KR20000010608A - 티로신 하이드록실라제 유전자로부터 유도된 발현 시스템 - Google Patents

티로신 하이드록실라제 유전자로부터 유도된 발현 시스템 Download PDF

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자끄 사비나
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Abstract

본 발명은 신규한 유전자 발현 시스템을 기재한다. 본 시스템은 특히 전사 증진 성질을 지닌 티로신 하이드록실라제 유전자의 제 1 인트론의 유도된 서열의 사용을 토대로 한다. 본 시스템은 시험관내, 생체외 또는 생체내, 특히 유전자 치료 적용시의 단백질 생성에 특히 유용하다.

Description

티로신 하이드록실라제 유전자로부터 유도된 발현 시스템
유전자 및 세포 요법은 결손 또는 이상(돌연변이, 이상 발현 등)을 교정하거나 유전 정보를 병에 걸린 세포 또는 기관에 도입함으로써 해당 치료 단백질의 발현을 제공하는 데에 있다. 이러한 유전 정보는 생체외에서 기관으로부터 추출된 세포로 도입된 다음 변형된 세포가 체내로 재도입될 수 있거나(세포 요법), 직접 생체내에서 적합한 조직으로 도입될 수 있다(유전자 요법). 유전자 전달을 실행하기 위한 상이한 기술이 존재하고, 여기에는 DNA와 DEAE-덱스트란의 복합체[참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA와 핵 단백질의 복합체[참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375] 및 DNA와 지질의 복합체[참조문헌: Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413]와 같은 천연 또는 합성 화학 또는 생화학 벡터, 리포좀[참조문헌: Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431], 양이온 지질 등의 사용을 수반하는 다양한 형질감염 기술이 포함된다. 다른 기술은 유전자 전달을 위한 벡터로서 바이러스의 사용을 기초로 한다. 이와 관련하여, 상이한 바이러스, 특히 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스가 특정 세포 집단을 감염시키는 능력에 대해 시험되었다. 그러나, 이들 유전자 및 세포 요법의 개발에 있어 어려움 중의 하나는 치료 효능에 있다. 특히, 치료 효과를 개선하기 위해서 해당 유전자의 강력한 발현을 수득해 낼 수 있는 것이 중요하다. 동일 유형의 문제점이 재조합 단백질의 제조방법의 경우에 발생한다.
상이한 유형의 프로모터가 문헌에 기재되어 있고 해당 유전자의 발현 조절에 사용된다. 그러나, 수득된 발현 수준은 종종 시험관내 재조합 단백질의 공업적 양을 수득하는 데에, 또는 생체내 실질적이고/이거나 지속적인 치료 효과를 생성하는 데에는 불충분하다. 본 발명은 유전자 발현을 위한 신규한, 특히 효과적인 시스템을 기재한다. 본 발명은 특히 프로모터의 강도 및 이에 따른 유전자 발현의 수준이 증가될 수 있게 하는 전사 인핸서 활성이 부여된 영역의 동정 성과이다.
본 발명은 좀더 상세하게는 전사 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있는 티로신 하이드록실라제의 제 1 인트론의 영역의 동정 성과이다. 이들 영역은 좀더 정확하게는 이 유전자의 제 1 인트론에 존재하는 마이크로새틀라이트 HUMTH01에 위치한다.
마이크로새틀라이트는 반복 모티프의 수 및/또는 이들 모티프의 서열에 있어서의 변이와 연관된 큰 다형성을 나타내는 DNA 반복 서열의 풍부한 계통을 나타낸다. 이러한 이유로, 이들 마이크로새틀라이트는 유전자 지도의 작제를 위한, 및 병리상태에 수반되는 로커스의 동정을 위한 유전자 마커로서 사용되어 왔다. 마이크로새틀라이트의 상이한 대립유전자의 크기는 반복 모티프의 수에 있어서의 변이에 의존한다. 따라서, 반복 이량체의 서열화 실험은 변이가 반복 모티프의 수 및 이들의 서열에서 나타날 수 있게 했다. 이들 변이는 특히 "완전" 반복, 즉, 염기 서열에서의 중단없는 반복, 또는 모티프 서열에서의 하나 이상의 중단을 함유하는 "불완전" 반복에 상응할 수 있고, 이들 중단은 결실 또는 삽입을 수반한다. 동일한 방법으로, 길이 및/또는 서열에 있어서의 변이가 또한 삼량체 또는 사량체 반복 모티프에 있어서 관찰되었다. 따라서, 이러한 유형의 변이가 마이크로새틀라이트 HUMHPRTB[참조문헌: Edward et al., Genomics 12 (1992) 241]와 HUMTH01[참조문헌: Puers et al., Am. J. Hum. Genet. 53 (1993) 953]에서 관찰되었다.
본 발명은 신규한 유전자 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 해당 유전자의 발현을 증가시키키거나 재조합 단백질을 생산하기 위한, 유전자 또는 세포 요법에 있어 이러한 시스템의 용도에 관한 것이다.
도 1: 플라스미드 pTK-Luc; 티미딘 키나제 최소 프로모터; 완전 반복부, TH 인트론의 센스 배향; 완전 반복부, 안티센스; 불완전 반복부, TH 인트론의 센스 배향; 불완전 반복부, 안티센스의 다이아그램.
도 2: 형질전환된 Hela 세포내 루시페라제 활성.
도 3: 형질전환된 PC12 세포내 루시페라제 활성.
분자생물학의 일반 기술
분자생물학에 전통적으로 사용되는 방법, 예를 들면, 칼슘 클로라이드/에티듐 브로마이드 구배에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 제한 효소로의 분해, 겔 전기영동, 이. 콜라이에서의 형질전환, 핵산의 침전 등이 문헌(참조: Maniatis et al., 1989)에 기재되어 있다.
효소는 New England Biolabs(미국 매사추세츠 비버리)에 의해서 제공된다.
연결을 위해서, DNA 단편을 0.8 내지 1.5% 아가로스 겔에서 크기별로 분리하고 GeneClean(미국 캘리포니아 라졸라의 BIO101)으로 정제하고 50 mM 트리스-HCl 완충제 pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP 중 14℃에서 파지 T4 DNA 리가제의 존재하에 밤새 배양한다.
PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의한 증폭이 또한 Maniatis 등(1989)에 따라서 하기의 명세로 수행된다:
- 8 mM로 된 MgCl2농도;
- 변성 온도 95℃, 하이브리드화 온도 55℃, 신장 온도 72℃.
이 사이클을 PE9600 열순환기 (미국 콜로라도 노워크의 Perkin Elmer)에서 25회 반복한다.
올리고뉴클레오티드를 β 위치에서 시아노에틸 그룹에 의해서 보호된 최종 유도체와 함께 포스포라미다이트 화학을 사용하여, 제조자의 권장에 따라서 Applied Biosystem model 394 자동 DNA 합성기(미국 캘리포니아 포스터 시티의 Applied Biosystem)를 이용하여 합성한다.
서열화를 형광 프라이머를 사용하여 쇄 종결 방법에 의해서 이본쇄 주형에서 수행한다. 제조자의 사양서에 따라서 Applied Biosystem(미국 캘리포니아 포스터 시티의 Applied Biosystem)으로부터의 Tag Dye Primer Kit인 서열화 키트를 사용한다.
마이크로새틀라이트 HUMTH01은 카테콜라민 생합성 경로의 제한 효소인 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 유전자의 제 1 인트론에 위치한다. 이러한 인트론의 서열 부분이 서열번호 1(871번 뉴클레오티드에서부터)로서 예시된다. 이러한 서열은 1170번 위치에 위치하는 마이크로새틀라이트 HUMTH01(대립유전자 (TCAT)9, 굵은 글자로 표시)을 포함한다 (GenBank, accession # D00269). 마이크로새틀라이트 HUMTH01은 사량체 TCAT 반복 모티프로 이루어져 있다. 이것은 특정 다형성을 나타내고, 상이한 대립유전자는 가변수의 반복 모티프를 지니는 것으로 기재되었다. 가장 자주 발생되는 대립유전자(대립유전자 Ei)는 10 개의 반복 모티프 및 서열 CAT를 함유하는 제 5 반복 모티프에 한 염기쌍의 결실을 함유한다 (서열번호 2). 다른 대립유전자는 5 내지 10 개의 TCAT 모티프를 운반하는 것으로 동정되었다.
본 출원인은 놀랍게도 이들 서열이 상이한 핵 추출물에 존재하는 단백질에 의해서 특이적으로 인식됨을 알아내었다 (실시예 1). 또한, 본 출원인은 이들 서열이 유전자 전사를 상이한 세포 시스템에서 증가될 수 있게 함을 입중하였다 (실시예 3 및 4). 따라서, PC 12 세포에서, 25 내지 50 배까지 전사 활성에 있어서의 증가가 관찰되었다. Hela 세포에서, 100 내지 350 배까지 예외적인 증가가 관찰되었다. 따라서, 이러한 서열은 매우 강력한 전사 활성자 성질을 나타낸다. 이러한 성질은 특히 예상치 못한 것이고, 기타 전사 인핸서로 관찰된 효과보다 훨씬 더 우수하다. 따라서, 3 내지 6 배까지 전사 활성에 있어서의 증가가 HRAS1-VNTR 서열로 관찰되고 [참조문헌: Green et al., 1993, ref], 2 내지 5 배까지는 INS-VNTR 서열로 관찰된다 [참조문헌: Catignani et al., 1995]. 본 발명의 서열로 수득된 증가는 300 배를 초과할 수 있고 기존 시스템 이상으로 막대한 장점을 구성한다. 또한, 수득된 결과는 본 발명의 서열이 다른 세포 유형 및 다른 기관의 세포 (PC12 래트 세포, HeLa 인간 세포)에 기능성임을 보여주며, 이는 매우 광범위한 적용의 잠재성을 증명한다.
따라서, 본 발명의 제 1 주제는 본질적으로 티로신 하이드록실라제 유전자의 제 1 인트론의 부분으로 이루어진, 전사 인핸서 활성을 갖는 DNA 단편에 관한 것이다. 유리하게는, 본 발명의 단편은 200 bp 이하를 포함하고 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 대립유전자를 포함한다. 좀더 바람직하게는, 단편은 100 bp 이하를 포함한다. 단편이 본질적으로 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 대립유전자로 이루어진 것이 특히 유리하다.
상술된 바와 같이, 마이크로새틀라이트 HUMTH01은 인간 TH 유전자(GenBank 수납번호 #D00269)의 약 1170번 위치에 위치하고 주로 사량체 TCAT 반복 모티프로 이루어져 있다. 이 마이크로새틀라이트의 상이한 대립유전자가 다양한 수(5 내지 10)의 반복 모티프 및 서열 변이를 지니고 약간의 대립유전자가 염기 돌연변이를 지니는 것으로 기재되었다. 따라서, 가장 자주 발생하는 대립유전자(대립유전자 Ei)는 10개의 모티프 및 서열 CAT를 함유하는 제 5 반복 모티프내 한 염기쌍 결실을 함유한다 (서열번호 2). 5 내지 10 개의 TCAT 모티프를 운반하는 다른 대립유전자가 동정되었다 (서열번호 9 내지 15). 또한, 3개의 TCAT 모티프를 운반하는 DNA 단편이 본 발명에 따라서 합성되고 전사 인핸서로서 시험될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 주제는 또한 전사 인해서 활성을 지니고, n이 1 내지 50 이고 o가 0 내지 20이며 p가 0 내지 50인 서열 (TCAT)n- (CAT)o-(TCAT)p를 보유함을 특징으로 하는 분리된 DNA 단편이다.
본 발명의 특정 변이체에 따라서, 전사 인핸서는 n이 2 내지 20 이고 o와 p가 0인 서열 (TCAT)n-(CAT)o-(TCAT)p를 보유한다.
본 발명의 특정 변이체에 따라서, 전사 인핸서는 n이 1 내지 10 이고 o가 1 내지 5이며 p가 1 내지 10인 서열 (TCAT)n- (CAT)o-(TCAT)p를 보유한다.
본 발명에 따른 전사 인핸서의 특정 예로서, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15의 단편이 언급될 수 있다.
본 발명의 다른 주제는 암호화 서열, 이의 발현을 허용하는 프로모터 및 상술된 바와 같은 전사 인핸서를 포함하는 발현 카세트에 있다. 유리하게는, 카세트는 또한 전사 종결 시그널을 포함한다.
프로모터는 유리하게는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포에서 작용성인 프로모터 중에서 선택된다. 해당 프로모터는 과증식성 세포(암세포, 재협착증 등)내에서 핵산 발현을 허용하는 것일 수 있다. 이와 관련하여, p53 유전자 프로모터와 같은 상이한 프로모터가 사용될 수 있다. 추가의 선택은 (기타 단백질 또는 합성 서열의 발현을 책임지는) 다른 기원의 영역을 포함한다. 따라서, 유전자 전사를 특이적으로 또는 이와 달리, 유도적으로 또는 이와 달리, 강하게 또는 약하게 자극하거나 억제하는 프로모터 또는 유도된 서열을 사용함이 가능하다. 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열이 특별히 언급될 수 있다. 가능한 프로모터 서열은 예를 들면, 표적 세포의 게놈 기원의 것이다. 진핵세포 프로모터 중에서, 특히 편재성 프로모터(HPRT, PGK, a-액틴, 튜불린 등 유전자의 프로모터), 중간 필라멘트의 프로모터(GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트, 케라틴 등 유전자의 프로모터), 치료 유전자의 프로모터(예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII, ApoAI, ApoAII, 알부민, 티미딘 키나제 등 유전자의 프로모터), 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 장 지방산 결합 단백질 또는 평활근 a-액틴 유전자의 프로모터), 신경세포 특이성 에놀라제 프로모터(참조: Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187), VAChT의 mRNA의 V1형을 생성하는 프로모터(아세틸콜린 수송체- 참조: Cervini et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 24654) 또는 이와 달리 자극에 반응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)를 사용함이 가능하다. 이와 유사하게, 프로모터 서열은 바이러스의 게놈 기원의 것, 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터 또는 이와 달리 RSV 또는 MMTV LTR 프로모터, 허프스바이러스 TK 유전자 프로모터 등일 수 있다. 또한, 이러한 프로모터 영역은 서열을 첨가하거나 결실시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 결과로, 프로모터 사용은 "최소" 프로모터, 즉, 활성이 본질적으로 본 발명의 인핸서와 같은 트랜스액티베이터의 존재에 의존하는 축소된 프로모터일 수 있다. 결과적으로, 인핸서의 부재시, 프로모터의 활성은 감소되고 유전자는 발현되지 않거나 적은 정도로만 발현된다. 이와는 대조적으로, 인핸서 존재시, 최소 프로모터의 활성은 강하고 해당 유전자의 발현은 상당한 정도이다. 최소 프로모터는 일반적으로 TATA 또는 INT 상자로 이루어진다. 이러한 요소는 사실상 트랜스액티베이터의 존재하에서 유전자 발현에 필요한 최소 요소이다. 이것은 유리하게는 200 bp 이하를 포함하고, TATA 또는 INR 박스를 포함한다. 최소 프로모터는 유전자 변형에 의해서 임의 프로모터로부터 제조될 수 있다. 가능한 프로모터의 특정 예로서, 티미딘 키나제 유전자 프로모터가 언급될 수 있다. 좀더 정확하게 말해서 뉴클레오티드 -109 내지 +52 또는 -37 내지 +19로 이루어진 허프스 심플렉스 유형 I 티미딘 키나제 (TK) 유전자 프로모터로부터 유도된 최소 프로모터로 유리한 결과가 수득되었다. 최소 프로모터는 또한 인간 HMV로부터 유도될 수 있다. 특히, 이것은 CMV의 뉴클레오티드 -53에서 +75 또는 -31에서 +75(ATG 코돈에 상응하는 +1)에 존재하는 단편으로 이루어질 수 있다. 그러나, 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, β-갈락토시다제 또는 이와 달리 루시페라제를 암호화하는 유전자의 프로모터와 같은 통상적인 프로모터가 사용될 수 있다.
또한, 전사 프로모터는 포유동물 세포에서 작용성인 프로모터이고, 특히 바이러스성 프로모터(TK, CMV), 편재성 프로모터(PGK) 또는 특이적 프로모터(신경세포 특이성 에놀라제 프로모터), VAchT mRNA의 V1 형을 생성하는 프로모터이다.
다른 바람직한 양태에서, 전사 프로모터는 본질적으로 TATA 또는 INR 박스를 포함하는 200 bp 이하의 영역으로 이루어진 최소 프로모터이다.
암호화 서열은 유리하게는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 서열은 특히 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 리보핵산 등일 수 있는 치료 산물을 암호화하는 것일 수 있다. 좀더 상세하게는, 암호화 서열은 단백질성 산물, 예를 들면, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 즉, 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92 03120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 즉, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포리포프로테인, 즉, ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (FR 91 11947)을 암호화하는 DNA 서열(cDNA, gDNA, 합성, 인간, 동물, 식물 등 DNA), 종양-억제 유전자, 즉, p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등 (FR 93 04745), 응고에 수반되는 인자, 즉 인자 VII, VIII, IX 등, 또는 이와 달리 천연 또는 인공 이뮤노글로불린의 전부 또는 일부(Fab, ScFv 등)를 암호화하는 유전자, 리간드 RNA (WO91/19813) 등이다.
암호화 서열은 또한 표적 세포에서의 발현이 유전자 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있게 하는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 서열은 특허 EP 140,308에 기재된 기술에 따라, 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고 따라서 단백질로의 해독을 차단할 수 있다.
본 발명은 또한 독성 인자를 암호화하는 서열의 발현에도 적합하다. 독성 인자는 특히 세포 독(디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신 A 등), 외부 제제에 대한 민감성을 유도하는 산물(자살 유전자:티미딘 키나제, 시토신 디아미나제 등), 또는 이와 달리 세포 사멸을 유도할 수 있는 사멸 유전자(Grb3-3 (PCT/FR94/ 00542), 안티-ras ScFv (WO94/29446) 등일 수 있다. 이러한 시스템은 또한 예를 들면, 시토카인, 인터페론, TNF 또는 TGF의 발현에 특히 유리하다.
발현 카세트는 유리하게는 하기의 요소로 이루어진다:
- 인핸서 영역으로서, n이 1 내지 50이고, o가 0 내지 20이며, p가 0 내지 50인 서열 (TCAT)n-(CAT)o-(TCAT)p,
- 프로모터로서, HSV-1 바이러스 티미딘 키나제 유전자 프로모터 또는 이로부터 유도된 최소 프로모터, CMV 초기 프로모터 또는 이로부터 유도된 최소 프로모터, PGK 프로모터, 특이적 에놀라제 프로모터 또는 VAChT 유전자 프로모터,
- 해당 암호화 서열.
좀더 바람직하게는, 프로모터는 HSV-1 티미딘 키나제 유전자 프로모터의 영역 -109 내지 +52 또는 -37 내지 +19로 이루어진다.
유리하게는, 인핸서 영역은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15의 단편 중에서 선택된다. 또한, 본 발명 인핸서 영역의 특히 주목할만한 성질은 이들이 센스 배향(TH 유전자에서 마이크로새틀라이트의 정상적 배향)과 안티센스 배향(TH 유전자에서 마이크로새틀라이트 배향에 대해 역배향) 모두에서 활성인 것으로 보인다는 점이다. 결과적으로, 본 발명의 발현 카세트에 있어서 인핸서 영역은 두 배향(5' → 3' 또는 3' → 5')으로 배치될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 또한 상기에 정의된 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 있다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 종의 것일 수 있다.
바이러스 벡터 중에서, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허프스바이러스 또는 이와 달리 아데노-수반 바이러스가 좀더 우선적으로 언급될 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스는 결손형이고, 즉, 표적 세포에서 자가 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서 사용되는 결손 바이러스의 게놈은 따라서 적어도 감염 세포내에서의 바이러스 복제에 필요한 서열이 부족하다. 이러한 영역은 특히 본 발명의 서열에 의해서 제거되거나(완전히 또는 부분적으로), 비작용성으로 되거나 기타 서열, 특히 본 발명의 서열로 대치될 수 있다. 바람직하게는, 결손 바이러스는 그럼에도 불구하고 바이러스 입자의 캡슐화에 필요한 게놈의 서열을 보유한다.
아데노바이러스와 관련하여, 좀더 상세하게는 다소 다양한 상이한 혈청형, 구조 및 성질이 특징규명 되었다. 이들 혈청형 중에서, 본 발명의 맥락에서, 사람 아데노바이러스 2형 또는 5형 (Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용하는 것이 바람직하다 (WO94/26914 참조). 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에서, 개, 소, 쥐 (참조: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 이와 달리 원숭이(예를 들면, SAV)의 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV-2 아데노바이러스 [예를 들면, Manhattan 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]이다. 본 발명의 맥락에서 인간 또는 개 또는 혼합 기원 아데노바이러스를 사용함이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 게놈은 적어도 ITR과 아데노바이러스의 캡슐화 영역, 키메릭 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및 상기에 정의된 바와 같은 발현 카세트를 포함한다. 좀더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에서, 적어도 E1 영역은 비-작용성이다. 해당 바이러스 유전자는 당업자에 공지된 기술에 의해서, 특히 전체 제거, 치환(예를 들면, 본 발명의 서열에 의해서), 해당 유전자(들)의 하나 이상의 염기의 부분 결실 또는 첨가에 의해서 비-작용성으로 될 수 있다. 이러한 변형이 시험관내(분리된 DNA상에서) 또는 생체내에서 예를 들면, 유전공학 기술에 의해서 또는 이와 달리 돌연변이제에 의한 처리에 의해서 수득될 수 있다. 기타 영역, 특히 E3(WO95/02697), E2(WO94 /28938), E4(WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697), 및 L5(WO95/02697) 영역이 또한 변형될 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에서의 결실을 포함한다. 다른 바람직한 양태에 따라, 이것은 E4 영역 및 본 발명의 서열이 삽입되는 E1 영역에서의 결실을 포함한다 (FR94 13355 참조).
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당해분야 전문가에게 공지된 기술에 의해서 제조될 수 있다 (참조: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185,573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). 특히, 이들은 아데노바이러스와 특히 본 발명의 발현 카세트와 아데노바이러스에 상동인 서열을 운반하는 플라스미드 간의 상동 재조합에 의해서 제조될 수 있다. 상동 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드의 적합한 세포주로의 공형질감염 후에 발생한다. 아데노바이러스 게놈은 또한 시험관내, 세균내(FR95 01632), 또는 효모내(WO95/03400)에서 제조될 수 있다. 아데노바이러스의 생성에 사용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소에 의해서 형질전환될 수 있고, (ii) 결손 아데노바이러스의 게놈 부분을 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해서 통합된 형태로 보완할 수 있는 서열을 함유한다. 세포주의 예로서, 특히, Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측부(12%)를 게놈에 통합된 채로 함유하는 인간 배 신장 세포주 293 (참조: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), 또는 특히 WO94/26914 및 WO95/02697에 기재된 바와 같은 E1 및 E4 기능을 보완할 수 있는 세포주를 언급할 수 있다.
그 후, 증식된 아데노바이러스는 실시예에 설명된 바와 같이 분자생물학의 표준 기술에 따라서 회수되고 정제된다.
아데노-수반 바이러스(AAV)는 그 자신만으로는, 이들이 감염시키는 세포의 게놈에서 안정하고 부위-특이적인 방식으로 통합하는 비교적 소형의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 생장, 형태 또는 분화에 영향을 유도하지 않으면서 광범위한 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 사람의 병리에 연루되는 것으로 보이지 않는다. AAV 게놈은 클로닝되고 서열화되고 특징화되었다. 이것은 약 4,700 염기를 포함하고 각 말단에 바이러스를 위한 복제 기원으로 작용하는 약 145 염기의 역 반복 영역(ITR)을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡슐화 기능을 운반하는 2개의 필수 영역: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반된 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측부; 및 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측부로 나뉜다.
시험관내 및 생체내 유전자 전달을 위한 AAV로부터 유도된 벡터의 사용이 문헌(특히 WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528 참조)에 기재되어 있다. 이들 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자에 의해서 치환되는 AAV로부터 유도된 상이한 작제물 및 해당 유전자를 시험관에서(배양액의 세포로) 또는 생체내에서(체내로 직접) 전달하기 위한 용도를 기재한다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 AAV의 역반복 영역 (ITR)에 의해서 플랭킹된 본 발명의 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 및 AAV의 캡슐화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드의 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)로 감염된 세포주로의 공형질감염에 의해 제조할 수 있다. 이어서 생성된 재조합 AAV를 표준 기술에 의해서 정제한다.
허프스 바이러스와 레트로바이러스에 관하여, 재조합 벡터의 작제가 문헌[참조: Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등]에 풍부히 기재되어 있다.
특히, 레트로바이러스는 분열 세포를 선택적으로 감염시키는 통합성 바이러스이다. 따라서, 이들은 암 적용을 위한 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스 게놈은 본질적으로 2 개의 LTR, 캡슐화 서열 및 3 개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전체적으로 또는 부분적으로 결실되고, 해당 이종 핵산 서열에 의해서 치환된다. 이들 벡터는 다른 유형의 레트로바이러스, 예를 들면, 특히 MoMuLV(Moloney 쥐 백혈병 바이러스; 또한 MoMLV로도 명명됨), MSV(Moloney 쥐 육종 바이러스), HaSV(Harvey 육종 바이러스), SNV(비장 괴사 바이러스), RSV(Rous 육종 바이러스) 또는 이와 달리 Friend virus로부터 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, 특히 LTR, 캡슐화 서열 및 본 발명의 서열(발현 카세트)을 함유하는 플라스미드를 일반적으로 작제한 다음, 플라스미드에 불충분한 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡슐화 세포주를 형질감염시키기 위해서 사용한다. 일반적으로, 캡슐화 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 캡슐화 세포주, 특히 세포주 PA317(US 4,861,719), 세포주 PsiCRIP (WO90/02806) 및 세포주 GP+envAm -12(WO89/07150)가 선행 기술에 기재되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성 및 gag 유전자의 부분을 함유하는 연장된 캡슐화 서열을 제거하기 위해서 LTR에서의 변형을 함유할 수 있다 (참조: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). 이어서 생성된 재조합 레트로바이러스를 표준 기술에 의해서 정제한다.
발현 카세트가 또한 플라스미드 벡터로 삽입될 수 있다 (FR95 02117).
본 발명의 유전자 발현 시스템은 유전자 또는 세포 요법용으로 또는 재조합 단백질 생성용으로 특히 적합하다. 유전자 또는 세포 요법 적용을 위해서, 카세트 또는 플라스미드 벡터는 네이키드 DNA의 형태로 사용될 수 있거나 DNA 복합체는 불활성 전달 벡터를 지닌다. 핵산의 진핵 세포로의 전달 및 이의 발현을 촉진할 수 있는 다른 유형의 불활성 벡터가 사실상 기재되어 왔다. 화학적 또는 생화학적 벡터가 특히 편의 및 안전성 때문에, 또한 형질감염될 DNA의 크기에 관한 이론적 한계의 부재로 인하여 바이러스에 대한 대체물을 나타낸다.
이러한 합성 벡터에는 형질감염될 핵산을 압축하는 것과 이것의 세포에의 결합 및 원형질막과 경우에 따라 두 핵막 모두를 통한 통과를 촉진하는 것의 2가지 주요 기능이 있다. 핵산의 다음이온성을 보상하기 위해서, 비-바이러스 벡터는 모두 다양이온 전하를 지닌다.
개발된 합성 벡터 중에서, 폴리리신, (LKLK)n, (LKKL)n, 폴리에틸렌이민(WO96/02655) 및 DEAE-덱트스란 유형의 양이온성 중합체, 또는 이와 달리 리포펙턴트 또는 양이온성 지질이 가장 유리하다. 이들은 DNA을 응축하는 성질과 이의 세포막과의 결합을 촉진하는 성질을 지닌다. 뒤에 언급한 화합물 중에서, 리포폴리아민(리포펙타민, 트랜스펙탐, WO95/18863)과 다양한 양이온성 또는 중성 지질(DOTMA, DOGS, DOPE 등)이 언급될 수 있다. 좀더 최근에는, 양이온성 중합체와 이식하기를 원하는 세포 유형의 표면에 존재하는 막 수용체에 대한 리간드 사이의 화학적 커플링의 결과로서 복합체의 막으로의 결합을 지시하면서 양이온성 중합체에 의해서 DNA를 응축시키는 원리를 잘 이용하는, 수용체-매개된 표적화 형질감염의 개념이 발전되었다. 따라서, 트랜스페린 또는 인슐린 수용체의 표적화 또는 간세포의 아시알로글리코프로테인 수용체의 표적화가 기재되었다.
본 발명의 주제는 또한 상기에 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 약학 조성물이다. 이들 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 등의 투여를 목적으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 주사 제형을 위해 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 멸균, 등장성 생리식염수 용액(일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염들의 혼합물), 또는 멸균수 또는 생리식염수 첨가시 경우에 따라 주사액이 형성될 수 있는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다. 레트로바이러스의 경우에, 직접 캡슐화 세포를 또는 생체내 재이식을 목적으로 경우에 따라 신-기관의 형태로 생체외 감염된 세포를 사용함이 유리할 수 있다 (WO94/24298).
주사용으로 사용된 벡터의 용량은 상이한 파라미터에 따라서, 특히 사용되는 투여 양식, 해당 병리 또는 원하는 치료 기간에 따라서 조정될 수 있다. 일반적으로 말해서, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 104내지 1014pfu/㎖ 용량의 형태로 제형되고 투여된다. AAV 및 아데노바이러스에 있어서 106내지 1010pfu/㎖ 용량이 또한 사용될 수 있다. 용어 pfu(플라크 형성 단위)는 비리온 현탁액의 감염력에 상응하고, 적합한 세포 배양액을 감염시키고 일반적으로 48시간 후에 감염 세포의 플라크 수를 측정함으로써 측정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정 기술은 문헌에 잘 기재되어 있다.
본 발명의 다른 주제는 상기에 정의된 바와 같은 DNA 단편, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 세포로 이루어진다. 이러한 세포는 DNA가 해당 세포로 도입되도록 할 수 있는 당해분야 전문가들에게 공지된 기술에 의해서 수득된다. 이 기술은 특히 형질전환, 형질감염, 감염, 전기투공, 접합, 원형질 융합 또는 당해분야 전문가들에게 공지된 기타 기술을 포함할 수 있다. 시험관내 또는 생체외 형질전환에 관하여, 상이한 프로토콜이 선행기술에 기재되었다. 특히, 세포 형질전환은 전체 세포를 리튬 아세테이트와 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 Ito 등(참조: J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168)에 의한 기술에 따라서, 또는 에틸렌 글리콜과 디메틸 설폭사이드의 존재하에 Durrens 등(참조: Curr. Genet. 18 (1990) 7)에 의한 기술에 따라서 처리함으로써 수행될 수 있다. 이와 다른 프로토콜이 또한 특허원 EP 361,991에 기재되었다. 전기투공이 사용되는 경우, 이것은 Becker와 Guarentte(참조: Methods in Enzymology Vol194 (1991) 182)에 따라서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 상이한 기원일 수 있다. 특히, 이들은 세균 또는 진핵 세포(효모, 동물 세포, 식물 세포) 등을 포함할 수 있다. 세균 중에서, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)[슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa)], 리조븀 멜릴로티(Rhizobium meliloti), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토마이세스 프릴스티내스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium) 또는 클로스트리듐(Clostridium) 등이 좀더 우선적으로 언급될 수 있다. 세균 중에서는 이. 콜라이를 사용하는 것이 바람직하다. 효모 중에서는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 등이 언급될 수 있다. 포유동물 세포 중에서, CHO, COS, NIH3T3, PC12 등의 세포가 언급될 수 있다. 생체외 유전자 요법 적용을 위해서, 조혈 간(stem) 세포(WO88/08450, WO93/20195, WO93/09815, WO93/11230), 내피 세포(WO89/05345, WO90/06757, WO92/09222), 근아세포(WO93/03768, WO93/24151, WO94/01129), 섬유아세포(US 5,219,740, WO89/02468, WO94/07906), 간세포(WO89/07136, WO92/12242, WO93/03142), 성상세포(WO94/01135), 신경아세포(WO94/10292, WO94/16059), 케라티노사이트(WO94/11011) 및 마크로파지(FR93/10222)가 또한 언급될 수 있다. 이들 세포는 일반적으로 치료 목적의 산물을 생성할 능력을 지니고 생체내에 이식될 수 있다. 혈액세포 중에서, 적혈구, 호중성, 호염기성 및 호산성 과립구, B 및 T 림프구, 특히 CD4 림프구, 세포독성 림프구(CD8, CTL), 종양 침윤성 림프구(TIL)와 LAK, 단핵구와 마크로파지, 수지상 세포, 거핵세포와 혈소판이 언급될 수 있다.
본 출원은 설명적이고 비-제한적인 것으로 간주되어야 하는 하기의 실시예에 의해서 좀더 상세하게 설명된다.
실시예 1: 핵 단백질과의 상호작용
유전자 발현의 조절에 있어 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 가능한 관여 겔 지연 실험(전기영동 운동성 시험, EMSA)에 의해서 연구된다. 이러한 목적을 위해 Hela 세포의 핵 추출물을 제조하고 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 존재하에 배양한다.
Hela 세포의 핵 추출물을 Dignam(NAR 11 (1983) 1474) 방법에 따라서 제조하고, 단백질 농축물을 Bradford(참조: Anal. Biochem. 72 (1976) 248)의 기술에 따라서 제조한다. 전기영동 운동성 시험을 최종 용적 10 ㎕에서 수행하고 핵 추출 배양물 10 내지 15 ㎍의 존재하에 5분 동안 폴리(dI-dC)-(dI-dC) 1 ㎍의 존재하에 4 mM HEPES 완충제, pH 7.6, 100 mM KCl, 12% 글리세롤에서 배양한다. 이어서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Amersham)에 의해서 [γ-32P]ATP로 표지된 이본쇄 올리고뉴클레오티드 25 fmol을 5분 동안 단백질과 함께 실온에서 배양한다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 대립유전자 Ei 및 Ep에 상응하는 탐침이다. 비교 실험을 위해서, 비표지 올리고뉴클레오티드를 표지 탐침 5분 전에 첨가한다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다:
Ei-센스: TCATTCATCA TTCATTCATT (서열번호 3)
Ei-안티센스: AATGAATGAA TGATGAATGA (서열번호 4)
Ep-센스: TCATTCATTC ATTCATTCAT (서열번호 5)
Ep-안티센스: ATGAATGAAT GAATGAATGA (서열번호 6)
이어서, 형성된 DNA-단백질 복합체를 0.5 x TBE 완충제 중의 비-변성 6% 아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해서 분석한다. 건조 후, 겔을 실온에서 밤새 방사선촬영한다.
수득된 결과는 두 올리고뉴클레오티드 모두 핵 추출물의 단백질에 의해서 인식됨을 보여준다. 또한, 상호작용의 특이성이 저온 올리고뉴클레오티드와의 경쟁 실험에서 입증되고, 이는 용량-의존성 결합을 입증한다. 따라서, 이러한 결과는 핵 인자가 마이크로새틀라이트 HUMTH01과 상호작용한다는 것을 명백히 증명한다.
제 2 단계에서, 다른 올리고뉴클레오티드와의 일련의 경쟁 실험을 수행한다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 인자 AP1 결합 서열 TRE (TGACTCA)에 상응한다. 수득된 결과는 이 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 Ei 및 Ep의 핵 인자로의 결합을 제거하지 않음을 보여준다. 이러한 결과는 마이크로새틀라이드 HUMTH01에 결합하는 인자가 Jun과 Fos와는 상이하다는 것을 나타낸다. 경쟁 실험을 또한 기타 단백질 결합 서열: CRE-TH; CRE; Pou; SP1; AP4 및 E-TH를 함유하는 올리고뉴클레오티드로 수행한다. 이들 서열의 어떤 것도 100배 몰 과량에서 Hela의 핵 추출물의 마이크로새틀라이트의 올리고뉴클레오티드로의 결합이 제거되도록 할 수 없으며, 이는 상호작용의 특이성을 확인시켜 준다.
실시예 2: 발현 카세트 및 벡터의 작제
2.1 인핸서 영역의 합성
다른 인핸서 영역을 이본쇄 형태로 합성한다. 올리고뉴클레오티드를 제조자의 권장에 따라서 Beckman Oligo 1000 합성기에서 합성한다. 생성된 인핸서는 하기와 같다:
- T10i-센스 (서열번호 7):
이 DNA 단편은 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 불완전 대립유전자를 센스 배향 (TH 인트론에서의 정상적 배향)으로 포함한다.
- T10i-안티센스 (서열번호 8):
이 DNA 단편은 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 불완전 대립유전자를 안티센스 배향 (TH 인트론에서의 역배향)으로 포함한다.
- T10p-센스 (서열번호 9):
이 DNA 단편은 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 불완전 대립유전자 ((TCAT)10)를 포함한다.
- T10p-안티센스 (서열번호 10):
- T9-센스 (서열번호 11):
- T8-센스 (서열번호 12):
- T7-센스 (서열번호 13):
- T6-센스 (서열번호 14):
- T5-센스 (서열번호 15):
2.2. 벡터의 작제
2.2.1 TK 프로모터를 포함하는 벡터
TK 프로모터 조절하의 이종 유전자(루시페라제), 및 본 발명에 따른 인핸서를 포함하는 벡터를 작제한다. 이러한 목적을 위해, 플라스미드 pTK-Luc(참조: DeThe et al., Nature 343 (1990) 177)를 사용한다. 이 벡터는 뉴클레오티드 -109 내지 +52를 포함하는 변형된 (최소) TK 프로모터를 포함한다. 더욱 작은 단편(뉴클레오티드 -37 내지 +19)으로 유사한 작제를 수행한다. 다른 인핸서 영역을 이러한 플라스미드에, TK 프로모터의 상류로 도입한다. 좀더 상세하게는, 실시예 2.1.에 기재된 54량체 인핸서를 SalI 부위내 평활 말단의 연결에 의해서 플라스미드 pTK-Luc로 서브클로닝한다. 삽입물의 삽입 및 배향을 서열화에 의해서 검토한다. 생성된 벡터의 발현 카세트의 구조를 도 1에 제시하였다. 본 발명의 인핸서 영역이 또한 프로모터 및 해당 유전자의 하류에 위치되는 것으로 이해된다.
2.2.2. 다른 프로모터를 포함하는 벡터
전술한 벡터를 TK 프로모터를 기타 목적하는 전사 프로모터, 예를 들면, CMV 초기 프로모터 또는 이로부터 유도된 최소 프로모터, 예를 들면, CMV의 뉴클레오티드 -53 내지 +75 또는 -31 내지 +75에 존재하는 단편으로 이루어진 프로모터로 치환하기 위해서 쉽게 변형시킬 수 있다. 다른 가능성은 마우스 또는 인간 PGK 유전자 프로모터, 신경세포 특이성 에놀라제 프로모터 또는 VAChT의 mRNA의 V1 형을 생성하는 프로모터이다. 또한, 이러한 다른 프로모터를 운반하는 다른 벡터 또는 카세트는 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 인핸서 서열을 이들 작제물로 삽입시킴으로써 본 발명의 벡터 또는 카세트를 작제할 수 있다 (참조: Forss-Petter et al., Neuron 5 (1990) 187; Cervini et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 24654 등).
2.2.3. 플라스미드 RSV-CAT
플라스미드 RSV-CAT를 세포 형질감염 효능을 측정하기 위한 실험에 사용한다. 따라서, 이 플라스미드를 본 발명의 벡터와 함께 공형질감염시킨다. 이 플라스미드는 RSV 바이러스 LTR의 조절하에 있는 CAT 유전자를 포함한다. 이의 작제가 Gorman 등(참조: Science 221 (1983) 551)에 의해 기재되어 있다.
실시예 3: HeLa 세포에서 유전자 발현에 대한 효과
본 실시예는 암종 세포에서의 유전자 발현 수준에 관하여 본 발명 서열의 활성 연구를 설명한다. 연구된 세포는 Hela 세포이다. 이들은 인간 상피 암종 기원의 세포이다. 이 세포들은 ATCC CCL-2 하에 ATCC에 기탁되어 있다.
Hela 세포를 Supreme 혈청 7%로 보충된 Dulbecco 배지에서 배양한다. 106세포를 무혈청 배지 0.15㎖에 취하고 Biorad "Gene Pulser"를 사용하여 전기투공에 의해서, 시험될 각각의 벡터 1 pmol, 비히클(Bluescript II) DNA 5 pmol 및 형질감염의 효능이 측정될 수 있게 하는 플라스미드 RSV-CAT 0.5 pmol과 함께 형질감염시킨다. 세포를 형질감염 24시간 및 48시간 후에 수거하고 루시페라제 활성에 대해서 3회 시험한다. 이러한 목적을 위해, LUMAT LB9501 발광측정계(Berthold)를 반응 용적 150 ㎕(0.08 mM 루시페린; 0.1 mM ATP; 25 mM 트리스-포스페이트 pH 7.8; 8 mM MgCl2; 2 mM 디티오트레이톨; 1 mM EDTA; 1% 트리톤; 15% 글리세롤)로 사용한다. 각 벡터의 루시페라제 활성을 공형질감염된 벡터 RSV-CAT로부터 생성된 CAT 활성으로 표준화한다. CAT 활성을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해서 측정한다. 표준화된 루시페라제 활성을 RLU(상대적인 광 단위)로 표시한다. 수득 결과는 세 실험의 평균이다.
수득 결과를 표 2에 제시하였다. 이들은 서열 T10i와 T10p 모두가 유전자 발현에서 강력한 증가를 유도함을 보여준다. 따라서, 24 시간 후, 서열 T10i는 90배까지의 루시페라제 활성의 증가를 유도하고 서열 T10p는 160배까지 유도한다. 관찰된 증가는 이들이 역 배향으로 배열될 경우 두 서열 모두에 대해서 약 250배까지이다. 48 시간 후, 발현 수준의 관찰된 증가는 두 배향 모두에서 두 서열 모두에 대해서 약 300 내지 350 배이다.
실시예 4: PC12 세포에서의 유전자 발현에 대한 효과
본 실시예는 래트 패오크로모사이톰의 세포에서의 유전자 발현 수준에 대한 본 발명 서열의 활성 연구를 설명한다. 연구된 세포는 ATCC CRL-1721 하에 ATCC에 기탁되어 있는 PC12 세포이다.
PC12 세포를 말 혈청 10%와 태송아지 혈청 5%로 보충된 RPMI 배지에서 배양한다. 형질감염 및 활성 측정의 프로토콜은 Hela 세포에 대해 실시예 3에서 사용된 것과 동일하다.
수득된 결과를 도 3에 제시하였다. 이들은 서열 T10i 및 T10p가 이의 배향에 관계없이 24시간 후 25배, 및 48시간 후 50배까지 유전자 발현의 증가를 유도함을 보여준다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 도시: 앙토니
(D) 국가: 프랑스
(E) 우편번호: 920165
(ii) 발명의 명칭: 티로신 하이드록실라제 유전자로부터 유도된 발현 시스템
(iii) 서열수: 15
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) 서열번호:1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 636 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(ix) 형상:
(A) 이름/키: 새틀라이트
(B) 위치: 300 . . 338
(D) 기타 정보: /rpt형= "기타"
/표준명= "HUMTH01"
(xi) 서열 배열 : 서열번호:1:
(2) 서열번호:2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:2:
(2) 서열번호:3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:3:
(2) 서열번호:4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:4:
(2) 서열번호:5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:5:
(2) 서열번호:6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:6:
(2) 서열번호:7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:7:
(2) 서열번호:8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:8:
(2) 서열번호:9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:9:
(2) 서열번호:10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
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(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:10:
(2) 서열번호:11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:11:
(2) 서열번호:12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 37 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:12:
(2) 서열번호:13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:13:
(2) 서열번호:14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:14:
(2) 서열번호:15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA
(xi) 서열 배열: 서열번호:15:

Claims (20)

  1. 전사 인핸서 활성을 보유하고 본질적으로 티로신 하이드록실라제 유전자의 제 1 인트론 부분으로 이루어짐을 특징으로 하는 분리된 DNA 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 마이크로새틀라이트 HUMTH01의 대립유전자를 포함함을 특징으로 하는 단편.
  3. 전사 인핸서 활성을 보유하고 n이 1 내지 50 이고 o가 0 내지 20이며 p가 0 내지 50인 서열 (TCAT)n- (CAT)o-(TCAT)p를 보유함을 특징으로 하는 분리된 DNA 단편.
  4. 제 3 항에 있어서, n이 2 내지 20 이고 o와 p가 0임을 특징으로 하는 단편.
  5. 제 3 항에 있어서, n이 1 내지 10이고, o가 1 내지 5이며 p가 1 내지 10임을 특징으로 하는 단편.
  6. 제 3 항에 있어서, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15를 보유함을 특징으로 하는 단편.
  7. - 전사 프로모터
    - 암호화 서열, 및
    - 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 전사 인핸서를 포함하는 발현 카세트.
  8. 제 7 항에 있어서, 전사 프로모터가 포유동물 세포에서 기능성인 프로모터임을 특징으로 하는 발현 카세트.
  9. 제 8 항에 있어서, 전사 프로모터가 바이러스성, 편재성 또는 조직-특이성 프로모터 중에서 선택됨을 특징으로 하는 발현 카세트.
  10. 제 8 항에 있어서, 전사 프로모터가 본질적으로 TATA 또는 INR 영역을 포함함을 특징으로 하는 발현 카세트.
  11. 제 7 항에 있어서, 전사 인핸서가 센스 배향임을 특징으로 하는 발현 카세트.
  12. 제 7 항에 있어서, 전사 인핸서가 안티센스 배향임을 특징으로 하는 발현 카세트.
  13. 제 7 항에 따른 카세트를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서, 플라스미드 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  15. 제 13 항에 있어서, 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  16. 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 단편이 도입된 재조합 세포.
  17. 제 7 항에 따른 발현 카세트가 도입된 재조합 세포.
  18. 제 13 항에 따른 벡터가 도입된 재조합 세포.
  19. 전사 인핸서로서 마이크로새틀라이트 HUMTH01로부터 유도된 서열의 용도.
  20. 제 7 항에 따른 발현 카세트 또는 제 13 항에 따른 벡터의 세포로의 도입을 포함하는 단백질 제조방법.
KR1019980708498A 1996-04-25 1997-04-10 티로신 하이드록실라제 유전자로부터 유도된 발현 시스템 KR20000010608A (ko)

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ZA973510B (en) 1997-11-18
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