SK61499A3 - Novel constructs and vectors for the targeted and inducible expression of genes - Google Patents
Novel constructs and vectors for the targeted and inducible expression of genes Download PDFInfo
- Publication number
- SK61499A3 SK61499A3 SK614-99A SK61499A SK61499A3 SK 61499 A3 SK61499 A3 SK 61499A3 SK 61499 A SK61499 A SK 61499A SK 61499 A3 SK61499 A3 SK 61499A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- promoter
- region
- recombinant
- gene
- recombinant vector
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 108010087614 Apolipoprotein A-II Proteins 0.000 claims description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 32
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 32
- 102000009081 Apolipoprotein A-II Human genes 0.000 claims description 22
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 229940125753 fibrate Drugs 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 11
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 229960002297 fenofibrate Drugs 0.000 claims description 6
- YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N fenofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(=O)OC(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 claims description 5
- 102000023984 PPAR alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 108091008725 peroxisome proliferator-activated receptors alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- ILPUOPPYSQEBNJ-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-phenoxypropanoic acid Chemical group OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=CC=C1 ILPUOPPYSQEBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- BMOVQUBVGICXQN-UHFFFAOYSA-N Clinofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(CC)C(O)=O)=CC=C1C1(C=2C=CC(OC(C)(CC)C(O)=O)=CC=2)CCCCC1 BMOVQUBVGICXQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100024783 Fibrinogen gamma chain Human genes 0.000 claims description 2
- HEMJJKBWTPKOJG-UHFFFAOYSA-N Gemfibrozil Chemical compound CC1=CC=C(C)C(OCCCC(C)(C)C(O)=O)=C1 HEMJJKBWTPKOJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101000733802 Homo sapiens Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 229960000516 bezafibrate Drugs 0.000 claims description 2
- IIBYAHWJQTYFKB-UHFFFAOYSA-N bezafibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(O)=O)=CC=C1CCNC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 IIBYAHWJQTYFKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229950003072 clinofibrate Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001214 clofibrate Drugs 0.000 claims description 2
- KNHUKKLJHYUCFP-UHFFFAOYSA-N clofibrate Chemical compound CCOC(=O)C(C)(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 KNHUKKLJHYUCFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108010048325 fibrinopeptides gamma Proteins 0.000 claims description 2
- 229960003627 gemfibrozil Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 3
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 claims 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 108010086049 apolipoprotein II Proteins 0.000 claims 2
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 claims 1
- 101500024172 Homo sapiens Adrenomedullin Proteins 0.000 claims 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 15
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 37
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000793406 Homo sapiens Apolipoprotein A-II Proteins 0.000 description 6
- 102100022691 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 Human genes 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- -1 αFGF Proteins 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000009716 hepatic expression Effects 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 1
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- KPSRODZRAIWAKH-JTQLQIEISA-N Ciprofibrate Natural products C1=CC(OC(C)(C)C(O)=O)=CC=C1[C@H]1C(Cl)(Cl)C1 KPSRODZRAIWAKH-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100031476 Cytochrome P450 1A1 Human genes 0.000 description 1
- 101710104049 Cytochrome P450 1A1 Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000208680 Hamamelis mollis Species 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007584 Prealbumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003524 antilipemic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002174 ciprofibrate Drugs 0.000 description 1
- KPSRODZRAIWAKH-UHFFFAOYSA-N ciprofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(O)=O)=CC=C1C1C(Cl)(Cl)C1 KPSRODZRAIWAKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- MGLDCXPLYOWQRP-UHFFFAOYSA-N eicosa-5,8,11,14-tetraynoic acid Chemical compound CCCCCC#CCC#CCC#CCC#CCCCC(O)=O MGLDCXPLYOWQRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000201 insect hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 239000003614 peroxisome proliferator Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940118846 witch hazel Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Predložený vynález sa týka oblasti biológie, konkrétne oblasti regulácie expresie génov. Opisuje konkrétne nové konštrukcie a nové vektory umožňujúce cielenú a indukovatelnú expresiu génov. Predložený vynález je použiteľný v mnohých oblastiach, najmä na tvorbu rekorabinantných proteínov, na tvorbu transgénnych zvieracích modelov, na tvorbu bunkových línii, na spresnenie testov triedenia alebo tiež v génovej a bunkovej terapii.
Doterajší stav techniky
Možnosť kontrolovať a riadiť expresiu konštitutívnych génov je veľmi dôležitá v biotechnologickom vývoji. In vitro umožňuje zlepšiť podmienky tvorby rekombinantných proteínov napríklad rozpriahnutim fázy bunkového cyklu a fázy produkcie. In vitro umožňuje tiež tvorbu bunkových línií schopných produkovať určité molekuly vo vybratých periódach. Je možné produkovať bunkové línie, ktoré riadene produkujú proteiny transkomplementujúce defektné vírusové genómy. In vitro riadený systém expresie umožňuje spresniť testy triedenia molekúl zasahujúcich do regulácie expresie génov. Regulácia expresie génov je veľmi dôležitá tiež pre terapeutický prístup ex vivo alebo in vivo, v ktorom je podstatné mať možnosť selektívne riadiť tvorbu terapeutických molekúl. Podľa aplikácii a podľa prenášaného génu je dôležité mať možnosť zacieliť do určitého tkaniva alebo do určitých časti organizmu, aby sa terapeutický účinok sústredil na určité tkanivo či časť organizmu a obmedzilo sa roznášanie a sekundárne účinky.
Cielenie sa prejavujúcich danú použití expresných typy. Z tohto špecifické promótory, ako pyruvátkinázu, vilín, GFAP, môže uskutočniť s použitím vektorov bunkovú špecifickosť. Iný prístup spočíva v signálov špecifických pre určité bunkové hľadiska promótor ľudského určitú a teda určité sa v literatúre opísali takzvané napríklad promótor génov kódujúcich promótor črevného proteínu viažuceho a-aktinu hladkého svalstva alebo albumínu.
tkanivovú
Napriek tomu, špecifickosť, iba obmedzené že tieto nie sú mastné kyseliny, promótor génu promótory majú regulovateľné, regulácie. V literatúre sa Napríklad prihláška vynálezu génov riadený tetracyklínom. 8180) opísal systém expresie opísal systém založený na (PNAS 93 (1996) 3346).
indukovatelné, neprejavujú poskytujú opísali iné komplexnejšie WO96/01313 opisuje systém
Rovnako možnosti systémy, expresie Wang a kol. (PNAS 91 (1994) pomocou RU486. Evans a kol. ekdyzónu, hmyzieho hormónu i sú tieto systémy dobre tkanivovú špecifickosť. Preto samotné riadený ; receptore Zatiaľ čo neumožňujú cielenie expresie na úrovni orgánov alebo požadovaných tkanív, ale jednoducho umožňujú indukovať alebo potláčať expresiu ubikvitárnym spôsobom. Navyše tetracyklinový systém má relatívne slabú úroveň regulácie, nižšiu ako faktor päť. Tieto systémy fungujú s hybridnými molekulami a vyžadujú kotransfekciu aspoň dvoch konštrukcii. Okrem toho využívajú heterologické systémy, čim sa riskuje tvorba imunitných reakcii.
Podstata vynálezu
Predložený vynález konkrétne opisuje nové konštrukcie umožňujúce cielenú a riadenú expresiu génov. Vynález tiež konkrétne opisuje rekombinantné vektory umožňujúce expresiu indukovateľných a hepatošpecifických génov. Vynález tiež opisuje nové promótorové konštrukcie so zlepšenou úrovňou regulácie.
Predložený vynález poskytuje prostriedok, konkrétne umožňujúci cielenú expresiu génov v pečeňových bunkách in vivo alebo in vitro a prostriedok na reguláciu tejto expresie.
Predložený vynález sa týka konkrétne použitia promótora ľudského génu apolipoproteínu AII. Apolipoprotein AII (apoAII) je jednou z hlavných vysokou denzitou (HDL). hlavne v pečeni, aj keď tiež v oblasti čreva. Ľudský (Tsao a kol., sa nachádza lipoproteinov s sa syntetizuje navrhujú syntézu
J. Biol.
Chem.
transkripcie, úrovni kb regulačné nukleotidov -903 až -680, asi 1
Zahrňuj e proteínových zložiek
Apolipoprotein apoAII jeho rozporné výsledky gén apoAII sa klonoval a sekvenoval 260 (1985) 15222). Oblasť promótora proti smeru elementy rovnako iniciačného kodónu nachádzajúce sa na ako niekoľkonásobné doplnkové miesta umiestnené na úrovni oblasti (nukleotidy -573 až -255) a blízke oblasti (-126 až -33). Optimálna expresia sa získa, ak sa jadrové faktory naviažu na blízke a vzdialené regulačné elementy promótora.
Sekvencia promótora ľudského génu apoAII, zvyšky -991 až +29 je uvedená v sekvencii SEQ ID NO.: 1.
Opačný mechanizmus regulácie promótora apoAII sa pozoroval u ľudí a u hlodavcov. V prvom prípade sa pozorovala stimulácia fibrátmi, v druhom prípade sa pozorovala inhibicia. Fibráty, často používané ako hypolipidemické činidlá, patria k chemickej rodine peroxizómových proliferantov, keďže indukujú hepatomegáliu spojenú s proliferáciou peroxizómov u hlodavcov. Ich účinok je riadený aktívnymi receptormi (PPAR: Peroxisome Proliferator Activated Receptor)/ skupinou štyroch odlišných jadrových receptorov (α, β, γ, δ) . PPAR patria k rodine jadrových hormonálnych receptorov, ktoré sa viažu na elementy špecifickej odpovede označené PPRE (Peroxisome Proliferator Response Element) . PPRE sa identifikovali v množstve génov kódujúcich enzýmy zahrnuté do dráhy β-oxidácie, u ktorých sa potvrdilo, že sú indukovateľné fibrátmi.
Predkladatel konkrétne spresnil systém expresie hepatošpecifických génov indukovatelných fibrátmi použiteľných in vitro a in vivo. Predkladatel konkrétne prvýkrát vytvoril vektor, majúci tropizmus k pečeni, umožňujúci selektívnu expresiu génov v pečeni alebo v pečeňových bunkách indukovateľnú fibrátmi. Predkladatel tiež vytvoril nové promótory odvodené z promótora ľudského génu apoAII, ktoré sú indukovatelné a majú zvýšenú silu.
Prvý predmet vynálezu spočíva v rekombinantnom vektore pre indukovateľnú a hepatošpecifickú expresiu molekuly vyznačujúcom sa tým, že obsahuje expresnú kazetu tvorenú nukleovou kyselinou kódujúcou uvedenú molekulu umiestnenú pod kontrolou promótora génu ľudského apolipoproteinu AII.
Podľa konkrétne uprednostňovaného variantu vynálezu rekombinantný vektor je vírusový vektor odvodený z adenovirusu obsahujúci v svojom genóme vloženú uvedenú expresnú kazetu.
Predkladatel významným spôsobom skutočne dokázal, že jeden takýto adenovirus umožňuje špecificky exprimovať gén v pečeni a že táto expresia je silno indukovatelná in vivo fibrátmi a že získané hladiny expresie sú porovnateľné s hladinami expresie skôr opísanými s najsilnejšími konštitutívnymi promótormi.
Hepatošpecifický charakter vírusov podľa vynálezu naznačuje, že tieto vírusy umožňujú veľmi selektívnu expresiu génu v hepatálnych bunkách in vitro, ex vivo alebo in vivo. Slabá nešpecifická expresia v iných tkanivách alebo typoch buniek sa môže tolerovať v tom prípade, keď sa pozoruje v hepatálnych bunkách veľmi silná expresia (výhodne viac ako 80% buniek exprimujúcich transgén sú hepatálne bunky, prednostne viac ako 90%). V rozpore s údajmi z doterajšieho stavu techniky, vírus podľa vynálezu neindukuje žiadnu detegovatelnú expresiu v čreve a poskytuje teda výrazne zvýšenú selektivitu. To je veľmi dôležité pre prístupy prenosu a expresie toxických génov, pre ktoré je nevyhnutná zvýšená úroveň selektivity. Inak, ako sa uviedlo, induktívne systémy opísané v doterajšom stave techniky prejavujú strednú indukovatelnosť, približne päťnásobnú. Výsledky uvedené v príkladoch ukazujú, že adenovirus podlá vynálezu je približne desaťnásobne indukovatelný. Úroveň indukovateľnosti je veľmi dôležitá pre získanie kontroly množstva uvoľnených molekúl in vivo. Je to významné najmä v prípade imunogénnych molekúl alebo molekúl schopných tvoriť zápalové reakcie. Je to zaujímavé predovšetkým pre expresiu molekúl, ktorých biologický účinok predpokladá ich zvýšené koncentrácie. Okrem toho iná významná vlastnosť vektora podľa vynálezu spočíva v získanej zvýšenej úrovni expresie. V skutočnosti, indukovateľné systémy všeobecne majú úroveň expresie strednú, dokonca slabú. Predkladáte! prekvapujúco a výhodne ukázal, že systém podľa vynálezu umožňuje získať úroveň expresie in vivo porovnateľnú s opísanou úrovňou expresie najsilnejších konštitutívnych promótorov. Systém podľa vynálezu teda prvýkrát kombinuje významné vlastnosti selektivity, indukovatelnosti a sily.
Jedno z hľadísk vynálezu teda spočíva v použití promótora ľudského génu apoAII. Iné hľadisko vynálezu spočíva v konštrukcii vektorov odvodených od adenovírusov. Vektory podľa vynálezu kombinujú významné vlastnosti prenosu génov, tkanivovej špecifickosti, indukovateľnosti a sily.
Promótor použitý vo vektoroch podľa vynálezu výhodne obsahuje regulačné elementy promótora génu apoAII. Tieto elementy sú konkrétne umiestnené na úrovni nukleotidov -903 až -680; -573 až -255 a -126 až -33 ľudského génu apoAII. Z tohto hľadiska podľa špeciálneho variantu promótor obsahuje zvyšky -911 až +29 génu apoAII (sekvencia SEQ ID NO.: 1).
Je jasné, že sa môžu použiť kratšie alebo dlhšie formy promótora. Je dôležité, aby promótor obsahoval iniciačné miesto transkripcie génu apoAII (označené +1 na SEQ ID NO. : 1) na 3' konci. Preto bude výhodnejšie, ak tento promótor nebude obsahovať prvý intrón génu apoAII, ktorý začína na nukleotide +38. Použitý fragment má výhodne 3' koniec nachádzajúci sa medzi zvyškami +5 a +35, konkrétne medzi +10 a +30 génu apoAII. 5' koniec bude výhodnejší na získanie významnej úrovne expresie v pečeni, ak sa zachová aspoň čiastočne väzbové miesto pečeňových faktorov. Toto miesto sa nachádza na úrovni nukleotidov -903 až -680. Preto výhodne použitý fragment má 5' koniec umiestnený proti smeru nukleotidu -902. Tento koniec môže byť umiestnený napríklad v oblasti -950 až -910. Inak z dôvodu klonovacej kapacity je výhodné použiť promótorovú oblasť so zmenšenou veľkosťou. Preto sa uprednostňuje použitie fragmentu, ktorého 5' koniec sa nachádza v oblasti -925 až -910.
Podľa uprednostňovaného variantu podľa vynálezu promótor obsahuje regulačné elementy umiestnené na úrovni nukleotidov -903 až -680 (alebo -903 až -720) a -126 až -33, ale nie stredné elementy umiestnené v oblasti nukleotidov -573 až -255. Použitý promótor výhodne obsahuje deléciu v oblasti nachádzajúcej sa medzi zvyškami -710 až -150. Napríklad promótor môže byť výhodne tvorený variantom sekvencie SEQ ID NO.: 1 získaným deléciou zvyškov 708-210. Konkrétne uprednostnený použitý promótor obsahuje deléciu v oblasti nachádzajúcej sa medzi zvyškami -670 a -210. Napríklad promótor môže byť výhodne tvorený variantom sekvencie SEQ ID NO.: 1 získaným deléciou zvyškov 653-210.
Výsledky uvedené v príkladoch skutočne ukazujú, že tento typ konštrukcie má zvýšenú silu a vyššiu indukovatelnosť fibrátmi natívny promótor apoAII v adenovíruse. Tieto konštrukcie sú výhodné na základe svojich regulačných vlastností, rovnako ako na základe klonovacej kapacity vektora, keďže promótorová oblasť je zmenšená.
Podlá iného spôsobu uskutočnenia adenovirusy podlá vynálezu obsahujú ako promótor variant promótora génu apolipoproteinu AII obsahujúci opakovanie motívov J. Znásobenie oblasti J umožňuje výhodným spôsobom zvýšiť indukovatelnosť promótora fibrátmi. Oblasť J je tvorená sekvenciou TCAACCTTTACCCTGGTAG (SEQ ID NO. : 2 podčiarknutá na SEQ ID NO.: 1). Nachádza sa v promótore AII na úrovni nukleotidov -734 až -716 promótora. Predkladatel teraz vytvoril rekombinantné vírusy obsahujúce promótory modifikované na úrovni oblasti J. Tieto vírusy majú konkrétne výhodné vlastnosti na prenos a expresiu génov, tak in vitro ako aj in vi vo.
Promótor obsahuje prednostne 2 až 5 motívov J. Ešte výhodnejšie obsahuje 3 motívy. Na konštrukciu týchto variantov sa opakovanie motívu J môže umiestniť na 5' konci promótora, na 3' konci promótora alebo vložiť do sekvencie promótora, prednostne na úroveň natívnej sekvencie J. Zmnoženie motívov J môže byť výhodne kombinované s takou deléciou, ako je už opísané. To umožňuje získať promótor s ešte lepšími vlastnosťami, čo sa týka výkonu a kontroly expresie génov.
Tieto rôzne konštrukcie sa môžu vytvoriť technikami molekulovej biológie známymi odborníkom. Odborník môže v sekvencii SEQ ID NO.: 1 uskutočniť rôzne delécie pomocou vhodných reštrikčných enzýmov. Delécie sa môžu tiež uskutočniť cielenou mutagenézou alebo PCR. Na druhej strane, oblasti J sa môžu umelo syntetizovať pomocou syntetizátorov nukleotidov, potom vložiť do promótora alebo fúzovať s promótorom metódou PCR alebo štiepiť a ligovať pomocou vhodných enzýmov. Tieto rôzne prístupy sú uvedené v príkladoch.
Ako už bolo uvedené, významná schopnosť vektorov podlá vynálezu vyplýva z použitého promótora, ako aj z výberu vektora. Dôkaz funkčnosti promótorov v súvislosti s adenovirusom in vivo umožňuje realizáciu týchto veľmi účinných vektorov.
Adenovírusy sú vírusy s dvojvláknovou lineárnou DNA s veľkosťou okolo 36 kb (kilobáz). Existujú rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sú trošku odlišné, ale ktoré majú porovnateľnú genetickú organizáciu. Rekombinantné adenovírusy môžu byť konkrétne ľudského a zvieracieho pôvodu. Čo sa týka adenovírusov ľudského pôvodu, môžu sa konkrétne uviesť adenovírusy triedy C, konkrétne adenovírusy typu 2 (ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) alebo 12 (Adl2). Z rôznych adenovírusov psieho pôvodu možno konkrétne uviesť všetky kmene adenovírusu CAV2 (napríklad kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). Ďalšie adenovírusy zvieracieho pôvodu sú konkrétne uvedené v prihláške vynálezu WO94/26914 zahrnutej do použitej literatúry.
Genóm adenovirusu obsahuje najmä sekvenciu obrátenej repeticie (ITR) na každom konci, sekvenciu enkapsidácie (Psi), rané gény a neskoré gény (pozri obrázok 1). Hlavné rané gény sa nachádzajú v oblastiach El, E2, E3 a E4. Z nich gény nachádzajúce sa v oblasti El sú nevyhnutné pre propagáciu vírusu. Hlavné neskoré gény sa nachádzajú v oblastiach L1 až L5. Genóm adenovirusu Ad5 bol úplne sekvenovaný a je dostupný v databázach (pozri konkrétne Genebank M73260). Takisto sa sekvenovali aj časti genómu, a dokonca celé genómy adenovirusov (Ad2, Ad7, Adl2, atď.).
Pripravili sa rôzne konštrukcie odvodené od adenovirusov obsahujúce rôzne terapeutické gény, aby sa použili ako rekombinantné vektory. V každej z týchto konštrukcii sa modifikoval adenovírus tak, aby nebol schopný replikácie v infikovanej bunke. Konštrukcie opísané v doterajšom stave techniky sú adenovirusy s deléciou oblasti El, ktorá je esenciálna pre replikáciu vírusu, na úroveň ktorej sú vložené sekvencie heterologickej DNA (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury a kol., Gene 50 (1986) 161). Inak na zlepšenie vlastností vektora sa navrhli vytvoriť ďalšie delécie alebo modifikácie v genóme adenovirusu. Mutant tsl25 obsahuje termosenzitívnu bodovú mutáciu schopnú inaktivovať DNA-väzbový proteín (DBP) s velkosťou 72 kDa (Van der Vliet a kol., 1975). Ďalšie vektory obsahujú deléciu inej oblasti esenciálnej pre replikáciu a/alebo propagáciu vírusu, oblasti E4. Oblasť E4 je v skutočnosti zahrnutá do regulácie expresie neskorých génov, stability neskorých jadrových RNA, vypnutia expresie proteínov hostiteľskej bunky a účinnosti replikácie vírusovej DNA. Adenovirusové vektory, v ktorých sú deletované oblasti El a E4, majú teda základ transkripcie a značne zníženú expresiu vírusových génov. Takéto vektory sa napríklad opísali v prihláškach vynálezov WO94/28152, W095/02697, WO96/22378. Okrem toho sa tiež opísali vektory nesúce modifikáciu na úrovni génu IVa2 (W096/10088).
V uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia vynálezu rekombinantný adenovirus je ľudský adenovirus skupiny C. Ide konkrétne o adenovirus Ad2 alebo Ad5.
Rekombinantný adenovirus výhodne použitý v rámci predloženého vynálezu obsahuje deléciu v oblasti E1 svojho genómu. Konkrétne obsahuje deléciu oblasti Ela a Elb. Ako príklad sa môžu uviesť delécie zasahujúce nukleotidy 454-3328; 382-3446 alebo 357-4020 (s odkazom ne genóm Ad5).
Podľa uprednostňovaného variantu vynálezu v rámci predloženého vynálezu použitý rekombinantný adenovirus obsahuje okrem iného deléciu v oblasti E4 svojho genómu. Delécia v oblasti E4 zasahuje skupinu otvorených čítacích rámcov. Ako príklad sa môžu uviesť delécie 33466-35535 alebo 33093-35535. Tiež sa opísali ďalšie delécie v oblasti E4 v prihláškach vynálezov WO95/02697 a EO96/22378, ktoré sú zahrnuté do použitej literatúry.
Expresná kazeta sa môže vložiť do rôznych miest rekombinantného genómu. Môže sa tiež vložiť na úrovni oblasti El, E3 alebo E4 s nahradením deletovaných sekvencii alebo navyše. Môže sa tiež vložiť do každého iného miesta mimo sekvencii nevyhnutných v cis na produkciu vírusu (sekvencie ITR a sekvencie enkapsidácie).
Rekombinantné adenovirusy sa produkujú v enkapsidačnej línii, teda línii buniek schopných komplementovať v trans jednu alebo viac funkcií deficientných v rekombinantnom adenovirusovom genóme. Jednou z týchto línií je napríklad línia 293, do ktorej bola vložená časť genómu adenovirusu. Línia 293 je línia ľudských embryonálnych obličkových buniek, ktoré obsahujú ľavý koniec genómu (asi 11-12%) adenovirusu sérotyp 5 (Ad 5) zahrňujúci ľavú ITR oblasť enkapsidácie, oblasť El, zahrňujúcu Ela a Elb, oblasti kódujúce protein pIX a časť oblasti kódujúcej protein pIVa2. Táto línia je schopná transkomplementovať rekombinantný adenovirus defektný v oblasti El, teda taký, ktorému chýba celá oblasť El alebo jej časť, a produkovať stok vírusov so zvýšeným titrom. Táto línia je tiež schopná produkovať pri permisivnej teplote (32 °C) zásobu vírusu obsahujúceho okrem iného termosenzitivnu mutáciu E2. Opísali sa ďalšie bunkové línie schopné komplementovať oblasť El, založené na bunkách karciňómu ľudských pľúc A549 (WO94/28152) alebo na ľudských retinoblastoch (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Inak línia schopné transkomplementovať viac funkcii adenovírusu sa tiež opísali. Konkrétne sa môžu uviesť línie komplementujúce oblasti El a E4 (Yeh a kol., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 1575) a línie komplementujúce oblasti El a E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Rekombinantné adenovírusu sú prevažne vytvorené vložením vírusovej DNA do enkapsidačnej línie nasledovaným lýzou buniek po dvoch alebo troch dňoch (kinetika adenovírusového cyklu sa pohybuje od 24 do 36 hodín) . Na uvedenie postupu podľa vynálezu vložená vírusová DNA môže byť úplný rekombinantný vírusový genóm, prípadne vytvorený v baktérii (WO96/25506) alebo v kvasinke (W095/03400), transfekovaný do buniek. Môže isť tiež o rekombinantný vírus použitý na infikovanie enkapsidačnej línie. Vírusová DNA sa môže tiež vložiť vo forme fragmentov, z ktorých každý nesie časť rekombinantného vírusového genómu a homologickú zónu umožňujúcu na vloženie do enkapsidačnej bunky vytvoriť rekombinantný vírusový genóm homologickou rekombináciou medzi rôznymi fragmentmi.
Po lýze buniek sa častice rekombinantných vírusov izolujú odstreďovaním v gradiente chloridu cézneho. Alternatívna metóda sa opísala v prihláške vynálezu FR96:08164 zahrnuté do použitej literatúry.
Rekombinantný vektor, majúci tropizmus k pečeni, sa môže vytvoriť z nevírusového vektora plazmidového typu, konkrétne takého, aký je opísaný v prihláškach vynálezu WO96/26720 a PCT/FR96/01414.
Ako je už uvedené, vektory podlá vynálezu umožňujú riadenú hepatošpecifickú tvorbu želaných molekúl s vysokú hladinou.
Želaná molekula je výhodne terapeutická molekula. Môže ísť o proteín alebo o nukleovú kyselinu (tRNA, antísens RNA, atď.).
Podlá uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu terapeutická molekula je proteín sekretovaný doobehu. Ako príklad sa môžu uviesť enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokiny: interleukiny, interferóny, TNF atď. (FR9203120), rastové faktory, neurotransmitery alebo ich prekurzory alebo syntetické enzýmy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atď., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atď. (WO94/25073), dystrofin alebo minidystrofín (WO93/06223), tumor supresorové gény: p53, Rb, RaplA, DCC, krev, atď. (WO94/24297), gény kódujúce faktory zahrnuté do koagulácie: Faktory VII, VIII, IX, atď. alebo tiež celok alebo časť prirodzeného alebo umelého imunoglobulínu (Fab, ScFv, atď., WO94/29446).
Na zaistenie sekrécie proteínu expresná kazeta výhodne obsahuje vhodnú signálnu sekvenciu. Môže isť konkrétne o prirodzenú signálnu sekvenciu sekretovaného proteínu, ak je funkčná v pečeňovej bunke. Môže ísť tiež o každú vhodnú heterologickú sekvenciu. Ako príklad sa môže uviesť sekvencia apolipoproteinu Al. Okrem toho kazeta všeobecne obsahuje oblasť umiestnenú na 3' konci, ktorá špecifikuje signál terminácie transkripcie a polyadenylácie. Napríklad sa používa namiesto polyA vírusu SV40. Je pochopiteľné, že výber medzi týmito signálmi je v kompetencii odborníka.
Predložený vynález sa tiež týka farmaceutickej kompozície obsahujúcej taký vektor, ako je už opísané. Farmaceutické kompozície podľa predloženého vynálezu sa môžu formulovať z hľadiska podávania, a to z orálneho, parenterálneho, intranazálneho, intravenózneho, intramuskulárneho, podkožného, intraokulárneho, transdermikálneho hľadiska podávania, atď.
Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu obsahuje vhodný farmaceutický nosič pre injikovateľnú formu. Môže isť konkrétne o roztoky soli (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogénfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý, alebo horečnatý, atď. alebo zmes týchto soli), sterilné izotonické roztoky alebo kompozície suché, konkrétne lyofilizované, ktoré po prídavku, podľa prípadu, sterilizovanej vody alebo fyziologického séra umožňujú injektovateľnú formu kompozície. Môžu sa použiť aj ďalšie prídavky ako je napríklad hydrogél. Tento hydrogél sa môže pripraviť z každého biokompatibilného a netoxického polyméru (homo alebo hetero). Tieto polyméry sa napríklad opísali v prihláške vynálezu WO93/08845. Niektoré z nich napríklad také, ktoré sa pripravujú z etylénoxidu a/alebo propylénoxidu, sú komerčné. Dávky vírusu použité na injekciu sa môžu prispôsobiť rôznym parametrom, konkrétne použitému spôsobu podávania, patológii, génu určenému na expresiu alebo tiež dĺžke liečenia. Všeobecne sú rekombinantné adenovirusy podľa vynálezu formulované a podávané vo forme dávok, ktoré obsahujú medzi 104 a 1014 pfu, prednostne 10® až 1O10 pfu. Termín pfu (plaque forming units) zodpovedá infekčnej schopnosti vírusového roztoku, ktorá je určená infekciou určitej bunkovej kultúry a následným meraním počtu plakov infikovaných buniek po 15 dňoch. Techniky určenia veľkosti pfu vírusového roztoku sú dobre opísané v odbornej literatúre.
Vektory (konkrétne adenovirusy) podľa vynálezu sú tiež použiteľné na tvorbu zvieracích modelov hepatických patológií z dôvodu svojich hepatošpecifických vlastností.
Inak sa vynález týka tiež každej bunky modifikovanej vektorom (konkrétne adenovírusom) tak, ako je už opísané. Tieto bunky sa môžu použiť na tvorbu rekombinantných proteínov in vitro. Môžu sa byť tiež určené na implantáciu do organizmu podľa metodológie opísanej v prihláške WO95/14785. Tieto bunky sú prednostne hepatické bunky.
Predmetom predloženého vynálezu je aj postup tvorby rekombinantných proteínov zahrnujúci infekciu alebo transfekciu bunkovej populácie vektorom, rekombinantným adenovírusom alebo zodpovedajúcim vírusovým genómom obsahujúcim expresnú kazetu kódujúcu požadovaný proteín, kultiváciu vyššie uvedenej bunkovej rekombinantnej populácie a získanie uvedeného proteínového produktu. Na uskutočnenie postupu podľa vynálezu sa výhodne používajú bunky pečeňového pôvodu. Môže ísť o získané kultúry alebo o primárnu kultúru.
Vynález sa tiež týka nových variantov promótora génu ľudského apolipoproteinu AII, ktoré majú zlepšené expresné vlastnosti. Tieto varianty podľa vynálezu obsahujú konkrétne opakované motívy J tak, ako je už opísané. Okrem toho varianty výhodne obsahujú deléciu v oblasti nachádzajúce sa medzi zvyškami -710 a -150 natívneho promótora.
Vynález sa tiež týka hepatošpecifických a indukovaťeľných promótorov odvodených z promótora génu ľudského apolipoproteinu AII obsahujúcich regulačnú oblasť tvorenú jedným alebo viacerými motívmi J promótora apolipoproteinu AII a hepatošpecifickú protmótorovú oblasť pochádzajúcu z iného promótora.
Hepatošpecifická promótorová oblasť výhodne pochádza z hepatošpecifického promótora iného ako promótor ľudského génu apolipoproteinu AII. Táto oblasť je prednostne tvorená promótorom vybratým z promótorov sérumalbumínu, apolipoproteinu Al, apolipoproteinu Cs, apolipoproteinu B100, gama reťazca fibrinogénu (JBC 270 (1995 28350), génu ľudskej fenylalanínhydroxylázy (PNAS 93 (1996) 728), génu AMBP (NAR 23 (1995) 395), génu faktora X (JBC 271 (1996) 2323), cytochrómu P450 1A1 (PNAS 92 (1995) 11926), vírusu hepatitídy B (Biol. Chem. 377 (1996) 187) alebo tiež α-antitrypsinu. Použitá promótorová oblasť je prednostne tvorená oblasťou nevyhnutnou a dostatočnou pre hepatickú expresiu (minimálny promótor). Táto oblasť všeobecne obsahuje TATA box a môže sa pripraviť podľa klasických technik molekulovej biológie, ako je uvedené v použitej literatúre. 209 prvých bázových párov promótora génu faktora X bol dostatočných na spustenie hepatickej expresie (vyššie uvedený JBC). Fragmenty -20 až -23; -54 až -57 a -66 až -77 promótora gama reťazca fibrinogénu tvoria minimálny promótor umožňujúci hepatošpecifickú expresiu. Tieto oblasti sa môžu pripojiť k oblastiam J (prednostne 1 až 5) podľa opísanej metodológie a naznačenej v príkladoch na vytvorenie hepatošpecifických a indukovatelných promótorov. Okrem toho tieto promótory môžu niesť prídavné sekvencie regulácie typu enhancer prinášajúce zlepšenie úrovne expresie.
Hepatošpecifická promótorova oblasť môže byť tiež tvorená ubikvitárnym promótorom spojeným s elementom zosilňovača transkripcie umožňujúcim hepatošpecifickú expresiu.
Z tohto hľadiska zosilňovač transkripcie hepatošpecifický charakter sa môže enhancerov: enhancer apolipoproteinov 268 (1993) 8221-8229 a J. Biol. Chem., poskytujúci nasledovných Biol. Chem., (enhancer) vybrať z E/C-I (J.
270 (1995)
22577-22585), enhancer albumínu (Gene Therapy, 3 (1996) 802810), enhancer transtyretínu (Mol. Celí. Biol. 15 (1995) 13641376), enhancer vírusu hepatitídy B (Biol. Chem. 377 (1996) alebo tiež umelé enhancery obsahujúce miesta HNF (hepatic nuclear factors), väzbové miesta pre „orphan repeptory, členy rodiny receptorov steroidných hormónov (Human Gene Therapy, 7 (1996) 159-171).
Ubikvitárny promótor môže byť každý nešpecifický tkanivový promótor. Môže ísť konkrétne o vírusový promótor alebo promótor zo skupiny takzvaných housekeeping promótorov (promótory génov, ktoré sa exprimujú konštitutívne vo všetkých bunkách organizmu). Z vírusových promótorov sa môže konkrétne uviesť promótor SV40 (Mol. Celí. Biol. 1982; 2: 1044-1051); RSV LTR, Rous Sarcoma vírus long terminál repeat (PNAS USA, 1982; 79: 6777-6781); CMV-IE, ľudský cytomegalovírus (Gene 1986; 3: 806810) a promótor génu HSV-TK, tymidín kináza (Nucleic Acid Res 1980; 8: 5949-5964). Z „housekeeping promótorov sa môžu uviesť promótor Humaa EF-lalpha, elongačný faktor (Gene 1993; 11: 82878301), POL II promótor, myšacia RNA-polymeráza II (Mol Celí Biol 1987; 7: 1881-1893), HK2, potkania hexokináza II (J. Biol. Chem. 1995; 270: 169-16925) a PRP, Prion (Virus Genes 1992; 6: 343356). Môže sa tiež použiť každý iný ubikvitárny promótor známy odborníkom.
Hepatošpecifická promótorová oblasť sa môže získať klasickými technikami molekulovej biológie spojením celku alebo časti ubikvitárneho promótora s elementom enhanceru. Oligonukleotidy zodpovedajúce miestam J obsahujúce bázy -737 až -715 promótora ľudského apoAII sa môžu klonovať do miest BamHI/BglII pIC20H (Gene 1984; 32: 481-485), štiepeného HindlII a subklonované na 5' konci vybratého ubikvitárneho promótora, napríklad promótora tymidinkinázy (TK) v plazmide pBLCAT4 (Nucl. Acid Res. 1987; 15: 5490) na vytvorenie vektora obsahujúceho miesta J a ubikvitárny promótor pred génom záujmu. Hepatálny enhancer sa môže pripojiť buď na 5' koniec promótora alebo na 3' koniec polyadenylačného miesta.
Tieto varianty sú konkrétne výhodné, pretože kombinujú vlastnosti sily expresie, tkanivovej špecificity a indukovateľnosti. Tieto rôzne varianty sa môžu použiť na expresiu génov záujmu in vitro a in vivo, ako je už uvedené a opísané v príkladoch.
Predložený vynález sa tiež týka rekombinantných vektorov obsahujúcich expresnú kazetu tvorenú génom záujmu pod riadením takého promótora, ako sa už opísal.
Predložený vynález sa tiež týka kompozície obsahujúcej taký rekombinantný vektor, ako je už opísaný a aktivátor PPAR z hľadiska simultánneho podávania alebo rozloženého v čase.
Rekombinantný vektor je výhodne rekombinantný adenovírus taký, ako je už definované a aktivátor PPAR je výhodne aktivátor PPARa.
Z aktivátorov PPARa sa môžu použiť predovšetkým fibráty rovnako ako každá zlúčenina zvyšujúca expresiu transkripčného faktora viažuceho sa na miesta J.
Ako uprednostňované fibráty sa môžu uviesť napríklad kyselina fibrová a jej také analógy, ako konkrétne gemfibrozil (Atherosclerosis 114 (1) (1995) 61), bezafibrát (Hepatology 21 (1995) 1025), ciprofibrát (BCE&M 9 (4) (1995) 825), clofibrát (Drug Safety 11 (1994) 301), fenofibrát (Fenofibrate Monograph, Oxford Cllnical Communications 1995), clinofibrát (Kidney International 44 (6) (1993) 1352), kyselina Wy-14,643 alebo kyselina ETYA. Tieto rôzne zlúčeniny sú kompatibilné s biologickým a/alebo farmakologickým použitim in vitro alebo in vivo použitim.
Ako príklad zlúčenín, ktoré zvyšujú expresiu transkripčného faktora, ktorý sa viaže na miesta J, sa môžu uviesť konkrétne retinoidy, ktoré aktivujú expresiu RXR a HFN4.
Inak kompozície podlá vynálezu môžu obsahovať v spojení viac aktivátorov PPAR, konkrétne fibráty alebo analóg fibrátu spojený s retinoidom.
Ako sa už uviedlo, vektor a aktivátor sa môže použiť súčasne alebo v čase postupne. Okrem toho sa môžu upraviť oddelene. Podľa spôsobu uskutočnenia vektor a aktivátor sú upravené a použité postupne v čase. Vektor je predovšetkým výhodne použitý ako prvý a potom sa použije aktivátor PPAR ako druhý. Termín „použitý označuje skontaktovanie uvedeného vektora alebo aktivátora s bunkami in vitro, ex vivo alebo in vivo. In vitro alebo ex vivo skontaktovanie sa môže uskutočniť inkubáciou bunkovej populácie s vektorom tak, ako je uvedené vyššie (napríklad od 0,01 až 100 μς vektora pre 106 buniek alebo vírusu s multiplícitou infekcie (MOI) od 0,1 až 1000) a následnou inkubáciou s aktivátorom s koncentračnými stupňami medzi 10~3 mM a 10 mM (prednostne medzi 10 μΜ a 500 μΜ) . In vivo napríklad na tvorbu transgénnych zvierat alebo pre hepatošpecifickú expresiu génov záujmu, skontaktovanie všeobecne zahrňuje podávanie vektora (pri už opísaných podmienkach) za ktorým nasleduje podávanie aktivátora. Z tohto hľadiska sa aktivátor môže podávať orálne napríklad vo výžive (konkrétne pre zvieratá) alebo vo forme piluliek (pre človeka). Denné dávky podávané zvieratám sú od 0,01 až 1% (hmotnosť/hmotnosť), prednostne od 0,2 až 0,5% (hmotnosť/hmotnosť). Denná typická dávka pre myši sa pohybuje napríklad medzi 100 až 300 mg, prednostne okolo 200 mg, čo zodpovedá plazmatickej koncentrácii μς/πιΐ (Vídal, 1996) . Okrem toho sa môže uskutočniť opakované podávanie/inkubácia vektora a/alebo aktivátora.
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, pričom však v nijakom smere neobmedzujú jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Štruktúra promótora apoAII a deletovaných foriem
Obrázok 2: Stratégia zdvojnásobenia oblasti J
Obrázok 3: Štruktúra promótora apoAII obsahujúceho zdvojnásobenie oblasti J na 5' konci, pripadne kombinované s internými deléciami.
Obrázok 4:
Štruktúra promótora apoAII obsahujúceho zdvojnásobenie oblasti J vo vnútri, pripadne kombinovanú s internými deléciami.
Obrázok 5: Znázornenie rekombinantného adenovirusu
Obrázok 6: Indukovatelnosť a sila rekombinantného adenovirusu in vivo.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné techniky molekulovej biológie
Metódy klasicky používané v molekulovej biológii, ako je preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, odstreďovanie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza v agarózovom alebo polyakrylamidovom géle, purifikácia DNA fragmentov elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážanie DNA v roztoku soli etanolom alebo izopropanolom, transformácia Escherichia coli, atď. t sú odborníkom dobre známe metódy a sú široko opísané v odbornej literatúre (Maniatis T. a kol., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. a kol (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987) .
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 sú komerčného pôvodu (Bethesda Research Laboratories). Na ligáciu sa DNA fragmenty separovali podlá veľkosti elektroforeticky v agarózovom géle alebo akrylamidovom. Extrahovali fenolom alebo zmesou fenol/chloroform, zrážali etanolom, potom inkubovali v prítomnosti DNA ligázy fága T4 (Biolabs) podlá odporučenia výrobcu. Doplnenie presahujúcich 5' koncov sa môže uskutočniť Klenowovým fragmentom DNA polymerázy E. coli (Biolabs) podľa odporučenia výrobcu. Odstránenie presahujúcich 3' koncov sa môže uskutočniť v prítomnosti DNA polymerázy fága T4 (Biolabs) použitej podlá odporučenia výrobcu. Odstránenie presahujúcich 5' koncov sa uskutočnilo pôsobením SI nukleázy.
In vitro cielená mutagenéza syntetickými oligodeoxynukleotidmi sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Taylorom a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) s použitím súpravy dodávanej firmou Amersham. Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki a kol., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. a Faloona F.A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335-350) sa môže uskutočniť s použitím DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podlá odporučenia výrobcu. Overenie nukleotidových sekvencií sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Sangerom a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467) s použitím súpravy dodanej z Amersham alebo Applied Biosystems.
Príklad 1: Klonovanie promótora Iudského génu apolipoproteinu AII.
Tento príklad opisuje klonovanie promótora ľudského génu apolipoproteinu AII. Predpokladá sa, že sa môže použiť každá technika na opakované klonovanie tohto promótora. Inak sa tiež môžu pripraviť z týchto klonovaných fragmentov klasickými technikami molekulovej biológie varianty kratšie na 5' a/alebo 3' konci.
1.1. Klonovanie fragmentu -911/+29
Promótor ľudského apolipoproteinu AII sa klonoval s PCR z ľudskej genómovej DNA. Priméry ATC GAA CGT TCT GAT ATC TAT TTA ACT GAT (SEQ ID NO.: 3) a CGT CTC TGT CCT TGG TGT CTG GAT CCA TCG (SEQ ID NO.: 4), ktoré vkladajú za prvé miesto HindlII na 5'konci promótora a za druhé miesto BamHI na 3', umožnili klonovať promótor od polohy -911 až +29. Sekvencia promótora sa potvrdila sekvenovanim (SEQ ID NO.: 1) a fragment HindlII-BamHI sa vložil do vektora pBLCAT5 na overenie transkripčnej aktivity.
1.2. Klonovanie fragmentu -911/+160
Fragment obsahujúci promótor apoAII so zvyškami -911/+160 sa tiež získal z genómovej banky a potom sa klonoval do vektora pBLCAT5.
Príklad 2: Konštrukcia variantov promótora AII
2.1. Tvorba skrátených foriem
Tento príklad opisuje konštrukciu variantov promótora apoAII obsahujúcich vnútorné delécie v oblasti nachádzajúcej sa medzi elementmi regulácie umiestnenými na úrovni nukleotidov -903 až -720 a -126 až -33. Tieto varianty sa vytvorili z fragmentov -911/+29 a -911/+160 opísaných v príklad 1.
Z vektorov pBLCAT5 obsahujúcich úplný promótor vo forme fragmentu -911/+29 alebo -911/+160, oblasť -210 až +29 alebo -210 až +160 sa získali PCR, pričom ako primér sa použil oligonukleotid -210/-198 so sekvenciou 5'-GACTCTAGATGTACCCCCTTA3' (SEQ ID NO. : 5) a vnútorný oligonukleotid génu CAT. Získaný fragment sa klonoval do plazmidu pBLCAT5, aby sa vytvorili plazmidy -210/+160AII-CAT a -210/+29AII-CAT. Vzdialená oblasť -911 až -653 (N-I) sa získala štiepením fragmentu -911 až +29 pomocou enzýmu Alul, potom klonovanim získaného fragmentu do plazmidov -210/+160AII-CAT a -210/+29AII-CAT. Vzdialená oblasť -911 až -708 (N-J) sa získala PCR s použitím oligonukleotidu
-708/-72 sekvencie 5'-GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG-3' (SEQ ID NO.: 6) ako priméru. Získaný fragment sa potom klonoval do plazmidov -210/+160AII-CAT a -210/+29AII-CAT
Štruktúra promótorov je uvedená na obrázku 1.
2.2. Zdvojnásobenia miesta J
Tento príklad opisuje konštrukciu variantov promótora AII, v ktorom sa zmnožila oblasť J.
Dva nasledovné oligonukleotidy zodpovedajúce miestu J sa syntetizovali s použitím DNA syntetizátora.
Oligo 1: 5'-gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa-3' (SEQ ID NO.: 7)
Oligo 2: 5'-gatCtCTACCAGGGTAAAGGTTGAag-3' (SEQ ID NO.: 8)
Tieto oligonukleotidy obnovujú na 3' konci miesto BamHI a na 5' konci miesto BglII. Tieto oligonukleotidy sa hybridizovali spoločne a získané fragmenty sa klonovali do miest BamHI-BglII do vektora pIC20H (Obrázok 2). Vzniknuté plazmidy pIC20H-J sa analyzovali, tak na určenie počtu kópií vložených miest J, ako aj na určenie ich vzájomnej orientácie.
Vybrali sa nasledovné plazmidy:
-plazmid nesúci jednu kópiu miesta J
-plazmid nesúci 2 kópie miesta J v rovnakej orientácii
-plazmid nesúci 2 kópie miesta J v opačnej orientácii
Na konštrukciu variantov promótora apoAII obsahujúceho opakované motívy J na 5' konci sa vštiepili inzerty nachádzajúce sa v plazmidoch uvedených ďalej vo forme fragmentov HindlII a klonovali sa na 5' koniec promótora apoAII (príklad 1) alebo jeho variantov opísaných v príklade 2.1, na úrovni miesta HindlII. Štruktúra výsledných promótorov je uvedená na obrázku
3.
Na konštrukciu variantov promótora apoAII obsahujúcich vo vnútri opakované motívy J, sa vyštiepili inzerty nachádzajúce sa v plazmidoch uvedených ďalej, vo forme vhodných reštrikčných fragmentov sa potom klonovali do promótora apoAII (príklad 1) alebo jeho variantov opísaných v príklade 2.1, na úrovni miesta umiestneného medzi natívnou oblasťou J a regulačnou oblasťou -126-33 natívneho promótora. Štruktúra výsledných promótorov je uvedená na obrázku 4.
Počet kópií oblasti J v konečnej konštrukcii je určený výberom plazmidu.
Príklad 3: Štúdium funkčnosti variantov promótora apoAII
Funkčnosť promótorov sa študovala transfekciou bunkovej hepatálnej línie buniek HepG2. Kontrolný pokus sa uskutočnil na nehepatálnej bunkovej línii buniek HeLa.
Transfekcia buniek HepG2 sa uskutočnila na 50-60% metódou zrážania fosforečnanom vápenatým. Bunky sa spoločne transfekovali zmesou plazmidov obsahujúcou:
-testovaný plazmid
-expresný plazmid PPARa (PBK-CMV- PPARa) alebo volný zodpovedajúci plazmid (PBK-CMV), atď.
-0,5 pg expresného plazmidu β-Gal (CMV-p-Gal) ako kontrola účinku transfekcie.
Všetky transfekcie sa uskutočnili s rovnakým množstvom úplnej DNA. Štyri hodiny po transfekcii sa bunky premyli pufrom PBS, potom inkubovali 24 hodín s fibrátom (Wy-14643, 1 μΜ) . Množstvo CAT sa potom určilo metódou podlá Gormana a kol. (Mol. Celí Biol. 2 (1982) 1044) . Výsledky sú vztiahnuté na účinok transfekcie tak, ako bola stanovená expresiou β-Gal.
Získané výsledky z dvoch sérií pokusov sú uvedené v tabuľke 1 a 2.
Tabuľka 1: Aktivita promótorov v pečeňových bunkách
| promótor | vektor | aktivátor | aktivita CAT | korekcia β-gal |
| phA-II | PBK-CMV | - | 2,52 | 5,52 |
| PBK-CMV | Wy | 5,37 | 11,75 | |
| mPPARa | - | 12,44 | 27,22 | |
| mPPARa | Wy | 12,04 | 26,34 | |
| phA-II(J3) | PBK-CMV | - | 4,17 | 9,13 |
| PBK-CMV | Wy | 7,8 | 17,06 | |
| mPPARa | - | 15,67 | 34,29 | |
| mPPARa | Wy | 24,96 | 54,61 | |
| phA-II N-I | PBK-CMV | - | 1,31 | 2,86 |
| PBK-CMV | Wy | 2,46 | 5,38 | |
| mPPARa | - | 3,58 | 7,83 | |
| mPPARa | Wy | 14,77 | 32,31 | |
| phA-II N-I(J3) | PBK-CMV | - | 1,32 | 2,89 |
| PBK-CMV | Wy | 2,95 | 6,45 | |
| mPPARa | - | 7,81 | 17,1 | |
| mPPARa | Wy | 17,51 | 38,32 | |
| phA-II N-J | PBK-CMV | - | 0,37 | o oo |
| PBK-CMV | Wy | 0,41 | 0,9 | |
| mPPARa | - | 0,44 | 0,97 | |
| mPPARa | Wy | 1,11 | 2,42 | |
| phA-II N-J(J3) | PBK-CMV | - | 0,46 | 1 |
| PBK-CMV | Wy | 0,77 | 1,69 | |
| mPPARa | - | 4,04 | 8,83 | |
| mPPARa | Wy | 13,06 | 28,59 |
Tabuľka 2: Aktivita promótorov v pečeňových bunkách
| promótor | vektor | aktivátor | aktivita CAT | korekcia β-gal |
| phA-II | PBK-CMV | - | 5,03 | 2,12 |
| PBK-CMV | Wy | 6,68 | 3,41 | |
| mPPARa | - | 49,77 | 16,99 | |
| mPPARa | Wy | 60,86 | 32,2 | |
| phA-II(J3) | PBK-CMV | - | 5,8 | 2,16 |
| PBK-CMV | Wy | 8,17 | 3,5 | |
| mPPARa | - | 69,71 | 17,08 | |
| mPPARa | Wy | 81,2 | 21,15 | |
| phA-II N-I | PBK-CMV | - | 2,91 | 1,25 |
| PBK-CMV | Wy | 1,35 | 0,67 | |
| mPPARa | - | 20,85 | 3,88 | |
| mPPARa | Wy | 32,34 | 8,86 | |
| phA-II N-I(J3) | PBK-CMV | - | 2,2 | 1,19 |
| PBK-CMV | Wy | 3,01 | 1,68 | |
| mPPARa | - | 57,07 | 11,65 | |
| mPPARa | Wy | 75,39 | 17,53 | |
| phA-II N-J | PBK-CMV | - | 2,02 | 1,5 |
| PBK-CMV | Wy | 0,56 | 0,37 | |
| mPPARa | - | 1,65 | 0,49 | |
| mPPARa | Wy | 2,91 | 1,26 | |
| phA-II N-J(J3) | PBK-CMV | - | 1,04 | 0,64 |
| PBK-CMV | Wy | 0,55 | 0,6 | |
| mPPARa | - | 21,4 | 3,87 | |
| mPPARa | Wy | 30,56 | 9,95 |
Tieto výsledky jasne ukazujú, že zdvojnásobenie motívu J v promótore nemení silu promótora, ale zvyšuje velmi významne jeho indukovatelnosť fibrátmi.
Inak v kontrolnom príklade uskutočnenom na bunkách Hela sa nepozorovala žiadna indukovatelnosť fibrátmi alebo s PPAR. To znamená, že promótory podlá vynálezu si zachovávajú svoju tkanivovú špecifickosť.
Tieto výsledky ukazujú, že promótory podlá vynálezu sú silné, vysoko indukovatelné a špecifické pre hepatálne bunky. Okrem toho promótory phA-II N-I(J3); phA-Iľ N-I(J3); phA-II NJ(J3); phA-II' N-J(J3); phA-II N-I(J3i); phA-II' N-I(J3i); phAII N-J(J3i) a phA-Iľ N-I(J3i) majú výhodu malej velkosti porovnateľnú s natívnym promótorom apoAII. Toto teda umožňuje mať výhodne vyššiu klonovaciu kapacitu v transportnom a/alebo expresnom vektore.
Príklad 4: Konštrukcia indukovatelných a hepatošpecifických adenovirusov
Tento príklad opisuje konštrukciu indukovatelných a hepatošpecifických adenovirusov poskytujúcich vysoko zvýšené úrovne expresie. Tieto adenovírusy sú použité na expresiu génov in vitro, ex vivo alebo in vivo. Opísaný adenovírus sa skonštruoval zo sérotypu Ad5. Je pochopiteľné, že sa môže použiť akýkoľvek iný sérotyp, konkrétne sérotyp Ad2, Ad7, Adl2 a CAV2. Adenovírusy sa vytvorili homologickou rekombináciou v enkapsidačnej línii medzi kyvadlovým vektorom nesúcim ľavú časť genómu vírusu a lineárnou adenovírusovou DNA nesúcou pravú časť genómu vírusu.
4.1. Konštrukcia kyvadlového vektora
Vytvorený kyvadlový vektor nesie expresnú kazetu tvorenú promótorom apoAII a nukleovou kyselinou kódujúcou sekretovanú molekulu: apolipoprotein AII (apoAII). Tento vektor okrem iného nesie Iavú časť genómu vírusu, konkrétne ľavú ITR a oblasť umožňujúcu rekombináciu.
Kyvadlové vektory, slúžiace na konštrukciu adenovírusu, sa vytvorili z plazmidu pCO5 (WO96/22378), plazmidu pIC20H-llb-UAÍ-SV40, ktorý obsahuje prvý intrón apoAI a cDNA apoAI pod kontrolou promótoru krysieho albumínu a plazmidu pBLAIICAT5, ktorý obsahuje taký promótor apoAII, ako je opísaný v príklade 1 alebo variant podlá príkladu 2.
a) Konštrukcia pIC20H-llb-U-Ai-SV40
Dva priméry GCG GCC GCT TCG AGC AGA CAT GAT AA (SEQ ID NO.:
9) a CGA TCT CAA GGG CAT CGG TCG ACG G (SEQ ID NO.: 10) umožnili amplifikáciu polyadenylačných sekvencii SV40 v neskorej orientácii. Primér 5* vkladá miesto Nôti proti smeru tejto sekvencie a primér 3' vkladá polovičné miesto Nrul. Získané fragmenty PCR sa opracovali s Klenowom, aby sa získal voľný koniec, a klonovali sa do vektora pIC20H štiepeného so Smal a Nrul v takom smere, aby sa vytvorilo miesto Nrul. Výsledný plazmid sa nazval pIC20H-SV40.
Konštrukcia pXL2336 obsahujúca minigén apolipoproteinu Al už bola opísaná (WO94/25073). Fragment PCR sa amplifikoval z pXL2336 pomocou primérov GGG ATC GCG TGG CTG CTT AGA GAC TGC (SEQ ID NO. : 11) a GGC GGC CGC CGG GAA GGG GGG CGG CGG (SEQ ID NO.: 12), ktoré vkladajú miesto BamHI proti smeru prvého exónu ApoAI a miesto Nôti v smere sekvencie kódujúcej ApoAI.
Fragment PCR sa klonoval do pCRII (Invitrogen) a jeho sekvencia sa overila. Fragment BamHI/Notl obsahujúci cDNA a prvý intrón apoA-I sa potom klonoval do rovnakých miest plazmidu pIC20H-SV40, aby sa vytvoril plazmid pIC20H-AI-SV40.
Oligonukleotidy CAC GTG CTT GTT CTT TTT GCA GAA GCT CAT AAT
AAA CGC TCA ACT GTG GC (SEQ ID NO.: 13) a CGT GGC CAC AGT TGA
GCG TTT ATT CTG AGC TTC TGC AAA AAG AAC AAG CA (SEQ ID NO. : 14) sa potom vzájomne hybridizovali a klonovali do miesta Dsal plazmidu pIC20H-AI-SV40 tak, aby miesto PmlI vytvorené počas tohto klonovania bolo vedia intrónu a aby sa miesto Dsal vytvorilo na opačnom konci. Tieto oligonukleotidy umožňujú vložiť fragment 5' neprekladanej časti mediátorovej RNA β-globínu. Získaný plazmid sa nazval pIC20H-AI-SV40.
Fragment HindlII/BglII promótora krysieho albumínu opísaný Trochom a kol. (Mol. Celí. Biol. 1989, 4759-4766) opracovaný
Klenowom sa klonoval v zodpovedajúcej orientácii do plazmidu pIC20H-U-AI-SV40 štiepeného s BamHI a opracovaného tiež f
Klenowom, aby sa vytvoril plazmid pIC20H-Alb-U-AI-SV40.
b) Konštrukcia kyvadlových vektorov
Oligonukleotidy CGT GGC AGG CAG GAC GCA CCT CCT TCT CGC AGT
CTC TAA GCA GCC TTC GAA GCA TG (SEQ ID NO.: 15) a CTT CGA AGG
CTG CTT AGA GAC TGC CAG AAG GAG GTG CGT CCT GCT GCC TGC CA (SEQ
ID NO. : 16) sa potom vzájomne hybridizovali tak, že vytvorili lepivý koniec Hpall. Tento fragment sa použil v trojzložkovej ligácii s fragmentom HpalI/DralII (4787/1518) plazmidu pIC20HAlb-U-AI-SV40 obsahujúcim cDNA ApoAI a fragmentom DralII/Sphl (1518/239 rovnakého plazmidu. Získaný plazmid sa nazval pXL2699Táto konštrukcia vytvorila miesto BstBI kompatibilné s Clal proti smeru fragmentu cDNA + intrón apoAI. Fragment BstBI/Sall • plazmidu pXL2699 obsahujúci cDNA apoAI sa klonoval do plazmidu pCO5 štiepeného s Clal a Sali. Získaný plazmid sa nazval pCO5-UAI-SV40.
Vybratý promótor apoAII (kompletný promótor alebo variant) sa vyštiepil zo zodpovedajúceho plazmidu pBLAIICAT, vo forme fragmentu HindlII-BamHI, po opracovaní Klenowom sa klonoval do miesta EcoRV plazmidu pCO5-U-AI -SV40, aby sa vytvoril kyvadlový vektor pXLPromAII/AI. Získali sa nasledovné vektory:
| kyvadlový vektor | verzia promótora |
| pXLAII/AI | -991/+29 |
| pXLhAII/AI | -991/+160 |
| pXLAII(J3)/AI | -991/+29; 3 motívy J na 5' |
| pXLAIIN-I/AI | -991/-653; -210/+29 |
| pXLAIIN-I(J3)/AI | -991/-653; -210/+29; 3 motívy J na 5' |
| pXLAIIN-J/AI | -991/-708; -210/+29 |
| pXLAIIN-J(J3) /AI | -991/-708; -210/+29; 3 motívy J na 5' |
Tieto vektory sú vhodné na expresiu ľudského apoAI prechodnou transfekciou v linii 293 alebo Cosl. Predpokladá sa, že nukleová kyselina kódujúca ľudský apolipoprotein AI sa môže ľahko nahradiť v kyvadlovom vektore akoukoľvek inou nukleovou kyselinou kódujúcou molekulu záujmu.
4.2 Konštrukcia adenovirusov
Adenovirusy sa vytvorili homologickou rekombináciou po spoločnej transfekcii dvoch fragmentov DNA do vhodných buniek, jeden fragment nesie ľavú časť genómu rekombinantného vírusu (kyvadlový vektor opísaný v príklade 4.1 má deléciu v oblasti El), druhý nesie pravú časť genómu rekombinantného vírusu (pripadne má deléciu v oblasti E4 a/alebo E3) .
a) Konštrukcia adenovirusu defektného v oblasti El
Adenovírus Ad-AII/AI sa získal homologickou rekombináciou in vivo medzi DNA Ad-RSV-PGal a kyvadlovým vektorom pXLAII/AI podľa nasledovného protokolu: kyvadlový vektor pXLAII/AI linearizovaný BstXI a DNA vírusu Ad-RSV-pGal linearizovaná enzýmom Clal sa spoločne použili na transfekciu línie 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého, aby sa umožnila homologická rekombinácia. Vytvorené rekombinantné adenovirusy sa potom selektovali purifikáciou na platni. Po izolácii DNA rekombinantného adenovirusu sa DNA amplifikovala v bunkovej línii 293, čim sa získal supernatant kultúry obsahujúci nepurifikovaný defektný rekombinantný adenovirus s titrom 1O10 pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali odstreďovaním v gradiente chloridu cézneho podlá známych technik (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456) alebo chromatograficky (FR96 08164). Adenovirus Ad-AII/AI sa môže uchovávať pri teplote -80 ’C v 20% glycerole. Štruktúra rekombinantného genómu je uvedená na obrázku 5.
Rovnaká stratégia sa použila na konštrukciu adenovirusu nesúceho rôzne formy promótora AII z kyvadlového vektora opísaného v príklade 4.1.
b) Konštrukcia adenovírusov defektných v oblastiach E1 a E4
Bunky IGRP2 (Yeh a kol., J. Virol. 70 (1996) 559) schopné transkomplementovať funkcie E1 a E4 adenovirusu sú spoločne transfekované s 5 mg kyvadlového vektora štiepeného s BstXI a 10 mg vírusovej DNA nesúcej funkčné delécie oblasti E4 (napríklad Ad2dl808, Ad5dll004, Ad5dll007 alebo Ad5dll014) štiepenej s Clal. Po objavení sa cytopatologického účinku sa vírusy purifikovali tak, že sa minimálne dva krát po sebe vytreli na pevnú pôdu, aby sa vytvorili plaky na IGRP2. Plaky zodpovedajúce infekcii hľadaného vírusu (analýza DNA ukazujúca dvojnásobnú deléciu E1 a E4) sa amplifikujú po sebe idúcimi infekčnými cyklami. Zásoby so zvýšeným titrom sa pripravili purifikáciou v gradiente chloridu cézneho. Adenovirusy sa uchovávali pri teplote -80 ’C podlá odborníkom známych klasických metód.
Príklad 5: Aktivita in vivo rekombinantných adenovirusov
Tento príklad opisuje funkčné vlastnosti adenovirusov podlá vynálezu po podávaní in vivo.
5xl09 pfu vírusu Ad(ApoAIIprom-ApoAI-SV40) a Ad(RSV-ApoAIbGH) sa injikovalo 8 a 3 myšiam C57bl6. Štyri myši injikované s Ad(ApoAIIprom-ApoAI-SV40) sa kŕmili fenofibrátom v dávke 0,5% (hmotnosť/hmotnosť) primiešaným k ich potrave. Plazmatická koncentrácia ľudského apoA-I a HDL-cholesterolu sa merala každý týždeň. Získané výsledky sú uvedené na obrázku 6.
Plazmatické hladiny apoA-I sú nižšie ako u kontrolného jedinca (10 mg/dl) u myší injikovaných vírusom Ad(ApoAIIpromApoAI-SV40), 81 ± 0,17 mg/dl u myší injikovaných vírusom Ad(ApoAIIprom-ApoAI-SV40) ošetrených fenofibrátom a 84 ± 15 mg/dl u myší injikovaných vírusom Ad(RSV-ApoAI-bGH), čo ukazuje za týchto podmienok aspoň osemnásobnú indukciu promótora apoA-II.
Hladina HDL-cholesterolu sa nezmenila u myší injikovaných vírusom Ad (ApoAIIprom-ApoAI-SV40) (52 ± 2 mg/dl): hladina identická s neošetrenými zvieratami. Naopak hldina HDLcholesterolu sa po 7 dňoch zvýšila až na 88 ± 14 mg/dl a 121 ± 22 mg/dl u myší injikovaných vírusom Ad(RSV-ApoAI-bGH) a u myší injikovaných vírusom Ad(ApoAIIprom-ApoAI-SV40) a ošetrených fenofibrátom (obrázok 6).
Tieto výsledky dokazujú in vivo silu, indukovatelnosť a hepatošpecifickosť promótora podlá vynálezu v adenovírusovej súvislosti. V kombinácii s významnou schopnosťou adenovirusov prenášať gény, vektory podlá vynálezu majú vlastnosti velmi výhodné na prenos a expresiu génov.
ZOZNAM SEKVENCIÍ
SEQ ID NO.: 1: sekvencia ludského promótora apoAII (-911 +29) str. 32 až 33
| AGCTTCTC-AT | ATCTATTTAA | CTGATTTCAC | CCAAATGCTT | TGAACCTGGG |
| -911 | -901 | |||
| AATGTACCTC | TCCCCCTCCC | CCACCCCCAA | CAGGAGTGAG | ACAAGGGCCA |
| GGGCTATTGC | CCCTGCTGAC | TCAATATTGG | CTAATCACTG | CCTAGAACTG |
| -811 | ||||
| ATAAGGTGAT | CAAATGACCA | GGTGCCTTCA | ACCTTTACCC | TGGTAGAAGC |
| -734 | -716 | |||
| CTCTTATTCA | CCTCTTTTCC | TGCCAGAGCC | CTCCATTC-GG | AGGGGACGGG |
| -711 | ||||
| CGGAAGCTGT | TTTCTGAATT | TGTTTTACTG | GGGGTAGGGT | ATGTTCAGTG |
| ATCAGCATCC | AGGTCATTCT | GGGCTCTCCT | GTTTTCTCCC | CGTCTCATTA |
| -611 | ||||
| CACATTAACT | CAAAAACGGA | CAAGATCATT | TACACTTGCC | CTCTTACCCG |
| ACCCTCATTC | CCCTAACCCC | CATAGCCCTC | AACCCTGTCC | CTGATTTCAA |
| -511 | ||||
| TTCCTTTCTC | CTCCCCAATA | TCTCTCTGCC | AAGTTGCAGT | |
| AAAGTGGGAT | ÄAGGTTGAGA | GATGAGATCT | GAATAAAGAC | |
| -411 | ||||
| ACCATGAGCT | TTCCATGGTA | TGATGGGTTG | ATGGTATTCC | ATGGGTTGAT |
| ATGTCAGAGC | TTTCCAGAGA | AATAACTTGG | AATCCTGCTT | CCTGTTGCAT |
| -311 | ||||
| TCAAGTCCAA | GGACCTCAGA | TCTCAAAAGA | ATGAACCTCA | AATATACCTG |
| AAGTGTACCC | CCTTAGCCTC | CACTAAGAGC | TGTACCCCCT | GCCTCTCACC |
| -211 | ||||
| CCATCACCAT | GAGTCTTCCA | TGTGCTTGTC | CTCTCCTCCC | CCATTTCTCC |
AACTTGTTTA -111 CCTGTCACCT TCTCCAGCC.-. -11
TCCTCACATA
GACAGGGGGT
GGGCAGGCAC
ATCCCTGCCC
GGGTAAACAG
AGACACCAAG + 10
CACTGGGCCC
ACAGGTATAT
GACAGAC-ACG
ATCCATAGTC
AGCCCCTTCC
SEQ ID NO.: 2: sekvencia oblasti J TCAACCTTTA CCCTGGTAG
SEQ ID NO.: 3:
ATCGAAGCTT CTGATATCTA TTTAACTGAT
SEQ ID NO.: 4:
CGTCTCTGTC CTTGGTGTCT GGATCCATCG
SEQ ID NO.: 5:
GACTCTAGATGTACCCCCCTTA
SEQ ID NO.: 6:
GGAAGCTGCAGAGGCTTCTACCAG
SEQ ID NO.: 7: gatcctTCAACCTTTACCCTGGTAGa
SEQ ID NO.: 8: gatctCTACCAGGGTAAAGGTTGAag
| SEQ | ID | NO. : | 9: | |||||
| GCG | GCC | GCT | TCG | AGC | AGA | CAT | GAT | AA |
| SEQ | ID | NO. : | 10: | |||||
| CGA | TCT | CAA | GGG | CAT | CGG | TCG | ACG | G |
SEQ ID NO.: 11:
| GGG | ATC GCG | TGG | CTG | CTT | AGA | GAC | TGC | |||||||
| SEQ | ID NO: 12: | |||||||||||||
| GGC | GGC CGC | CGG | GAA | GGG | GGG | CGG | CGG | |||||||
| SEQ | ID NO.: | 13: | ||||||||||||
| CAC | GTG CTT | GTT | CTT | TTT | GCA | GAA | GCT | CAT | AAT | AAA | CGC | TCA | ACT | GTG |
| GC | ||||||||||||||
| SEQ | ID NO.: | 14: | ||||||||||||
| CGT | GGC CAC | AGT | TGA | GCG | TTT | ATT | CTG | AGC | TTC | TGC | AAA | AAG | AAC | AAG |
| CA | ||||||||||||||
| SEQ | ID NO.: | 15: | ||||||||||||
| CGT | GGC AGG | CAG | GAC | GCA | CCT | CCT | TCT | CGC | AGT | CTC | TAA | GCA | GCC | TTC |
| GAA | GCA TG | |||||||||||||
| SEQ | ID NO.: | 16: | ||||||||||||
| CTT | CGA AGG | CTG | CTT | AGA | GAC | TGC | CAG | AAG | GAG | GTG | CGT | CCT | GCT | GCC |
TGC CA
Claims (39)
1. Rekombinantný vektor na indukovatelnú a hepatošpecifickú expresiu molekuly vyznačujúci sa tým, že obsahuje expresnú kazetu tvorenú nukleovou kyselinou kódujúcu uvedenú molekulu umiestnenú pod riadením promótora ludského génu pre apolipoproteín II.
2. Rekombinantný vektor podlá nároku 1 vyznačujúci sa tým, že promótor obsahuje regulačné elementy nachádzajúce sa na úrovni nukleotidov -903 až -680; -573 až -255 a -126 až -33 promótora ludského génu apolipoproteínu II.
3. Rekombinantný vektor podlá nároku 1 alebo 2 vyznačujúci sa tým, že 3' koniec promótora sa nachádza medzi zvyškami +5 až +35, prednoste medzi zvyškami +10 a +30 génu apoAII.
4. Rekombinantný vektor podlá nárokov 1 až 3 vyznačujúci sa tým, že 5' koniec promótora sa nachádza medzi zvyškami -950 a -905, prednostne medzi zvyškami -925 a -910 génu apoAII.
5. Rekombinantný vektor podlá nároku 1 vyznačujúci sa tým, že promótor obsahuje sekvenciu SEQ ID NO. : 1 (-911 až +29).
6. Rekombinantný vektor podlá nárokov 1, 3 alebo 4 vyznačujúci sa tým, že promótor obsahuje regulačné elementy nachádzajúce sa na úrovni nukleotidov -903 až -680 alebo -903 až -720 a -126 až -33 promótora ludského génu
35 apolipoproteinu AII, ale nie stredne vzdialené elementy ležiace na úrovni nukleotidov -573 až -255.
8. Rekombinantný vektor podlá nároku 6 vyznačujúci sa t ý m, že promótor obsahuje deléciu v oblasti nachádzajúcej ♦ sa medzi zvyškami -710 a -150.
9.
Rekombinantný vektor podlá nároku
8 vyznačujúci tým, že promótor obsahuje deléciu zvyškov -708 až -210.
10. Rekombinantný vektor podlá jedného z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že promótor obsahuje opakovanie motívov J, pričom uvedený motív J je definovaný v sekvenciách SEQ ID NO.: 1 a SEQ ID NO.: 2.
11. Rekombinantný vektor podlá nároku 10 vyznačujúci sa t ý m, že promótor obsahuje 2 až 5 motívov J.
12. Rekombinantný vektor podlá nároku 10 vyznačujúci sa tým, že opakovanie motívov J je umiestnené na 5' konci promótora.
13. Rekombinantný vektor podlá nároku 10 vyznačujúci sa tým, že opakovanie motívov J je umiestnené na 3' konci promótora.
14. Rekombinantný vektor podľa nároku 10 vyznačujúci sa tým, že opakovanie motívov je vložené do sekvencie promótora.
15. Rekombinantný vektor podľa nároku 10 vyznačujúci satým, že promótor obsahuje regulačné oblasť tvorenú viacerými motívmi J a hepatošpecifickú promótorovú oblasť.
16. Rekombinantný vektor podlá nároku 15 vyznačujúci sa tým, že hepatošpecifická promótorová oblasť je tvorená hepatošpecifickým promótorom vybratým z promótorov sérového albumínu, apolipoproteinu Al, apolipoproteinu Cs, apolipoproteinu B106, gama reťazca fibrinogénu, ľudského génu fenylalanínhydroxylázy, génu AMBP, génu faktora X a α-antitrypsínu.
17. Rekombinantný vektor podľa jedného z nárokov 1 až 16 vyznačujúci sa tým, že ide o rekombinantný adenovirus.
18. Rekombinantný vyznačujú E1 svojho genómu.
adenovirus sa tým, že podľa obsahuje nároku deléciu v oblasti
vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem iného deléciu v oblasti E4 svojho genómu.
21. Rekombinantný adenovirus podlá nároku 20 vyznačujúci sa tým, že delécia v oblasti E4 zasahuje skupinu otvorených čítacích rámcov.
22. Rekombinantný adenovirus podlá nárokov 18 až 21 vyznačujúci sa tým, že expresná kazeta je vložená na úrovni oblasti E1 namiesto deletovaných sekvencií.
23. Rekombinantný adenovirus podlá nárokov 18 až 21 vyznačujúci sa tým, že expresná kazeta je vložená na úrovni oblasti E4 namiesto deletovaných sekvencií.
24. Rekombinantný adenovirus podlá nárokov 18 až 21 vyznačujúci sa tým, že expresná kazeta je vložená na úrovni oblasti E3.
25. Rekombinantný vektor podlá nároku
1 vyznačujúci sa t ý m, že molekula je terapeutický proteín.
26. Rekombinantný vektor podlá nároku 25 vyznačujúci sa tým, že terapeutická molekula je proteín sekretovaný do obehu.
27. Rekombinantný vektor podlá nároku 25 vyznačujúci sa tým, že terapeutický proteín je vybratý z hormónov, lymfokinov, rastových faktorov, neurotransmiterov alebo ich prekurzorov alebo syntetických enzýmov, trofických faktorov.
28. Adenovirusový vektor obsahujúci expresnú kazetu tvorenú nukleovou kyselinou kódujúcou molekulu záujmu umiestnenou pod riadením promótora ľudského génu apolipoproteinu AII.
30. Variant podľa nároku 29 vyznačujúci sa tým, že obsahuje 2 až 5 motívov J.
32. Variant až sa tým, nachádzajúcej podľa nároku 29 že obsahuje okrem sa medzi zvyškami -710 iného a -150 v y z n deléciu oblasti natívneho promótora.
33. Variant promótora ľudského génu apolipoproteinu Alľ vyznačujúci sa tým, že obsahuje regulačnú oblasť tvorenú viacerými motívmi J promótora apolipoproteinu AII, pričom uvedený motív J je definovaný v sekvenciách SEQ ID NO.: 1 a SEQ ID NO.: 2, a hepatošpecif ickú promótorovú oblasť pochádzajúcu z iného promótora.
34. Variant podľa nároku 33 vyznačujúci sa tým, že hepatošpecifická promótorová oblasť je tvorená hepatošpecifickým promótorom iným ako je promótor ľudského génu apolipoproteinu AII.
35. Variant podlá nároku 33 vyznačujúci sa tým, že hepatošpecifická promótorová oblasť je tvorená ubikvitárnym promótorom spojeným s enhancerovým elementom udeľujúcim hepatošpecifickú expresiu.
36. Bunka modifikovaná vektorom podľa jedného z nárokov 1 až 28.
37. Farmaceutická kompozícia obsahujúca adenovírus podľa nároku 17 a farmaceutický prijateľný nosič.
38. Postup tvorby požadovaného rekombinantného proteínu obsahujúci:
infekciu alebo transfekciu bunkovej populácie rekombinantným vektorom podľa nároku 1 alebo vírusovým genómom obsahujúcim expresnú kazetu kódujúcu uvedený požadovaný proteín,
- kultiváciu uvedenej rekombinantnej bunkovej populácie a
- získanie uvedeného proteínového produktu.
39. Použitie adenovirusu podľa nároku 17 na prípravu transgénneho zvieracieho nehumánneho modelu.
40. Kompozícia obsahujúca rekombinantný vektor podľa jedného z nárokov 1 až 28 a aktivátor PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) z hľadiska použitia simultánneho alebo rozloženého v čase.
41. Kompozícia podlá nároku 40 vyznačujúca sa tým, že vektor je rekombinantný adenovírus podľa nároku 17.
42. Kompozícia podľa nároku 40 alebo 41 vyznačujúca sa t ý m, že aktivátor PPAR je aktivátor PPARa.
43. Kompozícia podlá nároku 42 vyznačujúca sa tým, že aktivátor PPARa sa vyberie z fibrátov a zlúčenín zlepšujúcich expresiu transkripčných faktorov viažucich sa na miesta J.
44. Kompozícia podlá nároku 43 vyznačujúca sa tým, že fibrát sa vyberie z kyseliny fibrovej, gemfibrozilu, bezafibrátu, clofibrátu, fenofibrátu a clinofibrátu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9613691A FR2755699B1 (fr) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible des genes |
| PCT/FR1997/001992 WO1998021349A1 (fr) | 1996-11-08 | 1997-11-06 | Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible de genes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK61499A3 true SK61499A3 (en) | 2000-02-14 |
Family
ID=9497481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK614-99A SK61499A3 (en) | 1996-11-08 | 1997-11-06 | Novel constructs and vectors for the targeted and inducible expression of genes |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020144302A1 (sk) |
| EP (1) | EP0946740A1 (sk) |
| JP (1) | JP2001503279A (sk) |
| KR (1) | KR20000053163A (sk) |
| AU (1) | AU5057898A (sk) |
| BR (1) | BR9713981A (sk) |
| CA (1) | CA2269864A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ163399A3 (sk) |
| FR (1) | FR2755699B1 (sk) |
| HU (1) | HUP9904235A3 (sk) |
| IL (1) | IL129593A0 (sk) |
| NO (1) | NO992153L (sk) |
| SK (1) | SK61499A3 (sk) |
| WO (1) | WO1998021349A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA9710114B (sk) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999005161A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Ligand Pharmaceuticals Incorporated | HUMAN PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GAMMA (PPARη) GENE REGULATORY SEQUENCES AND USES THEREFOR |
| AU6164500A (en) * | 1999-06-22 | 2001-01-09 | Aventis Pharma S.A. | Regulation system of expression using nuclear ppar receptors |
| FR2795425B1 (fr) * | 1999-06-22 | 2003-12-05 | Aventis Pharma Sa | Systeme de regulation pharmacologique de l'expression utilisant les recepteurs nucleaires par et leurs ligands |
| CA2403189A1 (fr) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Charbel Massaad | Promoteurs hybrides inductibles par l'inflammation, vecteurs les contenant et utilisations |
| FR2806418B1 (fr) * | 2000-03-14 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Promoteurs hybrides inductibles par l'inflammation, vecteurs les contenant et utilisations |
| EP1288303A1 (en) * | 2001-08-23 | 2003-03-05 | Aventis Pharma S.A. | Inducible expression systems employing PPAR transcriptional activators |
| WO2003012113A2 (en) * | 2001-08-02 | 2003-02-13 | Gencell S.A. | Inducible expression systems employing ppar transcriptional activators |
| US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
| EP3755795A4 (en) | 2018-02-19 | 2022-07-20 | Homology Medicines, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF |
| TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2070058A1 (en) * | 1991-05-31 | 1992-12-01 | Robert A. Gadski | Vectors and methods for assaying the regulation of apolipoprotein ai synthesis |
| FR2704556B1 (fr) * | 1993-04-30 | 1995-07-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique. |
| FR2718329B1 (fr) * | 1994-03-21 | 2002-09-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Lapin transgénique sensibilisé aux dyslipoprotéinémies. |
| FR2726285B1 (fr) * | 1994-10-28 | 1996-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation |
-
1996
- 1996-11-08 FR FR9613691A patent/FR2755699B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-11-06 WO PCT/FR1997/001992 patent/WO1998021349A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1997-11-06 BR BR9713981-5A patent/BR9713981A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-11-06 KR KR1019990704102A patent/KR20000053163A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-11-06 SK SK614-99A patent/SK61499A3/sk unknown
- 1997-11-06 JP JP52223498A patent/JP2001503279A/ja active Pending
- 1997-11-06 EP EP97913264A patent/EP0946740A1/fr not_active Withdrawn
- 1997-11-06 CA CA002269864A patent/CA2269864A1/fr not_active Abandoned
- 1997-11-06 US US09/297,910 patent/US20020144302A1/en not_active Abandoned
- 1997-11-06 AU AU50578/98A patent/AU5057898A/en not_active Abandoned
- 1997-11-06 HU HU9904235A patent/HUP9904235A3/hu unknown
- 1997-11-06 CZ CZ991633A patent/CZ163399A3/cs unknown
- 1997-11-06 IL IL12959397A patent/IL129593A0/xx unknown
- 1997-11-10 ZA ZA9710114A patent/ZA9710114B/xx unknown
-
1999
- 1999-05-04 NO NO992153A patent/NO992153L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0946740A1 (fr) | 1999-10-06 |
| CA2269864A1 (fr) | 1998-05-22 |
| BR9713981A (pt) | 2000-05-02 |
| AU5057898A (en) | 1998-06-03 |
| WO1998021349A1 (fr) | 1998-05-22 |
| FR2755699A1 (fr) | 1998-05-15 |
| NO992153D0 (no) | 1999-05-04 |
| US20020144302A1 (en) | 2002-10-03 |
| JP2001503279A (ja) | 2001-03-13 |
| FR2755699B1 (fr) | 1998-12-18 |
| CZ163399A3 (cs) | 1999-08-11 |
| HUP9904235A2 (hu) | 2000-04-28 |
| ZA9710114B (en) | 1998-06-08 |
| IL129593A0 (en) | 2000-02-29 |
| KR20000053163A (ko) | 2000-08-25 |
| NO992153L (no) | 1999-05-04 |
| HUP9904235A3 (en) | 2003-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2219241C2 (ru) | Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты) | |
| KR100403708B1 (ko) | 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 | |
| KR100514070B1 (ko) | 재조합아데노바이러스,에이에이브이제조를위한이의용도,상보성세포주및이러한아데노바이러스를함유하는약학조성물 | |
| US6156497A (en) | Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors | |
| KR100510822B1 (ko) | 재조합 아데노바이러스 제조용 세포 | |
| US6033885A (en) | Integrative recombinant adenoviruses, preparation thereof and therapeutical uses thereof | |
| JP3565859B2 (ja) | 改良されたアデノウイルスおよびその使用法 | |
| WO1994029471A1 (en) | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia | |
| US6521426B1 (en) | Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of adeno-associated virus | |
| WO2008095027A2 (en) | Adenoviral vector comprising herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and a transgene for increasing the expression of the transgene | |
| HU226018B1 (en) | Deficien recombinant adenovirus vectors, method for reducing homologous recombination phenomena and method for producing said adenoviruses | |
| SK61499A3 (en) | Novel constructs and vectors for the targeted and inducible expression of genes | |
| KR100484441B1 (ko) | IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스 | |
| MXPA97001766A (en) | Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv | |
| SK169898A3 (en) | Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector | |
| WO2016037931A1 (en) | Nucleic acid constructs and expression vectors for gene therapy of acute porphyrias and other diseases | |
| AU1360002A (en) | Novel constructs and vectors for the targeted and inducible expression of genes | |
| JP2009256370A (ja) | 組換えアデノウイルスベクターおよび使用方法 | |
| AU752811B2 (en) | Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of Adeno-Associated Virus | |
| Erger et al. | 371. Optimizing Capsid Composition for the Production of Recombinant Adeno-Associated Virus Using the Baculovirus Expression System |