WO2000078939A2 - Vektoren zur gentherapeutischen tumorbehandlung - Google Patents

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WO2000078939A2
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Annette Paschen
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Definitions

  • the present invention relates to vectors for gene therapy, preferably for the treatment of tumors, for example of malignant melanoma.
  • tumor therapy is still essentially based on the three main pillars: surgery, surgery and radiotherapy.
  • these therapies have the following serious disadvantages: (a) They are hardly effective in the etastatic disease stage or as preventive therapy after removal of the primary tumor, i.e. healing at the metastatic stage is no longer possible, (b) they are very inadequate in terms of clinical response, the duration of the relapse-free interval, the overall survival and the quality of life of the patient, and (c) they have a number of sometimes serious side effects , for example considerable damage to normal tissue.
  • the invention is therefore essentially based on the object of providing means for tumor therapy which do not have the disadvantages of the current therapeutic methods described above, in particular allow targeted tumor cell killing without substantial damage to healthy tissue.
  • the present invention thus relates to an expression vector for the tissue-specific expression of a gene which codes for a cytotoxic or "prodrug-activating" protein, wherein the expression vector comprises the following DNA sequences functionally linked: (a) one or more tissue-specific enhancer elements, (b) a tissue-specific promoter and (c) a coding DNA sequence for a cytotoxic or "prodrug-activating" protein.
  • tissue-specific enhancer elements refers to all enhancer elements which are only present in the desired cells or tissues, i.e. for example, in tumor cells or tumor tissue and in the non-malignant output lines, cause an increase in transcription.
  • tissue-specific enhancer elements are the human and murine tyrosinase enhancers, which are specifically active in melanoma cells and melanocytes.
  • both enhancer elements are not identical in sequence (for the murine enhancer: Genbank accession number: X76647, see also Ganss et al., EMBO J.
  • Enhancers were also characterized for other cell types, which mediate tissue-specific enhancement of the transcription. In muscle cells, for example, the enhancers of the genes for creatine kinase or troponin I specifically increase gene expression. In hepatocytes, this is done by the enhancer of the alpha-fetoprotein gene.
  • the term “enhancer” also refers to enhancer element fragments or enhancer elements with modified sequences that are still biologically active.
  • tissue-specific promoter refers to all promoters which lead to gene expression only in the desired cells or tissues, ie tumor cells or tumor tissue and in the non-malignant starting lines.
  • tissue-specific promoters is the murine tyrosinase promoter (Genbank accession number: L46805; see Ganss et al., EMBO J. 13 (13) (1994), 3083-3093), which is only active in melanoma cells and melanocytes .
  • the following promoters also mediate tissue-specific gene expression in Melanocytes and melanoma cells: promoter of the trp-1 (tyrosinase related protein 1) gene, promoter of the trp-2 (tyrosinase related protein) gene, promoter of the MART-1 / melanA gene.
  • the human MIA (Melanoma Inhibitory Activity) promoter (Genbank accession number: X84707; see Bosserhoff et al., J.Biol.Chem. 271 (1996), 490-495) is in melanocytes and chondrocytes (cartilage cells) and their malignant forms active.
  • Gene therapy constructs based on the activity of the MIA promoter can therefore be used not only for the treatment of melanoma, but also for the treatment of chondrosarcoma.
  • promoters which can be used in gene therapy have a very high degree of cell and tissue specificity. As a rule, these promoters are active in the tumor and in the corresponding starting line or in a very limited number of cell types. Please refer to the table below.
  • Myocytes (muscle cells) creatin kinase, troponin I, actin
  • Hepatocytes liver cells
  • albumin alpha-fetoprotein
  • promoter also refers to promoter fragments or promoters with modified sequences that are still biologically active.
  • coding DNA sequence for a cytotoxic or prodrug-activating "protein” refers to all DNA sequences that code for a gene product that either which is directly toxic to the specific target cell or which converts a non-toxic precursor of a chemical into a toxic substance. This leads to the target cell being killed, ie for example a tumor cell.
  • DNA sequences which code for the A chain of diphtheria toxin or the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK).
  • HSV-TK herpes simplex virus thymidine kinase
  • the activity of HSV-TK leads to the intracellular conversion of an additionally administered protoxin to a cytotoxic reaction product, for example from additionally administered ganciclovir to GCV triphosphate (TP).
  • the group of therapeutically usable prodrug-activating enzymes includes cytosine deaminase, which catalyzes the conversion of fluorocytosine to toxic 5-fluorouracil; the nitroreductase, which converts the tumor-inhibiting nitrophenylaziridine CB1954 into the toxic substance 5'-aziridinyl-4-hydroxylamino-2-nitrobenzamide. Further examples are shown in the tables below.
  • toxins or prodrug-activating proteins also refer to fragments of these DNA sequences or modified sequences which are still biologically active, ie which still lead to the expression in the target cell of a product which is (directly or indirectly) toxic.
  • the expression vectors according to the invention are constructs which are active in gene therapy and can be used for the therapeutic, local or systemic treatment of tumors, in particular malignant melanoma.
  • the presence of the expression vector in the cancer cell activates the expression of a cytotoxic or "prodrug" -activating gene product in a tissue-specific manner, which leads to the selective killing of the cancer cell.
  • the tissue-specific expression of the cytotoxic or the "prodrug" -activating gene product is guaranteed by a selective transcription control based on the tissue-specific activity of certain promoters and enhancers.
  • tissue-specific promoters such as the (murine or human) tyrosinase promoter and the (human) "melanoma inhibitory activity" (MIA) promoter are used, their activity being achieved by (multiple) copies of tissue-specific enhancer elements, for example the murine or human Tyrosinase enhancers.
  • the fusion of the promoter with these enhancers results in the cell or tissue-specific and efficient expression of the cytotoxic (for example the A chain of diphtheria toxin) or the "prodrug” activating (for example Herpes simplex virus thymidine kinase; HSV-TK) gene product.
  • cytotoxic for example the A chain of diphtheria toxin
  • prodrug activating for example Herpes simplex virus thymidine kinase; HSV-TK
  • the activity of the HSV-TK leads to a cytotoxic reaction product when an additional protoxin (ganciclovir) is administered.
  • the expression of the functional A chain of diphtheria toxin is directly toxic to the cell.
  • cancer cells for example melanoma cells
  • enhancer elements whose activity is limited to melanoma cells / melanocytes.
  • the genes encoding the cytotoxic gene products can also be produced in non-malignant cells of origin of a melanoma, the melanocytes.
  • tissue-specific enhancer elements of the expression vector according to the invention are tyrosinase enhancer elements, preferably murine or human tyrosinase enhancer elements.
  • tissue-specific promoters of the expression vector according to the invention are a tyrosinase promoter, for example a murine or human tyrosinase promoter, or a "melanoma inhibitory activity" (MIA) promoter, preferably the human MIA promoter.
  • a tyrosinase promoter for example a murine or human tyrosinase promoter
  • MIA melanoma inhibitory activity
  • the DNA sequence encoding a cytotoxic or "prodrug-activating" protein codes for the A chain of diphtheria toxin (Genbank Acession No. K01722) or herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK; Genbank Accession No. J02224)).
  • Expression vectors are most preferred in which the tyrosinase promoter is combined with several, for example at least three, tyrosinase enhancer elements or the MIA promoter with one or more enhancer elements, for example wise three or more tyrosinase enhancer elements is combined.
  • the expression vectors according to the invention may also contain additional (signal) sequences which bring about a further optimization of gene expression in the target cell, for example a B (ovine) G (rowth) H (ormone) poly-adenylation signal (Woychik et al., Nucleic Acids Research 10, pp. 7197-7210 (1982) -).
  • Another usable poly-adenylation signal comes from the DNA of Simian Virus 40 (SV40; Genbank Accession: J02402, M24874).
  • the poly adenylation signals of various genes can be used, e.g. polyA signal of the herpes simplex virus (Genbank Accession No. M12700) or of human neutrophil elastase (Genbank Accession: J03545).
  • the expression vector according to the invention is a plasmid (for example pUC19 with a ColEl origin of replication). Almost all plasmids with unique restriction sites can be used to produce the gene therapy constructs. These include, for example, the vector pBr322 (Genbank Accession No. V01119), M13 vectors (Genbank Accession No.X02513 / L08821) or the pGEM-3Z and the pGEM-4Z plasmid (Genbank Accession No, X65304, Genbank Accession No. X65305) .
  • viral vectors can also be used to transfer the therapeutic DNA sequences into the cell, for example a retrovirus or adenovirus or adenoviral vectors.
  • a very efficient form of application is the direct injection of the expression plasmids or the viral constructs into the tumor, and a systemic application of the constructs is also conceivable.
  • Other useful viral vectors are the AAV (adeno-associated virus) vectors.
  • Recombinant plasmids can be packaged in AV virus envelopes. This principle is based on the construction of an infectious plasmid in which all coding viral sequences are deleted and only viral terminal sequence repeats are retained.
  • Retroviruses are RNA viruses in which the viral genes are encoded by a single-stranded RNA molecule. After entering the host cell, the viral RNA is converted into a double-stranded DNA molecule via reverse transcription, after which this DNA reaches the nucleus and integrates into the host genome as a so-called provirus, which in turn is the template for the expression of viral genes and the Synthesis of virion RNA is.
  • retroviruses make it possible to introduce foreign DNA into a desired organism and also to express it there. Retroviruses are therefore generally a good vehicle for gene therapy.
  • suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV.
  • the individual DNA sequences are preferably integrated into the U3 region of the LTR of the retrovirus.
  • the expression vectors according to the invention can also be transported to the target cells in the form of colloidal dispersions. These include, for example, lipososms or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6. (198-8), 682).
  • the expression plasmids are bound to microprojectiles (eg gold particles). The skin of the patient is bombarded with these particles using special equipment (gene gun). The DNA gets directly into the cell.
  • Gene transfer based on a receptor-mediated endo- cytosis In this case, the DNA is coupled to a hybrid plasmid, which is intended to facilitate targeted uptake into the cell.
  • the hybrid protein consists of two functional domains: a DNA-binding domain (for coupling the therapeutically effective DNA) and a ligand domain, which mediates the binding to a cellular receptor and thus enables the vector to be transported across the cell membrane.
  • the general principle was described by Wu et al., J. Biol. Chem.
  • Attenuated bacterial strains can also be used as a transfer vehicle for the transport of the plasmids.
  • attenuated E. coli strains are known which are useful.
  • attested Listeria monocytogenes or Salmonella typhimurium strains are known which can be used (Dietrich et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998), pp. 181-185; Low et al., Nat. Biotechnol. 17 (1999), Pp. 37-41).
  • the expression vector according to the invention can also additionally contain a gene which encodes a detectable phenotypic marker, and thus the successful introduction into the target cell can be detected.
  • Suitable marker genes are, for example, the gene coding for luciferase, LacZ gene (coded for ⁇ -galactosidase; Genbank Accesssion No. J01636), cat gene (coded for chloramphenicol acetyl transferase; Genbank Accession No. L29345), gfp gene ( encodes green fluorescent protein; Genbank Accession No. L29345) or luc gene (encodes Firefly-Luciferase; Genbank Accession No. E05447).
  • the present invention also relates to the host cells containing the expression vectors described above, which can serve, for example, to multiply these vectors.
  • host cells include bacteria (for example the E. coli strains HB101, DH1, xl776, JM101, JM109, BL21 and SG13009), yeast, preferably S. cerevisiae, insect cells, preferably sf9 cells, and animal cells, preferably mammalian cells.
  • Preferred mammalian cells are CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, B16, NIH 3T3, L929, DM13 and WI38 cells.
  • the present invention further relates to a medicament containing the expression vector according to the invention or its use for tumor therapy, preferably for therapy of malignant melanoma.
  • These drugs may also contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Suitable carriers and the formulation of such medicaments are known to the person skilled in the art.
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the type of carrier naturally depends on how the expression vector according to the invention is to be administered. The appropriate dosage is determined by the attending physician and depends on various factors, for example the age, gender, weight of the patient, the severity of the disease, the type of administration, etc.
  • Fig. La Constructs based on the tyrosinase promoter
  • Fig. Lb Constructs based on the MIA promoter
  • Example 1 Construction of an MIA expression plasmid
  • the procedure was as follows: starting from the plasmid phsTyr (0.2) CAT (Ganss et al., EMBO J. 13 (13) (1994), S. 3083-3093), on which the tyrosinase enhancer is located upstream of the tyrosinase promoter, copies of the enhancer were generated by means of PCR.
  • the specific primers used for amplification generated a HindIII restriction interface on the promoter distal and an Xhol interface on the promoter proximal end of the enhancer fragment.
  • a Sall recognition sequence was also introduced immediately downstream of the HindIII interface.
  • the amplificate was restricted with the enzymes Hindlll and Xhol. It was then cloned into the MIA plasmid treated with HindIII and SalI (CAT-MIA-1386; Bosserhoff et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), pp. 490-495) upstream of the MIA promoter.
  • the resulting plasmid with a copy of the enhancer was subsequently restricted with Hindlll / Sall, so that a further enhancer (Hindlll / Xhol restricted) could be inserted upstream of the enhancer. In this way, multiple copies of the enhancer were inserted upstream of the promoter.
  • Figure 1b a construct containing multiple copies of the tyrosinase enhancer upstream of the MIA promoter is shown in Figure 1b.
  • Primer for amplification of the murine tyrosinase enhancer incorporation of a HindIII / SalI interface (underlined in AP-Tyr-1-2) and an Xhol interface (underlined in AP-Tyr-2); Sequence parts of the enhancer are highlighted.
  • Promoter combinations have been tested in vitro.
  • the activity was determined on the basis of the expression of the CAT reporter gene in various melanoma and non-melanoma cell lines.
  • the data from a measurement are shown here using two melanoma cell lines and a non-melanoma cell line as examples.
  • T rans riptionelle A kt disclose various enhancer / promoter combinations: T he t rans k riptionelle A kt naval the enhancer / promoter constructs M IA II I (3 f acher murine E nHancer + MIA promoter) and MIAIV (4x murine E nHancer + MIA P romotor ) WUR d e estimmt compared to MIA1386 (MIA promoter without enhancer) b.
  • T he kt foundedsbeées was based on the expression of CAT is d R d s in eportergens M elanomzellinien MeWo and UKRV-Mel-06a and I in the N t - M s l anomzelline KB.
  • U n t he Ve rassemble specific primers were generated by PCR K o p h e n d t he h, it a clampic genes that have a cloning run gd he F ra g m e n t it romabwash t of the enhancer / promoter region in A us t of C hg e g s d allow as reporter gene.
  • Downstream de s the ra pe u t ic hey n G s s is the BGH poly-adenylation adds ⁇ g e. M i tt e l s PCR were those suitable for cloning BGH DN A fragments generated.
  • Primer for amplifying the BGH poly adenylation signal incorporation of a Sacl interface (underlined in BGHSac-5) and an EcoRI interface (underlined in BGHEco-3); Sequence parts of the BGH signal are highlighted.
  • an increased expression of the gene coding for the "prodrug" -activating herpes simplex virus thymidine kinase is achieved by means of a positive feedback loop (feed back loop).
  • feed back loop This approach is based on the arrangement of the following DNA sequences on the plasmid pUC19 (Genbank Access No. X02514):
  • tissue-specific enhancer sequence tissue-specific promoter sequence
  • MIA promoter tissue-specific promoter sequence
  • HSV-TK IRES internal ribosome entry site
  • Gene of a yeast-specific transcription activator e.g. GAL4
  • the tissue-specific enhancer / promoter combination is activated in the tumor cells. This leads to the transcription of the therapeutic gene and the downstream gene, which codes for a yeast-specific transcription activator, in the form of a common RNA.
  • the IRES internal ribosome entry-site sequence, which preferably derives from the encephalomyocarditis virus (Jackson et al., Trends Biochem. Sci. 15 (1990), pp. 477-483; Accesssion No. X87335, AJ000154) both coding regions are translated independently of one another.
  • the Gal4 protein in turn binds to a specific recognition sequence that is located upstream of the tissue-specific enhancer / promoter combination and thus leads to a further increase in transcription.
  • Example 2 Construction of a tyrosinase expression plasmid To clone multiple copies of the murine tyrosinase enhancer upstream of the tyrosinase promoter, the procedure was as follows: The MIA expression plasmid (see Example 1) was converted into the simple enhancer or multiple copies of the enhancer using Xbal and Sall Restriction cut out. The enhancer fragments were then cloned into the Xbal and Sall restricted plasmid PCAT (Ganss et al., EMBO J. 13 (3) (1994), pp. 3083-3093) upstream of the tyrosinase promoter.
  • the activity of the enhancer / promoter constructs was determined in transfection experiments based on the expression of the CAT reporter gene in various melanoma and non-melanoma cell lines according to standard methods (Bosserhoff et al., J. Biol. Chem. 271 (1) (1996) , Pp. 490-495; Bruhn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (20), (1993), pp. 9707-9711).
  • the activity of the individual constructs was in each case related to the activity of the CMV promoter (positive control) within a cell line.
  • the results are shown in Fig. 2.
  • Both the activity of the tyrosinase and MIA promoters is cell type specific, i.e. the downstream reporter gene is only expressed in melanoma but not in control cell lines (e.g. HeLa). This cell type specificity is also retained in the enhancer constructs.
  • the MIA constructs show a significantly higher specific activity than the tyrosinase constructs, e.g.
  • the activity of the MIA promoter is approximately 16 times higher than that of the tyrosinase promoter, it being emphasized here that the tyrosinase promoter constructs according to the invention are suitable, but the MIA promoter constructs are superior.
  • Example 3 Experiments similar to those in Example 3 were carried out.
  • the cell lines tested were the melanoma cell lines SK-Mel-23, UKRV-Mel-6a and MeWo.
  • the results are shown in FIG. 3. It follows that the promoter activity of both the tyrosinase and MIA promoters is increased by multiple copies of the murine tyrosinase enhancer. The maximum promoter strength is achieved with four enhancer elements.
  • the MIA promoter for example, for the melanoma cell line UKRV- Mel-6a increased the activity 10-fold to approximately 19% of the CMV promoter activity. With 5 enhancers, however, the activity of the MIA promoter decreases again.

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Abstract

Beschrieben werden Expressionsvektoren zur gewebespezifischen Expression eines Gens, das für ein cytotoxisches oder 'Prodrug'-aktivierendes Protein codiert, wobei der Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft umfaßt: a) ein oder mehrere gewebespezifische Enhancerelemente, beispielsweise den murinen oder humanen Tyrosinase-Enhancer; b) einen gewebespezifischen Promotor, beispielsweise den Tyrosinase-Promotor oder den 'Melanoma Inhibitory Activity' (MIA)-Promotor; und c) eine für ein cytotoxisches oder 'Prodrug'-aktivierendes Protein, beispielsweise die A-Kette des Diphterietoxins oder Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK), codierende DNA-Sequenz. Diese Vektoren eignen sich zur Behandlung von Tumoren, beispielsweise des malignen Melanoms.

Description

Vektoren zur gentherapeutischen Tumorbehandlung
Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren zur Gentherapie, bevorzugt zur Behandlung von Tumoren, beispielsweise des malignen Melanoms .
Gegenwärtig stützt sich die Tumortherapie im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Che o- und Radiotherapie. Allerdings haben diese Therapien die folgenden gravierenden Nachteile: (a) Sie sind im etastasierenden Krankheitsstadium bzw. als vorbeugende Therapie nach Entfernung des Primärtumors kaum wirksam, d.h. eine Heilung im Metastasierungsstadium ist nicht mehr möglich, (b) sie sind im Bezug auf das klinische Ansprechen, auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls, die Gesamtüberlebenszeit sowie die Lebensqualität des Patienten sehr unzureichend und (c) sie weisen eine Reihe von teilweise schwerwiegenden Nebenwirkungen auf, beispielsweise eine beträchtliche Schädigung von normalem Gewebe .
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Tumortherapie bereitzustellen, die nicht die vorstehend beschriebenen Nachteile der gegenwärtigen Therapieverfahren ausweisen, insbesondere eine gezielte Abtötung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung von gesundem Gewebe erlauben.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausfüh- rungsformen erreicht.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor zur gewebespezifischen Expression eines Gens, das für ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivierendes " Protein codiert, wobei der Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktioneil verknüpft umfaßt: (a) ein oder mehrere gewebespezifische Enhancerelemente, (b) einen gewebespezifischen Promotor und (c) eine codierende DNA-Sequenz für ein cytotoxisches oder "Prodrug-akti- vierendes" Protein.
Der hier verwendete Ausdruck "gewebespezifische Enhancerelemente" bezieht sich auf alle Enhancerelemente, die nur in den gewünschten Zellen bzw. Geweben, d.h. beispielsweise in Tumorzellen bzw. Tumorgewebe und in den nicht malignen Ausgangszeilen, eine Verstärkung der Transkription bewirken. Beispiele für solche gewebespezifische Enhancerelemente sind der humane sowie murine Tyrosinase-Enhancer, die spezifisch in Melanomzellen und Melanocyten aktiv sind. Beide Enhancerelemente sind jedoch nicht sequenzidentisch (für den murinen Enhancer: Genbank-Zugangs- nummer: X76647, siehe auch Ganss et al . , EMBO J. 13 (13) (1994), 3083-3093; für den humanen Enhancer: Genbank-Zugangsnummer: D26163, siehe auch Yasumoto et al . , Mol. Cell Biol . 14(12) (199- 4), S. 8058-8070). Auch für andere Zelltypen wurden Enhancer charakterisiert, die eine gewebespezifische Verstärkung der Transkription vermitteln. So verstärken in Muskelzellen die Enhancer der Gene für Kreatinkinase oder Troponin I gewebsspezi- fisch die Genexpression. In Hepatocyten erfolgt dies durch den Enhancer des Gens für Alpha-Fetoprotein. Der Begriff "Enhancer" bezieht sich auch auf Enhancerelement-Fragmente oder Enhancerelemente mit modifizierten Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind.
Der hier verwendete Ausdruck "gewebespezifischer Promotor" bezieht sich auf alle Promotoren, die nur in den gewünschten Zellen bzw. Geweben, d.h. Tumorzellen bzw. Tumorgewebe und in den nicht malignen Ausgangszeilen, zu einer Genexpression führen. Ein Beispiel für solche gewebespezifische Promotoren ist der murine Tyrosinase-Promotor (Genbank-Zugangsnummer : L46805; vgl. Ganss et al . , EMBO J. 13 (13) (1994), 3083-3093), der nur in Melanomzellen und Melanocyten aktiv ist. Weiter vermitteln u.a. folgende Promotoren eine gewebespezifische Genexpression in Melanocyten und Melanomzellen: Promotor des trp-1 (tyrosinase related protein 1) Gens, Promotor des trp-2 (tyrosinase related protein) Gens, Promotor des MART-1/melanA Gens. Der humane MIA (Melanom Inhibitory Activity) Promotor (Genbank-Zugangsnummer : X84707; vgl. Bosserhoff et al . , J.Biol.Chem. 271 (1996), 490- 495) ist in Melanocyten und Chondrocyten (Knorpelzellen) sowie deren malignen Formen aktiv. Gentherapeutische Konstrukte, die auf der Aktivität des MIA Promotors beruhen, können daher nicht nur zur Behandlung des Melanoms, sondern auch zur Behandlung von Chondrosarcomen eingesetzt werden. Im Sinne der Erfindung verfügen gentherapeutisch nutzbare Promotoren über einen sehr hohen Grad an Zeil- und Gewebespzifität . In der Regel sind diese Promotoren im Tumor und in der entsprechenden Ausgangszeile bzw. in einer sehr begrenzten Zahl an Zelltypen aktiv. Hierzu wird auf die nachfolgende Tabelle verwiesen.
Zelltyp die Promotoren folgender Gene vermitteln eine gewebespezifische Aktivität
Myocyten (Muskelzellen) Kreati kinase, Troponin I, -Actin
Hepatocyten (Leberzellen) Albumin, Alpha-Fetoprotein
Astrocyten (Sternzellen) glial fibrillary acid protein
Endothelzellen von Willebrand Faktor
Der Begriff "Promotor" bezieht sich auch auf Promotor-Fragmente oder Promotoren mit modifizierten Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind.
Der hier verwendete Ausdruck "codierende DNA-Sequenz für ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivierendes " Protein" bezieht sich auf alle DNA-Sequenzen, die ein Genprodukt codieren, das entwe- der für die spezifische Zielzelle direkt toxisch ist oder das eine nicht-toxische Vorstufe einer Chemikalie in eine toxische Substanz umwandelt. Dies führt zur einer Abtötung der Zielzelle, d.h. beispielsweise einer Tumorzelle. Beispiele für solche DNA- Sequenzen sind DNA-Sequenzen, die für die A-Kette des Diphterie- toxins oder die Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK) codieren. Die Aktivität der HSV-TK führt zur intrazellulären Umwandlung eines zusätzlich verabreichten Protoxins zu einem cytotoxischen Reaktionsprodukt, z.B. von zusätzlich verabreichtem Ganciclovir zu GCV-Triphosphat (TP) . Im Gegensatz dazu ist die Expression der funktionellen A-Kette des Diphterietoxins direkt toxisch für die Zelle. Zur Gruppe der therapeutisch nutzbaren Prodrug-aktivierenden Enzyme gehören u.a. die Cytosin Deaminase, die eine Umsetzung von Fluorcytosin zum toxischen 5- Fluoruracil katalysiert; die Nitroreduktase, die das Tumor-inhi- bierende Nitrophenylaziridin CB1954 zu der toxischen Substanz 5 ' -Aziridinyl-4-hydroxylamino-2-nitrobenzamid umsetzt. Weitere Beispiele sind in den nachfolgenden Tabellen gezeigt.
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Die Begriffe "Toxine bzw. Prodrug-aktivierende Proteine" beziehen sich auch auf Fragmente dieser DNA-Sequenzen oder modifizierte Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind, d.h. in der Zielzelle noch zur Expression eines Produkts führen, das (direkt oder indirekt) toxisch ist.
Bei den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren handelt es sich um gentherapeutisch wirksame Konstrukte, die zur therapeutischen, lokalen oder systemischen Behandlung von Tumoren, insbesondere des malignen Melanoms, eingesetzt werden können. Dabei wird durch die Gegenwart des Expressionsvektors in der Krebszelle die Expression eines cytotoxischen oder "Prodrug"-aktivierenden Gen- produkts gewebespezifisch angeschaltet, was zur selektiven Abtötung der Krebszelle führt. Dabei wird die gewebespezifische Expression des cytotoxischen bzw. des "Prodrug"-aktivierenden Genprodukts durch eine selektive Transkriptionskontrolle gewährleistet, die auf der gewebespezifischen Aktivität bestimmter Promotoren und Enhancer beruht. Dabei kommen beispielsweise gewebespezifische Promotoren wie der (murine oder humane) Tyro- sinase-Promotor und der (humane) "Melanoma Inhibitory Activity" (MIA) -Promotor zum Einsatz, deren Aktivität durch (mehrfache) Kopien gewebespezifischer Enhancerelemente, beispielsweise des murinen oder humanen Tyrosinase-Enhancers , verstärkt wird. Durch die Fusion des Promotors mit diesen Enhancern kommt es nach Aufnahme des erfindungsgemäßen Expressionsvektors durch die Zelle zu einer Zeil- bzw. Gewebe-spezifischen und effizienten Expression des cytotoxischen (beispielsweise die A-Kette des Diphtherietoxins ) oder des "Prodrug" -aktivierenden (beispielsweise Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase; HSV-TK) Genprodukts. Die Aktivität der HSV-TK führt bei der Umsetzung eines zusätzlich verabreichten Protoxins (Ganciclovir) zu einem cytotoxischen Reaktionsprodukt. Im Gegensatz dazu ist die Expression der funktioneilen A-Kette des Diphtherietoxins direkt toxisch für die Zelle. Dadurch können Krebszellen, beispielsweise Melanomzellen, bei Verwendung von Enhancerelementen, deren Aktivität auf Melanomzellen/Melanocyten begrenzt ist, sehr selektiv abgetötet werden. Eine Expression der vorstehend be- schriebenen, die cytotoxischen Genprodukte codierenden Gene kann jedoch auch in nicht-malignen Ursprungszellen eines Melanoms, den Melanocyten, erfolgen. Mehrere, vor allem immunologische Untersuchungen zeigten, daß die Zerstörung der (gesunden) Melanocyten nicht mit entscheidenden Nebenwirkungen für den Patienten verbunden ist.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Re- kombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo- Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Ausubel und Frederick (1991) , Current Protocols in Molecular Biology (J.Wi- ley S Sons, New York) beschrieben sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die gewebespezifischen Enhancerelemente des erfindungsgemäßen Expressionsvektors Tyro- sinase-Enhancerelemente, vorzugsweise murine oder humane Tyrosi- nase-Enhancerelemente .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die gewebespezifischen Promotoren des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ein Tyrosinase-Promotor, beispielsweise ein muriner oder humaner Tyrosinase-Promotor, oder ein "Melanoma Inhibitory Activity" (MIA) -Promotor, vorzugsweise der humane MIA-Promotor .
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren codiert die ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivierendes" Protein codierende DNA-Sequenz für die A-Kette des Diphterietoxins (Genbank Acession No . K01722) oder Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK; Genbank Accession No. J02224) ) .
Am meisten bevorzugt sind Expressionsvektoren, bei denen der Tyrosinase-Promotor mit mehreren, beispielsweise mindestens drei, Tyrosinase-Enhancerelementen kombiniert ist oder der MIA- Promotor mit einem oder mehreren Enhancerelementen, beispiels- weise drei oder mehr Tyrosinase-Enhancerelementen, kombiniert ist .
Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können außerdem noch zusätzliche (Signal) Sequenzen enthalten, die eine weitere Optimierung der Genexpression in der Zielzelle bewirken, beispielsweise ein B(ovine)G(rowth)H(ormone) poly-Adenylierungssignal (Woychik et al . , Nucleic Acids Research 10, S. 7197-7210 (1982)- ) . Ein weiteres verwendbares poly-Adenylierungssignal stammt aus der DNA des Simian Virus 40 (SV40; Genbank Accession: J02402, M24874) . Die poly-AdenylierungsSignale verschiedenster Gene sind nutzbar, z.B. polyA-Signal des Herpes Simplex Virus (Genbank Accession No . M12700) oder der humanen neutrophilen Elastase (Genbank Accession: J03545) .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein Plasmid (z.B. pUC19 mit einen ColEl-Repli- kationsursprung) . Für die Herstellung der gentherapeutischen Konstrukte können nahezu alle Plasmide mit singulären Restrik- tionsschnittstellen genutzt werden. Dazu gehören z.B. der Vektor pBr322 (Genbank Accession No . V01119), M13-Vektoren (Genbank Accession No . X02513/L08821 ) oder das pGEM-3Z und das pGEM-4Z Plasmid (Genbank Accession No, X65304, Genbank Accession No. X65305) . Anstelle von "nackter" Plasmid-DNA (z.B. gekoppelt an Trägersubstanzen) können auch virale Vektoren zum Transfer der therapeutischen DNA-Sequenzen in die Zelle eingesetzt werden, beispielsweise ein Retrovirus oder Adenovirus bzw. adenovi- rale Vektoren. Eine sehr effiziente Form der Applikation ist die direkte Injektion der Expressionsplasmide bzw. der viralen Konstrukte in den Tumor, ebenso ist eine systemische Applikation der Konstrukte denkbar. Weitere brauchbare virale Vektoren sind die AAV (Adeno-assoziierte Viren) -Vektoren. Rekombinante Plasmide können in AAVirushüllen verpackt werden. Dieses Prinzip basiert auf der Konstruktion eines infektiösen Plasmids, in dem alle kodierenden viralen Sequenzen deletiert werden und lediglich virale terminale Sequenzwiederholungen erhalten bleiben. Die Expression der ausgewählten Sequenzen (d.h. der therapeuti- sehen Gene) wird ausschließlich durch die ausgesuchten regulatorischen Elemente (gewebespezifischer Enhancer/Promotor) gesteuert und nicht durch virale Sequenzen beeinflußt. Die rekombinan- te DNA gelangt nach Infektion der Zelle in den Zellkern und kann dort in das Genom integrieren. Weiter besonders bevorzugt sind Retroviren. Retroviren sind RNA-Viren, bei denen die viralen Gene von einem einzelsträngigen RNA-Molekül codiert werden. Nach Eintritt in die Wirtszelle wird die virale RNA über reverse Transkription in ein doppeisträngiges DNA-Molekül umgewandelt, im Anschluß daran gelangt diese DNA in den Nucleus und integriert sich in das Wirtsgenom als sogenanntes Provirus, das wiederum die Matritze für die Expression viraler Gene und die Synthese von Virion-RNA ist. Die viralen Genprodukte und die Virion-RNA lagern sich zu einem intakten Virion zusammen, das dann die Zelle wieder verlassen und neue Zellen infizieren kann. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, daß es mittels Retroviren möglich ist, Fremd-DNA in einen gewünschten Organismus einzuschleusen und dort auch zur Expression zu bringen. Somit bieten sich Retroviren grundsätzlich als gutes Vehikel für eine Gentherapie an. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Vorzugsweise sind bei diesen Retroviren die einzelnen DNA-Sequenzen (Enhancer/Promotor/Toxin- codierendes Gen) in den U3-Bereich des LTR des Retrovirus integriert. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al . , Biotechniques 6. (198- 8) , 682) .
Hinsichtlich der Möglichkeiten die Vektoren zu verabreichen, sind beispielsweise zu nennen:
Ballistischer Gentransfer mittels "Gene Gun" : Die Expressionsplasmide werden an Mikroprojektile (z.B. Goldpartikel) gebunden. Die Haut der Patienten wird mit diesen Partikeln unter Anwendung eine speziellen Apparatur (Gene Gun) beschossen. Dabei gelangt die DNA direkt in die Zelle. Gentransfer basierend auf einer Rezeptor-vermittelten Endo- cytose: In diesem Fall wird die DNA an ein Hybridplasmid gekoppelt, wodurch eine gezielte Aufnahme in die Zelle erleichtert werden soll. Das Hybridprotein besteht aus zwei funktioneilen Domänen: einer DNA-bindenden Domäne (zur Kopplung der therapeutisch wirksamen DNA) und einer Liganden-Domäne, die die Bindung an einen zellulären Rezeptor vermittelt und damit den Transport des Vektors über die Zellmembran ermöglicht. Das allgemeine Prinzip wurde durch Wu et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), S. 14338-14342 oder Zenke et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. 87 (1990), S. 3655- 3659 beschrieben und ist auf die gezielte Belieferung von Melanomzellen/Melanoycten übertragbar .
Gentransfer mittels attenuierter Bakterien: Attenuierte Bakterienstämme, die in ihrer Pathogenität deutlich eingeschränkt sind, können ebenfalls als Transfervehikel für den Transport der Plasmide verwendet werden. Beispielsweise sind attenuierte E. Coli-Stämme bekannt, die brauchbar sind. Desweiteren sind attentuierte Listeria monocytogenes oder Salmonella typhimurium Stämme bekannt, die eingesetzt werden können (Dietrich et al . , Nat . Biotechnol . 16 (1998), S. 181-185; Low et al . , Nat. Biotechnol. 17 (1999), S. 37- 41) .
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann außerdem zusätzlich ein Gen enthalten, das einen nachweisbaren phänotypischen Marker codiert, und somit die erfolgreiche Einschleusung in die Zielzelle nachgewiesen werden kann. Geeignete Markergene sind beispielsweise das für Luciferase codierende Gen, LacZ-Gen (kodiert für ß-Galactosidase; Genbank Accesssion No . J01636), cat-Gen (kodiert für Chloramphenicol-Acetyl-Transferase; Genbank Accession No . L29345), gfp-Gen (kodiert für grün-fluoreszierendes Protein; Genbank Accession No . L29345) oder luc-Gen (kodiert für Firefly-Luciferase; Genbank Accession No . E05447).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren enthaltende Wirtszellen, die beispielsweise zur Vermehrung dieser Vektoren dienen können. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli- Stämme HB101, DH1 , xl776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9- Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO- , VERO- , BHK- , HeLa- , COS-, MDCK, 293-, B16-, NIH 3T3-, L929-, DM13- und WI38-Zellen. Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, zur Vermehrung der Plasmide Bakterienzellen zu verwenden und zur Vermehrung viraler Vektoren Säugerzellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt .
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthaltendes Arzneimittel bzw. dessen Verwendung zur Tumortherapie, vorzugsweise zur Therapie des malignen Melanoms. Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Art des Trägers hängt natürlich davon ab, wie der erfindungsgemäße Expressionsvektor verabreicht werden soll. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Schweregrad der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc..
Die Erfindung wird anhand der Figuren näher erläutert:
Fig. la: Konstrukte auf der Basis des Tyrosinase-Promotors
Stromaufwärts des murinen Tyrosinase-Promotors wurden 1-5 Kopien des 200 bp langen murinen Tyrosinase-Enhan- cers kloniert Fig. lb: Konstrukte auf der Basis des MIA-Promotors
Stromaufwärts des humanen MIA-Promotors wurden 1-5 Kopien des 200 bp langen murinen Tyrosinase-Enhancers kloniert
Fig. 2: Darstellung der relativen Aktivität der Enhan- cer/Promotorkonstrukte in der Melanomzellinie MeWo und in der Nicht-Melanomzellinie HeLa
Die relative Aktivität der Konstrukte ist in % CMV- Aktivität angegeben (Aktivität des CMV-CAT-Konstrukts = 100%) .
Tyr : einfacher Tyrosinase-Promotor; Tyr + 1 Enh: Tyrosinase-Promotor kombiniert mit einem Tyrosinase-Enhan- cer; Tyr + 2 Enh: Tyrosinase-Promotor kombiniert mit zwei Tyrosinase-Enhancern; Tyr + 3 Enh: Tyrosinase- Promotor kombiniert mit drei Tyrosinase-Enhancern; Tyr + 4 Enh: Tyrosinase-Promotor kombiniert mit vier Tyrosinase-Enhancern; MIA: einfacher MIA-Promotor; MIA + 1 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit einem Tyrosinase- Enhancer; MIA + 2 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit zwei Tyrosinase-Enhancern; MIA + 3 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit drei Tyrosinase-Enhancern; MIA + 4 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit vier Tyrosinase-Enhancern; MIA + 5 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit fünf Tyrosinase-Enhancern; neg: CAT-Reportergenkonstrukt ohne Promotor
Fig. 3: Darstellung der relativen Aktivität der Enhancer/Promotorkonstrukte in den Melanom-Zellinien SK- Mel-23, UKRV-Mel-6a und MeWo
Die relative Aktivität der Konstrukte ist in % CMV- Aktivität angegeben (Aktivität des CMV-CAT-Konstrukts = 100%) .
Tyr: einfacher Tyrosinase-Promotor; Tyr + 1 Enh: Tyrosinase-Promotor kombiniert mit einem Tyrosinase-Enhan- cer; Tyr + 2 Enh: Tyrosinase-Promotor kombiniert mit zwei Tyrosinase-Enhancern; Tyr + 3 Enh: Tyrosinase- Promotor kombiniert mit drei Tyrosinase-Enhancern; Tyr + 4 Enh: Tyrosinase-Promotor kombiniert mit vier Tyrosinase-Enhancern; MIA (kurz) : einfacher MIA-Promotor (Promotorlänge von 493 bp) ; MIA: einfacher MIA-Promotor (Promotorlänge von 1386 bp) ; MIA + 1 Enh: MIA- Promotor kombiniert mit einem Tyrosinase-Enhancer; MIA + 2 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit zwei Tyrosinase- Enhancern; MIA + 3 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit drei Tyrosinase-Enhancern; MIA + 4 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit vier Tyrosinase-Enhancern; MIA + 5 Enh: MIA-Promotor kombiniert mit fünf Tyrosinase-Enhancern; neg: CAT-Reportergenkonstrukt ohne Promotor
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1: Konstruktion eines MIA Expressionsplasmids Zur Klonierung multipler Kopien des murinen Enhancers stromaufwärts des MIA-Promotors wurde wie folgt vorgegangen: Ausgehend von dem Plasmid phsTyr ( 0.2 ) CAT (Ganss et al . , EMBO J. 13 (13) (1994), S. 3083-3093), auf dem der Tyrosinase-Enhancer stromaufwärts des Tyrosinasepromotors lokalisiert ist, wurden mittels PCR Kopien des Enhancers generiert. Durch die spezifischen, zur Amplifikation verwendeten Primer wurde eine Hindlll Restrik- tionsschnittstelle an dem Promotor-distalen und eine Xhol Schnittstelle an dem Promotor-proximalen Ende des Enhan- cer-Fragments generiert. Unmittelbar stromabwärts der Hindlll Schnittstelle wurde ebenfalls eine Sall Erkennungssequenz eingeführt. Das Amplifikat wurde mit den Enzymen Hindlll und Xhol restringiert. Anschließend wurde es in das mit Hindlll und Sall behandelte MIA Plasmid (CAT-MIA-1386 ; Bosserhoff et al . , J. Biol. Chem. 271 (1996), S. 490-495) stromaufwärts des MIA Promoters kloniert. Das resultierende Plasmid mit einer Kopie des Enhancers wurde nachfolgend mit Hindlll/Sall restringiert, so daß stromaufwärts des Enhancers ein weiterer Enhancer (Hindlll/Xhol restringiert) eingefügt werden konnte. Auf diese Weise wurden multiple Kopien des Enhancers stromaufwärts des Promotors eingefügt . Beispielsweise ist ein Konstrukt, das multiple Kopien des Tyrosinase Enhancers stromaufwärts des MIA-Promotors enthält, in Fig. lb gezeigt.
PrimerSequenzen
Primer zur Amplifizierung des murinen Tyrosinase-Enhancers: Einbau einer Hindlll/Sall Schnittstelle (unterstrichen in AP-Ty- r-1-2) und eines Xhol Schnittstelle (unterstrichen in AP-Tyr-2); Sequenzanteile des Enhancers sind hervorgehoben.
AP-Tyr-1-2 (sense primer)
5 ' -ACC TAA GCT TGT CGA CGA TTC CTG CCA GCT GAC TTT GTC AAG -3 '
Hindlll Sall
AP-Tyr-2 (antisense primer)
5 ' -GTT ACT CGA GTG CCA GGA CCC CAG CAG AAG CAG CTG ACA C -3 '
Xhol
PCR Bedingungen :
Initiale Denaturierung: 94°C, 2 Min.
35 Zyklen: Denaturierung 94°C 1 Min.
Annealing 55°C 1 Min.
Elongation 72°C 1 Min. finale Elongation: 72°C 10 Min.
Die Aktivität der so konstruierten Enhancer/
Promotorkombinationen wurde in vitro getestet. Die Aktivitäts- bestimmung erfolgte anhand der Expression des CAT-Reportergens in verschiedenen Melanom- und Nicht-Melanomzellinien. Die Daten einer Messung sind hier anhand zweier Melanomzellinien und einer Nicht-Melanomzellinie exemplarisch dargestellt.
Figure imgf000015_0001
Trans riptionelle Aktivität verschiedener Enhancer/ Promotor Kombinationen : Die transkriptionelle Aktivität der Enhancer/ Promotor Konstrukte MIAIII ( 3 f acher muriner Enhancer + MIA Promotor) und MIAIV (4facher muriner Enhancer + MIA Promotor) wurde im Vergleich zu MIA1386 (MIA Promotor ohne Enhancer) bestimmt . Die Aktivitätsbestimmung erfolgte anhand der Expression des CAT Reportergens in den Melanomzellinien MeWo und UKRV-Mel-06a sowie in der Nicht-Melanomzellinie KB .
Die Aktivität der Enhancer/Promotor Konstrukte wurde anhand von Reportergens tudien bestimmt . Ausgehend von den Reportergenkon- strukten werden die therapeutisch wirksamen Expressionsplas ide hergestel l t . Unter Verwendung spezifischer Primer wurden mittels PCR Kopien der therapeutischen Gene generiert , die eine Klonie- rung der Fragmente stromabwärts der Enhancer/Promotorregion im Austausch gegen das Reportergen ermöglichen . Stromabwärts des therapeutischen Gens wird das BGH poly-Adenylierungssignal ein¬ gefügt . Mittels PCR wurden solche zur Klonierung geeigneten BGH DNA Fragmente generiert .
Primersequenzen
Primer zur Amplif i zierung des Gens kodierend für die A-Kette des Diphtherietoxins : Einbau einer BamHI-Schnittstelle (unterstri¬ chen in DiphBam-5 ) und eines Sacl Schnittstelle (unterstrichen in DiphSac-3 ) ; Sequenzanteile der A-Kette des Diphtherietoxin- gens sind hervorgehoben .
DiphBam-5 ( sense primer)
5 ' - ATT AGG ATC CCC ATG GAT CCT GAT GAT GTT GTT GAT TC - 3 BamHI
DiphSac-3 (antisense primer)
5 ' - ATT AGA GCT CGG TTC CTT CAC AAA GAT CGC CTG ACA CG - 3 '
Sacl
Primer zur Amplifizierung des BGH poly-Adenylierungssignals : Einbau einer Sacl Schnittstelle (unterstrichen in BGHSac-5) und eines EcoRI Schnittstelle (unterstrichen in BGHEco-3); Sequenzanteile der BGH-Signals sind hervorgehoben.
BGHSac-5 (sense primer)
5'- CCG AAA GAG CTC TCA GCC TCG ACT GTG CCT TCT AGT TG-3 '
Sacl
BGHEco-3 (antisense primer)
5 ' - CCg AAA GAA TTC CCC ACC GCA TCC CCA GCA TGC CTG CT - 3 '
EcoRI
PCR Reaktionsbedingungen:
Initiale Denaturierung: 94°C, 3 Min.
30 Zyklen: Denaturierung 94°C 0,5 Min.
Annealing 55°C 1 Min.
Elongation 72°C 1,5 Min. finale Elongation: 72°C 7 Min.
In einem weiteren Ansatz wird mittels einer positiven Rückkopp- lungsschleife (feed back loop) eine verstärkte Expression des Gens kodierend für die "Prodrug" -aktivierende Herpes simplex Virus Thymidinkinase erzielt. Dieser Ansatz beruht auf- Anordnung folgender DNA-Sequenzen auf dem Plasmid pUC19 (Genbank Access- sion No. X02514) :
GAL4 DNA Bindungssequenz gewebespezifische Enhancersequenz (Tyrosinase-Enhancer) gewebespezifische Promotorsequenz (MIA Promotor) therapeutisches Gen HSV-TK IRES (internal ribosome entry site)
Gen eines Hefe-spezifischen Transkriptionsaktivators (z.B. GAL4)
SV40 poly-Adenylierungssignal
Die gewebespezifische Enhancer/Promotorkombination wird in den Tumorzellen aktiviert. Dies führt zur Transkription des therapeutischen Gens und des nachgeschalteten Gens, das für einen Hefe-spezifischen Transkriptionsaktivator kodiert, in Form einer gemeinsamen RNA. Durch die IRES (Internal ribosome entry-site)- Sequenz, die vorzugsweise vom Encephalomyocarditis Virus (Jackson et al., Trends Biochem. Sei. 15 (1990), S. 477-483; Accesssion No. X87335, AJ000154) stammt, können beide Kodierregionen unabhängig voneinander translatiert werden. Das Gal4 Protein bindet wiederum an eine spezifische Erkennungssequenz , die stromaufwärts der gewebespezifischen Enhancer/Promotor-Kombination lokalisiert ist und führt somit zu einer weiteren Transkrip- tionsSteigerung .
Beispiel 2 : Konstruktion eines Tyrosinase Expressionsplasmids Zur Klonierung multipler Kopien des murinen Tyrosinase Enhancers stromaufwärts des Tyrosinase-Promotors wurde wie folgt vorgegangen: Aus dem MIA-Expressionsplasmid (s. Beispiel 1) wurden der einfache Enhancer bzw. multiple Kopien des Enhancers mittels Xbal und Sall Restriktion ausgeschnitten. Die Enhancer-Fragmente wurden dann in das mit Xbal und Sall restringierte Plasmid PCAT (Ganss et al . , EMBO J. 13(3) (1994), S. 3083-3093) stromaufwärts des Tyrosinase Promotors kloniert.
Beispielsweise ist ein Konstrukt, das multiple Kopien des Tyrosinase Enhancers stromaufwärts des Tyrosinase-Promotors enthält, in Fig. la gezeigt.
Beispiel 3 : Untersuchung der Zelltypspezifität der Enhancer/Promotorkonstrukte
Die Aktivität der Enhancer/Promotorkonstrukte (Tyrosinase-Pro- motor + 1-5 Tyrosinase-Enhancerelemente; MIA-Promotor + 1-5 Tyrosinase-Enhancerelemente) wurde in Transfektionsexperimenten anhand der Expression des CAT-Reportergens in verschiedenen Melanom- und Nicht-Melanomzellinien gemäß Standardmethoden (Bosserhoff et al., J. Biol. Chem. 271(1) (1996), S. 490-495; Bruhn et al., Proc. Natl . Acad. Sei. USA 90(20), (1993), S. 9707-9711) getestet.
Um die CAT-Expression in verschiedenen Zellinien miteinander vergleichen zu können, wurde innerhalb einer Zellinie die Aktivität der einzelnen Konstrukte jeweils auf die Aktivität des CMV-Promotors (Positivkontrolle) bezogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Sowohl die Aktivität des Tyrosinase- als auch des MIA-Promotors ist zelltypspezifisch, d.h. das nachgeschaltete Reportergen wird nur in Melanom-, aber nicht in Kontroll- zellinien (z.B. HeLa) , exprimiert. Diese Zelltypspezifität bleibt auch bei den Enhancer-Konstrukten erhalten. Die MIA-Konstruk- te zeigen eine deutlich höhere spezifische Aktivität als die Tyrosinase-Konstrukte, z.B. ergibt sich beim Vergleich der Pro- motorkonstrukte mit 3 Enhancern im Falle der Melanom-Zellinie MeWo eine etwa 16-fach höhere Aktivität des MIA-Promotors gegenüber dem Tyrosinase-Promotor, wobei hier betont werden soll, daß auch die Tyrosinase-Promotor-Konstrukte erfindungsgemäß geeignet sind, aber die MIA-Promotor-Konstrukte aber überlegen sind.
Beispiel 4: Steigerung der Promotorstärke durch mehrere Enhancer-Kopien
Es wurden ähnliche Experimente wie in Beispiel 3 ausgeführt. Die getesteten Zellinien waren die Melanom-Zellinien SK-Mel-23, UKRV-Mel-6a und MeWo. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Daraus ergibt sich, daß die Promotoraktivität sowohl des Tyrosinase- als auch des MIA-Promotors durch mehrere Kopien des murinen Tyrosinase-Enhancers gesteigert wird. Die maximale Promotor- stärke wird mit vier Enhancer-Elementen erreicht. Im Falle des MIA-Promotors ergibt sich z.B. für die Melanom-Zellinie UKRV- Mel-6a eine Aktivitätssteigerung um das 10-fache auf etwa 19% der CMV-Promotoraktivität. Mit 5 Enhancern nimmt die Aktivität des MIA-Promotors dagegen wieder ab.

Claims

Patentansprüche
Expressionsvektor zur gewebespezifischen Expression eines Gens, das für ein cytotoxisches oder "Prodrug-aktivieren- des" Protein codiert, wobei der Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft umfaßt: a) ein oder mehrere gewebespezifische Enhancerelemente; b) einen gewebespezifischen Promotor; und c) eine codierende DNA-Sequenz für ein cytotoxisches oder " Prodrug-aktivierendes " Protein .
Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die gewebespezi- fischen Enhancerelemente Tyrosinase-Enhancerelemente sind.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der gewebespezifische Promotor ein Tyrosinase-Promotor oder ein "Melanoma Inhibitory Activity" (MIA) -Promotor ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die für ein cytotoxisches oder "Prodrug" -aktivierendes Protein codierende DNA-Sequenz die A-Kette des Diphtherietoxins oder Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK) codiert .
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der zusätzlich eine BGH-Polyadenylierungsstelle enthält.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Vektor ein Plasmid, ein Adenovirus, ein Adeno-assozi- ierter Virus (AAV) oder ein Retrovirus ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der zusätzlich ein Gen enthält, das einen nachweisbaren phäno- typischen Marker codiert.
Zelle, den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend.
9. Zelle nach Anspruch 8, die eine Tierzelle ist.
10. Zelle nach Anspruch 9, die eine Säugerzelle ist.
11. Verwendung des Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Tumortherapie.
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Tumortherapie die Therapie des malignen Melanoms ist.
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