DE60038631T2

DE60038631T2 - Modulatoren und inhibitoren von angiogenese und vaskulärer durchlässigkeit

Info

Publication number: DE60038631T2
Application number: DE60038631T
Authority: DE
Inventors: David A. Encinitas CHERESH; Brian Carlsbad ELICEIRI; Robert Paul
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: EP1250155B1; HUP0203957A3; DK1250155T3; KR100813818B1; AU2740001A; CZ304320B6; CA2395136A1; NO20023036L; ATE553782T1; CN1434727A; EP1250155A4; HU229628B1; HUP0203957A2; PL356815A1; JP2003518077A; ATE392215T1; ES2383763T3; RU2271216C2; SK287575B6; PT1905457E

Description

Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der U. S.-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 09/470,881, eingereicht am 22. Dezember 1999, und 09/538,248, eingereicht am 29. März 2000, die beide die Priorität der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US99/11780 beanspruchen, die die Vereinigten Staaten von Amerika bestimmt, am 28. Mai 1999 eingereicht wurde und die Priorität der vorläufigen U. S.-Patentanmeldung Nr. 60/087,220, eingereicht am 29. Mai 1998, beansprucht.
Angaben bezüglich Regierungsrechten
Ein Teil der beschriebenen Arbeit wurde teilweise durch eine Förderung des NIH im Namen der Vereinigten Staaten von Amerika unterstützt. Daher kann die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika bestimmte Rechte an der Erfindung haben.
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Medizin und insbesondere Zusammensetzungen für ein Modulieren und Hemmen von Gefäßpermeabilität (VP).
Hintergrund
Angiogenese ist ein Vorgang der Gefäßvaskularisation, der das Wachstum von sich neu entwickelnden Blutgefäßen in ein Gewebe einbezieht und auch als Neo-Vaskularisation bezeichnet wird. Der Vorgang wird durch die Infiltration von Endothelzellen und glatten Muskelzellen vermittelt. Es wird vermutet, dass der Vorgang auf einem der drei Wege fortschreitet: die Gefäße können aus vorbestehenden Gefäßen auswachsen, Neuentwicklung von Gefäßen kann aus Vorläuferzellen entstehen (Vasculogenese), oder bestehende kleine Gefäße können sich hinsichtlich des Durchmessers vergrößern; Blond et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89–118 (1990). Damit eine Angiogenese auftritt, müssen Endothelzellen zuerst die Blutgefäß-Basalmembran in einer Art und Weise, die zu der von Tumorzellen während einer Invasion und Metastasenbildung ähnlich ist, abbauen und sie überqueren. Angiogenese fehlt im Allgemeinen bei erwachsenen oder reifen Geweben, obwohl sie während einer Wundheilung und in dem Wachstumszyklus des Corpus luteum auftritt; vgl. beispielsweise Moses et al., Science, 248: 1408–1410 (1990).
Obwohl Angiogenese ein wichtiger Vorgang bei dem Wachstum von Neugeborenen ist, ist sie auch bei der Wundheilung wichtig und ist ein Faktor bei der Pathogenese einer großen Vielzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich Gewebeentzündung, Arthritis, Tumorwachstum, diabetischer Retinopathie, Makulardegeneration durch Neovaskularisierung der Retina und ähnlicher Zustände. Diese klinischen Manifestationen, die mit Angiogenese assoziiert sind, werden als angiogenetische Erkrankungen bezeichnet; Folkman et al., Science, 235: 442–447 (1987).
Es wurde vorgeschlagen, dass eine Hemmung von Angiogenese eine hilfreiche Therapie für eine Begrenzung von Tumorwachstum wäre. Es wurde vorgeschlagen, Angiogenese durch (1) Hemmen der Freisetzung von "angiogenetischen Molekülen" wie bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor), (2) Neutralisieren von angiogenetischen Molekülen wie durch Verwendung von Anti-βFGF-Antikörpern, (3) Verwendung von Inhibitoren des Vitronectin-Rezeptors α_vβ₃ und (4) Hemmen der Reaktion von Endothelzellen auf angiogenetische Reize zu hemmen. Die letztere Strategie erregte Aufmerksamkeit. Folkman et al., Cancer Biology, 3: 89–96 (1992) beschrieben mehrere Hemmstoffe der Endothelzellenreaktion, einschließlich Collagenase-Inhibitor, Basalmembran-Umsatz-Inhibitoren, angiostatischer Steroide, von Pilzen abgeleiteter Angiogenese-Inhibitoren, Blutplättchenfaktor 4, Thrombospondin, Arthritis-Arzneistoffe wie D-Penicillamin und Goldthiomalat, Vitamin D₃-Analoga, Alpha-Interferon und dergleichen, die verwendet werden könnten, um Angiogenese zu hemmen. Bezüglich weiterer vorgeschlagener Hemmstoffe der Angiogenese wird auf Blond et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89–118 (1990), Moses et al., Science, 248: 1408–1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59: 44–51 (1988) und die US-PSen 5,092,885 , 5,112,946 , 5,192,744 , 5,202,352 , 5,753,230 und 5,766,591 verwiesen. Keiner der Hemmstoffe der Angiogenese, die in den vorstehenden Literaturstellen beschrieben sind, bezieht jedoch die Src-Proteine ein.
Es wurde zuvor beschrieben, dass Angiogenese von der Wechselwirkung zwischen Gefäßintegrinen und extrazellulären Matrixproteinen abhängt; Brooks et al., Science, 264: 569–571 (1994). Des Weiteren wurde beschrieben, dass ein programmierter Zelltod (Apoptose) von angiogenetischen Gefäßzellen durch die Wechselwirkung, die durch bestimmte Antagonisten des Gefäßintegrins a_vβ₃ gehemmt werden würde, ausgelöst wird; Brooks et al., Cell, 79: 1157–1164 (1994). In jüngerer Zeit wurde beschrieben, dass die Bindung von Matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) an den Vitronectin-Rezeptor (α_vβ₅) durch Verwendung von α_vβ₅-Antagonisten gehemmt werden kann, wodurch die enzymatische Funktion der Proteinase gehemmt wird; Brooks et al., Cell, 85: 683–693 (1996). Die α_v-Integrine wurden als wichtige Komponenten bei dem Überleben von Endothelzellen in angiogenetischen Blutgefäßen identifiziert. Spezifische Integrin-α_v-Integrin-Antagonisten blocken bestimmte Wachstumsfaktorinduzierte Angiogenesewege. Zum Beispiel wird die Gefäßendothel-Wachstumsfaktor(VEGF)-induzierte Angiogenese durch Integrin-α_vβ₅-Antagonisten blockiert, während die basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor(bFGF)-induzierte Angiogenese durch Integrin-α_vβ₃-Antagonisten blockiert wird.
Das Gefäßsystem im Gehirn zeichnet sich durch eine hochgradig restriktive Blut-Hirn-Schranke aus, die verhindert, dass kleine Moleküle in das umgebende Hirngewebe austreten. Der Aufbau der Blut-Hirn-Schranke bei Säugern war in pharmakologischen Untersuchungen von besonderem Interesse, da aufgrund der hochgradig restriktiven Blut-Hirn-Schranke viele Arzneistoffe routinemäßig daran gehindert werden, von den Gefäßen in die Hirngewebe überzutreten. Die vorliegende Erfindung betrifft die unerwartete Feststellung, dass VP durch Src oder Yes moduliert werden kann, wie durch Durchsickern von Blut durch Gefäße gemessen wurde. Des Weiteren wurde VP mit Angiogenese und anderen Pathologien in Zusammenhang gebracht. Eine durch Entzündung induzierte erhöhte Gefäßpermeabilität ist mit Ödem und Schwellung assoziiert.
Ein Erfordernis bezüglich Src-Tyrosinkinase-Aktivität für VEGF-, jedoch nicht bFGF-induzierte Angiogenese, zeigte, dass signifikante Unterschiede hinsichtlich Regulations- und Aktivierungssignalen zwischen diesen Wegen sowohl in Hühnerembryo- als auch Mäusemodellen vorliegen; Eliceiri et al., Molecular Cell, 4: 915–924 (1999).
Veränderungen der Gefäßpermeabilität aufgrund angiogenetischer Signale aus Tumorzellen stellten ein Modell für eine Untersuchung der Signalwege, die mit Krebs in Beziehung stehen, bereit. Jedoch ist Gefäßpermeabilität aufgrund von Verletzung, Erkrankung oder einem anderen Trauma der Blutgefäße eine Hauptursache von Gefäßdurchlässigkeit und Ödem, das mit Gewebeverletzung assoziiert ist. Zum Beispiel sind cerebrovaskuläre Erkrankungen, die mit Schlaganfall (CVA) assoziiert sind, oder eine andere Gefäßverletzung in den Hirn- oder Wirbelsäulengeweben die häufigste Ursache für eine neurologische Erkrankung und eine Hauptquelle für Invalidität. Typischerweise bezieht eine Schädigung des Hirn- oder Wirbelsäulengewebes in der Region eines CVA ein Durchsickern durch Gefäße und/oder Ödem ein. Typischerweise kann CVA eine durch Gehirnischämie verursachte Verletzung, eine Unterbrechung des normalen Blutflusses zu dem Gehirn, eine cerebrale Insuffizienz aufgrund transienter Störungen des Blutflusses, einen Infarkt aufgrund Embolie oder Thrombose der intra- oder extrakranialen Arterien, eine Blutung und arteriovenöse Fehlbildungen umfassen. Ischämischer Schlaganfall und cerebrale Blutung können sich abrupt entwickeln und die Auswirkung des Vorfalls spiegelt im Allgemeinen den verletzten Gehirnbereich wieder (vgl. The Merck Manual, 16. Auflage, Kapitel 123, 1992).
Abgesehen von CVA können Infektionen oder Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) auch die Blutgefäße des Gehirns und der Wirbelsäule beeinflussen und können Entzündung und Ödem einbeziehen, wie es beispielsweise bei bakterieller Meningitis, viraler Enzephalitis und einer Gehirnabszessbildung der Fall ist (vgl. The Merck Manual, 16. Auflage, Kapitel 125, 1992). Systemische Erkrankungszustände können auch Blutgefäße schwächen und zu einem Durchsickern durch Gefäße und Ödem führen, wie es bei Diabetes, Nierenerkrankung, Atherosklerose und dergleichen der Fall ist. Somit sind ein Durchsickern durch Gefäße und Ödem kritische Pathologien, die von Krebs verschieden und davon unabhängig sind und ein wirksames spezifisches therapeutisches Eingreifen im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Verletzungs-, Trauma- oder Erkrankungszuständen bedürfen.
Wir haben festgestellt, dass eine selektive Hemmung der Src-Familie-Tyrosinkinase-Aktivität Verletzung oder Trauma verringert, die/das mit einer VP-Zunahme in Geweben assoziiert ist, und zu einer Linderung der Pathologie führt, die mit Durchsickern durch Blutgefäße und/oder Ödem in Beziehung steht.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erfindungsgemäßer Aspekt umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Src fähig ist, und eine Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Yes fähig ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die exprimierbaren Nukleinsäuren, die für Src- oder Yes-Protein kodieren, können Nukleinsäuresegmente umfassen, die das Yes- oder Src-Protein vollständig oder teilweise beschreiben. Bei einem Transfer in Zielzellen transkribiert und translatiert die Zielzelle die Nuldeinsäuresequenz, um das gewünschte Protein zu exprimieren.
Falls die Modulation eine Verstärkung oder Erhöhung der vaskulären Permeabilität der Blutgefäße in dem Zielgewebe ist, wird die Src-kodierende Nukleinsäure für aktive Formen von Src kodieren und die Yes-kodierenden Nukleinsäuren werden für aktive Formen von Yes-Kinase-Proteinen kodieren. Nach einem Transfer in die Ziel-Wirtszelle werden die Nukleinsäuren durch die Wirtszelle exprimiert werden. Eine bevorzugte Src-kodierende Nukleinsäure kodiert für aktives Src A-Protein. Eine weitere bevorzugte Src-kodierende Nukleinsäure kodiert für ein mutiertes aktives Src, bei dem der Aminosäurerest an der Position 527 des exprimierten Src-Proteins ein jeglicher Aminosäurerest mit der Ausnahme von Tyrosin, Serin oder Threonin ist. Eine bevorzugte Yes-kodierende Nukleinsäure wird für das Wildtyp-Protein oder ein Protein kodieren, das dahingehend modifiziert ist, um die inaktivierende Phosphorylierungsstelle des Yes-Proteins in einer Art und Weise, die ähnlich zu der der beschriebenen Src-Position 527-Mutation ist, zu beseitigen oder zu hemmen.
Falls die gewünschte Modulation eine Hemmung oder Verringerung der Gefäßpermeabilität der Blutgefäße in dem Zielgewebe ist, kodiert eine bevorzugte inaktives Src-kodierende Nukleinsäure für Src 251-Protein. Eine weitere bevorzugte inaktives Src-kodierende Nukleinsäure kodiert für inaktives Src-K295M. Eine bevorzugte inaktives Yes-kodierende Nukleinsäure wird für ein Protein kodieren, das eine verringerte Kinase-Aktivität aufweist.
Es ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein Gemisch aus Nukleinsäuren umfassen können, wobei jede Nukleinsäure ein exprimierbares Src- oder Yes-Gen umfassen kann. Des Weiteren ist vorgesehen, dass eine einzelne Nukleinsäure sowohl eine Nukleinsäure, die für ein Src-Protein kodiert, als auch ei ne Nukleinsäure, die für ein Yes-Protein kodiert, umfassen kann. Für eine verfeinerte Modulation von Angiogenese und VP in Zielgeweben können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ein Gemisch aus Nukleinsäuren umfassen, die in der Lage sind, aktives oder inaktives Tyrosinkinase-Protein Src oder Tyrosinkinase-Protein Yes zu exprimieren.
Durch Verwendung unterschiedlich exprimierbarer Promotoren oder anderer solcher regulatorischer Elemente kann ein erstes niedrig exprimierendes Gen, das für eine erste Tyrosinkinase kodiert, zusammen mit einem zweiten hoch exprimierenden Gen, das für eine zweite Tyrosinkinase kodiert, gemäß der erfindungsgemäßen Lehre verabreicht werden. In dieser Ausführungsform kann eine Zunahme der Angiogenese erreicht werden, während ebenfalls VP aufrecht erhalten, minimiert oder verringert wird, dadurch, dass ein erstes niedrig exprimierendes aktives Src-Gen in Kombination mit einem zweiten hoch exprimierenden inaktives Yes-Gen verwendet wird. Diese gemeinsame Verabreichung kann durch eine Verwendung getrennter Expressionsvektoren oder eines einzigen kombinierten Expressionsvektorkonstrukts erreicht werden. In ähnlicher Weise kann eine Verringerung der Angiogenese erreicht werden, während VP aufrecht erhalten, verstärkt oder erhöht wird, dadurch, dass ein erstes niedrig exprimierendes inaktives Src-Gen in Kombination mit einem zweiten hoch exprimierenden aktives Yes-Gen verwendet wird. Ein weiterer Grad einer Modulation kann durch die verschiedenen Permutationen von hoch/niedrig und src/yes in Kombination mit einer Auswahl der Aktivität von Promotorelementen und induzierbaren Promotoren erreicht werden.
Es ist vorgesehen, dass sich die einzelnen src- und yes-Gene unter der regulatorischen Kontrolle gleicher oder verschiedener regulatorischer Nukleinsäuresequenzen wie in nicht begrenzender Weise Enhancer, Repressoren und Promotorelemente befinden können. Wenn zwei oder mehrere Proteine von einem einzelnen Vektor exprimierbar sind, ist vorgesehen, dass sich die Regulation und Steuerung der Transkription der unabhängigen Proteingene unter der Kontrolle der gleichen regulatorischen Elemente befinden kann. Es ist auch vorgesehen, dass eine Regulation und Steuerung der Transkription durch zwei oder mehr unabhängig voneinander arbeitende regulatorische Elemente erfolgen kann. Regulatorische Elemente sind bekannt und können konstitutiv aktive oder induzierbare Enhancer-, Promotor-, Suppressor-Nukleinsäuresequenzen oder dergleichen sein.
Es ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Zusammensetzungen virale und/oder nicht-virale Gentransfervektoren mit einem Nukleinsäuresegment, das für ein Src- und/oder Yes-Protein kodiert, umfassen können. Retrovirale und nicht-virale Gentransfer- und Expressionsvektoren sind bekannt und nachstehend kurz beschrieben.
Eine bevorzugte Nukleinsäure kodiert für Src-A-Protein. Ein weiteres bevorzugtes aktives Src-Protein ist ein Protein, bei dem der Aminosäurerest an der Position 527 des Src-Proteins ein jeglicher Aminosäurerest mit der Ausnahme von Tyrosin, Serin oder Threonin ist.
Es ist auch gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass ein Gemisch aus Nukleinsäure, das für Src- und Yes-Protein kodiert, aktive und inaktive Formen des Proteins kombinieren kann, abhängig von dem Grad einer erwünschten Modellierung und der erwünschten koordinierten Wirkung auf Angiogenese und VP.
Falls das Src- oder Yes-Protein inaktiviert oder gehemmt wird, ist die Modulierung eine Hemmung von VP. Falls das Src- oder Yes-Protein aktiv oder aktiviert ist, ist die Modulierung eine Verstärkung von VP.
Falls die erwünschte therapeutisch wirksame VP-modulierende Wirkung eine Erhöhung oder Verstärkung von VP ist, ist vorgesehen, dass Nukleinsäuren, die für aktive Formen von Src-Protein und/oder Yes-Protein kodieren, verabreicht werden können.
Das zu behandelnde Gewebe kann ein jegliches Gewebe sein, bei dem eine Modulierung von VP erwünscht ist. Eine therapeutische Behandlung wird durch In-Kontakt-Bringen des Zielgewebes mit einer wirksamen Menge der gewünschten modulierenden Zusammensetzung erreicht und es wird für eine ausreichende Kontaktierungszeit gesorgt, damit die Nukleinsäure-Bestandteile des Pharmazeutikums in das Zielgewebe eintreten. Bezüglich einer VP-Hemmung ist es günstig, erkranktes Gewebe zu behandeln, bei dem ein schädliches Durchsickern durch Gefäße auftritt. Beispielhafte Gewebe umfassen entzündetes Gewebe, Gewebe, die mit Schlaganfall, Myokardinfarkt oder einer anderen Blockierung des normalen Flusses assoziiert sind, Gewebe, die Restenose durchlaufen, und ähnliche Gewebe.
Bezüglich einer Verstärkung ist es günstig, Patienten mit ischämischen Extremitäten, bei denen eine schlechte Zirkulation in den Extremitäten aufgrund Diabetes oder anderer Zustande auftritt, oder für ein Verstärken der Verabreichung von Arzneimitteln an das Gehirn über die Blut-Hirn-Schranke zu behandeln. Patienten mit chronischen Wunden, die nicht heilen und daher von der Erhöhung der Gefäßzellproliferation und Neovaskularisierung wie durch VP moduliert, profitieren könnten, können auch behandelt werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfasst die Verwendung einer Nukleinsäure, die zur Expression eines inaktiven Tyrosinkinase-Proteins Yes oder eines Gemisches von inaktiven Tyrosinkinase-Proteinen Src und Yes fähig ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung eines pathologischen Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Schlaganfallinduzierten Schädigungen, Wachstum von Tumoren, Myokardinfarkt, Arteriosklerose, Gehirnödem, cerebrovaskulärer Erkrankung oder cerebrovaskulärem Trauma, rheumatoider Arthritis, diabetischer Retinopathie, entzündlichen Erkrankungen, Restenose, Hirnblutung, Gehirn- und Wirbelsäulentrauma, Hypoxie-induzierter Gehirn- und Wirbelsäulenverletzung, entzündlichen Erkrankungen des ZNS, viralen oder bakteriellen Infektionen des ZNS, Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit einer chronischen Zunahme der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke und akutem progressivem Lungenversagen (ARDS), durch Hemmen von Gefäßpermeabilität in einem Zielgewebe.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer Nukleinsäure, die zur Expression eines aktiven Tyrosinkinase-Proteins Yes oder eines Gemisches von aktiven Tyrosinkinase-Proteinen Src und Yes fähig ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung eines pathologischen Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ischämischen Extremitäten und chronischen Wunden, durch Verstärken von Gefäßpermeabilität in einem Zielgewebe.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt sind Herstellungsartikel, die Verpackungsmaterial und eine in dem Verpackungsmaterial enthaltene pharmazeutische Zusammensetzung umfassen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulierung von Gefäßpermeabilität in einem Gewebe, das an einem Erkrankungszustand leidet, fähig ist, das Verpackungsmaterial einen Hinweis umfasst, der anzeigt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Behandlung von Erkran kungszuständen durch Modulierung von Gefäßpermeabilität verwendet werden kann, und die pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge einer Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Yes fähig ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Diese Ausführungsform umfasst Nukleinsäuren, die für aktives oder inaktives Yes-Protein kodieren. Sowohl retrovirale, als auch nicht-virale Gentransfer-/Expressionsvektoren können ein Nukleinsäuresegment enthalten, das für Yes-Protein in der aktiven oder inaktiven Form oder beides kodiert. Wenn sowohl aktive, als auch inaktive Formen eines Proteinkinase-Gens vorhanden sind, ist vorgesehen, dass die Gene unter getrennter Regulierung durch induzierbare Promotoren stehen, um wie gewünscht eine alternierende Expression zu ermöglichen.
In ähnlicher Weise betrifft ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt Herstellungsartikel, worin die pharmazeutische Zusammensetzung eine Nuldeinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Src und Yes fähig ist, in einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfasst. Ein bevorzugter Nukleinsäure-Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung dieses Herstellungsartikels kodiert für ein aktives Src-Protein, falls die erwünschte Modulierung eine Verstärkung oder Aktivierung von VP ist. Weiter vorgesehen sind Nukleinsäuren, die für aktives Yes-Protein kodieren. Ein bevorzugtes aktives Src ist Src-A-Protein. Eine weitere bevorzugte aktives Src-kodierende Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, bei der der Aminosäurerest an der Position 527 des Src-Proteins ein jeglicher Aminosäurerest mit der Ausnahme von Tyrosin, Serin oder Threonin ist. Es ist auch vorgesehen, dass eine einzige Nukleinsäure hergestellt werden kann, die sowohl Yes als auch Src exprimieren wird, entweder unabhängig reguliert oder unter der transkriptionellen Kontrolle der gleichen Promotor-, Enhancer-, Suppressor-, Repressor- oder einer anderen geeigneten regulatorischen Nukleinsäuresequenz.
Gewebeverletzung, die mit einem Durchsickern durch Gefäße und/oder Ödem, das mit schädlichen Veränderungen der Gefäßpermeabilität assoziiert ist, in Beziehung steht, kann durch einen Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor gelindert werden. Gewebeverletzung aufgrund eines Durchsickerns durch Gefäße oder Ödem kann in dieser Art und Weise verringert werden.
Eine jegliche Pathologie, die eine schädliche Verletzungs-induzierte Zunahme der Gefäßpermeabilität und Gewebeverletzung aufgrund eines Durchsickerns durch Gefäße oder Ödem einbezieht, kann erfindungsgemäß behandelt werden. Solche pa thologischen Ereignisse können Trauma der Blutgefäße wie physikalische Ligatur, Blockierung, Trennung, Verschluss, Trauma und dergleichen umfassen. Andere systemische pathologische Ereignisse wie Atherosklerose, diabetische Retinopathie, entzündliche Erkrankung aufgrund Infektion durch mikrobielle Mittel, Arthritis und dergleichen werden auch in geeigneter Weise erfindungsgemäß behandelt.
Die Erfindung ist für ein Behandeln von cerebrovaskulärer Erkrankung oder Trauma durch ein Lindern von damit assoziierter Gewebeschädigung aufgrund einer Zunahme eines Durchsickerns durch Gefäße und/oder Ödem geeignet. Insbesondere ist die Erfindung zum Lindern von Gewebeschädigung geeignet, die mit einer Gefäßendothel-Wachstumsfaktor(VEGF)-induzierten Src-vermittelten Zunahme der Gefäßpermeabilität assoziiert ist. Jedoch ist die Erfindung nicht auf VEGF-induzierte Zunahme der Gefäßpermeabilität begrenzt, sondern ist auch für ein Modulieren der Src-Familie-Tyrosinkinase-vermittelten Zunahme der Gefäßpermeabilität in Reaktion auf andere regulatorische Signale geeignet.
Insbesondere können durch Hemmen von Tyrosinkinase Src (hier auch allgemein als Src bezeichnet) und der nahe verwandten Tyrosinkinase Yes (hier auch allgemein als Yes bezeichnet) behandelte Gewebe spezifisch moduliert werden, um darin eine Zunahme der Gefäßpermeabilität zu hemmen, die mit Verletzung oder Krankheit assoziiert ist.
Geeignet für eine Modulierung der Gefäßpermeabilität in einem Gewebe ist eine Nukleinsäure, die für ein Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor-Protein wie ein inaktives Src- oder inaktives Yes-Protein kodiert. Solche Nukleinsäure-Inhibitoren der Src-Familie-Tyrosinkinase-Aktivität können einen oder mehrere retrovirale Expressionsvektoren, nicht-virale Expressionsvektoren oder dergleichen umfassen. Solche Nukleinsäure-Inhibitoren können die geeigneten regulatorischen Signale umfassen, wie Promotoren oder Enhancer für ein oder mehrere exprimierbare Segmente einer Nukleinsäure auf einer jeglichen gegebenen Nukleinsäure.
Ein erfindungsgemäßer Herstellungsartikel kann als Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung einen Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor enthalten, der ein chemischer Inhibitor ist. Insbesondere ist ein bevorzugter chemischer Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 und Geldanamycin, oder Verbin dungen mit ähnlicher Src-hemmender Aktivität. Ein am meisten bevorzugter Inhibitor ist PP1.
Die pharmazeutische Zusammensetzung des Herstellungsartikels kann abhängig von der gewünschten modulatorischen oder inhibierenden Wirkung unterschiedlich sein und der Verpackungshinweis wird entsprechend genauso unterschiedlich sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Zeichnungen bilden einen Teil dieser Offenbarung:
1 ist eine cDNA-Sequenz von c-Src aus Hühnern, die die vollständige kodierende Sequenz mit den deletierten Introns darstellt, wie zuerst beschrieben durch Takeya et al., Cell, 32: 881–890 (1983). Die Sequenz ist über die GenBank-Zugangsnummer J00844 zugänglich. Die Sequenz enthält 1759 Nukleotide, wobei der Protein-kodierende Teil bei den jeweiligen Nukleotidpositionen 112 und 1713 beginnt und endet (SEQ ID NO: 2).
2 ist die kodierte Aminosäurerestsequenz von c-Src aus Hühnern der in 1 gezeigten kodierenden Sequenz (SEQ ID NO: 3).
3 ist eine cDNA-Sequenz von menschlichem c-Src, die zuerst von Braeuninger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 10411–10415 (1991) beschrieben wurde. Die Sequenz ist über die GenBank-Zugangsnummer X59932 X71157 zugänglich. Die Sequenz enthält 2187 Nukleotide, wobei der Protein-kodierende Teil bei den jeweiligen Nukleotidpositionen 134 und 1486 beginnt und endet (SEQ ID NO: 4).
4 ist die kodierte Aminosäurerestsequenz des humanen c-Src der in 3 gezeigten kodierenden Sequenz (SEQ ID NO: 5).
5 zeigt die Aktivierung von endogenem Src durch bFGF oder VEGF wie in Beispiel 4 beschrieben. Der obere Teil der Figur zeigt die Ergebnisse eines in vitro-Kinasetests mit dem Faktor einer Aktivierung des endogenen c-Src durch entweder bFGF oder VEGF. Der untere Teil der Figur ist der Kinasetest-Blot, der mit einem Anti-Src-Antikörper als Beladungskontrolle für einen gleichen Gehalt an Src und IgG sondiert wurde.
6 zeigt die Wirkung einer Retrovirus-vermittelten Genexpression von c-Src A auf die Angiogenese in der Hühner-CAM wie in Beispiel 4 beschrieben. Neun Tage alte Hühner-CAMs wurden gegenüber RCAS-Src A-(aktives mutiertes c-Src) oder Kontroll-RCAS-GFP-(grün fluoreszierendes Protein; ein fluoreszierendes Indikatorprotein)-Retroviren oder Puffer für 72 Stunden exponiert. Der Grad an Angiogenese wurde wie in 6A gezeigt quantifiziert, wobei die jeweiligen Mikroaufnahmen (4×) in 6B einer jeden mit einem Stereomikroskop aufgenommenen Behandlung entsprechen.
7 zeigt die retrovirale Expression von c-Src A bei einer Aktivierung von vaskulärer MAP-Kinase-Phosphorylierung. 7A zeigt Gewebeextrakte von 10 Tage alten Hühner-CAMs, die gegenüber VEGF oder PMA 30 Minuten exponiert wurden oder mit c-src A-Retrovirus 48 Stunden infiziert wurden. NT steht für keine Behandlung. Src wurde aus gleichen Mengen an Gesamt-Proteinextrakt immunpräzipitiert und einem in vitro-Immunkomplex-Kinasetest unter Verwendung eines FAK-GST-Fusionsproteins als Substrat unterzogen, elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen. Teilmengen der vorstehenden Gesamt-Gewebelysate wurden auch durch Immunblotting mit einem Anti-Phospho-ERK-Antikörper auf endogene ERK-Phosphorylierung gemessen. 7B zeigt 10 Tage alte CAMs, die mit entweder Kontroll-RCAS oder RCAS mit SRC A infiziert worden waren. Nach zwei Tagen wurden die CAMs präpariert, in OCT cryokonserviert und bei 4 μm geschnitten. Schnitte wurden mit einem anti-phosphoryliertes ERK-Antikörper (New England Biolabs) immungefärbt, gewaschen und mit einem Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem Sekundärantikörper aus Ziege nachgewiesen. Fluoreszenzdarstellungen wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera (Princeton Inst.) aufgenommen.
8 zeigt das selektive Erfordernis für Src-Aktivität während VEGF-, jedoch nicht bFGF-induzierter Angiogenese. Neun Tage alte Hühner-CAMs wurden gegenüber RCAS-Src 251- oder Kontroll-RCAS-GFP-Retroviren oder Puffer 20 Stunden exponiert und sodann weitere 72 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von bFGF oder VEGF inkubiert. Der Grad an Angiogenese wurde wie vorstehend beschrieben quantifiziert (8A) und beispielhafte Mikroaufnahmen (6×) wurden mit einem Stereomikroskop wie in 8B gezeigt aufgenommen. 8C zeigt einen Blot, der mit einem Anti-Src-Antikörper sondiert wurde, um die Expression von Src 251 in transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontrollbehandlungen zu bestätigen.
9 zeigt die Ergebnisse einer retroviralen Zufuhr von RCAS-Src 251 an menschliche Tumoren. 9A ist eine Mikroaufnahme, die ein mit RCAS-GFP (RCAS-grün fluoreszierendes Protein) infiziertes humanes Medulloblastom-Tumorfragment zeigt, das GFP ausschließlich in den Tumor-Blutgefäßen (Pfeilspitze) exprimiert, wie nachgewiesen durch optische Schnittdarstellung mit einem konfokalen Scanning-Laser-Mikroskop von Bio Rad (Balken = 500 μm). 9B zeigt Daten aus Tumoren, die mit einer topischen Applizierung von Retroviren behandelt worden waren und 3 oder 6 Tage gewachsen waren, worauf sie herausgeschnitten wurden und das Nassgewicht bestimmt wurde. Daten sind als die mittlere Veränderung des Tumorgewichts (anhand des 50 mg Tumor-Startgewichts) +/– SEM von zwei Replikaten ausgedrückt. 9C zeigt in beispielhaften Mikroaufnahmen Medulloblastomtumoren, die operativ aus den Embryos entfernt worden waren (Balken = 350 μm). Die unteren Bilder sind Darstellungen mit hoher Auflösung eines jeden Tumors und zeigen die Gefäße eines jeden Tumors im Detail (Balken = 350 μm). Die Pfeilspitze zeigt eine Zerstörung von Blutgefäßen in RCAS-Src 251-behandelten Tumoren.
10 ist ein Diagramm, das eine Restriktionskarte des RCASBP (RCAS)-Vektorkonstrukts zeigt (SEQ ID NO: 1).
11 zeigt die kodierte Aminosäurerestsequenz von humanem c-Yes-Protein in Ein-Buchstaben-Aminosäure-Darstellung (SEQ ID NO: 8).
12 zeigt die Nukleinsäuresequenz einer für humanes c-Yes-Protein kodierenden cDNA. Die Sequenz ist über die GenBank-Zugangsnummer M15990 zugänglich. Die Sequenz enthält 4517 Nukleotide, wobei der Protein-kodierende Teil an den jeweiligen Nukleotidpositionen 208 und 1839 beginnt und endet und in die in 11 gezeigte Aminosäuresequenz translatiert wird (SEQ ID NO: 7).
13 zeigt Ergebnisse aus einer retroviralen Zufuhr von Src 251 und CSK in einem subkutanen Mäuse-Angiogenesemodell. 13A zeigt Immunblotting-Ergebnisse für einen Nachweis von flk-Expression. 13B zeigt Immunblotting-Ergebnisse aus einem Test für flk unter VEGF- und bFGF-stimulierten Bedingungen. 13C ist ein Diagramm, das die Anzahl an CD34-positiven Blutgefäßen (Durchschnitt von dreifachen zufälligen Feldern bei 20x) durch Behandlung wie stimuliert durch VEGF und bFGF in Gegenwart von GFP-, Src 251- oder CSK-Retrovirus darstellt.
14 zeigt Ergebnisse aus einem modifizierten Miles-Test für VP von VEGF in der Haut von Mäusen, die bezüglich Src, fyn und Yes defizient sind. 14A sind Aufnahmen von behandelten Ohren. 14B sind Diagramme von experimentellen Ergebnissen bezüglich einer Stimulierung der verschiedenen defizitären Mäuse. 14C stellt die Menge an eluiertem Evans-Blau-Farbstoff durch Behandlung dar.
15 ist ein Diagramm, das die relative Größe eines Infarkts in Src +/–-, Src -/–-, Wildtyp(WT)- und PP1-behandelten Wildtyp-Mäusen zeigt. PP1-Behandlung bestand aus 1,5 mg/kg Körpergewicht.
16 zeigt sequenzielle MRI-Scans von Kontroll- und PP1-behandelten Mäusegehirnen, die weniger Gehirninfarkt in PP1-behandelten Tieren (rechts) als in Kontrolltieren (links) zeigen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen
Aminosäurerest: Eine bei chemischer Spaltung (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptidbindungen gebildete Aminosäure. Die hier beschriebenen Aminosäurereste liegen vorzugsweise in der "L"-Isomer-Form vor. Jedoch kann ein jeglicher L-Aminosäurerest gegen Reste in der "D"-Isomer-Form ausgetauscht werden, sofern die erwünschte funktionelle Eigenschaft durch das Polypeptid beibehalten wird. NH₂ betrifft die freie Aminogruppe, die am Aminoterminus eines Polypeptids vorliegt. COOH betrifft die freie Carboxygruppe, die am Carboxyterminus eines Polypeptids vorliegt. Es wird die Standard-Polypeptid-Nomenklatur beibehalten (beschrieben in J. Biol. Chem., 243: 3552–59 (1969) und angewandt in 37 CFR §1.822(b)(2)).
Alle Aminosäurerestsequenzen sind hier durch Formeln dargestellt, deren linke und rechte Orientierung in der herkömmlichen Richtung von Aminoterminus zu Carboxyterminus vorliegt. Ferner zeigt ein Bindestrich am Anfang oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz von einer oder mehreren Aminosäureresten an.
Polypeptid: Betrifft eine lineare Anordnung von Aminosäureresten, die aneinander durch Peptidbindungen zwischen der Alpha-Aminogruppe und Carboxygruppe von benachbarten Aminosäureresten verbunden sind.
Peptid: Betrifft wie hier verwendet eine lineare Anordnung von nicht mehr als etwa 50 Aminosäureresten, die miteinander wie in einem Polypeptid verbunden sind.
Cyclisches Peptid: Betrifft eine Verbindung mit einer Heteroatom-Ringstruktur, die mehrere Amidbindungen wie in einem typischen Peptid umfasst. Das cyclische Peptid kann ein homodetes "Kopf-an-Schwanz"-cyclisiertes lineares Polypeptid sein, bei dem der N-Terminus eines linearen Peptids eine Amidbindung mit dem C-terminalen Carboxylat des linearen Peptids gebildet hat, oder es kann eine Ringstruktur enthalten, in der das Polymer heterodet ist und Amidbindungen und/oder andere Bindungen, um den Ring zu schließen, umfasst, wie Disulfidbrücken, Thioester, Thioamide, Guanidin und ähnliche Bindungen.
Protein: Betrifft eine lineare Anordnung von mehr als 50 Aminosäureresten, die miteinander wie in einem Polypeptid verbunden sind.
Fusionsprotein: Betrifft ein Polypeptid mit mindestens zwei verschiedenen Polypeptiddomänen, die operabel durch eine typische Peptidbindung verbunden ("fusioniert") sind, wobei die zwei Domänen Peptiden entsprechen, die in der Natur nicht in Fusion vorgefunden werden.
Synthetisches Peptid: Betrifft eine chemisch erzeugte Kette von miteinander durch Peptidbindungen verbundenen Aminosäureresten, die frei von natürlich auftretenden Proteinen und Fragmenten davon ist.
B. Allgemeine Überlegungen
Die Erfindung betrifft allgemein: (1) die Feststellung, dass VEGF-induzierte VP spezifisch durch die Tyrosinkinase-Proteine Src und Yes vermittelt wird und dass VP durch Bereitstellen von entweder aktiven oder inaktiven Src- oder Yes-Proteinen für eine Verstärkung oder Hemmung von Angiogenese moduliert werden kann, (2) die weitere Feststellung, dass ein Durchsickern durch Gefäße und/oder Ödem, das mit einer Zunahme der Gefäßpermeabilität assoziiert ist, die mit Trauma, Krankheit oder Verletzung in Beziehung steht, durch Hemmung von Src-Familie-Tyrosinkina se-Aktivität spezifisch moduliert und gelindert werden kann, und (3) die Feststellung, dass eine in vivo-Verabreichung eines Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitors Gewebeschädigung aufgrund einer Zunahme der Gefäßpermeabilität, die mit Krankheit oder Verletzung in Beziehung steht, jedoch nicht mit Krebs oder Angiogenese assoziiert ist, verringert.
Diese Feststellung ist aufgrund der Rolle, die Gefäßpermeabilität in einer Vielzahl von Erkrankungsprozessen und in Assoziierung mit Angiogenese, der Bildung von neuen Blutgefäßen, spielt, wichtig. Falls Gewebe, die mit einem Erkrankungszustand assoziiert sind, Angiogenese für ein Gewebewachstum erfordern, ist es erwünscht, Angiogenese zu hemmen und dadurch das krankhafte Gewebewachstum zu hemmen. Angiogenese kann wirksamer durch gleichzeitige Hemmung von VP gehemmt werden. Falls verletztes Gewebe Angiogenese für ein Gewebewachstum und eine Heilung erfordert, ist es erwünscht, VP und somit Angiogenese zu verstärken oder zu fördern, und dadurch Gewebeheilung und -wachstum zu beschleunigen.
Falls das Wachstum von neuen Blutgefäßen die Ursache für die Pathologie ist, die mit einem Erkrankungsgewebe assoziiert ist, oder dazu beiträgt, wird eine Hemmung von VP und somit Angiogenese die schädlichen Wirkungen der Erkrankung verringern. Durch Hemmen von mit Angiogenese assoziierter VP kann man in die Erkrankung eingreifen, die Symptome lindern und in manchen Fällen die Erkrankung heilen.
In bestimmten Fällen ist eine erhöhte VP für eine Erhöhung der Wirksamkeit einer Arzneimittelzufuhr mittels einer systemischen Verabreichung wünschenswert. Die Blut-Hirn-Schranke ist ein Begriff, der verwendet wird, um die strikte Regulierung von VP und somit den minimalen Zugang von sogar kleinen Molekülarzneistoffen zu dem Gehirn aus dem Blutkreislauf zu beschreiben. Die Fähigkeit, selektiv und spezifisch die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke durch Modulieren der VP der beteiligten Blutgefäße zu modellieren, wird die Verabreichung von Arzneistoffen ermöglichen, die ansonsten nicht fähig wären, über den Kreislauf in die Hirngewebe einzudringen.
In ähnlicher Weise werden viele Schlaganfall-induzierte Pathologien und Schädigungen durch die plötzliche Zunahme der VP eingeleitet und somit wird die Fähigkeit, spezifisch VP zu modulieren, ermöglichen, dass neue und wirksame Behandlungen die nachteiligen Wirkungen von Schlaganfall verringern.
Die hier beschriebene Therapie ist teilweise dadurch wirksam, dass sie hochgradig selektiv für VP und nicht andere biologische Prozesse ist.
Die Erfindung betrifft teilweise die Feststellung, dass Angiogenese durch das Tyrosinkinase-Src-Protein vermittelt wird und dass Angiogenese durch Bereitstellen von entweder aktiven oder inaktiven Src-Proteinen für eine Verstärkung oder Hemmung von Angiogenese moduliert werden kann.
Diese Feststellung ist aufgrund der Rolle, die Angiogenese, die Bildung von neuen Blutgefäßen, in einer Vielzahl von Erkrankungsprozessen spielt, wichtig. Falls Gewebe, die mit einem Erkrankungszustand assoziiert sind, Angiogenese für ein Gewebewachstum erfordern, ist es erwünscht, Angiogenese zu hemmen und dadurch das krankhafte Gewebewachstum zu hemmen. Falls verletztes Gewebe Angiogenese für ein Gewebewachstum und eine Heilung erfordert, ist es erwünscht, Angiogenese zu verstärken oder zu fördern und dadurch Gewebeheilung und -wachstum zu verstärken.
Falls das Wachstum von neuen Blutgefäßen die Ursache für die mit einem Erkrankungsgewebe assoziierte Pathologie ist oder dazu beiträgt, wird eine Hemmung von Angiogenese die schädlichen Wirkungen der Erkrankung verringern. Durch Hemmen von Angiogenese kann man in die Erkrankung eingreifen, die Symptome lindern und in manchen Fällen die Erkrankung heilen.
Beispiele für Gewebe, das mit Erkrankung und Neovaskularisierung assoziiert ist und von einer inhibierenden Modulierung von Angiogenese profitieren wird, umfassen rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, entzündliche Erkrankungen, Restenose und dergleichen. Falls ein Wachstum von neuen Blutgefäßen erforderlich ist, um ein Wachstum eines schädlichen Gewebes zu unterstützen, wird eine Hemmung von Angiogenese die Blutzufuhr zu dem Gewebe verringern und dadurch zu einer Verringerung der Gewebemasse basierend auf Blutzufuhrerfordernissen beitragen. Beispiele umfassen ein Wachstum von Tumoren, falls Neovaskularisierung ein beständiges Erfordernis für ein Wachstum des Tumors über eine Stärke von wenigen Millimetern hinaus und für die Etablierung von festen Tumormetastasen ist.
Falls angenommen wird, dass das Wachstum von neuen Blutgefäßen zu einem Heilen von Gewebe beiträgt, wird eine Verstärkung von Angiogenese bei einer Heilung helfen. Beispiele umfassen eine Behandlung von Patienten mit ischämischen Extremitäten, wobei eine schwache Durchblutung in den Extremitäten aufgrund von Diabetes oder anderer Zustände vorliegt. Auch vorgesehen sind Patienten mit chronischen Wunden, die nicht heilen, und die daher von einer Zunahme der Gefäßzellproliferation und Neovaskularisierung profitieren könnten.
Die hier beschriebene Therapie ist teilweise dadurch wirksam, dass sie hochgradig selektiv für Angiogenese und nicht andere biologische Prozesse ist.
Wie zuvor beschrieben umfasst Angiogenese eine Vielzahl von Vorgängen, die eine Neovaskularisierung eines Gewebes, einschließlich "Auswachsen", Vaskulogenese oder Gefäßvergrößerung, einbeziehen, wobei all diese Angiogenesevorgänge durch Src-Protein bewirkt werden. Mit der Ausnahme einer Heilung von traumatischen Wunden, einer Bildung des Corpus luteum und einer Embryogenese sind vermutlich die Mehrzahl an Angiogenesevorgängen mit Erkrankungsprozessen assoziiert und daher ist die hier beschriebene Therapie für die Erkrankung selektiv und weist keine schädlichen Nebenwirkungen auf.
Die Erfindung betrifft auch teilweise die Feststellung, dass ein Aussickern aus Gefäßen und/oder Ödem, das mit einer Zunahme der Gefäßpermeabilität assoziiert ist, die mit Trauma, Krankheit oder Verletzung in Beziehung steht, spezifisch durch Hemmung von Src-Familie-Tyrosinkinase-Aktivität moduliert und gelindert werden kann. Insbesondere betrifft die Erfindung die Feststellung, dass die in vivo-Verabreichung eines Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitors Gewebeschädigung aufgrund Krankheits- oder Verletzungs-bezogener Zunahme der Gefäßpermeabilität, die nicht mit Krebs oder Angiogenese assoziiert ist, verringert.
Obwohl eine Verabreichung eines Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitors eine Zunahme der VEGF-induzierten VP moduliert, lindert die spezifische Hemmung der Src-Familie-Kinase-Aktivität eine Schädigung von umgebenden Geweben, die durch ein Aussickern aus Gefäßen und/oder Ödem verursacht wird, jedoch wird das Src-Familie-Kinase-Signal aktiviert.
Gefäßpermeabilität spielt eine Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungsvorgängen, unabhängig von einer jeglichen direkten Assoziierung mit Angiogenese. Beispiels weise werden viele Schlaganfall-induzierte Pathologien und Schädigungen durch die plötzliche Zunahme der VP aufgrund Trauma der Blutgefäße verursacht und somit wird die Möglichkeit, spezifisch VP zu modulieren, es ermöglichen, dass neue und wirksame Behandlungen die nachteiligen Wirkungen von Schlaganfall verringern.
Beispiele für Gewebe, das mit Krankheits- oder Verletzungs-induziertem Aussickern aus Gefäßen und/oder Ödem assoziiert ist und von der spezifischen inhibierenden Modulierung unter Verwendung eines Src-Familie-Kinase-Inhibitors profitieren wird, umfassen rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, entzündliche Erkrankungen, Restenose und dergleichen.
Traumata des Kopfes oder der Wirbelsäule und andere cerebrovaskuläre Unfälle, die typischerweise durch ischämische oder hämorrhagische Ereignisse verursacht werden, sind eine Hauptursache für neurologische Erkrankungen und verwandte Verletzungen. Gehirnödem oder Aussickern aus Gefäßen aufgrund von solchen Verletzungen ist eine lebensbedrohliche Pathologie, die eine systemische und verbreitete Schädigung des Gehirns und des Rückenmarks (Zentralnervensystem, ZNS) auslöst, und die Fähigkeit, spezifisch die gewebeschädigenden Wirkungen von Aussickern aus Gefäßen und Ödem zu modulieren, ist in solchen Fällen sehr hilfreich.
ZNS-Infektionen, Meningitis, Cerebritis, Enzephalitis können alle in der nachteiligen Pathologie, einschließlich cerebralem Ödem, resultieren. Eine Behandlung der zugrunde liegenden Infektion kann mit einer spezifischen Therapie für eine Verringerung von Aussickern aus Gefäßen oder Ödem supplementiert werden.
Es wurde beschrieben, dass eine systemische Neutralisierung von VEGF-Protein unter Verwendung eines VEGF-Rezeptor-IgG-Fusionsproteins die Infarktgröße nach cerebraler Ischämie verringert. Diese Wirkung wurde der Verringerung von VEGF-vermittelter Gefäßpermeabilität zugeschrieben; N. van Bruggen et al., J. Clin. Ines. 104: 1613–1620 (1999). Jedoch ist VEGF nicht der entscheidende Vermittler für eine Erhöhung von Gefäßpermeabilität, sondern Src wie nun gezeigt wurde.
Andere Erkrankungen oder Zustände, bei denen eine Src-vermittelte Zunahme der Gefäßpermeabilität beteiligt ist und die somit geeignete Ziele für eine Behandlung durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind, können umfassen: Gehirnblutung, Gehirn- und Wirbelsäulentrauma, Hypoxie-induzierte Gehirn- und Wirbelsäulenverletzung, entzündliche Erkrankungen des ZNS: virale oder bakteri elle Infektionen (z. B. Meningitis, HIV-Enzephalopathie), Autoimmunerkrankungen (z. B. Multiple Sklerose), Erkrankungen mit einer chronischen Zunahme der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (z. B. Morbus Alzheimer), Operationen, bei denen eine temporäre Beeinträchtigung von Perfusion oder Oxigenierung von Gewebe als Schutzmaßnahme erforderlich ist, akutes progressives Lungenversagen (ARDS), rheumatoide Arthritis und diabetische Retinopathie.
C. Src-Familie-Tyrosinkinase-Proteine
Ein Tyrosinkinase-Protein für eine erfindungsgemäße Verwendung kann abhängig von der beabsichtigten Verwendung unterschiedlich sein. Die Begriffe "Src-Protein" oder "Src" werden verwendet, um kollektiv die hier beschriebenen verschiedenen Formen von Tyrosinkinase-Src-Protein entweder in den aktiven oder inaktiven Formen zu bezeichnen. Die Begriffe "Yes-Protein" oder "Yes" werden verwendet, um kollektiv die hier beschriebenen verschiedenen Formen von Tyrosinkinase-Yes-Protein entweder in den aktiven oder inaktiven Formen zu bezeichnen. Im Zusammenhang mit der Beschreibung wird auch auf Src- oder Yes-kodierende Nukleinsäure-genetische Sequenzen oder Gene Bezug genommen. Der Begriff "Src-Familie" betrifft die Gruppe von Tyrosinkinasen, die mit Src funktionell und hinsichtlich der Aminosäuresequenz in Beziehung stehen.
Ein "aktives Src-Protein" betrifft eine jegliche einer Vielzahl von Src-Protein-Formen, die Angiogenese oder VP verstärken. Ein "aktives Yes-Protein" betrifft eine jegliche einer Vielzahl von Yes-Protein-Formen, die VP verstärken. Tests für eine Messung einer Verstärkung von Angiogenese oder VP sind hier beschrieben und nicht begrenzend zu verstehen. Ein Protein wird als aktiv betrachtet, falls der Grad an Angiogenese oder VP mindestens 10% höher, vorzugsweise 25% höher und insbesondere 50% höher als ein Kontrollgrad ist, bei dem kein Protein zu dem Testsystem gegeben wird.
Der bevorzugte Test für ein Messen einer Verstärkung von Angiogenese ist der CAM-Test, bei dem RCAS-viraler Vektor wie in den Beispielen beschrieben verwendet wird und der Angiogenese-Index durch Zählen von Verzweigungspunkten berechnet wird.
Ein bevorzugter Test für eine Messung einer Verstärkung von VP ist der Miles-Test, bei dem Evans-Blau-Farbstoff in Mäusen wie in den Beispielen beschrieben verwen det wird und VP durch die Menge an aus den Blutgefäßen ausgetretenem Evans-Blau-Farbstoff gemessen wird.
Ein bevorzugtes aktives Src- oder Yes-Protein weist auch Tyrosinkinase-Aktivität auf. Beispiele für aktive Src- oder Yes-Proteine sind in den Beispielen beschrieben und umfassen Src-A und Yes-1.
Ein "inaktives Src-Protein" betrifft eine jegliche einer Vielzahl von Src-Protein-Formen, die Angiogenese oder VP hemmen. Ein "inaktives Yes-Protein" betrifft eine jegliche einer Vielzahl von Yes-Protein-Formen, die VP hemmen. Tests zur Messung der Hemmung von VP-Zunahme sind hier beschrieben und nicht begrenzend zu verstehen. Ein Src-Protein wird als inaktiv betrachtet, falls der Grad an Angiogenese mindestens 10% niedriger, vorzugsweise 25% niedriger und insbesondere 50% niedriger ist als ein Kontrollgrad, bei dem kein exogenes Src zu dem Testsystem gegeben wird.
Ein Src- oder Yes-Protein wird als inaktiv betrachtet, falls der Grad an VP mindestens so hoch ist wie oder 10% niedriger, vorzugsweise 25% niedriger und insbesondere 50% niedriger ist als ein Kontrollgrad, bei dem kein exogenes Src oder Yes zu dem Testsystem gegeben wird.
Ein bevorzugter Test für ein Messen einer Hemmung von Angiogenese ist der CAM-Test, bei dem RCAS-viraler Vektor wie in den Beispielen beschrieben verwendet wird und der Angiogenese-Index durch Zählen von Verzweigungspunkten berechnet wird.
Ein bevorzugter Test für ein Messen einer Hemmung von VP ist der Miles-Test, bei dem Evans-Blau-Farbstoff in Mäusen wie in den Beispielen beschrieben verwendet wird und VP durch die Menge an aus den Blutgefäßen ausgetretenem Evans-Blau-Farbstoff gemessen wird.
Ein bevorzugtes inaktives Src- oder Yes-Protein weist auch eine verringerte Tyrosinkinase-Aktivität auf. Beispiele für inaktive Src-Proteine sind in den Beispielen beschrieben und umfassen Src-251 und Src K295M.
Ein erfindungsgemäß verwendbares Src-Protein kann durch ein jegliches einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich Isolierung aus natürlichen Quellen, einschließlich Gewebe, Produktion durch rekombinante DNA-Expression und Aufreinigung und dergleichen. Src- und/oder Yes-Protein kann auch "in situ" durch Einbringen eines Gen-Therapiesystems in das interessierende Gewebe, das sodann das Protein in dem Gewebe exprimiert, bereitgestellt werden.
Ein Gen, das für ein Src-Protein oder Yes-Protein kodiert, kann durch eine Vielzahl von bekannten Verfahren hergestellt werden und die Erfindung ist nicht in dieser Hinsicht begrenzt. Beispielsweise ist bekannt, dass die natürliche Historie von Src eine Vielzahl von Homologen aus Säugern, Vögeln, Viren und ähnlichen Spezies umfasst, und das Gen kann einfach unter Verwendung von cDNA-Klonierungsverfahren aus einem jeglichen Gewebe, das das Protein exprimiert, kloniert werden. Ein bevorzugtes Src für eine erfindungsgemäße Verwendung ist ein zelluläres Protein wie die Säuger- oder Vögelhomologe, die als c-src bezeichnet werden. Besonders bevorzugt ist humanes c-src. Ein bevorzugtes Yes für eine erfindungsgemäße Verwendung ist ein humanes zelluläres Protein, c-yes. Besonders bevorzugt ist humanes c-yes-1, das für die in 11 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert. Das Protein Yes-1 der 11 wird durch ein Segment der in 12 gezeigten Nukleinsäuresequenz kodiert, das als das kodierende Domänensegment identifiziert ist.
D. Rekombinante DNA-Moleküle und Expressionssvsteme für eine Expression von Src- oder Yes-Protein
Die Erfindung beschreibt mehrere Nukleotidsequenzen, die spezifisch erfindungsgemäß verwendbar sind. Diese Sequenzen umfassen Sequenzen, die für ein erfindungsgemäß verwendbares Src-Protein kodieren, und verschiedene DNA-Segmente, rekombinante DNA(rDNA)-Moleküle und Vektoren, die für eine Expression von Src-Protein konstruiert wurden. Diese Sequenzen umfassen auch Sequenzen, die ein erfindungsgemäß verwendbares Yes-Protein kodieren, und verschiedene DNA-Segmente, rekombinante DNA(rDNA)-Moleküle und Vektoren, die für eine Expression von Yes-Protein konstruiert wurden.
DNA-Moleküle (Segmente), die erfindungsgemäß verwendbar sind, können daher Sequenzen, die für gesamte Strukturgene, Fragmente von Strukturgenen oder eine Kombination von Genen kodieren, und Transkriptionseinheiten umfassen, wie weiter hier beschrieben.
Ein bevorzugtes DNA-Segment ist eine Nukleotidsequenz, die für ein Src- oder Yes-Protein oder beides wie hier definiert oder ein biologisch aktives Fragment davon kodiert.
Die Aminosäurerestsequenz und Nukleotidsequenz eines bevorzugten Src und Yes ist in den Beispielen beschrieben.
Ein bevorzugtes DNA-Segment kodiert für eine Aminosäurerestsequenz, die im Wesentlichen gleich zu einer Aminosäurerestsequenz oder Teilen davon ist, die einem hier beschriebenen Src- oder Yes-Protein entspricht, und vorzugsweise besteht sie im Wesentlichen daraus. Beispielhafte und bevorzugte DNA-Segmente sind ferner in den Beispielen beschrieben.
Die Aminosäurerestsequenz eines Proteins oder Polypeptids steht direkt über den genetischen Code mit der Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Sequenz des Strukturgens, das für das Protein kodiert, in Beziehung. Somit kann ein Strukturgen oder DNA-Segment hinsichtlich der Aminosäurerestsequenz, d. h. das Protein oder Polypeptid, für die es kodiert, definiert werden.
Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redundanz. Das heißt bezüglich der meisten der Aminosäuren, die verwendet werden, um Proteine zu bilden, kann mehr als ein kodierendes Nukleotidtriplet (Codon) für einen bestimmten Aminosäurerest kodieren oder diesen bezeichnen. Daher kann eine Reihe von unterschiedlichen Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäurerestsequenz kodieren. Solche Nukleotidsequenzen werden als funktionell gleichwertig betrachtet, da sie zu der Bildung der gleichen Aminosäurerestsequenz in allen Organismen führen können. Gelegentlich kann eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in eine bestimmte Nukleotidsequenz eingebaut werden. Jedoch beeinträchtigt eine derartige Methylierung nicht die kodierende Beziehung in irgendeiner Weise.
Eine Nukleinsäure ist ein jegliches Polynukleotid oder Nukleinsäurefragment und kann ein Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, d. h. RNA oder DNA, oder Analoga davon sein. In bevorzugten Ausführungsformen liegt ein Nukleinsäuremolekül in der Form eines Segments von Duplex-DNA, d. h. ein DNA-Segment, vor, obwohl für bestimmte molekularbiologische Verfahren einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt ist.
DNA-Segmente werden durch eine Reihe von Methoden hergestellt, einschließlich Verfahren einer chemischen Synthese und rekombinante Ansätze, vorzugsweise durch Klonieren oder durch Polymerasekettenreaktion (PCR). DNA-Segmente, die für Teile eines Src-Proteins kodieren, können leicht durch chemische Techniken, beispielsweise das Phosphotriesterverfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185–3191, 1981, oder durch Verwendung von automatischen Syntheseverfahren hergestellt werden. Des Weiteren können größere DNA-Segmente einfach durch bekannte Verfahren wie Synthese einer Gruppe an Oligonukleotiden, die das DNA-Segment definieren, gefolgt von Hybridisieren und Ligieren von Oligonukleotiden, um das vollständige Segment aufzubauen, hergestellt werden. Alternative Verfahren umfassen eine Isolierung eines bevorzugten DNA-Segments durch PCR mit einem Paar an Oligonukleotid-Primern, die bei einer cDNA-Bibliothek verwendet werden, von der angenommen wird, dass sie Mitglieder enthält, die für ein Src-Protein kodieren.
Natürlich kann mittels chemischer Synthese eine jegliche erwünschte Modifikation einfach durch Substitution von Basen, die für die native Aminosäurerestsequenz kodieren, gegen geeignete Basen hergestellt werden. Dieses Verfahren ist bekannt und kann einfach auf die Herstellung der verschiedenen unterschiedlichen hier beschriebenen "modifizierten" Src-Proteine angewandt werden.
Ferner können DNA-Segmente, die im Wesentlichen aus Strukturgenen bestehen, die für ein Src- oder Yes-Protein kodieren, sodann beispielsweise durch Stellen-gerichtete oder zufällige Mutagenese modifiziert werden, um eine jegliche erwünschte Substitution einzubringen.
1. Klonierung eines Src- oder Yes-Gens
Ein Src- oder Yes-Gen kann aus einer geeigneten Quelle an genomischer DNA oder Messenger-RNA (mRNA) durch eine Vielzahl von biochemischen Verfahren kloniert werden. Ein Klonieren dieser Gene kann gemäß den in den Beispielen beschriebenen allgemeinen Verfahren und wie es im Fachgebiet bekannt ist erfolgen.
Quellen für Nukleinsäuren für ein Klonieren eines Src- oder Yes-Gens, die erfindungsgemäß geeignet sind, können genomische DNA oder Messenger-RNA (mRNA) in der Form einer cDNA-Bibliothek aus einem Gewebe, von dem vermutet wird, dass es diese Proteine exprimiert, umfassen. Ein bevorzugtes Gewebe ist humanes Lungengewebe, obwohl ein jegliches anderes geeignetes Gewebe verwendet werden kann.
Ein bevorzugtes Klonierungsverfahren umfasst die Herstellung einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Standardverfahren und eine Isolierung der Src-kodierenden oder Yes-kodierenden Nukleotidsequenz durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von paarweisen Oligonukleotid-Primern basierend auf den hier beschriebenen Nukleotidsequenzen. Alternativ können die erwünschten cDNA-Klone aus einer cDNA- oder genomischen Bibliothek durch herkömmliche Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Hybridisierungssonde basierend auf den hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen identifiziert und isoliert werden. Andere Verfahren zur Isolierung und Klonierung geeigneter Src- oder Yes-kodierender Nukleinsäuren sind für den Fachmann ersichtlich.
2. Gentransfer- und/oder Expressionsvektoren
Erfindungsgemäß ist ein rekombinantes DNA-Molekül (rDNA) vorgesehen, das ein DNA-Segment enthält, das für ein Src- oder Yes-Protein oder beides wie hier beschrieben kodiert. Eine exprimierbare rDNA kann dadurch hergestellt werden, dass (im Raster, exprimierbar) ein Vektor an ein erfindungsgemäßes Src- oder Yes-kodierendes DNA-Segment gebunden wird. Somit ist ein rekombinantes DNA-Molekül ein Hybrid-DNA-Molekül, das mindestens zwei Nukleinsäuren von Nukleotidsequenzen, die normalerweise nicht zusammen in der Natur vorliegen, umfasst.
Die Wahl des Vektors, an den ein erfindungsgemäß verwendbares DNA-Segment operabel gebunden wird, hängt bekanntlich direkt von den erwünschten funktionellen Eigenschaften wie der Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle ab, typische Betrachtungen bei einer Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle. Ein erfindungsgemäß vorgesehener Vektor ist zumindest fähig, die Replikation und vorzugsweise auch die Expression eines Strukturgens, das in den Vektor-DNA-Segmenten eingeschlossen ist, an die es operabel gebunden ist, zu steuern.
Falls ein Expressionsvektor sowohl eine exprimierbare src-Nukleinsäuresequenz, als auch eine exprimierbare yes-Nukleinsäuresequenz enthält, können beide Gene durch die gleichen regulatorischen Elemente, die stromaufwärts des ersten Gens liegen, reguliert werden oder sie können jeweils einzeln durch getrennte regulatorische Elemente reguliert werden.
Der Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Vektoren kennt sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Expressionsvektoren und diese sind in Ausebel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschrieben. Diese Literaturstellen beschreiben auch viele der allgemeinen rekombinanten DNA-Verfahren, auf die hier Bezug genommen wird.
In einer Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäß vorgesehener Vektor ein prokaryontisches Replikon, d. h. eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit, eine autonome Replikation und Aufrechterhaltung des rekombinanten DNA-Moleküls extrachromosomal in einer prokaryontischen Wirtszelle wie einer bakteriellen Wirtszelle, die damit transformiert ist, zu steuern. Solche Replikons sind bekannt. Des Weiteren umfassen diejenigen Ausführungsformen, die ein prokaryontisches Replikon einbeziehen, auch ein Gen, dessen Expression eine Arzneimittelresistenz an einen damit transformierten Bakterienwirt verleiht. Typische bakterielle Arzneimittelresistenz-Gene sind diejenigen, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin oder Tetracyclin verleihen.
Diejenigen Vektoren, die ein prokaryontisches Replikon umfassen, können auch einen prokaryontischen Promotor umfassen, der fähig ist, die Expression (Transkription und Translation) eines Strukturgens in einer bakteriellen Wirtszelle wie E. coli, die damit transformiert ist, zu steuern. Ein Promotor ist ein Expressionskontrollelement, das durch eine DNA-Sequenz gebildet wird, die eine Bindung von RNA-Polymerase und ein Auftreten von Transkription erlaubt. Promotorsequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren, die günstige Restriktionsstellen für eine Insertion eines erfindungsgemäß verwendbaren DNA-Segments enthalten, bereitgestellt. Typische Beispiele für solche Vektorplasmide sind pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories (Richmond, CA) verfügbar sind, pRSET, der von Invitrogen (San Diego, CA) verfügbar ist, und pPL und pKK223, die von Pharmacia, Piscataway, N. J. verfügbar sind.
Expressionsvektoren, die mit eukaryontischen Zellen kompatibel sind, vorzugsweise diejenigen, die mit Vertebratenzellen kompatibel sind, können auch verwendet werden, um die erfindungsgemäß verwendbaren rekombinanten DNA-Moleküle herzu stellen. Expressionsvektoren für eukaryontische Zellen sind bekannt und von mehreren gewerblichen Quellen verfügbar. Typischerweise werden solche Vektoren mit günstigen Restriktionsstellen für eine Insertion des gewünschten DNA-Segments bereitgestellt. Typische Beispiele für solche Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC, #31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), der bevorzugte in den Beispielen beschriebene Vektor, und ähnliche eukaryontische Expressionsvektoren.
Ein spezifisch bevorzugtes System für eine Genexpression in Zusammenhang mit der Erfindung umfasst eine Gen-Zuführkomponente, d. h. die Fähigkeit, das Gen an das Gewebe von Interesse zuzuführen. Geeignete Vektoren sind "infektiöse" Vektoren wie rekombinante DNA-Viren, Adenovirus- oder Retrovirus-Vektoren, die verändert sind, um das gewünschte Protein zu exprimieren, und die Merkmale aufweisen, die eine Infektion von vorgewählten Zielgeweben ermöglichen. Besonders bevorzugt ist das replikationskompetente Vogel-Sarkom-Virus (RCAS), das hier beschrieben ist.
Säugerzellsysteme, die rekombinante Viren oder virale Elemente verwenden, um eine Expression zu steuern, können verändert werden. Beispielsweise kann bei einer Verwendung von Adenovirus-Expressionsvektoren die kodierende Sequenz eines Polypeptids an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex wie den späten Promotor und die dreiteilige Leitsequenz ligiert werden. Dieses chimäre Gen kann sodann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination inseriert werden. Eine Insertion in eine nicht-essenzielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, das lebensfähig ist und in der Lage ist, das Polypeptid in den infizierten Wirten zu exprimieren (vgl. z. B. Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3655–3659 (1984)). Alternativ kann der Vacciniavirus-7.5K-Promotor verwendet werden (vgl. z. B. Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7415–7419 (1982), Mackett et al., J. Virol., 49: 857–864 (1984), Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 4927–4931 (1982)). Von besonderem Interesse sind Vektoren auf der Basis von Rinderpapillomvirus, die die Fähigkeit haben, als extrachromosomale Elemente zu replizieren (Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1: 486 (1981)). Kurz nach Eintritt dieser DNA in Zielzellen repliziert das Plasmid auf etwa 100–200 Kopien pro Zelle. Eine Transkription der inserierten cDNA erfordert nicht eine Integration des Plasmids in das Chromosom des Wirts, wodurch ein hoher Grad einer Expression erreicht wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression dadurch verwendet werden, dass ein selektierbarer Marker wie das neo-Gen in das Plasmid eingebaut wird. Alternativ kann das retrovirale Genom für eine Verwendung als ein Vektor modifiziert werden, der fähig ist, die Expression der Polypeptid-kodierenden Nukleotidsequenz in Wirtszellen einzubringen und zu steuern (Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6349–6353 (1984)). Eine Expression bei einem hohen Grad kann auch dadurch erreicht werden, dass induzierbare Promotoren, einschließlich in nicht begrenzender Weise des Metallothionin IIA-Promotors und der Hitzeschockpromotoren, verwendet werden.
In jüngerer Zeit wurde das Langzeitüberleben von Cytomegalovirus(CMV)-Promotor- gegenüber Rous-Sarkom-Virus(RSV)-Promotor-getriebener Thymidinkinase (TK)-Gentherapie in nackten Mäusen mit humanem Ovarialkrebs untersucht. Zellabtötungswirksamkeit der Adenovirus-vermittelten CMV-Promotor-getriebenen Herpes simplex-Virus-TK-Gentherapie war 2- bis 10-fach wirksamer als RSV-getriebene Therapie (Tong et al., 1999, Hybridoma 18(1): 93–97). Das Erstellen von chimären Promotoren für Gentherapieanwendungen, die eine Expression bei einem niedrigen Grad, gefolgt von einer induzierbaren Expression bei einem hohen Grad erfordern, wurde ebenfalls beschrieben (Suzuki et al., 1996, Human Gene Therapy 7: 1883–1893).
Bei Langzeitproduktion von rekombinanten Proteinen mit einer hohen Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Im Gegensatz zu einer Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit einer cDNA transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (wie Promotor- und Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einen selektierbaren Marker gesteuert wird. Wie vorstehend beschrieben verleiht der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht es den Zellen, stabil das Plasmid in ihre Chromosomen zu integrieren und anzuwachsen, um Foci auszubilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien expandiert werden können.
Zum Beispiel kann es nach dem Einbringen von Fremd-DNA den veränderten Zellen ermöglicht werden, ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium anzuwachsen, und sie werden sodann auf ein Selektivmedium umgestellt. Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-(Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-(Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 48: 2026 (1962)) und Adenin-Phosphoribosyltransferase-(Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980))-Gene, die in tk^–-, hgprt^–- oder aprt^–-Zellen verwendet werden können. Anti-Metabolitresistenz-verleihende Gene können auch als Selektionsbasis verwendet werden, beispielsweise die Gene für dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht, (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77: 3567 (1980), O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 1527 (1981)), gpt, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht, (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)), neo, das Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht, (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1 (1981)), und hygro, das Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht, (Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)). In jüngerer Zeit wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, namentlich trpB, das Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, hisD, das Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden, (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 804 (1988)), und ODC (Ornithindecarboxylase), das Resistenz gegenüber dem Ornithindecarboxylase-Inhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO, verleiht, (McConlogue L., in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg., (1987)).
Die grundsätzlichen Vektoren, die für eine Gentherapie beim Menschen vorgesehen sind, leiten sich von Retroviren ab (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107 (Sup. 1): 31–32, Bank et al., 1996, Bioessays 18(12): 999–1007, Robbins et al., 1998, Pharmacol. Ther. 80(1): 35–47). Das therapeutische Potential von Gentransfer- und Antisense-Therapie stimulierte die Entwicklung vieler Vektorsysteme für eine Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen (Gefäßsystem, Stephan et al., 1997, Fundam. Clin. Pharmacol. 11(2): 97–110, Feldman et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3): 391–404, Vassalli et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3): 459–69, Baek et al., 1998, Circ. Res. 82(3): 295–305, Niere, Lien et al., 1997, Kidney I. Suppl. 61: S85–8, Leber, Ferry et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9(14): 1975- 81, Muskel, Marshall et al., 1998, Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3): 360–5). Zusätzlich zu diesen Geweben ist ein entscheidendes Ziel für die Gentherapie bei Menschen Krebs, entweder der Tumor selbst oder assoziierte Gewebe (Runnebaum, 1997, Anticancer Res. 17(4B): 2887–90, Spear et al., 1998, J. Neurovirol. 4(2): 133–47).
Spezifische Beispiele für virale Gentherapievektorsysteme, die leicht für eine erfindungsgemäße Verwendung adaptierbar sind, werden kurz nachstehend beschrieben. Eine retrovirale Genzufuhr wurde kürzlich durch Federspiel und Hughes (1998, Methods in Cell Biol. 52: 179–214) zusammengefasst, die insbesondere die Vogel-Leukose-Virus(ALV)-Retrovirusfamilie beschreiben (Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93: 4931 (1996), Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 11241 (1994)). Retrovirale Vektoren, einschließlich ALV und murines Leukämievirus (MLV), werden weiter von Svoboda (1998, Gene 206: 153–163) beschrieben.
Modifizierte retrovirale/adenovirale Expressionssysteme können leicht für eine Durchführung der Erfindung angepasst werden. Beispielsweise werden murines Leukämievirus(MLV)-Systeme von Karavanas et al., 1998, Crit. Rev. In Oncology/Hematology 28: 7–30 zusammengefasst. Adenovirus-Expressionssysteme werden von Von Seggern und Nemerow in Gene Expression Systems (Hrsg. Fernandez und Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, Kapitel 5, Seiten 112–157) zusammengefasst.
Es zeigte sich, dass Proteinexpressionssysteme sowohl in vivo als auch in vitro eine wirksame Verwendung aufweisen. Beispielsweise wurde ein wirksamer Gentransfer an humane Plattenepithelkarzinome durch einen Herpes simplex-Virus(HSV)-Typ 1-Ampliconvektor beschrieben (Carew et al., 1998, Am. J. Surg. 176: 404–408). Herpes simplex-Virus wurde für einen Gentransfer zu dem Nervensystem verwendet (Goins et al., 1997, J. Neurovirol. 3 (Sup. 1): S80–8). Zielgerichtete Suizidvektoren unter Verwendung von HSV-TK wurden an soliden Tumoren getestet (Smiley et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8(8): 965–77). Herpes simplex-Virus-Typ I-Vektor wurde für eine Krebs-Gentherapie an Colonkarzinomzellen verwendet (Yoon et al., 1998, Ann. Surg. 228(3): 366–74). Hybrid-Vektoren wurden entwickelt, um die Zeitspanne einer Transfektion zu verlängern, einschließlich HSV/AAV(adeno-assoziiertes Virus)-Hybride für eine Behandlung von Hepatozyten (Fraefel et al., 1997, Mol. Med. 3(12): 813–825).
Vakziniavirus wurde aufgrund seines großen Genoms für eine Gentherapie am Menschen entwickelt (Peplinski et al., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7(3): 575–88). Thymidinkinase-deletiertes Vakziniavirus, das Purinnukleosid-Pyrophosphorylase exprtmiert, wurde für eine Verwendung als ein Tumor-gerichteter Gentherapie-Vektor beschrieben (Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy 10: 649–657).
Adeno-assoziiertes Virus 2 (AAV) wurde für eine Verwendung bei der Gentherapie am Menschen beschrieben. Jedoch erfordert AAV einen Helfervirus (wie Adenovirus oder Herpesvirus) für eine optimale Replikation und Verpackung in Säugerzellen (Snoeck et al., 1997, Exp. Nephrol. 5(6): 514–20, Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5): 470–5). Jedoch wurde eine in vitro-Verpackung eines infektiösen rekombinanten AAV beschrieben, was dieses System sehr viel vielversprechender macht (Ding et al., 1997, Gene Therapy 4: 1167–1172). Es wurde gezeigt, dass der AAV-vermittelte Transfer von ekotroper Retrovirus-Rezeptor-cDNA eine ekotrope retrovirale Transduktion von etablierten und primären humanen Zellen ermöglicht (Qing et al., 1997, J. Virology 71(7): 5663–5667). Krebs-Gentherapie unter Verwendung eines humanes Wildtyp-p53 exprimierenden AAV-Vektors wurde gezeigt (Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy 4: 675–682). Gentransfer in Gefäßzellen unter Verwendung von AAV-Vektoren wurde auch gezeigt (Maeda et al., 1997, Cardiovascular Res. 35: 514–521). Es wurde gezeigt, dass AAV ein geeigneter Vektor für eine Leber-gerichtete Gentherapie ist (Xiao et al., 1998, J. Virol. 72(12): 10222–6). AAV-Vektoren wurden für eine Verwendung bei der Gentherapie von Gehirngeweben und des Zentralnervensystems gezeigt (Chamberlin et al., 1998, Brain Res. 793(1–2): 169–75, During et al., 1998, Gene Therapy 5(6): 820–7). AAV-Vektoren wurden auch mit Adenovirus-Vektoren (AdV) für eine Gentherapie der Lunge und einen Transfer an humane Epithelzellen bei cystischer Fibrose verglichen (Teramoto et al., 1998, J. Virol. 72(11): 8904–12).
Chimäre AdV/retrovirale Gentherapie-Vektorsysteme wurden beschrieben, die die nützlichen Qualitäten eines jeden Virus enthalten, um einen nicht-integrativen AdV zu erzeugen, der über die intermediäre Bildung einer retroviralen Producerzelle funktionell integrativ gemacht wird (Feng et al., 1997, Nat. Biotechnology 15(9): 866–70, Bilbao et al., 1997, FASER J 11(8): 624–34). Diese leistungsstarke neue Erzeugung eines Gentherapie-Vektors wurde für eine zielgerichtete Krebs-Gentherapie angepasst (Bilbao et al., 1998, Adv. Exp. Med. Biol. 451: 365–74). Eine einzige Injektion von p53-exprimierendem AdV hemmte ein Wachstum von subkutanen Tumorknoten von humanen Prostatakrebszellen (Asgari et al., 1997, Int. J. Cancer 71(3): 377–82). AdV-vermittelter Gentransfer von Wildtyp-p53 in Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs wurde beschrieben (Schuler et al., 1998, Human Gene Therapy 9: 2075–2082). Der gleiche Krebs war Gegenstand einer p53-Gen-Ersatztherapie, die durch AdV-Vektoren vermittelt wurde (Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl. 8): 33–7). AdV-vermittelter Gentransfer von p53 hemmt eine Differenzierung von Endothelzellen und Angiogenese in vivo (Riccioni et al., 1998, Gene Ther. 5(6): 747–54). Adenovirus-vermittelte Expression von Melanomantigen gp75 als Immuntherapie für metastatisches Melanom wurde auch beschrieben (Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapy 5: 975–983). AdV erleichtert eine Infektion von humanen Zellen mit ekotropem Retrovirus und erhöht die Wirksamkeit einer retroviralen Infektion (Scott-Taylor, et al., 1998, Gene Ther. 5(5): 621–9).
AdV-Vektoren wurden für einen Gentransfer an Zellen der glatten Gefäßmuskulatur (Li et al., 1997, Chin. Med. J. (Engt) 110(12): 950–4), Zellen des Plattenepithelkarzinoms (Goebel et al., 1998, Otolarynol. Head Neck Surg. 119(4): 331–6), Zellen von Ösophaguskrebs (Senmaru et al., 1998, Int. J. Cancer 78(3): 366–71), mesangiale Zellen (Nahman et al., 1998, J. Investig. Med. 46(5): 204–9), Gliazellen (Chen et al., 1998, Cancer Res. 58(16): 3504–7) und die Gelenke von Tieren (Ikeda et al., 1998, J. Rheumatol. 25(9): 1666–73) verwendet. In jüngerer Zeit wurde ein Katheter-basierter perikardialer Gentransfer, der durch AcV-Vektoren vermittelt war, gezeigt (March et al., 1999, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl 1): I23–9). Eine Manipulierung des AdV-Systems mit den richtigen genetischen Kontrollelementen ermöglicht die AdV-vermittelte regulierbare Zielgenexpression in vivo (Burcin et al., 1999, PNAS (USA) 96(2): 355–60).
Alphavirus-Vektoren wurden für Gentherapie-Anwendungen beim Menschen entwickelt, wobei Verpackungszelllinien für eine Transformation mit Expressionskassetten geeignet waren, die für eine Verwendung mit Sindbis-Virus- und Semliki-Forest-Virus-abgeleiteten Vektoren geeignet waren (Polo et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 96: 4598–4603). Nicht-cytopathische Flavivirus-Replikon-RNA-basierte Systeme wurden auch entwickelt (Varnavski et al., 1999, Virology 255(2): 366–75). Suizid-HSV-TK-Gen-enthaltende Sindbis-Virus-Vektoren wurden für eine zellspezifische Steuerung an Tumorzellen verwendet (Iijima et al., 1998, It. J. Cancer 80(1): 110–8).
Retrovirale Vektoren auf der Basis von humanem Foamy-Virus (HFV) sind auch vielversprechend als Gentherapie-Vektoren (Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapo 9: 2517–2525). Foamy-Virus-Vektoren wurden für eine Suizid-Gentherapie entworfen (Nestler et al., 1997, Gene Ther. 4(11): 1270–7). Rekombinante murine Cytomegalovirus- und Promotorsysteme wurden auch als Vektoren für eine Expression bei einem hohen Grad verwendet (Manning et al., 1998, J. Virol. Meth. 73(1): 31–9, Tong et al., 1998, Hybridoma 18(1): 93–7).
Eine Genzufuhr an sich nicht teilende Zellen wurde durch die Erzeugung von Sendai-Virus-basierenden Vektoren ermöglicht (Nakanishi et al., 1998, J. Controlled Release 54(1): 61–8).
In einem anderen Versuch, die Transformation von sich nicht teilenden somatischen Zellen zu ermöglichen, wurden lentivirale Vektoren untersucht. Eine Gentherapie von cystischer Fibrose unter Verwendung eines replikationsdefizienten huma nen Immundefizienzvirus(HIV)-basierenden Vektors wurde beschrieben (Goldman et al., 1997, Human Gene Therapy 8: 2261–2268). Eine anhaltende Expression von Genen, die der Leber und der Muskulatur durch lentivirale Vektoren zugeführt worden waren, wurde auch gezeigt (Kafri et al., 1997, Nat. Genet. 17(3): 314–7). Jedoch sind Sicherheitsbedenken vorherrschend und eine Entwicklung verbesserter Vektoren schreitet rasch voran (Kim et al., 1998, J. Virol. 72(2): 994–1004). Eine Untersuchung des HIV-LTR und -Tat ergab wichtige Informationen hinsichtlich der Organisation des Genoms für ein Entwickeln von Vektoren (Sadaie et al., 1998, J. Med. Virol. 54(2): 118–28). Somit werden die genetischen Erfordernisse für einen wirksamen HIV-basierenden Vektor nun besser verstanden (Gasmi et al., 1999, J. Virol. 73(3): 1828–34). Selbst-inaktivierende Vektoren oder konditionierte Verpackungszelllinien wurden beschrieben (z. B. Zuffery et al., 1998, J. Virol. 72(12): 9873–80, Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72(10): 8150–7, Dull et al., 1998, J. Virol. 72(11): 8463–71 und Kaul et al., 1998, Virology 249(1): 167–74). Eine wirksame Transduktion von humanen Lymphozyten und CD34+-Zellen durch HIV-Vektoren wurde gezeigt (Douglas et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10(6): 935–45, Miyoshi et al., 1999, Science 283(5402): 682–6). Eine wirksame Transduktion von sich nicht teilenden humanen Zellen durch felines Immundefizienzvirus(FIV)-lentivirale Vektoren wurde beschrieben, was Sicherheitsbedenken bei einer Verwendung von HIV-basierenden Vektoren minimiert (Poeschla et al., 1998, Nature Medicine 4(3): 354–357). Eine produktive Infektion von humanen mononukleären Blutzellen durch FIV-Vektoren wurde gezeigt (Johnston et al., 1999, J. Virol. 73(3): 2491–8).
Obwohl viele virale Vektoren schwierig handzuhaben sind und die Kapazität für inserierte DNA begrenzt ist, wurden diese Beschränkungen und Nachteile angegangen. Beispielsweise wurden zusätzlich zu vereinfachten viralen Verpackungszelllinien mini-virale Vektoren, die von humanem Herpesvirus, Herpes simplex-Virus-Typ 1 (HSV-1) und Epstein-Barr-Virus (EBV) abgeleitet sind, entwickelt, um eine Manipulation von genetischem Material und eine Herstellung von viralen Vektoren zu vereinfachen (Wang et al., 1996, J. Virology 70(12): 8422–8430). Es wurde zuvor gezeigt, dass Adaptor-Plasmide eine Insertion von Fremd-DNA in Helfer-unabhängige retrovirale Vektoren vereinfachen (1987, J. Virology 61(10): 3004–3012).
Virale Vektoren sind nicht das einzige Mittel für eine Bewirkung von Gentherapie, da mehrere nicht-virale Vektoren auch beschrieben wurden. Ein zielgerichteter nicht-viraler Genzufuhrvektor basierend auf der Verwendung von epidermalem Wachstumsfaktor/DNA-Polyplex (EGF/DNA) führte zu einer wirksamen und spezi fischen Genzufuhr (Cristiano, 1998, Anticancer Res. 18: 3241–3246). Eine Gentherapie des Gefäßsystems und des ZNS unter Verwendung kationischer Liposomen wurde gezeigt (Yang et al., 1997, J. Neurotrauma 14(5): 281–97). Eine transiente Gentherapie von Pankreatitis wurde auch durch Verwendung kationischer Liposomen erreicht (Denham et al., 1998, Ann. Surf. 227(6): 812–20). Es wurde gezeigt, dass Chitosan-basierte Vektor/DNA-Komplexe für ein Zuführen von Genen wirksam sind (Erbacher et al., 1998, Pharm. Res. 15(9): 1332–9). Ein nicht-viraler DNA-Zufuhrvektor basierend auf einem Terplex-System wurde beschrieben (Kim et al., 1998, 53(1–3): 175–82). Viruspartikel-beschichtete Liposomenkomplexe wurden auch für einen Gentransfer verwendet (Hirai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241(1): 112–8).
Eine Gentherapie durch direkte Tumorinjektionen von nicht-viralem T7-Vektor, der für ein Thymidinkinasegen kodiert, wurde gezeigt (Chen et al., 1998, Human Gene Therapy 9: 729–736). Die Herstellung von Plasmid-DNA ist für einen Gentransfer durch direkte Injektion wichtig (Horn et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6(5): 656–73). Modifizierte Plasmidvektoren wurden spezifisch für eine direkte Injektion angepasst (Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7(10): 1205–17).
Somit sind eine große Vielzahl von Gentransfer/Gentherapie-Vektoren und -Konstrukten bekannt. Diese Vektoren werden einfach für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren angepasst. Durch die geeignete Manipulation unter Verwendung rekombinanter DNA-/Molekularbiologie-Verfahren, um ein operabel verbundenes Src oder Yes oder beides (entweder aktiv oder inaktiv) in den ausgewählten Expressions-/Zufuhrvektor zu inserieren, können viele äquivalente Vektoren für eine Durchführung der Erfindung erzeugt werden.
E. Modulation von Gefäßpermeabilität (VP)
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung für die Modulation von Gefäßpermeabilität (VP) der Blutgefäße in einem Gewebe, das mit einem Erkrankungsverlauf oder -zustand assoziiert ist, bereitgestellt und dadurch bewirkt die Erfindung Ereignisse in dem Gewebe, die von VP abhangen. Im Allgemeinen kann die Zusammensetzung in einem Verfahren verwendet werden, das eine Verabreichung an das Gewebe, das mit einem Erkrankungsverlauf oder -zustand assoziiert ist, einer Zusammensetzung umfasst, die eine VP-modulierende Menge eines Nukleinsäurevektors umfasst, der aktives oder inaktives Yes oder sowohl aktives als auch inaktives Yes und Src exprimiert.
Wie hier beschrieben kann ein jegliches einer Vielzahl von Geweben oder Organen aus organisierten Geweben eine Stelle für VP in Erkrankungszuständen sein, einschließlich Gehirn, Haut, Muskeln, Darm, Bindegewebe, Gelenke, Knochen und ähnliche Gewebe, bei denen Blutgefäße vorliegen.
Der erfindungsgemäß behandelte Patient ist vorzugsweise ein menschlicher Patient, obwohl verstanden werden soll, dass die erfindungsgemäßen Prinzipien anzeigen, dass die Erfindung bei allen Säugern wirksam ist, die von dem Begriff "Patient" eingeschlossen werden sollen. In diesem Zusammenhang soll ein Säuger eine jegliche Sängerspezies einschließen, bei der eine Behandlung von Gewebe, das mit einer Erkrankung assoziiert ist, die Angiogenese einbezieht, erwünscht ist, insbesondere Sängerspezies, die landwirtschaftliche Tiere und Haustiere sind.
Somit umfasst das Verfahren eine Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer physiologisch verträglichen Zusammensetzung mit einem DNA-Vektor für eine Expression eines Yes-Proteins oder sowohl eines Yes- als auch Src-Proteins an einen Patienten.
Im Allgemeinen wird die Dosis von dem Alter, Zustand, Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung des Patienten abhängen und kann durch den Fachmann bestimmt werden. Die Dosis kann auch durch den behandelnden Arzt bei Auftreten einer jeglichen Komplikation angepasst werden.
Eine therapeutisch wirksame VP-modulierende Menge ist eine Menge einer Nukleinsäure, die für Src- oder Yes-Protein kodiert, die ausreichend ist, um eine messbare Modulierung von VP in dem behandelten Gewebe zu erzeugen, d. h. eine VP-modulierende Menge. Modulierung von VP kann durch einen hier beschriebenen Test oder durch ein anderes bekanntes Verfahren gemessen werden.
Eine Modulierung von VP kann durch den Miller-Test wie hier beschrieben oder durch ein anderes bekanntes Verfahren gemessen werden.
Der Nukleinsäurevektor, der das Src- oder Yes-Protein oder beides exprimiert, kann parenteral durch Injektion oder durch graduelle Infusion über die Zeit verabreicht werden. Obwohl das zu behandelnde Gewebe typischerweise in dem Körper durch systemische Verabreichung zugänglich ist und daher am häufigsten durch intravenöse Verabreichung von therapeutischen Zusammensetzungen behandelt wird, sind andere Gewebe und Zufuhrmittel vorgesehen, falls eine Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass das Zielgewebe das Zielmolekül enthält. Somit können erfindungsgemäße Zusammensetzungen intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär, transdermal verabreicht werden und können durch peristaltische Mittel zugeführt werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die einen Nukleinsäurevektor enthalten, der das Src- oder Yes-Protein exprimiert, können herkömmlicherweise intravenös wie durch Injektion einer Einheitsdosis verabreicht werden. Der Begriff "Einheitsdosis" betrifft, wenn er in Bezug auf eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung verwendet wird, physikalisch getrennte Einheiten, die als einheitliche Dosen für das Lebewesen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an wirksamem Material enthält, von dem berechnet wurde, dass es die erwünschte therapeutische Wirkung zusammen mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, erzeugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Reagenz in einer einzigen Dosis intravenös verabreicht. Eine lokale Verabreichung kann durch direkte Injektion oder durch Zuhilfenahme von anatomisch isolierten Kompartimenten, Isolierung der Mikrozirkulation von Ziel-Organsystemen, Reperfusion in einem Kreislaufsystem oder von Katheter-basiertem temporärem Verschluss von Zielregionen des Gefäßsystems, die mit erkrankten Geweben assoziiert sind, erfolgen.
Die Zusammensetzungen werden in einer Weise, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge und der Zeitablauf hängen von dem zu behandelnden Lebewesen, der Fähigkeit des Systems des Lebewesens, den wirksamen Bestandteil zu verwenden, und dem Grad der erwünschten therapeutischen Wirkung ab. Genaue Mengen an aktivem Bestandteil, die für eine Verabreichung erforderlich sind, hängen von der Beurteilung des Fachmanns ab und sind für jedes Lebewesen spezifisch. Jedoch sind geeignete Dosisbereiche für eine systemische Verabreichung hier beschrieben und hängen von dem Verabreichungsweg ab. Geeignete Verabreichungspläne sind auch variabel, typisch ist jedoch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosen bei Intervallen von einer oder mehreren Stunden durch eine darauf folgende Injektion oder andere Verabreichung. Alternativ ist eine kontinuierliche intravenöse Infusion, die ausreichend ist, um Konzentrationen in dem Blut in Bereichen aufrecht zu erhalten, die für in vivo-Therapien spezifiziert sind, vorgesehen. Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, von denen angenommen wird, dass eine Hemmung von Angiogenese wichtig ist, die als angiogene Erkrankungen bezeichnet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise entzündliche Erkrankungen wie Immun- und Nicht-Immun-Entzündung, chronischer Gelenkrheumatismus und Psoriasis, Erkrankungen, die mit einem unangemessenen oder ungünstigen Einwandern von Gefäßen assoziiert sind, wie diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Restenose, Kapillarproliferation in arteriosklerotischen Plaques und Osteoporose und Krebs-assoziierte Erkrankungen wie solide Tumoren, solide Tumormetastasen, Angiofibrome, retrolentale Fibroplasie, Hämangiome, Kaposi-Sarkom und ähnliche Krebstypen, die für ein Unterstützen eines Tumorwachstums einer Neovaskularisierung bedürfen.
In ähnlicher Weise ist Gefäßpermeabilität eine wichtige Komponente von Angiogenese und selbst mit schädlichen Pathologien assoziiert. Beispielsweise löst eine Schädigung aufgrund einer Schlaganfall-induzierten Gefäßpermeabilität eine Entzündungs-bezogene Schädigung aus.
Somit lindern Verfahren, die Gefäßpermeabilität in einem Gewebe hemmen, das mit einem Erkrankungszustand assoziiert ist, Symptome der Erkrankung und abhängig von der Erkrankung können sie zur Heilung der Erkrankung beitragen. In einer Ausführungsform ist erfindungsgemäß die Hemmung von Gefäßpermeabilität per se in einem Gewebe vorgesehen, das mit einem Erkrankungszustand assoziiert ist. Das Ausmaß an Gefäßpermeabilität in einem Gewebe und daher das Ausmaß an erreichter Hemmung kann durch eine Vielzahl von Verfahren bewertet werden. Somit ist in einer verwandten Ausführungsform ein zu behandelndes Gewebe ein entzündetes Gewebe und die zu hemmende Gefäßpermeabilität hat ihre Ursache in einer VEGF-vermittelten Stimulierung. In dieser Klasse sieht das Verfahren eine Hemmung von VP in arthritischen Geweben wie in einem Patienten mit chronischem Gelenkrheumatismus, in immun- oder nicht-immun-entzündeten Geweben, in psoriatischem Gewebe und dergleichen vor.
In einer verwandten Ausführungsform ist ein zu behandelndes Gewebe ein Retinagewebe eines Patienten mit einer Retinaerkrankung wie diabetischer Retinopathie, Makulardegeneration oder neovaskulärem Glaukom und die zu hemmende VP ist VP von Retinagewebe, bei dem Neovaskularisierung von Retinagewebe auftritt.
Die Verfahren sind auch besonders gegen die Bildung von Metastasen wirksam, da (1) ihre Bildung eine Vaskularisierung eines Primärtumors erfordert, so dass die metastatischen Krebszellen aus dem Primärtumor austreten können, und (2) ihre Etablierung an einer Sekundärstelle eine Neovaskularisierung erfordert, um ein Wachstum der Metastasen zu unterstützen.
In einer verwandten Ausführungsform sieht die Erfindung die Durchführung zusammen mit anderen Therapien wie einer herkömmlichen Chemotherapie gegen solide Tumoren und zur Steuerung einer Etablierung von Metastasen vor. Die Verabreichung eines VP-Inhibitors erfolgt typischerweise während oder nach einer Chemotherapie, obwohl es bevorzugt ist, VP nach einem Chemotherapieplan zu Zeitpunkten zu hemmen, zu denen das Tumorgewebe auf den toxischen Angriff durch Induktion von VP, um die Bereitstellung einer Blutzufuhr und von Nährstoffen für das Tumorgewebe wiederherzustellen, reagieren wird. Des Weiteren ist es möglich, die Verfahren zur Hemmung von Gefäßpermeabilität nach einer Operation, wobei solide Tumoren entfernt wurden, als eine Prophylaxe gegen Metastasen zu verabreichen.
Sofern die Erfindung auf eine Hemmung von Gefäßpermeabilität, die bei Metastasen beteiligt ist, Anwendung findet, kann die Erfindung auch auf eine Hemmung der Bildung von Metastasen und auf eine Regression von etablierten Tumoren angewandt werden.
Restenose ist ein Vorgang einer Wanderung und Proliferation von glatten Muskelzellen (SMC) in das Gewebe an der Stelle einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie, was den Erfolg einer Angioplastie hemmt. Die Wanderung und Proliferation von SMCs während einer Restenose kann als ein Vorgang von VP betrachtet werden, der erfindungsgemäß gehemmt wird. Daher ist erfindungsgemäß auch eine Hemmung von Restenose durch Hemmung von Gefäßpermeabilität in einem Patienten nach Angioplastie-Eingriffen vorgesehen. Für eine Hemmung von Restenose wird die inaktivierte Tyrosinkinase typischerweise nach dem Angioplastie-Eingriff verabreicht, da die Koronargefäßwand ein Risiko für Restenose typischerweise etwa 2 bis etwa 28 Tage und noch typischer etwa die ersten 14 Tage nach dem Eingriff aufweist.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einem Verfahren zur Hemmung von Gefäßpermeabilität in einem Gewebe, das mit einem Erkrankungszustand assoziiert ist, und daher auch für die Durchführung der Behandlung von Erkrankungen, die mit Gefäßpermeabilität in Beziehung stehen, verwendet werden, wobei das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen eines Gewebes, bei dem erhöhte Gefäßpermeabilität auftritt, oder das ein Risiko für ein solches Auftreten aufweist, mit einer Zusammensetzung umfasst, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Vektors umfasst, der ein inaktiviertes Yes-Protein oder ein inaktiviertes Src- und Yes-Protein exprimiert.
Eine Manipulation der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke, um den Zugang von Arzneistoffen zu dem Gehirngewebe zu modulieren, ist vorgesehen. Eine Erhöhung der Gefäßpermeabilität der Blut-Hirn-Schranke wird es Arzneistoffen, die normalerweise nicht die Schranke überqueren können, ermöglichen, in die Gehirngewebe einzudringen.
Eine Hemmung oder Verstärkung von Angiogenese tritt deutlich 5 bis 7 Tage nach dem anfänglichen Kontaktieren mit der therapeutischen Zusammensetzung der Beispiele auf. In ähnlicher Weise kann eine Modulierung von VP in einem ähnlichen zeitlichen Rahmen auftreten. Wirkungen können innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach einer Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung auftreten. Die Zeit-begrenzenden Faktoren umfassen Geschwindigkeit einer Geweberesorption, zelluläre Aufnahme, Proteintranslokation oder Nukleinsäuretranslation (abhängig von dem Therapeutikum) und Protein-Zielsteuerung. Somit können VP-modulierende Wirkungen in so wenig wie einer Stunde ausgehend von dem Zeitpunkt einer Verabreichung auftreten. Eine weitere oder verlängerte Exposition gegenüber inaktivem Src- und/oder Yes-Protein kann auch erfolgen, wobei die richtigen Bedingungen verwendet werden. Somit kann eine Vielzahl von erwünschten therapeutischen zeitlichen Rahmen durch Modifizieren solcher Parameter entworfen werden.
Die Erfindung umfasst auch eine Verabreichung einer Zusammensetzung, die einen Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor umfasst, an ein Gewebe, das mit einem Erkrankungsverlauf oder einer Blutgefäßverletzung oder einem Traumazustand assoziiert ist.
Beispiele für geeignete chemische Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren umfassen in nicht begrenzender Weise PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamycin und dergleichen.
PP1 (von Biomol, unter Lizenz von Pfizer) war der für diese Untersuchungen verwendete synthetische Src-Inhibitor. PP1 ist Teil der Pyrazolpyrimidin-Familie von Src-Inhibitoren. Andere synthetische Src-Inhibitoren umfassen PP2 (von Calbiochem, unter Lizenz von Pfizer), das hinsichtlich der Struktur mit PP1 in Beziehung steht, und es wurde auch gezeigt, dass es Src-Familie-Kinase-Aktivität blockiert (Hanke et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(2): 695–701). Andere spezifische Src-Kinase-Inhibitoren umfassen PD173955 (Moasser et al., 1999, Cancer Res. 59: 6145–6152, Parke Davis), wofür die Struktur veröffentlicht wurde. PD162531 (Owens et al., 2000, Mol. Biol. Cell 11: 51–64) ist auch ein spezifischer Src-Kinase-Inhibitor von Parke Davis, aber die Struktur ist aus der Literatur nicht zugänglich. Geldanamycin ist auch ein Src-Kinase-Inhibitor, der von Life Technologies erhältlich ist. Radicicol, das käuflich von verschiedenen Firmen (z. B. Calbiochem, RBI, Sigma) angeboten wird, ist ein fungizides makrocyclisches Lacton-Antibiotikum, das auch als unspezifischer Protein-Tyrosinkinase-Inhibitor fungiert und für das gezeigt wurde, dass es Src-Kinase-Aktivität hemmt. Bevorzugte chemische Inhibitoren sind PP1 und PP2 oder dergleichen, wobei ein am meisten bevorzugter chemischer Inhibitor PP1 ist.
Weitere geeignete Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren können unter Verwendung bekannter Standardverfahren identifiziert und charakterisiert werden. Beispielsweise wurde ein Screening nach chemischen Verbindungen für potente und selektive Inhibitoren von Src oder anderen Tyrosinkinasen durchgeführt und führte zu der Identifizierung von chemischen Gruppen, die bei potenten Inhibitoren von Src-Familie-Tyrosinkinasen verwendbar sind.
Beispielsweise wurden Katechole als wichtige Bindeelement für eine Reihe von Tyrosinkinase-Inhibitoren, die von natürlichen Produkten abgeleitet sind, identifiziert und sie wurden in Verbindungen gefunden, die durch kombinatorische Ziel-gesteuerte Selektion auf selektive Inhibitoren von c-Src selektiert wurden; vgl. Maly, D. J. et al. (2000, "Combinatorial target-guided ligand assembly: Identification of potent subtype-selective c-Src inhibitors" PNAS (USA) 97(6): 2419–2424). Kombinatorische Chemie-basiertes Screening von Kandidaten-Inhibitorverbindungen unter Verwendung von Gruppen, von denen bekannt ist, dass sie für eine Src-Hemmung wichtig sind, als Ausgangspunkt ist ein leistungsstarkes und wirksames Mittel für eine Iso lierung und Charakterisierung anderer chemischer Inhibitoren von Src-Familie-Tyrosinkinasen.
Jedoch kann sogar eine sorgfältige Selektion von möglichen Bindeelementen basierend auf dem Potential, einen großen Bereich von Funktionalitäten auf Polypeptiden und Nukleinsäuren nachzuahmen, verwendet werden, um ein kombinatorisches Screening für aktive Inhibitoren durchzuführen. Beispielsweise sind O-Methyloxim-Bibliotheken besonders für diese Aufgabe geeignet, berücksichtigt man, dass die Bibliothek leicht durch Kondensation von O-Methylhydroxylamin mit einem jeglichen einer großen Anzahl von käuflich verfügbaren Aldehyden hergestellt wird. O-Alkyloxim-Bildung ist mit einem großen Bereich von Funktionalitäten, die bei physiologischem pH-Wert stabil sind, kompatibel; Malay et al., supra.
Wie beschrieben umfassen geeignete Src-Familie-Kinase-Inhibitoren auch eine VP-hemmende Menge eines inaktiven Src- oder Yes-Proteins oder eines Gemisches davon oder eines Nuldeinsäurevektors, der inaktives Src oder Yes oder beides exprimiert.
Andere geeignete Src-Familie-Kinase-Inhibitoren umfassen CSK oder einen Nukleinsäurevektor, der inaktivierende Mengen von CSK exprimiert.
Wie hier beschrieben kann ein jegliches einer Vielzahl von Geweben oder Organen aus organisierten Geweben eine Stelle für VP in Erkrankungszuständen sein, einschließlich Gehirn, Haut, Muskel, Darm, Bindegewebe, Gelenke, Knochen und ähnliche Gewebe, bei denen Blutgefäße vorliegen.
Der Patient, der erfindungsgemäß behandelt werden kann, ist vorzugsweise ein menschlicher Patient, obwohl verstanden werden soll, dass die erfindungsgemäßen Prinzipien anzeigen, dass die Behandlung bei allen Säugern wirksam ist. In diesem Zusammenhang wird ein Säuger dahingehend verstanden, dass er eine jegliche Sängerspezies einschließt, bei der eine Behandlung von Gewebeschädigung, die mit Durchsickern durch Gefäße oder Odem assoziiert ist, erwünscht ist, insbesondere Sängerspezies, die landwirtschaftliche Tiere und Haustiere sind.
Die Dosisbereiche für die Verabreichung von chemischen Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren wie PP1 können in einem Bereich von etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht oder bis zu der Grenze einer Löslichkeit des wirk samen Mittels in dem pharmazeutischen Träger liegen. Vorzugsweise können typische Dosen etwa 1 mg/kg Körpergewicht bis etwa 9 mg/kg betragen. Niedrigere Dosen wie von 0,1 mg/kg Körpergewicht bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht können bezüglich einer mehrfachen Verabreichung, um chronische Zustände zu behandeln, optimiert werden. Typische Dosen für eine Behandlung akuter Zustände, die weniger schwerwiegend und leicht zugänglich sind, und bei denen der Verabreichungsweg direkter ist, können etwa 1 mg/kg bis etwa 3 mg/kg Körpergewicht betragen. Abhängig von der Schwere der Verletzung, der Lage oder dem Verabreichungsweg kann eine höhere Dosis von etwa 3 mg/kg Körpergewicht bis 10 mg/kg Körpergewicht (oder bis zu der Löslichkeitsgrenze des Mittels in dem pharmazeutischen Träger) verwendet werden, wenn eine ernsthaftere Verletzung oder eine schwer zugängliche Stelle vorliegt oder falls eine Verabreichung nur über den indirekten systemischen Weg erfolgen kann.
In dem Fall von akuter Verletzung oder Trauma ist es am besten, eine Behandlung so bald wie möglich nach Auftreten der Störung zu verabreichen. Jedoch kann der Zeitpunkt für eine wirksame Verabreichung von Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren innerhalb von etwa 48 Stunden ausgehend von dem Ausbruch der Verletzung oder des Traumas in dem Fall von akuten Störungen liegen. Es ist bevorzugt, dass eine Verabreichung innerhalb von etwa 24 Stunden eines Ausbruchs erfolgt, wobei 12 Stunden besser ist und am meisten bevorzugt ist, dass eine Verabreichung innerhalb von etwa 6 Stunden eines Ausbruchs stattfindet. Eine Verabreichung nach 48 Stunden einer anfänglichen Verletzung kann geeignet sein, um weitere Gewebeschädigung aufgrund weiterem Durchsickern durch Gefäße oder Ödem zu lindern, jedoch kann die Wirkung auf die anfängliche Gewebeschädigung stark vermindert sein.
Falls eine prophylaktische Verabreichung durchgeführt wird, um ein Durchsickern durch Gefäße oder Ödem, das mit einem operativen Verfahren assoziiert ist, zu verhindern, oder eine derartige Verabreichung im Hinblick auf eine Prädisponierung von diagnostischen Kriterien durchgeführt wird, kann eine Verabreichung vor einer eigentlichen VP-Zunahme oder während eines solchen VP-Zunahme-verursachenden Ereignisses erfolgen. Für die Behandlung chronischer Zustände, die zu einer VP-Zunahme und einem assoziierten Durchsickern durch Gefäße oder Ödem führen, kann eine Verabreichung von aktive Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren mit Hilfe eines kontinuierlichen Dosisplans erfolgen.
Eine therapeutisch wirksame VP-modulierende Menge ist eine Menge an Nukleinsäure, die für inaktives Src- oder Yes-Protein kodiert, die ausreichend ist, um eine messbare Modulierung von VP in dem behandelten Gewebe zu erzeugen, d. h. eine VP-modulierende Menge. Eine Modulierung von VP kann durch einen hier beschriebenen Test oder durch andere bekannte Verfahren gemessen werden. Eine Modulierung von VP kann durch den Miller-Test wie hier beschrieben oder durch andere bekannte Verfahren gemessen werden.
Im Allgemeinen kann die Dosis von dem Alter, Zustand, Geschlecht, und dem Ausmaß der Erkrankung bei dem Patienten abhängen und kann durch den Fachmann bestimmt werden. Die Dosis kann auch durch den behandelnden Arzt im Fall einer jeglichen Komplikation angepasst werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können parenteral durch Injektion oder durch graduelle Infusion über die Zeit verabreicht werden. Obwohl das zu behandelnde Gewebe typischerweise in dem Körper durch systemische Verabreichung zugänglich ist und daher am häufigsten durch intravenöse Verabreichung von therapeutischen Zusammensetzungen behandelt werden kann, sind andere Gewebe und Zufuhrmittel vorgesehen, falls es eine Wahrscheinlichkeit dafür gibt, dass das angesteuerte Gewebe das Zielmolekül enthält. Somit können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär, transdermal verabreicht werden und können durch peristaltische Mittel zugeführt werden.
Eine intravenöse Verabreichung wird beispielsweise durch die Injektion einer Einheitsdosis bewirkt. Der Begriff "Einheitsdosis" betrifft, wenn er in Bezug auf eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung verwendet wird, physikalisch getrennte Einheiten, die als Einheitsdosis für das Lebewesen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorher bestimmte Menge an wirksamem Material enthält, von der berechnet wurde, dass sie die erwünschte therapeutische Wirkung zusammen mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, erzeugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform soll das wirksame Mittel intravenös in einer einzigen Dosis verabreicht werden. Eine lokale Verabreichung kann durch direkte Injektion oder durch Zuhilfenahme von anatomisch isolierten Kompartimenten, Isolierung der Mikrozirkulation von Ziel-Organsystemen, Reperfusion in einem Kreis laufsystem oder Katheter-basiertem temporärem Verschluss von Zielregionen des Gefäßsystems, die mit erkrankten Geweben assoziiert sind, erfolgen.
Die Zusammensetzungen sollen in einer Weise, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden. Die zu verabreichende Menge und die Zeiteinteilung hängen von dem zu behandelnden Lebewesen, der Fähigkeit des Systems des Lebewesens, den wirksamen Bestandteil zu verwenden, und dem Grad einer erwünschten therapeutischen Wirkung ab. Genaue Mengen eines zu verabreichenden wirksamen Bestandteils hängen von der Beurteilung des Fachmanns ab und sind für jedes Lebewesen spezifisch. Jedoch sind geeignete Dosisbereiche für eine systemische Verabreichung hier beschrieben und hängen von dem Verabreichungsweg ab. Geeignete Pläne für eine Verabreichung sind auch veränderlich, typisch ist jedoch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosen bei Intervallen von einer oder mehreren Stunden durch eine darauf folgende Injektion oder eine andere Verabreichung. Alternativ ist eine kontinuierliche intravenöse Infusion, die ausreichend ist, um Konzentrationen in dem Blut in Bereichen zu halten, die für in vivo-Therapien spezifiziert sind, vorgesehen.
Eine Linderung von Gewebeschädigung aufgrund eines Durchsickerns durch Gefäße oder aufgrund von Ödem, das mit einem Erkrankungszustand, einer Verletzung oder Trauma assoziiert ist, lindert Symptome der Erkrankung und kann abhängig von der Erkrankung zu der Heilung der Erkrankung beitragen. Das Ausmaß an Gefäßpermeabilität in einem Gewebe und daher das Ausmaß einer Hemmung kann durch eine Vielzahl von Verfahren bewertet werden. Insbesondere können Schlaganfall oder eine andere mit einer cerebrovaskulären Störung in Beziehung stehende Verletzung des ZNS, die aufgrund einer Verletzungs-induzierten Zunahme von VP auftreten, und eine darauf folgende Schädigung aufgrund eines Durchsickerns durch Gefäße und/oder eines Ödems der assoziierten Gewebe gelindert werden.
In einer verwandten Ausführungsform ist ein zu behandelndes Gewebe ein entzündetes Gewebe und die zu hemmende Gefäßpermeabilität beruht auf einer VEGF-vermittelten Stimulierung. Für diesen Typ einer Krankheit sieht die Erfindung eine Hemmung von VP in arthritischen Geweben wie in einem Patienten mit chronischem Gelenkrheumatismus, in immun- oder nicht-immun-entzündeten Geweben, in psoriatischem Gewebe und dergleichen vor.
In einer weiteren verwandten Ausführungsform ist ein zu behandelndes Gewebe ein Retinagewebe eines Patienten mit einer Retinaerkrankung wie diabetischer Retinopathie, Makulardegradation oder neovaskulärem Glaukom und die VP, die gehemmt werden soll, ist VP des Retinagewebes mit Neovaskularisierung von Retinagewebe.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einem Verfahren zur Hemmung von Gefäßpermeabilität in einem Gewebe, das mit einer Verletzung oder einem Erkrankungszustand assoziiert ist, und daher auch für eine Durchführung der Behandlung von Gefäßpermeabilität-bezogenen Erkrankungen verwendet werden, wobei das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen eines Gewebes, in dem eine erhöhte Gefäßpermeabilität auftritt oder ein Risiko für ein derartiges Auftreten besteht, mit einer Zusammensetzung umfasst, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitors umfasst.
Eine Modulierung von VP und eine Linderung von Gewebeschädigung aufgrund Durchsickerns durch Gewebe und Ödem kann innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach Verabreichen der therapeutischen Zusammensetzung auftreten. Die meisten therapeutischen Wirkungen können innerhalb von drei Tagen nach Verabreichung in dem Fall von akuter Verletzung oder akutem Trauma sichtbar gemacht werden. Typischerweise sind Wirkungen einer chronischen Verabreichung nicht so leicht augenscheinlich.
Die Zeit-begrenzenden Faktoren umfassen die Geschwindigkeit einer Geweberesorption, zelluläre Aufnahme, Protein-Translokation oder Nukleinsäure-Translation (abhängig von dem Therapeutikum) und Protein-Zielsteuerung. Somit können Wirkungen, die eine Gewebeschädigung modulieren, in so wenig wie einer Stunde ausgehend von dem Zeitpunkt einer Verabreichung des Inhibitors auftreten. Eine weitere oder verlängerte Exposition gegenüber Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren kann unter Verwendung der geeigneten Bedingungen auch erfolgen. Somit kann eine Vielzahl von erwünschten therapeutischen zeitlichen Rahmen durch Modifizieren solcher Parameter entworfen werden.
F. Therapeutische Zusammensetzungen (allgemeine Betrachtungen)
Erfindungsgemäß sind therapeutische Zusammensetzungen vorgesehen, die für ein Durchführen der hier beschriebenen therapeutischen Verfahren verwendbar sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die therapeutische Zusammensetzung bei einer Verabreichung an einen Säuger-Patienten oder menschlichen Patienten für therapeutische Zwecke nicht immunogen.
Wie hier verwendet, werden die Begriffe "pharmazeutisch verträglich", "physiologisch verträglich" und grammatikalische Variationen davon, wie sie Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien betreffen, austauschbar verwendet und stellen dar, dass die Materialien an einen oder bei einem Säuger verabreicht werden können, ohne dass sie unerwünschte physiologische Wirkungen wie Übelkeit, Schwindel, Magenstörungen und dergleichen erzeugen.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die darin gelöste oder dispergierte wirksame Bestandteile enthält, ist im Fachgebiet bekannt und braucht basierend auf einer Formulierung nicht begrenzt zu werden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als Einspritzmittel entweder als flüssige Lösungen oder Suspension hergestellt, jedoch können feste Formen, die vor einer Verwendung für ein Lösen oder Suspendieren in einer Flüssigkeit geeignet sind, auch hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert oder als Liposomenzusammensetzung dargeboten werden.
Der wirksame Bestandteil kann mit Exzipienzien, die pharmazeutisch verträglich und mit dem wirksamen Bestandteil kompatibel sind, in Mengen gemischt werden, die für eine Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Exzipienzien sind beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Des Weiteren kann, falls erwünscht, die Zusammensetzung kleinere Mengen an Hilfssubstanzen wie Benetzungsmittel oder Emulgationsmittel, pH-Pufferstoffe und dergleichen enthalten, die die Wirksamkeit des wirksamen Bestandteils verstärken.
Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann pharmazeutisch verträgliche Salze der Bestandteile darin enthalten. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids), die mit anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essig-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen gebildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen wie Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Prokain und dergleichen abgeleitet sein.
Physiologisch verträgliche Träger sind bekannt. Beispiele für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine Materialien zusätzlich zu den wirksamen Bestandteilen und Wasser enthalten oder einen Puffer wie Natriumphosphat bei einem physiologischen pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beides wie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthalten. Des Weiteren können wässrige Träger mehr als ein Puffersalz, sowie Salze wie Natrium- und Kaliumchloride, Dextrose, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe enthalten.
Flüssige Zusammensetzungen können auch flüssige Phasen zusätzlich zu und unter Ausschluss von Wasser enthalten. Beispiele für solche weiteren flüssigen Phasen sind Glycerin, Pflanzenöle wie Baumwollsamenöl und Wasser-Öl-Emulsionen.
F(i). Erfindungsgemäße VP-modulierende therapeutische Zusammensetzungen
Bezüglich DNA-Expressionsvektoren hängt die verabreichte Menge von den Eigenschaften des Expressionsvektors, dem zu behandelnden Gewebe und ähnlichen Betrachtungen ab.
F(ii). Erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen von Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren
Geeignete Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren werden spezifisch die biologische Tyrosinkinase-Aktivität von Src-Familie-Tyrosinkinasen hemmen. Eine am meisten geeignete Src-Familie-Tyrosinkinase wird eine primäre Spezifität für eine Hemmung der Aktivität des ^pp60Src-Proteins aufweisen und sekundär die am meisten verwandten Src-Familie-Tyrosinkinasen wie Yes hemmen. Beispiele für besonders geeignete Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren umfassen PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamycin und dergleichen. Weitere geeignete chemische Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren können unter Zuhilfenahme bekannter Standardtests identifiziert und charakterisiert werden.
Mutationen in Src, für die gezeigt ist, dass sie VP hemmen und nicht stimulieren, werden als inaktive Src-Mutationen bezeichnet. Proteine mit Mutationen, die diese hemmende Aktivität verleihen, werden auch als dominant negative Src-Proteine dadurch bezeichnet, dass sie VP hemmen, einschließlich derjenigen, die sich aus einer endogenen Aktivität von Src, sowie einer verstärkten Src-Aktivität aufgrund einer Wachstumsfaktor-Simulierung ergibt. Somit können bestimmte erfindungsgemäße Mutationen von Wildtyp-c-Src auch als dominant negativ im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Blutgefäßwachstum und VP zu blockieren, fungieren und beispielsweise daher VP in vivo verringern. Daher können andere geeignete Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren inaktive Formen von Src- und Yes-Protein umfassen, die Src- oder Yes-Aktivität antagonisieren können, was zu einer Hemmung oder Verringerung von Gefäßpermeabilität von Blutgefäßen in dem Zielgewebe führt. Ein bevorzugtes inaktives Src-Protein ist Src 251. Ein weiteres bevorzugtes inaktives Src-Protein ist Src K295M. Ein bevorzugtes inaktives Yes-Protein wird eine verringerte Kinaseaktivität im Vergleich zu dem Wildtyp-Protein aufweisen.
Andere Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitoren können Antisense-Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga oder Protein-Nukleinsäuren sein, die die Expression von Src- oder Yes-Genen in Zielzellen hemmen. Die Antisense-Moleküle können eine therapeutisch wirksame, VP-modulierende Menge sein, wenn die Antisense-Nukleinsäure, die zur Hybridisierung an die für Src- oder Yes-Protein kodierende mRNA fähig ist, an eine solche mRNA hybridisieren kann und zu einer Hemmung der Zellexpression von Tyrosinkinase-Protein Src oder Yes bei einer Transfektion in eine Zielzelle in einem geeigneten pharmazeutischen Träger führen kann.
Wie beschrieben umfasst ein bevorzugtes inhibierendes c-Src-Protein das Src 251, bei dem nur die ersten 251 Aminosäuren von Src exprimiert werden. Diesem Konstrukt fehlt die gesamte Kinasedomäne und es wird daher als "Kinase-totes" Src-Protein bezeichnet. Ein zweites Konstrukt ist die Src(K295M)-Mutation, bei der der Lysin-Aminosäurerest 295 in ein Methionin mutiert ist. Diese Punktmutation in der Kinasedomäne verhindert ein Binden von ATP und blockiert auch Kinase-abhängige Src-Funktionen, die mit einer Gefäßzell- und Tumorzellsignalgebung und -proliferation in Beziehung stehen.
Im Hinblick auf die Punktmutationen ist eine jegliche Mutation, die zu der erwünschten inhibitorischen Aktivität führt, für eine erfindungsgemäße Verwendung vorgesehen. Fusionsproteinkonstrukte, die das erwünschte Src-Protein (Mutation oder Fragment davon) mit exprimierten Aminosäure-Tags, antigenen Epitopen, fluoreszierenden Proteinen oder anderen solchen Proteinen oder Peptiden kombinieren, sind auch vorgesehen, sofern die erwünschte modulierende Wirkung des Src-Proteins intakt bleibt.
In ähnlicher Weise ist die Zugabe eines exogenen Inhibitors der Src-Protein-Aktivität oder die Stimulierung einer Expression eines solchen Inhibitors innerhalb der Zielgewebe wie CSK (C-terminale Src-Kinase) auch ein Mittel für eine Hemmung von Src-Aktivität. Eine Phosphorylierung von Tyrosin, die Src inaktiviert, ist ein Mittel für eine negative Regulierung durch die C-terminale Src-Kinase, bezeichnet als CSK (Nada et al., 1991, Nature 351: 69–72, Okada et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(36): 24249–24252). Wenn CSK AS527 in dem Wildtyp-Src phosphoryliert, wird das Src-Protein inaktiviert. Somit ist CSK ein geeigneter und potenter Inhibitor der Src-Aktivität. Die humane CSK-Proteinsequenz mit 450 Aminosäuren ist durch die Zugangsnummer P41240 identifiziert und findet sich in der Swiss-Protein-Datenbank. Eine humane CSK-kodierende mRNA-Nukleinsäuresequenz ist durch die Zugangsnummer NM 004383 in der GenBank-Datenbank identifiziert.
Bezüglich Expressionsvektoren hängt die verabreichte Menge von den Eigenschaften des Expressionsvektors, dem zu behandelnden Gewebe und dergleichen ab. Somit ist eine wirksame Menge eines Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitors in einer pharmazeutischen Zusammensetzung diejenige Menge, die zu einer therapeutisch wirksamen Modulierung von Src-regulierter Gefäßpermeabilität führt. Eine therapeutische Menge einer jeglichen pharmazeutischen Zusammensetzung ist eine Menge, die selbst zu einer Linderung von Gewebeschädigung führt, die mit einem Durchsickern durch Gefäße oder Ödem in Beziehung steht.
G(i) Allgemeine Betrachtungen; Herstellungsartikel
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff Verpackungsmaterial ein Material wie Glas, Kunststoff, Papier, Folie und dergleichen, das fähig ist, ein pharmazeutisches Mittel innerhalb fester Mittel aufzunehmen. Somit kann das Verpackungsmaterial beispielsweise Kunststoff- oder Glasgefäße, laminierte Hüllen und ähnliche Behälter sein, die verwendet werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu enthalten, die das pharmazeutische Mittel einschließt.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verpackungsmaterial einen Hinweis, der ein materieller Ausdruck ist, der den Inhalt des Herstellungsartikels und die Verwendung des darin enthaltenen pharmazeutischen Mittels beschreibt.
G(ii) VP-modulierende therapeutische Zusammensetzungen; Herstellungsartikel
Das pharmazeutische Mittel in einem Herstellungsartikel ist eine jegliche der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die für eine Bereitstellung eines Src- und Yes-Proteins geeignet sind und in einer pharmazeutisch verträglichen Form wie hier beschrieben gemäß den beschriebenen Angaben formuliert sind. Somit kann die Zusammensetzung eine DNA, die zur Expression von Yes-Protein fähig ist, oder eine DNA, die zur Expression von sowohl Yes- als auch Src-Proteinen fähig ist, umfassen. Der Herstellungsartikel enthält eine Menge des pharmazeutischen Mittels, die ausreichend für eine Verwendung bei einer Behandlung eines hier beschriebenen Zustands ist, entweder in einer Einheitsdosis oder in mehreren Dosen.
Das Src- oder Yes-Protein kann aktiv oder inaktiv sein, abhängig von der erwünschten Modulierung. Bevorzugte Formen von aktivem und inaktivem Src und Yes sind vorstehend beschrieben.
Das Verpackungsmaterial umfasst einen Hinweis, der die Verwendung des pharmazeutischen Mittels, das darin enthalten ist, z. B. für eine Behandlung von Zuständen, die durch die Hemmung oder Verstärkung von Gefäßpermeabilität unterstützt wird, und ähnlichen hier beschriebenen Zuständen anzeigt. Der Hinweis kann ferner Anweisungen für eine Verwendung und verwandte Information, wie sie für eine Vermarktung erforderlich sein kann, umfassen. Das Verpackungsmaterial kann (einen) Behälter für eine Lagerung des pharmazeutischen Mittels umfassen.
G(iii). Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor-Zusammensetzung; Herstellungsartikel
Erfindungsgemäß ist auch ein Herstellungsartikel vorgesehen, der ein markierter Behälter für eine Bereitstellung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitors ist. Ein Herstellungsartikel umfasst ein Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Mittel, das in dem Verpackungsmaterial enthalten ist. Der Herstellungsartikel kann auch zwei oder mehrere subtherapeutisch wirksame Mengen einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten, die zusammen synergistisch wirken, um in einer Linderung von Gewebeschädigung aufgrund Durchsickerns durch Gefäße oder Ödem zu resultieren.
Das pharmazeutische Mittel in einem Herstellungsartikel ist eine jegliche der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die für eine Bereitstellung eines Src-Familie- Tyrosinkinase-Inhibitors geeignet sind und in einer pharmazeutisch verträglichen Form wie hier beschrieben gemäß den beschriebenen Angaben formuliert sind. Somit kann die Zusammensetzung einen chemischen Inhibitor wie PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 und Geldanamycin, einen Proteininhibitor wie inaktives Src, inaktives Yes, aktives CSK-Protein oder ein Nukleinsäuremolekül, das zur Expression eines solchen Proteins oder einer solchen Kombination von Proteinen fähig ist, umfassen. Der Herstellungsartikel enthält eine Menge eines pharmazeutischen Mittels, die für eine Verwendung bei einer Behandlung eines hier beschriebenen Zustands ausreichend ist, entweder in einer Einheitsdosis oder in mehreren Dosen.
Das Verpackungsmaterial umfasst einen Hinweis, der die Verwendung des darin enthaltenen pharmazeutischen Mittels z. B. für eine Behandlung von Zuständen, die durch die Hemmung einer Zunahme der Gefäßpermeabilität unterstützt wird, und ähnliche hier beschriebene Zustände anzeigt. Der Hinweis kann ferner Anleitungen für eine Verwendung und verwandte Information, wie sie für eine Vermarktung erforderlich sein kann, umfassen. Das Verpackungsmaterial kann (einen) Behälter für eine Lagerung des pharmazeutischen Mittels umfassen.
Beispiele
Die nachstehenden die Erfindung betreffenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollten natürlich nicht als für die Erfindung spezifisch begrenzend verstanden werden. Darüber hinaus sollen Abänderungen der Erfindung, die bekannt sind oder später entwickelt werden und sich im Bereich des Fachmanns befinden, in den Umfang der vorliegenden Erfindung wie nachstehend beansprucht fallen.
1. Herstellung von c-src- oder c-yes-Expressionskonstrukten
Für eine Herstellung der Expressionskonstrukte, die für eine Modulierung von VP und Angiogenese verwendbar sind, wird c-src-cDNA manipuliert und in ein/einen Expressionskonstrukt/-vektor inseriert.
Die cDNA-Sequenz, die für Wildtyp (d. h. endogenes)-Hühner-c-src kodiert, ist in 1 gezeigt (SEQ ID NO: 2), wobei die kodierte Aminosäurerestsequenz in 2 gezeigt ist (SEQ ID NO: 3). Die kodierte Proteinsequenz wird anhand der cDNA-Nukleotidpositionen 112 bis 1713 translatiert. Die Nukleinsäuresequenz, die der Nuk leinsäuresequenz von humaner c-src-cDNA (SEQ ID NO: 4) entspricht, und die kodierte Aminosäurerestsequenz (SEQ ID NO: 5) sind jeweils in den 3 und 4 gezeigt. Bezüglich der humanen Proteinsequenz beginnt die kodierende Sequenz bei Nukleotidposition 134 bis 1486 der cDNA.
Wildtyp- sowie eine Reihe von mutierten c-src-cDNAs wurden hergestellt. Mutierte c-Src-Konstrukte wurden durch stellengerichtete Mutagenese wie durch Kaplan et al., EMBO J., 13: 4745–4756 (1994) beschrieben hergestellt. Die mutierten c-Src-Konstrukte für eine Kodierung von mutierten Src-Proteinen für eine erfindungsgemäße Verwendung sind in Kapla et al., id., beschrieben. Kaplan et al. beschreiben verschiedene mutierte c-Src-Konstrukte und kodierte Proteine, die für die Durchführung der Erfindung verwendbar sind. Beispielsweise zeigen Kaplan et al. mehrere Produkte von Hühner-c-src-Allelen in ihrer 1, einschließlich Src A und Src 251.
Die Erfindung beschreibt zwei Kategorien von c-Src-Funktion, um VP zu modulieren. Wie zuvor beschrieben enthält eine Kategorie Src-Moleküle, die VP erhöhen und somit als aktive Proteine betrachtet werden. Es ist erfindungsgemäß gezeigt, dass Wildtyp-Src zusammen mit verschiedenen Mutationen VP induzieren. Eine Mutation von Wildtyp-c-src, die in diesem Zusammenhang im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Blutgefäßwachstum und VP zu induzieren, fungiert, ist die Src A-Mutante mit einer Punktmutation an der Aminosäure (AS)-Restposition 527, wodurch Tyrosin 527 zu Phenylalanin geändert wird. Diese Stelle ist normalerweise eine Stelle für eine negative Regulierung durch die c-Src-Kinase, die als Kinase CSK bezeichnet wird. Wenn CSK AS527 in dem Wildtyp-Src phosphoryliert, wird das Protein inaktiviert. Jedoch verleiht in mutiertem Src A bei AS527 das zu Phenylalanin konvertierte regulatorische Tyrosin dem Protein eine konstitutive (d. h. permanente) Aktivität, die nicht Gegenstand einer Inaktivierung durch Phosphorylierung ist.
Es ist hierin gezeigt, dass andere Mutationen in Src die entgegengesetzte modulierende Wirkung auf VP aufweisen, wodurch VP gehemmt und nicht stimuliert wird. Solche Mutationen werden als inaktive Src-Mutationen bezeichnet. Proteine mit einer Mutation, die diese hemmende Aktivität verleiht, werden auch als dominant negative Src-Proteine dadurch bezeichnet, dass sie VP hemmen, einschließlich derjenigen, die sich aus einer endogenen Aktivität von Src, sowie einer verstärkten Src-Aktivität aufgrund von Wachstumsfaktor-Simulierung ergibt. Somit können bestimmte erfindungsgemäß verwendbare Mutationen von Wildtyp-c-src auch als do minant negativ im Hinblick auf ihre Fähigkeit fungieren, Blutgefäßwachstum und VP zu blockieren und daher beispielsweise VP in vivo zu verringern.
Ein solches bevorzugtes inhibitorisches c-Src-Protein umfasst das Src 251, bei dem nur die ersten 251 Aminosäuren von Src exprimiert werden. Diesem Konstrukt fehlt die gesamte Kinasedomäne und es wird daher als "Kinase-totes" Src-Protein bezeichnet. Ein zweites Konstrukt ist die Src (K295M)-Mutation, bei der der Lysin-Aminosäurerest 295 in ein Methionin mutiert ist. Diese Punktmutation in der Kinasedomäne verhindert eine ATP-Bindung und blockiert auch Kinase-abhängige Src-Funktionen, die mit Gefäßzell- und Tumorzellsignalgebung und -proliferation in Beziehung stehen.
In Bezug auf die Punktmutationen ist eine jegliche Mutation, die in der erwünschten hemmenden oder stimulierenden Aktivität resultiert, für eine erfindungsgemäße Verwendung vorgesehen. Fusionsprotein-Konstrukte, die das erwünschte Src-Protein (Mutation oder Fragment davon) mit exprimierten Aminosäure-Tags, antigenen Epitopen, fluoreszierenden Proteinen oder anderen solchen Proteinen oder Peptiden kombinieren, sind auch vorgesehen, sofern die erwünschte modulierende Wirkung des Src-Proteins intakt bleibt.
Beispielsweise ist erfindungsgemäß bezüglich der aktivierenden Mutation von Src bei Rest 527, sofern der resultierende mutierte Aminosäurerest nicht Tyrosin, Serin oder Threonin ist, vorgesehen, dass das Vorliegen einer anderen Aminosäure an der erwünschten Position zu einem Src-Protein mit einer erwünschten aktiven, VP-verstärkenden modulierenden Aktivität führen wird.

Src-Familie-Kinase Yes wurde zuvor beschrieben, jedoch ist nicht viel über seine zelluläre Funktion bekannt (Burck et al., 1988, The Oncogenes, Springer-Verlag, New York, S. 133–155, Marth et al., 1985, Cell, 43: 393, Semba et al., 1986, PNAS (USA) 83: 5459, Shibuya et al., 1982, J. Virol. 42: 143, Yoshida et al., 1985, Jpn. J. Cancer Res. 76: 559). Bevorzugtes aktives humanes Yes-Protein wird durch die in Sukegawa et al. (1987, Mol. Cell Biol. 7: 41–47) beschriebene Nukleinsäure kodiert. Inaktivierende Modifikationen von humanem Yes-Protein und Nukleinsäuren, die für Yes kodieren, können wie für Src beschrieben bereitgestellt werden. TABELLE I

Src/Mutation	Src-Funktion	Wirkung auf VP und
		Angiogenese
c-Src	+ aktiv	stimulierend
ScrA (T527F)	+ aktiv	stimulierend
Scr527 (Punkt)	+ aktiv	stimulierend
Scr251	– inaktiv	inhibierend
Src (verkürzt)	– inaktiv	inhibierend
Src (K295M)	– inaktiv	inhibierend
Src295 (Punkt)	– inaktiv	inhibierend

Ein bevorzugtes Expressionskonstrukt für eine erfindungsgemäße Verwendung ist das RCASBP(A)-Konstrukt (SEQ ID NO: 1). Dieser Expressionsvektor basiert auf einer Reihe von replikationskompetenten Vogel-Sarkom-Viren mit einer verstärkten Bryan-Polymerase (BP) für einen verbesserten Titer und ist für das A-Typ-Hüll-Glykoprotein, das auf normalen Vogelzellen exprimiert wird, spezifisch (zusammengefasst in Methods in Cell Biology, 52: 179–214 (1997), vgl. auch Hughes et al., 1987, J. Virol. 61: 3004–3012, Fekete und Cepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4): 2604–2613, Itoh et al., 1996, Development 122: 291–300 und Stott et al., 1998, BioTechniques 24: 660–666). Die vollständige Sequenz von RCASBP(A)(SEQ ID NO: 1) ist im Sequenzprotokoll angegeben und eine Restriktionskarte des Konstrukts ist in 10 gezeigt, hier als RCAS bezeichnet.
Das ursprüngliche Src 251-Konstrukt wurde von Dr. Pam Schwartzberg am NIH in dem Labor von Dr. Harold Varmus subkloniert. Zusammengefasst erfolgte eine Klonierung einer Src-cDNA-Sequenz für eine Expression derselben durch Inserieren eines Linkers mit NotI-BstBI-NotI-Restriktionsstellen in eine einzelne NotI-Stelle an dem 5'-Ende von Src 251. Src weist eine einzelne ClaI-Stelle am 3'-Ende auf. Eine Spaltung von Src 251 mit BstBI und ClaI erzeugte ein BstBI-ClaI-Fragment, das sodann in die ClaI-Stelle von RCASBP(A) ligiert wurde. Ein BstBI-Überhang ermöglicht eine Ligation mit einem ClaI-Überhang, der nicht mit ClaI erneut geschnitten wird.
Die Src-Konstrukte, die für eine Verwendung bei einer Durchführung der Erfindung geeignet sind, werden einfach in dem vorstehenden Vektor durch anfängliche Spaltung des Src 251 enthaltenden RCAS-Vektors mit NotI und ClaI (in einem DAM+- Hintergrund), um eine Insertion einer ähnlich gespaltenen Src-cDNA zu ermöglichen, erhalten. Daher wurde dieses anfängliche RCASBP(A)-Konstrukt mit Src 251 weiter verwendet, um alle anderen Src-Konstrukte wie vorstehend und in Kaplan et al. (1994, The EMBO J. 13(20): 4745–4756) beschrieben in RCASBP(A) über ein NotI-ClaI-Fragment, das durch die Konstruktion von Src 251 erzeugt wurde, zu subklonieren. Um die erwünschten c-src-Mutationen in der cDNA zu erzeugen, wurden Standard-Stellen-gerichtete Mutagenese-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet. PCR-Primer, die entworfen sind, um die erwünschten Mutationen einzubauen, wurden auch mit Restriktionsstellen entworfen, um darauf folgende Klonierungsschritte zu erleichtern. Gesamte Segmente von Src-kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden von den Nukleinsäurekonstrukten durch PCR-Amplifikationstechniken basierend auf den bekannten cDNA-Sequenzen von Huhn, Mensch und ähnlichen Homologen von Src und darauf folgende Bildung neuer Konstrukte deletiert. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kodiert der für eine Amplifikation von Src-Nukleinsäuren verwendete 3'-PCR-Primer auch für eine In-Frame-Sequenz. Eine Verwendung dieses Primers fügt ein 9E10-myc-Epitop-Tag an den Carboxyterminus des darauf folgenden Src-Konstrukts an. Die nachstehenden Aminosäuren wurden nach Aminosäure 251 von Src angefügt, um Vektorkonstrukte mit dem 9E10-myc-Epitop-Tag zu erzeugen: VDMEQKLIAEEDLN (SEQ ID NO: 6). Zwei getrennte PCRs wurden für jedes Konstrukt durchgeführt und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten. Alle mutierten Konstrukte, die durch PCR erstellt worden waren, wurden auch durch PCR sequenziert, um die vorhergesagte DNA-Sequenz der Klone zu bestätigen. Wildtyp- und mutierte Src-cDNAs für eine Verwendung in den erfindungsgemäß verwendbaren Expressionssystemen sind auch von Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY verfügbar, die src von Vogel sowie Mensch und mehrere Kinase-tote und aktivierte mutierte Formen verkaufen.
Alternative Expressionsvektoren für eine Expression der erfindungsgemäß verwendbaren Src- oder Yes-Proteine umfassen auch adenovirale Vektoren wie beschrieben in den US-PSen 4,797,368 , 5,173,414 , 5,436,146 , 5,589,377 und 5,670,488 . Alternative Verfahren für ein Zuführen der Src- oder Yes-modulierenden Proteine umfassen ein Zuführen der Src- oder Yes-cDNA mit einem nicht-viralen Vektorsystem wie beschrieben in der US-PS 5,675,954 und ein Zuführen der cDNA selbst als nackte DNA wie beschrieben in der US-PS 5,589,466 . Ein Zuführen von Konstrukten für eine erfindungsgemäße Verwendung ist auch nicht auf eine topische Verabreichung eines viralen Vektors wie in dem nachstehenden CAM-Testsystem beschrieben begrenzt. Beispielsweise werden virale Vektor-Präparate auch intravenös für eine sys temische Verabreichung in das Gefäßbett injiziert. Diese Vektoren sind beispielsweise auch an Stellen einer erhöhten Neovaskularisierung durch lokalisierte Injektion eines Tumors steuerbar.
In vitro-exprimierte Proteine sind auch für eine Zufuhr davon nach Expression und Aufreinigung des ausgewählten Src-Proteins durch Verfahren, die für ein Zuführen von Proteinen oder Polypeptiden verwendbar sind, vorgesehen. Ein solches Verfahren umfasst Liposomen-Zuführsysteme wie beschrieben in den US-PSen 4,356,167, 5,580,575, 5,542,935 und 5,643,599. Andere Vektor- und Protein-Zuführsysteme sind für eine Verwendung bei der Expression und/oder Zufuhr der erfindungsgemäß verwendbaren Src- oder Yes-Proteine bekannt.
2. Charakterisierung der unbehandelten Hühner-Chorioallantoismembran (CAMP)
A. Herstellung der CAM
Angiogenese kann auf der Hühner-Chorioallantoismembran (CAM) induziert werden, nachdem normale embryonale Angiogenese zu der Bildung von reifen Blutgefäßen geführt hat. Es wurde gezeigt, dass Angiogenese in Reaktion auf spezifische Cytokine oder Tumorfragmente induziert wird, wie beschrieben von Leibovich et al., Nature, 329: 630 (1987) und Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597 (1975). CAMs wurden aus Hühnerembryonen für eine darauf folgende Induktion von Angiogenese und Hemmung davon hergestellt. Zehn Tage alte Hühnerembryonen wurden von McIntyre Poultry (Lakeside, CA) erhalten und bei 37°C und 60% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Ein kleines Loch wurde am Ende des Eis direkt über dem Luftsack unter Verwendung eines kleinen Handwerksbohrers (Dremel, Abteilung von Emerson Electric Co. Racine WI) durch die Schale gebohrt. Ein zweites Loch wurde an der breiten Seite des Eis in einer Region gebohrt, in der keine embryonalen Blutgefäße vorliegen, wie zuvor durch ein Durchleuchten des Eis festgestellt wurde. Unterdruck wurde auf das ursprüngliche Loch appliziert, was zu einem Abheben der CAM (Chorioallantoismembran) von der Schalenmembran und zu einer Bildung eines falschen Luftsacks über der CAM führte. Ein 1,0 Zentimeter (cm) × 1,0 cm-Quadratfenster wurde in der Schale über der abgeworfenen CAM durch Verwendung einer kleinen Modell-Schleifscheibe (Dremel) ausgeschnitten. Das schmale Fenster ermöglichte einen direkten Zugang zu der darunter liegenden CAM.
Das sich ergebende CAM-Präparat wurde sodann entweder 6 Tage nach Embryogenese, eine Stufe, die durch aktive Neovaskularisierung gekennzeichnet ist, ohne weitere Behandlung der CAM, was das Modell widerspiegelt, das für eine Bewertung von Wirkungen auf embryonale Neovaskularisierung verwendet wird, oder 10 Tage nach Embryogenese nach Ablauf von Angiogenese verwendet. Das letztere Präparat wurde somit erfindungsgemäß für ein Induzieren von erneuter Angiogenese in Reaktion auf Cytokinbehandlung oder Tumorkontakt wie nachstehend beschrieben verwendet.
3. CAM-Angiogenese-Test
A. Durch Wachstumsfaktoren induzierte Angiogenese
Es wurde gezeigt, dass Angiogenese durch Cytokine oder Wachstumsfaktoren induziert wird. Angiogenese wurde durch Positionieren einer 5 Millimeter (mm) × 5 mm Whatman-Filterscheibe (Whatman Filterpapier Nr. 1), die mit Hanks-ausgeglichener Salzlösung (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) oder HBSS mit 2 Mikrogramm/Milliliter (μg/ml) rekombinantem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) oder Gefäßendothelzellwachstumsfaktor (VEGF)(Genzyme, Cambridge, MA) gesättigt war, auf die CAM eines 9- oder 10-Tage-alten Hühnerembryos in einem Bereich ohne Blutgefäße induziert und die Fenster wurden später mit Klebeband verschlossen. Andere Konzentrationen von Wachstumsfaktoren waren auch bei einer Induzierung von Blutgefäßwachstum wirksam. Für Tests, bei denen eine Hemmung von Angiogenese mit intravenösen Injektionen von Antagonisten bewertet wird, wird Angiogenese zuerst mit 1–2 μg/ml bFGF oder VEGF in Fibroblastenwachstumsmedium induziert. Angiogenese wurde durch Fotomikroskopie nach 72 Stunden aufgezeichnet.
B. Embryonale Angiogenese
sDas CAM-Präparat für eine Bewertung der Wirkung von Angiogenese-Inhibitoren auf die natürliche Bildung von embryonalen neu gebildeten Gefäßen ist der 6 Tage alte embryonale Hühnerembryo wie zuvor beschrieben. Bei dieser Entwicklungsstufe unterlaufen die Blutgefäße ein de novo-Wachstum und somit wird ein geeignetes System für eine Bewertung einer Modulation von Angiogenese durch die erfindungsgemäß verwendbaren Src-Proteine bereitgestellt. Das CAM-System wird wie vorstehend beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass der Test an dem embryonalen Tag 6 und nicht an dem Tag 9 oder 10 durchgeführt wird.
4. Modulierung von Angiogenese wie gemessen in dem CAM-Test
Um die Wirkung von Src-Proteinen auf Angiogenese zu bewerten, wurden die nachstehenden Tests an 10 Tage alten Hühner-CAM-Präparaten durchgeführt. 5 μg von RCAS-Konstrukten, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden waren, wurden in die immortalisierte Hühnerfibroblasten-Linie, DF-1 (Geschenk von Doug Foster, U. of Minn.), transfiziert. Diese Zelllinie, sowie primäre Hühnerembryo-Fibroblasten waren in der Lage, Virus zu produzieren, jedoch produzierte die DF-1-Zelilinie höhere Titer. Virale Überstände wurden aus subkonfluenten DF-1-Producer-Zelllinien in serumfreiem CLM-Medium [Zusammensetzung: F-10-Mediumbasis, supplementiert mit DMSO, Folsäure, Glutaminsäure und MEM-Vitaminlösung] gewonnen. 35 ml viraler Überstand wurden durch Ultrazentrifugation bei 4°C für 2 Stunden bei 22000 UpM konzentriert. Diese konzentrierten viralen Niederschläge wurden in 1/100 des ursprünglichen Volumens in serumfreiem CLM-Medium resuspendiert, aufgeteilt und bei –80°C gelagert. Der Titer wurde durch serielle Verdünnung eines viralen Kontrollvektors mit einer für grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodierenden Nukleotidsequenz, bezeichnet als RCAS-GFP, für eine Infektion von primären Hühnerembryo-Fibroblasten, die für 48 bis 72 Stunden inkubiert wurden, bewertet. Die Titer von viralen Stammlösungen, die nach Konzentration erhalten wurden, überschritten routinemäßig 10⁸ I. U. pro ml. Für den CAM-Test unter Verwendung der viralen Stammlösungen wurden mit Cortisonacetat getränkte Whatman-Filterscheiben mit einem Durchmesser von 6 mm in 3 mg/ml Cortisonacetat für 30 Minuten in 95% Ethanol hergestellt. Die Scheiben wurden in einem laminaren Abzug getrocknet und sodann mit 20 μl von viraler Stammlösung pro Scheibe 10 Minuten getränkt. Diese Scheiben wurden auf die CAM von 9 oder 10 Tage alten Hühnerembryonen appliziert und mit Cellophanband verschlossen und bei 37°C 18 bis 24 Stunden inkubiert. Sodann wurde entweder Kontroll-PBS oder Wachstumsfaktoren bei einer Konzentration von 5 μg/ml zu der CAM in einem Volumen von 20 μl der geeigneten Virus-Stammlösung als eine zusätzliche Verstärkung von Virus zu dem CAM-Gewebe gegeben. Nach 72 Stunden wurden die CAMs geerntet und bezüglich Veränderungen des angiogenen Index untersucht, wie bestimmt durch doppeltes blindes Auszählen der Anzahl von Verzweigungspunkten in der CAM unter der Scheibe. Für Kinasetests wurde das Gewebe unter der Scheibe in RIPA geerntet, mit einer Motormühle homogenisiert und Src aus gleichen Mengen an Gesamtprotein immunpräzipitiert und einem in vitro-Kinasetest unter Verwendung eines FAK-GST-Fusionsproteins als Substrat unterzogen. Für Immunfluo reszenzuntersuchungen wurde CAM-Gewebe unter den Scheiben in OCT, einem Cryokonservierungsmittel, eingefroren, bei 4 μm geschnitten, in Aceton eine Minute fixiert, in 3% normalem Ziegenserum eine Stunde inkubiert, gefolgt von einer Inkubation in primären Kaninchen-Anti-phosphoryliertes ERK-Antikörper wie zuvor beschrieben (Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140: 1255–1263 (1998)), in PBS gewaschen und mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper nachgewiesen.
A. Aktivierung von endogenem Src durch bFGF oder VEGF
Um die Wirkungen von Wachstumsfaktoren auf Src-Aktivität bei einer Modulierung von Angiogenese zu bewerten, wurden die nachstehenden Tests durchgeführt. Gewebeextrakte von 10 Tage alten Hühner-CAMs, die gegenüber bFGF oder VEGF (2 μg/ml) für zwei Stunden exponiert worden waren, wurden lysiert. Endogenes Src wurde aus gleichen Mengen an Gesamtprotein immunpräzipitiert und einem in vitro-Immunkomplex-Kinasetest unter Verwendung eines FAK-GST-Fusionsproteins als Substrat unterzogen, elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen.
Die Ergebnisse des Tests sind in 5 gezeigt, worin die Erhöhung der Src-Aktivität in der erhöhten Dichte des Gels mit entweder bFGF- oder VEGF-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten (Kontrolle) Proben, die Basislinien-Src-Aktivität in dem CAM-Test anzeigen, ersichtlich ist. Sowohl bFGF als auch VEGF führte zu einer etwa zweifachen Zunahme von endogener Src-Aktivität in der CAM. Der vorstehende Kinasetest-Blot wurde auch mit einem Anti-Src-Antikörper als Beladungskontrolle für einen gleichen Gehalt an Src und IgG sondiert.
B. Wirkung von Retrovirus-vermittelter Genexpression von Src A auf Angiogenese in der Hühner-CAM
Der nachstehende Test wurde durchgeführt, um die Wirkung von mutierten Src-Proteinen auf Angiogenese in dem CAM-Präparat zu bewerten. Für den Test wurden 9 Tage alte Hühner-CAMs RCAS-Src A- oder RCAS-GFP-exprimierenden Retroviren oder Puffer für 72 Stunden ausgesetzt, wobei das vorstehend beschriebene Protokoll befolgt wurde.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in 6A gezeigt, worin der Grad an Angiogenese wie vorstehend beschrieben quantifiziert wurde. Beispielhafte Mikroaufnahmen (4×) wurden mit einem Stereomikroskop wie in 6B gezeigt aufgenommen. Endogene Basislinie-Src-Aktivität weist einen angiogenen Index von etwa 50 auf. Im Gegensatz dazu führten CAMs, die mit durch retrovirale Vektoren exprimiertem RCAS-Src A behandelt worden waren, das eine Punktmutation bei der Aminosäurerestposition 527 von einem Tyrosin zu einem Phenylalanin aufweist, zu einer Verstärkung (Induktion) von Angiogenese bei einem angiogenen Index von etwa 90. Die Verstärkung von Src A-vermittelter Angiogenese ist auch in der in 6B gezeigten Aufnahme ersichtlich.
C. Retrovirale Expression von Src A aktiviert vaskuläre MAP-Kinase-Phosphorvlierung
Die Wirkung von Src A im Vergleich zu den Wachstumsfaktoren VEGF und PMA auf vaskuläre MAP-Kinase-Phosphorylierung wurde auch bewertet, wobei die vorstehend und hier beschriebenen Testverfahren befolgt wurden. Gewebeextrakte von 10 Tage alten Hühner-CAMs, die für 30 Minuten gegenüber VEGF oder PMA (ein anderes Mitogen bei einer vergleichbaren Konzentration) ausgesetzt worden waren, wurden mit denjenigen verglichen, die mit Src A-exprimierendem Retrovirus für 48 Stunden infiziert worden waren. Src wurde sodann aus gleichen Mengen an Gesamtproteinextrakt immunpräzipitiert und einem in vitro-Immunkomplex-Kinasetest unter Verwendung eines FAK-GST-Fusionsproteins als Substrat unterzogen, elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in 7A gezeigt, worin unbehandelte CAMs (NT) endogene Basislinien-Src-vermittelte vaskuläre MAP-Kinase-Phosphorylierung aufweisen. Sowohl VEGF als auch PMA führten zu einer etwa 2-fachen Zunahme gegenüber der Basislinie. Im Gegensatz dazu verstärkte Src A die Aktivität etwa 5- bis 10-fach gegenüber der bei unbehandelten Proben.
Teilmengen der vorstehenden Gesamtgewebelysate wurden auch bezüglich endogener ERK-Phosphorylierung durch Immunblotting mit einem Anti-Phospho-ERK-Antikörper wie in 7B gezeigt gemessen. Für diese Bewertung wurden 10 Tage alte CAMs mit entweder Kontroll-RCAS oder RCAS, das Src A exprimiert, infiziert. Nach zwei Tagen wurden CAMs präpariert, in OCT cryokonserviert und bei 4 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit einem anti-phosphoryliertes ERK-Antikörper (New England Biolabs) immungefärbt, gewaschen und mit einem Ziege-Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem Sekundärantikörper nachgewiesen. Fluoreszenzdarstellun gen wurden auf einer gekühlten CCD-Kamera (Princeton Inst.) aufgenommen. Die Mikroaufnahmen zeigen eine verstärkte Immunfluoreszenz bei Src A-behandelten Präparaten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen.
D. Selektives Erfordernis für Src-Aktivität während VEGF-, jedoch nicht bFGF-induzierter Angiogenese
Um die Wirkung von Src-modulierender Aktivität auf Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese zu bewerten, wurden die nachstehenden Tests durchgeführt. Neun Tage alte Hühner-CAMs wurden gegenüber dem retroviralen Vektorpräparat ausgesetzt, das die dominant negative Src-Mutation exprimiert, die wie zuvor beschrieben als Src 251 oder Src K295M bezeichnet wird. RCAS-Src 251- oder Kontroll-RCAS-GFP-Retroviren- oder Puffer-CAMs wurden 20 Stunden behandelt und sodann weitere 72 Stunden bei Vorliegen oder Fehlen von bFGF oder VEGF inkubiert.
Der Grad an Angiogenese, der wie vorstehend beschrieben qualifiziert wurde, ist in 8A gezeigt. Beispielhafte Mikroaufnahmen (6×), die in 8B gezeigt sind, wurden mit einem Stereomikroskop aufgenommen. 8C zeigt einen Blot, der mit einem Anti-Src-Antikörper sondiert wurde, um die Expression von Src 251 in transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontrollbehandlungen zu bestätigen.
Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Tests zeigen, dass sowohl bFGF- als auch VEGF-behandelte CAMs in Gegenwart von RCAS-GFP-Kontrollen Angiogenese gegenüber der Src-vermittelten Basislinien-Angiogenese, die bei scheinbehandelten oder unbehandelten CAM-Präparaten festgestellt wurde, induzierten. Die exprimierte dominant negative Mutante Src 251 war bei einer Hemmung von VEGF-induzierter Angiogenese zurück auf Basislinien-Niveaus wirksam, während sie nicht bei einer Hemmung von bFGF-vermittelter Angiogenese wirksam war. Die in 8B gezeigten Mikroaufnahmen bestätigen bildlich die in 8A gezeigten Daten. Somit ist retroviral exprimiertes Src 251 ein wirksamer Angiogenese-Inhibitor, wenn Angiogenese durch VEGF induziert wird.
Anwendungen der erfindungsgemäß verwendbaren Src-Proteine mit anderen Angiogenesemodellen wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind erfindungsgemäß vorgesehen.
5. Regression von Tumorgewebewachstum mit Src-Modulatoren wie gemessen durch einen in vivo-Kaninchen-Augenmodell-Test
Die Wirkung von Src-Modulatoren auf Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese kann in natürlicherweise transparenten Strukturen festgestellt werden, wie beispielhaft durch die Cornea des Auges dargestellt. Neue Blutgefäße wachsen von dem Rand der Cornea, die eine reiche Blutzufuhr aufweist, in das Zentrum der Cornea ein, das normalerweise keine Blutzufuhr aufweist. Stimulatoren von Angiogenese wie bFGF induzieren bei einem Auftragen auf die Cornea das Wachstum neuer Blutgefäße von dem Rand der Cornea. Antagonisten von Angiogenese, die auf die Cornea aufgetragen werden, hemmen das Wachstum neuer Blutgefäße von dem Rand der Cornea. Somit durchläuft die Cornea Angiogenese durch eine Invasion von Endothelzellen aus dem Rand der Cornea in das robuste Collagen-gepackte Cornea-Gewebe, die leicht sichtbar ist. Der Kaninchen-Augenmodell-Test stellt daher ein in vivo-Modell für die direkte Feststellung einer Stimulierung oder Inhibierung von Angiogenese nach Einbringen von Verbindungen direkt in die Cornea des Auges bereit.
Ein in vivo-Kaninchen-Augenmodell-Test zeigt eine durch Wachstumsfaktoren induzierte Angiogenese
Angiogenese wird in dem in vivo-Kaninchen-Augenmodell-Test durch die Wachstumsfaktoren bFGF oder VEGF induziert und ist in den nachstehenden Abschnitten beschrieben.
Hydronpolymer-Pellets mit Wachstumsfaktor werden wie von D'Amato et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 4082–4085 (1994) beschrieben hergestellt. Die einzelnen Pellets enthalten 650 ng der Wachstumsfaktoren, die getrennt an Sucralfat (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) gebunden sind, um den Wachstumsfaktor zu stabilisieren und seine langsame Freisetzung in das umgebende Gewebe sicherzustellen. Des Weiteren werden Hydronpellets hergestellt, die einen erwünschten Src-exprimierenden Retrovirus wie zuvor beschrieben enthalten. Die Pellets werden in speziell hergestellte Teflon-Stifte mit einem 2,5 mm-Loch, das in ihre Oberflächen gebohrt wurde, gegossen. Etwa 12 μl des Gießmaterials wird in jeden Stift gegeben und über Nacht in einem sterilen Abzug polymerisiert. Die Pellets werden sodann durch Ultraviolettbestrahlung sterilisiert. Wirkungen von Src-Proteinen werden sodann wie zuvor beschrieben bewertet.
6. In vivo-Regression von Tumorgewebewachstum mit Src-Modulatoren wie gemessen durch einen chimären Maus: Mensch-Test
Ein in vivo-chimäres Maus: Mensch-Modell wird durch Ersetzen eines Teils einer Haut aus einer SCID-Maus durch menschliche Vorhaut von Neugeborenen erzeugt. Das in vivo-chimäre Maus: Mensch-Modell wird im Wesentlichen wie in Van et al., J. Clin. Invest., 91: 986–996 (1993) beschrieben hergestellt. Zusammengefasst wird eine 2 cm²-Quadratfläche der Haut operativ aus einer SCID-Maus (6 bis 8 Wochen alt) entfernt und durch menschliche Vorhaut ersetzt. Die Maus wird anästhesiert und das Haar von einem 5 cm²-Bereich auf jeder Seite der lateralen Abdominalregion durch Rasieren entfernt. Zwei runde Transplantatbetten von 2 cm² werden durch Entfernen der vollen Stärke der Haut bis runter zu der Fascia präpariert. Menschliche Haut-Implantate mit voller Stärke der gleichen Größe, die von menschlicher Vorhaut von Neugeborenen abgeleitet ist, werden auf die Wundbetten gegeben und an der Stelle vernäht. Das Transplantat wird mit einem Pflaster abgedeckt, das an die Haut genäht wird. Micropore-Textilklebeband wird auch appliziert, um die Wunde abzudecken.
Die M21-L-humane Melanomzelllinie oder MDA 23.1-Brustkarzinomzelllinie (ATCC HTB 26, α_vβ₃-negativ durch Immunreaktivität von Gewebeschnitten mit mAB LM609) werden verwendet, um die soliden humanen Tumoren auf den humanen Haut-Transplantaten auf den SCID-Mäusen auszubilden. Eine Einzelzellsuspension von 5 × 10⁶ M21-L- oder MDA 23.1-Zellen wird intradermal in das humane Haut-Transplantat injiziert. Die Mäuse werden sodann zwei bis vier Wochen beobachtet, um ein Wachstum von messbaren menschlichen Tumoren zu ermöglichen.
Nachdem ein messbarer Tumor etabliert ist, werden erfindungsgemäße Retrovirus-Präparate oder PBS in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Nach zwei bis drei Wochen wird der Tumor ausgeschnitten und bezüglich Gewicht und Histologie analysiert. Die Wirkung von exprimierten erfindungsgemäß verwendbaren Src-Proteinen auf die Tumoren wird sodann bewertet.
7. In vitro-Regression von humanem Tumorgewebewachstum mit Src-Modulatoren wie gemessen durch einen CAM-Test
Tumorwachstum hängt von Angiogenese ab (Folkman, 1992, J. Biol. Chem. 267: 10931–10934, Weidner et al., 1991, N. E. J. Med. 324: 1–8, Brooks et al., 1994, Cell 79: 1157–1164). In der Tat legen jüngere Berichte nahe, dass Tumorwachstum den anti-angiogenen Wirkungen von VEGF-Rezeptor-Antagonisten zugänglich ist (Kim et al., 1993, Nature 362: 8451–844). Daher untersuchten wir, ob eine Unterdrückung von Angiogenese durch Zufuhr von Kinase-deletiertem Src 251 das Wachstum eines humanen Medulloblastoms (DAOY), ein hochgradig angiogener Tumor, von dem bekannt ist, dass er VEGF und sehr wenig bFGF produziert, beeinflussen würde.
Die 3- und 6-Tage-DAOY-Medulloblastom-Tumorwachstumstests erfolgten in der Hühner-CAM im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Brooks et al., 1994, supra). 5 × 10⁶ DAOY-Zellen, die in RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert worden waren, wurden gewaschen und auf die CAM eines 10 Tage alten Embryos gegeben, um DAOY-Tumorfragmente zu erzeugen. Nach 7 Tagen wurden 50 mg Tumorfragmente präpariert und auf einen anderen 10 Tage alten Embryo gegeben und weitere 3 oder 6 Tage unter topischer Applikation (25 μl) von entweder Kontroll-RCAS-GFP-Retrovirus, RCAS-Src 251 oder Kontrollbehandlung inkubiert. Unter Verwendung der Gesamtgewebe-Konfokaldarstellung von infizierten Tumoren als Wegweiser waren wir fähig, zu bestimmen, dass eine signifikante Expression der RCAS-Konstrukte um das Tumorfragment und innerhalb des Tumorfragments in diesem topischen Ansatz vorlag. Resektionen und ein Abwiegen von Tumoren erfolgten in einer doppelt blinden Weise, wobei lediglich die leicht definierbare solide Tumormasse entfernt wurde (Brooks et al. 1994, supra). Das Tumor-Nassgewicht nach 3 oder 6 Tagen wurde mit dem Anfangsgewicht verglichen und die prozentuale Änderung des Tumorgewichts für jede Gruppe bestimmt.
Diese Tumoren wachsen leicht auf der CAM und erzeugen aktive Angiogenese (9), was es uns ermöglicht, das von Vögeln abgeleitete Tumor-Gefäßsystem durch Verwendung eines Vogel-spezifischen RCAS-Retrovirus selektiv anzusteuern.
9 zeigt Ergebnisse, die darstellen, dass eine retrovirale Zufuhr von RCAS-Src 251 an humane Tumoren, die auf der Hühner-CAM wachsen, Tumorwachstum umkehrt. 9A zeigt humane Medulloblastome, die auf der CAM von Hühnerembryo nen wie vorstehend beschrieben angewachsen waren. Retrovirus, das RCAS-GFP oder RCAS-Src 251 enthielt, wurde topisch auf voretablierte Tumoren von mehr als 50 mg appliziert. Eine beispielhafte Mikroaufnahme eines Medulloblastom-Tumorfragments, das mit GFP-exprimierendem RCAS-GFP infiziert worden war, zeigt ausschließliche Expression in den Tumor-Blutgefäßen (Pfeilspitze) wie nachgewiesen durch optische Schnittdarstellung mit einem Bio Rad-konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Balken = 500 μm). 9B zeigt Ergebnisse aus Tumoren, die wie vorstehend beschrieben behandelt worden waren und denen ermöglicht worden war, für 3 oder 6 Tage zu wachsen, worauf sie herausgeschnitten und das Nassgewicht bestimmt wurde. Daten sind als die mittlere Änderung des Tumorgewichts (ausgehend von dem 50 mg Tumor-Ausgangsgewicht) +/– SEM von zwei Replikaten ausgedrückt. RCAS-Src 251 wies eine signifikante Wirkung auf das Tumorwachstum nach drei Tagen (*, P < 0,002) und 6 Tagen (**, P < 0,05) auf. 9C zeigt beispielhafte Stereomikroaufnahmen von operativ aus den Embryos entfernten Medulloblastomtumoren, die mit einem Olympus-Stereomikroskop aufgenommen worden waren (Balken = 350 μm). (Unteres Bild) Eine Mikroaufnahme bei hoher Vergrößerung eines jeden Tumors, die das Gefäßsystem eines jeden Tumors im Detail zeigt (Balken = 350 μm). Die Pfeilspitze zeigt eine Zerstörung von Blutgefäßen in RCAS-Src 251-behandelten Tumoren an.
Die Ergebnisse zeigen, dass ein Zuführen von RCAS, das Src 251 enthält, an voretablierte Medulloblastome zu einer selektiven viralen Expression in den Tumor-assoziierten Blutgefäßen führte (9A) und dieses führte letztendlich zu der Regression dieser Tumoren innerhalb einer Zeitspanne von 6 Tagen (9B). Wichtig ist, dass die Tumor-assoziierten Blutgefäße in Tieren, die mit Virus behandelt worden waren, das Src 251 enthält, schwerwiegend zerstört waren, und geringer in der Anzahl waren im Vergleich zu Tumorgefäßen in Kontrolltieren (9C). Die Tatsache, dass RCAS-GFP-infizierte Tumoren eine GFP-Lokalisierung nur in dem Tumor-Gefäßsystem aufwiesen, legt nahe, dass die Anti-Tumor-Wirkungen, die bei einer retroviralen Zufuhr von Src 251 festgestellt worden waren, auf dessen anti-angiogenen Eigenschaften beruhten.
8. Src-Erfordernis für ein Überleben von Endothelzellen während VEGF-, jedoch nicht bFGF-vermittelter Angiogenese
Jüngere Daten legen nahe, dass Wachstumsfaktorrezeptoren (Choi und Ballermann, 1995, J. Biol. Chem. 270: 21144–21150, Satake et al., 1998, Biochem. Bio phys. Res. Comm. 244: 642–646) und Integrine (Meredith et al., 1993, Mol. Biol. Cell 4: 953–961, Brooks et al., 1994a, Science 264: 569–571) ein Überleben von angiogenen Endothelzellen verstärken. Die Tatsache, dass sowohl Wachstumsfaktoren, als auch Adhäsionsrezeptoren auch Src-Aktivität regulieren, veranlasste die Untersuchung der Rolle von Src bei einem Überleben von Endothelzellen während einer Angiogenese. CAMs, die mit bFGF oder VEGF stimuliert worden waren, wurden mit Retrovirus infiziert, das Src 251 enthielt, und Cryostat-Schnitte dieser Gewebe wurden auf das Vorliegen von apoptotischen Zellen untersucht.
Zusammengefasst wurden Cryoschnitte von mit RCAS-GFP oder RCAS-Src 251 behandelten CAMs, die mit bFGF oder VEGF behandelt worden waren, bezüglich apoptotischer Zellen unter Verwendung des Apoptag-Kits (Oncor, Gaithersburg, MD) untersucht. Schnitte wurden auch mit einem polyklonalen Kaninchen-AntivWf (biogenix, San Ramon, CA) immungefärbt und mit 1 μg/ml DAPI gegengefärbt. Fluoreszenzdarstellungen wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera aufgenommen (Roper, Trenton, NJ) und die Fluoreszenzdarstellungen wurden entwickelt und zwischen experimentellen Behandlungen wie zuvor beschrieben bezüglich Exposition angepasst (Ellcelri et al., 1998, supra).
Um den apoptotischen Index von Retrovirus-infizierten CAM-Geweben zu messen, wurde FITC-konjugiertes Annexin V (Clontech, Palo Alto, CA) verwendet, um Zellsuspensionen zu färben, und die gewaschenen Zellen wurden durch Flusscytometrie analysiert. Zellsuspensionen von CAM-Zellen wurden aus Kontroll-infizierten oder Virus-infizierten CAMs durch Verdau mit 0,1% (w/v) Collagenase Typ IV (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ) in RPMI 1640 von zerkleinertem CAM-Gewebe, das eine Stunde bei 37°C schüttelte, wie zuvor beschrieben präpariert (Brooks et al., 1994b) und durch ein 100 μm Nylon-Sieb (Becton Dickinson, Fountain Lakes, NJ) filtriert. Fluoreszenz wurde mit einem FACscan-Flusscytometer (Becton Dickinson) gemessen, um 10000 Zellen zu zählen.
Eine Messung der vWf-Färbung durch FACs erfolgte mit parallelen Collagenase-verdauten CAM-Gewebe-Zellpräparaten, die in 1,8% Paraformaldehyd fixiert, in 70% Ethanol permeabilisiert, mit dem Anti-vWf-Antikörper inkubiert und mit einem FITC-konjugierten Sekundärantikörper nachgewiesen wurden.
Eine Zufuhr von Src 251 verstärkte eine intensive TUNEL-Färbung bei den Faktor VIII-bezogenes Antigen (von Willebrand-Faktor [vWf])-positiven Blutgefäßen in VEGF-, jedoch nicht bFGF-stimulierten CAMs. Tatsächlich wurde minimale Apoptose bei anderen Zelltypen in diesen CAMs festgestellt, was ein Endothelzell-spezifisches Erfordernis für Src-Kinase-Aktivität für ein Überleben von Zellen in VEGF-aktivierten Blutgefäßen nahe legt. In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden Retrovirus-infizierte CAMs, die mit VEGF oder bFGF stimuliert worden waren, einem begrenzten Collagenase-Verdau unterworfen, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Es wurde gezeigt, dass diese CAM-abgeleiteten Zellen etwa 20% bis 50% Endothelzellen (vWf-positiv) enthalten, und sie wurden bezüglich Apoptose durch flusscytometrischen Nachweis von Annexin V-positiven Zellen, ein früher Apoptosemarker, analysiert. Zellen, die von mit Src 251 infizierten, VEGF-stimulierten CAMs abgeleitet waren, wiesen eine signifikant erhöhte Annexin V-Färbung im Verhältnis zu Zellen aus RCAS-GFP-kontrollinfizierten CAMs, die mit VEGF behandelt worden waren, auf. Im Gegensatz dazu wiesen Zellen, die von kontrollinfizierten CAMs oder denjenigen, die mit RCAS-Src 251 infiziert und mit bFGF stimuliert worden waren, abgeleitet waren, eine geringe oder keine Annexin V-Färbung auf. Zusätzlich wurde keine Annexin V-Färbung bei Zellen festgestellt, die von nicht-stimulierten oder bFGF-stimulierten CAMs abgeleitet waren. Diese Daten zeigen, dass Src-Kinase-Aktivität selektiv für ein Überleben von Endothelzellen während VEGF-, jedoch nicht bFGF-vermittelter Angiogenese in der CAM erforderlich ist.
9. Selektives Erfordernis für Src-Kinase-Aktivität in einem subkutanen Mäusemodell von Angiogenese
Um weiter die Rolle von Src bei der Angiogenese zu untersuchen, wurde ein Mäusemodell verwendet. In diesem Fall wurde Angiogenese durch subkutane Injektion von Wachstumsfaktor-freiem Matrigel, das mit bFGF (100 ng/ml) oder VEGF (400 ng/ml) supplementiert war, in athymische erwachsene wehl (nu/nu)-Mäuse induziert und nach fünf Tagen untersucht (Passaniti et al., 1992). Angiogenese wurde durch Entfernen und Homogenisieren von Gewebe, Isolieren der Proteine und Immunblotting mit einem VEGF-Rezeptor-Antikörper (flk-1)(13A), der für Endothelzellen spezifisch ist, quantifiziert. Wie bei den Hühnern festgestellt, blockierte eine Expression der Kinase-deletiertes Src 251-cDNA eine VEGF-induzierte Angiogenese in diesem Mäusemodell, während sie keine Wirkung auf eine bFGF-induzierte Angiogenese aufwies (13B). Um die Rolle von endogenem Src in diesem Modell zu etablieren, wurden Gewebe mit einem Retrovirus infiziert, das Cak exprimiert, das endogene Src-Aktivität durch Phosphorylierung der C-terminalen regulatorischen Stelle inhibiert (Nada et al., 1991, Nature 361: 68–72). Eine Expression von Cak blockierte eine VEGF-, jedoch nicht bFGF-induzierte Angiogenese (13), was eine Rolle für endogene Src-Aktivität in VEGF-vermittelter Angiogenese bestätigt. Eine Neovaskularisierung dieser Virus-infizierten VEGF-stimulierten Gewebe wurde durch direkte Immunfluoreszenz mit einem FITC-konjugierten Anti-DC34-Antikörper (13) oder einem Anti-flk-1-Antikörper bestätigt und durch Auszählen der Anzahl positiv gefärbter CD34-Blutgefäße in jedem Cryoschnitt quantifiziert (13C).
Zusammengefasst wurde Angiogenese durch eine subkutane Injektion von Wachstumsfaktor-freiem Matrigel mit Kochsalzlösung oder VEGF (400 ng/ml) mit 2 × 10⁶ ektropen Verpackungszellen, die GFP-Retrovirus exprimieren, in die Flanke von athymischen Wahl (nu/nu)-Mäusen induziert und nach 5 Tagen Inkubation untersucht. Die Neovaskularisierung wurde durch Immunblotting mit einem VEGF-Rezeptor-Antikörper (flk-1), der für Endothelzellen spezifisch ist, quantifiziert. 15A zeigt Immunblotting-Ergebnisse. Die Wirkungen von Kinase-deletiertes Src 251-, Csk- oder GFP-Retrovirus auf VEGF-(400 ng/ml) oder bFGF-(400 ng/ml) induzierte Angiogenese wurde durch Immunblotting der Gewebelysate mit einem Anti-flk-1-Antikörper untersucht. Ein Beispiel für diese Ergebnisse ist in 15B gezeigt. Die Wirkung der Src 251- und Csk-exprimierenden Retroviren auf VEGF-induzierte Neovaskularisierung wurde durch Auszählen der Anzahl an CD34-positiven Gefäßen in Gewebequerschnitten durch indirekte Immunfluoreszenz in dreifachen zufälligen Feldern bei 20x quantifiziert. Cryoschnitte der Pfropfen wurden auch einer Immunfluoreszenzfärbung mit einem Anti-CD34-Antikörper oder einem Anti-flk-Antikörper unterzogen, fotografiert und wie vorstehend für die CAM-Angiogenese-Tests beschrieben quantifiziert.
Whole-Mount-direkte Fluoreszenz eines RCAS-GFP-infizierten Tumorfragments erfolgte durch Präparation eines Tumorfragments und Darstellung des nicht-fixierten Gewebes direkt auf einem Objektträger mit einem konfokalen Lasermikroskop (MRC 1024: Bio-Rad, Hercules, CA).
10. Wirkung einer intradermalen Expression von VEGF in src^–/–- oder src^+/–-Mäuseohren
Unter Fortsetzung der mit Hühner- und Mäuse-Angiogenesemodellen erhaltenen Ergebnisse wurde ein direkter genetischer Ansatz verwendet, um intradermale VEGF-induzierte Angiogenese in src^–/–-Mäusen zu untersuchen. Ebenfalls unter sucht wurden Wirkungen auf Gefäßpermeabilität, da bekannt war, dass VEGF sowohl das Wachstum neuer Blutgefäße initiiert als auch Gefäßpermeabilität verstärken kann (Senger et al., 1983, Science 218: 983–985, Ferrera und Davis-Smyth, 1997, Endocr. Rev. 16: 4–25).
Intradermale Injektionen von Adenovirus, das eine humanes VEGF-cDNA exprimiert, erfolgten in das Ohr von src^–/– und src^–/+-Mäusen, während β-Galactosidaseexprimierendes Kontroll-Adenovirus in das gegenüberliegende Ohr einer jeden Maus injiziert wurde. VEGF-abhängiges Wachstum von neuen Blutgefäßen war in src^+/–-Ohren zum ersten Mal innerhalb von 48 Stunden nachweisbar und eine Neovaskularisierung wurde nach 5 Tagen analysiert.
Zusammengefasst wurden pp60^c-src-, pp60^c-yes-, pp60^c-fyn-defiziente Mäuse (129/8v/Ev × C57B16/J) wie zuvor beschrieben erzeugt (Soriano et al., 1991, Cell 64: 693–702). Weitere Bestände wurden von Jackson Labs erhalten. Mäuseohren wurde intradermal (Eriksson et al., 1980, Microvasc. Res. 19: 374–378) 5 μl Adenovirus injiziert, das entweder VEGF oder β-Galactosidase exprimiert, und die Ohren wurden nach 5 Tagen mit einem Stereoskop fotografiert.
Es stellte sich heraus, dass identische virale Expressionsniveaus in src^+/– und src^–/– vorlagen, wie bestimmt durch X-gal-Färbung von β-Galactosidase-Adenovirus-injizierten Ohren. In VEGF-injizierten src^–/–-Ohren trat keine signifikante Verringerung der Angiogenese auf, wie gemessen durch ein Auszählen von Verzweigungspunkten (p < 0,05). Jedoch war überraschenderweise der am meisten augenscheinliche Phänotyp in diesen Tieren eine vollständige Blockierung eines Durchsickerns durch Gefäße im Vergleich mit den VEGF-injizierten src^+/–--Ohren. Eine Untersuchung von mit VEGF injizierten Ohren bestätigt das Ausmaß des Durchsickerns durch Gefäße in src^+/–-Mäusen, das im Wesentlichen in den src^–/–-Mäusen fehlt. Das Durchsickern durch Gefäße in diesen Tieren legt nahe, dass die VP-Aktivität, die mit Angiogenese in vivo assoziiert worden war (Dvorak et al., 1995, Am. J. Pathol. 148: 1029–1039), selektiv in pp60^c-src-defizienten Mäusen unterbrochen werden könnte.
11. VEGF kompromittiert nicht die Blut-Hirn-Schranke in Mäusen, denen pp60^c-src fehlt
Das Gefäßsystem im Gehirn zeichnet sich durch eine hochgradig restriktive Blut-Hirn-Schranke aus, die verhindert, dass kleine Moleküle in das umgebende Hirnge webe austreten. Tumorwachstum innerhalb des Gehirns kann diese Schranke teilweise aufgrund der Produktion von angiogenen Wachstumsfaktoren wie VEGF kompromittieren. Daher untersuchten wir die Art der Blut-Hirn-Schranke in src^+/–- oder src^–/–-Mäusen. In diesem Fall wurde VEGF oder Kochsalzlösung stereotaktisch in die rechte oder linke Gehirnhälfte injiziert. Alle Mäuse erhielten systemische Injektionen von Evans-Blau-Farbstoff, um VP-Aktivität zu überwachen.
Zusammengefasst wurde Kochsalzlösung oder VEGF (200 ng in 2 μl) stereotaktisch in den linken oder rechten Vorderlappen 92 mm links/rechts zu der Mittellinie, 0,5 mm rostral vom Bregma und 3 mm in der Tiefe von der Dura injiziert. Die Tiere erhielten eine Lösung mit Evans-Blau-Farbstoff intravenös 30 Minuten nach Injektion wie vorstehend beschrieben. Nach weiteren 30 Minuten wurden die Mäuse perfundiert und die Gehirne wurden entfernt. Evans-Blau-Farbstoff-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops bei frischen nicht-fixierten Cryoschnitten des Gehirns festgestellt.
Ein Durchsickern von Blut durch Gefäße wurde in der VEGF-injizierten Gehirnhälfte in src^+/–-Mäusen lokalisiert, jedoch fehlte ein Durchsickern durch Gefäße in src^–/–-Mäusen vollständig. Dies war auch der Fall, falls die VP durch Messen der Anhäufung von Evans-Blau-Farbstoff untersucht wurde, wie nachgewiesen durch Epifluoreszenzanalyse von Cryostat-Schnitten dieser Gehirne. Somit kompromittiert VEGF die Blut-Hirn-Schranke in einer Weise, die von aktivem pp60^c-src abhängt.
12. VEGF-vermittelte VP, jedoch nicht Entzündung-assoziierte VP hängt von pp60^c-src ab
Um weiter die Wirkung von VEGF als VP-Faktor in src^+/–- oder src^–/–-Mäusen zu analysieren und zu quantifizieren, wurde ein Miles-Test (Miles und Miles, 1952) verwendet, um quantitativ die Gefäßpermeabilität in der Haut dieser Tiere zu messen. VEGF wurde intradermal in src^+/–- oder src^–/–-Mäuse, die eine intravenöse systemische Verabreichung von Evans-Blau-Farbstoff erhalten hatten, injiziert. Innerhalb von 15 Minuten nach Injektion von VEGF trat eine dreifache Zunahme der VP in src^+/–-Mäusen auf. Jedoch wurde in src^–/–-Mäusen keine nachweisbare VP-Aktivität festgestellt. Farbstoffelution der injizierten Hautflecken wurde quantifiziert und mit Kontroll-Kochsalzlösung und bFGF verglichen. Kontrollen von bFGF oder Kochsalzlösung, die benachbart zu dem VEGF injiziert worden waren, zeigten keine signifikante Zunahme der VP.
Zusammengefasst wurde der Miles-Test (Miles et al., 1962) für Mäuse durch intradermale Injektion von 10 μl VEGF (400 ng/ml), Allylisothiocyanat (Senföl, 20% w/v in Mineralöl) oder Kochsalzlösung in Mäuse, denen zuvor intravenös 100 μl 0,5% Evans-Blau-Farbstoff injiziert worden war, angepasst. Nach 15 Minuten wurden die Hautflecken präpariert, fotografiert und bei 58°C mit Formalin eluiert und mit einem Spektrophotometer quantifiziert.
Es ist auch bekannt, dass Durchsickern durch Gefäße/Permeabilität während einer Entzündung auftritt, was eine Anhäufung von Serum-assoziiertem Adhäsionsprotein und Entzündungszellen in Geweben ermöglicht. Tatsächlich verstärken Entzündungsmediatoren selbst direkt ein Durchsickern durch Gefäße. Daher wurde ein solcher Entzündungsmediator, Allylisothiocyanat, auch bekannt als Senföl (Innoue et al., 1997, supra) in src^+/–- oder src^–/–-Mäusen bezüglich seiner Kapazität, VP zu induzieren, getestet. Im Gegensatz zu VEGF-stimulierten src^–/–-Tieren wurde keine Abnahme der VP, die durch die Injektion des Entzündungsmediators Allylisothiocyanat erzeugt worden war, festgestellt. Somit kann gefolgert werden, dass Src eine selektive Rolle bei der VEGF-induzierten VP-Aktivität spielt und nicht VP, die mit dem Entzündungsvorgang assoziiert ist, beeinflusst.
13. VEGF-vermittelte VP-Aktivität hängt von Src und Yes, jedoch nicht Fyn ab
Die Spezifität des Src-Erfordernisses für VP wurde durch Untersuchung der VEGF-induzierten VP-Aktivität, die mit SFKs wie Fyn oder Yes, die ähnlich wie Src bekanntlich in Endothelzellen exprimiert werden, assoziiert ist, untersucht (Bull et al., 1994, FEBS Letters, 361: 41–44, Kiefer et al., 1994, Curr. Biol. 4: 100–109). Es wurde bestätigt, dass diese drei SFKs gleichmäßig in den Hauptschlagadern von Wildtyp-Mäusen exprimiert wurden. Ähnlich zu src^–/–-Mäusen waren Tiere, die hinsichtlich Yes defizitär waren, auch bezüglich VEGF-induzierter VP defizitär. Jedoch behielten Mäuse, denen Fyn fehlte, überraschenderweise eine hohe VP in Reaktion auf VEGF bei, die nicht signifikant verschieden zu Kontrolltieren war. Die Störung der VEGF-induzierten VP in src^–/–- oder yes^–/–-Mäusen zeigt, dass die Kinaseaktivität von spezifischen SFKs für ein VEGF-vermitteltes Signalgebungsereignis wesentlich ist, das zu VP-Aktivität, jedoch nicht Angiogenese führt.
Die vaskulären Permeabilitätseigenschaften von VEGF in der Haut von src^+/–-(14A, linkes Bild) oder src^–/–-(14A, rechtes Bild) Mäusen wurden durch intrader male Injektion von Kochsalzlösung oder VEGF (400 ng) in Mäuse bestimmt, denen intravenös Evans-Blau-Farbstoff injiziert worden war. Nach fünfzehn Minuten wurden Hautflecken fotografiert (Maßstabsbalken, 1 mm). Die Sternchen zeigen die Injektionsstellen an. Die Regionen, die die Injektionsstellen von VEGF, bFGF oder Kochsalzlösung umgeben, wurden herausgeschnitten und die VP durch Elution von Evans-Blau-Farbstoff in Formamid bei 58°C für 24 Stunden quantifiziert und die Absorption bei 500 nm gemessen (14B, linkes Diagramm). Die Fähigkeit eines Entzündungsmediators (Allylisothiocyanat), der bekanntlich mit Entzündung in Beziehung stehende VP induziert, wurde in src^+/–- oder src^–/–-Mäusen getestet (14B, rechts).
Die Fähigkeit von VEGF, VP zu induzieren, wurde in src^–/–-, fyn^–/–- oder yes^–/–-Mäusen in dem Miles-Test verglichen (14C). Daten für einen jeden der Miles-Tests sind als der Mittelwert +/– SD von dreifachen Tieren ausgedrückt. Src^–/–- und yes^–/–-VP-Defekte im Vergleich zu Kontrolltieren waren statistisch signifikant (*p < 0,05, paarweiser t-Test), während die VP-Defekte weder in den VEGF-behandelten fyn^–/–-Mäusen, noch in den Allylisothiocyanat-behandelten src^+/–-Mäusen statistisch signifikant waren (**p < 0,05).
14. Src-Familie-Tyrosinkinase-Inhibitor-behandelte Mäuse und Src^–/–-Mäuse zeigen eine verringerte Gewebeschädigung, die mit Trauma oder Verletzung der Blutgefäße assoziiert ist, als unbehandelte Wildtyp-Mäuse
Eine spezifische Verabreichung von Inhibitoren der Src-Familie-Kinasen fungiert als Inhibitoren eines pathologischen Durchsickerns durch Gefäße und einer pathologischen Permeabilität während Gefäßverletzung oder Erkrankungen wie Schlaganfall. Das Gefäßendothel ist ein dynamischer Zelltyp, der auf viele Reize reagiert, um Vorgänge wie das Auswachsen von neuen Blutgefäßen während Angiogenese eines Tumors und die Permeabilität der Gefäßwand während eines Schlaganfall-induzierten Ödems und einer Gewebeschädigung zu regulieren.
Eine Verringerung der Gefäßpermeabilität in den zwei Mäuse-Schlaganfallmodellen durch eine Arzneistoffhemmung des Src-Weges ist ausreichend, um eine Gehirnschädigung durch eine Verringerung von Ischämie-induzierter Gefäßdurchsickerung zu hemmen. Ferner ist in Mäusen, die hinsichtlich src genetisch defizitär sind und ein verringertes Durchsickern durch Gefäße/eine verringerte Gefäßpermeabilität aufweisen, das Infarktvolumen auch verringert. Die Kombination der syntheti scher Src-Inhibitor-Daten mit der stützenden genetischen Evidenz eines verringerten Durchsickerns durch Gefäße bei Schlaganfall und andere verwandte Modelle zeigen die physiologische Relevanz dieses Ansatzes bei einer Verringerung von Gehirnschädigung nach Schlaganfällen. Eine Hemmung dieser Wege mit einer Reihe von verfügbaren Src-Familie-Kinase-Inhibitoren dieser Signalgebungskaskaden weist den therapeutischen Nutzen einer Linderung von Gehirnschädigung aufgrund Gefäßpermeabilität-bezogener Gewebeschädigung auf.
Zwei unterschiedliche Verfahren für eine Induktion von fokaler cerebraler Ischämie wurden verwendet. Beide Tiermodelle einer fokalen cerebralen Ischämie sind gut etabliert und werden weit verbreitet in der Schlaganfallforschung verwendet. Beide Modelle wurden zuvor verwendet, um die Pathophysiologie von cerebraler Ischämie zu untersuchen sowie neue Arzneimittel gegen Schlaganfall zu testen.

a) Mäuse wurden mit Avertin anästhesiert und die Körpertemperatur wurde durch Halten des Tiers auf einem Heizkissen aufrechterhalten. Ein Einschnitt wurde zwischen dem rechten Ohr und dem rechten Auge gemacht. Der Schädel wurde durch Zurückziehen des Schläfenmuskels freigelegt und ein kleines Bohrloch in die Region über der mittleren Gehirnarterie (MCA) gebohrt. Die Hirnhäute wurden entfernt und die rechte MCA wurde durch Koagulation unter Verwendung eines Heizfilaments verschlossen. Es wurde den Tieren ermöglicht, sich zu erholen, und sie wurden in ihre Käfige zurückgesetzt. Nach 24 Stunden wurden die Gehirne perfundiert, entfernt und in 1 mm-Querschnitte zerschnitten. Die Schnitte wurden in 2% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) eingetaucht und der Gehirnbereich mit Infarkt wurde als nicht-gefärbtes (weißes) Gewebe, umgeben von lebensfähigem (rotem) Gewebe identifiziert. Das Infarktvolumen wurde als die Summe der nicht-gefärbten Bereiche der Schnitte multipliziert mit ihrer Stärke definiert.

Mäuse, die hinsichtlich Src (Src–/–) defizitär waren, wurden verwendet, um die Rolle von Src bei cerebraler Ischämie zu untersuchen. Src+/–-Mäuse dienten als Kontrollen. Wir fanden, dass in Src–/–-Mäusen das Infarktvolumen von 26 ± 10 mm³ auf 16 ± 4 mm³ in Kontrollen 24 Stunden nach dem Eingriff verringert war. Die Wirkung war noch mehr ausgeprägt, wenn C57B16-Wildtyp-Mäusen 1,5 mg/kg PP1 intraperitoneal (i. p.) 30 Minuten nach Gefäßverschluss injiziert wurde. Die Infarktgröße war von 31 ± 12 mm³ in der nicht-behandelten Gruppe auf 8 ± 2 mm³ in der PP1-behandelten Gruppe verringert.

b) In einem zweiten Modell einer fokalen cerebralen Ischämie wurde die MCA durch Platzieren eines Embolus am Ursprung der MCA verschlossen. Ein einzelner intakter Fibrin-reicher 24 Stunden alter homologer Pfropfen wurde an dem Ursprung der MCA unter Verwendung eines modifizierten PE-50-Katheters platziert. Eine Induktion von cerebraler Ischämie wurde durch die Verringerung von cerebralem Blutfluss in die ipsilaterale Gehirnhälfte im Vergleich zu der kontralateralen Gehirnhälfte bestätigt. Nach 24 Stunden wurden die Gehirne entfernt, serielle Schnitte wurden präpariert und mit Hämatoxylin-Eosin (HE) angefärbt. Infarktvolumina wurden durch Addition der Bereiche mit Infarkt in seriellen HE-Schnitten multipliziert mit dem Abstand zwischen jedem Schnitt bestimmt.

Die in dieser Untersuchung verwendete Dosis von PP1 (1,5 mg/kg i. p.) wurde empirisch ausgewählt. Es ist bekannt, dass VEGF zuerst etwa 3 Stunden nach einer cerebralen Ischämie in dem Gehirn exprimiert wird, wobei ein Maximum nach 12 bis 24 Stunden auftritt. In dieser Untersuchung wurde PP1 30 Minuten nach dem Ausbruch des Infarkts verabreicht, um vollständig eine VEGF-induzierte Zunahme der Gefäßpermeabilität zu blockieren. Gemäß dem zeitlichen Verlauf einer typischen VEGF-Expression wäre ein mögliches therapeutisches Fenster für die Verabreichung von Src-Inhibitoren bis 12 Stunden nach dem Schlaganfall. Bei Erkrankungen, die mit einer anhaltenden Zunahme der Gefäßpermeabilität assoziiert sind, ist eine chronische Verabreichung des Src-hemmenden Arzneimittels geeignet.
15 ist ein Diagramm, das die vergleichenden Ergebnisse eines durchschnittlichen Infarktvolumens (mm³) in Mäuse-Gehirnen nach einer Verletzung zeigt, wobei Mäuse bezüglich Src heterogen waren (Src+/–), dominant negative Src-Mutanten waren (Src–/–), Wildtyp-Mäuse waren (WT) oder Wildtyp-Mäuse waren, die mit 1,5 mg/kg PP1 behandelt worden waren, (PP1).
16 zeigt beispielhafte sequenzielle MRI-Scans von isoliertem perfundiertem Mäuse-Gehirn nach Behandlung für eine Induktion von ZNS-Verletzung, wobei die Progression von Scans in dem PP1-behandelten Tier (rechts) deutlich weniger Infarkt als die Progression von Scans in dem nicht-behandelten Kontrolltier (links) zeigt.
Die vorliegende Erfindung ist besonders für den spezifischen Eingriff von VP-induzierter Gewebeschädigung geeignet, da die zielgerichtete Hemmung der Wirkung von Src-Familie-Tyrosinkinase eine Hemmung auf VP ohne Langzeitwirkung auf an dere VEGF-induzierte Reaktionen fokussiert, die für eine Erholung von einer Verletzung günstig sein können. Im Gegensatz zu einer Neutralisierung von VEGF-Protein greift die Hemmung von Src nicht in die kumulative angiogene Wirkung von VEGF ein, die in einem späteren Stadium der Erkrankung günstig sein könnte.
Die Verwendung von synthetischen kleinen Molekülen als Inhibitoren ist im Allgemeinen sicherer und besser handhabbar als die Verwendung großer Proteine. Die Verwendung rekombinanter Proteine wie eines VEGF-Rezeptor-murines Immunglobulin-Fusionsproteins ist möglicherweise schädlich und erlaubt nicht eine wiederholte Verabreichung aufgrund einer Gefahr für ein Auslösen einer allergischen Reaktion bei einer Verwendung im Menschen (d. h. humaner Anti-Maus-Antikörper, HAMA). Schlussendlich ist VEGF nicht der einzige Aktivator von stromabwärts gelegenem Src und andere Cytokine, die bei der Pathophysiologie einer cerebralen Ischämie beteiligt sind, können Gefäßpermeabilität beeinflussen, wie IL-6 und TMF-α. Somit könnte eine Hemmung von VEGF nicht die gesamte darauf folgende Verletzungs-bezogene Src-Aktivierung hemmen. In der Tat ist eine Verringerung der Infarktgröße durch PP1 mehr ausgeprägt als durch einen VEGF-Antagonismus, was anzeigt, dass andere Wege Src-Kinasen aktivieren könnten, was eine Permeabilitätszunahme erleichtert.
Die vorstehende Beschreibung wird als ausreichend betrachtet, um es dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung durchzuführen. Die Hinterlegung von Material stellt kein Zugeständnis dar, dass die hier enthaltene Beschreibung nicht ausreichend ist, um die Durchführung irgendeines Aspekts der Erfindung zu ermöglichen, einschließlich der besten Möglichkeit dafür. Sie soll auch nicht dahingehend verstanden werden, dass sie den Umfang der Ansprüche auf die spezifische Veranschaulichung, die sie darstellt, begrenzt. Tatsächlich werden dem Fachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denjenigen, die hier gezeigt und beschrieben sind, aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich werden und diese liegen im Umfang der beigefügten Ansprüche. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, die Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Src fähig ist, und Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Yes fähig ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Src fähig ist, und die Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Yes fähig ist, zwei getrennte Nukleinsäuren sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eine einzige Nukleinsäure die Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Src fähig ist, und die Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Yes fähig ist, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Src-Protein Src-A ist, oder an dem Aminosäurerest 527 einen jeglichen Aminosäurerest mit der Ausnahme von Tyrosin, Serin oder Threonin aufweist, oder wobei das Src-Protein inaktiv ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das inaktive Src-Protein Src K295M oder Src 251 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Yes-Protein ein inaktives Yes-Protein ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die einen viralen Gentransfervektor oder einen nicht-viralen Gentransfervektor umfasst.
Verwendung einer Nukleinsäure, die zur Expression eines inaktiven Tyrosinkinase-Proteins Yes oder eines Gemisches von inaktiven Tyrosinkinase-Proteinen Src und Yes fähig ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung eines pathologischen Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Schlaganfall-induzierten Schädigungen, Wachstum von Tumoren, Myokardinfarkt, Arteriosklerose, Gehirnödem, cerebrovaskulärer Erkrankung oder cerebrovaskulärem Trauma, rheumatoider Arthritis, diabetischer Retinopathie, entzündlichen Erkrankungen, Restenose, Hirnblutung, Gehirn- und Wirbelsäulentrauma, Hypoxie-induzierter Gehirn- und Wirbelsäulenverletzung, entzündlichen Erkrankungen des ZNS, viralen oder bakteriellen Infektionen des ZNS, Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit einer chronischen Zunahme der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke und akutem progressivem Lungenversagen (ARDS), durch Hemmen von vaskulärer Permeabilität in einem Zielgewebe.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das inaktive Src-Protein Src K295M, Src 251 oder ein Gemisch davon ist.
Verwendung einer Nukleinsäure, die zur Expression eines aktiven Tyrosinkinase-Proteins Yes oder eines Gemisches von aktiven Tyrosinkinase-Proteinen Src und Yes fähig ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung eines pathologischen Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ischämischen Extremitäten und chronischen Wunden, durch Verstärken von vaskulärer Permeabilität in einem Zielgewebe.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das aktive Src-Protein Src-A ist oder an dem Aminosäurerest 527 einen jeglichen Aminosäurerest außer Tyrosin, Serin oder Threonin aufweist.
Herstellungsartikel, der Verpackungsmaterial und eine in dem Verpackungsmaterial enthaltene pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulierung von vaskulärer Permeabilität in einem Gewebe, das an einem Erkrankungszustand leidet, fähig ist, das Verpackungsmaterial einen Hinweis umfasst, der anzeigt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Be handlung von Erkrankungszuständen durch Modulierung von vaskulärer Permeabilität verwendet werden kann, und die pharmazeutische Zusammensetzung Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Yes fähig ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Herstellungsartikel nach Anspruch 12, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ferner Nukleinsäure umfasst, die zur Expression von Tyrosinkinase-Protein Src fähig ist.
Herstellungsartikel nach Anspruch 13, wobei das Src-Protein ein aktives oder inaktives Src ist.
Herstellungsartikel nach Anspruch 14, wobei das aktive Src-Protein Src-A ist oder an dem Aminosäurerest 527 einen jeglichen Aminosäurerest außer Tyrosin, Serin oder Threonin aufweist.
Herstellungsartikel nach Anspruch 14, wobei das inaktive Src-Protein Src K295M oder Src 251 ist.
Herstellungsartikel nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Yes-Protein aktiv oder inaktiv ist.
Herstellungsartikel nach Anspruch 13, wobei die Src- und Yes-Proteine durch ein Gemisch von Nukleinsäuren kodiert werden, die zur Expression von Src-Protein und zur Expression von Yes-Protein fähig sind.