
| FR (1) | FR2852021B1 (fr) |
| WO (1) | WO2004080378A2 (fr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050164210A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Vivek Mittal | Regulated polymerase III expression systems and related methods |
| DE102020211050B4 (de) | 2020-09-02 | 2022-05-19 | Volkswagen Aktiengesellschaft | Antriebseinrichtung für ein Kraftfahrzeug |
| US20220135954A1 (en) * | 2020-10-15 | 2022-05-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Nucleic acid constructs for va rna transcription |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997027309A1 (fr) * | 1996-01-23 | 1997-07-31 | Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A. | Constructions d'adn et vecteurs d'expression derives du gene de l'arn va i d'adenovirus |
| WO1998032880A1 (fr) * | 1997-01-23 | 1998-07-30 | Immusol Incorporated | Analyse fonctionnelle et decouverte de genes a l'aide de banques de vecteurs de genes de ribozymes specifiques a une cible ou bien rendues aleatoires |
| WO1999041371A1 (fr) * | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Genetrace Systems, Inc. | Utilisation de ribozymes afin d'identifier la fonction de genes |
| WO2003022311A1 (fr) * | 2001-09-13 | 2003-03-20 | Genvec, Inc. | Vecteur adenoviral, systeme correspondant et procedes de fabrication et d'utilisation |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2687411A1 (fr) * | 1992-02-13 | 1993-08-20 | Nice Sophia Antipolis Universi | Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn. |
| US5837503A (en) * | 1993-07-07 | 1998-11-17 | Universite De Nice-Sophia-Antipolis | Vector containing viral gene transcribed by RNA polymerase III and methods for use |
| EP0716692A1 (fr) * | 1993-09-03 | 1996-06-19 | Chiron Corporation | Procede de suppression de la reponse auto-immune |
| US6183959B1 (en) * | 1997-07-03 | 2001-02-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for target site selection and discovery |
| EP1554386A2 (fr) * | 2002-07-24 | 2005-07-20 | Immusol Incorporated | Systeme a un seul promoteur pour la production de cassettes d'expression d'arnsi et genotheque d'expression reposant sur l'utilisation d'un lieur en epingle a cheveux d'amorce de polymerase |
-
2003
- 2003-03-04 FR FR0302633A patent/FR2852021B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-03-03 WO PCT/FR2004/000499 patent/WO2004080378A2/fr not_active Application Discontinuation
- 2004-03-03 US US10/547,489 patent/US20070122798A1/en not_active Abandoned
- 2004-03-03 EP EP04716629A patent/EP1599604A2/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997027309A1 (fr) * | 1996-01-23 | 1997-07-31 | Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A. | Constructions d'adn et vecteurs d'expression derives du gene de l'arn va i d'adenovirus |
| WO1998032880A1 (fr) * | 1997-01-23 | 1998-07-30 | Immusol Incorporated | Analyse fonctionnelle et decouverte de genes a l'aide de banques de vecteurs de genes de ribozymes specifiques a une cible ou bien rendues aleatoires |
| WO1999041371A1 (fr) * | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Genetrace Systems, Inc. | Utilisation de ribozymes afin d'identifier la fonction de genes |
| WO2003022311A1 (fr) * | 2001-09-13 | 2003-03-20 | Genvec, Inc. | Vecteur adenoviral, systeme correspondant et procedes de fabrication et d'utilisation |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ELOIT M ET AL: "High level of transgene expression in cell cultures and in the mouse by replication-incompetent adenoviruses harboring modified VAI genes", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 71, no. 7, 1997, pages 5375 - 5381, XP002269684, ISSN: 0022-538X * |
| GWIZDEK CAROLE ET AL: "Terminal minihelix, a novel RNA motif that directs polymerase III transcripts to the cell cytoplasm: Terminal minihelix and RNA export", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 28, 13 July 2001 (2001-07-13), pages 25910 - 25918, XP002269631, ISSN: 0021-9258 * |
| ILVES HEINI ET AL: "Retroviral vectors designed for targeted expression of RNA polymerase III-driven transcripts: A comparative study", GENE (AMSTERDAM), vol. 171, no. 2, 1996, pages 203 - 208, XP002269685, ISSN: 0378-1119 * |
| MEDINA M F C ET AL: "RNA POLYMERASE III-DRIVEN EXPRESSION CASSETTES IN HUMAN GENE THERAPY", CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS, CURRENT DRUGS, LONDON,, GB, vol. 1, no. 5, October 1999 (1999-10-01), pages 580 - 594, XP001055319, ISSN: 1464-8431 * |
| YU M ET AL: "IN VITRO AND IN VIVO CHARACTERIZATION OF A SECOND FUNCTIONAL HAIRPIN RIBOZYME AGAINST HIV-1", VIROLOGY, ACADEMIC PRESS,ORLANDO, US, vol. 206, no. 1, 1995, pages 381 - 386, XP000652043, ISSN: 0042-6822 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2852021B1 (fr) | 2007-12-07 |
| WO2004080378A3 (fr) | 2005-04-21 |
| US20070122798A1 (en) | 2007-05-31 |
| EP1599604A2 (fr) | 2005-11-30 |
| WO2004080378A2 (fr) | 2004-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116590257B (zh) | VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及其用途 | |
| DE60225586T2 (de) | Sirna knockout prüfverfahren und konstrukte | |
| JP6649468B2 (ja) | 操作されたｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ９組成物及び使用方法 | |
| EP1853712B1 (fr) | Vecteurs d'expression stable et de longue duree de sirna et leurs applications | |
| JP2023027277A (ja) | Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 | |
| Sumanas et al. | Morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides in zebrafish: a recipe for functional genomics? | |
| US20040002077A1 (en) | siRNA expression system and method for producing functional gene knock-down cell using the system | |
| FR2838442A1 (fr) | Sirnas inhibiteurs de l'expression de genes responsables de l'inactivation de la p53 et leur utilisation dans le traitement des cancers | |
| EP3230451A1 (fr) | Arn guides protégés (pgrnas) | |
| EP1462525A1 (fr) | Systeme d'expression d'arnsi et procede de production de cellule knockdown a gene fonctionnel ou analogue utilisant ce systeme | |
| FR2821855A1 (fr) | Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg | |
| Takahashi et al. | Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies | |
| EP4100533A1 (fr) | Assemblage et expression d'arn à médiation par ribozyme | |
| FR2852021A1 (fr) | Methodes et outils pour le criblage d'arn actifs in cellulo | |
| US20230071834A1 (en) | Exported rna reporters for live-cell measurement | |
| FR3124522A1 (fr) | Composition et méthode permettant l’édition génomique | |
| JP4877835B2 (ja) | Ｒｎａ干渉誘導エレメント及びその用途 | |
| EP1556496B1 (fr) | Procede pour inserer un acide nucleique d interet dans une cellule procaryote ou eucaryote par recombinaison homologue | |
| FR2884522A1 (fr) | Methode d'inhibition de la traduction et/ou la replication d'une sequence d'arn par multimerisation d'une de ses regions d'arn non codant replie | |
| Carmell | The role of argonaute proteins in mammalian development | |
| WO2006006514A1 (fr) | PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D’UNE BANQUE DE VECTEURS D’EXPRESSION DE L’ARNsi |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TP | Transmission of property | ||
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20091130 |