CA2184202A1

CA2184202A1 - Lapin transgenique sensibilise aux dyslipoproteinemies

Info

Publication number: CA2184202A1
Application number: CA002184202A
Authority: CA
Inventors: Patrick Benoit; Patrice Denefle; Nicolas Duverger; Louis Marie Houdebine
Original assignee: Individual
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-03-21
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 1995-09-28
Also published as: FR2718329B1; EP0751993A1; US5792902A; WO1995025793A1; FR2718329A1; JPH10501683A

Abstract

La présente invention se rapporte à un lapin transgénique exprimant une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, son procédé de préparation ainsi que son usage à titre de modèle animal.

Description

WO gS/25793 2 1 8 4 2 0 2 I _~/r~ . - .
r ~PIN TR ~NCGF.~rOUE ,CF,N.CTR~T .T~F. A~ JX DY.CT IPOpROTF ll~.Mll~.C
La présente imentiQn a pLur objet un lapin L V' ', exprimant une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux '~ , ' son prccede de préparation ainsi que son usage à titre de modèle r~l.
Les J~ , sL nt des désordres du ' ' des ~i .
'' du tLansport dans le sang et les fluides 1' ;' , de lipides ccn~ne b cholestérol et les l-i~.i~. Elles Lionduiserlt à des pathologies iLnportantes, Lees ,~i._..~-. à ]' JI ' ' ' 1~L~L ' ' ~ OU 11~LA~h~ ' '' te~le que LIC4amment r L'~ ' est une rnaladie coLnplexe, ~ ,, , , q~u est définie, sur le plan ~ S , par des dépôts (plaques lipidiques ou fibr~lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sangLuns dans la paroi des grosses artères (aorte, arteres corLnaires, car~tide), Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon 1' du prLlcessus, peLIvent etoe jurnelees à des lésions et sont Lees à 1' ' dans les artèoes de depots graisseux constitLlés 5 ' ,~: 11 .; d'esters de cholestéroL Ces plaques ~ d'un, de la paroi artérieLle, avec ~ .' du muscle Lisse, apparition de ceDules spumeuses et de tissu fibreLu~, La plaque ' est toes r~eLnent en oelief sur la paroi, ce q u lui confèoe un caractèoe stenosant responsable des occlusions vasculaioes par athérome, throrn~se ou ernboLe qui sLuviennent cbez les patients les plus atteints, Les 20 ~"~,, ' ' peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves teLes que l'infarctus, la mort subite, la ~' . cardiaque. Ies aociderlts céoebrovasculaioes, etc.
Il est donc I ' ` impL [tant de pouvoir disposer rapidement de traitements per~nettant de duninuer, dans certaines situations I ' ' _ . les taux de cholestérol 25 plasmatique voioe de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol) au niveau des tissus I ;' . afin de décharger les ceLules ayant aocurr~lé du cholestérol dans le o~ntexte de la formation d'une plaque d'athéroLne, (Le cholestéL~I est véhicLllé dans le sang par diverses 'i, ~, dorlt les 'i,, ~- de faible der~sité (LDL) et les 'i, . de haute densité (HDL), Les LDL sont syr~étisées au niveau du foie et 30 perrnettent d'~ les tissus I ' .' . en cholestérol. Au contraire, les HDI.captent le cholestérol au niveau des tissus I . ' , et le transportent vers le foie où il est stocké et/ou dégradé).
Dans cette perspective, il serait intéressant de disposer d'un modèle animal capable d'exprimer une protéine susceptible d'ir~férer dans les pathologies Lées aux 35 ~ li, . ' Un tel modèle animal ser~it I "' avantageux pour la FEUILLE DE REMPLA~EMENT (RE~iLE 26) Wo 95/25793 . vl/rl 5 i~ -21 8420~ --q ~ de ces path~ologies et plus ~ des mécanismes de régulation qu'elles initdent. Il permettrait de tester, in vivo et rapidement, un nombre important d'agents i . , pour detecter une activité potentielle au niveau de rexpression desdites protéines. Un oel modèle serait en outre intéressant pour développer de nouvelles méthodes 5 Ih .~ pour le traitement de ce type de pathologies telles des méthodes basées sur la thérapie génique par exemple.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un lapin modifié dans ce sens.
D'une manière générale, les murins à savoir les souris, rats et cobayes sont les modèles 10 animaux les plus répandus. Ils son~ facilemcnt , . '' et de faible coût.
r~ ~ t, ces petits mammifères ne sont pas toujours compatibles avec l'application visée~ C'est ainsi qu'ils ne sont pas toujours ~ iL du modèle humain et de ses ' ' Plus prcche de l'homme, le cbimpanzé est un aoimal temoin qui est surtout utilisé pour détecter des agents ~ , et des vaccins dirigés contre le sida et le canoer.
15 Toutefois, son coût très impcrtant constitue un handicap majeur et v au niveau de son utilisation.
Le lapin s'est avéré dans le cadre de la présente invention, le modèle animal approprié.
Le l- et les pathologies liées aux l;~,u~ ..w sont oonnues, chez le lapin, de fa,con exhaustive. C'est un animal qui est classé 'mammifère à LDL", c'est-à-dire que les LDL sont les ~ majorihires du cholestérol plasmatique oomme cbez Illomme, aux rats et souris qui sont des animaux classcs n r à HDL". De plus, il existe de nombreuses variations génétiques des niveaux des l;~ ---~ parmi les lignées de lapins tels que les lapins WHHL, déficients en réccpteur LDL (Wahnabe herihble l-" li,-' -rabbit) ou bien les lapins "St Thomas Hospital" qui ~ les LDL (Rosenfeld et al, 1990, A-~ b~ 10, 680-687; Sedon et al; 1987, A-~ .u~L~ Z, 113-124).
Plus précisément, la présente invention conceme un lapin l~ , , l - dans le génome duquel est insérée au moios une séquence d'ADN génomique exogène codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux J.r~ u,~
Un lapin i ~- . selon l'invention p~ut intégrer la séquence d'ADN génomique dans toutes ses cellules ou seulement dans un certain pourcenhge de cellules, il sera alors dit mosaique. En general, la séquence d'ADN génomique est intégrée au niveau de toutes les cellules.
Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous la désignation "protéine susceptible d'interférer dans les patbologies liées aux ~ ~", les .~ li . ' et tout produit protéique ayant une activité liée aux path!ologies ~ W09S/25793 21 ~ Y~llr~S~

" . ' De préférenoe le terme produit protéique designe tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique d'une a; 'i, ~ u~;..~:, ainsi que tout variant naturel des ~ J ~
Par æquence d'ADN génomique, on entend désigner selon l'invention, rADN
5 génomique ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel æraient insérés un ou plusieurs introns.
De préférence, il s'agit d'une séquence d'ADN génomique humaine.
A~ I'utilisation d'ADN génomique w~ al~l;.. à l'ADN
. ' conduit à des taux d'expression nettement plus élevés.
La séquenoe d'ADN génomique insérée selon rinvention, code pour tout ou une partie active d'au moins une protéine impliquée dans le . ,~ des lipu,ul u.~ ,~.11 peut s'agir ~'une . 'i , choisie par exemple pammi les: . li, , A-I, A-ll, A-IV, B, C-l, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), -d'une enzyme telle lâ lipoprotéine lipase, la lipase hépatique ou la lécithine cholestérol . . r~
-d'une protéine de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholesterol et la protéine de transfert des l ~
-drune protéine de liaisons des HDL ou encore -d'un réoepteur choisi par exemple pammi les recepteurs LDL, récepteurs des ~I-ylu...;~,lu~
20 remnants et les récepteurs scavenger.
Bien entendu, oetle liste est présentee à titre non limitatif du domaine de rinvention.
Cette séquence d'ADN génomique peut egalment compoendoe plusieurs gènes, organisés le cas échéant sous fomme de cluster.
Parmi les æquence d'ADN inséoees au æns de la présente inYention, on peut citer 25 plus ua~ Ies gènes codant pour tout ou une partie active des . ~ij, Al, B, AIV ou E ou d'un variant ou d'un dérivé de celles-ci.
L'apuliuu~,.u..;.~ AI est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la fomme d'une ,u~ -ul~lu.-;.-e de 267 résidus, ayant une masse moléculaioe de 23.000 daltons. Elle est synthétisée chez rhomme ~ ;r;,~ dans le foie et rintestin et elle 30 constitue la protéine essentielle des particules HDL (70% de leur masse en protéines). Elle est abondante dans le plasma (10-12 g/l) Son activité la mieux caractérisée sur le plan biochimique est l'activation de la lecithine-cholestérol acyl-transférase (LCAT), mais de nomboeuses autres activités lui sont attribuées, comme notamment la stimulation de l'efflux de cholestérol oerlulaire. Le rBle ,ull.r"iolo~ e de 1', 'i, . u.~ I~ Al semble ~ par 35 r;, ~ u~ 1l All puisque chez l'homme, le rapport des deux .~...., ..~,.I;.,..~ 1,l , -I;.I,.

W0951250793 2 1 8 4 2 0 2 P_l/r~ lo (AII/AI) est très éttoitement corrélé avec le risque coronatien~ L'j:~JVI;PV~ IV~;. G Al joue un rôle majeur dans la résistance à r~ldl;.~lGIvaG~ lié au transport inverse du cholestétvl, puisque la seule exprGssion de cette ~ i, . dans des souris ~
permet de réduire de 40 fois la surface des depôts lipidiques au niveau de l'aor~e par rapport a des souris contrôles (Rubrn et al. 1993 Science, vol 365 p 762). Son gène, long de 1863 bp, a été cloné et séquencé (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 1~21(1984) 3917) . Panmi les produits protéiques à activite de type .1, ~i, , U.~;.IG Al, on peut citer notamment les vatiants naturels décrits dans l'att antérieur (tableau ci-aprw).
Variant: Mutation Variant Mutation Milano Argl73Cys Norvay Glu136Lys Marburg LyslO70 Prol65Arg Munster2B Alal58Glu Pro3His Giessen Prol43Arg ArglOLeu Munster3A AsplO3Asn Gly26Arg Munster3B Pro4Arg Asp89Glu Munster3C Pro3Arg LyslO7Met Munster3D Asp213Gly Glu139Gly Munster4 Glu198Lys Glul47Val Yame Aspl3Tyr Alal58Glu Asp213Gly Glul69Gln Argl77His L'~vlipvl,,v~;..e B-lûO est le constituant protéique majeur des li~tJIv~..-w de très basses densité (VLDL), dew L,uu,ulv~lw de basse densité (LDL) et de la lipoprotéine Lp(a).
Cette protéine est le Lgand ~ Oivlvb;.lue du récepteur LDL, et sa l l - I ,- ;", . plasmatique est ~iLi~. corrélée avec le d;.~lv~)~elll~lt de l'ah~.va-,lélvae (Brunzell et al. 1984 A~ , 79-93). L'apoB-100 est une des plus grosses protéines con~ues avec une masse de 550 kDa et elle contient 4536 acides aminés (Chen et al. 1986 J, biol, Chem, 261, 12919-21). Cette a~ . v~ le est synthétisée uniquement dans le foie. Sa c~
plasmatique est de 1,0-1,2 g/l. L'apoB-100 est le tri~nsporteur plasmatique majeur du cholestérol synthétisé dans le foie vers les autres cellules de rorganisme. Une autre version de 20 I'apoB, l'apoB-48, est présente dans les ~..rlvllli~vlla. Chez Ihomme, I'apoB48 est synthétisée dans l'intestin. L'apoB-48 a une masâe de 260kDa et contient 2152 acides aminés qui ~.~.,._1,., l, ..: de façon Lnéaire à 48~ du cvté N-temminal de l'apoB-100 (Powerl et al, 1987, ~ W095/25793 2 1 84202 p~ r~ 6 Cell 50, 831-40). Sachant que la moitié C-tem~inale de l'apoB-100 contient la wne de liaison de rapoB-100 au récepteur LDL, I'apoB-48 ne se fixe pas sur ce dernier et se comporie .rF; .... - "
L'a~,ul;~ul,.ulGi.le AIV (apoAlV) wt une protéine constituée de 376 acides aminés, synthétisée ~ r;,l, ~l dans rrAtestin sous la forme d'un prGcurseur de 396 résidu. La proteine r~ . wt relativement abondante (0.16 g/l) et a une masse moléculaire de46.000 daltons. Ere est url composant majeur dw ~I~,ylu~ ul~ sécrétés dans la Iymphe, mais er~e presente la particularité d'etre ; sous fomme non associée avec des li~ù,u-uo .. w darls le plasma (R.B. Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24: 52-59).
Par ailleurs, I'aroAIV plasmatique wt polymorphe. bien que la nature de ce ~vl~. L
soit encore mcormue (G. Utemmann et Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257: 501-507). Le role IAl~;ulu~ uG de rapoAlV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lécithin-cholestérol-~ rGI~G (LCA~ (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol. Chem., ~11: 2258-2264) et qu'elle peut, o~mme 1' . 'i, . Al, interférer avec la frxation des particules de HDL sur les cellules i ' ` - ' aortiques bovrAes (Savion et Coll., 1987, Eur.
J. Biochem., 257: 41714178). Ces deux activités indiquent que l'apoAlV intervient très v ` ` ` comme médiateur du transport inverse du cholestérol. Le gène de l'apoAlV
a éte cloné et décrit dans l'art anterieur (voir notamment WO 92/05253 et Elshourbagy et col, J. Biol. Chem., 1987, 262(17), 7973-7981). Parmi les produits protéiques à activité de type Il lil ., A~V, on peut citer notamment les fragments et dérivés décrits dans la demande de brevet FR 92 00806.
L'~,uli~uul, E oomprend 317 résidus dont 18 ~ au peptide signal.
Il n'y a pas de propeptide. Le gène de l'apoE a été cloné et séquencé (environ 3600bp) et code rour un ARNm de 1163bp, [Das et coll, J. Biol. Chem., 1985~ 260, 6240-6247). L'apoE est répartie dans le plasma entre les particules VLDL et HDL. Elle représente environ 10-20% des proteines des VLDL et 2~Vo des protéiAes des HDL. Lw HDL-E constituent une sous-classe distincte de HDL. La .. A~ I plasmatique de l'apoE est d'environ 0.05 g/l. L'aroE est synthétisée sous la fonme d'une sialo-protéine qui wt ensuite désialilée dans le plasma. La 3v synthèse de l'apoE est réalisée par le foie et faiblement par l'intestin. Cependant,, aux autres I 'i, I . rapoE wt également synthétisée dans de nomboeux autres tissus (cerveau~ rein, surrénales, cerlules reticulo ` ` ) L'apoE reconAait avec une très forte affinité le récepteur aux LDL (apoB/E receptor) mais également un autre récepteur sur les cellules hépatiques ne pas l'apoB (~ IVII~ VI~GIIUI~II receptor).

Wo 95/25793 2 1 8 4 2 0 ~ /r~ . ,~

Un Uvl~ a éte mis en évidence sur la base de mobilités différentes. Six phénotypes majeurs (E212, E2/3, E2/4, E3/4, E3/3, E4/4) ont airlsi été décrits.
Selon les études menées sur de grandes populations la prévalence des arlèles serait de 14-15% pour e4, de 74-78% pour e3 et 8-12% pour e2. Un écart est 5 trouvé chez les F~nlandais pour lesquels e4 est plus abondant (23%) et e2 moins (4~v). L'allèle normal est e3. L'allèle e2 ~ à la v~ . 'i, ., de type m (phénotype E2/2), maladie associée à une ~ du cholestérol et des triglycérides, des xanthomes et à une ' vol,l~lvot précoce. Une association entre rallèle e4 et la maladie d'Alzheimer familiale a été rapportée récemment (Slrittmatter et al. P.N.A.S. 99 ~1993) 1977).0 Plus récemment la destruction du gène de l'apoE dar~s la souris a montré l'apparition d'une à lld~llelvoul~voe (E. Rubin et al. Cell 1992).
, la séquence d'ADN génomique insérée comprend également des séquenoes pemmettant son expression dans la cellule la contenant. Il peut s'agir de sequences qui sont ~ de l'expression dudit gène lorO~que ces séquenoes sont 15 susceptibles de fonctionner dans ladite cellule. n peut également s'agir de séquences d'origine différente (~ I -l~ de l'expression d'autres protéines, ou meme ,r.~ éliuu~o). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux. A dtre d'exemple, il peut s'agir de sequences prvmotrices issues du génome de la oellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des genes ElA, MLP d'adénovirus, le promoteur 20 CMV, LTR-RSV, etc. Les séquences promotrices non virales l,.;';.. ~; Il ~-: utilisées sont les promoteurs ApoAI ou les enhancers hépatiques de l'ApoE ou intestinaux de l'apo Clll, Bien entendu, ces sequences d'expression peuvent en outre, etre modifiées par addition de séquences d'acdvadon, de réguladon, etc. L'ADN génomique peut également être inclut dans un vecteur d'expression de grande capacité comme les vecteur P1 ou encore les YAC
La présente invention vise également la protection d'un lapin ~ selon l'invention suscepdble d'interférer dans les pathologies liées aux ~OIi~v!"v~.ii,-é-~ O.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention du lapin oevendiqué, Plus précisément, elle se rapporte à un procéde d'obtention du lapin ~
selon l'invention mettant en oeuvre l'injection dans un embryon de lapin, d'au moins une séquence d'ADN exogène génomique codant pour une prvtéine susceptible d'interrérer dans les pathologies liées aux ~ vulv~f:illf~ d, le transfert de l'embr~von à une lapine receveuse et après la naissance, le contrôle de la présence de ladite séquence d'ADN genomique dans le 35 génome du lapin nouveau-né.

wo ss/2~i7s3 2 1 8 ~ 2 ~12 ]! ~ llr~

Le procedc d'obtention selon l'invention est décnt plus en détail dans l'exemple 2 présenté ci-aprcs. La mise en oeuvre d'un tel procedé ne pose aucune difficulte à l'homme de l'art familianse aux techniques de micro-injection~ de prélèvement et d' ,' d'embryons.
S La presente invention se rapporte egalement à l'utilisation du lapin i ~' .revendiqué pour detecter l'activite d'agents i' , , ou de méthodes i' . . en vu de prévenir etlou traiter les pathologies liées aux .I~. 'i,, ainsi qu'aux procédés de détection de nouveaux composés mettant en oeuvre cc lapin ct aux composés ainsi caractenses.
La presente invention offre ainsi un modele animal, ' avantageux pour detecter des agcnts i' , , specifiques au traitement et~ou à la prevention des pathologics liées aux ~ . . en particulicr dans le domaine des affections ' . ' . comme l'infarctus du myocarde. I'angor, la mort subite, la ~" .
cardiaque, les accidents cérebro . ' ou dans le domaine des affections . ' ~ .
15 où certaines u,uul~uu,u~utO;~,~ comme l'apoE semblent jouer un rôle important (maladies du . _I ..~_....,.IL neurollal, Alzlleimer familial. regenération neuronale).
La présente invention est plus ~ , " décrite à l'aide des exemplcs et figures qui suivent. qui doivent ctre considercs commc illustratifs ct non limitatifs.
- Figurc 1: R~"UIC~I~IILGLjUII de l'ADN genomique codant pour 1', 'i, " Al.
- Figure 2: ~'- du cholesterol des fractions VLDL et LDL au cours d'un regime riche en cholestérol.
- Figure 3~ plasmatique en cholestérol de la fraction HDL au cours d'un régime riche en cholestérol.
- Figure 4: Evaluation de la surface léséc contenant des strics lipidiques chez les lapins i _ . et lapins témoins.
- Figure 5: O- . dc 1' ' de cholcstérol dans l'aorte thoracique des lapins i _ , et temoins apres un regime de 14 semaines.
- Figure 6: C~ . de 1' ' d'esters de cholesterol dans l'aorte thoracique des lapins i _ , et tcmoins après un regime de 14 semaines.

W095/2s793 21 84202 r~l/rlv~ -O

EXEMPLE I
PRFPARATIONDUFR~ T~;FN~ IrFD'AF~-AI
Un fragment d'ADN contenant le gene codant pou~ r, -~ I, Al humaine, 5 sous controle de son propre promoteur, a été obtenu par criblage d'une banque génomique humaine.
Pour cela, une banque de fragments partiels EcoRI d'ADN ' . issu des cellules K562 a été construite dans le' .' v Charon 4a. Cette banque a été ensuite criblée par hybridation avec une sonde d'ADN ~ de 1'. ~i, . Al 10 humaine.
Le clone K 3-5-10 a été i~olé dans ce criblage et analysé par rapport aux cartes de restriction publiees pour le complexe génomique AVClvAlV (S.K. I~-~tl` ~ iC et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6147-6151,1983 S.K. ~: ' Proc Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6374-6378,1985). n contient en particulier un fragment EcoRI d'environ 12,5 kbases qLu 15 hybride avec l'ADN ~ . ' de rApo-AI (cf. figure 1).
Le phage K3-5-10 a été amplifié en milieu solide et son ADN préparé par des techniques classiques. Le fragment de restriction EcoRI-BamHI (la digestion BamHI permet de bien séparer ce fragmenl sur un gel d'agarose) contenant le gène de l'ApoAI a ensuite été
purifié à partir d'un gel d'agarose préparatif et dialysé contre une solution de tris 10 mM pH 7-20 5 EDTA 0.1 nM avant injection.
EXEMPLE 2GENFR ~T r~N DF.C LAPINS TRA N.Cf .F~IDI IFC SF~ r)N L'lNVENTrON
La ~u~ a~ l de 28 lapines de la race ' ' et agées de 5 mois a été
induite par injection de 0,375 mg de FS~ (folliculine stimulating hommone) de porc matin et soir pendant I jour, puis de 0,782 mg de FSH de porc matin et soir le jour suivant et enfin de 0,375 mg de FSH de porc le 3ème jour au matin. Vers 16 heures le meme jour, les 16 lapines, 30 en état de su~ u..-laliul" ont été mr~es en présence de males de la meme race, pour etre fécondées. A l'issue de la fécondation, 0,33 mg de LH (luteising hormone) sont injectées à
chaque lapine. Le 4ème jour au matin, les femelles ont été séparées des mâles, purs sacrifiées.
Les embryons sont préleves par lavage de l'utéru.~ de chaque lapine.
Les oeufs, encore agglutinés par un trssu folliculeux sont trempés pendant 35 20 minutes, ~ viron dans une solution de ~J ' ' Puis ils sont laves deux fois dans la W0 95/25793 2 1 8 4 2 0 2 ~ ., .6 solution de Brinster. Pour les manipuler ensuite sous le microscope, les oeufs ont éte déposés dans une goutte de solution Brinster-Hépès addutionnée de ~ ~ll~d~ . Cette solution pemmet à l'oeuf d'avoir une meilleure résistance à l'injection.
Par observation au microscope (~-u~i~ x100 x 200) les oeufs ont eté
5 sélectionnés et mis en culture dans du milieu B2 Menezo. Environ 500 embryons ont été
retenus pour la l~ ,lUUI;~ ;UII.
Ce même quatrième jour, dans un délai très court de l'ordre de 30 minutes ap~es leur prélèvement, les embryons reçoivent par micro-injection dans le pronucléus male 2 picolitres d'une solution de l'ADN obtenu selon l'exemple 1. L'ADN est à la ~ 1 de 2,5 pglml lû dans 10mM Tris pH 7,5-0,1 mM EDTA.
Ces embryons llllk,~u~;~L~ ont été ensuite répartis entre 24 lapines de la race " ' en état de pseudo-gestation. Sur ces 24 lapines seulement 3 d'entre elles n'ont pas mené leur gestation à temme. 41 lapereaux sont nés pour 3 mort-nés.
Pour l';~ ... des i " . les 41 lapereaux ont été analysés de la fa,con 15 suivante: L'ADN, extrait à partir d'un fragment de queue prélevé sur chaque lapereau, est analysé par PCR pour la presenoe de rADN génomique humain codant pour rApoAI. Les amorces suivantes, 5'-TGGCTTTCTCGCCAA(~ AGGTGG-3' et 5'-GACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAA-3', sont spécifiques de la séquence de l'ApAI humaine et permettent d'amplifier un fRgment de 800pb chez les animaux20 '~
6 lapereaux ~ - sur les 41 analysés, ont de cette manière été identifiés.
UIL~ U~ il a été vérifié que les lapins ~ ,f ,;~ le gène Apo-AI à leur rla~ n~l .naa EXEMPiE 3 CONTROI F DE L'EXPT~FCCrON DE L'APOI.IT~OPROTEn~F A-l ITIrM~INF ~N~C LF. PLA~ DF.C
L~PINS TRANC(1F~IOITFC
Des échantillons de sang frais des lapins ~ a~, agés de 5 mois, et des lapins temoins ont été obtenus par prélèvement à l'ooeire après une nuit à jeun, et introduits dans des tuT~es contenant de l'acide étbylène-diamine L~ éLi~ e à la ,l-,- - IIA~;IIII finale de 1,5 gfl.
Après le prélevement, ces tubes ont été mis directement dans de la glace pillée Le plasma a été
obtenu par ~ lente de 30 minutes à 4C.
La ~ d;~ d';ll ul;~ u~-uLéilR A-I humaine a été quantifiée par le kit HYDRAG~ APOAIB(SEBIA, réf. N4050), kit de gels d'agarose contenant 2 anticorps WO9S/25793 2 1 84202 P~/r~_. 16 polyclonaux ~ ~ ;r;.~ anti apoA-I et anti apoB. Ces anticorps sont faits chez le lapin, ce qui exclue les réactivités croisees homme-lapin.
Les résultats des dosages d', 'il, A-l humaine obtenus chez les six lapins ..... ~,.'.:' 1 , A-l figurent dans le tableau I ci-après, Lapin ApoA-I humaine (g/l) N 1 (male) 1,00 N 2 (mâle) 1,21 N 3 (male) 0,73 N 4 (male) 0,17 N 5 (mâle) 0,30 N 6 (femelle) 0,92 Témoins (5 males et 5 femelles) 0,00 Tableau I

Ml')nTFTCATlONSDF.CPROFII.';I TPOPROTFTOIlF!~CrrF7LFS:LAPTNS~rRANcllFl~lolrF.~:

Les dosages de cholestérol total, triglycérides et du cholestérol HDL (high density li~u~ '' ` ont eté réalises avec des kits ~- ,... - -~: -- ~ (Boehringer Mannheim, Allemagne).
Les différentes fractions de li~ut~u~ ~ ont été séparées par ~ ;r~ selon la méthode de Havel et al. (RJ. Havel, H.A. Eder et J.H. Bragon, 1955, J. Clrn. Invest, vol 34, 15 1345).
Les résulIats des dosages de lipides obtenus chez les 6 lapins llr -~ A-l et lapins témoins, tous ages de 5 mois, sont représentés dans les tableaux II et 111.

W0 9512~5793 ~ rr.: 5 16 ~ 2 ~
Lapin Triglyc6ridos (mg/dl) N 1 (male) 39,10 N 2 (mâle) 11.80 N 3 (male) 15,10 N 4 (mâle) 09,80 N 5 (mâle) 29,40 N 6 (femelle*) 09,50 Témoins (5 ma]es et 5 femelles) 25,20 (8) Tablcau ll VLDL~$
Lapirl Cholcst6rol +LDL-C
VLDLLDL HDL Total HDL-C
m~/dlm~/dl m~,/dl m~/dl N 1 (male) 0,9 09,7 26,6 37,2 0,40 N 2 (mâle) 0,4 06,0 30,9 37,3 0,20 N 3 (male) 1,2 11,5 19,6 32,0 0,45 N 4 (mâle) 0,6 07,6 13,9 æ,1 0,58 N 5 (mâle) 1,2 03,1 10,8 15,1 0.39 N 6 (femelle*) I,5 06,6 22,5 --30,6 0,36 ~émoins (5 mâles & 5 femelles) 2,3 (0,5) 26,1 (5,1) 23,6 (4,3) 52,0 (8.2) 01,20 (0,2) Tablcau lll * = femelle gestante. Entre parenthèse = écart-type **=Ve~y Low Densi~ Lipoprolein.

Wo 95125793 r~-,r~ ~
21 8~2~

EXEMPLE S
PROTECTION DES LAPINS TRANSGENIOUES EXPRIMANT L'APOLIPOROTEINE
A-l CONTRE LE DEVELOPPEMENT DE L'ATHEROSCLEROSE
S Pour évaluer la protection obtenue par l'apoA-I chez les lapins i ~, , issus de la ligmée n20, nous avons mis ces lapins et des lapins temoins en régime riche en cholestérol. et nous avons ajusté leur niveaux de cholesterol athérogène~ VLDL et LDL-cholesterol (Figure 2). Les de cholestérol ont augmentc ~nv~ alv, jusqu'à environ 10-12 g/l entre la 6ième semaine de régime et la fin du régime ( 14 semaines).
Le taux plasmatique du cholestérol-HDL a aussi été evalué. Les ~ du HDL-C ont ,, .. été 2 fois plus élevées chez les lapins i ,, , par rapport aux témoins tont au long de l'expenence (Figure 3).
15 En fin d'experiencc, nous avons cvaluc les lésions obtenues. Ces lésions se situcnt notamment au niveau de l'aorte, surtout de la crosse aortique et au depart des arteres. L'utilisation de lapins nous permet ici d'avoir une, ' plus prccise des lesions et de conna^~tre leur nature.
Les résultats de cette expenence montrent que la surface contenant les lésions chez les lapins 20 i v , correspond a environ 50% de celle observee chez les lapins témoins (Figure 4).
L' ' de cholestérol dans l'aorte est aussi ! ',, ' ' " . . ' plus faiblc chcz les lapins que chez les témoins (Figure 5).
25 Cette difference concerne notamment la quantite d'esters de cholesterol retrouvé au niveau de l'aorte, On observe en effet. une ' dcs CE chcz les lapins ténwins qui n'est pasretrouvee chez les lapins i ~ , (Figurc 6).
En utilisant le lapin comme modele, nous avons donc mis en évidence Ic rôlc protectcur de 30 I'apoA-I dans le phénomène d'2~11.. ,.v~-,16.v~

OBTENTIO~ DE LAPINS TRANSGENIOUES EXPRIMANT L'APOLIPQROTEINE A-l DANS UN FOND GENETIQI,JE WATANABE _ _ WO 95/~5793 2 1 8 4 2 0 2 I _llr~ . . ~

Le lapin i ~ , n20 a été croisé avec des femelles WHHL (Watanabe Hentable HyperLipemic). Chez 8 des 15 !' ' ', tous ll~,t~l.UL.~ pour la déficience en recepteur LDL. nous avons dctecte la presence du transgene. Ces 8 lapins sont donc _ , pour I'apoA-I et ll.~t~hvLJ~,u.~ pour la déScience en reoepteurs LDL. Les en HDL-C
sont de 70+10 mg/DI chez les lapins _', apoA-I humaine (n=8) contre 35+10 md/DL chez les lapins témoins (n=7). La .~ plasmatique d'apoA-I chez les est 1.00+0.15 mg/DL (n=7).
Un lapin màle i _ . pour l'apoA-I humaine et heteroygote WHHL a ensuite éte croisé
avec des femclles WHHL. Les lapins issus dc ce croisement sont pour la moitie l~.,t~,luL.~
WHHL et pour l'autre moitié homozygote WHHL. Ces lapins se ~1iff~rrnrif~t par leur niveaux I ' , de cholcstcrol total. entre l O0 ct 300 mg/DL pour le premier groupe et entre 400 et 800 mg/DI pour le second groupe. Nous avons obtenus 14 lapins issus de ce croisement dont plusieurs possedent le transgenc apoA-I humaine et oeci dans les deux groupes de lapins.
I~,t~,lULyt;Ut~ WHHL et homoygote WHHL.
~n utilisant des croisement sucoessifs. nous avons donc obtenu dcs lapins ~ _' .exprimant l'apoA-I humaine dans un fond genetique homoygote WHHL.

Claims

REVENDICATIONS

1. Lapin transgénique dans le génome duquel est insérée au moins une séquence d'ADN
exogène génomique codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

2. Lapin transgénique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN génomique humain.

3. Lapin transgénique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la séquence d'ADN
code pour au moins une apolipoprotéine ou un produit protéique ayant une activité liée aux pathologies cardiovasculaires.

4. Lapin transgénique selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la séquence d' ADN code pour tout ou une partie active de l'apolipoprotéine AI, de l'apolipoprotéine B, de l'apolipoprotéine AIV, de l'apolipoprotéine E ou d'un variant ou d'un dérivé naturel de celles-ci.

5. Lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN génomique insérée comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule la contenant.

6. Lapin transgénique selon la revendication 5 caractérisé en ce que ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation et/ou de régulation.

7. Lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 6 caractérisé en ce qu'il exprime au moins une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

8. Procédé d'obtention d'un lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 7 mettant en oeuvre l'injection dans un embryon de lapin, d'au moins une séquence d'ADN exogène génomique, codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, le transfert de l'embryon à une lapine receveuse et après la naissance, le contrôle de la présence de ladite séquence d'ADN génomique dans le génome du lapin nouveau-né.

9. Utilisation d'un lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 7 pour détecter l'activité d'agents thérapeutiques ou de méthodes thérapeutiques en vu de prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

10. Procédé pour détecter des composés utiles pour prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un lapin selon l'une des revendications de 1 à 7.

11. Composés mis en évidence selon le procédé de la revendication 10.