CA2252529A1 - Systeme d'expression derive du gene de la tyrosine hydroxylase - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouveau système pour l'expression de gènes. Le système de l'invention est basé notamment sur l'utilisation de séquences dérivées du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase possédant des propriétés d'enhancer de la transcription. Le système de l'invention est particulièrement avantageux pour la production de protéines in vitro, ex vivo ou in vivo, notamment dans des applications de thérapie génique.

Description

CA 022~2~29 1998-lO- 19

2 PCT/FR97/00636 SYSTEME D'EXPRESSION DERIVE DU GENE r~E LA TYROSINE
HYDROXYLASE

La présente invention concerne un nouveau système pour l'expression de gènes. Elle concerne également l'utilisation de ce système en thérapie S génique ou cellulaire, pour augmenter l'expression de gènes d'intérêt, ou pour la production de protéines recombinantes.

Les thérapies génique et cellulaire consistent à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une 10 information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme (thérapie cellulaire), soit directement in vivo dans le tissu approprié (thérapie génique). Différentes techniques existent pour effectuer le transfert de gènes, 15 parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des vecteurs chimiques ou biochimiques, naturels ou synthétiques tels que des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), I'emploi de 20 liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), lipides cationiques, etc. Une autre technique repose sur l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires et en particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés et 25 les adénovirus. L'une des difficultés pour le développement de ces thérapies génique et cellulaire réside cependant dans l'efficacite du traitement. En particulier, il est important de pouvoir obtenir une expression forte du gène d'intérêt afin d'améliorer l'effet thérapeutique. Le même type de CA 022~2~29 1998-10-19 problématique se pose dans le cas de procédes de production de protéines recombinantes.

Différents types de promoteurs ont été decrits dans la iittérature et sont utilisés pour controler l'expression de gènes d'intér~ts. Cependant, les 5 niveaux d'expression obtenus sont parfois insuffisants pour obtenir des quantites industrielles de protéine recombinante in vitro ou pour générer in vivo un effRt thérapeutique important eVou durable. La présente invention décrit maintenant un nouveau système d'expression de gènes particulièrement efficace. La presente invention découle notamment de 10 I'idenlitication de régions dotées d'une activite enhancer de la transcription, permettant d'augmenter la force de promoteurs, et ainsi les niveaux d'expression de gènes.

La présente invention résulte plus particulierement de l'identification de régions du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase, capables 15 d'augmenter l'activité de promoteurs transcriptionnels. Ces régions sont localisées plus précisement au niveau du microsatellite HUMTH01 présent dans le premier intron de ce gène.

Les microsatellites représentent une classe abondante de séquences répétées d'ADN qui présentent un grand polymorphisme lié à des variations 20 dans le nombre de motifs répétés eVou dans la séquence de ces motifs. Ces microsatellites ont pour cette raison été utilisés comme marqueurs génétiques pour la construction de cartes génétiques et pour l'identification de loci impliqués dans des pathologies. La taille des différents allèles d'un microsatellite dépend de variations dans le nombre de motifs répétés. Des 2s expériences de séquençage de dimères répétés ont ainsi permis de montrer une variation dans le nombre de motifs répétés et dans leur séquence. Ces variations peuvent correspondre notamment à des répétitions "parfaites", c'est-à-dire sans interruption dans la séquence de bases, ou à des répétitions "imparfaites", contenant une ou plusieurs interruptions dans la CA 022~2~29 1998-10-19 WO 97/40172 PCT/~R97/00636 séquence des motifs, qu'il s'agisse de délétion(s) ou d'insertion(s). De la même façon, des variations de longueur eVou de séquence ont également été observées dans les motifs trimériques ou tétramériques répétés. Ainsi, des variations de ce type ont été observées dans les mic,osatellites 5 HUMHPRTB (Edwards et al., Genomics 12 (1992) 241) et HUMTH01 (Puers et al., Am.J.Hum.Genet. 53 (1993) 953).

Le micr~satellite HUMTH01 est localisé dans le premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase (TH), qui est l'enzyme limitante de la voie de biosynthèse des catecholamines. Une partie de la séquence de cet intron est 10 représentée SEQ ID N. 1 (a partir du nucleotide 871). Cette séquence inclut le microsatellite HUMTH01 (allèle (TCAT)9, represente en gras), qui est localisé a la position 1170 (GenBank, accession # D00269). Le microsatellite HUMTH01 est constitué de motifs tétramériques TCAT répétés. Il présente un certain polymorphisme, différents allèles ayant été décrits possédant des 15 nombres de motifs répétés variables. L'allèle le plus souvent rencontré (allèle Ei) comporte 10 motifs répétés et une délétion d'une paire de base dans le cinquième motif répété, qui comporte la séquence CAT (SEQ ID N. 2).
D'autres allèles ont été identifiés portant de 5 a 10 motifs TCAT.

La demanderesse a maintenant montré que, de manière surprenante, 20 ces séquences sont reconnues spécifiquement par des protéines présentes dans différents extraits nucléaires (exemple 1). De plus, la demanderesse a démontré que ces séquences permettaient d'augmenter la transcription de gènes dans différents systèmes cellulaires (exemples 3 et 4). Ainsi, dans les cellules PC12, une augmentation d'un facteur 25 a 50 de l'activité
25 transcriptionnelle a été observée. Dans les cellules Hela, une augmentation remarquable d'un facteur 100 a 350 fois a été observée. Ces séquences présentent donc des propriétés d'activateurs transcriptionnels très puissants.
Ces propriétes sont particulièrement inattendues, et bien supérieures aux effets observés avec d'autres enhanceurs transcriptionnels. Ainsi, une CA 022~2~29 1998- lO- 19 augmentation de l'activité transcriptionnelle d'un facteur 3 a 6 a été obseNée avec des séquences HRAS1-VNTR (Green et al., 1993, ref), et d'un facteur 2 a 5 avec des séquences INS-VNTR (Catignani et al., 1995). L'augmentation obtenue avec les séquences de l'invention peut ~p~-sser un facteur 300, et 5 constitue un avantage énorme par rapport aux systèmes antérieurs. En outre, les résultats obtenus montrent que les séquences de l'invention sont fonctionnelles dans différents types cellulaires et dans des cellules d'organisrr~es différents (cellules de rat PC12, cellules humaines HeLa), ce qui démontre un potentiel d'applications très large.

Un premier objet de l'invention concerne donc un fragment d'ADN
ayant une activité d'enhancer transcriptionnel consistant essentiellement en une portion du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase.
Avantageusement, le fragment de l'invention comprend moins de 200 pb et inclut un allèle du microsatellite HUMTH01. Plus préférentiellement, le 15 fragment comprend moins de 1 OOpb. De manière particulièrement avantageuse, le fragment est constitué essentiellement d'un allèle du microsatellite HUMTH01.

Comme indiqué ci-avant, le microsatellite HUMTH01 est localisé a la position 1170 environ du gène TH humain (GenBank accession #D00269), et 20 est constitué principalement de motifs tétramériques TCAT répétés.
Différents allèles de ce microsatellite ont été décrits possédant des nombres de motifs répétés variables (de 5 a 10) et des variations de séquences, certains allèles possédant des mutations de bases. Ainsi, I'allèle le plus souvent rencontré (allèle Ei) comporte 10 motifs répétés et une délétion 25 d'une paire de base dans le cinquième motif répété, qui comporte la séquence CAT (SEQ ID N. 2). D'autres allèles ont été identifi~s portant de 5 a 10 motifs TCAT (SEQ ID N. 9-15). En outre, un fragment d'ADN portant 3 motifs TCAT peut être synthétisé et teste comme enhanceur transcriptionnel, selon l'invention.

CA 022~2~29 1998- lo- 19 A cet egard, I'invention a également pour objet un fragment isolé
d'ADN caractérise en ce qu'il possède une activite d'enhanceur transcriptionnel et en ce qu'il possède la séquence (TCAT)n-(CAT)o~(TCAT)p~
dans laquelle n est compris entre 1 et 50; o est compris entre 0 et 20 et p est 5 compris entre 0 et 50.

Selon une variante particulière de l'invention, I'enhanceur transcriptionnel possède une séquence (TCAT)n-(CAT)o~(TCAT)p dans laquelle n est compris entre 2 et 20 inclus, et o et p valent 0.

Selon une autre variante particulière de l'invention, I'enhanceur 10 transcriptionnel possède une séquence (TCAT)n-(CAT)o~(TCAT)p dans laquelle n est compris entre 1 et 10, o est compris entre 1 et 5 et p est compris entre 1 et 10.

A titre d'exemple spécifique d'enhanceurs transcriptionnels selon l'invention, on peut citer les fragments de séquence SEQ ID N.1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15.

Un autre objet de la présente invention réside dans une cassette d'expression comprenant une séquence codante, un promoteur permettant son expression et un enhancer de la transcription tel que défini ci-avant.
Avantageusement, la cassette comprend en outre un signal de terminaison 20 de la transcription.
Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de préférence humaines. Il peut s'agir notamment d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A
25 cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés, tels que le promoteur du gène p53. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou CA 022~2~29 1998- lo- 19 WO 97/40172 PCT/FRg7tO0636 réprimant la tra"scri~ulion d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promol,ices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs 5 eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur 10 Vlll, ApoAI, ApoAII, Albumine, Thymidine kinase, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, de la villine, de la protéine intestinale de liaison des acides gras, de l'a-actine du muscle lisse, promoteur de l'enolase specifique neuronale (Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187); etc), du promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la 15 VAChT (transcporteur de l'acetylcholine: Cervini et al., J.Biol.Chem. 270 (1995) 24654) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et Ml P d'adénovirus, le 20 promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, le promoteur du gène TK d'un virus de l'herpes, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition ou délétion de séquences. A cet effet, le promoteur utilise peut etre un promoteur Lminimal", c'est-a-dire un promoteur reduit dont l'activité dépend essentiellement de la 25 présence d'un transactivateur tel qu'un enhaceur de l'invention. De ce fait, en l'absence de l'enhanceur, I'activité du promoteur est reduite et le gène n'est pas ou peu exprimé. En revanche, en présence de l'enhanceur, I'activité du promoteur minimal est ~orte et l'expression du gène d'intérêt importante. Le promoteur minimal est constitué généralement d'une boite TATA ou INR. Ces 30 éléments sont en effet les éléments minimum nécessaires à l'expression d'un CA 022~2~29 1998-10-19 ~ gbne en présence d'un transactivateur. Il comprend avantageusement moins de 200 pb, incluant la region TATA ou INR. Le promoteur minimal peut être préparé à partir de tout promoteur par mo~ icaLion génétique. A titre d'exemple particulier de promoteur candidat on peut citer le promoteur du 5 gène de la thymidine kinase. Des résultats intéressants ont plus précisément été obtenus avec un promoteur minimal dérivant du promoteur du gène de la thymidine kinase du virus de l'herpes simplex type I (TK) composé des nucléotideS -109 a +52, ou -37 à +19. Le promoteur minimal peut également dériver du CMV humain. En particulier, il peut être constitué du fragment 10 compris entre les nucléotides -53 à +75 ou -31 à +75 du CMV (+1 correspondant au codon ATG). Tout promoteur conventionnel peut toutefois être utilisé tel que par exemple le promoteur des gènes codant pour la chloramphénicol acétyle trans~érase, la ~-galactosidase ou encore la luciférase.
Avantageusement, le promoteur transcriptionnel est un promoteur fonctionnel dans les cellules mammifères, et notamment un promoteur viral (TK, CMV) ubiquitaire (PGK) ou spécifique (promoteur de l'enolase spécifique neuronale, promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la VAChT.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le promoteur transcriptionnel est un promoteur minimal, composé essentiellement d'une région de moins de 200 pb comprenant une boite TATA ou INR.

La séquence codante comprend avantageusement une ou plusieurs séquences codant pour des protéines. Il peut s'agir notamment d'une séquence codant pour un produit thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, la séquence codante est une séquence d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain,animal, végétal, etc) codant pour un produit protéique tel que des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les Iymphokines:

CA 022~2~29 l998- lO- l9 interieukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apoli,uoprvtéines: ApoAI, ApoAlV, ApoE, etc (FR 93 0~125), la 5 dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation: Facteurs Vll, Vlll, IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (V\tO91/19813) etc.

La séquence codante peut également être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telies séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la 15 technique décrite dans le brevet EP 140 308.

La présente invention est egalement adaptée à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides 20 :Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes tueurs capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3 (PCT/FR94tO0~42), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Ce système est également particulièrement intéressant pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple.

La cassette d'expression est avantageusement constituée des éléments suivants:

CA 022~2~29 1998- lo- 19 - comme région enhanceur, une séquence (TCAT)n-(CAT)o-(TCAT)p~
dans laquelle n'est compris entre 1 et 50; o est compris entre 0 et 20 et p est compris entre 0 et 50, - comme promoteur, le promoteur du gène de la thymidine kinase du 5 virus HSV-1 ou un promoteur minimum en derivant, le promoteur précoce du CMV ou un promoteur minimum en dérivant, le promoteur PGK, le promoteur de l'enolase spécifique ou le promoteur du gène VAChT, - une séquence codante d'intérêt.

Encore plus préférentiellement, le promoteur est constitué de la région 10 -109 a +52, ou -37 à +19 du promoteur du gène de la thymidine kinase du HSV-1 .

Avantageusement, la région enhanceur est choisie parmi les fragments de séquence SEQ ID N.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15. En outre, une propriété particulièrement remarquable des régions 15 enhanceur de l'invention est qu'elles semblent être actives aussi bien dans l'orientation sens (orientation normale du microsatellite dans le gène TH) que dans l'orientation antisens (orientation inverse de celle du microsatellite dansle gène TH). De ce fait, dans les cassettes d'expression de l'invention, la région enhanceur peut être positionnée dans les deux orientations (5' ~ 3' 20 ou3'~5').

Un autre aspect de l'invention réside également dans un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Le vecteur peut être de nature plasmidique ou virale.

Parmi les vecteurs viraux, on peut citer plus préférentiellement les 25 adénovirus, les rétrovirus, les virus de l'herpès ou encore les virus adéno associés. Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.

CA 022~2~29 1998-10-19 ~ Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent ~êtresoit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit 5 substit(lées par d'autres séquences et notamment par les séquences de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.

S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotvpes, 10 dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.
Parmi ces sérotvpes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente 15 invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De 20 préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.

Préférentiellement, le génome des adénovirus recombinants de l'invention comprend au moins les ITR et la région d'encapsidation d'un adénovirus, et la séquence d'acides nucléiques codant pour une molécule 2~ chimérique et une cassette d'expression telles que définies ci-avant. Plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution (par exemple par les CA 022~2~29 l998- lO- l9 WO 97t40172 PCT/FR97/00636 séquences de l'invention), dét~tion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les g~nes considérés. De telles modifications peuvent être ~ obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents 5 mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de miss en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation 10 préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérées la région E4 et les séquences de l'invention (Cf FR94 13355).

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En 15 particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la cassette d'expression de l'invention et des séquences homologués a l'adénovirus. La recombinaison homologué se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. Le génome adénoviral peut également 20 être prépare in vitro, dans une bactérie (FR95 01632) ou dans une levure (W095/03400). La lignée cellulaire utilisée pour la production des adénovirus doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les 25 risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les 30 demandes n~ W0 94/26914 et W095/02697.

CA 022~2~29 1998-10-19 Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récup~rés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Concernant les virus adéno-associés (MV), il s'agit de virus à ADN de 5 tallle relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. lls sont capables d'infecter unlarge spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pasimpliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des MV a été
10 cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé
en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication 15 virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.

L'utilisation de vecteurs dérivés des MV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91 /18088;WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes 20 décrivent différentes constructions dérivées des MV, dans lesquelles les gènes rep eVou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les MV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un 25 lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la cassette d'expression de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'MV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'MV. Les MV
recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

CA 022~2~29 1998- lo- 19 PCT/F1~97/00636 - Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, 5 BioTechnology 3 (1985) 689, etc.

En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivem,ent les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions 10 codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus";
15 encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV
("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.

Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et les 20 séquences de l'invention (cassette d'expression) est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.
Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans 25 I'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRlP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par - ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag CA 022~2~29 l998- lO- l9 ~ (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

La cassette de l'expression peut également être insérée dans un vecteur plasmidique (FR95 02117).

Le systbme d'expression de gènes de l'invention est particulièrement approprié pour une utilisation en thérapie génique ou cellulaire, ou pour la production de protéines recombinantes. Pour des applications de thérapie génique ou cellulaire, les cassettes ou vecteurs plasmidiques peuvent être utilisés sous forme d'ADN nu, ou complexe a des vecteurs inertes de transfert. Différents types de vecteurs inertes capables de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes ont en effet été décrits. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative aux virus, en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.

Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.

Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine (W096/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine,transfectam, W095/18863) et différents lipides cationiques ou neutres CA 022~2~29 1998-10-19 (DOTMA, DOGS, DOPE, etc). Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met à profit le principede condenser l'ADN grâce au polymère cationique toùt en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère 5 cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit.

La présente invention a également pour objet toute composition 10 pharmaceutique comprenant un vecteur tel que défini ci-avant. Ces compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une 15 formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de 20 solutés injectables. S'agissant des rétrovirus, ils peut être avantageux d'utiliser directement les cellules d'encapsidation ou des cellules infectées exvivo en vue de leur réimplantation in vivo, éventuellement sous forme de néo-organes (W094/24298).

Les doses de vecteur utilisées pour l'injection peuvent être adaptées 25 en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les MV et les adénovirus, des doses de 106 à

CA 022~2~29 1998-10-19 101~ pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées.
5 Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

Un autre objet de l'invention consiste en une cellule comprenant un fragment d'ADN, une cassette d'expression ou un vecteur tels que definis ci-dessus. Ces cellules sont obtenues par toute technique connue de l'homme 10 du métier permettant l'introduction d'un ADN dans une cellule donnée. Il peuts'agir notamment de transformation, transfection, infection, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. S'agissant de la transformation in vitro ou ex vivo, différents protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, la transformation 15 de cellules peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décrite par Ito et al. (J. Bacteriol. 153 ~1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulfoxyde selon la technique de Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7). Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de 20 brevet EP 361 991. S'agissant d'électroporation, elle peut être réalisée selon Becker et Guarentte (in: Methods in Enzymology Vol1 94 (1 991 ) 1 82).

~ es cellules selon l'invention peuvent être de différentes origine. En particulier, il peut s'agir de bactéries ou de cellules eucaryotes (levures, cellules animales, cellules végétales) etc. Parmi les bactéries, on peut citer 25 plus préférentiellement ~QIi, 1~- subtilis. Stre~tQmyces. Pseudomon~
putida, e- aeruginosa)~ Rhi70bium meliloti. Agrobacterium tumef~iens.
St~hylococcus aureus. Streptomyces pristin~esoiralis. Fnterococcus faecium ou Clostridium. etc. Parmi les bactéries, on préfère utiliser E. coli.
Parmi les levures, on peut citer Kluyveromyces. Saccharomyces. Pichia, CA 022~2~29 1998-10-19 H~nsenul~ etc. Parmi les cellules animales de mammif~res, on peut citer les cellules CHO, COS, NIH3T3, PC12, etc. Pour des applications de thérapie génique ex vivo, on peu egalement citer les cellules souches hématopoietiques (W088/08450, W093/20195, WO93/09815, 5 WO93/11230), les cellules endo~héliales (W089/05345, WO90/06757, W092/09222), les myoblastes (W093/03768, WO93/24151, WO94/01129), les fibroblastes (US 5,219,740, W089/02468, W093/07906), les hé,~atocytes (W089/07136, WO92/12242, WO93/03142), les astrocytes (WO94/01135), les neurobl~stes (WO94/10292, W094/16059), les kératinocytes 10 (WO94/11011), les macrophages (FR93/10222). Ces cellules possedent généralement la capacite de produire un produit d'intérêt thérapeutique et peuvent être implantées in vivo. Parmi les cellules sanguines, on peut citer les ervthrocytes, les granulocytes neutrophiles, basophiles et éosinophiles, les Iymphocytes B et T, notamment les Iymphocytes CD4, les Iymphocytes 15 cytotoxiques (CD8 CTL), les Iymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) et les L~K, les monocytes et les macrophages, les cellules dendritiques, les mégacaryocytes et les plaquettes.

La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Légende des Figures Fi~ure 1: Représentation du plasmide pTK-Luc; promoteur minimal Thymidine kinase; Répétition parfaite, sens de l'intron TH; Répétition parfaite, antisens; Répétition imparfaite, sens de l'intron TH; Répétition imparfaite, antisens.

Fi~ure ?: Activité luciférase dans les cellules Hela transformées Fi~ure 3: Activité luciférase dans les cellules PC12 transformées Techniques Qénérales de Biologie Moléculaire CA 022~2~29 1998- lO- l9 WO 97/40172 rCT/P'R97/00636 Les méthodes cl~ssiques de biologie mol~culaires telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par les enzymes de restriction, I'électrophorèse sur gel,la transformation dans E-~Qli, la précipitation des acides nl~cl~i~ues etc, 5 sont décrites dans la littérature (Maniatis ~ al.,1989).

Les enzymes ont été fournies par New-England Biolabs (Beverly, MA~.

Pour les ligatures les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose de 0,8 à 1,5 %, purifiés par GeneClean (Bl0101, LaJolla CA) et incubés de nuit à 14~C dans un tampon Tris-HCI pH 7.4 50 10 mM, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4.

L'amplification par PCR, (Polymerase Chain Reaction), a également été réalisée selon Maniatis ~ ~1., 1989, avec les spécifications suivantes:

-Concentration en MgCI2 portée à 8mM.

-Température de dénaturation 95~C, température d'hybridation 55~C, température d'allongement 72~C. Ce cycle a été répété 25 fois dans un P~9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwalk C0).

Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en B par un groupement cyanoéthyl, (Sinha 20 .a.,1984, Giles 198~), avec le synthétiseur automatique d'ADN Applied Biosystem modèle 394, (Applied Biosystem, Foster City CA), selon les recommandations du fabricant.

Le séquencage a été éffectué sur des matrices double-brin par la méthode de terminaison de chaînes en utilisant des amorces fluorescentes.
25 Nous avons utilisé le kit se séquencage Taq Dye Primer Kit de chez Applied CA 022~2~29 Isss-lo-ls WO97/40172 PCT~R97/00636 Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) selon les spécifications du fabricant.

Exe~les Fxeml~le 1: Intér~tion Avec des protéines nuclé~ires L'implication possible du microsatellite HUMTH01 dans la régulation de l'expression de gènes a été étudiée par des expériences de retard sur gel (test de mobilite electrophoretique, EMSA). Pour cela, des extraits nucléaires de cellules Hela ont été préparés, et incubés en présence d'oligonucleotides correspondants a des séquences du microsatellite HUMTH01.

Les extraits nucléaires de cellules Hela ont été préparés selon la méthode de Dignam (NAR 1 1 (1983) 1474), et les concentrations protéiques selon la technique de Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248). Le test de mobilité électrophorétique a été réalisé dans un volume tinal de 10 ,ul, en présence de 10 a 15 ~19 d'extrait nucléaire incubé 5 min en présence de 1 ~lg de poly (dl-dC)-(dl-dC), dans un tampon HEPES 4mM, pH 7,6, KCI 100 mM, Glycerol 12%. 25 fmol d'oligonucléotides double-brins marques au ~32P-ATP
au moyen de la T4 polynucleotide kinase (Amersham), ont ensuite été
incubés pendant 5 min avec les protéines, a température ambiante. Les oligonucleotides utilisés sont des sondes correspondant aux alleles Ei et Ep du microsatellite HUMTH01. Pour les expériences de compétition, les oligonucléotides non-marqués ont été ajoutés 5 min avant les sondes marquées. La séquence des oligonucléotides est la suivante:
Ei-sens : TCATTCATCA TTCATTCATT (SEQ ID N. 3) Ei-as : AATGAATGAA TGATGAATGA (SEQ ID N. 4) Ep-sens : TCATTCATTC ATTCATTCAT (SEQ ID N. 5) Ep-as : ATGAATGAAT GAATGAATGA (SEQ ID N. 6) CA 022~2~29 1998-10-19 WO 97/40172 PCT/FRg7/00636 ~ Les complexes ADN-protéine formés ont ensuite été résolus par ~lectrophorèse en gel non-denaturant, 6% d'acrylamide dans un tampon 0,5X TBE a 4C. Après séchage, les gels sont autoradiographes pendant la nuit a température ambiante.

Les résultats obtenus montrent que les deux oligonucléotides sont reconnus par des protéines de l'extrait nucléaire. Par ailleurs, la specificite de l'intéraction a été démontrée dans une expérience de compétition avec des oligonucléotides froids, démontrant une liaison dose-dépendante. Ces résultats démontrent donc clairement que des facteurs nucléaires interagissent avec le microsatellite HUMTH01.

Dans une seconde étape, une série d'expériences de compétition avec des oligonucléotides differents a été réalisée. Les oligonucléotides utilisés correspondent a la séquence TRE de liaison du facteur AP1 (TGACTCA). Les résultats obtenus montrent que cet oligonucléotide ne déplace pas la liaison des oligonucléotides Ei et Ep aux facteurs nucléaires.
Ceci indique que les ~acteurs liant le microsatellite HUMTH01 sont differents de Jun et Fos. Des expériences de compétition ont également été réalisées avec des oligonucléotides contenant d'autres séquences de liaison de protéines : CRE-TH; CRE; Pou; SP1; AP4 et E-TH. Aucune de ces séquences, en exces molaire de 100 fois, n'a permis de déplacer la liaison des extraits nucléaires des cellules Hela aux oligonucléotides du microsatellite, confirmant la spécificité de l'intéraction.

Exem~le 2: Construction de cassettes et vecteurs d'e~Dression.

2.1. Synthèse des régions enhanceur Différentes régions enhanceur ont été synthétisées sous forme d'oligonucléotides double-brins. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur CA 022~2~29 l998-lO-l9 WO97/40172 PCT~R97/00636 un synthétissur Beckman oligo 1000, selon les recommandations du fabricant. Les enhanceurs produits sont les suivants:

- T1 Oi-sens (SEO ID N. 7):

CCCTCATTCA TTCATTCATC ATTCATTCAT TCATTCATTC
ATTCACCGCG CGCG

Ce fragment d'ADN comprend l'allèle imparfait du microsatellite HUMTH01, dans l'orientation sens (orientation normale dans l'intron TH) - T10i-as (SEQ ID N. 8):

CGCGCGCGGT GAATGAATGA ATGAATGAAT GAATGATGAA
TGAATGAATG AGGG

Ce fragment d'ADN comprend l'allèle imparfait du microsatellite HUMTH01, dans l'orientation antisens (orientation inverse de l'intron TH) - T10p-sens (SEQ ID N. 9):

CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCATT
CATTCACCGC GCGC

Ce fragment d'ADN comprend l'allèle parfait du microsatellite HUMTH01 ((TCAT)~

- T10p-as (SEQ ID N. 10):

GCGCGCGGTG AATGAATGAA TGAATGAATG AATGAATGAA
TGAATGAATG AGGG

- T9-sens (SEQ ID N. 11):

CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCATC C

- T8-sens (SEQ ID N. 12):

CA 022~2~29 1998-10-19 WO 97/4~172 rCT/FR97100636 ~ CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATCC

- T7-sens (SEQ ID N. 13):

CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TCC

- T6-sens (SEQ ID N. 14):

CCCTCATTCA TTCATTCATT CATTCATCC

- T5-sens (SEQ ID N. 15):

CCCTCATTCA TTCATTCATT CATCC

2.2. Construction de vecteurs 2.2.1. Vecteur comprenant un promoteur TK

Un vecteur comprenant un gène hétérologue (luciferase) sous le controle d'un promoteur TK, ainsi qu'un enhanceur selon l'invention a été
construit. Pour cela le plasmide pTK-Luc (DeThe et al., Nature 343 (1990) 177) a été utilisé. Ce vecteur comprend un promoteur TK modifié (minimal), comprenant les nucléotides -109 a +52. Une construction similaire est réalisée avec un fragment plus petit (nucleotides -37 a +19). Différentes régions enhancer ont été introduites dans ce plasmide, en amont du promoteur TK. Plus particulièrement, les enhanceurs de 54 mer decrits dans l'exemple 2.1. ont été sous-clonés dans le plasmide pTK-Luc par ligation d'extrémités franches dans le site Sall. L'insertion et l'orientation des inserts 20 a été controlée par séquencage. La structure des cassettes d'expression du vecteur résultant est présentée sur la figure 1. Il est entendu que les régions enhanceur de l'invention peuvent être positionnées également en aval du promoteur et du gène d'intérêt.

2.2.2. Vecteur comprenant un autre promoteur CA 022~2S29 1998-10-19 Le vecteur décrit ci-~essus peut facilement être modifié pour remplacer le promoteur TK par tout autre promoteur transcriptionnel - souhaite, tel que le promoteur précoce du CMV ou tout promoteur minimal en dérivant tel qu'un promoteur constitué du ~ragment compris entre les 5 nucléotides -53 à ~75 ou -31 à +75 du CMV. Il peut egalement s'agir du promoteur du gène PGK murin ou humain, du promoteur de l'enolase spécifique neuronale, ou du promoteur promoteur générant la forme V1 de l'ARNm de la VAChT. Par ailleurs, différents vecteurs ou c~ssettes portant ces différents promoteurs ont été décrits dans la littérature. Il est ainsi 10 possible de construire des vecteurs ou cassettes de l'invention par insertiond'une séquence enhanceur dans ces constructions (Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187; Cervini et al., J.Biol.Chem. 270 (1995) 24654; etc) 2.2.3. Plasmide RSV-CAT

Le plasmide RSV-CAT a été utilisé dans les expériences pour 15 déterminer l'efficacité de transfection cellulaire. Ce plasmide a donc été co-transfecté avecles vecteurs de l'invention. Ce plasmide comprend le gène CAT sous le controle du LTR du virus RSV. Sa construction a été décrite dans Gorman et al (Science 221 (1983) 551).

Exem~le 3: Fffet sur l'ex~ression de gènes d~ns les cellules Hel ~

Cet exemple décrit une étude de l'activité des séquences de l'invention sur les niveaux d'expression de gènes dans des cellules d'un carcinome. Les cellules étudiées sont les cellules Hela. Il s'agit de cellules issues d'un carcinome epithelial humain. Ces cellules ont été déposées a l'ATCC sous la référence ATCC CCL-2.

Les cellules Hela ont été cultivées en milieu Dulbecco complémenté
par 7% de serum Supreme. 106 cellules ont été reprises dans 0,15 ml de milieu sans serum, et transféctées par éléctroporation en utilisant le "Gène CA 022~2~29 1998- lo- 19 Pulser~ de Biorad, avec 1 pmol de chaque vecteur a tester, 5 pmol d'ADN
véhicule (Bluescript ll), et 0,5 pmol de plasmide RSV-CAT permettant d'évaluer l'efficacite de transfection. Les cellules ont été récoltées 24 et 48 heures apres la trans~ection, et testées en triple pour l'activité luci~érase.
5 Pour cela, le luminomètre LUMAT LB9501 (Berthold) a été utilisé, avec un volume réactionnel de 150 1ll (luciférine 0,08 mM; ATP 0,1 mM; Tris-Phosphate 25 mM pH 7,8; MgCI2 8 mM; dithiothreitol 2mM; EDTA 1mM;
Triton 1%; Glyceral 15%). L'activité luciférase de chaque vecteur a ensuite été normalisée a l'activité CAT résultant du vecteir RSV-CAT co-transfecté.
10 L'activité CAT a été mesurée par comptage en scintillation liquide. L'activité
luciférase normalisée est exprimée en RLU (Relative Light Units). Les résultats donnés sont les moyennes de trois expériences.

Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2. Ils montrent que les séquences T10i et T10p induisent toutes les deux une forte augmentation 15 de l'expression du gène. Ainsi, après 24 heures, la séquence T10i induit une augmentation de l'activité luciférase d'un facteur 90 et la séquence T1 Op d'un facteur 160. L'augmentation observée est d'un facteur 250 environ pour les deux séquences, lorsque celles-ci sont disposées dans l'orientation inverse.
Apres 48 heures, I'augmentation des niveaux d'expression observée est 20 d'environ 300 a 350 fois, pour les deux séquences, dans les 2 orientations.

Fxemole 4: Fffet sur l'ex~ression de ~ènes dans les cellules PC1 ?

Cet exemple décrit une etude de l'activité des séquences de l'invention sur les niveaux d'expression de gènes dans des cellules d'un pheochromocytome de rat. Les cellules étudiées sont les cellules PC12, 25 déposées a l'ATCC sous la référence ATCC CRL-1721.

Les cellules PC12 ont été cultivées en milieu RPMI complémenté par 10% de sérum de cheval et 5% de sérum de veau ~etal. Le protocole de CA 02252s29 1998-lo-lg W O 97/40172 PCT~R97/00636 transfection et de mesure de l'activité est identique a celui utilisé dans l'exemple 3 pour les cellules Hela.

Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3. Ils montrent que les séquences TlOi et T10p induisent, quelle que soit leur orie"L~Iion, une 5 augmentation de l'expression du gène d'un facteur 25 après 24 heures et d'un facteur 50 après 48 heures.

CA 022~2~29 l998-l0-l9 W O 97l40172 PCTAFR97/00636 LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERA'LES:
~i) DEPOSANT:
(A) NOM: Rhone Poulenc Rorer SA
(B) RUE: 20, avenue Raymond Aron (C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 920165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SYSTEME D'EXPRESSION DERIVE DU GENE
DE LA TYROSINE HYDROXYLASE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS~MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Verslon #1.30 (OEB) 25 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 636 palres de bases (B) TYPE: nucléotide (c) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: satellite 40 (B) EMPLACEMENT:300.. 338 (D) AUTRES INFORMATIONS:/rpt_type= "other"
/standard_name= "HUMTH01"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

CA 022~2~29 1998-10-19 W O97140172 PCT~R97/00636 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

50 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ( c ) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

CA 022~2~29 l998-l0-l9 W O 97/40172 PCTA~R97/00636 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 54 paires de bases ~B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 54 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéalre (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 54 palres de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

CA 022~2~29 1998-10-19 W O 97/40172 PCTn~R97/00636 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 54 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 41 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: llnéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEO ID NO: 14:

, W O97/40172 PCTrFR97/00636 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Fragment isolé d'ADN caracterisé en ce qu'il possède une activité
d'enhanceur transcriptionnel et en ce qu'il consiste essentiellement en une portion du premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase.

2. Fragment selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un allèle du microsatellite HUMTH01.

3. Fragment isolé d'ADN caractérisé en ce qu'il possède une activité
d'enhanceur transcriptionnel et en ce qu'il possède la séquence (TCAT)n-(CAT)o-(TCAT)p, dans laquelle n'est compris entre 1 et 50; o est compris entre 0 et 20 et p est compris entre 0 et 50.

4. Fragment selon la revendication 3 caracterise en ce que n est compris entre 2 et 20 inclus, et o et p valent 0.

5. Fragment selon la revendication 3 caractérisé en ce que n'est compris entre 1 et 10, o est compris entre 1 et 5 et p est compris entre 1 et 10.

6. Fragment selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il possède la séquence SEQ ID N.1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 ou 15.

7. Cassette d'expression comprenant - un promoteur transcriptionnel - une séquence codante - un enhanceur transcriptionnel tel que défini dans les revendications 1 a 6.

8. Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que le promoteur transcriptionnel est un promoteur fonctionnel dans les cellules mammifères.

9. Cassette d'expression selon la revendication 8 caractérisée en ce que le promoteur transcriptionnel est choisi parmi les promoteurs viraux, ubiquitaires et spécifiques de tissu.

10. Cassette d'expression selon la revendication 8 caractérisée en ce que le promoteur transcriptionnel comprend essentiellement une région TATA ou INR.

11. Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'enhanceur transcriptionnel est en orientation sens.

12 Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'enhanceur transcriptionnel est en orientation antisens.

13. Vecteur d'expression comprenant une cassette selon la revendication 7.

14. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.

15. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.

16. Cellule recombinante dans laquelle a été introduite un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 a 6.

17. Cellule recombinante dans laquelle a été introduite une cassette d'expression selon la revendication 7.

18. Cellule recombinante dans laquelle a été introduite un vecteur selon la revendication 13.

19. Utilisation de séquences dérivées du microsatellite HUMTH01 comme enhanceur transcriptionnel.

20. Procède de production de protèines comprenant l'introduction dans une cellule d'une cassette selon la revendication 7 ou d'un vecteur selon la revendication 13.