JPH11511139A - ヒツジアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト細胞に感染可能なヒツジアデノウイルスのゲノムまたは機能的に同等な核酸配列またはその一部をコードする核酸配列、およびウイルスベクターが少なくとも一つのヒト患者の細胞に感染し感染された細胞が遺伝子を発現するような細胞において発現される遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列を含むDNA分子を含むウイルスベクターを、ヒト患者に投与することを含むヒト患者における遺伝子治療の方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒツジアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療 技術的分野 本発明は新しいヒツジアデノウイルスベクターを用いたヒトにおける遺伝子治 療の方法に関する。特に本発明は遺伝子が細胞によって機能的に発現されるよう なヒト細胞内への遺伝子の導入法に向けられている。 本分野の背景 ガン、嚢胞性繊維症、筋ジストロフィーのような病気および多くの他の疾患を 引き起こす遺伝的欠陥は、ヒトのヘルスケアのコストに多大なる寄与をしている 。従って体細胞のレベルで効果的な遺伝的治療を供給するための新しいアプロー チを開発するために世界的に主要な研究努力が行われている。 この研究の中心はレトロ、ポックス、アデノ関連性およびアデノウイルスのよ うなウイルス由来の様々な遺伝子ベクターである。これらのベクターが由来する ウイルスは低い病原性であり、ベクターはホスト細胞内に治療上の遺伝子を運ぶ ためにデザインされている。適切なコンディションの下ではこれらはホストを予 防接種し、細胞表現型を変え、免疫応答を刺激し、遺伝的欠陥を補いまたは細胞 を死へ導くことができる産物を生産し得る。 単一のウイルスベクターで全ての治療上の場面に対して望ましい全ての特質を 持つものはない。あるベクターはその生物学的性質のため特定の課題に対して他 のものよりよく適している。例えばレトロウイルスはホストのゲノム内に挿入で きるので、これらのベクターは造血細胞系列の幹細胞のような分裂している細胞 に遺伝子を運ぶのによく適している。これに対してアデノウイルスベクターは通 常そのDNAを挿入しないが、非分裂細胞に効率よく感染できる。ヒトアデノウイ ルスベクターは例えば肺、筋肉、肝臓、血管および脳細胞等のヒトおよび動物モ デルにおける様々な組織に遺伝子を運ぶために用いられている。ヒトアデノウイ ルスを使用する上での主要な不都合は、これらのウイルスは天然でヒトに感染す る ため、ヒトアデノウイルスベクターを用いて治療されたヒトが循環抗体を持って おり、ベクターが標的細胞に到達する前にそれを中和してしまい得ることである 。免疫性はまた細胞免疫系によってホスト細胞からウイルスの効率的なクリアラ ンスをも引き起こし、それによって遺伝子発現のためいかなる治療上の効果も急 速に消失してしまう。それゆえ先在する免疫系の問題を解決するために、通常ヒ トに感染しないウイルス由来のベクターを開発する必要がある。ヒツジとヒトの アデノウイルスは血清学的に別個のものであるので、ベクターとしてのヒツジア デノウイルス(OAV)の使用はこの目標を達成し得るかもしれない。免疫応答がよ り厳しくなく、遺伝子発現がより許容されやすいために、ホスト細胞におけるそ の存在が隠されているベクターを開発することも本質的なことである。ヒツジア デノウイルスはほとんどの非ヒツジ動物細胞においてでさえ生産的に複製されな いので(1)、ヒト細胞に感染できたとしてもそこにおいて複製不能であると期待 された。早期の段階で複製がブロックされることは感染された細胞においてウイ ルス産物の最小限の発現を導き、結果として細胞の免疫応答の低レベル誘導を引 き起こすであろう。 本発明はヒツジアデノウイルスOAV287由来のアデノウイルスベクターを開発し た。それら由来のウイルスおよびウイルスベクターはCommonwealth Scientific and Industrial Research Organisationの名の下で1995年7月26日に提出された 国際特許出願番号WO96/03508に十分に記述されている(以下では「PCT出願」として 示し、参考としてここで取り込まれる)。PCT出願で開示されたアデノウイルスベ クターは様々な非ヒト細胞特にヒツジ細胞内に外来DNAを導入するためのベクタ ーとしての使用に適していると発見された。OAV287のゲノム配列および配置は国 際特許出願番号WO91/11525およびWO94/26914に記述されたイヌアデノウイルス、 国際特許出願WO95/16048に記述されたウシアデノウイルスおよびトリCELO単離物 (2)を含むあらゆる既知のヒト、動物およびトリアデノウイルスとも異なってい る。OAVはまた血清学的にも別個であり(1)、血清ヒトAd5によっても中和されな い。これはヘキソン、ペントンおよび繊維状抗原における特徴的なアミノ酸配列 に一致する。他の既知のアデノウイルスと比較して、OAVのキャプシドタンパク 質には他の主要な差異も存在する。OAVはキャプシドタンパク質同族体ＶおよびI Xを欠いて いるが、少なくとも2つの他の構造タンパク質を含む(3)。OAVと他のアデノウイ ルス間の低い核酸配列相同性のため、感染性組換えウイルスを形成するためにホ スト内に共感染する間にOAVともう一つのアデノウイルス間で組換えを起こす機 会はほとんど存在しない。 ヒトの遺伝子治療に対してOAVベクターを使用することについて決定的なこと は、OAVが現実にヒト細胞に入ることができるかどうかという問題である。ヒト 細胞内へのヒトアデノウイルスの侵入は繊維状およびペントンベースタンパク質 における特異的なアミノ酸配列が関与する二段階の工程経由で生ずる(4,5)。第 一にウイルスはウイルスの表面から突き出た三量体繊維状タンパク質経由で未同 定の表面受容体に付着する。第二に繊維状スパイクの基部でペントンタンパク質 複合体の部分を形成するα_vβ_vクラスインテグリンおよびArg/Gly/Asp(RGD)トリ ペプチド間の相互作用が(最初に)生ずる。それからウイルスはエンドサイトーシ スによって細胞内に取り込まれる。ヒツジアデノウイルスOAV287繊維状タンパク 質の細胞結合ドメインは比較的小さく、そのヒトアデノウイルス同族体に対して 完全に異なる配列を持つ。それが異なる一次受容体に結合することはほぼ確かで あろう。ヒトアデノウイルスと比較してOAVペントンタンパク質は決定的なRGDモ チーフおよび側面の配列も欠いている(3)。それゆえOAV287を含むOAVがヒト細胞 に感染しうるかどうかは未知であったし予想され得ることもなかった。 本発明はその細胞付着タンパク質における主要な差異にも関わらず、ヒツジア デノウイルスOAV287由来のベクターが全てではないが様々なヒト細胞系に感染し 得るという驚くべき発見をなした。この発見はヒト遺伝子治療ベクターとしての OAVの使用を可能にする。 発明の開示 第一の面として、本発明はヒツジアデノウイルスのゲノムまたは機能的に同等 な核酸配列またはその一部をコードする核酸配列、およびウイルスベクターが少 なくとも一つのヒト患者の細胞に感染し感染された細胞が遺伝子を発現するよう な細胞において発現される遺伝子を含む少なくとも一つの核酸配列を含むDNA分 子を含むウイルスベクターを、ヒト患者に投与することを含むヒト患者における 遺 伝子治療の方法にある。 本発明の好ましい実施態様として、ヒツジアデノウイルスのゲノムはOAV287ま たはそれから由来した核酸分子である。 細胞内で実質的に全くウイルスの複製が生じないのが好ましい。また細胞内で 実質的に全く早期のまたは後期の遺伝子発現が生じないのがより好ましい。 ここで用いられている「機能的に同等な核酸配列」なる語は、DNAコードにお ける縮重のため天然のヒツジアデノウイルスとは実質的に異なる生物学的活性を 持つウイルスを引き起こさないヒツジアデノウイルス配列における少量のバリエ ーションを企図している。コードされたアデノウイルスタンパク質は天然のウイ ルス配列から改変されたアミノ酸配列を持ち得るが、天然のウイルスタンパク質 と実質的に同じ生物学的活性を維持すべきである。これはウイルスを実質的に改 変しない範囲で挿入、欠失および保存的であれ非保存的であれ置換のような配列 内の様々な変化によって成し遂げられよう。 遺伝子は機能的な分子をコードするいかなる核酸配列としても定義される。遺 伝子はガン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子であるかもしれないし、アンチセンスまたは リボザイムRNA、酵素をコードする遺伝子、サイトカインまたは他の免疫調節高 分子をコードする遺伝子、組換え抗体をコードする遺伝子、細胞溶解性ペプチド をコードする遺伝子、ワクチン抗原をコードする遺伝子、体細胞における遺伝的 欠陥を相補する高分子をコードする遺伝子または細胞を死に導くプロセスを触媒 する高分子をコードする遺伝子を含む治療上の高分子をコードするであろう。細 胞死は遺伝子発現の結果として直接的に、発現された外来高分子に対する免疫応 答の結果として間接的に生ずるであろう。好ましくは遺伝子はヘルペスウイルス チミジンキナーゼまたはプロドラッグを代謝する非哺乳動物シトシンデアミナー ゼをコードし、より好ましくは遺伝子は原核生物プリンヌクレオシドホスホリラ ーゼをコードする。適切なプロドラッグの存在下で、感染細胞による遺伝子の発 現およびプロドラッグの代謝は細胞を死に導く毒性産物を引き起こす。 本発明の第一の面のさらに好ましい実施態様として、ウイルスベクターは遺伝 子が望ましい標的細胞内でのみ発現するような遺伝子と意義深くリンクした細胞 特異的プロモーターを含む。該プロモーターは本分野でよく知られている。例え ば前立腺ガンの治療に対して、プロモーターはプロバシン、前立腺特異的抗原(P SA)または前立腺特異的膜抗原(PSMA)から由来したプロモーターを含むグループ から制限されることなく選択され得る。同様に胸部ガンに対しては、erbB-2プロ モーターが有用であろう。肺のような他のガンに対しては、ガン胎児性抗原(CEA )プロモーターが用いられ得る。 本発明の第一の面のより好ましい実施態様はウイルスベクターOAV211である。 第二の面として本発明は、本発明の第一の面にしたがったヒツジアデノウイル スベクターが修飾されたアデノウイルスゲノムの一つ以上のコード領域を持つ遺 伝子治療の方法にある。修飾は好ましくはウイルスの改変されたコートタンパク 質を引き起こす。より好ましくは改変されたコートタンパク質は繊維状、ヘキソ ンおよびペントンベースタンパク質から成るグループより選択される。 修飾は好ましくは特異的なヒツジアデノウイルスDNAを他の動物またはヒトア デノウイルス由来の同等なコード領域で置換することを含む。 ヒトアデノウイルス5/lacZ型組換え体はCSL503細胞に感染できる。それゆえAd 5ペントンおよび繊維状タンパク質由来の細胞結合ドメインを、CSL503細胞にお いて複製するハイブリッドOAVの能力を維持したままOAVタンパク質のその領域で 置換することは可能である。該ハイブリッドウイルスはヒト細胞において未だ複 製不能であろう。例えばヒツジアデノウイルス繊維状タンパク質の細胞結合ドメ インをヒトまたは動物アデノウイルス由来の同等なドメインで交換することは、 ハイブリッドOAVが天然のOAVと比較して細胞の異なるスペクトルに感染すること を可能にする。同様にヒトアデノウイルス由来のペントンベースRGDモチーフま たは動物アデノウイルス由来の同等の領域を運ぶハイブリッドヒツジアデノウイ ルスは、きっと野生型OAVより広い様々なヒトおよび動物細胞に侵入することが できるだろう。繊維状およびペントンの両タンパク質修飾を運ぶハイブリッドヒ ツジアデノウイルスは、非ヒツジ細胞におけるヒツジアデノウイルスの複製不能 性質を維持したまま、きっと細胞結合配列が由来するアデノウイルスとして同じ スペクトルの細胞に効率よく結合し侵入するであろう。 本発明の第二の面のより好ましい実施態様は、ウイルスベクターOAV206/Ad5f およびOAV206/Ad5pである。さらに好ましい実施態様として、OAV206/Ad5fおよび OA V206/Ad5p由来の両修飾を運ぶウイルスベクターである。 本発明のウイルスベクターは10⁴から10¹⁴好ましくは10⁶から10¹⁰のml当たりの プラーク形成ユニットの濃度で局所的に、経口的にまたは注射により投与される 。投与量および投与経路は必要とされる治療に依存するであろうことが認められ よう。 第三の面として本発明は本発明の第一および第二の面の方法における使用のた めのワクチンにある。 本発明の性質をより明らかに理解し得るために、以下の実施例および図面を参 考として好ましい形態が記述されるであろう。 図面の簡単な説明 図1はpOAV206プラスミドのマップおよびHCMVプロモーターからのVP7sc抗原を 発現する相当する組換えウイルスを示す。 図2はOAV206を用いた様々な細胞タイプの感染に引き続くHCMVプロモーターか らのVP7scレポータータンパク質の発現を示す。(A)CSL503ヒツジ肺およびヒト胸 部MCF7細胞、(B)ヒト前立腺PC3とLNCaPおよび胸部T47D2、(C)ヒトMM418Eメラノ ーマおよびMRC5肺細胞。(U)および(I)はそれぞれ非感染と感染細胞を示す。(D) ではCSL503,PC3およびウサギ腎細胞がOAV MLP/TLSからVP7scを発現するOAV204を 用いて感染された(「PCT出願」参照)。 図3はOAV配列(アンダーライン)およびAd5細胞結合ドメインの間の接合部でOAV 206/Ad5fにおけるハイブリッド繊維状タンパク質のアミノ酸配列を示す。 図4はAd5RGDモチーフの挿入に引き続くOAV206Ad5pにおける修飾されたペント ンタンパク質のアミノ酸配列を示し、アンダーライン残基はOAVとAd5配列の間の 接合部を示す。 図5はプロドラッグ6MPDRの存在下でin vitroで(A)T47D2および(B)McF7胸部ガ ン細胞を用いた、OAV211を用いた感染の代謝活性に対する効果を示す。 図6はOAV206またはOAV206Ad5fを用いた感染に引き続くLNCaPおよびMCF7細胞に おけるVP7scの発現を示す。(U)は非感染細胞を示す。時間は感染後の時間(hour) を示す。 図7は(A)ペントン、(B)ヘキソンおよび(C)GAPDH遺伝子に対するRNA転写のRT-P CRによる分析を示す。RNAサンプルは非感染(点で示されている)および感染細胞 から指示された時間で調製された。ペントン転写産物は全ての細胞タイプから24 および48時間で分析された。ヘキソン転写産物は示された時間で分析された。 図8は様々な細胞タイプにおけるOAVゲノムの極端な右腕末端に位置するプロモ ーターから由来した転写産物のRT-PCR分析を示す。RNAは示された時間で回収さ れた。 発明を実施する方法 方法 感染性プラスミドの構築 DNA配列の操作およびプラスミドの修飾の技術は、本分野でよく知られておりS ambrook等(7)のような出版物に記述されている。プラスミドpOAV100は以前に記 述されているように(PCT出願)HindIIIおよびSmaＩサイト間の配列を取り除くた めに修飾されているBluescript M13-(Stratagene)のKpnＩ内に、OAV287ゲノムの フルレングスコピーをクローニングすることによって構築された。pOAV100は829 2位でOAV287の野生型配列に存在するSphＩサイトを欠いている。さらにpOAV100 はMuta-gene Phagemid(Biorad Labs,Ca)またはAlteredサイトII(Promega,Wi)ミ ュータジェネシスキットを用いて、pVIIIおよび繊維状遺伝子の間の位置のゲノ ムの22,129と22,130核酸の間のApaＩおよびNotＩサイトを含む20の核酸配列の挿 入によって修飾された。結果として生じたプラスミド、pOAV200はApaＩ/NotＩサ イトを用いたOAV287ゲノム内に挿入される遺伝子発現カセットのためのアクセプ ターであった。例えばHCHV/VP7scプロモーター/遺伝子カセットは別々のプラス ミドで組み立てられ、プラスミドpOAV206を形成するためにApaＩ/NotＩ側面サイ トを用いてpOAV200内に取り込まれた。 修飾された繊維状タンパク質を運ぶウイルスOAV206/Ad5fは、以下のように構 築された。OAV繊維状タンパク質のC末端で提案された細胞結合ドメインを修飾す るために、OAV287ゲノム配列の21,527-28,644ベース由来のSphＩ/SalＩ断片をSp hＩ/SalＩカットプラスミドpAlter-1(Promega)内にサブクローン化した。ミュー タジ ェニックオリゴヌクレオチドおよびAlteredサイトII(Promega,Wi)ミュータジェ ネシスキットを、配列の23,454および23,894位でNcoＩおよびCelIIサイトをそれ ぞれ導入するために用いた。NcoＩとCelIIサイトを取り込んだオリゴヌクレオチ ドプライマーを、Ad5細胞結合ドメイン(5)をコードする32,156および32,776核酸 位間のヒトアデノウイルス5型ゲノムの同等な部分をPCR増幅するために用いた。 PCR断片をNcoＩとCelIIを用いて切断し、OAV配列を置換するためにNcoＩ/CelII カット組換えpAlter-1プラスミド内にクローン化した。それから修飾繊維状タン パク質遺伝子を含むAgeＩ/SalＩ断片を、プラスミドpOAV206/Ad5fを作出するた めにAgeＩ/SalＩカットプラスミドpOAV206内にサブクローン化した。作出された 修飾タンパク質の配列は図3に示されている。 ペントンタンパク質を修飾するために、ペントン遺伝子を含むOAV287の13kb X maＩ/SphＩ断片(9,224-21,527ベース)をXmaＩ/SphＩカットpAlter-1内にサブク ローン化し、12,654および12,674位でAatIIおよびXhoＩサイトをそれぞれ導入す ることによってミューテートした。これらの制限サイトを含むミュータジェニッ クオリゴヌクレオチドプライマーを、ヘリックスループヘリックスモチーフ(8) を含むヒトAd5ペントン遺伝子の同等な部分をPCR増幅するために用いた。他のア デノウイルス由来の同等な配列も用いられ得た。この断片(279bp)をOAV配列を置 換するためにミューテートされたAatII/XhoＩカットpAlter-1プラスミド内にサ ブクローン化した。それからXmaＩ/SphＩ断片を潜在的な感染性プラスミド、pOA V206/Ad5pを構築するために、XmaＩ/SphＩカットpOAV206内にサブクローン化し た。このプラスミドは修飾ペントンタンパク質を運ぶウイルス(OAV206/Ad5p)を 回収するために用いられ得る。ハイブリッドペントンタンパク質配列の派生体は 図4に示されている。 PSA/PNPアーゼ/ポリAカセットを含む組換えウイルス、OAV211は以下のように 構築された。620bpPSAプロモーター断片をPCR増幅によって白血球DNAから単離し 、pGem-Tベクター(Promega Corp,Madison,WI)内にサブクローン化した。同様に 、大腸菌DeoD遺伝子(Genbank Accession Number M60917)をGenbank配列の105お よび849ベースでSpeＩおよびBamHＩをそれぞれ導入し、それらの酵素で切断した PCRプライマーを用いてゲノムDNAから増幅した。SV40ポリアデニル化シグナルを 含む5 13bp断片を、BamHＩおよびSalＩを用いてpJC119(9)を切断することによって調製 した。この断片をSpeＩおよびSalＩを用いてカットしたpGem/PSAベクター内にDe oDPCR断片を用いた三方向ライゲーションによってクローン化した。それからPSA /PNPアーゼカセットをXbaＩおよびSalＩを用いて摘出し、SpeＩおよびSalＩを用 いてカットしたアデノウイルス5型ベースプラスミドpXCX3内にサブクローン化し た。(pXCX3はKpnＩSpeＩEcoRＶBglIISalＩおよびサイトを含むポリリンカーをXb aＩサイト内にクローニングすることによってpXCX2(10)から由来した)。これら からカセットはpOAV211を形成するために、pOAV200のApaＩ/NotＩサイト内にpGe m11zf+経由でサブクローン化した。 ウイルスの回収 KpnＩを用いたpOAV100,pOAV200およびpOAV206/Ad5fの切断は、直線状のOAV287 または修飾されたウイルスゲノムを放出した。これらをリポフェクトアミン(Gib coBRL)および以前に記述された方法(PCT出願)を用いてCSL503細胞にトランスフ ェクトした。成育可能なゲノムはこれらのコンディションの下でCSL503細胞にお いて感染性であり、ウイルスが生産され、細胞に対して細胞変性効果を引き起こ した。しかしながらpOAV206およびpOAV211はKpnＩ切断無しで回収された。フリ ーゲノム末端が回収のため必要であると一般的に考えられていたので(11,12)、 これにはいくぶん驚かされた。回収されたウイルスをそのゲノム構造が正しいこ とを確認するために制限酵素切断によって特性指摘した。代わりにOAVのDNA-Ter minalタンパク質複合体を、ヒトAd5(13)に対して記述されているようにTi80ロー ターで20-22時間40,000rpmで4Mグアニジン-HCl/2.5MCsClを含む勾配で遠心分離 して調製した。感染性ウイルスのような大きなプラスミドの回収は、例えばBglI I/StuＩを用いた切断の後、それらをOAVDNA末端タンパク質複合体の断片と共にC SL503細胞内でコトランスフェクトすることによって改良しうるであろう。 細胞の感染、RT-PCR分析および抗原の発現 CSL503ヒツジ肺、ウサギ腎臓およびヒト細胞系を偽感染しまたは以前に記述さ れているように(14)20pfu/細胞の非常に多くの感染でウイルスを用いて感染した 。 感染は細胞系に依存して12-96時間行われることを許容した。標準的な方法を用 いてポリアデニル化RNAを〜10⁷細胞から調製した。トータルcDNAをオリゴ(dT)を プライマーにしてまたは特異的なプライマーでAMV逆転写酵素を用いて合成した 。ｃDNAを興味ある遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRによって増幅し、ア ガロースゲル上で分析した。タンパク質発現を分析するため、新しく合成された タンパク質をラベルするための35S-メチオニンの存在下で細胞をメチオニンフリ ー培地でインキュベートした。興味あるタンパク質を、発現されたタンパク質に 対する特異的な抗血清を用いて(14)免疫沈降法によって細胞溶解物から回収した 。回収されたタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し 、オートラジオグラフィーまたはPhosphorimager(Molecular Dynamics)を用いて 検出した。 結果 OAV287ウイルスのホストの範囲は未知であるが、ウイルスがウサギ腎臓、ウシ (MDBK)およびサル(CV-1)細胞(1)においては成長しないため、主にヒツジ細胞に 制限されていると考えられる。生産的なウイルス感染はヒツジ肺細胞(CSL503系) においてのみ本発明で観察されており、ウシ鼻甲介細胞系で非常にわずかな量見 受けられた。 ヒツジアデノウイルスは異種の細胞においては生産的に複製しないので、ウイ ルスが細胞に侵入したが複製の早期の段階でブロックされたのかどうか、または ウイルスが全く侵入しなかったのかどうかを決定することは容易なことではない 。この問題を調べ、ヒツジアデノウイルスのホスト範囲を決定するために、本発 明はロタウイルスVP7sc抗原と機能的にリンクしたヒトサイトメガロウイルスIE9 4(HCMV)エンハンサー/プロモーターエレメントおよびポリアデニル化シグナル(P CT出願)を運ぶ組換えウイルスOAV206を用いた。発現カセットをpVIIIおよび繊維 状タンパク質(図１)をコードする遺伝子の間でヒツジアデノウイルス内に挿入し た。このウイルスを様々なヒト細胞に感染させるために用い、VP7scタンパク質 の発現をラジオラベルされたタンパク質の免疫沈降法によってモニターした。VP 7sc発現が2つの胸部細胞系(T47D2およびMcF7),1つの前立腺ガン系(PC3)およびヒ ト肺繊維 芽細胞系MRC5において検出されたことは明らかである(図2A,BおよびC)。それゆ えその独特の細胞接着タンパク質にもかかわらず、OAV206はこれらの細胞に感染 した。感染は効率的でもあった。McF7細胞においては、例えばわずかに20のMOI で細胞の〜30-50％が免疫蛍光法によって示されるようにVP7scを発現した。しか しながら全てのヒト細胞系が感染されたわけではない。VP7sc発現はヒトメラノ ーマ細胞系MM418Eまたは前立腺細胞系LNCaPでは検出されなかった。後者の結果 は前立腺PC3細胞系は効率的に感染されるために驚くべきことだった。 OAV211による細胞殺傷 OAV211はPSA/PNPアーゼ/SV40ポリAカセットを含む。このPSAプロモーター断片 は組織特異的態様で発現されず、CATレポーター遺伝子を用いたアッセイで示さ れるように、いくつかの細胞タイプで比較的低い活性しかもたない。PNPアーゼ はプロドラッグ6-メチル-プリン-2'-デオキシリボヌクレオシド(6MPDR)を細胞に とって毒性である毒性産物6MP(15)に代謝する酵素である。ヒト前立腺PC3および 胸部ガン系細胞McF7およびT47D2を10のMOIでOAV211を用いて感染させた。他の細 胞は非感染のままであった。感染および非感染の両者を20日までの期間0-100μM 6MPDRの存在下でインキュベートした。細胞における代謝活性をAlamar Blue(Ala mar Biosciences Inc.,Sacramento.CA.)を用いてモニターした。OAV感染はPC-3, McF7およびT47D2細胞では感染後13日で検出可能な効果はなかった。プロドラッ グ(0-100μM)はT47D2細胞では効果がなかった(図5A)。ほとんどの細胞が薬剤を 除去すると回復したが、McF7細胞は代謝活性がいくらか減少を示した(図5B)。し かしながら50-100μM6MPDRの存在下でOAV211を用いた感染に引き続いて、PSAプ ロモーター断片がこれらの細胞で低いレベルの活性しかもたないという我々の最 近の研究が明らかにした事実にもかかわらず、両胸部ガン細胞系を感染後13日で 殺傷した。同様の結果は前立腺PC3細胞系を用いても得られた。OAVベクターが特 定のヒトガン細胞に感染し得るという証明は、それらを酵素-プロドラッグ治療 の輸送において有用なものにさせる。細胞殺傷において考慮すべき改良が、より 強いプロモーターを用いることで期待され得る。アラビノフラノシル-2-フルオ ロアデニン(Fludarabine)のような他の化合物もまたPNPアーゼに対する基質とし て用いられ得る。 OAVの改変された細胞親和性 繊維状タンパク質の先端の細胞結合ドメインは、細胞表面の未知の受容体との アデノウイルスの最初の付着部位である(5)。このドメインを変えることによっ て、もし三量体繊維状タンパク質の完全性が維持されるならば、アデノウイルス の細胞親和性を改変することがきっと可能であろう。OAVの繊維状タンパク質上 の細胞結合ドメインを、図3に記述されているようにヒトアデノウイルス5型由来 の同等な領域を用いて変換した。OAV206Ad5fウイルスをCSL503細胞内への相当す るプラスミドのトランスフェクションに引き続いて回収した。ウイルスOAV206お よびOAV/Ad5fを、ヒトLNCaPおよびMcF7細胞を感染させるために用いた。VP7scの 発現をウイルスが細胞内に侵入したかどうかの指標として感染の12,24および48 時間後にこれらの細胞でモニターした。偽感染細胞は感染後24時間でモニターし た。図2Aおよび2Bのデータで一貫しているが、OAV206はVP7sc発現に示されるよ うにMcF7には感染できたがLNCaP細胞には感染できなかった(図6,レーン2-4およ びレーン8,10および11)。しかしながらOAV206Ad5fはLNCaPおよびMcF7細胞の両方 に感染し、VP7scを効率よく発現した(図6,レーン5-7およびレーン12-14)。(これ らの細胞タイプにおけるVP7scのサイズの差異は、タンパク質に付着した炭水化 物の差異を反映している(14))。それゆえAd5f由来のものにOAV繊維状タンパク質 の細胞付着ドメインを変換することは、OAV206/Ad5fがOAVでは感染できないヒト LNCaP細胞に感染することを許容した。他のアデノウイルスから細胞結合ドメイ ンを選択することによって、特定の細胞タイプに感染するOAVの能力を変化させ ることが可能であろう。図4に記述されているようにペントンタンパク質におい て配列を変化させることによっても、OAVの細胞親和性をさらに明確にすること が可能であろう。ハイブリッドウイルスはその複製不能な性質を維持し続けるで あろう。 これらのデータはヒツジアデノウイルスがある細胞には侵入できるが、全ての ヒト細胞タイプに侵入できるわけではなく、活性なプロモーターから外来遺伝子 を発現しうることを明らかに示す。ウイルスによって運ばせるプロモーターおよ び発現カセット中の遺伝子を変えることは可能である。例えばプロバシン(15)ま たはPSMA(17)のような前立腺特異的プロモーター、ある胸部ガンで特異的に活性 なerbB-2プロモーターまたは腫瘍特異的CEAプロモーターを、酵素/プロドラッグ 系によって特的な細胞殺傷を達成するために用い得る。他の組織に適して活性な プロモーターも適切なように用い得る。輸送し得る遺伝子には、ガン遺伝子また は腫瘍抑制遺伝子またはアンチセンスあるいはリボザイム(触媒性)RNA、サイト カインおよび他の免疫調節タンパク質、ワクチン抗原、細胞を死に導くプロセス を触媒するタンパク質および体細胞における遺伝的欠陥を相補する他のものをコ ードする治療上の遺伝子が含まれる。OAVおよびその組換え誘導体は異種細胞に おいては生産的に複製しないので、それらは非標的細胞へのウイルスの拡大の危 険なく、ホストに対する最小限の副作用のみで遺伝子の輸送と発現を許容する。 OAVプロモーター機能の分析 感染に引き続いて、OAVゲノムはあるヒト細胞においてかなりの時間ほとんど 検出可能な効果なく生き残り得る。例えばPC3細胞は20のMOIでOAVを用いて感染 され、3週間までの期間カルチャーを維持する。この期間中細胞は非感染PC3細胞 と比較して最小限の表現型変化しか示さない。感染後三週間でPC3細胞からDNAを 抽出し、その一部をPCRによって増幅した。ウイルスゲノムは未だ検出可能であ り、それが生き残っていることを示した。これと比較してLNCaP細胞を使用した 場合、ウイルスゲノムは感染後2-5日で既に検出不能であった。LNCaP細胞はOAV によって感染されないので、これはゲノムがPC3細胞内で生き残るに違いないこ とを示し、感染がほとんど影響しなかったことを確認する。ゲノム持続性および 細胞生存性はOAVプロモーターの不活性なために生じ、結果としてウイルスタン パク質の合成の欠如のためであろう。ヒトアデノウイルスベクターにおいては、 残余のMLP機能が免疫応答を刺激する高い免疫原性ウイルスキャプシドタンパク 質の低レベルの合成を引き起こすので、この結果は遺伝子治療のために有利であ ろう。それは細胞免疫系によってウイルスのクリアランスを引き起こすので、こ れは望ましくない。非複製許容細胞におけるOAVゲノムの持続性は、きっと継続 して治療上の遺伝子発現を許容するであろう。 OAV感染細胞におけるプロモーター活性は、ラジオラベルタンパク質への³⁵[S] メチオニンを用いた細胞のインキュベーションによって間接的に最初に調べられ た。MLP/TLS/VP7scカセットを運ぶ組換えウイルス(OAV204)は、CSL503細胞にお いてVP7scを容易に発現するが(PCT出願)、ウサギ腎細胞またはヒト前立腺PC3細 胞(図2D)においてはそれを発現しなかった。ヘキソン,繊維状タンパク質および ペントンのような後期ウイルスタンパク質の合成もまた、複製許容CSL503では容 易に検出できたが、これらの細胞においてはラジオラベルによって検出できなか った。 CSL503および非ヒツジ細胞におけるプロモーター機能のより感度のよい研究で は、RNA転写産物を探すため逆転写およびPCRを用いて実施された。トータルポリ アデニル化RNAをOAV206を用いた感染後(MOI20pfu/細胞)様々な時間でCSL503,PC3 ,MRC5,McF7,T47D2,RK15およびLNCaPから調製した。オリゴ(dT)をプライマーにし て、cDNAを逆転写酵素を用いて合成した。それから選択したcDNAをTLSのエキソ ン2由来の5'プライマー(PCT出願)および興味ある転写産物と相補的な3'プライマ ーを用いて増幅した。ペントンおよびヘキソンに対するPCR産物(それぞれ606お よび740bpのサイズと期待される)を、OAV206感染細胞から増幅したが、感染後24 および48時間で集められた非感染CSL503細胞RNAからはしなかった(図７)。期待 されたサイズの産物はまた、繊維状タンパク質およびIIIa転写産物からも増幅さ れた。しかしながらヘキソンおよびペントンPCR産物は、いかなるヒトまたは動 物細胞系由来のRNAをRT-PCRで分析しても検出可能に増幅されなかった(図７)。 予想される産物は全てのサンプルでハウスキーピング酵素GAPDHに対して増幅さ れた。それゆえOAVMLPは、非ヒツジ細胞においては検出可能に機能しなかった。 これはこれらの細胞タイプでの複製不能の理由を十分に説明する。 同様な観察は、早期プロモーター由来の転写産物に対してもなされた。未知の 機能のオープンリーディングフレームのグループ(仮にPCT出願でE3?領域として 名付けられた)が、ゲノムの極端に右腕末端に位置づけられている。RT-PCRと26, 700および29,220位で始まるプライマーを用いて、〜750および〜550bpの産物をO AV感染細胞から単離したポリアデニル化RNAから増幅したが、非感染CSL503細胞 からはしなかった(図８)。〜2,500bpの産物もまた感染後48時間で検出された。 これを複製されたゲノムDNAから増幅した。核酸配列から、750および550bp産物 は異なる位置でのスプライシングから生産されたことが示された。それゆえこれ らのRNAは、このストランドの最初のメチオニンコドン(29,425-29,427ベース)と ゲノムの末端 の間に位置するに違いない未同定のプロモーターから右から左方向で転写される 。転写産物はRT-PCRによって感染後12時間と同じように早期に検出でき、感染後 24時間でより顕著である(図8)。同じプライマーを用いて、図7に記述されている 感染および非感染ヒトおよびウサギ細胞から調製したRNAでRT-PCRを実施した。C SL503細胞で検出されたPCR産物は、ほとんどの他のOAV感染細胞において検出さ れず(図8)、この早期のプロモーターは様々なヒトおよび非ヒツジ細胞において 検出可能に機能していないことを示す。より小さいPCR産物がMRC5細胞において 感染後96時間で検出されたが、これはプロモーターがこの時間で活性であること を示した(図8)。細胞RNAから由来した〜900bpの産物もまた見られた。しかしな がら2.5kb産物の不存在は、DNA複製がこれらの細胞で起こっていないことを示し た。このデータはほとんどの非ヒツジ細胞で早期および後期プロモーター機能が 検出できなかったことを示す。OAVは外来プロモーターから発現された遺伝子を 輸送することができるままである一方で、ある細胞では良性なベクターであると 思われる。 OAV287組換えベクターが動物に感染し、それらの動物の細胞に外来ゲノムを輸 送し得ることがPCT出願に示されている。さらにOAV287由来のベクターがヒト細 胞に感染し、その細胞に治療上の遺伝子を輸送し得ることが本明細書で示されて いる。これらの結果から、ヒツジアデノウイルス由来のウイルスベクターおよび 特にOAV287由来のベクターが、ヒトに対して遺伝子を輸送するための方法におい て記述されているように機能することが認められよう。 要約すると、様々なヒト細胞系においてOAV287アデノウイルスの複製は不能で あり、検出可能なウイルスは生産されない。複製不能性は早期および後期プロモ ーター機能の欠如によって説明される。ある細胞タイプにおけるウイルスプロモ ーター活性のさらなる減少は、ヒトアデノウイルスベクターに対して示されたよ うに(21)、DNA Binding Proteinに対する遺伝子のミューテーションを導入する ことによって成し遂げられよう。ヒト細胞に感染しないが治療上の遺伝子を機能 的に発現するヒツジアデノウイルスベクターは、特にそれらはヒトアデノウイル スに対する抗体によって中和されないので、遺伝子治療における使用に対して利 点があるであろう。その独特の核酸配列のため、OAVベクターはまた、循環して いるヒトアデノウイルスとの相同的組換えを被りそうもない。 組換えヒツジアデノウイルスベクターを用いた本発明の遺伝子治療の方法は、 遺伝子治療におけるヒトまたは非ヒトアデノウイルスの使用に対して以下の利点 がある： -ウイルスベクターがヒト細胞に感染し得る: -ウイルスベクターがヒト細胞において複製欠陥がある: -ヒト細胞において低い残余のウイルスベクター遺伝子の発現しかない: -他の非ヒツジアデノウイルスとウイルスベクターの組換えはありそうにない: -ヒツジアデノウイルスに以前にさらされる可能性は低く、それゆえウイルス ベクターに対する以前に形成された抗体は存在しない。 非常に多くのバリエーションおよび/または修正が、広く記述されている本発 明の精神および範囲からそれることなく特別の実施態様において示された本発明 になし得ることは、当業者によって認められ得るであろう。それゆえ本実施態様 は全ての点で実例となり、制限するものではないと考えるべきである。 参考文献 1. D.B.Boyle等,Vet Microbiol 41,281-291(1994)。 2. S.Chiocca等,J Virol 70,2939-2949(1996)。 3. S.Vrati等,Virolory 220,186-199(1996)。 4. J.M.White,Current Biology 3,596-599(1993)。 5. L.J.Henry等,J Virol 68,5239-5246(1994)。 6. T.J.Wickham等,Cell 73,309-319(1993)。 7. J.Sambrook等,編,Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1989)。 8. P.Mathias等,J Virol 68,6811-6814(1994)。 9. J,Sprague等,J.Virol.43,369-378(1983)。 10．R.Spessot等,Virology 168,378-387(1989)。 11．K.L.Berkner,P.A.Sharp,Nuc Acids Res 11,6003-6020(1983)。 12．D.Hanahan,Y.Gluzman,Mol Cell Biol 4,302-309(1984)。 13．S.Miyake等,Proc Natl Acad Sci USA 93,1320-1324(1996)。 14．Z.Z.Xu等,J gen Virol 76,71-80(1995)。 15．E.J.Sorscher等,Gene Ther 1,233-238(1994)。 16．N.M.Greenberg等,Mol Endocrinol 8,230-239(1994)。 17．R.S.Israeli等,Cancer Res 54,1807-1811(1994)。 18．J.D.Harris等,Gene Therapy 1,170-175(1994)。 19．T.Osaki等,Cancer Res 54,5258-5261(1994)。 20．Y.P.Yang等,Proc Natl Acad Sci USA 91,4407-4411(1994)。 21．J.F.Engelhardt等,Proc Natl Acad Sci USA 91,6196-6200(1994)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月１０日 【補正内容】 請求の範囲 １．ヒツジアデノウイルスOAV287のゲノムまたは機能的に同等な核酸配列または ヒト細胞に感染可能なその一部をコードする核酸配列、およびウイルスベクター が少なくとも一つのヒト患者の細胞に感染し感染された細胞が遺伝子を発現する ような細胞において発現される遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列を 含むDNA分子を含むウイルスベクターを、ヒト患者に投与することを含むヒト患 者における遺伝子治療の方法。 ２．実質的に細胞内で全くウイルスの複製が起こらない請求項1にしたがった方 法。 ３．実質的に細胞内で全く早期または後期ウイルス遺伝子の発現が起こらない請 求項1にしたがった方法。 ４．遺伝子がガン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスまたはリボザイムRNA 、酵素をコードする遺伝子、サイトカインまたは他の免疫調節高分子をコードす る遺伝子、組換え抗体をコードする遺伝子、細胞溶解性ペプチドをコードする遺 伝子、ワクチン抗原をコードする遺伝子、体細胞における遺伝的欠陥を相補する 高分子をコードする遺伝子および細胞を死に導くプロセスを触媒する高分子をコ ードする遺伝子より成るグループから選択されたものである請求項1から3のいず れか一つにしたがった方法。 ５．プロドラッグの存在下で感染された細胞がプロドラッグを細胞を死に導く毒 生産物に代謝するような、プロドラッグを代謝する酵素を遺伝子がコードする請 求項4にしたがった方法。 ６．遺伝子が原核生物のプリンヌクレオチドホスホリラーゼ(PNPアーゼ)をコー ドし、プロドラッグが6-メチル-プリン-2'-デオキシリボヌクレオシド(6MPDR)で ある請求項5にしたがった方法。 ７．遺伝子が望ましい標的細胞においてのみ発現するように、遺伝子と意義深く リンクした細胞特異的プロモーターをウイルスベクターが含む請求項1から6のい ずれか一つにしたがった方法。 ８．細胞特異的プロモーターがウサギプロバシン、ヒトPSA、PSMA、erbB-2また はCEAプロモーターから成るグループより選択されたものである請求項7にしたが った方法。 ９．標的細胞が前立腺または胸部ガン細胞である請求項8にしたがった方法。 10．ウイルスベクターがOAV211である請求項1から9のいずれか一つにしたがった 方法。 11．ヒツジアデノウイルスベクターが修飾されたアデノウイルスゲノムの一つ以 上のコード領域を持つ請求項1から10のいずれか一つにしたがった方法。 12．修飾がウイルスの改変されたコートタンパク質を引き起こす請求項11にした がった方法。 13．改変されたコートタンパク質が繊維状、ヘキソンおよびペントンベースタン パク質より成るグループから選択されたものである請求項12にしたがった方法。 14．修飾が特異的なヒツジアデノウイルスDNA領域を、他の動物またはヒトアデ ノウイルス由来の同等なコード領域で置換したものを含む請求項11から13のいず れか一つにしたがった方法。 15．修飾が望ましい標的細胞に対して結合特異性を持つベクターを引き起こすよ うな請求項12にしたがった方法。 16．ウイルスベクターがOAV206/Ad5fである請求項11から14のいずれか一つにし たがった方法。 17．ウイルスベクターがOAV206/Ad5pである請求項11から14のいずれか一つにし たがった方法。 18．ウイルスベクターがOAV206/Ad5fおよびOAV206/Ad5p由来の両修飾を運ぶもの である請求項11から14のいずれか一つにしたがった方法。 19．ウイルスベクターが10⁴から10¹⁴、好ましくは10⁶から10¹⁰のml当たりのプラ ーク形成の濃度で投与される請求項1から18のいずれか一つにしたがった方法。 20．ウイルスベクターが局所的に、経口的にまたは注射により投与される請求項 1から19のいずれか一つにしたがった方法。 【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３ Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｂ ６４３Ｍ 31/70 ６２３ 31/70 ６２３ 35/76 35/76 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト細胞に感染可能なヒツジアデノウイルスのゲノムまたは機能的に同等な 核酸配列またはその一部をコードする核酸配列、およびウイルスベクターが少な くとも一つのヒト患者の細胞に感染し感染された細胞が遺伝子を発現するような 細胞において発現される遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列を含むDN A分子を含むウイルスベクターを、ヒト患者に投与することを含むヒト患者にお ける遺伝子治療の方法。 ２．ヒツジアデノウイルスがOAV287である請求項1にしたがった方法。 ３．実質的に細胞内で全くウイルスの複製が起こらない請求項1または2にしたが った方法。 ４．実質的に細胞内で全く早期または後期ウイルス遺伝子の発現が起こらない請 求項1または2にしたがった方法。 ５．遺伝子がガン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスまたはリボザイムRNA 、酵素をコードする遺伝子、サイトカインまたは他の免疫調節高分子をコードす る遺伝子、組換え抗体をコードする遺伝子、細胞溶解性ペプチドをコードする遺 伝子、ワクチン抗原をコードする遺伝子、体細胞における遺伝的欠陥を相補する 高分子をコードする遺伝子および細胞を死に導くプロセスを触媒する高分子をコ ードする遺伝子より成るグループから選択されたものである請求項1から4のいず れか一つにしたがった方法。 ６．プロドラッグの存在下で感染された細胞がプロドラッグを細胞を死に導く毒 生産物に代謝するような、プロドラッグを代謝する酵素を遺伝子がコードする請 求項5にしたがった方法。 ７．遺伝子が原核生物のプリンヌクレオチドホスホリラーゼ(PNPアーゼ)をコー ドし、プロドラッグが6-メチル-プリン-2'-デオキシリボヌクレオシド(6MPDR)で ある請求項6にしたがった方法。 ８．遺伝子が望ましい標的細胞においてのみ発現するように、遺伝子と意義深く リンクした細胞特異的プロモーターをウイルスベクターが含む請求項1から7のい ずれか一つにしたがった方法。 ９．細胞特異的プロモーターがウサギプロバシン、ヒトPSA、PSMA、erbB-2また はCEAプロモーターから成るグループより選択されたものである請求項8にしたが った方法。 10．標的細胞が前立腺または胸部ガン細胞である請求項9にしたがった方法。 11．ウイルスベクターがOAV211である請求項1から10のいずれか一つにしたがっ た方法。 12．ヒツジアデノウイルスベクターが修飾されたアデノウイルスゲノムの一つ以 上のコード領域を持つ請求項1から10のいずれか一つにしたがった方法。 13．修飾がウイルスの改変されたコートタンパク質を引き起こす請求項12にした がった方法。 14．改変されたコートタンパク質が繊維状、ヘキソンおよびペントンベースタン パク質より成るグループから選択されたものである請求項13にしたがった方法。 15．修飾が特異的なヒツジアデノウイルスDNA領域を、他の動物またはヒトアデ ノウイルス由来の同等なコード領域で置換したものを含む請求項12から14のいず れか一つにしたがった方法。 16．修飾が望ましい標的細胞に対して結合特異性を持つベクターを引き起こすよ うな請求項13にしたがった方法。 17．ウイルスベクターがOAV206/Ad5fである請求項12から15のいずれか一つにし たがった方法。 18．ウイルスベクターがOAV206/Ad5pである請求項12から15のいずれか一つにし たがった方法。 19．ウイルスベクターがOAV206/Ad5fおよびOAV206/Ad5p由来の両修飾を運ぶもの である請求項12から15のいずれか一つにしたがった方法。 20．ウイルスベクターが10⁴から10¹⁴、好ましくは10⁶から10¹⁰のml当たりのプラ ーク形成の濃度で投与される請求項1から19のいずれか一つにしたがった方法。 21．ウイルスベクターが局所的に、経口的にまたは注射により投与される請求項 1から20のいずれか一つにしたがった方法。