CA2233250A1 - Application de la proteine gax au traitement de cancers - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à l'utilisation thérapeutique, notamment pour le traitement du cancer, d'acide nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci.
Description
WO 97/164~9 PCT/FR96/01690 APPLICATION DE LA PROTEINE GAX
AU TRAITEMENT DE CANCERS
La ~les~ e il~v~llion con~ e une nouvelle methode pour le tr~it~m~nt des cancers. Plus particulie.~ , elle con~ P une mPt~ de IL~ des cancers par blocage de la prolifération c~ re laquelle peut être dérégulée dans les cellules 5 ~-mor~l~s e~ un onro,~nf~ tel que ras muté ou d~firi~nt~s pour un gène sup~u~ de turneur tel que p53. Elle colu~ . .e ég~lPm~nt l'utili~tion des v~te lL~
de thérapie géni4ue pe..ll~ I de réguler celle-ci, ainsi que les cc.ll,posiIionspharm~.~euti.lues les CCJ~t~ Q~
Les produits des gènes ras, génér~lemPnt dPcign~ protéines p21, jouent un 10 rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire chez tous les or~nismPs eucaryotes où ils ont été recherchés. Certaines mo~iifi~ti~n~ spe~ifiqu~ de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les con~ pnt à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nombre de lull,eul~ h.. ~ P~ a été associé à la présence de gènes ras mod~fiés. De même, une su~ r~ ion de ces protéines p21 peut con~iu~ à un dérPglPmPnt de la 15 proli~.~Iioll cPlllll~ire.
Dans un co..l~le celllll~ire normal, cette prolifération des oncogènes est vL~ ,hl~lem~nt contrée, au moins en partie, par la génération de gènes dits ~u~:~euL~ de tl~mel~ comme p53 et Rb. On sait ainsi que la protéine p53, au moins sous sa forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement 20 la croissance et la division ce~ ire et qui, dans certaines situations, est capable d'induire l'apoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 3 l5-3 17, 1991). Ces propriétés se manifestant en situation de stress où l'intégrité de l'ADN cellulaire est m~n~cée, p53 a été suggérée être un ~ gardien du génome ~. Toutefois. certains phénomènes peuvent venir pelLulber ce méc~ni.sme d'autoré,~ulation cellulaire et25 favoriser alors le développement d'un état néoplasique. Un de ces évènements con~icte en des mutations au niveau des gènes suppresseurs de tumeurs. C'est ainsi que des forrnes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et not~mmem dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateuY~ comme les ostéosarcomes et qu-il a été noté la pr~sence de p53 mutées dans environ 30 ~0 ~c des tumeurs hllm~inPs, tous types confondus (pour revues, voir Montenarh, ~ Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) En consequence, la mise en évidence de cl~mpos~ biologiques susceptibles d~ k lr~ - à l'~lcollLLt: de ce type de dérèglemf nt de la prolifération cellulaire et/ou de s~-ppl~r à ce type de .1Pri.~:f n~ en gènes su~pLe~euu~ de lu~-euu~ est par conséquent d'un intérêt majeur dans l'approche ~el ~pe~ e de la cancérogen~
La ~esenLe ~ .Lon résulte prfY~i~m~nt en partie de la mise en évidence que la protéine GAX c~ e un inhihit~ .~ pstentif l de la ~oliré,~lion c~ lAire induite par les protéines ras. Elle résulte en particulier de la mise en évidence qu'une ~lil~éL~Lion cf llt~l~;re~ déregulée dans des cellules h~moraies, peut etre retabLte en y 1~ la protéine GAX.
La protéine GAX est une protéine de 303 acides arninés. Sa séquence a été
caractérisée et son cDNA cloné (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
Le gène gax(growth arrest specific homeobox) appartient à la famille des gènes ho~eot;ques. Ces gènes codent pour des fAct~ n~ tionnels qui conti~nn~nt des séql~ences con~ (ou h~)mo~omAinf~s) l~con--Ai~ des régions s~éci~iq~les de l'ADN (ou homéoboîtes) (rewe: Gehring et al. Cell, 78: 211-223, 1994).
L'h-me~cmAin~ de la pL.~Iéinc gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245. Ce gène possède ce,~ines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il ~mble égpl~m~nt contrôler la trAn~hirln G0/G1 du c~cle cellulaire. Ainsi les nivea d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
L~e~,vression du gène gax est donc répninée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Ces observations ont leur cc,r,l.e~ ie in vivo puisquê chez le rat, l'hype~plasie intim~l~ provoquee par l'abrasion de la carotide est associée à une forte baisse de l'e~le~ion de gax (Weir et al. J. Biol. Chem. l99S, 270, 5457-5461).
L'e~ession du gène gax a été mise en évidence dans le système cardio-v~ulaire, not~mment le coeur et l'aorte et jusqu'ici l'utilisation en thérapie génique de ce gène était donc lirnitée au niveau de ces cellulesi l'exprimant naturPIl~m~nt De manière in~ltendue, la ~l~m~n-leresse a découvert qu'il était possible de valoriser avantageusement une activité inhibitrice de la protéine GAX à l'égard de la prolifération cellulaire dans des cellules tumorales c'est à dire des cellules qui n'expriment pas le gène gax de manière endogène.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrél,.enL
efficace pour le ~I di~ l des t~lm~)rs ~i~s à un dérè~1~ment de la pro~ lion cellulaire telles que les Ll~lle~ du poumon non à petites cf~ , les c~;.-o...
~ pan.;.é~Liques et c~liq1les~ les ostéos~c""es etc.
La ~ lv~nLioll décrit e~l~mPnt des systèmes p~~ ièlelllen~
~-rr;.~ la déLv~ ce in vivo, d;~t ..~-~ dans les t~m~, de tels ColllpOSéS et ainsi de lutter contre le dévelo~pe",~ des c~n~
Un ~ .,ier objet de l'illv~l~Lioll réside donc dans l'l~tili.e~tic)n de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la ~,ép~dLion d'une co,l-posiLion 10 ~ re--l;que ~lestinpe au ~ e~ des c~n~
Plus pr~ Pmrnt~ elle se rapporte à l'utili~tion d'au moins une séquence mlrlPi~lt~e codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la p.epaldLion d'une co...l o~;l;on pl~ ret~hque ~estin~e au tr~it~om~nt des C~nr~
Comme indiqué ci-avant il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la p.~senLe invention le terme variant désigne tout mutant fr~gm~nt ou peptide pO~A........ I au moins une propriété
biologique de GAX, ainsi que tout homologue de GAX obtenu à partir d'autres ~c~es Ces fr~gmPntc et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de 20 I'homme du métier, et not~mment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par hybridation ou par clona~e par e~p.e~ion, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modificationsgénétiques incluent les suppressions, deletion.c~ mutations, etc La séquence n~ ue mise en oeuvre peut coder pour tout ou partie la 25 protéine GAX de rat ou un de ses variants.
Le gène utilisé au sens de l'invention est ~-tl-~iellement le gène codant ~ pour la protéine GAX de rat ou de son homologue hnm~in Il s'agit plus préférPntiellement d'un ADNc ou d'un ADNg.
La séquence nucléique revendiquée peut être injectée telle quelle au niveau du 30 site à traiter, ou inc~ée dire~ .e..~ avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans FEUILLE DE REMPLhCEMENT (REGLE 26) WO 97/16459 PCT~R96/01690 vecteur particulier. rTé nin~, on préfère dans le cadre de la plésenle u~ve~lliOII
utiliser un vecteur dt~ ;n;~ LILon, pe~mett~nt d'arnéliorer (i) l'Pfflr~ritP de la p~nP~tirm cç~ ire~ (ii) le ciblage (iii) la st~hilitp exbra- et intr~rP~ ires.
Dirr~ ~ types de vecteurs peu~ être utilisés. Il peut s'agir de v~;leu 5 viraux ou non viraux Le v~;leul selon l'ulv~~ peut ainsi être un agent non vital capable de plOlllOUVO~ le hal~ell et 1I~Lt~ ;OII de la s~-~n~e n~rlP~lue dans des oellules p~aLr~les ou eucaLy-~les. Les ve~;leu~ himi~lu~p~s Oll biochimiques lèpl~esenten~ une 10 ~ l; v~ ullél~:j~l~ aux virus naturels en pa ficulier pour des raisons de commo~it.o, de sécurité et Pg~l~mPnt par rabsence de limite théorique en ce qui c~ n~ Ia taille de l'ADN à transfecter.
Ces veCIeuL~ synthétiques ont deux f~ n~tion~ ln ;nf~;p~lPc, co.~p~cle~ l'acide mlclPiqtle à transfecter et promouvoir sa fixation cell~ ire ainsi que son passage à
15 travers la m~mh~nf~ pl~...;q~,e et, le cas é~h~nt les deux n~é~ u~es nucléaires.
Pour pallier à la nature poly~nioni~le des acides nucléiques, les vecteurs non viraux po~ent tous des charges polyr~ti~nillues.
Parmi les ve~;leul~ ~yllllléliques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyélllylène immine et DEAE dextran ou 20 encore les lipides c~tic~niqtl~ps ou li~>fee~-b sont les plus avantageux. Ils po~ nt la propriété de con~ n.~er l'ADN et de promouvoir son ~C~oci~tion avec la membrane oellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofect~min~
transfectam, etc) et di~érenL~ lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ou li~oss...Ps Plus rPcPmment~ il a élé développé le concept de la 25 transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met a, profit le principe de con-ipn~pr l'ADN gràce au polyrnère cationique tout en ~iirigP~Mt la fixation du complexe à la membrane grace à un couplage ~himitlue entre le polymère c~ti~nique et le ligand d'un récepteur memb.di~a~e, present à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la L,dl~e..ule, à l'insiuline ou du récepteur des 30 asialoglyco,~ ,té.nes des hépatocvtes a ainsi été décrit.
La séquence nucléique utilisée dans la présente in~ention peut etre formulée en vue d'~mini~rations par voie topique, ol~ale, parenLé.ale, intr~n~le intravein~ e. intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De 35 préférence, elle est utilisée sous une forme injectable. Elle peut donc etre mélangée à
FEUILLE DE REMPLACEMeNT (REGLE 26) tout véhicule l~hP ~ ~~ l açcçpts~b!e pour une form~ tion inje~ble~
n.~ pour une iniertion directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de sol~tinnc stériles, icot~ni~ es ou de co~ ~s;~;rn~ sèches, nr.lA....,,~n hili.cP~c, qui, par s~rlriition selon le cas d'eau ~~ icee ou de sémm physiol~q~5 p~ ",~ lac~ x1;4~l;rl~desolutés injec~stl~ Une~ ;Londirectedelase~ n~e n~ L t~ e dans la tumeur du patient est ~I-L~ lt~l~è car elle permet de con~ er l'effet ll.5~ ue au niveau des tissus affectés. Les doses en séquence n~ e ufili~-c peuvenl être S~AS~rt~s en fonction de diî~ ~-Ljp& ~..ell~S, et n~ en fonction du vecteur, du mode d'~A~ aLicll utilisé, de la pStholo~e conrernee ou 10 encore de la durée du ~ ?-lL recherchée.
Pour la mise en oeuvre de la pl~se~ invention, il est tout particulièrement av~ntS~ c d'utiliser un virus recomhin-Smt défectif.
Il est ainsi poscible d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les ~;hov..us15 et plus ~w~ les virus adéno S~ es~ Ces ve.t~,.ux s'avèrent particulièrement pe~Ço~ ~ sur le plan de la ll~;lion.
La ~lesel-~ ve~ ion a donc pour second objet l'utili.e~tion d'un virus - re~omhinS~ntdéfectifco..~ .l auln~lsU~lgèneinsérécodantpourtoutoupartiede 20 la protéine GAX ou d'un variant de oelle-ci. L'invention réside éE~l.om.ont dans l'-nili~ticm d'un tel virus pour le trair~m~nt des cancers. Dans les vecteurs del'invention, le gène inséré et/ou présent peut être un fragment d'ADN complem~nt~ire (ADNc), d'ADN E~nomitlue (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient inséres un ou plusieurs introns. Il peut25 également s'agir de séquences synthétiques ou semisvnthétiques.
Génér~l~m~nt, le gène inséré co~ re,ld eg~l~mpnt des séquences perrnettant son e~lession dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont naturell~m~nt responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sontsusceptibles de foncticmn~r dans la cellule infectee. Il peut ég~lem~nt s'agLr de 30 séquences d'origine di~ e (l~spol~bles de l'expression d'autres protéines, oumême s,vnthétiques). Not~mrn~ont, il peut s'agir de séquences de gènes eucarvotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou l~pih~ L la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon in~ tihle ou non. A titre d'~x~mrle, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLF 26) ~onome d'un virus, et n~ ~1,.."",~ les promoteurs des gènes ElA, MLP' dladénovLL~t, le pLo-~-ote~ CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les p~ , euc~yoles~ on peut citer ~plP~rtPnt les promote~ s ubiq., a~s (HPRT, V;,..t~ -actine, ftlhllinP~ etc), lec P~J~ des fil~tm~nt.c ;.~ r~l;A;n~ PCminP, neurnfilz~mPntc, ke~tin-~, GFAP',5 etc) les prom-~te-.~.c de gènes 1l..~ ;ques (type MDR, CFTR, facteur Vm, etc) les p.~,...ot~ -c de tis~us (p~....,l~--- de l'acline dec oellule~c du muscle lisse), les prc~mote.~-.c pléré~ ~I;Pll~mPnt ac.'ivés dans les cellules en divl~;on, ou encore les promote~s .e~.~ à un ~imllll~c (récepte~ des hoL.Ilolles stéroides, récepteur del'acide rétinoique, etc,). En outre, ces séq~n~es d'~Apl~ion peuvent être m~ fié~
par ~iition de séquences d'a ;~ivulion, de régulation, etc. Par z~illPIlnc, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séqllences d'~ e~ ion, il peut être inséré danc le ~nomP
du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par zlillP,llrc, le gène inséré co~ r~l~d générz~lPment. en amont de la séquencecorizlntP~ une séquence signal riirigPZmt le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séq-lence signal peut être la séquence signal naturelle de GAX, mais il peut P~lPmpnt s'agir de toute autre séquence signal f~n.~ nilplle (celle du gène de la thymidine kinase par exempleJ, ou d'une seq len~e signal artifiri~llP
Les virus selon la plesenle invention sont defectifs, c'est-à-dire incapables dese répliquer de façon ~zlutr~n- mP dzms la cellule cible. GénéralPmPnt, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nPcPe.sz ires à la réplir~ticm dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit PliminPPs (en tout ou en partie), soit rendues non-foncti--nnrll~s, soit s~lbstituees par d'autres sequences et notamrnent par le ~ène inséré
P~l:fé ~ mPnt, le virus défectif conserve n~nmoins les sequences de son génome qui sont nécPs~ires à ll~nr~psi~i~tir~n des particules virales.
Il e.Yiste différents sérotvpes d'adénovirus. dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotvpes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus hllm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale ~voir ~IPm~n-l~ W094/26914). Parmi les adéno~irus d'origine animale utili~hles dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, mu~ne, (PYemrlle: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 9~/16459 PCT~FR96/01690 nce, radén~v~u~ d'cfigine animale est un adénovirus canin, plus ;Pllf~m~nt un adénovirus CAV2 [souche mnnhsttt~n ou A26/61 (ATCC VR-800) par ~-- ..pl~]. De p.~er~t:nce, on utilise dans le cadre de l'invention desadénovirus d'origine h.. ~ e ou canine ou m-~xte.
E~tr,o~ ;pllpmpnt~ les adé~lovi",~ dtr~tir~ de ru-v~llion co~lpl~ enL les lTR, une seq~n~e ~--.el~-l l'~ n~ et l'acide n~rlei~lue d'interêt. Encore plus ~féf~.llielle-nent, dans le ~ nom~ des adéll. Vil u~ de l'invention, la region El au m~ s~ n~ti~ ~ g~lle ~ c~ t ~ cr. ~ n~l par toute technique connue de l'homme du métier, et nc~ ....ont par su~.e~ion 10 totale, ~ b~ l;on, ~ielehon partielle, ou a~ ih~m d'une ou p1t~ciel~rc bases dans le ou les gènes con~ci~lprés~ De telles mc~ifit~ti~ peuvent être obtenues in vit~o (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par ~~y~mp1e au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par tr~it~m~nt au moyen d'agents m-lt~,~enPs D'autres régions peuvent e~lPm~Pnt être mc~rlifiP~Ps, et n~lA..~ la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon rinvention col~x~l~d une ~iplp~tion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de r~ ti~n préféré, il co..~ nd une ~ ti-)n dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquellce codant pour-GAX (Cf FR94 13355). Dans les virus 20 de l'invention, la ~lplétion dans la région E1 s'étend ~re~ ;PIlPm~nt des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovims recombinans défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 ~73; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être 25 preparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un pl~crnirlP portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La reco".l i~l~icon homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et pl~crnirl.~ dans une lignée cellulaire appn,pliée. La lignée cellulaire utilisée doit de pl~e-ellce (i) être transformable par lesdits Plémentc, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie 30 du génome de l'adénovirus défectif, de plerére-lce sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'eYPmrle de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen Virol. 36 (197/) 59) qui contiçnt no~ intégree dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovLrus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de comple~.,~~ les fonctions El et FEUILLE DE REMPLA~EMENT (REGEE ~6) W O 97/16459 PCT~R96/01690 E4 telles que ~rites n..~ nt dans le~s demandes n~ WO 94/26914 et Fnsl)it~, les adénovin~s qui se sont ~ ie~; sont .~cu~çes et purifiés selon les te~hnitltlets classiques de biolo~i~ m~ o~ire.
Co ~ A ,I les virus adéno o~oc;es (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille ~,laliv~ réduite, qui s'intègrent dans le g~?nom~ des oellules qu'ils inr~t~, deEmit; lt~ stable et site-sp~ifique. Ils sont c-orAhl~ d'l.~ un large spectre de ?s, sans induire d'effet sur la c.u;~ e, la ~-lolphologie ou la dir~~
oellul ires. Par ~ ~, ils ne semblent pas; . l~ és dans des pathologies chez l'h-mmf~ Le génom~ des AAV a été cloné, séque~é et caractensé Il co,-,~ d environ 4700 bases, et c~ à chaque e~l e--,ilé une région répétée inversée (ITR)de 145 bases environ, servant d'origine de rérlir.otic-~ pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions .~ntif'.ll~S portant les fonctions d'~n~-op~ Ation: la partie gauche du g~?n( m~, qui c~"~ le gène rep innrli~lue dans la répli~Ation virale et l'~ln~e~ion des gènes viraux; la partie droite du g~n~me, qui conti~nt le gène cap codant pour les ~roleilles de capside du virus.
L~l~tilic~Ation de v~;leu.~ dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la lilléL~Iu~e (voir ~ f ~l WO 91/18088; WO
93/09239; US 4,797,368, US5,139,941. EP 488 528). Ces ~lem~Anrl~s décrivent difr~-~"les constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un org~nicme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recomhin~nt.s défectifs selon l'invention peuvent être ~ s par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire hurnain (par exemple un adénovirus), d'un pl~cmi~le c-nt~n~nt la séquence nucléique d'intérêtbordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'~ncA~rs~ tion (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinAnt.c produit~s sont ensuite purifiés par des techniques classiq~les. L'invention concerne donc eg~l~m~nt un virus recombinAnt dérivé des AAV dont le génome con"u,.:nd une séquence codant pour GAX bordée des ITR de l'AAV. L'invention concerne ég~l~m~nt un plA~crnicle comprenant une séquence codant pour GAX bordée de deux ITR d'un AAV Un tel plAcmicle peut être utilisé tel quel pour transférer la sequence de GAX, év~ntllelhnlent incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo-vinus).
PEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO 97/16459 PCT~R96/01690 ConrPrn~nt les létL.~vLLus, la col~lLu~:lion de Ve~;leUI:j rec-mhin~nte a été
"~"1 décrite rl~ne la lilléil~LIUI'e voir nc~tA----~nt EP 453242, EP178220, RP~ e;~ et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormiclf, BioTerhno~o~ 3 (1985) 689, etc. En particulier, les nGll~v;LuS sont des virus intégratifs, IllrèCl~ull les cellules en 5 divisia~L Le ~Pn~mP des Lch~vLLus co,l~nd ~nt P11PmPnt deux LTR, une séquence d~nl~p~ ~ti~n et trois régions c~nfPs (gag, pol et env). Dans les vGcleuL~
recomhin~nte dérivés des lé~ v;Lus, les gènes gag, pol et env sont génér~lPm-~ntdélétés, en tout ou en partie, et ,~ ~~ par une séquellce d'acide mlclPi~lt~e hétérologue d'intérêt. Ces vG~IèuL~ pe~LvGlll être réalisés à partir de dirrGfGIll~ types de 10 IG~V;L~S tels que ~ le MoMuLV ("murine moloney IP~ Pm;:~ virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("mtmne moloney sa.~o.na virus"), le HaSV ("harvey saL~Illa virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma vims") ou encore le virus de Friend.
Pour CO1~1 Ui1G des IGlI~JV~US recomhin~nt~ comportant une se~ence 15 codant pour GAX selon l'invention, un pl~mi~ comportant ,~t~ pnt les LTR, la séquence d'Pn-~p~ tion et ladite séquence codante est gPn~r~lPmP.nt COhSkui~, puis utilisé pour transfecter une lignée oellulaire dite d'en~ ~p~ tion, capable d'appo, le. en trans les fon~tic~n~c IG~ vilales ~i~r;e~ ~ dans le pl~cmi~ GénérAI~m~nf, les lignées ~ cl'Fn~ ;nn sont donc rAr~hl~ d'~-.pJ;.~ les gènes gag, pol et env. De telles20 li~ées d~nr~rc;~i~tion ont été décrites dans l'art Ant~riel~r, et n~ nt la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (W090/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les léllOvil l1S recomhinAmc peuvent COIII~)OI~er des mo~lifirAtionc au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'enr~rc~ tion éten~ltJes, comportant une partie du gène gag (Bender 25 et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recomhinAntc produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour le trAitem~nt des cancers, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Il est possible d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adéno,irus recombinant), et permet egalement 30 une action efficace et très rapide sur les sites a traiter. Les adénovirus de l'invention - sont e~ mPnt capables d'~ èu à hauts nivea~x le gène gax introduit, ce qui leur confere une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère ~ épisomal, les adénovims de l'invention ont tme persi~tAn~e limitée dans les cellules prolifé.~ives et donc un effet transitoire p~h~;te~u~nt adapté à l'effet thérapeutique 35 recherché.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W O 97/16459 PCT~FR96/01690 Les do~s de virus l)t li~s pour l'injection peuvt.-t être adaptées en ~on;lion de d;lî~lL~ p&.alllcLIcS, et 11~.19.. ~nl en fonction du mode d'~fl.. n;~-dion utilisé et de la durée du l~n;lf7~f nl reclleLcl~e. D'une ~ iCI~ générale, les virus ~co-nb n~.~
~lon l'invention sont forrm~l~ et r I~;n;~h~:s sous forme de doses co,-,~es entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 101~ pfu/ml p~u~ gAl~m~nt être utiIi~. Le tenne pfu ("plaque forming unit") co..es~,ond au pouvoir i If ~;Lieu~ d'une ~s~n~ '~11 de vinons, et est ~ ...;n~ par infection d'une culture c~llnl~ire ap~n~-iée, et mesure, ~ n~ m~lt après 48 heures, du nombre deplages de cellules infectées. Les te~hni~lt1es de di:le~ ;n~I;on du titre pfu d'une solution 10 virale sont bien ~nc~ t~ ~ dans la liL~ ...c.
La présente invention est avAntA~ ~m~nt utilisée in vivo pour la destruction de cellules en lly~e~ lifération (i.e. en prolifération Anorm~If~).
Elle est ainsi A~pli-~hle à la destruction des cellules tumorales. Elle est toutparticulic.e..lcnL appl~pliée au tr~it~m~nt des cancers dans le~ elc un nnro~ne 15 activé est impliqlJe. A titre d'exemple, on peut citer les A~l~?noc~- c;nom~s du colon, les cancers de la thyroide, les cd~r;n~ du ~oull-on, les l~-~...;es myéloides, les cancers COl~ au~L, les cancers du sein, les cancers du po~lllon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les Iy.~ fi...~s B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les ~ o...~s, etc.
En outre, ce tr~it~m~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux rIome5ti-lues (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La p~senle invelllion est plus complèt~m~nt décrite à l'aide des e~e"~lcs qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limit~tifs.
~ FGE~DE DESFIGURES
F~l-re 1: Représentation du pl~mi~ pC01.
Fi~ure 2: Représentation du plasmide pXL-CMV-Gax HA.
Fi~ure 3: Représ~nt~tion de l'effet de l expression de l AdCMV gax sur la prolifération c~ ire chez des cellules hllm~in~c tumorales H460.
30 F;gure 4: Cellules turnorales H460 traitées par l ad,énovims AdCMV gax à M.O.I..
1000 (Figure 4A), M.O.I. 100 (Figure 4B) et M.O.L 1000 (Figure 4C).
Fi~ e 5: Re~l~sel~laLion de l'effet de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulai~
chez des cellules h~ ines tumorales Saos.
FEUILLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26) CA 022332~0 1998-04-27 F~e6: Re~fesr~ ;oll de l'effet de l'l;~loll de l'AdCMV gax sur la p~ ion c~ lAire chez des cellules ll---..Ain~,s tumorales H358.
TECHN-OUES C~ENERALES l)E BIOLOGIE MOLECULAIRE
Les mrthr~es riAeS;q..r-."~ tiij~ en birlo~ie m~ ire telles que les 5 e~ion~ pL~alaLiv~s d'ADN p~ ;q-l~ la cen1rifuga~on d'ADN ~ ;r~ue en ~rArli~nt de chlorure de cesium, rélecllopho~èse sur geLs d'agarose ou ~l'ac-~l&.ude, la ~fication de f~gnn~ dl'A~)N par élecbr~llltion~ extrac~ion de protéines au phénol ou au phénol-chlo,~ollne, la preciritAtir)n d'ADN en milieu salin par de réthanol ou de risopn~ ol, la llansL~ n dans Escherichia coli, etc ... sont bien10 c~nn-~r-s de l'homme de métier et sont z~ nri~ décrites dans la liueldl [Maniatis T. et al., "Mol~l~r ClQnin~, a Labol~k,ly Manual", Cold Spring Harbor LaboraLoly, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Mo'~ Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les rl~rnj~ de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont 15 d'origine co....~ .eiale (Rethr~ Research r ~ho~aton~).
Pour les ligatures, les f~mr~nt~ d'ADN peu~elll être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'aclyla-luide, extraits au phénol ou par un ~ m~l~n~ phenoVchlon~ole, ~x~c~ és à l'éthanol puis incubés en p~sence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les ,~~o~ tion~ du fo.l. n;~
Le ,~ e des e~ iL~ s 5' pçoçmin~nt~ peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du foll~nic~el~. La destruction des ~L.e...i~és 3' pro~min~nt~ est effectuée en presence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~tions du fabricant. La destruction des exL ~---i~s 5' pro.~min~nt~s est effectuée par un traitement ménagé par la m~cle~ee S1.
La ml-t~ n~e dirigée in vitro par oligodéoxym~ ot~ s svnthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Tavlor et al. [Nucleic Acids Res. 13 ( 1985) 8 ,49-8764] en ut~ nt le kit distribué par Amersham.
L'~mrlific~tion el~.,.aLique de fra~rnenr~ d'ADN par la technique dite de PCR
Lol~vmérase-catalvzed Chain Beaction, Saiki R.K. et ai., Science 23Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzvm. 155 (1987) 33~-350] peut être effectuée en ~nili~nt un "DNA therrnal cvcler" (Perkin Elmer Cetus) selon les specifications du ~'bsicant.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) La vérifi-~tion des s~ ~~ es nucléotidi,~ues peut être effectuee par la mPthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. .A.cad. Sci; USA, 74 (1977) 5463-5467] en lltili.e~nt le kit d~L ibllé par ~...e~ ~1.A~..
F.XF.lVlPr.F. 1: co~ u;~ion du vecteur pXL~CMV-G~Y HA po~tant le ~en~ ccA~nt 5 pou~ la protPin~ ~ de rat sous le contrôle du plul~o!~ir CMV.
Cet ~ e décrit la co~,:,ku~;lion d'un ~e~leur cn.~ l'ADNc codant pour la protéine gax (espèce: rat) et des Seq~ ces a~nov..~les pelln~lL~IL une ~J,,,h;n~;eon L'épitope de l'h-~m~ ;n~ du virus ;.~ ipn~A (épitope HA1), co,.lp.en~nL 18 acides aminés, est ajouté à l'I Akél~l;lé N-t~rmin~le de la protéine gax (Field et al., Mol.Cell.Biol. 8: 2159-2165, 1988). Ce procédé d'addition d'épitope pemnet de suivre, nnl;..,....Pnt par des techniques d'i,--....~nnfl--nre~Pnt~ç, l'expression de gax à l'aide d'anticorps dirigés contre l'épitope HA1. Outre sa ~n~ihilit.o, cette methoflp permet de ~ rr~ h;~ du bruit de fond cores~ndant à l'eA~ession de p~Lé.nes gax Pnr1o~n.os à la fois in vitro et in vivo.
1.1. Co~ in-l du plasmide pCOl (Figure 1) A - Corl~truction du pl~cmi~ pCE
Le fragment EcoRI-XbaI correspondant à ll~,ALIéllliLé gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été cloné entre les sites EcoRI et XbaI du vecteur pIC19H.
Ceci génère le pl~ pCA. Le p~ e pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses 20 eAL èlllinles 5' pro~minf~ntf~ ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN
polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du pl~cmif1P pCA qui contient l'eALIèm;léé gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et SmaI du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Ceci génère le pl~cmi~i~P pCB. Le p!~ e pCB a ensuite été coupé
25 par EcoRI, ses e~LrèmlllLès 5' prC!PminPntps ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polvmérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du pl~cmi~l~ pCB qui contiPnt l'e.nrémité gauche du génome de l'adéno~irus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites Nru~ et BglII du vecteur plC20H. Ceci génere le pl~cmi~lP pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières 30 paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage B - Con'stn~ction du plasmide pCD' FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGI E 26) W O 97~16459 PCT~R96/01690 Le fragment Sau3A (33463 - SstI (3645) et le fra~ment SstI (3645) - Narl (5519) du ~nom~ de l'adénu.v~us Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clonés entre les sites ClaI et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le rls~niAe pPY53. Le fr~gment SalI-TaqI du ~t-~"~;~.o pPY53 préparé à partir d'un cc.~ dam-, co~lP~
la partie du ~ me de l'ad&,~vvi.ux Ad5 cr.. ~ e entre les sites Sau3A (3346) et TaqI
(5207) a ensuite été cloné entre les sites SalI et ClaI du vecteur pIC20H, ce qui génère le r'~ pCA'. Le [.~.~,,,.c:nL TaqI (5207) - NarI (5519) du ~Pnom~o de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un co..~t~Y~? dam- et le fr~m~nt SalI-TaqI du rlq~mi~e pCA' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NarI du vecteur pIC20H. Ceci génère le rlstemi-le pCC'. Le fr~t~ nt NarI (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un C~ YI~- dam- et le fragment SalI-NarI du rkl~mi~l~ pCC~ ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le rls.~mi~o pCD'.
C - C.~ u-lion du pklcmifl.? pC01 Une digestion partielle par XhoI puis une r~ on cornrlète par SalI du rt~cmitle pCD' génère un fra,~mPnt de restriction qui c~ la séquence de l'adén~v-- us Ad5, du site Sau3A ~3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été cloné
dans le site SalI du pls~miriP pCE. Ceci génère le p~s~ pC01 (figure 1), qui conti~nt la partie gauche de rad~lov--u~ Ad5 jusqu'au site Hinfl (382), un mlllti~it~ de clonage et le fr~rn~nt Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus Ad5.
1.2. Construction du vecteur p~CMV-Gax HA (cf. figure 2) L'ADNc de Gax a été cloné entre les sites XbaI-BamHI du vecteur pCGN
(Tanaka et Herr, Cell 60: 375-386, 1990). Le vecteur pGCN-Gax résultant contient25 les promoteur précoce et séquence ~nh~n-~er du cyton~ lovims (CMV) (-522, +~2;
Boshart et al, Cell, 41: 521-530, 1985), la séquence leader de la th~midine kinase de l'Herpes simplex virus inrlu~nt le codon d'initiation AUG ainsi que les trois premiers acides aminés (+55, +lO l; Rusconi et Yamarnoto. EMBO J., 6: 1309-1315, 198~), la sequence codant pour l'épitope HA1,1'ADNc de gax de rat et enfin la sec~uence de 30 poly adénylation du gène de ~globine de Lapin (Pabc, et al, cell. 35: ~>- l53, 1983).
Le vecteur pCGN-Gax a ensuite été coupe par ~nnI et SfiI et le fragment obtenu, c--nt~n~nt promoteur, ADNc et séquence de polyadénylation, préalablementtraité à la Klenow, a été introduit au site EcoRV du vecteur navette pCOl contenant FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W O 97/16459 PCT~R96/01690 les seqllences a~-~vilales nP~ es à la ~-~n~ina-s~n. Le pl~ cmidP obtenu a été
désigné pXL-CMV-Gax HA (cf figure 2).
FX~.l~p~.F 2: C--n.~ n de l'adéncvu ls recombinant Ad-CMV~
Le vecteur pXL,CMV-Gax HA préparé dan~ 1 est ensuite l;~~~
et col-n.. xr~cté pour la ,~ h;~u;xon avec un vecte~ur adél~uvi~ efi~t~nt, dans les oellules helper (lignée 293) appo~ en ~rans les fo~octi~n~ codées par les régions E1 lElA et E:lLB) d'adenovirus.
L'adénovirus Ad-CMVgax a été obtenu par reco...l~ aison homologue in vivo entre raden.~.vu ls Ad.RSVBgal (Stratford-PP~rica~ pt et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le vecteur p~L-CMV-Gax HA selon le protocole suivant: le vecteur pXL-CMV-Gax HA 1;QP~ e par l'enzyme Xm~lI et l'adén~.v.lu~ Ad.RSVBgal linéarisé par ClaI ont été co-transfectés dans la lignée 293 en ~ sence de l~hospll~tP de calcium pour per...ellle la rec~mh;n~;~)n hom~)logl~p Les adénovirus rP~omhin~ntc ainsi 15 générés ont été ~l~ti~nnP~ par p~l~ifi~ ~tion sur plaque. Après isQlPmPnt, l'adénovims rea m~in~nt est ~mplifiP dans la lignée c~llnl~ire 293, ce qui conduit à un s~n~nt de culture CO~ Q~ l'ade~l~v~us défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101~ pfu/rnl.
Les particulec virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure 20 de oesium selon les techniques connl~Pc (voir n~t~mmPnt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-CMVgax est conservé à -80~C dans 10 ~c de glvcérol F.XEMPLE 3: Contrôle de l'eA~,~ssion de l Ad-CMV~x dans des cellules tumorale$
h~ ainç5 H460.
Les cellules tumorales hum~in~oc H~60 dérivées d'un cancer du poumon non à
petites oellules ont été tr~n~1litpc par l'adénovirus recombinant Ad-CMV gax et par un virus contrôle e~ t la ~3-galactoc;~ Ad-RSV- ~3gal) à mllltir!i~itPc d'infection (M.O.I.) croissantes (figure 3). Après 1 heure 30 d in-ubation en présence 30 de la solution adénovirale, le rnilieu de culture co.-.~,.ellant 10 ~c de serum foetal est renouvelé et les oellules in~héPc pendant une période de ~8 heures. La viabilitécellulaire étant contrôlée par test d'exclusion de bleu trypan, le nombre de cellules viables par puits de culture est alors dt:le--"---é. Deux lots d'adénovirus AdCMV gax, Ad-gax et Ad-gax(2), ont été utilisés et correspondent à deux productions FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26) .s dans les cellules 293. Les L_livi~s des deux lots s'avèrent co...p~.,.hloc et bien ri;~ s de l'adénovims corltrôle AdRSV 13gal.
L'uti1ie~tifn de Ad-RSV - ,~gal a pt~ ?~ n~nt permis de c~e-.-l..l.ct la c~ d'un n;iénuv.Lus reC~-mhin~nt à l.,~ e de ll~h;.c efficace les oellules H460. Ainsi l'activité 13gal m~ ire a été ~etectée dans plus de 75 % des cellules traitées par Ad-RSV- ~gal (M.O.I. 1000). En F~ CA~;On de la protéine gax a été mise en cvide.lce dans les oellules l - A~ C par Ad-CMV gax par imm1m~ ~esCe~ ne. Les ~ it~e de tran~ cti~n des virus Ad-CMV gax et Ad-RSV- ~3gal se sont avérés co ~.p~bles. Le tr~itemf~nt des oellules H460 par Ad-CMV
gax est associé à une ré~ction de la p~olifération cellulaire mais é~1~m~nt à une eyll~l~AiCité Ill~biV~ ~letectee 48 heures après la tr~n~c~ucti~n par l'adénovirus (cf.
figurec 4A, 4B et 4C). Un tel effet n'est pas observé avec l'adénovirus contrôle. Ces ~ mn~ ...onl.e~l donc que la S~leA~'e~iOn de la protéine gax s'accomp~gn~ d'un arrêt de la ~ e des cellules H460.
De Illalli~e illlél~X~ e, les oellules H460 ~yrrim~nt une plvléi~e ras mutée (Ki-ras). Nos c~nn~s démontrent de I~ surprenante que l'e~e~ion de la protéine gax permet de rétablir le contrôle de la prolifération c~ ire initi~l-om-ont dérégulée par la ~Ivléine ras ...~;r;~e Le caractère ~1O...;.~.I du facteur gax vis-à-vis des ....~ n~ on~o~niqu~o-s de ras n'est pas l~ll~i,ll aux ca~ o,~les du poumon. Des 20 résultats similaires, à savoir un arrêt de e~ ~ par AdCMV gax, ont été obtenus sur les cellules HCT116 dérivés d'un ca.~ino-l-e du côlon. Une m~lt~tion de l'oncogène ras (G13C) et du gène DCC ont été décrites dans cette lignée cellulaire (Brattain et al., Cancer Research, 41:1751-1756, 1981).
25 ExF-l~Ipr-F 5: Controle de l'expression de l'Ad-CMV-~x dans des cell~ tumorales h1lmaines à el~v~lmement p53 nul Les cellules H358, é~l~m~nt dérivées d'un carcinome du poumon non à
petites rellllhs, con~titu~nt un modèle de déficience pour la protéine p53 Cette lignée 30 cellulaire présente en effee une délétion homoz~gote pour le gène p~3 (Ma~cwell and ~ Roth, Oncog~nf~ 8: 3 121, 1993). De manière avantageuse, l'adénovinLs Ad-gax bloque de manière efficace la croissance des cellules H358 et provoque une - ~;y~Lo~icité l.. a~ive 48 heures après la tr~n~ cti~ adénovirale (figure 5). Cette mort cellulaire n-est pa~s ~tectee en présence d'un adénovirus controle Ad-RSV-~gal. Ces 35 d-nn~ démontrent que la sllle~ression de gax bloque de manière spécifique et FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
W O 97/16459 PCT~R96/01690 efficace la c,u;~ nre des oellules tumorales ~l~fit~i~nt~ pour p53. De manière P, ces rl~nnP~ ne se limitent pas aux cellules dérivées de car~ s du poumon. En effet, la c.~ Anoe des oellules l~.. ~inP~ Saos, dérivées d'un o~l~s~o,lle, est egpl~m~nt bloquée après l,i.;le~ par Ad-CMV gax. Les oellules 5 Saos co--x~ ./ un modèle ~P~ re à ~,vu~-nn~ p53 et pRb nuls. De nou~,~a~, cet ~nêt de c~ -re est ~IPP~ .,l de la c~n~ n de virus utilisée et n'est pasobs~vee après l~ ;on des oellules ca-~ce,~llses par le virus contrôle (Figure 6).
Ainsi plus de 90 % des oellules Saos-2 sont positives pour l'activité ~gal aprèsin~1t-cticn par AdRSV ~gal à une ml1lt1rliritP d'infection de 250. Dans les mêmes 0 C~n~iition~ p~ (m--ltirliritP d'i,~ ;Lioll 250), AdCMV gax entraîne une baisse de la viabilité c~ ire s~ rte~re à 70%. Gax ayant été initi~ m~nt dé,critcomme un gène d' arrêt de c~u;~ e, la d~m~n~resse a observé de manière n&lle que l'arrêt de c~ s~.lre est suivi par tme mort oellulaire s'app~n~l à
l'apoptose.
La cc,.. L ep~Lie in vivo de la mort oellulaire induite par la su~ e~ion de Gax peut de ",alliè,~ av~nt~g~lce être ~C~iee à un b~n~fi~e thérapeutique chez le patient cancé,eu~.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
AU TRAITEMENT DE CANCERS
La ~les~ e il~v~llion con~ e une nouvelle methode pour le tr~it~m~nt des cancers. Plus particulie.~ , elle con~ P une mPt~ de IL~ des cancers par blocage de la prolifération c~ re laquelle peut être dérégulée dans les cellules 5 ~-mor~l~s e~ un onro,~nf~ tel que ras muté ou d~firi~nt~s pour un gène sup~u~ de turneur tel que p53. Elle colu~ . .e ég~lPm~nt l'utili~tion des v~te lL~
de thérapie géni4ue pe..ll~ I de réguler celle-ci, ainsi que les cc.ll,posiIionspharm~.~euti.lues les CCJ~t~ Q~
Les produits des gènes ras, génér~lemPnt dPcign~ protéines p21, jouent un 10 rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire chez tous les or~nismPs eucaryotes où ils ont été recherchés. Certaines mo~iifi~ti~n~ spe~ifiqu~ de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les con~ pnt à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nombre de lull,eul~ h.. ~ P~ a été associé à la présence de gènes ras mod~fiés. De même, une su~ r~ ion de ces protéines p21 peut con~iu~ à un dérPglPmPnt de la 15 proli~.~Iioll cPlllll~ire.
Dans un co..l~le celllll~ire normal, cette prolifération des oncogènes est vL~ ,hl~lem~nt contrée, au moins en partie, par la génération de gènes dits ~u~:~euL~ de tl~mel~ comme p53 et Rb. On sait ainsi que la protéine p53, au moins sous sa forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement 20 la croissance et la division ce~ ire et qui, dans certaines situations, est capable d'induire l'apoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 3 l5-3 17, 1991). Ces propriétés se manifestant en situation de stress où l'intégrité de l'ADN cellulaire est m~n~cée, p53 a été suggérée être un ~ gardien du génome ~. Toutefois. certains phénomènes peuvent venir pelLulber ce méc~ni.sme d'autoré,~ulation cellulaire et25 favoriser alors le développement d'un état néoplasique. Un de ces évènements con~icte en des mutations au niveau des gènes suppresseurs de tumeurs. C'est ainsi que des forrnes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et not~mmem dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateuY~ comme les ostéosarcomes et qu-il a été noté la pr~sence de p53 mutées dans environ 30 ~0 ~c des tumeurs hllm~inPs, tous types confondus (pour revues, voir Montenarh, ~ Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) En consequence, la mise en évidence de cl~mpos~ biologiques susceptibles d~ k lr~ - à l'~lcollLLt: de ce type de dérèglemf nt de la prolifération cellulaire et/ou de s~-ppl~r à ce type de .1Pri.~:f n~ en gènes su~pLe~euu~ de lu~-euu~ est par conséquent d'un intérêt majeur dans l'approche ~el ~pe~ e de la cancérogen~
La ~esenLe ~ .Lon résulte prfY~i~m~nt en partie de la mise en évidence que la protéine GAX c~ e un inhihit~ .~ pstentif l de la ~oliré,~lion c~ lAire induite par les protéines ras. Elle résulte en particulier de la mise en évidence qu'une ~lil~éL~Lion cf llt~l~;re~ déregulée dans des cellules h~moraies, peut etre retabLte en y 1~ la protéine GAX.
La protéine GAX est une protéine de 303 acides arninés. Sa séquence a été
caractérisée et son cDNA cloné (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
Le gène gax(growth arrest specific homeobox) appartient à la famille des gènes ho~eot;ques. Ces gènes codent pour des fAct~ n~ tionnels qui conti~nn~nt des séql~ences con~ (ou h~)mo~omAinf~s) l~con--Ai~ des régions s~éci~iq~les de l'ADN (ou homéoboîtes) (rewe: Gehring et al. Cell, 78: 211-223, 1994).
L'h-me~cmAin~ de la pL.~Iéinc gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245. Ce gène possède ce,~ines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il ~mble égpl~m~nt contrôler la trAn~hirln G0/G1 du c~cle cellulaire. Ainsi les nivea d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
L~e~,vression du gène gax est donc répninée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Ces observations ont leur cc,r,l.e~ ie in vivo puisquê chez le rat, l'hype~plasie intim~l~ provoquee par l'abrasion de la carotide est associée à une forte baisse de l'e~le~ion de gax (Weir et al. J. Biol. Chem. l99S, 270, 5457-5461).
L'e~ession du gène gax a été mise en évidence dans le système cardio-v~ulaire, not~mment le coeur et l'aorte et jusqu'ici l'utilisation en thérapie génique de ce gène était donc lirnitée au niveau de ces cellulesi l'exprimant naturPIl~m~nt De manière in~ltendue, la ~l~m~n-leresse a découvert qu'il était possible de valoriser avantageusement une activité inhibitrice de la protéine GAX à l'égard de la prolifération cellulaire dans des cellules tumorales c'est à dire des cellules qui n'expriment pas le gène gax de manière endogène.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrél,.enL
efficace pour le ~I di~ l des t~lm~)rs ~i~s à un dérè~1~ment de la pro~ lion cellulaire telles que les Ll~lle~ du poumon non à petites cf~ , les c~;.-o...
~ pan.;.é~Liques et c~liq1les~ les ostéos~c""es etc.
La ~ lv~nLioll décrit e~l~mPnt des systèmes p~~ ièlelllen~
~-rr;.~ la déLv~ ce in vivo, d;~t ..~-~ dans les t~m~, de tels ColllpOSéS et ainsi de lutter contre le dévelo~pe",~ des c~n~
Un ~ .,ier objet de l'illv~l~Lioll réside donc dans l'l~tili.e~tic)n de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la ~,ép~dLion d'une co,l-posiLion 10 ~ re--l;que ~lestinpe au ~ e~ des c~n~
Plus pr~ Pmrnt~ elle se rapporte à l'utili~tion d'au moins une séquence mlrlPi~lt~e codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la p.epaldLion d'une co...l o~;l;on pl~ ret~hque ~estin~e au tr~it~om~nt des C~nr~
Comme indiqué ci-avant il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la p.~senLe invention le terme variant désigne tout mutant fr~gm~nt ou peptide pO~A........ I au moins une propriété
biologique de GAX, ainsi que tout homologue de GAX obtenu à partir d'autres ~c~es Ces fr~gmPntc et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de 20 I'homme du métier, et not~mment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par hybridation ou par clona~e par e~p.e~ion, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modificationsgénétiques incluent les suppressions, deletion.c~ mutations, etc La séquence n~ ue mise en oeuvre peut coder pour tout ou partie la 25 protéine GAX de rat ou un de ses variants.
Le gène utilisé au sens de l'invention est ~-tl-~iellement le gène codant ~ pour la protéine GAX de rat ou de son homologue hnm~in Il s'agit plus préférPntiellement d'un ADNc ou d'un ADNg.
La séquence nucléique revendiquée peut être injectée telle quelle au niveau du 30 site à traiter, ou inc~ée dire~ .e..~ avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans FEUILLE DE REMPLhCEMENT (REGLE 26) WO 97/16459 PCT~R96/01690 vecteur particulier. rTé nin~, on préfère dans le cadre de la plésenle u~ve~lliOII
utiliser un vecteur dt~ ;n;~ LILon, pe~mett~nt d'arnéliorer (i) l'Pfflr~ritP de la p~nP~tirm cç~ ire~ (ii) le ciblage (iii) la st~hilitp exbra- et intr~rP~ ires.
Dirr~ ~ types de vecteurs peu~ être utilisés. Il peut s'agir de v~;leu 5 viraux ou non viraux Le v~;leul selon l'ulv~~ peut ainsi être un agent non vital capable de plOlllOUVO~ le hal~ell et 1I~Lt~ ;OII de la s~-~n~e n~rlP~lue dans des oellules p~aLr~les ou eucaLy-~les. Les ve~;leu~ himi~lu~p~s Oll biochimiques lèpl~esenten~ une 10 ~ l; v~ ullél~:j~l~ aux virus naturels en pa ficulier pour des raisons de commo~it.o, de sécurité et Pg~l~mPnt par rabsence de limite théorique en ce qui c~ n~ Ia taille de l'ADN à transfecter.
Ces veCIeuL~ synthétiques ont deux f~ n~tion~ ln ;nf~;p~lPc, co.~p~cle~ l'acide mlclPiqtle à transfecter et promouvoir sa fixation cell~ ire ainsi que son passage à
15 travers la m~mh~nf~ pl~...;q~,e et, le cas é~h~nt les deux n~é~ u~es nucléaires.
Pour pallier à la nature poly~nioni~le des acides nucléiques, les vecteurs non viraux po~ent tous des charges polyr~ti~nillues.
Parmi les ve~;leul~ ~yllllléliques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyélllylène immine et DEAE dextran ou 20 encore les lipides c~tic~niqtl~ps ou li~>fee~-b sont les plus avantageux. Ils po~ nt la propriété de con~ n.~er l'ADN et de promouvoir son ~C~oci~tion avec la membrane oellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofect~min~
transfectam, etc) et di~érenL~ lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ou li~oss...Ps Plus rPcPmment~ il a élé développé le concept de la 25 transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met a, profit le principe de con-ipn~pr l'ADN gràce au polyrnère cationique tout en ~iirigP~Mt la fixation du complexe à la membrane grace à un couplage ~himitlue entre le polymère c~ti~nique et le ligand d'un récepteur memb.di~a~e, present à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la L,dl~e..ule, à l'insiuline ou du récepteur des 30 asialoglyco,~ ,té.nes des hépatocvtes a ainsi été décrit.
La séquence nucléique utilisée dans la présente in~ention peut etre formulée en vue d'~mini~rations par voie topique, ol~ale, parenLé.ale, intr~n~le intravein~ e. intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De 35 préférence, elle est utilisée sous une forme injectable. Elle peut donc etre mélangée à
FEUILLE DE REMPLACEMeNT (REGLE 26) tout véhicule l~hP ~ ~~ l açcçpts~b!e pour une form~ tion inje~ble~
n.~ pour une iniertion directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de sol~tinnc stériles, icot~ni~ es ou de co~ ~s;~;rn~ sèches, nr.lA....,,~n hili.cP~c, qui, par s~rlriition selon le cas d'eau ~~ icee ou de sémm physiol~q~5 p~ ",~ lac~ x1;4~l;rl~desolutés injec~stl~ Une~ ;Londirectedelase~ n~e n~ L t~ e dans la tumeur du patient est ~I-L~ lt~l~è car elle permet de con~ er l'effet ll.5~ ue au niveau des tissus affectés. Les doses en séquence n~ e ufili~-c peuvenl être S~AS~rt~s en fonction de diî~ ~-Ljp& ~..ell~S, et n~ en fonction du vecteur, du mode d'~A~ aLicll utilisé, de la pStholo~e conrernee ou 10 encore de la durée du ~ ?-lL recherchée.
Pour la mise en oeuvre de la pl~se~ invention, il est tout particulièrement av~ntS~ c d'utiliser un virus recomhin-Smt défectif.
Il est ainsi poscible d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les ~;hov..us15 et plus ~w~ les virus adéno S~ es~ Ces ve.t~,.ux s'avèrent particulièrement pe~Ço~ ~ sur le plan de la ll~;lion.
La ~lesel-~ ve~ ion a donc pour second objet l'utili.e~tion d'un virus - re~omhinS~ntdéfectifco..~ .l auln~lsU~lgèneinsérécodantpourtoutoupartiede 20 la protéine GAX ou d'un variant de oelle-ci. L'invention réside éE~l.om.ont dans l'-nili~ticm d'un tel virus pour le trair~m~nt des cancers. Dans les vecteurs del'invention, le gène inséré et/ou présent peut être un fragment d'ADN complem~nt~ire (ADNc), d'ADN E~nomitlue (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient inséres un ou plusieurs introns. Il peut25 également s'agir de séquences synthétiques ou semisvnthétiques.
Génér~l~m~nt, le gène inséré co~ re,ld eg~l~mpnt des séquences perrnettant son e~lession dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont naturell~m~nt responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sontsusceptibles de foncticmn~r dans la cellule infectee. Il peut ég~lem~nt s'agLr de 30 séquences d'origine di~ e (l~spol~bles de l'expression d'autres protéines, oumême s,vnthétiques). Not~mrn~ont, il peut s'agir de séquences de gènes eucarvotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou l~pih~ L la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon in~ tihle ou non. A titre d'~x~mrle, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLF 26) ~onome d'un virus, et n~ ~1,.."",~ les promoteurs des gènes ElA, MLP' dladénovLL~t, le pLo-~-ote~ CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les p~ , euc~yoles~ on peut citer ~plP~rtPnt les promote~ s ubiq., a~s (HPRT, V;,..t~ -actine, ftlhllinP~ etc), lec P~J~ des fil~tm~nt.c ;.~ r~l;A;n~ PCminP, neurnfilz~mPntc, ke~tin-~, GFAP',5 etc) les prom-~te-.~.c de gènes 1l..~ ;ques (type MDR, CFTR, facteur Vm, etc) les p.~,...ot~ -c de tis~us (p~....,l~--- de l'acline dec oellule~c du muscle lisse), les prc~mote.~-.c pléré~ ~I;Pll~mPnt ac.'ivés dans les cellules en divl~;on, ou encore les promote~s .e~.~ à un ~imllll~c (récepte~ des hoL.Ilolles stéroides, récepteur del'acide rétinoique, etc,). En outre, ces séq~n~es d'~Apl~ion peuvent être m~ fié~
par ~iition de séquences d'a ;~ivulion, de régulation, etc. Par z~illPIlnc, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séqllences d'~ e~ ion, il peut être inséré danc le ~nomP
du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par zlillP,llrc, le gène inséré co~ r~l~d générz~lPment. en amont de la séquencecorizlntP~ une séquence signal riirigPZmt le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séq-lence signal peut être la séquence signal naturelle de GAX, mais il peut P~lPmpnt s'agir de toute autre séquence signal f~n.~ nilplle (celle du gène de la thymidine kinase par exempleJ, ou d'une seq len~e signal artifiri~llP
Les virus selon la plesenle invention sont defectifs, c'est-à-dire incapables dese répliquer de façon ~zlutr~n- mP dzms la cellule cible. GénéralPmPnt, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nPcPe.sz ires à la réplir~ticm dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit PliminPPs (en tout ou en partie), soit rendues non-foncti--nnrll~s, soit s~lbstituees par d'autres sequences et notamrnent par le ~ène inséré
P~l:fé ~ mPnt, le virus défectif conserve n~nmoins les sequences de son génome qui sont nécPs~ires à ll~nr~psi~i~tir~n des particules virales.
Il e.Yiste différents sérotvpes d'adénovirus. dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotvpes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus hllm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale ~voir ~IPm~n-l~ W094/26914). Parmi les adéno~irus d'origine animale utili~hles dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, mu~ne, (PYemrlle: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 9~/16459 PCT~FR96/01690 nce, radén~v~u~ d'cfigine animale est un adénovirus canin, plus ;Pllf~m~nt un adénovirus CAV2 [souche mnnhsttt~n ou A26/61 (ATCC VR-800) par ~-- ..pl~]. De p.~er~t:nce, on utilise dans le cadre de l'invention desadénovirus d'origine h.. ~ e ou canine ou m-~xte.
E~tr,o~ ;pllpmpnt~ les adé~lovi",~ dtr~tir~ de ru-v~llion co~lpl~ enL les lTR, une seq~n~e ~--.el~-l l'~ n~ et l'acide n~rlei~lue d'interêt. Encore plus ~féf~.llielle-nent, dans le ~ nom~ des adéll. Vil u~ de l'invention, la region El au m~ s~ n~ti~ ~ g~lle ~ c~ t ~ cr. ~ n~l par toute technique connue de l'homme du métier, et nc~ ....ont par su~.e~ion 10 totale, ~ b~ l;on, ~ielehon partielle, ou a~ ih~m d'une ou p1t~ciel~rc bases dans le ou les gènes con~ci~lprés~ De telles mc~ifit~ti~ peuvent être obtenues in vit~o (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par ~~y~mp1e au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par tr~it~m~nt au moyen d'agents m-lt~,~enPs D'autres régions peuvent e~lPm~Pnt être mc~rlifiP~Ps, et n~lA..~ la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon rinvention col~x~l~d une ~iplp~tion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de r~ ti~n préféré, il co..~ nd une ~ ti-)n dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquellce codant pour-GAX (Cf FR94 13355). Dans les virus 20 de l'invention, la ~lplétion dans la région E1 s'étend ~re~ ;PIlPm~nt des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovims recombinans défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 ~73; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être 25 preparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un pl~crnirlP portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La reco".l i~l~icon homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et pl~crnirl.~ dans une lignée cellulaire appn,pliée. La lignée cellulaire utilisée doit de pl~e-ellce (i) être transformable par lesdits Plémentc, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie 30 du génome de l'adénovirus défectif, de plerére-lce sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'eYPmrle de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen Virol. 36 (197/) 59) qui contiçnt no~ intégree dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovLrus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de comple~.,~~ les fonctions El et FEUILLE DE REMPLA~EMENT (REGEE ~6) W O 97/16459 PCT~R96/01690 E4 telles que ~rites n..~ nt dans le~s demandes n~ WO 94/26914 et Fnsl)it~, les adénovin~s qui se sont ~ ie~; sont .~cu~çes et purifiés selon les te~hnitltlets classiques de biolo~i~ m~ o~ire.
Co ~ A ,I les virus adéno o~oc;es (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille ~,laliv~ réduite, qui s'intègrent dans le g~?nom~ des oellules qu'ils inr~t~, deEmit; lt~ stable et site-sp~ifique. Ils sont c-orAhl~ d'l.~ un large spectre de ?s, sans induire d'effet sur la c.u;~ e, la ~-lolphologie ou la dir~~
oellul ires. Par ~ ~, ils ne semblent pas; . l~ és dans des pathologies chez l'h-mmf~ Le génom~ des AAV a été cloné, séque~é et caractensé Il co,-,~ d environ 4700 bases, et c~ à chaque e~l e--,ilé une région répétée inversée (ITR)de 145 bases environ, servant d'origine de rérlir.otic-~ pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions .~ntif'.ll~S portant les fonctions d'~n~-op~ Ation: la partie gauche du g~?n( m~, qui c~"~ le gène rep innrli~lue dans la répli~Ation virale et l'~ln~e~ion des gènes viraux; la partie droite du g~n~me, qui conti~nt le gène cap codant pour les ~roleilles de capside du virus.
L~l~tilic~Ation de v~;leu.~ dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la lilléL~Iu~e (voir ~ f ~l WO 91/18088; WO
93/09239; US 4,797,368, US5,139,941. EP 488 528). Ces ~lem~Anrl~s décrivent difr~-~"les constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un org~nicme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recomhin~nt.s défectifs selon l'invention peuvent être ~ s par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire hurnain (par exemple un adénovirus), d'un pl~cmi~le c-nt~n~nt la séquence nucléique d'intérêtbordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'~ncA~rs~ tion (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinAnt.c produit~s sont ensuite purifiés par des techniques classiq~les. L'invention concerne donc eg~l~m~nt un virus recombinAnt dérivé des AAV dont le génome con"u,.:nd une séquence codant pour GAX bordée des ITR de l'AAV. L'invention concerne ég~l~m~nt un plA~crnicle comprenant une séquence codant pour GAX bordée de deux ITR d'un AAV Un tel plAcmicle peut être utilisé tel quel pour transférer la sequence de GAX, év~ntllelhnlent incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo-vinus).
PEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO 97/16459 PCT~R96/01690 ConrPrn~nt les létL.~vLLus, la col~lLu~:lion de Ve~;leUI:j rec-mhin~nte a été
"~"1 décrite rl~ne la lilléil~LIUI'e voir nc~tA----~nt EP 453242, EP178220, RP~ e;~ et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormiclf, BioTerhno~o~ 3 (1985) 689, etc. En particulier, les nGll~v;LuS sont des virus intégratifs, IllrèCl~ull les cellules en 5 divisia~L Le ~Pn~mP des Lch~vLLus co,l~nd ~nt P11PmPnt deux LTR, une séquence d~nl~p~ ~ti~n et trois régions c~nfPs (gag, pol et env). Dans les vGcleuL~
recomhin~nte dérivés des lé~ v;Lus, les gènes gag, pol et env sont génér~lPm-~ntdélétés, en tout ou en partie, et ,~ ~~ par une séquellce d'acide mlclPi~lt~e hétérologue d'intérêt. Ces vG~IèuL~ pe~LvGlll être réalisés à partir de dirrGfGIll~ types de 10 IG~V;L~S tels que ~ le MoMuLV ("murine moloney IP~ Pm;:~ virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("mtmne moloney sa.~o.na virus"), le HaSV ("harvey saL~Illa virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma vims") ou encore le virus de Friend.
Pour CO1~1 Ui1G des IGlI~JV~US recomhin~nt~ comportant une se~ence 15 codant pour GAX selon l'invention, un pl~mi~ comportant ,~t~ pnt les LTR, la séquence d'Pn-~p~ tion et ladite séquence codante est gPn~r~lPmP.nt COhSkui~, puis utilisé pour transfecter une lignée oellulaire dite d'en~ ~p~ tion, capable d'appo, le. en trans les fon~tic~n~c IG~ vilales ~i~r;e~ ~ dans le pl~cmi~ GénérAI~m~nf, les lignées ~ cl'Fn~ ;nn sont donc rAr~hl~ d'~-.pJ;.~ les gènes gag, pol et env. De telles20 li~ées d~nr~rc;~i~tion ont été décrites dans l'art Ant~riel~r, et n~ nt la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (W090/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les léllOvil l1S recomhinAmc peuvent COIII~)OI~er des mo~lifirAtionc au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'enr~rc~ tion éten~ltJes, comportant une partie du gène gag (Bender 25 et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recomhinAntc produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour le trAitem~nt des cancers, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Il est possible d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adéno,irus recombinant), et permet egalement 30 une action efficace et très rapide sur les sites a traiter. Les adénovirus de l'invention - sont e~ mPnt capables d'~ èu à hauts nivea~x le gène gax introduit, ce qui leur confere une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère ~ épisomal, les adénovims de l'invention ont tme persi~tAn~e limitée dans les cellules prolifé.~ives et donc un effet transitoire p~h~;te~u~nt adapté à l'effet thérapeutique 35 recherché.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W O 97/16459 PCT~FR96/01690 Les do~s de virus l)t li~s pour l'injection peuvt.-t être adaptées en ~on;lion de d;lî~lL~ p&.alllcLIcS, et 11~.19.. ~nl en fonction du mode d'~fl.. n;~-dion utilisé et de la durée du l~n;lf7~f nl reclleLcl~e. D'une ~ iCI~ générale, les virus ~co-nb n~.~
~lon l'invention sont forrm~l~ et r I~;n;~h~:s sous forme de doses co,-,~es entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 101~ pfu/ml p~u~ gAl~m~nt être utiIi~. Le tenne pfu ("plaque forming unit") co..es~,ond au pouvoir i If ~;Lieu~ d'une ~s~n~ '~11 de vinons, et est ~ ...;n~ par infection d'une culture c~llnl~ire ap~n~-iée, et mesure, ~ n~ m~lt après 48 heures, du nombre deplages de cellules infectées. Les te~hni~lt1es de di:le~ ;n~I;on du titre pfu d'une solution 10 virale sont bien ~nc~ t~ ~ dans la liL~ ...c.
La présente invention est avAntA~ ~m~nt utilisée in vivo pour la destruction de cellules en lly~e~ lifération (i.e. en prolifération Anorm~If~).
Elle est ainsi A~pli-~hle à la destruction des cellules tumorales. Elle est toutparticulic.e..lcnL appl~pliée au tr~it~m~nt des cancers dans le~ elc un nnro~ne 15 activé est impliqlJe. A titre d'exemple, on peut citer les A~l~?noc~- c;nom~s du colon, les cancers de la thyroide, les cd~r;n~ du ~oull-on, les l~-~...;es myéloides, les cancers COl~ au~L, les cancers du sein, les cancers du po~lllon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les Iy.~ fi...~s B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les ~ o...~s, etc.
En outre, ce tr~it~m~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux rIome5ti-lues (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La p~senle invelllion est plus complèt~m~nt décrite à l'aide des e~e"~lcs qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limit~tifs.
~ FGE~DE DESFIGURES
F~l-re 1: Représentation du pl~mi~ pC01.
Fi~ure 2: Représentation du plasmide pXL-CMV-Gax HA.
Fi~ure 3: Représ~nt~tion de l'effet de l expression de l AdCMV gax sur la prolifération c~ ire chez des cellules hllm~in~c tumorales H460.
30 F;gure 4: Cellules turnorales H460 traitées par l ad,énovims AdCMV gax à M.O.I..
1000 (Figure 4A), M.O.I. 100 (Figure 4B) et M.O.L 1000 (Figure 4C).
Fi~ e 5: Re~l~sel~laLion de l'effet de l'AdCMV gax sur la prolifération cellulai~
chez des cellules h~ ines tumorales Saos.
FEUILLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26) CA 022332~0 1998-04-27 F~e6: Re~fesr~ ;oll de l'effet de l'l;~loll de l'AdCMV gax sur la p~ ion c~ lAire chez des cellules ll---..Ain~,s tumorales H358.
TECHN-OUES C~ENERALES l)E BIOLOGIE MOLECULAIRE
Les mrthr~es riAeS;q..r-."~ tiij~ en birlo~ie m~ ire telles que les 5 e~ion~ pL~alaLiv~s d'ADN p~ ;q-l~ la cen1rifuga~on d'ADN ~ ;r~ue en ~rArli~nt de chlorure de cesium, rélecllopho~èse sur geLs d'agarose ou ~l'ac-~l&.ude, la ~fication de f~gnn~ dl'A~)N par élecbr~llltion~ extrac~ion de protéines au phénol ou au phénol-chlo,~ollne, la preciritAtir)n d'ADN en milieu salin par de réthanol ou de risopn~ ol, la llansL~ n dans Escherichia coli, etc ... sont bien10 c~nn-~r-s de l'homme de métier et sont z~ nri~ décrites dans la liueldl [Maniatis T. et al., "Mol~l~r ClQnin~, a Labol~k,ly Manual", Cold Spring Harbor LaboraLoly, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Mo'~ Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les rl~rnj~ de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont 15 d'origine co....~ .eiale (Rethr~ Research r ~ho~aton~).
Pour les ligatures, les f~mr~nt~ d'ADN peu~elll être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'aclyla-luide, extraits au phénol ou par un ~ m~l~n~ phenoVchlon~ole, ~x~c~ és à l'éthanol puis incubés en p~sence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les ,~~o~ tion~ du fo.l. n;~
Le ,~ e des e~ iL~ s 5' pçoçmin~nt~ peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du foll~nic~el~. La destruction des ~L.e...i~és 3' pro~min~nt~ est effectuée en presence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~tions du fabricant. La destruction des exL ~---i~s 5' pro.~min~nt~s est effectuée par un traitement ménagé par la m~cle~ee S1.
La ml-t~ n~e dirigée in vitro par oligodéoxym~ ot~ s svnthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Tavlor et al. [Nucleic Acids Res. 13 ( 1985) 8 ,49-8764] en ut~ nt le kit distribué par Amersham.
L'~mrlific~tion el~.,.aLique de fra~rnenr~ d'ADN par la technique dite de PCR
Lol~vmérase-catalvzed Chain Beaction, Saiki R.K. et ai., Science 23Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzvm. 155 (1987) 33~-350] peut être effectuée en ~nili~nt un "DNA therrnal cvcler" (Perkin Elmer Cetus) selon les specifications du ~'bsicant.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) La vérifi-~tion des s~ ~~ es nucléotidi,~ues peut être effectuee par la mPthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. .A.cad. Sci; USA, 74 (1977) 5463-5467] en lltili.e~nt le kit d~L ibllé par ~...e~ ~1.A~..
F.XF.lVlPr.F. 1: co~ u;~ion du vecteur pXL~CMV-G~Y HA po~tant le ~en~ ccA~nt 5 pou~ la protPin~ ~ de rat sous le contrôle du plul~o!~ir CMV.
Cet ~ e décrit la co~,:,ku~;lion d'un ~e~leur cn.~ l'ADNc codant pour la protéine gax (espèce: rat) et des Seq~ ces a~nov..~les pelln~lL~IL une ~J,,,h;n~;eon L'épitope de l'h-~m~ ;n~ du virus ;.~ ipn~A (épitope HA1), co,.lp.en~nL 18 acides aminés, est ajouté à l'I Akél~l;lé N-t~rmin~le de la protéine gax (Field et al., Mol.Cell.Biol. 8: 2159-2165, 1988). Ce procédé d'addition d'épitope pemnet de suivre, nnl;..,....Pnt par des techniques d'i,--....~nnfl--nre~Pnt~ç, l'expression de gax à l'aide d'anticorps dirigés contre l'épitope HA1. Outre sa ~n~ihilit.o, cette methoflp permet de ~ rr~ h;~ du bruit de fond cores~ndant à l'eA~ession de p~Lé.nes gax Pnr1o~n.os à la fois in vitro et in vivo.
1.1. Co~ in-l du plasmide pCOl (Figure 1) A - Corl~truction du pl~cmi~ pCE
Le fragment EcoRI-XbaI correspondant à ll~,ALIéllliLé gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été cloné entre les sites EcoRI et XbaI du vecteur pIC19H.
Ceci génère le pl~ pCA. Le p~ e pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses 20 eAL èlllinles 5' pro~minf~ntf~ ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN
polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du pl~cmif1P pCA qui contient l'eALIèm;léé gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et SmaI du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Ceci génère le pl~cmi~i~P pCB. Le p!~ e pCB a ensuite été coupé
25 par EcoRI, ses e~LrèmlllLès 5' prC!PminPntps ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polvmérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du pl~cmi~l~ pCB qui contiPnt l'e.nrémité gauche du génome de l'adéno~irus Ad5 a ensuite été cloné entre les sites Nru~ et BglII du vecteur plC20H. Ceci génere le pl~cmi~lP pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières 30 paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage B - Con'stn~ction du plasmide pCD' FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGI E 26) W O 97~16459 PCT~R96/01690 Le fragment Sau3A (33463 - SstI (3645) et le fra~ment SstI (3645) - Narl (5519) du ~nom~ de l'adénu.v~us Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clonés entre les sites ClaI et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le rls~niAe pPY53. Le fr~gment SalI-TaqI du ~t-~"~;~.o pPY53 préparé à partir d'un cc.~ dam-, co~lP~
la partie du ~ me de l'ad&,~vvi.ux Ad5 cr.. ~ e entre les sites Sau3A (3346) et TaqI
(5207) a ensuite été cloné entre les sites SalI et ClaI du vecteur pIC20H, ce qui génère le r'~ pCA'. Le [.~.~,,,.c:nL TaqI (5207) - NarI (5519) du ~Pnom~o de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un co..~t~Y~? dam- et le fr~m~nt SalI-TaqI du rlq~mi~e pCA' ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NarI du vecteur pIC20H. Ceci génère le rlstemi-le pCC'. Le fr~t~ nt NarI (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un C~ YI~- dam- et le fragment SalI-NarI du rkl~mi~l~ pCC~ ont ensuite été ligaturés et clonés entre les sites SalI et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le rls.~mi~o pCD'.
C - C.~ u-lion du pklcmifl.? pC01 Une digestion partielle par XhoI puis une r~ on cornrlète par SalI du rt~cmitle pCD' génère un fra,~mPnt de restriction qui c~ la séquence de l'adén~v-- us Ad5, du site Sau3A ~3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été cloné
dans le site SalI du pls~miriP pCE. Ceci génère le p~s~ pC01 (figure 1), qui conti~nt la partie gauche de rad~lov--u~ Ad5 jusqu'au site Hinfl (382), un mlllti~it~ de clonage et le fr~rn~nt Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus Ad5.
1.2. Construction du vecteur p~CMV-Gax HA (cf. figure 2) L'ADNc de Gax a été cloné entre les sites XbaI-BamHI du vecteur pCGN
(Tanaka et Herr, Cell 60: 375-386, 1990). Le vecteur pGCN-Gax résultant contient25 les promoteur précoce et séquence ~nh~n-~er du cyton~ lovims (CMV) (-522, +~2;
Boshart et al, Cell, 41: 521-530, 1985), la séquence leader de la th~midine kinase de l'Herpes simplex virus inrlu~nt le codon d'initiation AUG ainsi que les trois premiers acides aminés (+55, +lO l; Rusconi et Yamarnoto. EMBO J., 6: 1309-1315, 198~), la sequence codant pour l'épitope HA1,1'ADNc de gax de rat et enfin la sec~uence de 30 poly adénylation du gène de ~globine de Lapin (Pabc, et al, cell. 35: ~>- l53, 1983).
Le vecteur pCGN-Gax a ensuite été coupe par ~nnI et SfiI et le fragment obtenu, c--nt~n~nt promoteur, ADNc et séquence de polyadénylation, préalablementtraité à la Klenow, a été introduit au site EcoRV du vecteur navette pCOl contenant FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W O 97/16459 PCT~R96/01690 les seqllences a~-~vilales nP~ es à la ~-~n~ina-s~n. Le pl~ cmidP obtenu a été
désigné pXL-CMV-Gax HA (cf figure 2).
FX~.l~p~.F 2: C--n.~ n de l'adéncvu ls recombinant Ad-CMV~
Le vecteur pXL,CMV-Gax HA préparé dan~ 1 est ensuite l;~~~
et col-n.. xr~cté pour la ,~ h;~u;xon avec un vecte~ur adél~uvi~ efi~t~nt, dans les oellules helper (lignée 293) appo~ en ~rans les fo~octi~n~ codées par les régions E1 lElA et E:lLB) d'adenovirus.
L'adénovirus Ad-CMVgax a été obtenu par reco...l~ aison homologue in vivo entre raden.~.vu ls Ad.RSVBgal (Stratford-PP~rica~ pt et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le vecteur p~L-CMV-Gax HA selon le protocole suivant: le vecteur pXL-CMV-Gax HA 1;QP~ e par l'enzyme Xm~lI et l'adén~.v.lu~ Ad.RSVBgal linéarisé par ClaI ont été co-transfectés dans la lignée 293 en ~ sence de l~hospll~tP de calcium pour per...ellle la rec~mh;n~;~)n hom~)logl~p Les adénovirus rP~omhin~ntc ainsi 15 générés ont été ~l~ti~nnP~ par p~l~ifi~ ~tion sur plaque. Après isQlPmPnt, l'adénovims rea m~in~nt est ~mplifiP dans la lignée c~llnl~ire 293, ce qui conduit à un s~n~nt de culture CO~ Q~ l'ade~l~v~us défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101~ pfu/rnl.
Les particulec virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure 20 de oesium selon les techniques connl~Pc (voir n~t~mmPnt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-CMVgax est conservé à -80~C dans 10 ~c de glvcérol F.XEMPLE 3: Contrôle de l'eA~,~ssion de l Ad-CMV~x dans des cellules tumorale$
h~ ainç5 H460.
Les cellules tumorales hum~in~oc H~60 dérivées d'un cancer du poumon non à
petites oellules ont été tr~n~1litpc par l'adénovirus recombinant Ad-CMV gax et par un virus contrôle e~ t la ~3-galactoc;~ Ad-RSV- ~3gal) à mllltir!i~itPc d'infection (M.O.I.) croissantes (figure 3). Après 1 heure 30 d in-ubation en présence 30 de la solution adénovirale, le rnilieu de culture co.-.~,.ellant 10 ~c de serum foetal est renouvelé et les oellules in~héPc pendant une période de ~8 heures. La viabilitécellulaire étant contrôlée par test d'exclusion de bleu trypan, le nombre de cellules viables par puits de culture est alors dt:le--"---é. Deux lots d'adénovirus AdCMV gax, Ad-gax et Ad-gax(2), ont été utilisés et correspondent à deux productions FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26) .s dans les cellules 293. Les L_livi~s des deux lots s'avèrent co...p~.,.hloc et bien ri;~ s de l'adénovims corltrôle AdRSV 13gal.
L'uti1ie~tifn de Ad-RSV - ,~gal a pt~ ?~ n~nt permis de c~e-.-l..l.ct la c~ d'un n;iénuv.Lus reC~-mhin~nt à l.,~ e de ll~h;.c efficace les oellules H460. Ainsi l'activité 13gal m~ ire a été ~etectée dans plus de 75 % des cellules traitées par Ad-RSV- ~gal (M.O.I. 1000). En F~ CA~;On de la protéine gax a été mise en cvide.lce dans les oellules l - A~ C par Ad-CMV gax par imm1m~ ~esCe~ ne. Les ~ it~e de tran~ cti~n des virus Ad-CMV gax et Ad-RSV- ~3gal se sont avérés co ~.p~bles. Le tr~itemf~nt des oellules H460 par Ad-CMV
gax est associé à une ré~ction de la p~olifération cellulaire mais é~1~m~nt à une eyll~l~AiCité Ill~biV~ ~letectee 48 heures après la tr~n~c~ucti~n par l'adénovirus (cf.
figurec 4A, 4B et 4C). Un tel effet n'est pas observé avec l'adénovirus contrôle. Ces ~ mn~ ...onl.e~l donc que la S~leA~'e~iOn de la protéine gax s'accomp~gn~ d'un arrêt de la ~ e des cellules H460.
De Illalli~e illlél~X~ e, les oellules H460 ~yrrim~nt une plvléi~e ras mutée (Ki-ras). Nos c~nn~s démontrent de I~ surprenante que l'e~e~ion de la protéine gax permet de rétablir le contrôle de la prolifération c~ ire initi~l-om-ont dérégulée par la ~Ivléine ras ...~;r;~e Le caractère ~1O...;.~.I du facteur gax vis-à-vis des ....~ n~ on~o~niqu~o-s de ras n'est pas l~ll~i,ll aux ca~ o,~les du poumon. Des 20 résultats similaires, à savoir un arrêt de e~ ~ par AdCMV gax, ont été obtenus sur les cellules HCT116 dérivés d'un ca.~ino-l-e du côlon. Une m~lt~tion de l'oncogène ras (G13C) et du gène DCC ont été décrites dans cette lignée cellulaire (Brattain et al., Cancer Research, 41:1751-1756, 1981).
25 ExF-l~Ipr-F 5: Controle de l'expression de l'Ad-CMV-~x dans des cell~ tumorales h1lmaines à el~v~lmement p53 nul Les cellules H358, é~l~m~nt dérivées d'un carcinome du poumon non à
petites rellllhs, con~titu~nt un modèle de déficience pour la protéine p53 Cette lignée 30 cellulaire présente en effee une délétion homoz~gote pour le gène p~3 (Ma~cwell and ~ Roth, Oncog~nf~ 8: 3 121, 1993). De manière avantageuse, l'adénovinLs Ad-gax bloque de manière efficace la croissance des cellules H358 et provoque une - ~;y~Lo~icité l.. a~ive 48 heures après la tr~n~ cti~ adénovirale (figure 5). Cette mort cellulaire n-est pa~s ~tectee en présence d'un adénovirus controle Ad-RSV-~gal. Ces 35 d-nn~ démontrent que la sllle~ression de gax bloque de manière spécifique et FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
W O 97/16459 PCT~R96/01690 efficace la c,u;~ nre des oellules tumorales ~l~fit~i~nt~ pour p53. De manière P, ces rl~nnP~ ne se limitent pas aux cellules dérivées de car~ s du poumon. En effet, la c.~ Anoe des oellules l~.. ~inP~ Saos, dérivées d'un o~l~s~o,lle, est egpl~m~nt bloquée après l,i.;le~ par Ad-CMV gax. Les oellules 5 Saos co--x~ ./ un modèle ~P~ re à ~,vu~-nn~ p53 et pRb nuls. De nou~,~a~, cet ~nêt de c~ -re est ~IPP~ .,l de la c~n~ n de virus utilisée et n'est pasobs~vee après l~ ;on des oellules ca-~ce,~llses par le virus contrôle (Figure 6).
Ainsi plus de 90 % des oellules Saos-2 sont positives pour l'activité ~gal aprèsin~1t-cticn par AdRSV ~gal à une ml1lt1rliritP d'infection de 250. Dans les mêmes 0 C~n~iition~ p~ (m--ltirliritP d'i,~ ;Lioll 250), AdCMV gax entraîne une baisse de la viabilité c~ ire s~ rte~re à 70%. Gax ayant été initi~ m~nt dé,critcomme un gène d' arrêt de c~u;~ e, la d~m~n~resse a observé de manière n&lle que l'arrêt de c~ s~.lre est suivi par tme mort oellulaire s'app~n~l à
l'apoptose.
La cc,.. L ep~Lie in vivo de la mort oellulaire induite par la su~ e~ion de Gax peut de ",alliè,~ av~nt~g~lce être ~C~iee à un b~n~fi~e thérapeutique chez le patient cancé,eu~.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Claims (13)
1. Utilisation de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
2. Utilisation d'au moins une séquence nucléique codant pour tout ou partie de la protéine GAX ou d'un variant de celle-ci pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
3. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que la séquence nucléique est utilisé sous forme complexée avec du DEAE-dextran, avec des protéines récepteurs, ou avec des lipides ou polymères cationiques, sous forme de liposomes ou encore tel quel.
4. Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que la séquence nucléique fait partie d'un vecteur viral recombinant.
5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que la séquence nucléique fait partie d'un vecteur viral, choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés.
6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2.
7. Utilisation selon la revendication 4, 5 ou 6 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine.
8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre code pour tout ou partie de la protéine GAX de rat ou d'un variant de celle-ci.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre code pour la protéine GAX de rat ou son homologue humain.
10. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre est un ADNc,
11. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre est un ADNg.
12 . Utilisation selon l'une des revendications 4 à 11 caractérisée en ce que laséquence nucléique mise en oeuvre comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée.
13. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 12 caractérisée en ce que la séquence nucléique mise en oeuvre comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
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