JPH11514881A - Ｇａｘタンパク質の癌治療への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＧＡＸタンパク質あるいはその変異体の全部あるいは一部をコードする核酸の治療上の使用、特に癌の治療のための使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＡＸタンパク質の癌治療への応用 本発明は癌の治療のための新規な方法に関する。特に、ｐ５３のような腫瘍抑 圧遺伝子についての突然変異あるいは欠損ｒａｓ（自律複製配列）のようなオン コジーンを発現する腫瘍細胞において、調節障害を生じた細胞増殖の遮断により 癌を治療する方法に関する。本発明はまた、遺伝子治療を調節することができる ベクターの使用ならびにかかるベクターを含む製薬組成物に関する。 一般にｐ２１タンパク質と称されるｒａｓ遺伝子産物は、それらを必要とする すべての真核生物にとって、細胞分裂のコントロールにおいて鍵となる役割を果 たす。これらのタンパク質の特異的修飾の一部は正常なコントロールを失わせ、 腫瘍形成性へと導く。それ故、数多くのヒト腫瘍が修飾ｒａｓ遺伝子の存在に結 びついてきた。同様に、これらのｐ２１タンパク質の過剰発現は細胞増殖の調節 障害を導きうる。 正常な細胞環境においては、このオンコジーンの増殖はおそらくｐ５３やＲｂ のようないわゆる腫瘍抑圧遺伝子の生成によ って、少なくとも一部は、妨げられる。たとえばｐ５３タンパク質は、少なくと も野性の形態では、細胞の増殖および分裂を負に調節し、特定の状況ではアポプ トシスを誘発することができる転写因子であることが知られている（Ｙｏｎｉｓ ｈ−Ｒｏｕａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、３４５−３４７、１９９１）。こ れらの特性は細胞ＤＮＡの完全性が脅かされるストレス条件下で発現するので、 ｐ５３は「ゲノムの番人」であると示唆されてきた。しかしながら、ある種の現 象がこの細胞の自己調節機序を混乱させ、新生物形成状態の発現を促進すること がある。かかる事象のひとつが腫瘍抑圧遺伝子における突然変異である。たとえ ばＲｂ遺伝子の不活化形態は種々の腫瘍、特に網膜芽細胞腫あるいは骨肉腫のよ うな間葉癌における役割が疑われており、またあらゆる種類を混合したヒト腫瘍 の約４０％において突然変異ｐ５３の存在が認められている（検討にあたっては 、Ｍｏｎｔｅｎａｒｈ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、７、１６７３−１６８０、１９９２ ；Ｏｒｅｎ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、６、３１６９−３１７６、１９９２；Ｚａｍｂ ｅｔｔｉとＬｅｖｉｎｅ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、７、８５５−８６５、１９９３参 照）。 それ故、この種の細胞増殖調節障害に抗するように干渉する、および／あるい は腫瘍抑圧遺伝子におけるこの種の欠損を補足する可能性のある生物学的化合物 を明らかにすることは、発癌現象の治療アプローチにおいて非常に興味深い。 本発明はまさに、部分的には、ＧＡＸタンパク質がｒａｓタンパク質によって 誘発される細胞増殖の潜在的な阻害因子であることを明らかにすることから生じ ている。特に、腫瘍細胞において変調を来した細胞増殖が、ＧＡＸタンパク質を 発現することによって修復されうることを証明することから生じている。 ＧＡＸタンパク質は３０３個のアミノ酸から成るタンパクである。その塩基配 列は特性付けられており、ｃＤＮＡがクローニングされている（Ｇｏｒｓｋｉら 、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３、６、３７２２−３７３３）。ｇａｘ 遺伝子（成長停止特異的ホメオボックス）は異形化遺伝子属に属する。これらの 遺伝子は、ＤＮＡの特定領域(あるいはホメオボックス)を認識するコンセンサス 配列（あるいはホメオドメイン）を含む転写因子をコードする（参照：Ｇｅｈｒ ｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、７８：２１１−２２３、１９９４）。ラットのｇａｘタン パク質のホメオドメインは１８５から２４５のアミノ酸の間に含ま れる。この遺伝子はｇａｓおよびＧａｄｄ遺伝子と類似したいくつかの特性を有 している。というのは、同様に細胞周期のＧ０／Ｇ１移行を制御すると思われる からである。たとえば、ＰＤＧＦに２時間接触したあと、第Ｘ因子のラットＣＭ ＬＶにおいてｇａｘのｍＲＮＡのレベルが低下する（Ｇｏｒｓｋｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３、６、３７２２−３７３３）。従ってＣＭＬＶの 分裂反応においてｇａｘ遺伝子の発現が抑制される。ｉｎ ｖｉｖｏではこれら の所見には反論がある。ラットでは、頚動脈の剥離によって引き起こされる内膜 肥厚はｇａｘ発現の大きな低下に結びついているからである（Ｗｅｉｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５、２７０、５４５７−５４６１）。 ｇａｘ遺伝子の発現は心臓血管系、特に心臓と大動脈において明らかにされて おり、従って現在までのところ、この遺伝子の遺伝子治療における使用は、それ が自然に発現されるこれらの細胞に限定されてきた。 意外にも本出願人は、腫瘍細胞、すなわち内因的にはｇａｘ遺伝子を発現しな い細胞での細胞増殖に対するＧＡＸタンパク質の阻害活性を好都合に高めること ができることを発見した。 本発明はそれ故、非小細胞性の肺癌、膵癌および結腸癌、骨肉腫等のような細 胞増殖の調節不全に関連する腫瘍の治療のために特に有効な新しいアプローチを 提供する。 本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで直接腫瘍内に供給送達することができる特に 有効な系、その化合物、ならびに癌の成長の抑制についても述べる。 本発明の第一の目的は、従って、癌の治療を意図した製薬組成物を調製するた めにＧＡＸタンパク質あるいはその変異体を使用することにある。 より正確には、本発明は、癌の治療を意図した製薬組成物を調製するために、 ＧＡＸタンパク質あるいはその変異体の全部あるいは一部をコードする少なくと も１つの核酸配列を使用することに関する。 前述したように、ＧＡＸタンパク質あるいはその変異体の全部あるいは一部を コードする遺伝子が対象である。本発明の意味するところでは、変異体の語は、 ＧＡＸの少なくとも１つの生物学的特性を有するあらゆる突然変異体、断片ある いはペプチド、ならびに他の種から得られたＧＡＸのあらゆる同族体を表わす。 これらの断片および変異体は当業者には既知の手法、 特にその生物学的活性に応じて変異体を選択することができる、遺伝的および／ あるいは化学的および／あるいは酵素的修飾、あるいはハイブリダイゼーション あるいは発現を通してのクローニングによって入手することができる。遺伝的修 飾には抑圧、欠失、突然変異等が含まれる。 使用する核酸配列は、ラットのＧＡＸタンパク質あるいはその変異体の１つの 全部あるいは一部をコードしうる。 本発明の目的に使用される遺伝子は、好ましくはラットのＧＡＸタンパク質あ るいはそのヒト同族体をコードする遺伝子である。より好ましくはｃＤＮＡある いはｇＤＮＡである。 請求の範囲に含まれる核酸配列は、治療部位にそのまま注入するか、もしくは 破壊するあるいは治療する細胞とともに直接インキュベートすることができる。 実際に、裸の核酸配列が特別なベクターなしで細胞内に浸透しうることが述べら れている。しかし、本発明の範囲内では、（ｉ）細胞浸透の効率、（ｉｉ）ター ゲティング、（ｉｉｉ）細胞外および細胞内での安定性を改善することができる 投与ベクターを使用することが望ましい。 様々な種類のベクターが使用できる。ウイルスあるいは非ウイルス性ベクター が使用しうる。 本発明に従ったベクターは、たとえば原核細胞あるいは真核細胞において核酸 配列の移入と発現を促進することができる非ウイルス性作用物質でありうる。化 学的あるいは生化学的ベクターは、特に簡便さや安全性の理由から、またトラン スフェクトするＤＮＡの大きさに関して理論的には制限がないことから、天然の ウイルスに代わる有利な代替策である。 これらの合成ベクターは２つの主要な機能を持つ。すなわちトランスフェクト する核酸をコンパクトに組み込むこと、そしてその細胞固定ならびに原形質膜、 場合によっては２つの核膜を通しての通過を促進することである。核酸のポリア ニオン特性を回避するために、非ウイルス性ベクターはポリカチオン電荷を有す る。 開発された合成ベクターのうち、ポリリジン型のカチオン性ポリマー、（ＬＫ ＬＫ）ｎ、（ＬＫＫＬ）ｎ、ポリエチレンイミンおよびＤＥＡＥデキストラン、 あるいはカチオン性脂質あるいはリポフェクタントが最も好都合である。それら はＤＮＡを圧縮し、細胞膜との結合を促進する特性を持つ。リポフェクタントの 中では、リポポリアミン（リポフェクタミン、トランスフェクタム等々）や種々 のカチオン性あるいは中性脂肪 （ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ等々）あるいはリポソームが挙げられる。最 近、受容体によって媒介される標的トランスフェクションの概念が開発された。 これは、カチオン性ポリマーと、移入しようとする細胞型の表面に存在する膜受 容体のリガンドとの化学結合を通して複合体の膜への固定を導きながら、カチオ ン性ポリマーによってＤＮＡを圧縮するという原理を利用している。たとえばト ランスフェリン、インシュリンの受容体あるいは肝細胞のアシアログリコプロテ インの受容体のターゲティングが述べられている。 本発明において使用される核酸配列は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内 、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路による投与のために製剤することができる 。好ましくは注射剤型で使用される。それ故、注射用製剤のための、特に治療部 位への直接注射のための製薬学的に許容されるあらゆる賦形剤と混合することが できる。特に、減菌液、等張液、あるいは乾燥組成物、中でも、場合に応じて滅 菌水または生理的血清を加えて注射溶質を生成することができる凍結乾燥組成物 である。患者の腫瘍内への核酸配列の直接注射は、治療効果を罹患組織に集中さ せることができるので有利である。使用する核酸配列の用量は、 様々なパラメータ、特にベクター、使用する投与方法、関連する疾病あるいは求 める治療期間に応じて調節しうる。 本発明を実施するために、欠損組換えウイルスを用いることは特に好都合であ る。 たとえばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、そして最近で はアデノ関連ウイルスを使用することができる。これらのベクターはトランスフ ェクションの面で特に性能が高いことが確認されている。 本発明は、それ故、ＧＡＸタンパク質あるいはその変異体の全部あるいは一部 をコードする、少なくとも１個の挿入された遺伝子を含む欠損組換えウイルスの 使用を第二の目的とする。本発明はまた、そのようなウイルスを癌の治療のため に使用することを目的とする。本発明のベクターにおいては、挿入されるおよび ／あるいは存在する遺伝子は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮ Ａ）の断片、あるいはたとえば１個または数個のイントロンが挿入されたｃＤＮ Ａから成るハイブリッド構築物でありうる。また合成あるいは半合成配列でもよ い。 一般に、挿入される遺伝子は、感染細胞中での発現を可能にする配列も含む。 それらの配列が感染細胞中で機能すると考え られる時には、自然の状態で該遺伝子の発現の役割を担う配列でありうる。また 、異なる由来の配列（他のタンパク質の発現の役割を担う配列、さらには合成配 列）でもよい。特に、特異的あるいは非特異的に、また誘発的あるいは非誘発的 に遺伝子の転写を刺激するあるいは抑制する、真核性あるいはウイルス性遺伝子 の配列あるいは誘導配列である。例として、感染させることを所望する細胞のゲ ノム、あるいはウイルスのゲノムから生じたプロモーター配列、特にアデノウイ ルスのＥ１Ａ、ＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ−Ｒ ＳＶ等々である。真核性プロモーターの中では、汎存性プロモーター（ＨＰＲＴ 、ビメンチン、−アクチン、チューブリン等）、中間径フィラメントのプロモー ター（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）、治療的遺伝子の プロモーター（ＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子等）、組織特異的プロモー ター（平滑筋細胞のアクチンプロモーター）、分裂中の細胞において選択的に活 性化されるプロモーター、あるいは刺激に反応するプロモーター(ステロイドホ ルモンの受容体、レチノイン酸の受容体等)が挙げられる。さらに、これらの発 現配列は活性化配列、調節配列等を付加して修飾することがで きる。その他に、挿入される遺伝子が発現配列を含まない時には、そのような配 列の下流の欠損ウイルスのゲノム中に挿入することができる。 さらに、挿入される遺伝子は一般に、コード配列の上流に、標的細胞の分泌経 路において合成されるポリペプチドを制御するシグナル配列を含む。このシグナ ル配列はＧＡＸの自然のシグナル配列でもよいが、他の機能的シグナル配列（た とえばチミジンキナーゼ遺伝子のシグナル配列）あるいは人工的シグナル配列で もよい。 本発明に従ったウイルスは欠損している、すなわち標的細胞において自律的に 複製することができない。一般に、本発明の範囲内で使用される欠損ウイルスの ゲノムは、従って、少なくとも感染した細胞中での該ウイルスの複製に必要な配 列が欠如している。これらの領域は除去するか（全部あるいは一部）、機能しな いようにするか、もしくは他の配列、特に挿入遺伝子によって置換することがで きる。それにもかかわらず、好ましくは、欠損ウイルスはウイルス粒子をカプシ ドで被包するのに必要なそのゲノム配列を保存している。 様々なセロタイプのアデノウイルスが存在し、その構造と特 性が多少異なっている。これらのセロタイプのうちで、本発明の範囲内では２ま たは５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２あるいはＡｄ５）あるいは動物由来のア デノウイルス（特許出願ＷＯ９４／２６９１４号参照）を使用することが好まし い。本発明の範囲内で使用することができる動物由来のアデノウイルスとしては 、イヌ、ウシ、マウス（たとえば：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥あるいはサル（たとえば：ＳＡＶ ）が挙げられる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスはイヌアデノウイルス 、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス［たとえばマンハッタンあるいはＡ２ ６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）系統］である。好ましくは、本発明の範囲 内ではヒトあるいはイヌあるいは混合由来のアデノウイルスを使用する。 好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスはＩＴＲ、カプシド被包を可能にす る配列ならびに対象とする核酸を含む。さらに好ましくは、本発明のアデノウイ ルスのゲノムにおいては、少なくともＥ１領域が非機能性である。考慮されるウ イルス遺伝子は、当業者に既知の手法、特に完全抑圧、置換、部分的欠失、ある いは考慮される遺伝子に１個または数個の塩基を加え ることによって非機能性にすることができる。そのような修飾はｉｎ ｖｉｔｒ ｏ（単離したＤＮＡに関して）あるいはｉｎ ｓｉｔｕで、たとえば遺伝子工学 の手法によって、あるいは変異原による処理によって達成することができる。そ の他の領域、特にＥ３（ＷＯ９５／０２６９７号）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３ ８号）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８５１２号、ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９５／ ０２６９７号）およびＬ５（ＷＯ９５／０２６９７号）領域も修飾することがで きる。好ましい実施方法によれば、本発明に従ったアデノウイルスはＥ１および Ｅ４領域における欠失を含む。もうひとつの好ましい実施方法によれば、本発明 に従ったアデノウイルスはＥ１領域の欠失を含み、そこにＥ４領域とＧＡＸをコ ードする配列（ＦＲ９４１３３５５参照）が挿入されている。本発明のウイルス では、Ｅ１領域における欠失は、好ましくはアデノウイルスＡｄ５の配列上のヌ クレオチド４５５〜３３２９にわたっている。 本発明に従った欠損組換えアデノウイルスは、当業者には既知の手法によって 調製することができる（Ｌｅｖｅｒｏら、Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５ 、ＥＰ１８５ ５７３；Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７ ）。特 に、アデノウイルスとプラスミド、特に所望するＤＮＡ配列を含むプラスミドと の間の同種組換えによって調製できる。同種組換えは、適当な細胞系統における 前記のアデノウイルスとプラスミドの同時トランスフェクション後に生じる。使 用する細胞系統は好ましくは、（ｉ）前記の要素によって形質転換できなければ ならず、（ｉｉ）欠損アデノウイルスのゲノムの部分を補助することができる配 列を、好ましくは組換えの危険性を避けるため組込まれた形態で含んでいなけれ ばならない。系統の例として、特にアデノウイルスＡｄ５（１２％）のゲノムの 左側部分をそのゲノム内に組込んで含むヒト胚子腎系統２９３（Ｇｒａｈａｍら 、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）あるいは特に特許出願ＷＯ ９４／２６９１４号およびＷＯ９５／０２６９７号に述べらているようなＥ１お よびＥ４機能を補助することができる系統が挙げられる。 次に、増殖したアデノウイルスを回収し、分子生物学の古典的手法に従って精 製する。 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に関しては、感染する細胞のゲノム内に安定且 つ部位特異的に組込まれる、比較的小さなＤＮＡウイルスである。細胞の成長、 形態あるいは分化に影響を 及ぼさずに、広いスペクトルの細胞に感染することができる。また、ヒトにおい ては疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムはクローニングされており、 配列決定され、特性付けられている。約４７００の塩基を含み、各々の末端に約 １４５塩基の逆方向反復領域（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔｅｄｒｅｇｉｏ ｎ，ＩＴＲ）を持ち、ウイルスの複製の起源として働く。ゲノムの残りの部分は カプシド被包機能を持つ２つの主要領域に分けられる：ゲノムの左側部分は、ウ イルスの複製とウイルス遺伝子の発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含む；ゲノムの右 側部分はウイルスのカプシドタンパクをコードするｃａｐ遺伝子を含む。 ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子移入のための、ＡＡＶから 誘導したベクターの使用は文献中に述べられている（特にＷＯ９１／１８０８８ 号；ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５ ，１３９，９４１号、欧州特許第４８８ ５２８号参照）。これらの特許出願は 、ｒｅｐおよび／あるいはｃａｐ遺伝子が欠失しているかあるいは所望する遺伝 子によって置換されている、ＡＡＶから誘導した種々の構築物、ならびに該遺伝 子のｉｎ ｖｉｔｒｏ （培養細胞に関して）あるいはｉｎ ｖｉｖｏ（直接生体において）での転移の ためのそれらの使用について述べている。本発明に従った欠損組換えＡＡＶは、 ヒト補助ウイルス（たとえばアデノウイルス）に感染させた細胞系統において、 ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）にはさまれた核酸配列を含むプラスミ ドとＡＡＶのカプシド被包遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を持つプラスミ ドの同時トランスフェクションによって調製することができる。次に、生じた組 換えＡＡＶを古典的手法によって精製する。本発明はそれ故、ゲノムがＡＡＶの ＩＴＲにはさまれたＧＡＸをコードする配列を含む、ＡＡＶから誘導される組換 えウイルスにも関する。本発明はまた、ＡＡＶの２つのＩＴＲにはさまれたＧＡ Ｘをコードする配列を含むプラスミドにも関する。そのようなプラスミドは、場 合によってはリポソームベクター（偽ウイルス）に組込まれた、ＧＡＸの配列を 移入するためにそのまま使用することができる。 レトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築は文献中に広く記述されて いる：特に欧州特許第４５３２４２号、欧州特許第１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓ ｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ 、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９等々参照。特に、レトロウイルス は分化中の細胞に感染するインテグラティブ（組込み）ウイルスである。レトロ ウイルスのゲノムは主として２つのＬＴＲ、カプシド被包配列および３つのコー ド領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから誘導される 組換えベクターにおいては、一般にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の全部ま たは一部が欠失しており、所望する異種核酸配列によって置換されている。これ らのベクターは、特にＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー白血病ウイルス；さらには ＭｏＭＬＶとも称される）、ＭＳＶ（マウスモロニー肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ （ハーベイ肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウ イルス）あるいはフレンドウイルスのような種々のタイプのレトロウイルスから 作製することができる。 本発明に従ったＧＡＸをコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築す るためには、一般に、特にＬＴＲ、カプシド被包配列および前記のコード配列を 含むプラスミドを構築し、次にそれを用いて、プラスミドに欠如しているレトロ ウイルス機能をトランスでもたらすことができる、カプシド被包の細胞 系統をトランスフェクトする。それ故一般に、カプシド被包系統はｇａｇ、ｐｏ ｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することができる。そのようなカプシド被包系統は 先行技術の中で述べられており、特にＰＡ３１７系統（米国特許出願第４，８６ １，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ系統（ＷＯ９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ ｅｎｖＡｍ−１２系統（ＷＯ８９／０７１５０号）が挙げられる。さらに、組換 えレトロウイルスは、転写活性を抑圧するためのＬＴＲにおける修飾、ならびに ｇａｇ遺伝子の部分を含む拡大カプシド被包配列(Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ.Ｖｉｒｏ ｌ.６１（１９８７）１６３９)を含みうる。その後、生じた組換えレトロウイル スを古典的手法によって精製する。 癌の治療にとって、欠損組換えアデノウイルスを使用することはとりわけ好都 合である。比較的少量の有効成分（組換えアデノウイルス）を使用して、治療す る部位に有効で極めて速やかな効果を及ぼすことができる。本発明のアデノウイ ルスはまた、導入されたｇａｘ遺伝子を高いレベルで発現することができ、その ことはこれらのウイルスに極めて有効な治療効果を与えるものである。さらに、 そのエピソーム特性のゆえに、本発明のアデノウイルスは増殖細胞において限ら れた残存性を持ち、 従って求める治療効果に完璧に適合した一過性の作用を有する。 注射のために使用するウイルスの用量は、種々のパラメータに応じて、特に使 用する投与方法と求める治療期間に応じて調整することができる。一般に、本発 明に従った組換えウイルスは１０⁴から１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ（両端を含む）用量 の形態で製剤され、投与される。ＡＡＶおよびアデノウイルスについては、１０⁶ 〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの用量も使用できる。ｐｆｕ（プラーク形成単位）とい う用語はビリオンの懸濁液の感染力に相当し、適当な細胞培養を感染させ、一般 には４８時間後に感染細胞数を数えて測定する。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測 定手法は文献中に広く記述されている。 本発明は、過剰増殖（すなわち異常増殖）細胞の破壊のためにｉｎ ｖｉｖｏ で好都合に使用される。 本発明は、たとえば腫瘍細胞の破壊に適用できる。活性オンコジーンが関与し ている癌の治療には特に適する。例として、結腸の腺癌、甲状腺癌、肺の癌腫、 骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂ型リンパ腫、卵巣癌 、膀胱癌、神経グリア芽細胞腫等が挙げられる。 さらにこの治療は、ヒツジ、ウシ、ペット動物（イヌ、ネコ 等）、ウマ、魚等のあらゆる動物と同様にヒトにも適用できる。 以下の実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは例示であっ て、本発明を制限するものとみなしてはならない。図の説明 図１：プラスミドｐＣＯ１の表示。 図２：プラスミドｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAの表示。 図３：ヒト腫瘍細胞Ｈ４６０における細胞増殖へのｇａｘＡｄＣＭＶ発現の作用 の表示。 図４：Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０００（図４Ａ）、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１００（図４Ｂ）および Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０００（図４Ｃ）での、ｇａｘＡｄＣＭＶアデノウイルスで治療 した腫瘍細胞Ｈ４６０。 図５：ヒト腫瘍細胞Ｓａｏｓにおける細胞増殖へのｇａｘＡｄＣＭＶの作用の表 示。 図６：ヒト腫瘍細胞Ｈ３５８における細胞増殖へのｇａｘＡｄＣＭＶ発現の作用 の表示。分子生物学の一般的手法 プラスミドＤＮＡの予備抽出、塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心 分離、アガロースゲルあるいはアクリルアミ ドでの電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノールあるいはフェノ ール−クロロホルムでのタンパク質の抽出、エタノールあるいはイソプロパノー ルによる食塩水媒質中でのＮＡの沈降反応、大腸菌における形質転換等々のよう な分子生物学で用いられる古典的方法は当業者には周知であり、文献において豊 富に記述されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、（編集），“Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ型のプラスミドおよびＭ１３シリーズのファージは市販 されている（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）。 結合のためには、アガロースゲルあるいはアクリルアミド電気泳動によりＤＮ Ａ断片をその大きさに応じて分離し、フェノールあるいはフェノール／クロロホ ルム混合物によって抽出し、 エタノールで沈降させ、その後供給業者の勧めに従ってファージＴ４のＤＮＡリ ガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で培養する。 突出５’末端の充填は、供給業者の仕様書に従い、大腸菌のＤＮＡポリメラー ゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のクレノー断片によって実施することができる。突出３ ’末端の破壊は、製造業者の勧めに従って使用されるファージＴ４のＤＮＡポリ メラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で実施される。突出５’末端の破壊は、ヌ クレアーゼＳ１で慎重に処理することによって実施される。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成オリゴデオキシヌクレオチドによって制御される突 然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍが市販しているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒ ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６ ４］が開発した方法に従って実施できる。 いわゆるＰＣＲ［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ触媒連鎖反応）、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ.Ｂ ．とＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］の手法 によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、製造業者の仕様書に従い、「ＤＮＡサーマル サイクラー」(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ)を用いることによって実 施できる。 ヌクレオチド配列の有効性確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍが市販しているキットを 使用し、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７ ４(１９７７)５４６３−５４６７］が開発した方法によって実施できる。実施例１：プロモーターＣＭＶの制御下での、ラットｇａｘタンパク質をコード する遺伝子を持つベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAの構築。 この実施例は、ｇａｘタンパク質をコードするｃＤＮＡ(種：ラット)と、組換 えを可能にするアデノウイルス配列を含むベクターの構築を述べるものである。 １８個のアミノ酸を含むインフルエンザウイルスの赤血球凝集素のエピトープ（ エピトープＨＡ１）をｇａｘタンパク質のＮ末端に付加する（Ｆｉｅｌｄら、Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５、１９８８）。このエピト ープ付加の工程は、特に免疫蛍光検査法により、エピトープＨＡ１に対する抗体 を用いてｇａｘの発 現を追跡することができる。その感受性に加えて、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒ ｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、内因性ｇａｘタンパク質の発現に対応する基礎ノ イズを免れることができる。 １．１．プラスミドｐＣＯ１の構築（図１）Ａ−プラスミドｐＣＥの構築 まず最初にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側末端に相当するＥｃｏＲＩ− ＸｂａＩ断片を、ベクターｐＩＣ１９ＨのＥｃｏＲＩとＸｂａＩ部位の間でクロ ーニングした。これによってプラスミドｐＣＡが生じる。次にプラスミドｐＣＡ をＨｉｎｆＩで切断し、その突出５’末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのク レノー断片で充填して、ＥｃｏＲＩで切断した。アデノウイルスＡｄ５のゲノム の左側末端を含むプラスミドｐＣＡのこのようにして生じた断片を、ベクターｐ ＩＣ２０ＨのＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位の間でクローニングした(Ｍａｒｓｈら 、Ｇｅｎｅ ３２（１９８４）４８１)。これによってプラスミドｐＣＢが生じ る。次にプラスミドｐＣＢをＥｃｏＲＩで切断し、その突出５’末端を大腸菌の ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で充填して、それをＢａｍＨＩで切断した 。アデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側末端を含むプラスミドｐＣＢ のこのようにして生じた断片を、ベクターｐＩＣ２０ＨのＮｒｕＩとＢｇ１ＩＩ 部位の間でクローニングした。これによってプラスミドｐＣＥが生じるが、その 興味深い特性は、多点クローニング部位に続くアデノウイルスＡｄ５の最初の３ ８２塩基対を有していることである。Ｂ−プラスミドｐＣＤ’の構築 まず最初にアデノウイルスＡｄ５のゲノムのＳａｕ３Ａ（３３４６）−Ｓｓｔ Ｉ（３６４５）断片とＳｓｔＩ（３６４５）−ＮａｒＩ（５５１９）断片を結合 させ、ベクターｐＩＣ２０ＨのＣ１ａＩとＢａｍＨＩ部位の間でクローニングす ると、プラスミドｐＰＹ５３が生じる。次に、Ｓａｕ３Ａ（３３４６）とＴａｑ Ｉ（５２０７）部位の間のアデノウイルスＡｄ５のゲノムの部分を含む、ｄａｍ −環境から調製したプラスミドｐＰＹ５３のＳａ１Ｉ−ＴａｑＩ断片を、ベクタ ーｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩとＣｌａＩ部位の間でクローニングすると、プラスミ ドｐＣＡ’が生じる。ｄａｍ−環境から調製したアデノウイルスＡｄ５のゲノム のＴａｑＩ（５２０７）−ＮａｒＩ（５５１９）断片を結合させ、ベクターｐＩ Ｃ２０ＨのＳａｌＩとＮａｒＩ部位の間でクローニングした。これによってプラ スミドｐＣ Ｃ’が生じる。次に、ｄａｍ−環境から調製したアデノウイルスＡｄ５のゲノム のＮａｒＩ（５５１９）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片とプラスミドｐＣＣ’のＳ ａｌＩ−ＮａｒＩ断片を結合させ、ベクターｐＩＣ２０ＲのＳａｌＩとＮｒｕＩ 部位の間でクローニングした。これによってプラスミドｐＣＤ’が生じる。Ｃ−プラスミドｐＣ０１の構築 プラスミドｐＣＤ’をＸｈｏＩで部分消化し、次にＳａｌＩで完全に消化する と、アデノウイルスＡｄ５のＳａｕ３Ａ（３４４６）部位からＮｒｕＩ（６３１ ６）部位までの配列を含む制限断片が生じる。この断片をプラスミドｐＣＥのＳ ａｌＩ部位においてクローニングした。これにより、ＨｉｎｆＩ（３８２）部位 までのアデノウイルスＡｄ５の左側部分、多点クローニング部位およびアデノウ イルスＡｄ５のＳａｕ３Ａ（３４４６）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片を含むプラ スミドｐＣ０１（図１）が生じる。 １．２．ベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HA（図２参照）の構築 ベクターｐＣＧＮのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位間でＧａｘのｃＤＮＡをクロー ニングした（ＴａｎａｋａとＨｅｒｒ、 Ｃｅｌｌ ６０：３７５−３８６、１９９０）。生じるベクターｐＧＣＮ−Ｇａ ｘは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターとエンハンサー配列 （−５２２、＋７２；Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０、１ ９８５）、ＡＵＧ開始コドンならびに最初の３個のアミノ酸を含む単純疱疹ウイ ルスのチミジンキナーゼのリーダー配列（＋５５、＋１０４；Ｒｕｓｃｏｎｉと Ｙａｍａｍｏｔｏ、ＥＭＢＯ Ｊ.、６：１３０９−１３１５、１９８７）、エ ピトープＨＡ１をコードする配列、ラットのｇａｘｃＤＮＡ、そして最後にウサ ギのβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化配列（Ｐａｂｏら、Ｃｅｌｌ、３５： ４４５−４５３、１９８３）を含む。 次にベクターｐＣＧＮ−ＧａｘをＸｍｎＩとＳｆｉＩで切断し、得られたプロ モーター、ｃＤＮＡおよびポリアデニル化配列を含む断片をあらかじめクレノー 断片で処理して、組換えに必要なアデノウイルス配列を含むシャトルベクターｐ ＣＯ１のＥｃｏＲＶ部位に導入した。得られたプラスミドをｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇ ａｘ^HAと称した（図２参照）。実施例２：組換えアデノウイルスＡｄ−ＣＭＶｇａｘの構築 実施例１で作製したベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAを 直線化し、アデノウイルスのＥ１領域（Ｅ１ＡとＥ１Ｂ）によってコードされる 機能をｔｒａｎｓで付与するヘルパー細胞（２９３系統）において、欠損アデノ ウイルスベクターとともに組換えのために同時トランスフェクトした。 次のプロトコールに従い、アデノウイルスＡｄ．ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｔ ｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ９０（１ ９９２）６２６）とベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−ＧａｘＨＡの間でのｉｎ ｖｉｖ ｏ同種組換えによりアデノウイルスＡｄ−ＣＭＶｇａｘを得た：酵素ＸｍｎＩに よって直線化したベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAとＣｌａＩによって直線化 したアデノウイルスＡｄ．ＲＳＶβｇａｌを、リン酸カルシウムの存在下で系統 ２９３に同時トランスフェクトし、同種組換えを行った。このようにして生じた 組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択した。単離後、組換えアデノ ウイルスを細胞系統２９３において増幅し、これから約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力 価を持つ精製されていない組換え欠損アデノウイルスを含む培養上清を導いた。 ウイルス粒子を、既知の手法に従って塩化セシウム勾配での遠心分離により精 製した（特にＧｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４５６）。アデノウイルスＡｄ−ＣＭＶｇａｘを１０％グリセ ロール中−８０℃で保存した。実施例３：ヒト腫瘍細胞Ｈ４６０におけるＡｄ−ＣＭＶｇａｘ発現の検査。 非小細胞性肺癌から誘導したヒト腫瘍細胞Ｈ４６０を、漸増感染多重度（Ｍ． Ｏ．Ｉ．）で、組換えアデノウイルスＡｄ−ＣＭＶｇａｘおよびβ−ガラクトシ ダーゼを発現する対照ウイルス(Ａｄ−ＲＳＶ−βｇａｌ)によって形質導入した （図３）。アデノウイルス溶液の存在下で１時間３０分インキュベートした後、 １０％胎児血清を含む培地を交換し、細胞を４８時間インキュベートした。トリ パンブルー除去試験によって細胞の生存度を調べ、培養ウエル当りの生菌数を測 定した。アデノウイルスＡｄＣＭＶｇａｘの２ロット、Ａｄ−ｇａｘとＡｄ−ｇ ａｘ（２）を使用した。これらは細胞２９３における２つの独立した産物に相当 した。２つのロットの活性は同等であり、対照アデノウイルスＡｄＲＳＶβｇａ ｌとは明らかに異なることが確認された。 Ａｄ−ＲＳＶ−βｇａｌの使用により、事前に、組換えアデノウイルスが細胞 Ｈ４６０を有効に形質導入する能力を明らか にすることができた。すなわち、Ａｄ−ＲＳＶ−βｇａｌで処理した細胞の７５ ％以上において核のβｇａｌ活性が検出された（Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０００）。これ と平行して、免疫蛍光検査法によりＡｄ−ＣＭＶｇａｘによって形質導入した細 胞においてｇａｘタンパク質の発現が明らかにされた。Ａｄ−ＣＭＶｇａｘおよ びＡｄ−ＲＳＶ−βｇａｌウイルスの形質導入の効果は同等であることが認めら れた。Ａｄ−ＣＭＶｇａｘによるＨ４６０細胞の処理は細胞増殖の低下に結びつ いたが、アデノウイルスによる形質導入後４８時間目に検出された強い細胞毒性 にも関連していた（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ参照）。そのような作用は対照アデ ノウイルスに関しては認められなかった。従ってこれらのデータは、ｇａｘタン パク質の過剰発現が細胞Ｈ４６０の成長停止を伴うことを示している。 興味深いことに、細胞Ｈ４６０は突然変異ｒａｓタンパク質（Ｋｉ−ｒａｓ） を発現する。我々のデータは意外にも、ｇａｘタンパク質の発現は、最初に修飾 ｒａｓタンパク質によって調節障害を生じた細胞増殖の制御を回復させうること を明らかにした。ｒａｓの催腫瘍性突然変異に対するｇａｘ因子の支配的特性は 肺の癌腫に限定されなかった。同様の結果、すなわち ＡｄＣＭＶｇａｘによる成長停止は、結腸の癌腫から誘導したＨＣＴ１１６細胞 に関しても認められた。ｒａｓオンコジーン（Ｇ１３Ｃ）およびＤＣＣ遺伝子の 突然変異はこの細胞系統において記述されている（Ｂｒａｔｔａｉｎら、Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４１：１７５１−１７５６、１９８１）。実施例５：ｐ５３不在環境でのヒト腫瘍細胞におけるＡｄ−ＣＭＶ−ｇａｘ発現 の検査。 同じく非小細胞性肺癌腫から誘導した細胞Ｈ３５８がタンパク質ｐ５３の欠損 モデルである。この細胞系統は、実際に、ｐ５３遺伝子の同型接合体欠失を示す (ＭａｘｗｅｌｌとＲｏｔｈ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：３４２１、１９９３)。好 都合にも、アデノウイルスＡｄ−ｇａｘはＨ３５８細胞の成長を有効に遮断し、 アデノウイルス形質導入後４８時間目に強い細胞毒性を引き起こす（図５）。こ の細胞死は対照アデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ−βｇａｌの存在下では検出されな かった。これらのデータは、ｇａｘの過剰発現がｐ５３欠損腫瘍細胞の成長を特 異的且つ有効に遮断することを示している。興味深いことに、これらのデータは 肺の癌腫から誘導した細胞に限定されない。実際に、Ａｄ−ＣＭＶｇａｘによる 処理後、骨肉腫から誘導した ヒト細胞Ｓａｏｓの成長も遮断された。Ｓａｏｓ細胞は、ｐ５３およびｐＲｂ不 在環境の細胞モデルである。やはり、この成長停止は使用するウイルス濃度に依 存しており、対照ウイルスによる癌細胞の形質導入後には認められなかった（図 ６）。Ｓａｏｓ−２細胞の９０％以上が、感染多重度２５０でのＡｄＲＳＶβｇ ａｌによる導入後βｇａｌ活性に関して陽性であった。同じ実験条件下で(感染 多重度２５０)、ＡｄＣＭＶｇａｘは７０％以上の細胞生存度の低下を引き起こ す。最初にＧａｘを成長停止遺伝子として述べたが、出願人は意外にも、成長停 止の後にアポプトシスに類似した細胞死が続くことを観察した。 Ｇａｘの過剰発現によって誘発される細胞死のｉｎ ｖｉｖｏでの対応は、癌 患者における治療上の恩恵に好都合に結びつけることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デネフル，パトリス フランス国、エフ−94100・サン−モール、 アブニユ・デ・フユジエ・ドウ・シヤトー ブリアン、45

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．癌の治療を意図した製薬組成物の調製のためのＧＡＸタンパク質あるいはそ の変異体の使用。 ２．癌の治療を意図した製薬組成物の調製のための、ＧＡＸタンパク質あるいは その変異体の全部あるいは一部をコードする少なくとも１個の核酸配列の使用。 ３．核酸配列が、ＤＥＡＥ−デキストラン、受容体タンパク質あるいはカチオン 性脂質またはポリマーと複合した形態、リポソームの形態あるいはそのままで使 用されることを特徴とする、請求項２に記載の使用。 ４．核酸配列が組換えウイルスベクターの一部を成すことを特徴とする、請求項 ２に記載の使用。 ５．核酸配列が、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスの 中から選択されるウイルスベクターの一部を成すことを特徴とする、請求項４に 記載の使用。 ６．アデノウイルス、好ましくはＡｄ５あるいはＡｄ２型のアデノウイルスであ ることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。 ７．動物由来、好ましくはイヌ由来のアデノウイルスであることを特徴とする、 請求項４、５または６に記載の使用。 ８．使用する核酸配列がラットのＧＡＸタンパク質あるいはその変異体の全部あ るいは一部をコードすることを特徴とする、請求項２〜７のいずれかに記載の使 用。 ９．使用する核酸配列がラットのＧＡＸタンパク質あるいはそのヒト同族体をコ ードすることを特徴とする、請求項８に記載の使用。 １０．使用する核酸配列がｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項２〜９のい ずれかに記載の使用。 １１．使用する核酸配列がｇＤＮＡであることを特徴とする、請求項２〜９のい ずれかに記載の使用。 １２．使用する核酸配列が感染細胞中でのその発現を可能にする配列を含むこと を特徴とする、請求項４〜１１のいずれかに記載の使用。 １３．使用する核酸配列が、標的細胞の分泌経路において合成されるポリペプチ ドを制御するシグナル配列を含むことを特徴とする、請求項４〜１２のいずれか に記載の使用。