DE19928342A1

DE19928342A1 - Vektoren zur gentherapeutischen Tumorbehandlung

Info

Publication number: DE19928342A1
Application number: DE19928342A
Authority: DE
Inventors: Dirk Schadendorf; Annette Paschen
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2000-12-28
Also published as: WO2000078939A2; WO2000078939A3

Abstract

Beschrieben werden Expressionsvektoren zur gewebespezifischen Expression eines Gens, das für ein cytotoxisches oder "Prodrug"-aktivierendes Protein codiert, wobei der Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft umfaßt: (a) ein oder mehrere gewebespezifische Enhancerelemente, beispielsweise den murinen oder humanen Tyrosinase-Enhancer; (b) einen gewebespezifischen Promotor, beispielsweise den Tyrosinase-Promotor oder den "Melanoma Inhibitory Activity"(MIA)-Promotor; und (c) eine für ein cytotoxisches oder "Prodrug"-aktivierendes Protein, beispielsweise die A-Kette des Diphterietoxins oder Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK), codierende DNA-Sequenz. Diese Vektoren eignen sich zur Behandlung von Tumoren, beispielsweise des malignen Melanoms.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren zur Gentherapie, bevorzugt zur Behandlung von Tumoren, beispielsweise des malig nen Melanoms.

Gegenwärtig stützt sich die Tumortherapie im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo- und Radiothera pie. Allerdings haben diese Therapien die folgenden gravierenden Nachteile: (a) Sie sind im metastasierenden Krankheitsstadium bzw. als vorbeugende Therapie nach Entfernung des Primärtumors kaum wirksam, d. h. eine Heilung im Metastasierungsstadium ist nicht mehr möglich, (b) sie sind im Bezug auf das klinische Ansprechen, auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls, die Gesamtüberlebenszeit sowie die Lebensqualität des Patienten sehr unzureichend und (c) sie weisen eine Reihe von teilweise schwer wiegenden Nebenwirkungen auf, beispielsweise eine beträchtliche Schädigung von normalem Gewebe.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Tumortherapie bereitzustellen, die nicht die vor stehend beschriebenen Nachteile der gegenwärtigen Therapiever fahren ausweisen, insbesondere eine gezielte Abtötung von Tumor zellen ohne wesentliche Schädigung von gesundem Gewebe erlauben.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereit stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausfüh rungsformen erreicht.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor zur gewebespezifischen Expression eines Gens, das für ein cyto toxisches oder "Prodrug-aktivierendes" Protein codiert, wobei der Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell ver knüpft umfaßt: (a) ein oder mehrere gewebespezifische Enhancer elemente, (b) einen gewebespezifischen Promotor und (c) eine codierende DNA-Sequenz für ein cytotoxisches oder "Prodrug-akti vierendes" Protein.

Der hier verwendete Ausdruck "gewebespezifische Enhancerelemen te" bezieht sich auf alle Enhancerelemente, die nur in den ge wünschten Zellen bzw. Geweben, d. h. beispielsweise in Tumor zellen bzw. Tumorgewebe und in den nicht malignen Ausgangszel len, eine Verstärkung der Transkription bewirken. Beispiele für solche gewebespezifische Enhancerelemente sind der humane sowie murine Tyrosinase-Enhancer, die spezifisch in Melanomzellen und Melanocyten aktiv sind. Beide Enhancerelemente sind jedoch nicht sequenzidentisch (für den murinen Enhancer: Genbank-Zugangs nummer: X76647, siehe auch Ganss et al., EMBO J. 13(13) (1994), 3083-3093; für den humanen Enhancer: Genbank-Zugangsnummer: D26163, siehe auch Yasumoto et al., Mol. Cell Biol. 14(12) (1994), S. 8058-8070). Auch für andere Zelltypen wurden Enhancer charakterisiert, die eine gewebespezifische Verstärkung der Transkription vermitteln. So verstärken in Muskelzellen die Enhancer der Gene für Kreatinkinase oder Troponin I gewebsspezi fisch die Genexpression. In Hepatocyten erfolgt dies durch den Enhancer des Gens für Alpha-Fetoprotein. Der Begriff "Enhancer" bezieht sich auch auf Enhancerelement-Fragmente oder Enhan cerelemente mit modifizierten Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind.

Der hier verwendete Ausdruck "gewebespezifischer Promotor" be zieht sich auf alle Promotoren, die nur in den gewünschten Zel len bzw. Geweben, d. h. Tumorzellen bzw. Tumorgewebe und in den nicht malignen Ausgangszellen, zu einer Genexpression führen. Ein Beispiel für solche gewebespezifische Promotoren ist der murine Tyrosinase-Promotor (Genbank-Zugangsnummer: L46805; vgl. Ganss et al., EMBO J. 13(13) (1994), 3083-3093), der nur in Melanomzellen und Melanocyten aktiv ist. Weiter vermitteln u. a. folgende Promotoren eine gewebespezifische Genexpression in Melanocyten und Melanomzellen: Promotor des trp-1 (tyrosinase related protein 1) Gens, Promotor des trp-2 (tyrosinase related protein) Gens, Promotor des MART-1/melanA Gens. Der humane MIA (Melanom Inhibitory Activity) Promotor (Genbank-Zugangsnummer: X84707; vgl. Bosserhoff et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 490- 495) ist in Melanocyten und Chondrocyten (Knorpelzellen) sowie deren malignen Formen aktiv. Gentherapeutische Konstrukte, die auf der Aktivität des MIA Promotors beruhen, können daher nicht nur zur Behandlung des Melanoms, sondern auch zur Behandlung von Chondrosarcomen eingesetzt werden. Im Sinne der Erfindung verfü gen gentherapeutisch nutzbare Promotoren über einen sehr hohen Grad an Zell- und Gewebespzifität. In der Regel sind diese Pro motoren im Tumor und in der entsprechenden Ausgangszelle bzw. in einer sehr begrenzten Zahl an Zelltypen aktiv. Hierzu wird auf die nachfolgende Tabelle verwiesen.

Der Begriff "Promotor" bezieht sich auch auf Promotor-Fragmente oder Promotoren mit modifizierten Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind.

Der hier verwendete Ausdruck "codierende DNA-Sequenz für ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivierendes" Protein" bezieht sich auf alle DNA-Sequenzen, die ein Genprodukt codieren, das entwe der für die spezifische Zielzelle direkt toxisch ist oder das eine nicht-toxische Vorstufe einer Chemikalie in eine toxische Substanz umwandelt. Dies führt zur einer Abtötung der Zielzelle, d. h. beispielsweise einer Tumorzelle. Beispiele für solche DNA- Sequenzen sind DNA-Sequenzen, die für die A-Kette des Diphterie toxins oder die Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK) codieren. Die Aktivität der HSV-TK führt zur intrazellulären Umwandlung eines zusätzlich verabreichten Protoxins zu einem cytotoxischen Reaktionsprodukt, z. B. von zusätzlich verabreich tem Ganciclovir zu GCV-Triphosphat (TP). Im Gegensatz dazu ist die Expression der funktionellen A-Kette des Diphterietoxins direkt toxisch für die Zelle. Zur Gruppe der therapeutisch nutz baren Prodrug-aktivierenden Enzyme gehören u. a. die Cytosin Deaminase, die eine Umsetzung von Fluorcytosin zum toxischen 5- Fluoruracil katalysiert; die Nitroreduktase, die das Tumor-inhi bierende Nitrophenylaziridin CB1954 zu der toxischen Substanz 5'-Aziridinyl-4-hydroxylamino-2-nitrobenzamid umsetzt. Weitere Beispiele sind in den nachfolgenden Tabellen gezeigt.

Die Begriffe "Toxine bzw. Prodrug-aktivierende Proteine" bezie hen sich auch auf Fragmente dieser DNA-Sequenzen oder modifi zierte Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind, d. h. in der Zielzelle noch zur Expression eines Produkts führen, das (direkt oder indirekt) toxisch ist.

Bei den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren handelt es sich um gentherapeutisch wirksame Konstrukte, die zur therapeutischen, lokalen oder systemischen Behandlung von Tumoren, insbesondere des malignen Melanoms, eingesetzt werden können. Dabei wird durch die Gegenwart des Expressionsvektors in der Krebszelle die Expression eines cytotoxischen oder "Prodrug"-aktivierenden Gen produkts gewebespezifisch angeschaltet, was zur selektiven Abtö tung der Krebszelle führt. Dabei wird die gewebespezifische Expression des cytotoxischen bzw. des "Prodrug"-aktivierenden Genprodukts durch eine selektive Transkriptionskontrolle gewähr leistet, die auf der gewebespezifischen Aktivität bestimmter Promotoren und Enhancer beruht. Dabei kommen beispielsweise gewebespezifische Promotoren wie der (murine oder humane) Tyro sinase-Promotor und der (humane) "Melanoma Inhibitory Activi ty"(MIA)-Promotor zum Einsatz, deren Aktivität durch (mehrfache) Kopien gewebespezifischer Enhancerelemente, beispielsweise des murinen oder humanen Tyrosinase-Enhancers, verstärkt wird. Durch die Fusion des Promotors mit diesen Enhancern kommt es nach Aufnahme des erfindungsgemäßen Expressionsvektors durch die Zelle zu einer Zell- bzw. Gewebe-spezifischen und effizienten Expression des cytotoxischen (beispielsweise die A-Kette des Diphtherietoxins) oder des "Prodrug"-aktivierenden (bei spielsweise Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase; HSV-TK) Gen produkts. Die Aktivität der HSV-TK führt bei der Umsetzung eines zusätzlich verabreichten Protoxins (Ganciclovir) zu einem cytotoxischen Reaktionsprodukt. Im Gegensatz dazu ist die Ex pression der funktionellen A-Kette des Diphtherietoxins direkt toxisch für die Zelle. Dadurch können Krebszellen, beispiels weise Melanomzellen, bei Verwendung von Enhancerelementen, deren Aktivität auf Melanomzellen/Melanocyten begrenzt ist, sehr se lektiv abgetötet werden. Eine Expression der vorstehend be schriebenen, die cytotoxischen Genprodukte codierenden Gene kann jedoch auch in nicht malignen Ursprungszellen eines Melanoms, den Melanocyten, erfolgen. Mehrere, vor allem immunologische Untersuchungen zeigten, daß die Zerstörung der (gesunden) Mela nocyten nicht mit entscheidenden Nebenwirkungen für den Patien ten verbunden ist.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Re kombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo- Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Ausubel und Frederick (1991), Current Protocols in Molecular Biology (J. Wi ley & Sons, New York) beschrieben sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die gewebespezifischen Enhancerelemente des erfindungsgemäßen Expressionsvektors Tyro sinase-Enhancerelemente, vorzugsweise murine oder humane Tyrosi nase-Enhancerelemente.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die gewe bespezifischen Promotoren des erfindungsgemäßen Expressions vektors ein Tyrosinase-Promotor, beispielsweise ein muriner oder humaner Tyrosinase-Promotor, oder ein "Melanoma Inhibitory Acti vity"(MIA)-Promotor, vorzugsweise der humane MIA-Promotor.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin dungsgemäßen Expressionsvektoren codiert die ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivierendes" Protein codierende DNA-Sequenz für die A-Kette des Diphterietoxins (Genbank Acession No. K01722) oder Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK; Genbank Acces sion No. J02224)).

Am meisten bevorzugt sind Expressionsvektoren, bei denen der Tyrosinase-Promotor mit mehreren, beispielsweise mindestens drei, Tyrosinase-Enhancerelementen kombiniert ist oder der MIA- Promotor mit einem oder mehreren Enhancerelementen, beispiels weise drei oder mehr Tyrosinase-Enhancerelementen, kombiniert ist.

Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können außerdem noch zusätzliche (Signal)sequenzen enthalten, die eine weitere Opti mierung der Genexpression in der Zielzelle bewirken, beispiels weise ein B(ovine)G(rowth)H(ormone) poly-Adenylierungssignal (Woychik et al., Nucleic Acids Research 10, S. 7197-7210 (1982)). Ein weiteres verwendbares poly-Adenylierungssignal stammt aus der DNA des Simian Virus 40 (SV40; Genbank Accession: J02402, M24874). Die poly-Adenylierungssignale verschiedenster Gene sind nutzbar, z. B. polyA-Signal des Herpes Simplex Virus (Genbank Accession No. M12700) oder der humanen neutrophilen Elastase (Genbank Accession: J03545).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein Plasmid (z. B. pUC19 mit einen ColE1-Repli kationsursprung). Für die Herstellung der gentherapeutischen Konstrukte können nahezu alle Plasmide mit singulären Restrik tionsschnittstellen genutzt werden. Dazu gehören z. B. der Vektor pBr322 (Genbank Accession No. V01119), M13-Vektoren (Genbank Accession No. X02513/L08821) oder das pGEM-3Z und das pGEM-42 Plasmid (Genbank Accession No, X65304, Genbank Accession No. X65305). Anstelle von "nackter" Plasmid-DNA (z. B. gekoppelt an Trägersubstanzen) können auch virale Vektoren zum Transfer der therapeutischen DNA-Sequenzen in die Zelle eingesetzt wer den, beispielsweise ein Retrovirus oder Adenovirus bzw. adenovi rale Vektoren. Eine sehr effiziente Form der Applikation ist die direkte Injektion der Expressionsplasmide bzw. der viralen Kon strukte in den Tumor, ebenso ist eine systemische Applikation der Konstrukte denkbar. Weitere brauchbare virale Vektoren sind die AAV (Adeno-assoziierte Viren)-Vektoren. Rekombinante Plasmi de können in AAVirushüllen verpackt werden. Dieses Prinzip ba siert auf der Konstruktion eines infektiösen Plasmids, in dem alle kodierenden viralen Sequenzen deletiert werden und ledig lich virale terminale Sequenzwiederholungen erhalten bleiben. Die Expression der ausgewählten Sequenzen (d. h. der therapeuti schen Gene) wird ausschließlich durch die ausgesuchten regulato rischen Elemente (gewebespezifischer Enhancer/Promotor) gesteu ert und nicht durch virale Sequenzen beeinflußt. Die rekombinan te DNA gelangt nach Infektion der Zelle in den Zellkern und kann dort in das Genom integrieren. Weiter besonders bevorzugt sind Retroviren. Retroviren sind RNA-Viren, bei denen die viralen Gene von einem einzelsträngigen RNA-Molekül codiert werden. Nach Eintritt in die Wirtszelle wird die virale RNA über reverse Transkription in ein doppelsträngiges DNA-Molekül umgewandelt, im Anschluß daran gelangt diese DNA in den Nucleus und inte griert sich in das Wirtsgenom als sogenanntes Provirus, das wiederum die Matritze für die Expression viraler Gene und die Synthese von Virion-BKA ist. Die viralen Genprodukte und die Virion-RNA lagern sich zu einem intakten Virion zusammen, das dann die Zelle wieder verlassen und neue Zellen infizieren kann. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, daß es mittels Re troviren möglich ist, Fremd-DNA in einen gewünschten Organismus einzuschleusen und dort auch zur Expression zu bringen. Somit bieten sich Retroviren grundsätzlich als gutes Vehikel für eine Gentherapie an. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Vorzugsweise sind bei diesen Re troviren die einzelnen DNA-Sequenzen (Enhancer/Promotor/Toxin- codierendes Gen) in den U3-Bereich des LTR des Retrovirus inte griert. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Hinsichtlich der Möglichkeiten die Vektoren zu verabreichen, sind beispielsweise zu nennen:

- Ballistischer Gentransfer mittels "Gene Gun": Die Expres sionsplasmide werden an Mikroprojektile (z. B. Goldpartikel) gebunden. Die Haut der Patienten wird mit diesen Partikeln unter Anwendung eine speziellen Apparatur (Gene Gun) be schossen. Dabei gelangt die DNA direkt in die Zelle.
- Gentransfer basierend auf einer Rezeptor-vermittelten Endo cytose: In diesem Fall wird die DNA an ein Hybridplasmid gekoppelt, wodurch eine gezielte Aufnahme in die Zelle erleichtert werden soll. Das Hybridprotein besteht aus zwei funktionellen Domänen: einer DNA-bindenden Domäne (zur Kopplung der therapeutisch wirksamen DNA) und einer Ligan den-Domäne, die die Bindung an einen zellulären Rezeptor vermittelt und damit den Transport des Vektors über die Zellmembran ermöglicht. Das allgemeine Prinzip wurde durch Wu et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), S. 14338-14342 oder Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), S. 3655- 3659 beschrieben und ist auf die gezielte Belieferung von Melanomzellen/Melanoycten übertragbar.
- Gentransfer mittels attenuierter Bakterien: Attenuierte Bakterienstämme, die in ihrer Pathogenität deutlich einge schränkt sind, können ebenfalls als Transfervehikel für den Transport der Plasmide verwendet werden. Beispielsweise sind attenuierte E. Coli-Stämme bekannt, die brauchbar sind. Desweiteren sind attentuierte Listeria monocytogenes oder Salmonella typhimurium Stämme bekannt, die eingesetzt werden können (Dietrich et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998), S. 181-185; Low et al., Nat. Biotechnol. 17 (1999), S. 37- 41).

Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann außerdem zusätzlich ein Gen enthalten, das einen nachweisbaren phänotypischen Marker codiert, und somit die erfolgreiche Einschleusung in die Ziel zelle nachgewiesen werden kann. Geeignete Markergene sind bei spielsweise das für Luciferase codierende Gen, LacZ-Gen (kodiert für β-Galactosidase; Genbank Accesssion No. J01636), cat-Gen (kodiert für Chloramphenicol-Acetyl-Transferase; Genbank Acces sion No. L29345), gfp-Gen (kodiert für grün-fluoreszierendes Protein; Genbank Accession No. L29345) oder luc-Gen (kodiert für Firefly-Luciferase; Genbank Accession No. E05447).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschrie benen Expressionsvektoren enthaltende Wirtszellen, die bei spielsweise zur Vermehrung dieser Vektoren dienen können. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli- Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9- Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293-, B16-, NIH 3T3-, L929-, DM13- und WI38-Zellen. Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, zur Vermehrung der Plasmide Bakte rienzellen zu verwenden und zur Vermehrung viraler Vektoren Säugerzellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expres sion der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet be kannt.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthaltendes Arzneimittel bzw. dessen Verwendung zur Tumortherapie, vorzugsweise zur The rapie des malignen Melanoms. Diese Arzneimittel enthalten gege benenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen bei spielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emul sionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Art des Trägers hängt natürlich davon ab, wie der erfindungsgemäße Expressionsvektor verabreicht werden soll. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Schwere grad der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1 Konstruktion eines MIA Expressionsplasmids

Zur Klonierung multipler Kopien des murinen Enhancers stromauf wärts des MIA-Promotors wurde wie folgt vorgegangen: Ausgehend von dem Plasmid phsTyr(0.2)CAT (Ganss et al., EMBO J. 13 (13) (1994), S. 3083-3093), auf dem der Tyrosinase-Enhancer strom aufwärts des Tyrosinasepromotors lokalisiert ist, wurden mittels PCR Kopien des Enhancers generiert. Durch die spezifischen, zur Amplifikation verwendeten Primer wurde eine Hindill Restrik tionsschnittstelle an dem Promotor-distalen und eine Xhol Sch nittstelle an dem Promotor-proximalen Ende des Enhan cer-Fragments generiert. Unmittelbar stromabwärts der HindIII Schnittstelle wurde ebenfalls eine SalI Erkennungssequenz einge führt. Das Amplifikat wurde mit den Enzymen HindIII und XhoI restringiert. Anschließend wurde es in das mit HindIII und SalI behandelte MIA Plasmid (CAT-MIA-1386; Bosserhoff et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), S. 490-495) stromaufwärts des MIA Pro motors kloniert. Das resultierende Plasmid mit einer Kopie des Enhancers wurde nachfolgend mit HindIII/SalI restringiert, so daß stromaufwärts des Enhancers ein weiterer Enhancer (Hin dIII/XhoI restringiert) eingefügt werden konnte. Auf diese Weise wurden multiple Kopien des Enhancers stromaufwärts des Promotors eingefügt.

Primersequenzen

Primer zur Amplifizierung des murinen Tyrosinase-Enhancers:
Einbau einer HindIII/SalI Schnittstelle (unterstrichen in AP-Ty r-1-2) und eines XhoI Schnittstelle (unterstrichen in AP-Tyr-2); Sequenzanteile des Enhancers sind hervorgehoben.

PCR Bedingungen

Initiale Denaturierung: 94°C, 2 Min.
35 Zyklen: Denaturierung 94°C 1 Min.
Annealing 55°C 1 Min.
Elongation 72°C 1 Min.
finale Elongation: 72°C 10 Min.

Die Aktivität der so konstruierten Enhan cer/Promotorkombinationen wurde in vitro getestet. Die Aktivi tätsbestimmung erfolgte anhand der Expression des CAT-Re portergens in verschiedenen Melanom- und Nicht-Melanomzellinien. Die Daten einer Messung sind hier anhand zweier Melanomzellinien und einer Nicht-Melanomzellinie exemplarisch dargestellt.

Transkriptionelle Aktivität verschiedener Enhancer/Promotor Kombinationen:
Die transkriptionelle Aktivität der Enhancer/Promotor Konstrukte MIAIII (3facher muriner Enhancer + MIA Promotor) und MIAIV (4facher muriner Enhancer + MIA Promotor) wurde im Vergleich zu MIA1386 (MIA Promotor ohne Enhancer) bestimmt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte anhand der Expression des CAT Reportergens in den Melanomzellinien MeWo und UKRV-Mel-06a sowie in der Nicht-Melanomzellinie KB.

Die Aktivität der Enhancer/Promotor Konstrukte wurde anhand von Reportergenstudien bestimmt. Ausgehend von den Reportergenkon strukten werden die therapeutisch wirksamen Expressionsplasmide hergestellt. Unter Verwendung spezifischer Primer wurden mittels PCR Kopien der therapeutischen Gene generiert, die eine Klonie rung der Fragmente stromabwärts der Enhancer/Promotorregion im Austausch gegen das Reportergen ermöglichen. Stromabwärts des therapeutischen Gens wird das BGH poly-Adenylierungssignal ein gefügt. Mittels PCR wurden solche zur Klonierung geeigneten BGH DNA Fragmente generiert.

Primersequenzen

Primer zur Amplifizierung des Gens kodierend für die A-Kette des Diphtherietoxins: Einbau einer BamHI-Schnittstelle (unterstri chen in DiphBam-5) und eines SacI Schnittstelle (unterstrichen in DiphSac-3); Sequenzanteile der A-Kette des Diphtherietoxin gens sind hervorgehoben.

Primer zur Amplifizierung des BGH poly-Adenylierungssignals:
Einbau einer SacI Schnittstelle (unterstrichen in BGHSac-5) und eines EcoRI Schnittstelle (unterstrichen in BGHEco-3); Sequenz anteile der BGH-Signals sind hervorgehoben.

PCR Reaktionsbedincruncren

Initiale Denaturierung: 94°C, 3 Min.
30 Zyklen: Denaturierung 94°C 0,5 Min.
Annealing 55°C 1 Min.
Elongation 72°C 1,5 Min.
finale Elongation: 72°C 7 Min.

In einem weiteren Ansatz wird mittels einer positiven Rückkopp lungsschleife (feed back 100p) eine verstärkte Expression des Gens kodierend für die "Prodrug"-aktivierende Herpes simplex Virus Thymidinkinase erzielt. Dieser Ansatz beruht auf Anordnung folgender DNA-Sequenzen auf dem Plasmid pUCl9 (Genbank Access sion No. X02514):
GAL4 DNA Bindungssequenz
gewebespezifische Enhancersequenz (Tyrosinase-Enhancer)
gewebespezifische Promotorsequenz (MIA Promotor)
therapeutisches Gen HSV-TK
IRES (internal ribosome entry site)
Gen eines Hefe-spezifischen Transkriptionsaktivators (z. B. GAL4)
SV40 poly-Adenylierungssignal

Die gewebespezifische Enhancer/Promotorkombination wird in den Tumorzellen aktiviert. Dies führt zur Transkription des thera peutischen Gens und des nachgeschalteten Gens, das für einen Hefe-spezifischen Transkriptionsaktivator kodiert, in Form einer gemeinsamen RNA. Durch die IRES (Internal ribosome entry-site)- Sequenz, die vorzugsweise vom Encephalomyocarditis Virus (Jack son et al., Trends Biochem. Sci. 15 (1990), S. 477-483; Access sion No. X87335, AJ000154) stammt, können beide Kodierregionen unabhängig voneinander translatiert werden. Das Gal4 Protein bindet wiederum an eine spezifische Erkennungssequenz, die stro maufwärts der gewebespezifischen Enhancer/Promotor-Kombination lokalisiert ist und führt somit zu einer weiteren Transkrip tionssteigerung.

Claims

1. Expressionsvektor zur gewebespezifischen Expression eines Gens, das für ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivieren des" Protein codiert, wobei der Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft umfaßt:

a) ein oder mehrere gewebespezifische Enhancerelemente;
b) einen gewebespezifischen Promotor; und
c) eine codierende DNA-Sequenz für ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivierendes" Protein.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die gewebespezi fischen Enhancerelemente Tyrosinase-Enhancerelemente sind.

3. Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der gewe bespezifische Promotor ein Tyrosinase-Promotor oder ein "Melanoma Inhibitory Activity"(MIA)-Promotor ist.

4. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die für ein cytotoxisches oder "Prodrug"-aktivierendes Protein codierende DNA-Sequenz die A-Kette des Diphtherie toxins oder Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK) codiert.

5. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der zusätzlich eine BGH-Polyadenylierungsstelle enthält.

6. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Vektor ein Plasmid, ein Adenovirus, ein Adeno-assozi ierter Virus (AAV) oder ein Retrovirus ist.

7. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der zusätzlich ein Gen enthält, das einen nachweisbaren phäno typischen Marker codiert.

8. Zelle, den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend.

9. Zelle nach Anspruch 8, die eine Tierzelle ist.

10. Zelle nach Anspruch 9, die eine Säugerzelle ist.

11. Verwendung des Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Tumortherapie.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Tumortherapie die Therapie des malignen Melanoms ist.