WO1995025793A1 - Lapin transgenique sensibilise aux dyslipoproteinemies - Google Patents
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Definitions
- the subject of the present invention is a transgenic rabbit expressing a protein capable of interfering in pathologies linked to dystipoproteinemias, its preparation process and its use as an animal model.
- Dyslipoproteinemias are disorders of the metabolism of lipoproteins, responsible for the transport in the blood and peripheral fluids of lipids such as cholesterol and triglycerides. They lead to significant pathologies, linked respectively to hypercolesterolemia, hypocholesterolemia or hypertriglyceridemia such as atherosclerosis in particular.
- Atherosclerosis is a complex, polygenic disease which is defined, histologically, by deposits (lipid plaques or fibro-lipid) of lipids and other blood derivatives in the wall of the large arteries (aorta, coronary arteries, carotid artery. These plaques, more or less calcified depending on the progress of the process, can be combined with lesions and are linked the accumulation in the arteries of fatty deposits consisting essentially of cholesterol esters. These plaques are accompanied by a thickening of the arterial wall, with enlargement of the smooth muscle, appearance of foam cells and accumulation of fibrous tissue.
- Atheromatous is very clearly in relief on the wall, which gives it a stenosing character r responsible for vascular occlusions by atheroma, thrombosis or embolism which occur in the most affected patients.
- Hypercholesterolaemia can therefore lead to very serious cardiovascular pathologies such as infarction, sudden death, cardiac decompensation, cerebrovascular accidents, etc.
- ⁇ is therefore particularly important to be able to quickly have treatments making it possible to decrease, in certain pathological situations, plasma cholesterol levels or even to stimulate the efflux of cholesterol (reverse transport of cholesterol) in peripheral tissues in order to discharge the cells having accumulated cholesterol against the background of the formation of an athero plaque e.
- LDL low density lipoproteins
- HDL high density lipoproteins
- an animal model capable of expressing a protein capable of interfering in pathologies linked to dyslipoproteinemias.
- Such an animal model would be particularly advantageous for the understanding of these pathologies and more particularly of the regulatory mechanisms they initiate. It would make it possible to test, in vivo and quickly, a large number of therapeutic agents to detect potential activity in terms of the expression of said proteins.
- Such a model would also be interesting for developing new therapeutic methods for the treatment of this type of pathologies such as methods based on gene therapy for example.
- the object of the present invention is precisely to propose a rabbit genetically modified in this sense.
- murins namely mice, rats and guinea pigs
- mice namely mice, rats and guinea pigs
- these small mammals are not always compatible with the intended application. This is why they are not always representative of the human model and its metabolisms.
- the chimpanzee is a control animal which is mainly used to detect therapeutic agents and vaccines directed against AIDS and cancer.
- its very high cost constitutes a major and binding handicap in terms of its use.
- the rabbit has been found in the context of the present invention, the appropriate animal model.
- the metabolism and pathologies linked to lipoproteins are known, in rabbits, exhaustively. It is an animal which is classified as "LDL mammal", that is to say that LDL are the main transporters of plasma cholesterol as in humans, unlike rats and mice which are animals classified as "mammal to HDL ".
- the present invention relates to a transgenic rabbit into the genome of which is inserted at least one exogenous genomic DNA sequence coding for a protein capable of interfering in the pathologies linked to dyslipoproteinemias.
- a transgenic rabbit according to the invention can integrate the genomic DNA sequence into all of its cells or only into a certain percentage of cells, it will then be called mosaic.
- the genomic DNA sequence is integrated at the level of all cells.
- protein capable of interfering in pathologies linked to dyslipoproteinemias is intended to cover, under the designation "apolipoproteins and any protein product having an activity linked to pathologies”. cardiovascular.
- protein product designates any mutant, fragment or peptide having at least one biological property of an apolipoprotein, as well as any natural variant of the apolipoproteins.
- genomic DNA sequence is intended to denote according to the invention, genomic DNA or a hybrid construction consisting for example of a cDNA in which one or more introns are inserted.
- genomic DNA sequence inserted according to the invention codes for all or an active part of at least one protein involved in the metabolism of lipoproteins. It could be:
- apolipoprotein chosen for example from the apolipoproteins A-I, A- ⁇ , A-IV, B, C-I,
- an enzyme such as lipoprotein lipase, hepatic lipase or lecithin cholesterol acyltransferase,
- lipid transfer protein such as the cholesterol ester transfer protein and the phospholipid transfer protein
- -a receptor chosen for example from LDL receptors, chylomicrons-remnants receptors and scavenger receptors.
- This genomic DNA sequence can also comprise several genes, organized where appropriate in the form of a cluster.
- DNA sequences inserted within the meaning of the present invention there may be mentioned more particularly the genes coding for all or an active part of the apolipoproteins AI,
- Apolipoprotein AI is a protein made up of 243 amino acids, synthesized in the form of a preproprotein of 267 residues, having a molecular mass of 28,000 daltons. It is synthesized in humans specifically in the liver and the intestine and it constitutes the essential protein of HDL particles (70% of their mass in proteins). It is abundant in plasma (1.0-1.2 g / 1). Its activity best characterized biochemically is the activation of lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT), but many other activities are attributed to it, such as in particular the stimulation of the efflux of cellular cholesterol.
- LCAT lecithin cholesterol acyl transferase
- Apolipoprotein AI plays a major role in resistance to atherosclerosis, probably linked to the reverse transport of cholesterol, since the mere expression of this apolipoprotein in transgenic mice makes it possible to reduce the surface of lipid deposits at the level of 40 aorta compared to control mice (Rubin et al. 1993 Science, vol 365 p 762). Its gene, 1863 bp long, was cloned and sequenced (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12 (9) (1984) 3917).
- protein products with apolipoprotein AI type activity mention may in particular be made of the natural variants described in the prior art (table below).
- Apolipoprotein B-100 is the major protein component of very low density lipoproteins (VLDL), low density lipoproteins (LDL) and lipoprotein Lp (a). This protein is the physiological ligand of the LDL receptor, and its plasma concentration is positively correlated with the development of atherosclerosis (Brunzell et al. 1984 Arterioscerosis 4, 79-93). ApoB-100 is one of the largest proteins known with a mass of 550 kDa and it contains 4536 amino acids (Chen et al. 1986 J; biol, Chem, 261, 12919-21). This apolipoprotein is only synthesized in the liver. Its plasma concentration is 1.0-1.2 g / l.
- ApoB-100 is the major plasma transporter of cholesterol synthesized in the liver to other cells in the body.
- Another version of apoB, apoB-48 is present in chylomicrons. In humans, apoB-48 is synthesized in the intestine. ApoB-48 has a mass of 260kDa and contains 2152 amino acids which correspond linearly to 48% on the N-terminal side of apoB-100 (Powell et al, 1987, Cell 50, 831-40). Knowing that the C-terminal half of apoB-100 contains the binding zone of apoB-100 to the LDL receptor, apoB-48 does not bind to the latter and behaves metabolically differently.
- Apolipoprotein AIV is a protein made up of 376 amino acids, synthesized specifically in the intestine in the form of a precursor of 396 residue.
- the plasma protein is relatively abundant (0.16 g / 1) and has a molecular mass of 46,000 daltons. It is a major component of the chylomicrons secreted in the lymph, but it has the distinction of being mainly in a form not associated with lipoproteins in the plasma (RB Weinberg et al., 1983, J. Lipid. Research, 24: 52- 59).
- plasma apoAIV is polymorphic, although the nature of this polymorphism is still unknown (G. Utermann et al., 1982, J. Biol. Chem.
- Apolipoprotein E comprises 317 residues, 18 of which correspond to the signal peptide. There is no propeptide.
- the apoE gene has been cloned and sequenced (approximately 3600bp) and codes for an mRNA of 1163bp, [Das et al, J. Biol. Chem., 1985, 260, 6240-6247).
- ApoE is distributed in plasma between VLDL and HDL particles. It represents around 10-20% of the VLDL proteins and 2% of the HDL proteins.
- HDL-E is a separate subclass of HDL.
- the plasma concentration of apoE is approximately 0.05 g / 1.
- ApoE is synthesized as a sialoprotein which is then desialilated in the plasma.
- apoE The synthesis of apoE is carried out by the liver and weakly by the intestine. However, unlike other apolipoproteins, apoE is also synthesized in many other tissues (brain, kidney, adrenal, reticuloendothelial cells ). ApoE recognizes with a very strong affinity the LDL receptor (apoB / E receptor) but also another receptor on liver cells which does not recognize apoB (chylomicron / remnant receptor). A polymorphism has been demonstrated on the basis of different electrophoretic mobilities. Six major phenotypes (E2 / 2, E2 / 3, E2 / 4, E3 / 4, E3 / 3, E4 / 4) have thus been described.
- the e2 allele corresponds to dyslipoproteinemia type HI (phenotype E2 / 2), a disease associated with an increase in cholesterol and triglycerides, xanthomas and early atherosclerosis.
- dyslipoproteinemia type HI phenotype E2 / 2
- An association between the e4 allele and familial Alzheimer's disease has been reported recently (Strittmatter et al. PNAS 99 (1993) 1977). More recently, the destruction of the apoE gene in mice has shown the appearance of hypersusceptibility to atherosclerosis (E. Rubin et al. Cell 1992).
- the inserted genomic DNA sequence also includes sequences allowing its expression in the cell containing it. These may be sequences which are naturally responsible for the expression of said gene when these sequences are capable of functioning in said cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be sequences of eukaryotic or viral genes. By way of example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or from the genome of a virus, and in particular, the promoters of the E1A, MLP genes of adenovirus, CMV promoter, LTR-RSV, etc.
- the non-viral promoter sequences preferentially used are the ApoAI promoters or the hepatic ApoE or intestinal enhancers of the apo CIIL.
- these expression sequences can also be modified by adding activation, regulatory sequences. , etc.
- Genomic DNA can also be included in a large capacity expression vector such as the PI vectors or even the YACs.
- the present invention also relates to the protection of a transgenic rabbit according to the invention capable of interfering in pathologies related to dyslipoproteinemias.
- the invention also relates to a process for obtaining the claimed transgenic rabbit. More specifically, it relates to a process for obtaining the transgenic rabbit according to the invention using the injection into a rabbit embryo of at least one exogenous genomic DNA sequence coding for a protein capable of interfering in pathologies linked to dyslipoproteinemias, the transfer from the embryo to a recipient rabbit and after birth, the control of the presence of said genomic DNA sequence in the genome of the newborn rabbit.
- the process for obtaining according to the invention is described in more detail in Example 2 presented below. The implementation of such a method poses no difficulty to those skilled in the art familiar with micro-injection techniques, removal and implantation of embryos.
- the present invention also relates to the use of the claimed transgenic rabbit to detect the activity of therapeutic agents or therapeutic methods with a view to preventing and / or treating pathologies linked to dyslipoproteinemias as well as to methods of detecting new compounds using this rabbit and the compounds thus characterized.
- the present invention thus offers a particularly advantageous animal model for detecting therapeutic agents specific to the treatment and / or prevention of pathologies linked to dyslipoproteinemias. in particular in the field of cardiovascular diseases such as myocardial infarction, angina, sudden death, cardiac decompensation, cerebrovascular accidents. or in the field of neurological conditions where certain apolipoproteins such as apoE seem to play an important role (diseases of neuronal aging. Familial Alzheimer's, neuronal regeneration).
- FIG. 1 Representation of genomic DNA coding for apolipoprotein AI.
- Clone K 3-5-10 was isolated in this screen and analyzed against the published restriction maps for the AI / CH / AIV genomic complex (S.K. Karathanasis et al, Proc.
- the phage K3-5-10 was amplified in solid medium and its DNA prepared by conventional techniques.
- the EcoRI-BamHI restriction fragment (BamHI digestion makes it possible to separate this fragment well on an agarose gel) containing the ApoAI gene was then purified from a preparative agarose gel and dialyzed against a solution 10 mM tris pH 7-5 EDTA 0.1 nM before injection.
- the superovulation of 28 5 month old New Zealand rabbits was induced by injection of 0.375 g of FSH (folliculin stimulating hormone) from pork morning and evening for 1 day, then from 0.782 mg of FSH from pork morning and evening next day and finally 0.375 mg of pork FSH on the 3rd day in the morning.
- FSH folliculin stimulating hormone
- the 16 rabbits, in a state of superovulation were put in the presence of males of the same breed, to be fertilized.
- 0.33 mg of LH (luteising hormone) is injected into each rabbit.
- the females were separated from the males, then sacrificed. The embryos are removed by washing the uterus of each rabbit.
- the eggs still agglutinated by follicular tissue, are soaked for 20 minutes, approximately in a solution of hyaluronidase. Then they are washed twice in the Brinster's solution. To manipulate them then under the microscope, the eggs were placed in a drop of Brinster-Hepes solution added with cytochalasin. This solution allows the egg to have better resistance to injection.
- L DNA is at a concentration of 2.5 pg / ml in 10 mM Tris pH 7.5-0.1 mM EDTA.
- the 41 rabbits were analyzed as follows: The DNA, extracted from a tail fragment taken from each rabbit, is analyzed by PCR for the presence of human genomic DNA coding for ApoAI.
- the following primers, 5'-TGGCTTTCTCGCCAAGTGTCTTCAGGTGG-3 'and 5'-GACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAA-3', are specific for the sequence of human ApAI and can amplify an 800 bp fragment in transgenic animals.
- Fresh blood samples from transgenic rabbits, 5 months old, and control rabbits were obtained by ear sampling after an overnight fast, and introduced into tubes containing ethylenediaminetetraacetic acid at final concentration of 1.5 g 1.
- the concentration of human apolipoprotein AI was quantified by the HYDRAGEL APOAIB kit (SEBIA, ref. No. 4050), agarose gels kit containing 2 antibodies monospecific polyclonal: anti apoA-I and anti apoB. These antibodies are made in rabbits, which excludes cross-reactivity between humans and rabbits.
- the total cholesterol, triglyceride and HDL (high density lipoprotein) cholesterol assays were carried out with commercial kits (Boehringer Mannheim, Germany).
- the different lipoprotein fractions were separated by ultracentrifugation according to the method of Havel et al. (RJ. Havel, H.A. Eder and J.H. Bragon, 1955, J. Clin. Invest, vol 34, 1345).
- HDL-C concentrations were approximately 2 times higher in transgenic rabbits compared to controls throughout the experiment ( Figure 3).
- a transgenic male rabbit for human and heterozygous WHHL apoA-I was then crossed with WHHL females.
- the rabbits from this cross are half heterozygous WHHL and the other half homozygous WHHL. These rabbits differ in their plasma total cholesterol levels, between 100 and 300 mg / DL for the first group and between 400 and 800 mg / Dl for the second group.
- WHHL heterozygotes and WHHL homozygotes were obtained 14 rabbits from this cross, several of which have the human apoA-I transgene, and this in the two groups of rabbits.
- transgenic rabbits expressing human apoA-I in a homozygous WHHL genetic background Using successive crosses, we therefore obtained transgenic rabbits expressing human apoA-I in a homozygous WHHL genetic background.
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Abstract
La présente invention se rapporte à un lapin transgénique exprimant une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, son procédé de préparation ainsi que son usage à titre de modèle animal.
Description
LAPIN TRANSGENIQUE SENSIBILISE AUX DYSLIPOPROTEINEMIES La présente invention a pour objet un lapin transgénique exprimant une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dystipoprotéinémies, son procédé de préparation ainsi que son usage à titre de modèle animal. Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines, responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l_ιyperc__olestérolémie, l"hypocholestérolémie ou lliypertriglycéridémie telle que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie, sur le plan histologique, par des dépôts (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro- vasculaires, etc. π est donc particulièrement important de pouvoir disposer rapidement de traitements permettant de diminuer, dans certaines situations pathologiques, les taux de cholestérol plasmatique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol) au niveau des tissus périphériques afin de décharger les cellules ayant accurnulé du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athéro e. (Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipoprotéines dont les lipoprotéines de faible densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et ou dégradé).
Dans cette perspective, il serait intéressant de disposer d'un modèle animal capable d'exprimer une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. Un tel modèle animal serait particulièrement avantageux pour la
compréhension de ces pathologies et plus particulièrement des mécanismes de régulation qu'elles initient. Il permettrait de tester, in vivo et rapidement, un nombre important d'agents thérapeutiques pour détecter une activité potentielle au niveau de l'expression desdites protéines. Un tel modèle serait en outre intéressant pour développer de nouvelles méthodes thérapeutiques pour le traitement de ce type de pathologies telles des méthodes basées sur la thérapie génique par exemple.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un lapin génétiquement modifié dans ce sens.
D'une manière générale, les murins à savoir les souris, rats et cobayes sont les modèles animaux les plus répandus. Ils sont facilement manipulables et de faible coût. Malheureusement, ces petits mammifères ne sont pas toujours compatibles avec l'application visée. C'est ainsi qu'ils ne sont pas toujours représentatifs du modèle humain et de ses métabolismes. Plus proche de l'homme, le chimpanzé est un animal témoin qui est surtout utilisé pour détecter des agents thérapeutiques et des vaccins dirigés contre le sida et le cancer. Toutefois, son coût très important constitue un handicap majeur et contraignant au niveau de son utilisation.
Le lapin s'est avéré dans le cadre de la présente invention, le modèle animal approprié. Le métabolisme et les pathologies liées aux lipoprotéines sont connues, chez le lapin, de façon exhaustive. C'est un animal qui est classé 'mammifère à LDL", c'est-à-dire que les LDL sont les transporteurs majoritaires du cholestérol plasmatique comme chez l'homme, contrairement aux rats et souris qui sont des animaux classés "mammifères à HDL". De plus, il existe de nombreuses variations génétiques des niveaux des lipoprotéines parmi les lignées de lapins tels que les lapins WHHL, déficients en récepteur LDL (Watanabe heritable hyperlipidaemic rabbit) ou bien les lapins "St Thomas Hospital" qui surproduisent les LDL (Rosenfeld et al, 1990, Arteriosclerosis _, 680-687 ; Sedon et al; 1987, Arteriosclerosis 7, 113-124).
Plus précisément, la présente invention concerne un lapin transgénique dans le génome duquel est insérée au moins une séquence d'ADN génomique exogène codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
Un lapin transgénique selon l'invention peut intégrer la séquence d'ADN génomique dans toutes ses cellules ou seulement dans un certain pourcentage de cellules, il sera alors dit mosaïque. En général, la séquence d'ADN génomique est intégrée au niveau de toutes les cellules.
Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous la désignation "protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies", les apolipoprotéines et tout produit protéique ayant une activité liée aux pathologies
cardiovasculaires. De préférence le terme produit protéique désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique d'une apolipoprotéine, ainsi que tout variant naturel des apolipoprotéines.
Par séquence d'ADN génomique, on entend désigner selon l'invention, l'ADN génomique ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns.
De préférence, il s'agit d'une séquence d'ADN génomique humaine. Avantageusement, l'utilisation d'ADN génomique comparativement à l'ADN complémentaire conduit à des taux d'expression nettement plus élevés. La séquence d'ADN génomique insérée selon l'invention, code pour tout ou une partie active d'au moins une protéine impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines. Il peut s'agir:
-d'une apolipoprotéine choisie par exemple parmi les apolipoprotéines A-I, A-ϋ, A-IV, B, C-I,
C-π. C-III, D, E, F, G, H, J et aρo(a),
-d'une enzyme telle la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique ou la lécithine cholestérol acyltransférase,
-d'une protéine de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides,
-d'une protéine de liaisons des HDL ou encore
-d'un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons- remnants et les récepteurs scavenger.
Bien entendu, cette liste est présentée à titre non limitatif du domaine de l'invention.
Cette séquence d'ADN génomique peut égalment comprendre plusieurs gènes, organisés le cas échéant sous forme de cluster.
Parmi les séquence d'ADN insérées au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour tout ou une partie active des apolipoprotéines AI,
B, AIV ou E ou d'un variant ou d'un dérivé de celles-ci.
L'apolipoprotéine AI est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la forme d'une préproprotéine de 267 résidus, ayant une masse moléculaire de 28.000 daltons. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et l'intestin et elle constitue la protéine essentielle des particules HDL (70% de leur masse en protéines). Elle est abondante dans le plasma (1.0-1.2 g/1). Son activité la mieux caractérisée sur le plan biochimique est l'activation de la lécithine-cholestérol acyl-transférase (LCAT), mais de nombreuses autres activités lui sont attribuées, comme notamment la stimulation de l'efflux de cholestérol cellulaire. Le rôle physiologique de l'apolipoprotéine AI semble contrebalancé par l'apolipoprotéine AH puisque chez l'homme, le rapport des deux concentrations plasmatiques
(AII/AI) est très étroitement corrélé avec le risque coronarien. L'apolipoprotéine AI joue un rôle majeur dans la résistance à l'athérosclérose, probablement lié au transport inverse du cholestérol, puisque la seule expression de cette apolipoprotéine dans des souris transgéniques permet de réduire de 40 fois la surface des dépôts lipidiques au niveau de l'aorte par rapport à des souris contrôles (Rubin et al. 1993 Science, vol 365 p 762). Son gène, long de 1863 bp, a été clone et séquence (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Parmi les produits protéiques à activité de type apolipoprotéine AI, on peut citer notamment les variants naturels décrits dans l'art antérieur (tableau ci- après).
. L'apolipoprotéine B-100 est le constituant protéique majeur des lipoprotéines de très basses densité (VLDL), des lipoprotéines de basse densité (LDL) et de la lipoprotéine Lp(a). Cette protéine est le ligand physiologique du récepteur LDL, et sa concentration plasmatique est positivement corrélée avec le développement de l'athérosclérose (Brunzell et al. 1984 Arterioscerosis 4, 79-93). L'apoB- 100 est une des plus grosses protéines connues avec une masse de 550 kDa et elle contient 4536 acides aminés (Chen et al. 1986 J; biol, Chem, 261, 12919-21). Cette apolipoprotéine est synthétisée uniquement dans le foie. Sa concentration plasmatique est de 1,0-1,2 g/1. L'apoB-100 est le transporteur plasmatique majeur du cholestérol synthétisé dans le foie vers les autres cellules de l'organisme. Une autre version de l'apoB, l'apoB-48, est présente dans les chylomicrons. Chez l'homme, l'apoB-48 est synthétisée dans l'intestin. L'apoB-48 a une masse de 260kDa et contient 2152 acides aminés qui correspondent de façon linéaire à 48% du côté N-terminal de l'apoB-100 (Powell et al, 1987,
Cell 50, 831-40). Sachant que la moitié C-terminale de l'apoB-100 contient la zone de liaison de l'apoB-100 au récepteur LDL, l'apoB-48 ne se fixe pas sur ce dernier et se comporte métaboliquement différemment.
L'apolipoprotéine AIV (apoAIV) est une protéine constituée de 376 acides aminés, synthétisée spécifiquement dans l'intestin sous la forme d'un précurseur de 396 résidu. La protéine plasmatique, est relativement abondante (0.16 g/1) et a une masse moléculaire de 46.000 daltons. Elle est un composant majeur des chylomicrons sécrétés dans la lymphe, mais elle présente la particularité d'être majoritairement sous forme non associée avec des lipoprotéines dans le plasma (R.B. Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24 : 52-59). Par ailleurs, l'apoAIV plasmatique est polymorphe, bien que la nature de ce polymorphisme soit encore inconnue (G. Utermann et Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257 : 501-507). Le rôle physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lécithin-cholestérol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol. Chem., 260 : 2258-2264) et qu'elle peut, comme l'apolipoprotéine AI, interférer avec la fixation des particules de HDL sur les cellules endothéliales aortiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257 : 4171-4178). Ces deux activités indiquent que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol. Le gène de l'apoAIV a été clone et décrit dans l'art antérieur (voir notamment WO 92/05253 et Elshourbagy et col, J. Biol. Chem., 1987, 26.2(17), 7973-7981). Parmi les produits protéiques à activité de type apolipoprotéine ATV, on peut citer notamment les fragments et dérivés décrits dans la demande de brevet FR 92 00806.
L'apolipoprotéine E comprend 317 résidus dont 18 correspondent au peptide signal. Il n'y a pas de propeptide. Le gène de l'apoE a été clone et séquence (environ 3600bp) et code pour un ARNm de 1163bp, [Das et coll, J. Biol. Chem., 1985, 260, 6240-6247). L'apoE est répartie dans le plasma entre les particules VLDL et HDL. Elle représente environ 10-20% des protéines des VLDL et 2% des protéines des HDL. Les HDL-E constituent une sous-classe distincte de HDL. La concentration plasmatique de l'apoE est d'environ 0.05 g/1. L'apoE est synthétisée sous la forme d'une sialo-protéine qui est ensuite désialilée dans le plasma. La synthèse de l'apoE est réalisée par le foie et faiblement par l'intestin. Cependant, contrairement aux autres apolipoprotéines, l'apoE est également synthétisée dans de nombreux autres tissus (cerveau, rein, surrénales, cellules réticulo-endothéliales...). L'apoE reconnaît avec une très forte affinité le récepteur aux LDL (apoB/E receptor) mais également un autre récepteur sur les cellules hépatiques ne reconnaissant pas l'apoB (chylomicron/remnant receptor).
Un polymorphisme a été mis en évidence sur la base de mobilités electrophorètiques différentes. Six phénotypes majeurs (E2/2, E2/3, E2/4, E3/4, E3/3, E4/4) ont ainsi été décrits. Selon les études menées sur de grandes populations caucasiennes, la prévalence des allèles correspondants serait de 14-15% pour e4, de 74-78% pour e3 et 8-12% pour e2. Un écart est trouvé chez les Finlandais pour lesquels e4 est plus abondant (23%) et e2 moins abondant(4%). L'allèle normal est e3. L'allèle e2 correspondrait à la dyslipoprotéinémie de type HI (phénotype E2/2), maladie associée à une augmentation du cholestérol et des triglycérides, des xanthomes et à une athérosclérose précoce. Une association entre l'allèle e4 et la maladie d'Alzheimer familiale a été rapportée récemment (Strittmatter et al. P.N.A.S. 99 (1993) 1977). Plus récemment la destruction du gène de l'apoE dans la souris a montré l'apparition d'une hypersusceptibilité à l'athérosclérose (E. Rubin et al. Cell 1992).
Généralement, la séquence d'ADN génomique insérée comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule la contenant. Il peut s'agir de séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans ladite cellule. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Les séquences promotrices non virales préférentiellement utilisées sont les promoteurs ApoAI ou les enhancers hépatiques de l'ApoE ou intestinaux de l'apo CIIL Bien entendu, ces séquences d'expression peuvent en outre, être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. L'ADN génomique peut également être inclut dans un vecteur d'expression de grande capacité comme les vecteur PI ou encore les YAC
La présente invention vise également la protection d'un lapin transgénique selon l'invention susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention du lapin transgénique revendiqué. Plus précisément, elle se rapporte à un procédé d'obtention du lapin transgénique selon l'invention mettant en oeuvre l'injection dans un embryon de lapin, d'au moins une séquence d'ADN exogène génomique codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, le transfert de l'embryon à une lapine receveuse et après la naissance, le contrôle de la présence de ladite séquence d'ADN génomique dans le génome du lapin nouveau-né.
Le procédé d'obtention selon l'invention est décrit plus en détail dans l'exemple 2 présenté ci-après. La mise en oeuvre d'un tel procédé ne pose aucune difficulté à l'homme de l'art familiarisé aux techniques de micro-injection, de prélèvement et d'implantation d'embryons. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du lapin transgénique revendiqué pour détecter l'activité d'agents thérapeutiques ou de méthodes thérapeutiques en vu de prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies ainsi qu'aux procédés de détection de nouveaux composés mettant en oeuvre ce lapin et aux composés ainsi caractérisés. La présente invention offre ainsi un modèle animal particulièrement avantageux pour détecter des agents thérapeutiques spécifiques au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires. ou dans le domaine des affections neurologiques où certaines apolipoprotéines comme l'apoE semblent jouer un rôle important (maladies du viellissement neuronal. Alzheimer familial, régénération neuronale).
La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
- Figure 1 : Représentation de l'ADN génomique codant pour l'apolipoprotéine AI.
- Figure 2: Concentration du cholestérol des fractions VLDL et LDL au cours d'un régime riche en cholestérol.
- Figure 3: Concentration plasmatique en cholestérol de la fraction HDL au cours d'un régime riche en cholestérol.
- Figure 4: Evaluation de la surface lésée contenant des stries lipidiques chez les lapins transgéniques et lapins témoins.
- Figure 5: Comparaison de l'accumulation de cholestérol dans l'aorte thoracique des lapins transgéniques et témoins après un régime de 14 semaines. - Figure 6: Comparaison de l'accumulation d'esters de cholestérol dans l'aorte thoracique des lapins transgéniques et témoins après un régime de 14 semaines.
EXEMPLE 1
PREPARATION DU FRAGMENT GENOMIQUE D'APO-Al
Un fragment d'ADN contenant le gène codant pour l'apolipoprotéine AI humaine, sous contrôle de son propre promoteur, a été obtenu par criblage d'une banque génomique humaine.
Pour cela, une banque de fragments partiels EcoRI d'ADN chromosomique issu des cellules K562 a été construite dans le bactériophage Charon 4a. Cette banque a été ensuite criblée par hybridation avec une sonde d'ADN complémentaire de l'apolipoprotéine AI humaine.
Le clone K 3-5-10 a été isolé dans ce criblage et analysé par rapport aux cartes de restriction publiées pour le complexe génomique AI/CH/AIV (S.K. Karathanasis et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6147-6151, 1983. S.K. Karanthanasis, Proc Natl. Acad. Sci. USA,
82, 6374-6378, 1985). Il contient en particulier un fragment EcoRI d'environ 12,5 kbases qui hybride avec l'ADN complémentaire de l'Apo-AI (cf. figure 1).
Le phage K3-5-10 a été amplifié en milieu solide et son ADN préparé par des techniques classiques. Le fragment de restriction EcoRI-BamHI (la digestion BamHI permet de bien séparer ce fragment sur un gel d'agarose) contenant le gène de l'ApoAI a ensuite été purifié à partir d'un gel d'agarose préparatif et dialyse contre une solution de tris 10 mM pH 7- 5 EDTA 0.1 nM avant injection.
EXEMPLE 2
GENERATION DES LAPINS TRANSGENIQUES SELON L'INVENTION
La superovulation de 28 lapines de la race néozélandaise et âgées de 5 mois a été induite par injection de 0,375 g de FSH (folliculine stimulating hormone) de porc matin et soir pendant 1 jour, puis de 0,782 mg de FSH de porc matin et soir le jour suivant et enfin de 0,375 mg de FSH de porc le 3ème jour au matin. Vers 16 heures le même jour, les 16 lapines, en état de superovulation, ont été mises en présence de mâles de la même race, pour être fécondées. A l'issue de la fécondation, 0,33 mg de LH (luteising hormone) sont injectées à chaque lapine. Le 4ème jour au matin, les femelles ont été séparées des mâles, puis sacrifiées. Les embryons sont prélevés par lavage de l'utérus de chaque lapine.
Les oeufs, encore agglutinés par un tissu folliculeux sont trempés pendant 20 minutes, environ dans une solution de hyaluronidase. Puis ils sont lavés deux fois dans la
solution de Brinster. Pour les manipuler ensuite sous le microscope, les oeufs ont été déposés dans une goutte de solution Brinster-Hépès additionnée de cytochalasine. Cette solution permet à l'oeuf d'avoir une meilleure résistance à l'injection.
Par observation au microscope (grossissement xlOO x 200) les oeufs ont été sélectionnés et mis en culture dans du milieu B2 Menezo. Environ 500 embryons ont été retenus pour la microinjection.
Ce même quatrième jour, dans un délai très court de l'ordre de 30 minutes après leur prélèvement, les embryons reçoivent par micro-injection dans le pronucléus mâle 2 picolitres d'une solution de l'ADN obtenu selon l'exemple 1. L'ADN est à la concentration de 2,5 pg/ml dans lOmM Tris pH 7,5-0,1 mM EDTA.
Ces embryons microinjectés ont été ensuite répartis entre 24 lapines de la race néozélandaise en état de pseudo-gestation. Sur ces 24 lapines seulement 3 d'entre elles n'ont pas mené leur gestation à terme. 41 lapereaux sont nés pour 3 mort-nés.
Pour l'identification des transgéniques, les 41 lapereaux ont été analysés de la façon suivante : L'ADN, extrait à partir d'un fragment de queue prélevé sur chaque lapereau, est analysé par PCR pour la présence de l'ADN génomique humain codant pour l'ApoAI. Les amorces suivantes, 5'-TGGCTTTCTCGCCAAGTGTCTTCAGGTGG-3' et 5'-GACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAA-3', sont spécifiques de la séquence de l'ApAI humaine et permettent d'amplifier un fragment de 800pb chez les animaux transgéniques.
6 lapereaux transgéniques sur les 41 analysés, ont de cette manière été identifiés.
Ultérieurement, il a été vérifié que les lapins transgéniques transmettaient le gène Apo-AI à leur descendance.
EXEMPLE 3
CONTROLE DE L'EXPRESSION DE L'APOLIPOPROTEINE A-I HUMAINE DANS LE PLASMA DES LAPINS TRANSGENIQUES
Des échantillons de sang frais des lapins transgéniques, âgés de 5 mois, et des lapins témoins ont été obtenus par prélèvement à l'oreille après une nuit à jeun, et introduits dans des tubes contenant de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique à la concentration finale de 1,5 g 1.
Après le prélèvement, ces tubes ont été mis directement dans de la glace pillée. Le plasma a été obtenu par centrifugation lente de 30 minutes à 4°C.
La concentration d'apolipoprotéine A-I humaine a été quantifiée par le kit HYDRAGEL APOAIB(SEBIA, réf. N°4050), kit de gels d'agarose contenant 2 anticorps
polyclonaux monospécifiques : anti apoA-I et anti apoB. Ces anticorps sont faits chez le lapin, ce qui exclue les réactivités croisées homme-lapin.
Les résultats des dosages d'apolipoprotéine A-I humaine obtenus chez les six lapins transgéniques A-I figurent dans le tableau I ci-après.
Lapin ApoA-I humaine (g/1)
N° 1 (mâle) 1,00
N° 2 (mâle) 1,21
N° 3 (mâle) 0,73
N° 4 (mâle) 0,17
N° 5 (mâle) 0,30
N° 6 (femelle) 0,92
Témoins (5 mâles et 5 femelles) 0,00
Tableau I
EXEMPLE 4
MODIFICATIONS DES PROFII-S LIPOPROTEIOUES CHEZ LES LAPINS TRANSGENIQUES
Les dosages de cholestérol total, triglycérides et du cholestérol HDL (high density lipoprotéines) ont été réalisés avec des kits commerciaux (Boehringer Mannheim, Allemagne). Les différentes fractions de lipoprotéines ont été séparées par ultracentrifugation selon la méthode de Havel et al. (RJ. Havel, H.A. Eder et J.H. Bragon, 1955, J. Clin. Invest, vol 34, 1345).
Les résultats des dosages de lipides obtenus chez les 6 lapins transgéniques A-I et lapins témoins, tous âgés de 5 mois, sont représentés dans les tableaux II et III.
Lapin Triglycérides (mg. dl)
N° 1 (mâle) 39,10
N° 2 (mâle) 11,80
N° 3 (mâle) 15,10
N° 4 (mâle) 09,80
N° 5 (mâle) 29,40
N° 6 (femelle*) 09,50
Témoins (5 mâles et 5 femelles) 25,20 (8)
Tableau II
Tableau III
* = femelle gestante. Entre parenthèse = écart-type **=Very Low Density Lipoprotein.
EXEMPLE 5
PROTECTION DES LAPINS TRANSGENIQUES EXPRIMANT L'APOLIPOROTEINE
A-I CONTRE LE DEVELOPPEMENT DE L'ATHEROSCLEROSE
Pour évaluer la protection obtenue par l'apoA-I chez les lapins transgéniques issus de la lignée n°20, nous avons mis ces lapins et des lapins témoins en régime riche en cholestérol, et nous avons ajusté leur niveaux de cholestérol athérogène, VLDL et LDL-cholestérol (Figure 2). Les concentrations de cholestérol ont augmenté progressivement jusqu'à environ 10-12 g/1 entre la 6,eme semaine de régime et la fin du régime (14 semaines).
Le taux plasmatique du cholestérol-HDL a aussi été évalué. Les concentrations du HDL-C ont approximativement été 2 fois plus élevées chez les lapins transgéniques par rapport aux témoins tout au long de l'expérience (Figure 3).
En fin d'expérience, nous avons évalué les lésions obtenues. Ces lésions se situent notamment au niveau de l'aorte, surtout de la crosse aortique et au départ des artères. L'utilisation de lapins nous permet ici d'avoir une quantification plus précise des lésions et de connaître leur nature. Les résultats de cette expérience montrent que la surface contenant les lésions chez les lapins transgéniques correspond à environ 50% de celle observée chez les lapins témoins (Figure 4).
L'accumulation de cholestérol dans l'aorte est aussi significativcment plus faible chez les lapins transgéniques que chez les témoins (Figure 5).
Cette différence concerne notamment la quantité d'esters de cholestérol retrouvé au niveau de l'aorte. On observe en effet, une accumulation des CE chez les lapins témoins qui n'est pas retrouvée chez les lapins transgéniques (Figure 6).
En utilisant le lapin comme modèle, nous avons donc mis en évidence le rôle protecteur de l'apoA-I dans le phénomène d'athérosclérose.
EXEMPLE 6
OBTENTION DE LAPINS TRANSGENIQUES EXPRIMANT L'APOLIPOROTEINE A-I DANS UN FOND GENETIQUE WATANABE
Le lapin transgénique n°20 a été croisé avec des femelles WHHL (Watanabe Heritable HyperLipemic). Chez 8 des 15 descendants, tous hétérozygotes pour la déficience en récepteur LDL. nous avons détecté la présence du transgène. Ces 8 lapins sont donc transgéniques pour l'apoA-I et hétérozygotes pour la déficience en récepteurs LDL. Les concentrations en HDL-C sont de 70±10 mg/Dl chez les lapins transgéniques apoA-I humaine (n=8) contre 35±10 md/DL chez les lapins témoins (n=7). La concentration plasmatique d'apoA-I chez les transgéniques est l.OO±O.15 mg/DL (n=7).
Un lapin mâle transgénique pour l'apoA-I humaine et hétérozygote WHHL a ensuite été croisé avec des femelles WHHL. Les lapins issus de ce croisement sont pour la moitié hétérozygotes WHHL et pour l'autre moitié homozygote WHHL. Ces lapins se différencient par leur niveaux plasmatiques de cholestérol total, entre 100 et 300 mg/DL pour le premier groupe et entre 400 et 800 mg/Dl pour le second groupe. Nous avons obtenus 14 lapins issus de ce croisement dont plusieurs possèdent le transgène apoA-I humaine et ceci dans les deux groupes de lapins. hétérozygotes WHHL et homozygote WHHL.
En utilisant des croisement successifs, nous avons donc obtenu des lapins transgéniques exprimant l'apoA-I humaine dans un fond génétique homozygote WHHL.
Claims
1. Lapin transgénique dans le génome duquel est insérée au moins une séquence d'ADN exogène génomique codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
2. Lapin transgénique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN génomique humain.
3. Lapin transgénique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la séquence d' ADN code pour au moins une apolipoprotéine ou un produit protéique ayant une activité liée aux pathologies cardiovasculaires.
4. Lapin transgénique selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la séquence d' ADN code pour tout ou une partie active de l'apolipoprotéine AI, de l'apolipoprotéine B, de l'apolipoprotéine AIV, de l'apolipoprotéine E ou d'un variant ou d'un dérivé naturel de celles-ci.
5. Lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN génomique insérée comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule la contenant.
6. Lapin transgénique selon la revendication 5 caractérisé en ce que ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation et/ou de régulation.
7. Lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 6 caractérisé en ce qu'il exprime au moins une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
8. Procédé d'obtention d'un lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 7 mettant en oeuvre l'injection dans un embryon de lapin, d'au moins une séquence d'ADN exogène génomique, codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, le transfert de l'embryon à une lapine receveuse et après la naissance, le contrôle de la présence de ladite séquence d'ADN génomique dans le génome du lapin nouveau- né.
9. Utilisation d'un lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 7 pour détecter l'activité d'agents thérapeutiques ou de méthodes thérapeutiques en vu de prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
10. Procédé pour détecter des composés utiles pour prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un lapin selon l'une des revendications de 1 à 7.
11. Composés mis en évidence selon le procédé de la revendication 10.
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