KR20020063259A - 혈관 형성 및 혈관 투과성 조절제 및 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Src 또는 변형된 Src 단백질, Yes 단백질 또는 변형된 Yes 단백질, Src 계열 타이로신 키나제 단백질 억제제, 및 이들 또는 이들의 혼합물을 발현할 수 있는 핵산을 사용하여 조직내 혈관 투과성(VP)을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 불활성 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 혼합물, 또는 CSK 단백질 또는 변형된 CSK 단백질, 또는 이를 암호화하는 핵산을 사용하거나 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146 및 겔다나마이신과 같은 화학적 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 사용함에 의해 VP를 억제하는 방법 또는 활성 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 혼합물, 또는 이를 암호화하는 핵산을 사용하여 VP를 강화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 관련 조성물 및 제품에 관한 것이다.

Description

혈관 형성 및 혈관 투과성 조절제 및 억제제{Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 1999년 12월 22일자로 출원된 미국 특허 출원번호 제09/470,881호 및 2000년 3월 29일자로 출원된 미국 특허 출원번호 제09/538,248호(이 출원 모두는 1998년 5월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원번호 제60/087,220호에 대한 우선권을 주장하고 미국을 지정하고 있는 국제 특허 출원번호 제PCT/US99/11780호에 대한 우선권을 주장한다)에 대한 우선권을 주장한다.

정부 권리에 대한 진술

기술된 연구의 일부가 미국을 대표하는 NIH로부터 승인하에 지원되었다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖고 있다.

혈관 형성은 혈관 신생(vasculariztion) 과정으로서 혈관이 새롭게 생성되어 조직으로 성장됨을 포함하고 또한 혈관 신생(neovasculariztion)으로서 언급된다. 이러한 과정은 내피 세포 및 평활근 세포의 침투에 의해 매개된다. 상기 과정은 3개의 방식중 하나로 진행되는 것으로 사료된다. 혈관이 기존의 혈관으로부터 발생할 수 있거나 혈관이 전구체 세포(혈관생성)로부터 드-노보(de-novo) 생성될 수 있거나 현존하는 작은 혈관의 직경이 비대해짐으로써 생성될 수 있다[문헌참조: Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118(1990)]. 혈관 형성을 위해 처음에 내피 세포는, 종양 세포가 침투하여 전이하는데 사용되는 유사한 방식으로 혈관 기저막을 분해하여 이동해야만 한다. 혈관 형성은 일반적으로 성인 또는 성숙한 조직에서는 일어나지 않지만 상처 치유 및 황체 성장 주기동안 일어난다[문헌참조: Moses et al., Science, 248:1408-1410(1990)].

혈관 형성은 신생아 발육에서 중요한 과정이고 또한 상처 치유에 있어서도 중요한 과정이며 조직 염증, 관절염, 종양 성장, 당뇨 망막증, 망막의 혈관 신생에 의한 황반 퇴화를 포함하는 다양한 임상학적 질환 및 유사 증상의 발병에 있어서 중요한 인자이다. 혈관 형성과 연관된 이들 임상학적 증상은 혈관 형성 질환으로서 언급된다[문헌참조: Folkman et al., Science, 235:442-447(1987)].

혈관 형성의 억제가 종양 성장을 억제하는데 유용한 치료법이 될 것으로 제안되었다. 혈관 형성은 (1) bFGF(기본 섬유아세포 성장 인자)와 같은 "혈관 형성 분자"의 방출을 억제하고 (2) 예를 들어 항-βbFGF 항체를 사용하여 혈관 형성 분자를 중화시키고 (3) 비트로넥틴 수용체 α_vβ₃의 억제제를 사용하고 (4) 혈관 형성 자극에 대한 내피 세포 반응을 억제함으로써 억제될 수 있는 것으로 제안되었다. 이러한 후자 방법이 주목받고 있고 문헌[참조: Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96(1992)]은 콜라게나제 억제제, 기저막 턴오버 억제제,지혈성 스테로이드, 진균류 기원 혈관 형성 억제제, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘, 관절염 약물(D-페니실라민 및 금 티오말레이트), 비타민 D₃동족체, 알파-인터페론 및 혈관 형성을 억제하는데 사용될 수 있는 억제제를 포함하는 다양한 내피 세포 반응 억제제를 기술하고 있다. 추가로 제안된 혈관 형성 억제제는 문헌[참조: Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118(1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410(1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51(1988), 및 미국 특허 제5,092,885호, 제5,112,946호, 제5,192,744호, 제5,202,352호, 제5,753,230호 및 제5,766,591호]에 기술되어 있다. 그러나 언급된 참조문헌에 기술된 혈관 형성 억제제중 어떠한 것도 Src 단백질을 포함하지 않는다.

선행 기술 분야에서 혈관 형성이 혈관 인테그린과 세포외 매트릭스 단백질간의 상호 작용에 의존하는 것으로 보고되었다[문헌참조: Brooks et al., Science, 264:569-571(1994)]. 추가로, 혈관 형성 혈관 세포의 프로그램된 세포사(어팝토시스)가 혈관 인테그린 α_vβ₃의 특정 길항제에 의해 억제되는 상호작용에 의해 개시되는 것으로 보고되었다[문헌참조: Brooks et al., Cell, 79:1157-1164(1994)]. 보다 최근에는, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)의 비트로넥틴수용체(α_vβ₅)로의 결합이 α_vβ₅길항제를 사용하여 억제될 수 있어 프로테이나제의 효소 기능이 억제될 수 있는 것으로 보고되었다[문헌참조: Brooks et al., Cell, 85:683-693(1996)]. α_v인테그린이 혈관 형성 혈관내 내피 세포의 생존에 중요한 성분으로서 동정되었다. 특이적 인테그린 α_v인테그린 길항제가 별개의 성장 인자 유도된 혈관 형성 경로를 차단한다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도된 혈관 형성은 인테그린 α_vβ₅길항제에 의해 차단되고 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 유도된 혈관 형성은 인테그린 α_vβ₃길항제에 의해 차단된다.

뇌 혈관계는 저분자가 주변 뇌 조직으로의 혈관외 유출을 억제하는 고도의 제한적인 혈뇌 장벽임을 특징으로 한다. 포유동물에서 혈뇌 장벽의 특성이 약리학적 연구에서 특별히 주목받아왔는데 그 이유는 고도의 제한적인 혈뇌 장벽으로 인해 많은 약물이 통상적으로 혈관계로부터 뇌조직으로 통과하지 못하기 때문이다. 본 발명은 혈액의 출혈에 의해 측정되는 바와 같이 VP가 Src 또는 Yes에 의해 조절될 수 있다는 예상치 않은 발견을 포함한다. 더욱이, VP는 혈관 형성 및 또 다른 병리학적 증상과 연관되어 있다. 염증 유도된 혈관 투과성의 증가는 부종 및 종창과 관련이 있다.

bFGF 유도된 혈관 형성이 아닌 VEGF 유도된 혈관 형성에 있어서 Src 타이로신 키나제 활성이 요구된다는 것은 이들 경로간(병아리 배아 및 마우스 모델)에 조절 및 활성화 신호에 상당한 차이가 존재함을 입증하는 것이다[문헌참조: Eliceiri et al., Molecular Cell, 4: 915-924(1999)].

종양 세포로부터 혈관 형성 신호로 인한 혈관 투과성의 변화는 암과 관련된 신호 경로를 조사하기 위한 모델을 제공하였지만 상처, 질환 또는 또 다른 혈관 외상으로 인한 혈관 투과성은 출혈 및 조직 손상과 연관된 부종의 주요 원인이다. 예를 들어, 뇌 혈관 사고(CVA) 또는 뇌 또는 척수 조직에 있어서의 또 다른 혈관 손상이 신경 장애의 가장 일반적인 원인이고 불구의 주요 원인이다. 전형적으로, CVA 영역에서 뇌 또는 척수 조직에 대한 손상은 출혈 및/또는 부종을 포함한다. 전형적으로, CVA는 뇌 허혈, 뇌로의 정상 혈류의 차단, 혈류의 일시적인 장애로 인한 뇌 기능부전, 두측내 또는 두측외 동맥의 색전증 또는 혈전증으로 인한 경색, 출혈, 동정맥 기형으로 인한 손상을 포함할 수 있다. 허혈 발작 및 뇌 출혈은 급작스럽게 일어날 수 있고 일반적으로 사고로 인한 충격이 뇌 영역을 손상시킨다[문헌참조: The Merck Manual, 16^thed. Chp. 123, 1992].

CVA 이외의 중추 신경계(CNS) 감염 또는 질환이 또한 뇌 및 척추의 혈관에 영향을 미칠 수 있고 예를 들어, 세균성 뇌막염, 바이러스성 뇌염 및 뇌 농양 형성에서 처럼 염증 및 부종과 관련이 있을 수 있다[문헌참조: The Merck Manual, 16^thed. Chp. 125, 1992]. 전신성 질환 증상은 또한 혈관을 약하게 하여 출혈 및 부종, 예를 들어, 당뇨병, 신장 질환, 아테롬성동맥경화증등을 유발시킬 수 있다. 따라서, 출혈 및 부종은 암과는 구분되고 이와는 무관하게 다양한 손상, 외상 또는질환 증상과 연관된 효과적인 특정 치료법이 요구되는 위험한 병인이다.

본 발명자는 Src 계열의 타이로신 키나제의 선택적 억제가 조직에서의 손상 또는 외상과 연관된 VP 증가를 감소시키고 혈액 출혈 및/또는 부종과 관련된 병인을 완화시킴을 밝혔다.

발명의 요약

본 발명은 일반적으로 본원에서 Src로서도 언급되는 타이로신 키나제 또는 일반적으로 본원에서 Yes로서 언급되는 타이로신 키나제 Yes에 의한 혈관 투과성(VP) 또는 Src 계열의 타이로신 키나제 활성을 선택적으로 억제시킴에 의한 혈관 투과성의 조절에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 포유동물의 표적 조직에서 VP를 조절하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 치료학적 VP 유효 조절량의 타이로신 키나제 Src 및 Yes의 혼합물을 포함한다.

활성 Src 및 Yes 키나제 단백질을 포함하는 조성물에서 예상되는 조절은 표적 조직에서의 혈관의 혈관 투과성의 강화 또는 증가이다. 목적하는 Src 단백질이 활성 키나제인 경우, 바람직한 Src는 Src-A이다. 또 다른 바람직한 활성 Src 단백질은 Src 단백질의 527번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 단백질이다. 바람직한 활성 Yes 단백질은 야생형 사람 Yes(예를 들어, 그 자체 또는 Yes-1 단백질)의 키나제 활성을 가질 것이다. 또 다른 바람직한 활성 Yes는 Yes 단백질의 키나제 불활성화 인산화 부위가 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기에서 Src의 527번 아미노산잔기의 돌연변이와 유사하게 돌연변이되어 불활성화 인산화가 불능이거나 최소화된 것이다.

조성물이 불활성 키나제 단백질인 Src 및 Yes 단백질을 포함하는 경우 예상되는 조절은 표직 조직내 혈관의 혈관 투과성의 억제 또는 감소이다. 목적하는 Src 단백질이 불활성 단백질인 경우, 바람직한 Src는 Src 251이다. 추가로 바람직한 불활성 Src는 Src K295M이다. 바람직한 불활성 Yes 단백질은 야생형 단백질과 비교하여 키나제 활성이 감소된 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 표적 세포로 형질감염되는 경우 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes를 발현할 수 있는, 적합한 약제학적 담체중의 치료학적 VP 유효 조절량의 핵산을 포함하는 약제학적 조성물이다. Src 또는 Yes 단백질을 암호화하는 발현 가능한 핵산은 Yes 또는 Src 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 절편을 포함할 수 있다. 표적 세포로 전달되는 경우, 표적 세포는 핵산 서열을 전사하고 해독하여 목적하는 단백질을 발현한다.

조절이 표적 조직내 혈관의 혈관 투과성을 강화시키거나 증가시키는 경우 Src 암호화 핵산은 Src의 활성 형태를 암호화하고 Yes 암호화 핵산은 Yes 키나제 단백질의 활성 형태를 암호화한다. 일단 표적 숙주 세포로 전달되면, 핵산은 숙주 세포에 의해 발현될 것이다. 바람직한 Src 암호화 핵산은 활성 Src A 단백질을 암호화한다. 추가로 바람직한 Src 암호화 핵산은 발현된 Src 단백질의 527번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 돌연변이된 활성 Src를 암호화한다. 바라직한 Yes 암호화 핵산은 야생형 단백질또는, 기술된 Src 527번 위치의 돌연변이와 유사한 방식으로 Yes 단백질의 불활성화 인산화 부위가 블능이거나 억제되도록 변형된 단백질을 암호화한다.

목적하는 조절이 표적 조직내 혈관의 혈관 투과성을 억제시키거나 감소시키는 경우, 바람직한 불활성 Src 암호화 핵산은 Src 251 단백질을 암호화한다. 추가로 바람직한 불활성 Src 암호화 핵산은 불활성 Src K295M을 암호화한다. 바람직한 불활성 Yes 암호화 핵산은 키나제 활성이 감소된 단백질을 암호화한다.

본 발명의 조성물은 핵산이 발현 가능한 Src 또는 Yes 유전자를 포함할 수 있는 경우 핵산의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가로, 단일 핵산은 Src 단백질을 암호화하는 핵산 및 Yes 단백질을 암호화하는 핵산 모두를 포함할 수 있다. 표적 조직내 혈관 형성 및 VP의 정확한 조절을 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 활성 또는 불활성 타이로신 키나제 단백질 Src, 또는 타이로신 키나제 단백질 Yes의 혼합물을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 활성 또는 불활성 타이로신 키나제 단백질 Src, 또는 타이로신 키나제 단백질 Yes를 발현할 수 있는 핵산의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 교시에 따라 제1 타이로신 키나제와, 동시 투여되는 보다 많은 양의 제2 타이로신 키나제의 상이한 양을 사용하여 조절을 정확하게 할 수 있다. 상기 양태에서, 차등적으로 발현시키는 프로모터 또는 또 다른 조절 요소들을 사용하여 본 발명의 교시에 따라 제1 타이로신 키나제 유전자의 발현량을 낮게 하면서 제2 타이로신 키나제 유전자의 발현량을 높게 하여 동시투여될 수 있다. 상기 양태에서, 혈관 형성은 제1 불활성 yes 유전자의 발현량을 높게 하면서 제 1 활성Src 유전자의 발현량을 낮게 하여 VP를 유지하거나 최소화하거나 감소시켜 증가시킬 수 있다. 이러한 동시 투여는 별도의 발현 벡터 또는 단일 조합된 발현 벡터 작제물을 사용하여 성취될 수 있다. 유사하게, 혈관 형성은 또한 제1 불활성 Src 유전자의 발현량을 낮게하고 제2 활성 yes 유전자의 발현량을 높게하여 VP를 유지하거나 강화시키거나 증가시켜 감소시킬 수 있다. 추가의 조절 정도는 특이적 활성의 프로모터 요소 및 유도성 프로모터와 조합하여 높고/낮은 src/yes의 다양한 돌연변이에 의해 성취될 수 있다.

각각의 src 및 yes 유전자는 동일하거나 상이한 조절 핵산 서열(예를 들어, 인핸서, 리프레서 및 프로모터 요소, 이에 제한되지 않음)의 조절 통제하에 있을 수 있다. 2개 이상의 단백질이 단일 벡터로부터 발현 가능한 경우, 독립적인 단백질 유전자의 전사 조절 및 억제는 동일한 조절 요소의 통제하에 있을 수 있다. 또한 전사의 조절 및 통제는 2개 이상의 독립적으로 작동하는 조절 요소에 의해 발휘될 수 있다. 조절 요소는 선행 기술분야에 공지되어 있고 지속적 활성, 유도성, 인핸서, 프로모터, 서프레서등의 핵산 서열일 수 있다.

본 발명의 핵산 서열은 Src 및/또는 Yes 단백질을 암호화하는 핵산 절편을 포함하는 바이러스 및/또는 비 바이러스 유전자 전달 벡터를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 및 비바이러스 유전자 전달 및 발현 벡터가 당해 분야에 공지되어 있고 하기에 간략하게 기술되어 있다.

바람직한 핵산은 Src A 단백질을 암호화한다. 또 다른 바람직한 활성 Src 단백질은 Src 단백질의 527번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 단백질이다.

Src 및 Yes 단백질의 혼합물 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 핵산은 본 발명의 교시에 따라 목적하는 조절 수준 및 목적하는 혈관 형성 및 VP에 대한 협력 효과에 따라 활성 및 불활성 형태의 단백질을 조합시킬 수 있다.

Src 또는 Yes 단백질을 제공하는 조성물은 정제된 단백질, 천연 단백질의 생물학적 활성 단편, 재조합적으로 제조된 Src 또는 Yes 단백질 또는 단백질 단편들 또는 융합 단백질, 또는 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 혼합물을 발현시키는 유전자/핵산 발현 벡터를 포함할 수 있다.

Src 또는 Yes 단백질이 불활성화되거나 억제되는 경우, 조절은 VP의 억제이다. Src 또는 Yes 단백질 활성이거나 활성화되는 경우, 조절은 VP의 강화이다.

본 발명은 치료학적 VP 유효 조절량의 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 배합물을 포함하는 조성물로 포유동물 조직을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 방법에서, Src 및 Yes 타이로신 키나제 단백질, 또는 이러한 단백질을 발현할 수 있는 핵산 발현 벡터는 VP 조절에 응답하는 질환 증상을 앓는 조직으로 투여된다.

목적하는 치료학적 VP 유효 조절 효과가 VP의 증가 또는 강화인 경우, 활성 형태의 Src 단백질 및/또는 Yes 단백질이 투여될 수 있다. 유사하게, 상기 방법은 활성 또는 불활성 형태의 Src 단백질 및/또는 Yes 단백질을 암호화하는 발현가능한 핵산을 투여함을 포함한다.

치료될 조직은 VP가 조절될 필요가 있는 임의의 조직일 수 있다. 치료는 표적 조직을 유효량의 목적하는 조절용 조성물과 접촉시켜 약제의 단백질 또는 핵산 성분과 충분한 시간동안 접촉시켜 표적 조직으로 흡수되도록 하여 성취될 수 있다. VP 억제는 해로운 출혈이 일어나는 병든 조직을 치료하는데 유용하다. 조직의 예는 염증 조직, 발작 및 심근 경색, 또는 정상 혈류의 또 다른 차단과 연관된 조직, 재발 협착증을 앓는 조직을 포함한다.

강화는 당뇨병 또는 또 다른 증상으로 인한 지절의 혈액 순환이 불량한 허혈 지절을 앓는 환자를 치료하는데 유용하고 강화하기 위해 약물을 혈뇌 장벽을 거쳐 뇌로 투여한다. 또한, 치유되지 않음에 따라서 혈관 세포 증식을 증가시키고 VP에 의해 매개되는 혈관신생을 통해 이로울 수 있는 만성적 상처를 갖는 환자가 치료될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 팩킹 재료 및 팩킹 재료내에 함유되는 약제학적 조성물을 포함하는 제품이고 당해 약제학적 조성물은 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절할 수 있고 팩킹 재료는 약제학적 조성물이 혈관 투과성을 조절함에 의해 질환 증상을 치료하는데 사용될 수 있음을 지적하는 표지를 포함하고 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체중의 치료학적 유효량의 타이로신 키나제 단백질 Yes를 포함한다. 상기 양태는 활성 또는 불활성 형태의 Yes 단백질 및 또한 활성 또는 불활성 Yes 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 레트로바이러스 및 비바이러스 유전자 전달/발현 백터는 활성 또는 불활성 형태중 하나 또는 둘다를 암호화하는 핵산 절편을 포함할 수 있다. 활성 및 불활성 형태의 단백질 키나제 유전자 둘 다가 존재하는 경우, 유전자는 별도의 유도성 프로모터하에 존재하여목적하는 바와 같이 별도로 발현될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체중에 치료학적 VP 유효 조절량의 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes를 포함하는 제품이다. 팩킹된 제품이 VP 조절 효과를 강화시킴을 지적하는 경우, Src 및 Yes는 활성 형태이다. 바람직한 활성 Src는 Src-A 단백질이다. 또 다른 바람직한 활성 Src 단백질은 Src 단백질의 527번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 단백질이다.

본 발명의 추가의 측면은 약제학적 조성물을 포함하는 제품이고 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체중에 치료학적 VP 유효 조절량의 불활성 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes 단백질을 포함하고 목적하는 조절 방식은 VP를 불활성화시키거나 억제시키는 것이다. 바람직한 불활성 Src는 Src 251 단백질이다. 또 다른 바람직한 불활성 Src 단백질은 Src K295M이다.

유사하게, 본 발명의 추가의 측면은 약제학적 조성물이 적합한 약제학적 담체중에 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes를 발현시킬 수 있는 핵산을 포함하는 제품이다. 상기 제품의 약제학적 조성물의 바람직한 핵산 성분은 활성 Src 단백질을 암호화하고 목적하는 조절은 VP를 강화시키거나 활성화시키는 것이다. 추가로 활성 Yes 단백질을 암호화하는 핵산이 고려된다. 바람직한 활성 Src는 Src-A 단백질이다. 또 다른 바람직한 활성 Src 암호화 핵산은 Src 단백질의 527번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 핵산이다. 또한 단일 핵산은 yes 및 src 둘 다를 발현하고 독립적으로 조절되거나동일한 프로모터, 인핸서, 서프레서, 리프레서 또는 또 다른 적합한 조절 핵산 서열하에 있도록 작제될 수 있다.

혈관 투과성의 해로운 변화와 연관된 출혈 및/또는 부종과 연관된 조직 손상은 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제에 의해 완화될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 혈관 투과성 유효 투여량의 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제가 이러한 치료를 받을 필요가 있는 조직으로 투여된다. 출혈 또는 부종으로 인한 조직 손상은 상기 방식으로 감소될 수 있다.

특히, 본 발명은 조직을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 치료학적 혈관 투과성 유효 억제량의 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제와 조직을 접촉시킴으로써 출혈 및/또는 부종과 연관된 질환을 앓는 조직의 혈관 투과성 증가를 억제시키는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, Src 특이적 타이로신 키나제 억제제가 조직으로 투여된다.

해로운 손상 유도된 혈관 투과성의 증가 및 출혈 또는 부종으로 인한 손상과 관련이 있는 임의의 병인을 상기 방법으로 치료할 수 있다. 이러한 병리학적 사건은 물리적 결찰, 차단, 분리, 폐색, 외상등과 같은 혈액에 대한 외상을 포함할 수 있다. 아테롬성동맥경화증, 당뇨 망막증, 미생물 감염으로 인한 염증 질환 및 관절염등과 같은 또 다른 전신성 병리학적 사건은 또한 본 발명의 방법에 의해 적절히 치료된다.

본 발명의 방법은 증가된 출혈 및/또는 이와 연관된 부종으로 인한 조직 손상을 완화시킴으로써 뇌혈관 질환 또는 외상을 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명의 방법은 혈관 투과성에 있어서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-유도된 Src 매개된 증가와 연관된 조직 손상을 완화시키는데 유용하다. 그러나, 본 발명의 방법은 VEGF 유도된 혈관 투과성의 증가에 제한되지 않고 또한 또 다른 조절 신호에 응답하여 Src 계열의 타이로신 키나제 매개된 혈관 투과성의 증가를 조절하는데 적당하다.

특히, 타이로신 키나제 Src(또한 일반적으로 본원에서 Src로 언급됨) 및 이와 밀접하게 연관된 타이로신 키나제 Yes(또한 일반적으로 본원에서 yes로 언급됨)을 억제시킴으로써 치료될 조직이 조절되어 손상 또는 질환과 연관된 혈관 투과성의 증가를 억제할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해 적합한 Src 계열의 타이롯긴 키나제 억제제는 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146 및 겔다나마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화학적 억제제이다. Src 계열의 타이로신 키나제의 또 다른 화학적 억제제는 또한 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.

조직내 혈관 투과성은 또한 불활성 Src 단백질(Src K295M 또는 Src 251) 또는 불활성 Yes 단백질, 또는 활성 C-말단 Src 키나제(CSK) 단백질과 같은 단백질 억제제인 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제를 조직으로 투여하여 조절될 수 있다.

Src 계열의 타이로신 키나제 억제제 단백질, 예를 들어, 불활성 Src, 불활성 yes 또는 활성 CSK 단백질과 같은 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제 단백질을 암호화하는 핵산이 혈관 투과성을 조절하는데 적합하다. Src 계열의 타이로신 키나제 활성에 대한 상기 핵산 억제제는 하나 이상의 레트로바이러스 발현 벡터, 비바이러스 벡터등을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 억제제는 적당한 조절 신호(예를 들어, 임의의 주어진 핵산에 대한 하나 이상의 발현 가능한 핵산의 절편에 대한 프로모터 또는 인핸서)를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 제품은 팩킹 재료 및 상기 팩킹 재료에 포함되는 약제학적 조성물을 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 질환 증상을 앓는 조직의 혈관 투과성을 조절할 수 있다. 팩킹 재료는 약제학적 조성물이 출혈 또는 부종 연관된 질환 증상에 사용될 수 있음을 지적하고 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체중에 치료학적 유효량의 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제를 포함함을 지적하는 표지를 포함한다.

본 발명의 제품은 약제학적 조성물의 일부로서, 화학적 억제제인 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제를 포함할 수 있다. 특히, 바람직한 화학적 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제는 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146 및 겔다나마이신 또는 유사한 Src 억제 활성을 갖는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직한 억제제는 PP1이다.

본 발명의 제품은 또한 약제학적 조성물이 Src K295M 또는 Src 251, 불활성 yes 단백질 또는 활성 CSK 단백질과 같은 불활성 Src 단백질인 단백질 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제를 포함하는 제품을 포함한다.

또한, 약제학적 조성물은 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제를 약제학적으로 허용되는 담체중에 포함한다. 이러한 약제학적 조성물중에서, 핵산이 암호화하는 억제제가 Src K295M 또는 Src 251, 불활성 Yes 단백질 또는 활성 CSK 단백질과 같은 불활성 Src 단백질일 수 있다.

제품은 치료학적 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제 또는 준치료학적 양의 하나 이상의 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제를 약제학적으로 허용되는 담체중에 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 제품의 약제학적 조성물은 하나 이상의 준치료학적 VP 유효 조절량의 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제의 혼합물을 포함할 수 있고 이러한 혼합물이 함께 작용하여 치료될 조직에 VP 감소 효과를 제공한다. 제품의 약제학적 조성물은 목적하는 조절 효과에 따라 다양할 수 있고 팩킹 표지는 또한 이와 상응하게 다양할 것이다.

제품의 약제학적 조성물은 목적하는 조절 또는 억제 효과에 다라 다양할 수 있고 팩킹 표지는 또한 이와 상응하게 다양할 것이다.

본 발명은 일반적으로 의학 분야에 관한 것이고 특히, 혈관 투과성(VP)을 조절하고 억제시키는 방법 및 이에 대한 조성물에 관한 것이다.

본 명세서의 일부를 구성하는 도면에서,

도 1은 처음에 문헌[참조: Takeya et al., Cell, 32:881-890(1983)]에 기술된 바와 같이 인트론이 결실된 완전한 암호화 서열인 닭 c-Src의 cDNA 서열이다. 상기 서열은 GenBank 승인 번호 제J00844호를 통해 입수할 수 있다. 상기 서열은 각각 뉴클레오타이드 112번 및 1713번에서 개시되고 종료되는 단백질의 일부를 암호화하는 1759개의 뉴클레오타이드(서열 2)를 포함한다.

도 2는 도 1에 나타낸 암호화 서열의 닭 c-Src의 암호화된 아미노산 잔기 서열(서열 3)이다.

도 3은 처음에 문헌[참조: Braeuninger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10411-10415(1991)]에 기술된 바와 같은 사람 c-Src의 cDNA 서열이다. 서열은 GenBank 승인번호 제X59932호 및 제X71157호를 통해 입수 가능하다. 서열은 각각 뉴클레오타이드 134번 위치 및 1486번 위치에서 개시되고 종료되는 단백질의 일부를 암호화하는 2187개의 뉴클레오타이드(서열 4)를 포함한다.

도 4는 서열 3에 나타낸 바와 같은 암호화 서열의 사람 c-Src의 암호화된 아미노산 잔기 서열(서열 5)이다.

도 5는 실시예 4에 기술된 바와 같은 bFGF 또는 VEGF에 의한 내인성 Src의 활성화를 설명한다. 도면의 상부는 bFGF 및 VEGF중 하나에 의한 내인성 c-Src의 활성화 배수와 함께 시험관내 키나제 분석 결과를 나타낸다. 도면의 하부는 동등한 Src 및 IgG 함량을 위한 로딩 대조구로서 항 Src 항체로 프로브된 키나제 분석 블롯이다.

도 6은 실시예 4에 기술된 바와 같이 병아리 CAM에서 혈관 형성에 대한 c-Src A의 레트로바이러스 매개 유전자 발현 효과를 설명한다. 9일된 병아리 CAM은 RCAS-Src A(활성 돌연변이된 c-Src) 또는 대조구 RCAS-GFP(녹색 형광 단백질; 형광성 표시 단백질) 레트로바이러스 또는 완충액에 72시간동안 노출시킨다. 혈관 형성 수준은 도 6A에 나타낸 바와 같이 정량되고 대표적인 현미경사진(4 x)이 도 6B에 나타나 있고 이것은 입체현미경으로 촬영된 각각의 처리물에 상응한다.

도 7은 혈관 MAP 키나제 인산화를 활성화시키는데 있어서 c-Src A의 레트로바이러스 발현을 설명한다. 도 7A는 30분동안 VEGF 또는 PMA에 노출되거나 48시간동안 c-src A 레트로바이러스로 감염된 10일된 병아리 CAM의 조직 추출물을 나타낸다. NT는 처리되지 않았음을 나타낸다. Src는 동일량의 총 단백질 추출물로부터 면역침전시키고 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하여 시험관내 면역 복합 카니제 분석을 Src에 대해 수행하고 전기영동하여 니트로셀룰로스로 이전시킨다. 상기 조직의 총 용해물의 적정액에 대해 항-포스포-ERK 항체로 면역블롯팅시켜 내인성 ERK 인산화를 측정한다. 도 7B는 모의 RCAS 또는 SRC A를 포함하는 RCAS 중 하나로 감염된 10일된 CAM을 나타낸다. 2일후에, CAMs는 절개되고 OCT에서 동결보존하고 4㎛로 절단한다. 절편을 항-인산화된 ERK 항체(New England Biolabs)로 면역염색하고 세척하여 염소 항-래빗 FITC 결합된 2차 항체로 검출한다. 형광성 이미지를 냉각된 CCD 카메라(Princeton Inst.)에 포착한다.

도 8은 bFGF 유도된 혈관 형성이 아닌 VFGF 유도된 혈관 형성동안에 Src 활성에 대한 선택적 요구조건을 설명한다. 9일된 병아리 CAM을 RCAS-Src 251 또는 대조구 RCAS-GFP 레트로바이러스 또는 완충액에 20시간동안 노출시킴에 이어서 추가로 bFGF 또는 VEGF의 존재하에 72시간동안 추가로 항온처리한다. 혈관 형성 수준을 상기된 바와 같이 정량하고(도 8A) 도 8B에 나타낸 바와 같이 입체 현미경으로 대표적인 현미경사진(6 x)을 촬영한다. 도 8C는 모의 처리물과 비교하여 형질감염된 세포내 Src 251의 발현을 확증하는 항-Src 항체로 프로브된 블롯을 나타낸다.

도 9는 레트로바이러스로 RCAS-Src 251을 종양 세포로 전달한 결과를 설명한다. 도 9A는 바이오 래드 레이저 공초점 스캐닝 현미경(막대는 500㎛)으로 광학적 절편화시킴으로써 검출된 바와 같이 종양 혈관(화살표)에서 GFP를 발현하는 RCAS-GFP(RCAS-녹색 형광 단백질)로 감염된 사람 수모세포종 종양 단편을 보여주는 현미경 사진이다. 도 9B는 3일 또는 6일동안 성장시키고 이후에 이들을 절개하고 습윤 중량을 결정하는, 레트로바이러스를 국소적으로 적용하여 처리된 종양으로부터 수득한 데이타를 묘사한다. 데이타는 종양 중량(50mg의 종양 초기 중량) +/- SEM으로부터 2회의 평균 변화로서 나타낸다. 도 9C는 대표적 현미경 사진으로 배아로부터 수술로 절개된 수모세포종 종양(막대는 350㎛)을 묘사한다. 하부 판넬은 각 종양의 혈관 생성을 상세하게 보여주는 각 종양에 대한 고배율의 사진이다. 화살표는 RCAS-Src251 처리된 종양에서 혈관이 붕괴되었음을 나타낸다.

도 10은 RCASBP(RCAS) 벡터 작제물(서열 1)의 제한 지도를 설명하는 도식이다.

도 11은 단일 문자 아미노산으로 표시된 사람 c-Yes 단백질의 암호화된 아미노산 잔기 서열(서열 8)을 나타낸다.

도 12는 사람 c-Yes 단백질을 암호화하는 cDNA의 핵산 서열을 나타낸다. 상기 서열은 GenBank 승인 번호 제M15990호를 통해 입수될 수 있다. 서열은 각각 뉴클레오타이드 208번 및 1839번에서 개시되고 종료되는 단백질의 일부를 암호화하고 도 11에 도시된 아미노산(서열 7)으로 해독되는 4517개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

도 13은 레트로바이러스로 Src 251 및 CSK를 피하 쥐 혈관 형성 모델로 전달하는 결과를 나타낸다. 도 13A는 flk 발현을 검출하기 위한 면역블롯팅 결과를 설명한다. 도 13B는 VEGF 및 bFGF 자극된 조건하에서 flk에 대한 분석으로부터의 면역블롯팅 결과를 설명한다. 도 13C는 GFP, Src 251 또는 CSK 레트로바이러스의 존재하에 VEGF 및 bFGF로 자극시키는 처리에 의해 CD34 양성 혈관의 수(20 x에서 3회 무작위 필드의 평균)를 플롯팅한 그래프이다.

도 14는 Src, fyn 및 Yes가 결핍된 마우스 피부내에서 VEGF의 VP에 대한 변형된 마일즈(Miles) 분석 결과를 설명한다. 도 14A는 처리된 귀의 사진이다. 도 14B는 다양한 결핍 마우스를 자극시킨 것에 대한 실험적 결과의 그래프이다. 도 14C는 처리에 의해 용출된 에반스 블루 염료의 양을 플롯팅한 것이다.

도 15는 Src +/-, Src-/-, 야생형(WT) 및 PP1 처리된 야생형 마우스에서 경색의 상대적 크기를 설명하는 그래프이다. PP1 처리물은 1.5mg/kg 체중으로 이루어진다.

도 16은 대조구 동물(좌측)에서 보다 PP1 처리된 동물(우측)에서 뇌 경색이 적게 일어남을 보여주는, 대조구 및 PP1 처리된 마우스 뇌의 연속 MRI 스캔을 나타낸다.

A 정의

아미노산 잔기: 이의 펩타이드 결합에서 폴리펩타이드의 화학적 분해(가수분해) 즉시 형성되는 아미노산. 본원에 기술된 아미노산 잔기는 바람직하게 "L" 이성체 형태이다. 그러나, 목적하는 작용 성질이 폴리펩타이드가 보유하고 있는 이상 "D" 이성체 형태의 잔기가 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH₂는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리된 아미노 그룹을 언급한다. COOH는 폴리펩타이드의 카복시 말단에 존재하는 유리된 카복시 그룹을 언급한다. 문헌[참조: J. Biol. Chem., 243:3552-59(1969)]에 기술되고 37 CFR §1.822(b)(2)에서 규정된 표준 폴리펩타이드 명명법에 따른다.

모든 아미노산 잔기 서열은 본원에서 좌측 우측 배향이 아미노 말단에서 카복시 말단인 통상적인 방향으로 나타냄을 주지해야 한다. 추가로, 아미노산 잔기 서열의 개시 또는 종결에서의 대시(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 대한 펩타이드 결합을 나타냄을 주지해야 한다.

폴리펩타이드: 연속 아미노산 잔기의 알파-아미노 그룹과 카복시 그룹간의 펩타이드 결합에 의해 서로가 연결된 선형의 아미노산 잔기를 언급한다.

펩타이드: 본원에 사용된 바와 같이 폴리펩타이드에서 처럼 서로 연결된 약 50개 이하의 선형 아미노산 잔기를 언급한다.

환형 펩타이드: 전형적인 펩타이드에서 처럼 여러 아미드 결합을 포함하는 헤테로원자 환 구조를 갖는 화합물을 언급한다. 환형 펩타이드는 선형 펩타이드의 n-말단이 선형 펩타이드의 c-말단 카복실레이트와 아미드 결합을 형성하는 헤모데틱(hemodetic) "머리 에서 꼬리"로 환형화된 선형 폴리펩타이드일 수 있거나 중합체가 헤테로데틱(heterodetic)하고 아미드 결합 및 폐환시키는 또 다른 결합(예: 디설파이드 브릿지, 티오에스테르, 티오아미드, 구아니디노 및 유사 결합)을 포함하는 환 구조를 포함할 수 있다.

단백질: 폴리펩타이드에서 처럼 서로가 연결되어 있는 50개 이상의 선형 아미노산 잔기를 언급한다.

융합 단백질: 2개이 도메인이 천연적으로 발견되지 않는 융합된 펩타이드에 상응하는, 전형적인 펩타이드 결합에 의해 작동적으로 연결된 2개 이상의 상이한 폴리펩타이드 도메인을 포함하는(융합됨) 폴리펩타이드를 언급한다.

합성 펩타이드: 천연적으로 존재하는 단백질 및 이의 단편에는 없는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 화학적으로 제조된 아미노산 잔기를 언급한다.

B. 일반적인 고찰

본 발명은 일반적으로, (1) VEGF 유도된 VP가 특히 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes에 의해 매개된다는 발견 및 VP가 각각 혈관 형성을 강화시키거나 억제시키기 위해 활성 또는 불활성 Src 또는 Yes 단백질을 제공함에 의해 조절될 수 있다는 발견; (2) 추가로, 외상과 연관된 출혈 및/또는 부종, 손상과 관련하여 혈관 투과성이 증가된 질환이 특히 Src 계열의 타이로신 키나제 활성의 억제에 의해 조절될 수 있고 완화될 수 있다는 발견 및(3) Src 계열의 타이로신 키나제 억제제가 암 또는 혈관 형성과는 무관한 질환 또는 손상과 관련된 혈관 투과성의 증가로 인한 조직 손상을 감소시킨다는 발견에 관한 것이다.

이러한 발견은 혈관 투과성이 다양한 질환 과정 및 혈관 형성, 혈관 신생에관여하기 때문에 중요하다. 질환 증상과 관련된 조직이 조직 성장을 위해 혈관 형성을 필요로 하는 경우 혈관 형성을 억제함으로써 병든 조직의 성장을 억제하는 것이 바람직하다. 혈관 형성은 VP를 동시에 억제함으로써 보다 효과적으로 억제될 수 있다. 손상된 조직이 조직 성장 및 치유를 위해 혈관 형성을 필요로 하는 경우, VP를 촉진시키거나 강화하여 혈관 형성을 유발함으로써 조직 치유 및 성장을 촉진시키는 것이 바람직하다.

혈관 신생이 병든 조직과 관련된 병인이고 이에 기여하는 경우, VP를 억제하여 질환에 대한 혈관 형성의 해로운 효과를 감소시키는 것이 바람직하다. 혈관 형성과 관련된 VP를 억제함으로써 질환을 예방하고 증상을 완화하거나 몇몇 경우에 질환을 치료할 수 있다.

특정 경우에, 전신 투여를 통한 약물 전달의 효능을 증가시키기 위해 VP를 증가시키는 것이 바람직하다. 혈뇌 장벽은 VP의 엄격한 조절을 기술하는데 사용되는 용어이고 따라서 심지어 저분자 약물이라도 혈액 순환으로부터 최소한 뇌에 접근하게 된다. 관여된 혈관의 VP의 조절을 통해 혈뇌 장벽이 침투성을 선택적으로 특이적으로 조절할 수 있는 능력은 혈액 순환을 통해 뇌 조직으로 통과될 수 없는 약물을 투여할 수 있게 한다.

유사하게, 많은 발작 유도된 병인 및 손상은 VP의 갑작스런 증가에 의해 유발되고 따라서 VP를 특이적으로 조절하는 능력은 신규하고 효과적인 치료법이 발작의 역효과를 감소시켜 준다.

본 발명의 방법은 치료법이 VP에 대해서는 고도로 특이적이지만 또 다른 생물학적 과정에는 특이적이지 않기 때문에 부분적으로 효과적이다.

본 발명은 부분적으로 혈관 형성이 타이로신 키나제 Src 단백질에 의해 매개되고 혈관 형성을 각각 강화하거나 억제시키기 위한 활성 또는 불활성 Src 단백질을 제공함에 의해 혈관 형성이 조절될 수 있는 발견에 관한 것이다.

이러한 발견은 혈관 형성 및 혈관 신생이 다양한 질환 과정에 관여하기 때문에 중요하다. 질환 증상과 관련된 조직이 조직 성장을 위한 혈관 형성을 요구하는 경우 혈관 형성을 억제함으로써 병든 조직의 성장을 억제시키는 것이 바람직하다. 손상된 조직이 조직 성장 및 치유를 위해 혈관 형성을 필요로 하는 경우, 혈관 형성을 강화시키거나 촉진시킴으로써 조직 치유 및 성장을 촉진시키는 것이 바람직하다.

혈관 신생이 질환 조직과 연관된 병인이고 이에 기여하는 경우 혈관 형성을 억제하여 질환의 해로운 효과를 감소키는 것이 바람직하다. 혈관 형성을 억제함으로써 질환을 예방하고 증상을 완화시키고 몇몇 경우에는 질환을 치료할 수 있다.;

혈관 형성을 억제시키는 조절을 통해 이로울 수 있는 질환 및 혈관 신생 관련된 조직의 예는 류마티스 관절염, 당뇨병 망막증, 염증 질환, 재발 협착증을 포함한다. 혈관 신생이 해로운 조직의 성장을 지지하는데 요구되는 경우, 혈관 형성의 억제는 조직으로의 혈액 공급을 억제함으로써 혈액 공급에 따라 조직이 비대해지는 것을 감소시키는데 기여할 수 있다. 이의 예는 종양이 몇 밀리미터 이상의 두께로 성장하고 고형 종양 전이를 확립하기 위해 혈관 신행이 계속적으로 필요한 경우의 종양 성장을 포함한다.

혈관 신생이 조직 치유에 기여하는 것으로 사료되는 경우, 혈관 형성의 강화는 상처 치유를 도울것이다. 이의 예는 당뇨병 또는 또 다른 증상에 의해 지절의 혈액 순환이 불량한 허혈성 지절을 갖는 환자의 치료를 포함한다. 또한 치유되지 않음에 따라서 혈관 세포 증식 및 혈관 신생을 증가시켜 이로울 수 있는 만성적인 상처를 갖는 환자가 고려된다,

본 발명의 방법은 치료가 혈관 형성에는 고도로 선택적이지만 또 다른 생물 학적 과정에는 선택적이지 않아 부분적으로 효과적이다.

앞서 기술한 바와 같이, 혈관 형성은 새롭게 형성되는 혈관 형성을 포함한 조직의 혈관 신생에 관여하는 다양한 과정을 포함하고 모든 혈관 형성 과정은 Src 단백질에 의해 발효된다. 외상 상처 치유, 황체 형성 및 배형성를 제외한, 대다수의 혈관 형성 과정이 질환 과정에 연관되어 있는 것으로 사료됨에 따라서 본 발명의 치료 방법의 용도는 그러한 질환에 선택적이고 해로운 부작용을 갖지 않는다.

본 발명은 또한 부분적으로 외상과 관련된 출혈 및/또는 부종, 혈관 투과성 증가와 관련된 손상 질환이 Src 계열의 타이로신 키나제 활성을 억제함으로써 특이적으로 조절될 수 있고 완화될 수 있다는 발견에 발견에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Src 계열의 타이로신 키나제 억제제의 생체내 투여가 암 또는 혈관 형성과는 무관한 질환 또는 손상 관련된 혈관 투과성의 증가로 인한 조직 손상을 감소시킨다는 발견에 관한 것이다.

Src 계열의 타이로신 키나제 억제제가 VEGF 유도된 VP 증가를 조절하고 Src 계열의 키나제 활성의 특이적 억제는 출혈 및/또는 부종에 의한 주변 조직에 대한손상을 완화시키지만 Src 계열의 키나제 신호는 활성화된다.

혈관 투과성이 혈관 형성과는 직접적인 관련이 없는 다양한 질환 과정에 연루되어 있다. 예를 들어, 많은 발작 유도된 병인 및 손상은 혈관에 대한 외상으로 인한 VP의 갑작스런 증가가 원인이고 따라서 VP를 특이적으로 조절하는 능력이 신규하고 효과적인 치료법으로 발작의 역효과를 감소시킬 수 있게 해준다.

Src 계열의 키나제 억제제를 사용한 특이적 억제 조절로부터 이로울 수 있는 질환 또는 손상 유도된 출혈 및/또는 부종과 관련된 조직의 예는 류마티스 관절염, 당뇨병 망막증, 염증 질환 및 재발 협착증을 포함한다.

머리 또는 골수에 대한 외상 및 전형적으로 허혈 또는 출혈이 원인이되는 또 다른 뇌혈관 사고가 신경 장애 및 관련 손상의 주요 원인이다. 이러한 손상으로 인한 뇌 부종 또는 출혈은 뇌 및 척추(중추 신경계; CNS)로 확대대되는 전신성 손상을 유발하는 생명을 위협하는 병인이고 이러한 경우에 출혈 및 외상이 조직 손상 효과를 특이적으로 조절하는 능력이 매우 유용하다.

CNS 감염, 수막염, 뇌막염, 뇌염 모두가 뇌 부종을 포함하는 부작용을 유발할 수 있다. 상기 감염의 치료는 특이적 치료법을 보충하여 출혈 또는 부종을 감소킬 수 있다.

VEGF 수용체 IgG 융합 단백질을 사용한 VEGF 단백질의 전신성 중화가 뇌 허혈에 따른 경색 크기를 감소시키는 것으로 보고되었고 이러한 효과는 VEGF 매개된 혈관 투과성의 감소로 인한 것이었다[문헌참조: N. van Bruggen et al., J. Clin. Inves. 104:1613-1620(1999)]. 그러나, VEGF는 혈관 투과성 증가의 중요한 매개체가 아니라 Src인 것으로 밝혀졌다.

Src 매개된 혈관 투과성의 증가가 관련되고 본 발명의 방법 및 조성물로 치료하는데 적합한 표적물인 또 다른 질환 또는 증상은 뇌 출혈, 뇌 및 골수 외상, 저산소증으로 유발된 뇌 및 척추 손상, CNS의 염증 장애, 바이러스 또는 세균성 감염(예: 수막염, HIV 뇌병증), 자가 면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증), 혈뇌 장벽 침투성의 만성적 증가에 따른 질환(예를 들어, 모르부스 알츠하아머), 조직의 일시적인 관류 또는 산소 공급의 저하가 보호제로서 요구되는 수술, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 류마티스 관절염 및 당뇨병 망막증을 포함한다.

C. Src 계열의 타이로신 키나제 단백질

본 발명에 사용하기 위한 타이로신 키나제 단백질은 의도된 용도에 따라 다양할 수 있다. 용어 "Src 단백질" 또는 "Src"는 본원에 기술된 활성 또는 불활성 형태의 다양한 형태의 타이로신 키나제 Src 단백질을 총체적으로 언급하는데 사용된다. 용어 "Yes 단백질" 또는 "Yes"는 본원에 기술된 활성 또는 불활성 형태의 e다양한 형태의 타이로신 키나제 Yes 단백질을 총체적으로 언급하는데 사용된다. 또한 본원에서 또한 Src 또는 Yes를 암호화하는 핵산 유전자 서열 또는 유전자가 언급된다. 용어 "Src 계열"은 Src에 대한 기능 및 아미노산 서열과 관련된 타이로신 키나제 그룹을 언급한다.

"활성 Src 단백질"은 혈관 형성 또는 VP를 강화시키는 임의의 다양한 형태의 Src 단백질을 언급한다. "활성 Yes 단백질"은 VP를 강화시키는 임의의 다양한 Yes 단백질 형태를 언급한다. 혈관 형성 또는 VP의 강화를 측정하기 위한 분석이 본원에 기술되어 있고 이로써 제한되는 것으로 해석되지 말아야 한다. 혈관 형성 또는 VP의 수준이 어떠한 단백질이 분석 시스템에 첨가되지 않은 대조구 수준보다 10% 초과, 바람직하게는 25% 초과 및 보다 바람직하게는 50% 초과인 경우 활성인 것으로 고려된다.

혈관 형성의 강화를 측정하기 위한 바람직한 분석은 혈관 형성 지수가 분기점을 계수하여 계산되는 실시예에 기술된 바와 같은 RCAS 바이러스 벡터를 사용한 CAM 분석이다.

VP의 강화를 측정하기 위한 바람직한 분석은 실시예에서 기술된 바와 같은 마우스에서 에반스 블루 염료를 사용하는 마일즈 분석이고 여기서 VP는 혈관으로 부터 유출되는 에반스 블루 염료의 양으로써 측정된다.

바람직한 활성 Src 또는 Yes 단백질은 또한 타이로신 키나제 활성을 나타낸다. 예시적인 활성 Src 또는 Yes 단백질은 실시예에 기술되어 있고 Src-A 및 Yes-1을 포함한다.

"불활성 Src 단백질"은 혈관 형성 또는 VP를 억제하는 임의의 다양한 형태의 Src 단백질을 언급한다. "불활성 Yes 단백질"은 VP를 억제하는 임의의 다양한 형태의 Yes 단백질을 언급한다. VP 증가 억제를 측정하기 위한 분석이 본원에 기술되어 있고 여기에 제한되는 것으로써 해석되지 말아야 한다. 혈관 형성의 수준이 어떠한 외인성 Src가 분석 시스템에 첨가되지 않은 대조구 수준보다 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상 및 보다 바람직하게는 50% 이상 낮은 경우 Src 단백질은 불활성인 것으로 사료된다.

VP의 수준이 어떠한 외인성 Src 또는 Yes가 분석 시스템에 첨가되지 않은 대조구 수준과 적어도 동일하거나, 또는 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상 및 보다 바람직하게는 50% 이상 낮은 경우 Src 또는 Yes 단백질은 불활성인 것으로 사료된다.

혈관 형성의 억제를 측정하기 위한 바람직한 분석은 실시예에서 기술된 바와 같은 RCAS 바이러스 벡터를 사용하는 CAM 분석이고 이때 혈관 형성 지수는 분기점을 계수하여 계산된다.

VP의 억제를 측정하기 위한 바람직한 분석은 실시예에서 기술된 바와 같이 마우스에서 에반스 블루 염료를 사용하는 마일즈 분석이고 이때 VP는 혈관에서 유출된 에반스 블루 염료의 양에 의해 측정된다.

바람직한 불활성 Src 또는 Yes 단백질은 또한 타이로신 키나제 활성이 감소되었음을 나타낸다. 예시적인 불활성 Src 단백질은 실시예에 기술되어 있고 Src-251 및 Src K295M을 포함한다.

본 발명에 유용한 Src 단백질은 조직을 포함한 천연 공급원으로부터 추출, 재조합 DNA 발현에 의한 제조 및 정제등을 포함하는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. Src 및/또는 Yes 단백질은 또한 유전자 치료 시스템을, 조직내에서 단백질을 발현하는 목적하는 조직으로 도입함에 의해 동일계에서 제공될 수 있다.

Src 또는 Yes 단백질을 암호화하는 유전자는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있고 본 발명은 여기에 제한되는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 예를 들어, Src는 포유동물, 조류, 바이러스등의 종으로부터 다양한동족체를 포함하여 천연적으로 유래되는 것으로 공지되어 있고 유전자는 단백질을 발현하는 임의의 조직으로부터 cDNA 클로닝 방법을 사용하여 용이하게 클로닝될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 Src는 c-src로 명명된 포유동물 또는 조류 동족체와 같은 세포 단백질이다. 사람 c-src가 특히 바람직하다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 Yes는 사람 세포 단백질인 c-yes이다. 도 11에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 사람 c-yes-1이 특히 바람직하다. 도 11의 단백질 Yes-1은 도 12에 도시된 핵산 서열의 절편에 의해 암호화되고 암호화 도메인 절편으로서 동정되었다.

D. Src 또는 Yes 단백질을 발현시키기 위한 재조합 DNA 분자 및 발현 시스템

본 발명은 본 발명에서의 특정 용도를 위해 여러 뉴클레오타이드 서열을 기술하고 있다. 이들 서열은 본 발명에 유용한 Src 단백질을 암호화하는 서열 및 다양한 DNA 절편, 재조합 DNA(rDNA) 분자 및 Src 단백질 발현용으로 작제된 벡터를 포함한다. 이들 서열은 또한 본 발명에 유용한 Yes 단백질을 암호화하는 서열 및 다양한 DNA 절편, 재조합 DNA(rDNA) 분자 및 Yes 단백질 발현용으로 작제된 벡터를 포함한다.

따라서, 본 발명의 DNA 분자(절편)는 전체 구조 유전자, 구조 유전자의 단편 또는 조합된 유전자 및 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 전사 단위체를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.

바람직한 DNA 절편은 본원에서 정의된 바와 같은 Src 또는 Yes 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.

바람직한 Src 및 Yes의 아미노산 잔기 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 실시예에 기술되어 있다.

바람직한 DNA 절편은 본원에 기술된 Src 또는 Yes 단백질과 실질적으로 거의 동일하고 바람직하게는 이에 상응하는 아미노산 잔기 서열 또는 이의 일부로 이루어진 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 대표적이고 바람직한 DNA 절편은 추가로 실시예에 기술되어 있다.

단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 서열은 유전자 코드를 통해 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 데옥시리보핵산(DNA) 서열에 직접적인 관련이 있다. 따라서, 구조 유전자 또는 DNA 절편은 아미노산 잔기 서열, 즉 그것이 암호화하고 있는 단백질 또는 폴리펩타이드의 관점에서 정의될 수 있다.

유전자 코드의 중요하고 널리 공지된 특징은 이의 축퇴성이다. 즉, 단백질을 제조하는데 사용되는 대부분이 아미노산에 대해 하나 이상의 암호 뉴클레오타이드 트리플렛(코돈)이 특정 아미노산 잔기를 암호화할 수 있거나 이를 지정한다. 따라서, 상이한 수의 뉴클레오타이드 서열이 특정 아미노산 잔기 서열을 암호화할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 모든 유기체에서 동일한 아미노산 잔기 서열을 제조할 수 있기 때문에 기능적으로 동일한 것으로서 간주된다. 때로는 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화된 변형체가 특정 뉴클레오타이드 서열로 삽입될 수 있다. 그러나, 이러한 메틸화는 어떠한 방식으로든지 암호 관계에 영향을 미치지 않는다.

핵산은 이것이 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드,즉 RNA 또는 DNA, 이의 동족체이든지 가에 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 단편이다. 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 이본쇄 DNA 절편 형태, 즉 DNA 절편이지만 특정 분자 생물학적 방법을 위해 일본쇄 DNA 또는 RNA가 바람직하다.

DNA 절편은 화학적 합성 방법 및 재조합 방법, 바람직하게는 클로닝 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함한 다양한 방법에 의해 제조된다. Src 단백질의 일부를 암호화하는 DNA 절편은 화학적 기술, 예를 들어, 문헌[참조:Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191, 1981]의 포스포트리에스테르 방법에 의해 또는 자동화 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 추가로, 보다 큰 DNA 절편이 널리 공지된 방법, 예를 들어, DNA 절편을 한정하는 특정 그룹의 올리고뉴클레오타이드의 합성에 이어서 올리고뉴클레오타이드와의 하이브리드화 및 이에 연결시켜 완전한 절편을 제조하는 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 또 다른 방법은 Src 단백질을 암호화하는 구성원을 포함하는 것으로 사료된 cDNA 라이브러리상에서 사용되는 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 함께 PCR하여 바람직한 DNA 절편을 추출하는 방법을 포함한다.

물론, 화학적 합성을 통해 적당한 염기를 천연 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 염기들로 대체함으로써 임의의 목적한는 바대로 간단하게 변형될 수 있다. 이러한 방법은 널리 공지되어 있고 본원에 기술된 다양하고 상이한 변형된 Src 단백질을 제조하는데 용이하게 응용될 수 있다.

추가로, 필수적으로 Src 또는 Yes 단백질을 암호화하는 구조 유전자로 이루어진 DNA 절편을 부위 특이적 또는 무작위 돌연변이 유발에 의해 연속적으로 변형시켜 임의의 목적하는 대체물을 도입할 수 있다.

1. Src 또는 Yes 유전자의 클로닝

본 발명의 Src 또는 Yes 유전자는 다양한 생화학적 방법에 의해 적합한 공급원인 게놈 DNA 또는 전령 RNA(mRNA)로부터 클로닝될 수 있다. 이들 유전자는 실시예에서 기술되어 있고 당해 기술 분야에 공지된 바와 같은 일반적인 방법에 따라 클로닝될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 Yrc 또는 Yes 유전자를 클로닝하기 위한 핵산 공급원은 이들 단백질을 발현하는 것으로 사료되는 조직으로터 cDNA 라이브러리 형태의 게놈 DNA 또는 전령 RNA(mRNA)를 포함할 수 있다. 바람직한 조직은 사람 폐 조직이지만 임의의 다른 적합한 조직이 사용될 수 있다.

바람직한 클로닝 방법은 표준 방법을 사용한 cDNA 라이브러리의 제조 및 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하는 쌍을 이룬 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 Src-암호화 또는 Yes-암호화 뉴클레오타이드 서열의 추출을 포함한다. 또한, 목적하는 cDNA 클론은 본원에 기술된 핵산 서열을 기본으로 하는 하이브리드화 프로브를 사용하여 통상적인 핵산 하이브리드화 방법에 의해 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 동정되고 추출될 수 있다. 적합한 Src 또는 Yes를 암호화하는 핵산을 추출하고 클로닝하는 또 다른 방법이 당해 기술분야의 기술자에게 명백하다.

2. 유전자 전달 및/또는 발현 벡터

본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 Src 또는 Yes 단백질, 또는 이 둘 다를암호화하는 DNA 절편을 포함하는 재조합 DNA 분자(rDNA)를 고려한다. 발현 가능한 rDNA는 벡터를 본 발명의 Src 또는 Yes 암호화 DNA 절편으로 작동적으로(프레임내에, 발현 가능한) 연결시켜 제조될 수 있다. 따라서, 재조합 DNA 분자는 천연적으로 함께 존재하지 않는 2개의 이상의 뉴클레오타이드 서열의 핵산을 포함하는 하이브리드 DNA이다. 본 발명의 DNA 절편이 작동적으로 연결되는 벡터는 당해 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 목적하는 작용 성질, 예를 들어, 단백질 발현 및 형질전환될 숙주세포에 따라 직접적으로 선택된다. 재조합 DNA 분자를 작제하기 위한 기술 분야의 통상적인 사항을 고려한다. 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 벡터 DNA 절편에 작동적으로 연결되어 있는 구조 유전자의 복제를 지시할 수 있고 바람직하게는 또한 이를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터가 발현 가능한 src 및 yes 핵산 서열 둘 다를 포하하는 경우, 유전자 둘 다는 첫번째 유전자의 업스트림에 있는 동일한 조절 요소에 의해 조절될 수 있거나 각각은 독립적으로 별도의 조절 요소에 의해 조절될 수 있다.

원핵 및 진핵 발현 벡터 둘 다는 벡터 작제 기술 분야에서의 통상적인 기술자에게 익히 공지되어 있고 문헌[참조: Ausebel, et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York(1993) and by Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)]에 기술되어 있다. 이들 문헌들은 또한 본원에 언급된 많은 일반 재조합 DNA 방법을 기술하고 있다.

한 양태에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 원핵 레플리콘, 즉, 형질전환된 세균 숙주 세포와 같은 원핵 숙주 세포에서 재조합 DNA 분자의 자율적 복제를 지시하고 재조합 DNA 분자를 염색체와 별도로 유지시키는 능력을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 레플리콘은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 추가로, 원핵 레플리콘을 포함하는 양태는 또한 유전자로 형질전환된 세균 숙주에서 발현되어 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 전형적인 세균 약물 내성 유전자는 암피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 유전자이다.

원핵 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한 형질전화된 이 콜리와 같은 세균 숙주 세포에서 구조 유전자의 발현(전사 및 해독)을 지시할 수 있는 원핵 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합하여 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 세균 숙주와 양립할 수 있는 프로모터 서열은 전형적으로 본 발명의 DNA 절편이 삽입될 간단한 제한 절단 부위를 포함한 플리스미드 벡터로 제공된다. 전형적인 이러한 벡터 플라스미드는 제조원[Biorad Laboratories,(Richmond, CA)]으로부터 입수 가능한 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329, 제조원[Invitrogen(San Diego, CA)]으로부터 입수 가능한 pRSET 및 제조원[Pharmacia, Piscataway, N.J.]으로부터 입수 가능한 pPL 및 pKK223이다.

진핵 세포와 양립할 수 있는 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 양립할 수 있는 벡터들을 또한 사용하여 본 발명의 재조합 DNA 분자를 형성할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고 여러 상업적 공급원으로부터 시판되고 있다. 전형적으로 이러한 벡터는 목적하는 DNA 절편이 삽입될 간단한 제한 절단 부위를 포함하여 제공된다. 전형적인 상기 벡터는 pSVL 및pKSV-10(Pharmacia), pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies, Inc.), pTDT1(ATCC, #31255), pRc/CMV(Invitrogen, Inc.), 실시예에 기술된 바람직한 벡터 및 진핵 발현 벡터이다. 본 발명에서 유전자 발현용으로 특히 바람직한 시스템은 유전자 전달 성분, 즉, 목적하는 조직으로 유전자를 전달시키는 능력을 갖는 성분을 포함한다. 적합한 벡터는 재조합 DNA 바이러스, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터이고 이들은 목적하는 단백질을 발현하도록 가공되고 예비 선택된 표적 조적을 감염시킨다는 특징을 갖는다. 본원에 기술된 복제 컴피턴트 아비안 사르코마 바이러스(RCAS)가 특히 바람직하다.

발현을 지시하기 위한 재조합 바이러스 또는 바이러스 요소들을 사용하는 포유동물 세포 시스템이 가공될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 경우, 폴리펩타이드의 암호 서열이 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체, 예를 들어, 레이트 프로모터 및 트리파르티트 리더 서열로 연결될 수 있다. 이어서 이러한 키메릭 유전자는 생체내 또는 시험관내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈으로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비 필수 영역(예를 들어, E1 또는 E3 영역)으로의 삽입은 재조합 바이러스가 감염된 숙주에서 생존할 수 있고 폴리펩타이드를 발현할 수 있도록 한다[문헌참조: Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3655-3659(1984)]. 또한, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터가 사용될 수 있다[문헌참조: Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:7415-7419(1982); Mackett et al., J. Virol., 49:857-864(1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:4927-4931(1982)]. 특히 관심이 되고 있는 것은염색체 외적 요소로서 복제할 능력을 갖는 소 파필로마 바이러스를 기본으로 하는 벡터이다[문헌참조: Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1:486(1981)]. 이러한 DNA가 표적 세포로 진입한 후 즉시 플라스미드는 세포당 약 100개 내지 200개의 카피수로 복제한다. 삽입된 cDNA의 전사는 숙주 염색체로의 통합을 요구하지 않음으로 고도로 발현된다. 이들 벡터는 플라스미드내에 선택 마커(예를 들어 neo 유전자)를 포함하여 적합한 발현을 위해 사용될 수 있다. 또한, 레트로바이러스 게놈은 숙주 세포내 폴리펩타이드 암호화 뉴클레오타이드 서열을 도입할 수 있고 이의 발현을 지시할 수 있는 벡터용으로 변형될 수 있다[문헌참조: Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353(1984)]. 메탈로티오닌 IIA 프로모터 및 열 쇼크 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유도성 프로모터를 사용하여 고도로 발현될 수 있다.

최근에, 사람 난소 암을 앓는 누드 마우스에서 장기적으로 생존하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 대 라우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터 구동 티미딘 키나제(TK) 유전자 치료법이 연구되어 왔다. 아데노바이러스 매개 CMV 프로모터 구동 헤르페스 심플렉스 바이러스 TK 유전자 치료법의 세포 사멸 효능은 RSV 구동 치료법보다 2 내지 10배 효과적인 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Tong et al., 1999, Hybridoma 18(1):93-97]. 낮은 수준의 발현에 이어서 고수준의 유도성 발현을 요구하는 유전자 치료 응용을 위한 키메릭 프로모터의 디자인이 또한 보고되었다[문헌참조: Suzuki et al., 1996, Human Gene Terapy 7:1883-1983].

장기적인 목적을 위해, 재조합 단백질을 고수율로 제조하는 것이 바람직하다. 바이러스의 복제 오리진을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 인자, 폴리아데닐화 부위등) 및 선택 마커에 의해 조절되는 cDNA로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 재조합 플라스미드내 선택 마커는 선별을 위한 내성을 부여하여 세포가 플라스미드를 안정적으로 이의 염색체로 통합되도록 하여 성장하면서 세포주로 클로닝될 수 있고 확장될 수 있는 포시(foci)를 형성하도록 한다.

예를 들어, 외래 DNA의 도입에 이어서 가공된 세포는 집적 배지에서 1 내지 2일 동안 증식하도록 하고 이어서 선택 배지로 전환된다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제[문헌참조: Wigler et al., Cell, 11:223(1977)], 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Szybalska et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 48:2026(1962)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[문헌참조: Lowy et al., Cell, 22:817(1980)] 유전자(이들은 각각 tk^-, hgprt^-또는 aprt^-세포에 사용될 수 있다)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성 부여 유전자, 예를 들어, 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr에 대한 유전자[문헌참조: Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:3567(1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:1527(1981)]; 마이코페놀산에 대해 내성을 부여하는 gpt[문헌참조: Mulligan et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:2072, (1981)]; 아미노글리코사이드 G-418에 대해 내성을 부여하는 neo[문헌참조: Colberre-Garapin et al, J. Mol. Biol., 150:1(1981)], 및하이그로마이신에 대해 내성을 부여하는 hygro[문헌참조: Santerre et al, Gene, 30:147(1984)]가 선택적 기준에 따라 사용될 수 있다. 최근에, 추가의 선택 유전자, 즉, 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용할 수 있도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용할 수 있도록 하는 hisD[문헌참조: Hartman et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:804(1988)] 및 오르니틴 데카복실라제 억제제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴(DFMO)에 대해 내성을 부여하는 ODC( 오르니틴 데카복실라제)[문헌참조: McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)]가 기술되었다.

사람 유전자 치료법에 고려될 기본 벡터는 레트로바이러스로부터 기원한다[문헌참조: Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107(Sup. 1):31-32; Bank et al., 1996, Bioassays 19(12):999-1007; Robbins et al.,1998, Pharmacol. Ther. 80(1):35-47]. 유전자 전달 및 안티센스 치료법의 효능은 다양한 조직을 치료하기 위한 많은 벡터 시스템의 개발을 자극시켰다[문헌참조: vasculature, Stephen et al., 1997, Fundam. Clin. Pharmacol. 11(2):97-110; Feldman et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3):391-404; Vassalli et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3):459-69; Baek et al., 1998, Circ. Res. 82(3): 295-305; kideney, Lien et al., 1997, Kidney Int. Suppl. 61:S85-8; liver, Ferry et al., 1998, Hum Gene Ther. 9(14):1975-81; muscle, Marchall et al., 1998, Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3):360-5]. 이들 조직 뿐만 아니라, 사람 유전자 치료법에 있어서 중요한 표적물은 암, 즉 종양 자체 또는 관련 조직이다[문헌참조: Runnebaum, 1997,Anticancer Res. 17(4B):2887-90; Spear et al., 1998, J. Neurovirol. 4(2):133-47].

본 발명의 방법에 사용하기 위해 용이하게 채용될 수 있는 바이러스 유전자 치료 벡터 시스템의 특정 예는 간략하게 하기에 기술한다. 레트로바이러스 유전자 전달은 최근에 문헌[참조: Federspiel and Hughes, 1998, Methods in Cell Biol. 52:179-214]에 보되었고 특히 아비안 류코시스 바이러스(ALV) 레트로바이러스 계열[문헌참조: Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4931(1996); Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:11241(1994)]을 기술하고 있다. ALV 및 뮤린 류케미아 바이러스(MLV)를 포함한 레트로바이러스 벡터는 추가로 문헌[참조: Svoboda, 1998, Gene 206:153-163]에 기술되어 있다.

변형된 레트로바이러스/아데노바이러스 발현 시스템은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 용이하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 뮤린 류케미아 바이러스(MLV) 시스템이 문헌[참조: Karavanas et al., 1998, Crit. Rev. in Oncology/Hematology 28:7-30]에 보고되었다. 아데노바이러스 발현 시스템은 문헌[참조: Von Seggern and Nemerow in Gene Expression Systems(ed. Fernandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, chapter 5, pages 112-157]에 보고되었다

단백질 발현 시스템이 생체내 및 시험관내에서 효과적이라는 것이 입증되었다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 유형 1 앰플리콘 벡터에 의한 사람 편평 세포암으로의 효율적인 유전자 전달이 보고되었다[문헌참조: Carew et al., 1998, Am. J. Surg. 176:404-408]. 헤르페스 심플렉스 바이러스는 신경계로의 유전자 전달을 위해 사용되었다[문헌참조: Goins et al., 1997, J. Neurovirol. 3(Sup. 1):S80-8]. HSV-TK를 사용한 표적화된 자살 벡터는 고형 종양에 대해 시험되었다[문헌참조: Smiley et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8(8):965-77]. 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1 벡터는 결장암 세포에 대한 암 유전자 치료을 위해 사용되었다[문헌참조: Yoon et al., 1998, Ann. Surg. 228(3):366-74]. 형질감염을 시간을 연장시키기 위해, 간세포 치료용 HSV/AAV(아데노-연관된 바이러스) 하이브리드를 포함하는 하이브리드 벡터가 개발되었다[문헌참조: Fraefel et al., 1997, Mol. Med. 3(12):813-825].

게놈이 거대하기 때문에 백시니아 바이러스가 사람 유전자 치료용으로 개발되었다[문헌참조: Peplinski et al., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7(3):575-88]. 퓨린 뉴클레오사이드 파이로포스포릴라제를 발현하는 티미딘 키나제 결실 백시니아 바이러스가 종양 지시된 유전자 치료 벡터용으로 개발되었다[문헌참조: Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy 10:649-657].

아데노 연관 바이러스 2(AAV)는 사람 유전자 치료법에 사용하기 위해 개발되었지만 AAV는 포유동물 세포에서 최적의 복제 및 팩키징을 위해 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)를 필요로 한다[문헌참조: Snoeck et al., 1997, Exp. Nephrol. 5(6):514-20; Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5):470-5]. 그러나, 감염성 재조합 AAV의 생체내 팩키징은 이러한 시스템이 보다 전망성이 있게 해주는 것으로 기술되었다[문헌참조: Ding et al., 1997, Gene Therapy 4: 1167-1172]. 에코트로픽 레트로바이러스 수용체 cDNA의 AAV 매개 전달이 확립된 1차 사람 세포의 에코트로픽 레트로바이러스 형질도입을 허용한다는 것이 밝혀졌다[문헌참조: Qing et al., 1997, J. Virology 71(7):5663-5667]. 사람 야생형 p53을 발현하는 AAV 벡터를 사용한 암 유전자 치료법이 입증되었다[문헌참조: Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy 4:675-682]. AAV 벡터를 사용한 혈관 세포로의 유전자 전달이 또한 밝혀졌다[문헌참조: Maeda et al., 1997, Cardiovascular Res. 35:514-521]. AAV는 간 지시된 유전자 치료용으로 적합한 벡터인 것으로서 입증되었다[문헌참조: Xiao et al., 1998, J. Virol. 72(12):10222-6]. AAV 벡터는 뇌 조직 및 중추 신경계의 유전자 치료용으로서 입증되었다[문헌참조: Chamberlin et al., 1998, Brain Res. 793(1-2):169-75; During et al., 1998, Gene Therapy 5(6):820-7]. AAV 벡터는 또한 폐의 유전자 치료 및 사람 낭성섬유증 상피 세포로의 전달에 대해 아데노바이러스 벡터(AdV)와 비교되었다[문헌참조: Teramoto et al., 1998, J. Virol. 72(11):8904-12].

각각의 유효량의 바이러스를 혼입시켜 비통합성 AdV를 작제하기 위한 키메릭 AdV/레트로바이러스 유전자 치료 벡터 시스템은 레트로바이러스 생산자 세포의 중간 세대를 거쳐 통합된 기능을 부여받는다[문헌참조: Feng et al., 1997, Nat. Biotechnology 15(9): 866-70; Bilbao et al., 1997, FASEB J 11(8):624-34]. 상기 강력한 새로운 세대의 유전자 치료 벡터는 표적화된 암 유전자 치료를 위해 사용되었다[문헌참조: Bilbao et al., 1998, Adv. Exp. Med. Biol. 451:365-74]. p53을 발현하는 Adv의 1회 주사는 사람 전립선 암 세포의 피하 종양 노듈의 성장을 억제시킨다[문헌참조: Asgari et al., 1997, Int. J. Cancer 71(3):377-82]. 진행된 작지 않은 세포 폐암을 앓는 환자에서 야생형 p53의 AdV 매개 유전자 전달이 보고되었다[문헌참조: Schuler et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2075-2082]. 이와 동일한 암에 AdV 벡터에 의해 매개되는 p53 유전자 대체 치료법이 적용되었다[문헌참조: Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl 8):33-7]. p53의 AdV 매개 유전자 전달은 생체내 내피 세포 분화 및 혈관 형성을 억제한다[문헌참조: Riccioni et al., 1998, Gene Ther. 5(6):747-54]. 전이성 흑색종 면역 치료법으로서 흑색종 항원 gp75의 아데노바이러스 매개 발현이 보고되었다[문헌참조: Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapy 5:975-983]. AdV는 에코트로픽 레트로바이러스에 의한 사람 세포의 감염을 촉진시키고 레트로바이러스 감염의 효율을 증가시킨다[문헌참조: Scott-Taylor, et al., 1998, Gene Ther. 5(5):621-9]. AdV 벡터는 유전자를 혈관 평활근 세포[문헌참조: Li et al., 1997, Chin. Med. J.(Engl) 110(12):950-4], 편평 세포암 세포[문헌참조: Goebel et al., 1998, Otolarvnol Head Neck Surg 119(4):331-6], 식도암 세포[문헌참조: Senmaru et al., 1998, Int J. Cancer 78(3):366-71], 혈관사이 세포[문헌참조: Nahman et al., 1998, J. Investig. Med. 46(5):204-9], 신경 세포[문헌참조: Chen et al., 1998, Cancer Res. 58(16):3504-7] 및 동물의 관절[문헌참조: Ikeda et al., 1998, J. Rheumatol. 25(9):1666-73]로 전달하는데 사용되었다. 보다 최근에는, 카테터를 사용하여 AcV 벡터에 의해 매개되는 심막 유전자 전달이 입증되었다[문헌참조: March et al., 1999, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl 1):I23-9]. 적합한 조절 유전자 요소를 사용한 AdV 시스템의 조작을 통해 표적 유전자가 생체내에서 AdV 매개 조절가능하게 발현될 수 있다[문헌참조: Burcin et al., 1999, PNAS(USA) 96(2):355-60].

신드비스 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스 유래 벡터와 함께 사용하기에 적합한 발현 카세트를 사용하여 형질전환시키는데 적합한 세포주에 팩키징되는, 사람 유전자 치료용 알파바이러스 벡터가 개발되었다[문헌참조: Polo et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 964598-4603]. 비세포 병변 플라비바이러스 레플리콘 RNA 기본 시스템이 또한 개발되었다[문헌참조: Varnaski et al., 1999, Virology 255(2):366-75]. 자살 HSV-TK 유전자 함유 신비스 바이러스 벡터가 세포 특이적으로 종양 세포를 표적화시키기 위해 사용되었다[문헌참조: Iijima et al., 1998, Int. J. Cancer 80(1);110-8].

사람 포미 바이러스(HFV)를 기본으로 하는 레트로바이러스 벡터는 또한 유전자 치료 벡터로서 전망이 있는 것으로서 나타났다[문헌참조: Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2517-2525]. 포미 바이러스 벡터는 자살 유전자 치료를 위해 디자인되었다[문헌참조: Nestler et al., 1997, Gene Ther. 4(11):1270-7]. 재조합 뮤린 사이토메갈로바이러스 및 프로모터 시스템이 또한 고수준의 발현용 벡터로서 사용되었다[문헌참조: Manning et al., 1998, J. Virol. Meth. 73(1):31-9; Tong et al., 1998, Hybridoma 18(1):93-7].

센다이 바이러스계 벡터를 제조하여 비-분열 세포로의 전달이 가능하게 되었다[문헌참조: Nakanishi et al., 1998, J Controlled Release 54(1):61-8].

비 분열 체세포를 형질전환 시키기 위한 또 다른 노력에서, 렌티바이러스 벡터가 개발되었다. 복제 결핍 사람 면역결핍 바이러스(HIV)계 벡터를 사용한 낭성 섬유증의 유전자 치료법이 보고되었다[문헌참조: Goldman et al., 1997, Human Gene Therapy 8:2261-2268]. 렌티바이러스 벡터에 의해 간 및 근육으로 전달되는 유전자의 지속적 발현이 또한 보고돠었다[문헌참조: Kafri et al., 1997, Nat. Genet. 17(3):314-7]. 그러나 안정성에 대한 걱정이 팽배해지고 있고 개선된 벡터의 개발이 신속히 진행되고 있다[문헌참조: Kim et al., 1998, J. Virol. 72(2):994-1004]. HIV LTR 및 Tat를 조사하여 벡터를 개발하기 위한 게놈의 구조분석에 중요한 정보를 얻었다[문헌참조: Sadaie et al., 1998, J. Med. Virol. 54(2):118-28]. 따라서, 효과적인 HIV계 벡터에 대한 유전학적 필요 조건에 대해서 보다 잘 이해되고 있다[문헌참조: Gasmi et al., 1999, J. Virol. 73(3):1828-34]. 자가 불활성화 벡터, 또는 조건적인 팩키징 세포주가 보고되었다[문헌참조: Zuffery et al., 1998, J. Virol.72(12):9873-80; Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72(10):8150-7; Dull et al., 1998, J. Virol. 72(11):8463-71; and Kaul et al., 1998, Virology 249(1):167-74]. HIV 벡터에 의한 사람 임파구의 효율적인 형질도입이 보고되었다[문헌참조: Douglas et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10(6):935-45; Miyoshi et al., 1999, Science 283(5402):682-6]. 펠린 면역결핍 바이러스(FIV) 렌티바이러스 벡터에 의한 비분열 사람 세포의 효율적인 형질도입이 보고되었고 이것은 HIV계 벡터를 사용한 안정성 문제를 최소화하였다[문헌참조: Poeschla et al., 1998, Nature Medicine 4(3):354-357]. FIV 벡터에 의한 사람 혈액 단핵 세포의 생산적 감염이 보고되었다[문헌참조: Johnston et al., 1999, J.Virol. 73(3):2491-8].

많은 바이러스 벡터는 취급하기가 어렵고 삽입될 DNA에 대한 용량이 제한되어 있으나 이들 한계 및 단점이 해결되었다. 예를 들어, 단순화된 바이러스 팩키징 세포주 뿐만 아니라 사람 헤르페스 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 유령 1(HSV-1) 및 엡스타인-바르 바이러스(EBV)로부터 개발된 미니 바이러스 벡터가 개발되어 유전물질의 조작 및 바이러스 벡터의 작제를 단순화하였다[문헌참조: Wang et al., 1996, J. Virology 70(12):8422-8430]. 어댑터 플라스미드는 이전에 외래 DNA의 헬퍼-비의존성 레트로바이러스 벡터로의 삽입을 단순화시킨 것으로 밝혀졌다[문헌참조: 1987, J. Virology 61(10):3004-3012].

다수의 비바이러스 벡터가 또한 보고된 바와 같이 바이러스 벡터가 유전자 치료를 실행하기 위한 유일한 수단이 아니다. 표피 성장 인자/DNA 폴리플렉스(EGF/DNA)의 사용을 기본으로하는 표적화된 비바이러스 유전자 전달 벡터가 유전자 전달에 있어서 효율적이고 특이적이라는 사실이 밝혀졌다[문헌참조: Cristiano, 1998, Anticancer Res. 18:3241-3246]. 양이온성 리포좀을 사용한 혈관 형성 및 CNS의 유전자 치료가 입증되었다[문헌참조: Yang et al., 1997, J. Neurotrauma 14(5):281-97]. 양이온성 리포좀을 사용하여 췌장염의 일시적인 유전자 치료법이 개발되었다[문헌참조: Denham et al.,1998, Ann. Surg. 227(6):812-20]. 유전자 전달을 위한 키토산계 벡터/DNA 복합체가 효과적인 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Erbacher et al., 1998, Pharm. Res. 15(9):1332-9]. 테르플렉스 시스템을 기본으로 하는 비바이러스 DNA 전달 벡터가 보고되었다[문헌참조: Kim etal., 1998, 53(1-3):175-82]. 바이러스 입자 피복된 리포좀 복합체가 또한 유전자 전달을 수행하기 위해 사용되었다[문헌참조: Hiral et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241(1):112-8].

티미딘 키나제 유전자를 함유하는 비바이러스 T7 벡터를 직접 종양에 주사함에 의한 유전자 치료법이 입증되었다[문헌참조: Chen et al., 1998, Human Gene Therapy 9:729-736]. 플라스미드 DNA 제제가 직접 주사하여 유전자를 전달하는데 중요하다[문헌참조: Horn et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6(5):656-73]. 변형된 플라스미드 벡터가 특히 직접 주사를 위해 사용되었다[문헌참조: Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7(10):1205-17].

따라서, 다양한 유전자 전달/유전 치료 벡터 및 작제물이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이들 벡터는 본 발명의 방법에 용이하게 사용된다. 재조합 DNA/분자 생물학 기술을 사용하여 선택된 발현/전달 벡터에 작동적으로 연결된 Src 또는 Yes, 또는 이 둘다(활성 또는 불활성)를 삽입시키는 적당한 조작에 의해 본 발명을 실시하기 위한 많은 등가의 벡터가 작제될 수 있다.

E. 혈관 투과성(VP)를 조절하기 위한 방법

본 발명은 질환 과정 또는 증상과 연관된 조직에서의 혈관 투과성(VP)를 조절함으로써 VP에 의존하는 조직내 반응을 유발시키는 방법을 제공한다. 일반적으로, 당해 방법은 본 발명의 방법에 따라, VP 조절량의 Src 또는 Yes 단백질, 또는 이의 혼합물, 또는 활성 또는 불활성 Src 또는 Yes, 또는 이 둘 다, 또는 화학적 Src 억제제, 단백질 Src 억제제와 같은 Src 계열 타이로신 키나제 억제제, 또는 핵산 Src 억제제를 포함하는 조성물을 질환 과정 또는 증상과 연관된 조직으로 투여함을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이,뇌, 피부, 근육, 소화관, 연결 조직, 관절, 골 및 혈관이 존재하는 조직을 포함하는 임의의 다양한 조직, 또는 조직으로 이루어진 기관에 질환 증상에 VP가 관여될 수 있다.

이의 많은 양태에서 본 발명에서 치료된 환자는 바람직하게 사람 환자이지만 본 발명의 원칙은 발명이 용어 "환자"로 정의되는 것으로 의도된 모든 포유동물에 대해 효과적인 적으로 이해되어야만 한다. 본원에서, 포유동물은 혈관 형성에 관여하는 질환과 연관된 조직을 치료하는 것이 바람직한 임의의 포유동물 종, 특히 농업용 포유동물 및 가정용 포유동물 종을 포함하는 것으로 이해된다.

따라서, 당해 방법은 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 혼합물, 또는 이 둘ㄹ다, 또는 Src 단백질 또는 Yes 단백질 또는 이 둘 다, 또는 Src 계열 타이로신 키나제 억제제(예: 화학적 Src 억제제, 단백질 Src 억제제, 또는 핵산 Src 억제제를 발현하는 DNA 벡터를 포함하는 치료학적 유효량의 생리학적으로 허용되는 조성물을 환자에게 투여함을 포함한다.

Src 또는 Yes 단밸질을 투여하기 위한 투여량 범위는 추가로 본원에 기술된 바와 같이 단백질의 형태 및 이의 효능에 따라 다양하고 VP가 완화되고 VP에 의해 매개되는 질환 증상이 완화되는 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양이다. 투여량은 역효과(예를 들어, 고점도 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전증등)를 일으킬 정도의 많은 양이어서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 연령, 증상, 성별 및 환자의질환 상태에 따라 다양하고 당해 기술 분야의 기술자에 의해 측정될 수 있다. 또한 투여량은 임의의 합병증 발생대문에 담당 의사에 의해 조정될 수 있다.

치료학적 VP 유효 조절량은 치료될 조직내 VP가 측정할 수 있을 정도로 조절되기에 충분한(즉, VP 조절량)양으로서 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 혼합물 또는 Src 또는 Yes 단백질ㄹ을 암호화하는 핵산의 양이다. VP의 조절은 본원에 기술된 바와 같은 분석에 의해 또는 당해 기술분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. VP의 조절은 본원에 기술된 바와 같이 밀러 분석에 의해 또는 당해 기술분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.

Src 또는 Yes 단백질 또는 이들 각각, 또는 이들 둘 다를 발현하는 핵산 벡터가 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적인 주입으로 비경구적으로 투여될 수 있다치료될 조직은 전형적으로 전신 투여에 따라서 가장 흔히 치료학적 조성물의 정맥내 투여에 의해 처리되어 체내에서 평가될 수 있지만 표적화된 조직이 표적 분자를 포함할 가능성이 있는 한 또 다른 조직 및 전달 수단이 고려된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 정맥내, 직장내, 근육내, 피하내, 강내, 경피적으로 투여될 수 있고 연동 수단에 의해 전달될 수 있다.

Src 또는 Yes 단백질 또는 이들을 발현하는 핵산 벡터를 함유하는 치료학적 조성물은 통상적으로 예를 들어, 단위 투여량의 주사에서와 같이 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 치료학적 조성물을 언급하는데 사용되는 경우 용어 "단위 투여량"은 피검자에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위체를 언급하고 각 단위체는 요구되는 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 배합하여 목적하는치료학적 효과를 나타내도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.

하나의 바람직한 양태에서, 제제는 정맥내로 1회 투여량으로 투여된다. 직접 주사 또는 해부학적 분리된 격막을 사용하거나 표적 기관계의 미세 순환을 추출하거나 순환계를 관류시키거나 병든 조직과 연관된 혈관 형성의 표적 영역에 대해 카테터를 사용한 일시적 폐색에 의해 국부적으로 투여될 수 있다.

조성물은 투여 제제와 양립할 수 있는 방식 및 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여될 양 및 시간은 치료될 피검자, 활성 성분을 사용할 피검자 시스템의 용량 및 목적하는 치료 효과 정도에 따라 다양하다. 투여될 필요가 있는 활성 성분의 정확한 양은 담당 의사의 판단에 준하고 각 개인마다 독특하다. 그러나 전신 투여를 위해 적합한 투여 범위가 본원에 기술되어 있고 투여 경로에 따라 다양하다. 적합한 투여 섭생이 또한 다양하지만 초기 투여에 따른 1회 이상의 시간간격에서 후속 주사 또는 또 다른 투여에 의해 반복 투여하는 것으로 전형화되어 있다. 또한, 생체내 치료를 위해 명시된 범위에서 혈액내 농도를 유지하는데 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.

혈관 형성의 억제가 중요한 것으로 사료되는, 즉 형관 형성 질환으로서 언급되는 다양한 질환이 있는데 이러한 질환은 면역 및 비면역 염증과 같은 염증 장애, 만성 관절 류마티즘 및 건선, 당뇨 망막증과 같은 혈관의 비적절하거나 부적당한 침입과 연관된 장애, 재발 협착증, 아테롬성경화증 플라크에서의 모세관 증식 및 골다공증 및 암 관련 장애, 예를 들어, 고형 종양, 고형 종양 전이, 혈관 섬유종, 수정체 후부 섬유 증식증, 혈관종, 카포시 육종 및 종양 성장을 지원하는 혈관 신생을 요하는 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

유사하게, 혈관 투과성은 혈관 형성의 중요한 요소이고 해로운 병인과 관련이 있다. 예를 들어, 발작 유도된 혈관 투과성으로 인한 손상은 손상과 관련된 염증을 유발한다.

따라서, 질환 증상과 연관된 조직내 혈관 투과성을 억제하는 방법은 질환의 증상을 완화시키고 질환에 따라 질환을 치료하는데 기여할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 질환 증상과 연관된 조직에서 혈관 투과성 자체의 억제를 고려한다. 조직내 혈관 투과성 정도 및 이에 따른 본 발명의 방법에 의해 성취되는 억제 정도는 당양한 방법에 의해 평가될 수 있다.

따라서, 이와 관련된 양태에서, 치료될 조직은 염증 조직이고 억제될 혈관 투과성은 VEGF에 매개된 자극으로 인한 것이다. 이러한 부류에서, 방법은 예를 들어, 만성 관절 류마티즘, 면역 또는 비면역 염증 조직, 건선 조직등과 같은 관절 조직내 VP의 억제을 고려한다.

또 다른 관련된 양태에서, 치료될 조직은 당뇨 망막증, 황반 퇴화 또는 혈관 신생 녹내장과 같은 망막 질환을 앓는 환자의 망막 조직이고 억제될 VP는 망막 조직의 혈관이 생성되는 망막 조직의 VP이다.

당해 방법은 또한 특히 다음과 같은 이유로 전이의 형성을 억제하는데 효과적이다: (1) 이의 전이체 형성은 초기 종양이 혈관을 형성할 것을 요구하여 전이 암 세포는 초기 종양을 이탈할 수 있고 (2) 2차 부위에서의 이의 확립은 전이체의 성장을 지원하기 위해 혈관 신생을 요구한다.

관련 양태에서, 본 발명은 고형 종양 예방용으로 통상적 화학 치료법과 같은 또 다른 치료법과 연계된 방법 및 전이체의 확립을 억제하기 위한 방법을 고려한다. VP 억제제의 투여는 전형적으로 화학치료요법동안에 또는 이후에 수행되지만 종양 조직이 혈액 공급을 받아 종양 조직으로 영양물이 공급되어 회복할 수 있도록 VP를 유도함에 위한 유해한 공격을 가하는 시점에서 화학치료 섭생후에 VP를 억제하는 것이 바람직하다. 추가로, 전이체에 대한 예방책으로서 고형 종양을 제거하는 수술후에 혈관 투과성 억제 방법을 적용할 수 있다.

본 발명의 방법이 전이에 관여하는 혈관 투과성의 억제에 적용되는 한 당해 방법은 또한 전이체 형성을 억제하고 확립된 종양을 퇴화시키는데 적용될 수 있다.

재발 협착증은 평활근 세포(SMC)가 혈관 성형술의 성공을 방해하는 경피 경관 관상동맥 성형술의 부위에서 조직으로 이동하여 증식하는 과정이다. 재발 협착증동안의 SMC의 이동 및 증식은 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있는 VP로써 사료될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 혈관 성형술 과정 후 환자에게 있어서 본 발명의 방법에 따른 혈관 투과성을 억제하여 재발 협착증을 억제하는 방법을 고려한다. 재발 협착증의 억제를 위해, 불활성화된 타이로신 키나제는 전형적으로 관상 동맥 혈관벽이 약 2 내지 약 28일동안 및 보다 전형적으로는 혈관 성형술 과정 후 약 처음 14일동안 재발 협착증에 걸릴 위험이 있기 때문에 혈관 성형술 과정후에 투여된다.

질환 증상과 연관된 조직내 혈관 투과성을 억제하고 혈관 투과성 관련 질환을 치료하기 위한 방법을 수행하기 위한 본 발명의 방법은 혈관 투과성이 증가되거나 증가될 위험이 있는 조직을, 치료학적 유효량의 불활성 Src 및/또는 Yes 단백질 또는 이러한 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시킴을 포함한다.

VP를 촉진시키거나 강화시키는 것이 바람직한 경우에, 활성 Src 및/또는 Yes 단백질을 조직으로 투여하는 것이 유용하다. 투여 경로 및 투여 시기는 억제시키는 방법들에 있어서 비교될 수 있다.

예를 들어, 약물의 뇌조직으로의 접근을 조절하기 위한 혈뇌 장벽의 침투성의 조작이 고려된다. 혈뇌 장벽의 혈관 투과성의 증가는 정상적으로는 장벽을 통과하지 못하는 약물이 뇌 조직으로 침투될 수 있도록 한다.

VP와 연계된 혈관 형성의 정확한 조절이 바람직할 수 있고 따라서 활성 및 불활성 형태의 Src 단백질, Yes 단백질 또는 Src 또는 Yes 단백질을 암호화하는 발현 가능한 핵산이 투여될 수 있다.

혈관 형성의 억제 또는 강화는 실시예의 치료학적 조성물을 처음 접촉시킨후 5 내지 7일 후에 명백하게 일어난다. 유사하게, VP의 조절은 유사한 시간 프레임에서 일어날 수 있다. 치료학적 조성물의 투여후 짧은 시간내에 효과가 나타날 수 있다. 시간 제한 요소는 조직 흡수 속도, 세포 취득 속도, 단백질 이동 속도 또는 핵산 해독 속도(치료에 의존함) 및 단백질 표적화 속도를 포함한다. 따라서, VP 조절 효과는 투여 시간후 1시간 정도에서 나타날 수 있다. 불활성 Src 및/또는 Yes 단백질에 대한 추가의 노출 또는 지속적 노출이 또한 적합한 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 다양한 목적하는 치료 시간 프레임이 이러한 변수를 변형시켜 계획될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 질환 과정 또는 혈관 손상 또는 외상과 관련된 조직으로 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. Src 계열 타이로신 키나제 억제제는 화학적 Src 억제제, 단백질 Src 억제제, 또는 핵산 Src 억제제일 수 있다.

적합한 화학적 Src 계열 타이로신 키나제 억제제의 예는 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146, 겔다나마이신등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

PP1[제조원: Biomol, by licence from Pfizer]는 이들 연구를 위해 사용된 합성 Src 억제제이다. PP1은 Src 억제제의 피라졸로피리미딘 계열의 일부이다. 또 다른 합성 Src 억제제는 PP2[제조원: Calbiochem, on license from Pfizer)는 PP1와 구조적으로 관련이 있으며 또한 Src 계열 키나제 활성을 차단하는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Hanke et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(2): 695-701]. 또 다른 특이적 Src 키나제 억제제는 PD173955[문헌참조: Moasser et al., 1999, Cancer Res. 59:6145-6152; Parke Davis]를 포함하고 이에 대한 구조는 공개되어 있다. PD162531[문헌참조: Owens et al., 2000, Mol. Biol. Cell 11:51-64]은 또한 제조원(Parke Davis)로부터 입수된 특이적 Src 키나제 억제제이지만 이의 구조는 문헌으로부터 밝혀지지 않았다. 켈다나마이신은 또한 제조원[Life Technologies]으로부터 입수 가능한 Src 키나제 억제제이다. 서로 다른 회사(예를 들어, Calbiochem, RBI, Sigma)에 의해 시판되는 라디시콜은 항진균성 거대환식 락톤 항생제로서 도한 비특이적으로 단백질 타이로신 키나제 억제제로서 작용하고 Src 키나제 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 화학적 억제제는 PP1 및 PP2등이고 가장 바람직한 화학적 억제제는 PP1이다.

추가로 적합한 Src 계열 타이로신 키나제 억제제는 당해 기술 분야에 공지된 표준 분석법을 사용하여 동정되고 특징화될 수 있다. 예를 들어, Src 또는 또 다른 타이로신 키나제에 대한 강력하고 선택적인 억제제인 화학적 억제제가 검색되어 왔고 Src 계열 타이로신 키나제의 강력한 억제제로서 유용한 화학적 잔기가 동정되었다.

예를 들어, 카테콜은 천연 산물로부터 유래된 다수의 타이로신 키나제 억제제에 대한 중요한 결합 성분으로서 동정되었고 c-Src에 대한 선택적 억제제에 대한 조합 표적 인도된 선별에 의해 선택된 화합물들중에서 발견되었다[문헌참조: Maly, D.J., et al. 2000, "Combinatorial target-guided ligand assembly: Indentification of potent subtype-selective c-Src inhibitors" PNAS(USA) 97(6): 2419-2424]. 개시점으로서 Src 억제에 중요한 것으로 공지된 잔기를 사용한 조합 화학을 기본으로 하는 후보 억제제 화합물의 검색은 Src 계열 타이로신 키나제의 또 다른 화학적 억제제를 추출하고 특징화하기 위한 강력하고 선택적인 수단이다.

그러나, 폴리펩타이드 및 핵산상에 존재하는 광범위한 작용기를 모사하는 효능을 기준으로 강력한 결합 성분에 대한 주의 깊은 설별을 사용하여 활성 억제제에 대한 조합 검색을 수행하였다. 예를 들어, O-메틸 옥사임 라이브러리는 특히 이러한 작업을 위해 적합하고 라이브러리는 O-메틸하이드록실아민을 다수의 상업적으로시판되는 알데하이드와 축합시켜 용이하게 제조된다. O-알킬 옥심 형성은 생리학적 pH에서 안정한 광범위 작용기와 양립할 수 있다[문헌참조: Malay et al., supra].

상기된 바와 같이, 적합한 Src 계열 키나제 억제제는 또한 본 발명의 방법에 따른 VP 억제량의 불활성 Src 또는 Yes 단백질 또는 이의 혼합물, 또는 불활성 Src 또는 Yes, 또는 이 둘다를 발현하는 핵산 벡터를 포함한다.

또 다른 적합한 Src 계열 키나제 억제제는 본 발명에 따른 CSK, 또는 불활성화 양의 CSK를 발현하는 핵산 벡터를 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이, 뇌, 피부, 근육, 소화관, 연결 조직, 관절, 골 및 혈관이 존재하는 조직을 포함하는, 임의의 다양한 조직 또는 이러한 구성된 조직으로 이루어진 기관의 질환 증상에 VP가 관여될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 환자는 바람직하게 사람 환자이지만 본 발명의 근본은 본 발명의 방법이 모든 포유동물에 효과적인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "환자"는 모든 포유동물을 포함한다. 본원에서, 포유동물은 질환 손상과 연관된 출혈 또는 부종의 치료가 요망되는 임으의 포유동물 종이고 특히 농업용 포유동물 종 및 가정용 포유동물 종이다.

본 발명을 구현하는 방법은 본 발명의 방법을 실시함에 있어서, 화학적 Src 계열 타이로신 키나제 억제제, 불활성 Src 또는 Yes 단백질, 활성 CSK 단백질, 이러한 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이의 혼합물을 함유하는 치료학적 유효량의 생리학적으로 허용되는 조성물을 포유동물 환자에게 투여함을 포함한다.

PP1과 같은 화학적 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 투여하기 위한 투여량 범위는 체중 kg당 약 0.1mg 내지 약 10mg의 범위이거나 약제학적 담체중의 활성제의 용해도 한계치의 범위일 수 있다. 바람직하게 전형적인 투여량은 체중 kg당 약 1mg 내지 약 9mg일 수 있다. 만성 증상을 치료하기 위한 다중 투여를 위해 체중 kg당 약 0.1mg 내지 1mg과 같은 낮은 투여량일 수 있다. 덜 심각하고 용이하게 취급될 수 있는 급성 증상을 치료하기 위한 전형적인 투여량은 투여 경로가 보다 직접적인 경우 체중 kg당 약 1mg 내지 약 3mg이다. 손상의 중증도, 위치 또는 투여 경로에 따라 보다 심각한 손상을 입었거나 접근 하기 어려운 위치인 경우 또는 간접적인 전신 투여인 경우 체중당 약 3mg 내지 10mg의 보다 높은 투여량(약제학적 담체중의 제제의 용해도 한계치)이 사용될 수 있다.

급성 손상 또는 외상인 경우, 사고 발행후 가능한한 즉시 치료제를 투여하는 것이 가장 좋다. 그러나, Src 계열 타이로신 키나제 억제제의 효과적인 투여 시간은 급성 사고인 경우 손상 또는 외상 발생 시점에서 약 48시간 이내 일 수 있다. 약 24시간 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내에 투여하는 것이 바람직하고 6시간 이내에 투여하는 것이 가장 바람직하다. 손상 발생 48시간 후의 투여는 추가의 출혈 또는 부종으로 인한 추가의 조직 손상을 완화시키는데 적절할 수 있지만 초기 조직 손상에 대한 효과는 크게 감소될 수 있다.

수술 과정에 다른 출혈 또는 부종을 예방하기 위해 투여되는 경우, 또는 진단을 용이하게 하기 위한 관점에서 투여되는 경우, 임의의 실질적으로 VP가 증가하기전에 또는 이러한 VP를 증가시키는 과정동안에 투여할 수 있다. VP를 증가시키고 이와 연관된 출혈 또는 부종을 유발하는 만성 증상을 치료하기 위해, 연속 투여 섭생으로 활성 Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 투여될 수 있다.

불활성 Src 또는 Yes 단백질 투여를 위한 투여량 범위는 추가로 본원에 기술되는 바와 같이 단백질 형태 및 이의 효능에 좌우되고 VP 및 이에 의해 매개되는 질환 증상이 환화되는 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양이다. 투여량은 고점도 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전증등과 같은 역효과를 일으킬 정도로 높지 않아야 한다.

치료학적 VP 유효 조절량은 치료된 조직에서의 VP가 측정 가능한 정도로 조절되었음을 나타내는데 충분한, 활성 CSK 또는 불활성 Src 또는 Yes 단백질, 또는 이의 혼합물, 이러한 단백질을 암호화하는 핵산의 양, 즉, VP-조절량이다. VP의 조절은 본원에 기술된 바와 같은 분석 또는 당해 기술분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. VP의 조절은 본원에 기술된 바와 같이 밀러 분석 또는 당해 기술 분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.

일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 성별 및 질환 정도에 따라 다양할 수 있고 당해 기술 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 또한 복합적인 경우에 개인 의사에 의해 조정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적인 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 치료될 조직은 전형적으로 전신성 투여에 의해 체내에서 접근 가능할 수 있어서 가장 흔히 치료학적 조성물을 정맥내 투여하여 치료되고 표적화된 조직이 표적 분자를 함유할 가능성 있는 경우 또 다른 조직 및전달 수단이 고려된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 정맥내, 직장내, 근육내, 피하내, 강내, 경피적으로 투여될 수 있고 연동 수단에 의해 전달될 수 있다.

정맥내 투여는 단위 투여량을 주사하여 수행된다. 본 발명의 치료학적 조성물을 언급하는데 사용되는 용어 "단위 투여량"은 피검자의 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위체를 언급하고 각 단위체는 요구되는 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 연합하여 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유하고 있다.

하나의 바람직한 양태에서, 활성제는 1회 투여량으로 정맥내 투여된다. 직접적인 주사 또는 해부학적으로 분리된 격막을 사용하거나, 표적 기관계의 미소순환시키거나 순환계에서 관류시키거나 카테터를 사용한 병든 조직과 연관된 혈관 형성의 표적 영역을 일시적으로 폐쇄시킴에 의해 국부적으로 투여된다.

당해 조성물은 투여 제제와 양립할 수 있는 방식 및 사용될 활성 성분에 대한 피검자의 용량 및 목적하는 치료 효과의 정도에 따라 다양하다. 투여될 활성 성분의 정확한 양은 담당 의사의 판단에 좌우되고 각 개인마다 독특하다. 그러나, 전신성 투여를 위해 적합한 투여 범위가 본원에 기술되어 있고 투여 경로에 좌우된다. 투여를 위해 적합한 투여 섭생은 또한 다양할 수 있지만 초기 투여에 이어서 1시간 이상의 시간 간역으로 반복 투여하고 이어서 주사 또는 또 다른 투여 방법에 의해 투여하는 것이 일반적이다. 또한, 생체내 치료법에 특정된 범위의 혈액 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.

질환 증상, 손상 또는 외상과 연관된 출혈 또는 부종으로 인한 조직 손상을완화시키는 본 발명의 방법은 질환 증상을 환화시키고 질환에 따라 질환을 치료하는데 기여할 수 있다. 조직내 혈관 투과성 정도 및 본 발명의 방법에 의해 성취된 억제 정도는 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 특히, 당해 방법은 VP의 손상 유도된 증가 및 이어지는 연관된 조직에 대한 출혈 및/또는 손상으로 인해 일어나는 발작 또는 또 다른 뇌혈관 사고와 관련된 CNS의 손상을 완화시키는데 적합하다.

하나의 관련 양태에서, 치료될 조직은 염증 조직이고 혈관 투과성의 억제는 VEGF 매개된 자극으로 인한 것이다. 이러한 유형의 일에 대해 본 발명의 방법은 만성 관절 류마티즘을 앓는 환자에서와 같은 관절 조직, 면역 또는 비면역 조직, 건선 조직등에서의 VP를 억제시키는 것이다.

또 다른 관련 양태에서, 치료될 조직은 낭뇨병 망막증, 황반 퇴화 또는 혈관 신생 녹내장과 같은 망막 질환을 앓는 환자의 망막 조직이고 억제될 VP는 망막 조직이 새로운 혈관를 형성하는 경우 망막 조직 VP이다.

손상 또는 질환 증상과 연관된 조직내 혈관 투과성을 억제하기 위한 본 발명의 방법 및 또한 혈관 투과성 관련 질환의 치료 방법을 실시하기 위한 방법은 혈관 투과성이 증가되거나 증가될 위험이 있는 조직을 치료학적 유효량의 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

VP 및 출혈 및 부종으로 인한 조직 손상은 치료학적 조성물 투여 후 짧은 시간 내에 조절되고 완화될 수 있다. 대부분의 치료학적 효과는 급성 손상 또는 외상인 경우 투여후 3일 이내에 나타날 수 있다. 전형적으로, 만성 투여의 효과는 명백하게 나타나지 않을 것이다.

시간 제한 인자는 조직 흡수율, 세포 취득율, 단백질 이동율 또는 핵산 해독 율(치료학적 방법에 좌우됨) 및 단백질 표적율을 포함한다. 따라서, 조직 손상 조절 효과는 억제제 투여 시점에서 1시간정도의 짧은 시간에 발휘될 수 있다. 적절한 조건을 사용하여 Src 계열 타이로신 키나제 억제제에 대한 추가적인 노출 또는 지속적 노출이 또한 수행될 수 있다. 따라서, 다양하게 목적하는 치료학적 시간 프레임이 상기 변수를 변형시켜 계획될 수 있다.

F. 치료학적 조성물(일반 고려 사항)

본 발명은 본원에 기술된 치료학적 방법을 실시하는데 유용한 치료학적 조성물을 고려한다. 본 발명의 치료학적 조성물은 활성 성분으로서 분산되어 있거나 용해되어 있는 본원에 기술된 바와 같은 Src 및 Yes 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터, 또는 화학적 Src 억제제, 단백질 Src 억제제, 또는 핵산 Src 억제제와 같은 본원에 기술된 바와 같은 Src 계열 타이로신 키나제 억제제와 함께 생리학적으로 허용될 수 있는 담체를 함유한다. 바람직한 양태에서, 치료학적 조성물은 치료 목적으로 포유동물 또는 사람 환자에게 투여되는 경우 면역원성이 아니다.

Src 및 Yes 단백질은 활성, 불활성 또는 목적하는 조절에 따라 이의 혼합된 양태일 수 있다. Src 및 Yes의 바람직한 형태는 상기되어 있다. CSK 단백질은 활성 형태를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 조성물, 담체, 희석제를 언급하는데 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 어휘 변형체는 호환적으로 사용되고 이것은 물질이 구역질, 현기증, 급성 위 연동 이상항진등과 같은바람직하지 못한 생리학적 효과를 발생시키지 않고 포유동물에게 투여될 수 있다는 것을 나타낸다.

용해되어 있거나 분산되어 있는 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제조는 당해 분야에 널리 이해되고 있고 제형을 기준으로 제한될 필요는 없다. 전형적으로 이러한 조성물은 주사제, 액상 용제 또는 현탁제로서 제형화되고 사용전에 액체중에서 제형화될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있거나 리포좀 조성물로서 제공될 수 있다.

활성 성분은 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 양립할 수 있는 부형제와 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 및 에탄올등 및 이의 배합물이다. 추가로, 경우에 따라, 조성물은 활성 성분의 효과를 증진시키는 최소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제등을 함유할 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물은 성분의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산 부가염(폴리펩타이드의 유리 아미노 그룹과 형성됨)을 포함한다. 유리된 카복실 그룹과 함께 형성되는 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기염 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인등과 같은 유기염으로부터 유래될 수 있다.

생리학적으로 허용되는 담체는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 액체담체의 예는 활성 성분 및 물이외의 어떠한 물질을 함유하지 않거나 생리학적 pH 값에서 인산나트륨, 생리학적 식염수 또는 이 둘다와 같은 완충제, 예를 들어, 포스페이트 완충된 식염수를 함유하는 살균 수용액이다. 여전히 추가로, 수성 담체는 하나 이상의 완충염 뿐만 아니라 염화나트륨 및 염화칼륨, 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 또 다른 용질을 함유할 수 있다.

액체 조성물은 또한 물이 추가된 액체상 및 물을 제외한 액체상을 함유할 수 있다. 이러한 추가된 액체상의 예는 글리세린, 식물성 오일(예: 면실 오일) 및 수중유 유제이다.

F(i). 본 발명의 VP 조절용 치료학적 조성물.

본 발명의 한 양태에서, 치료학적 조성물은 Src 및/또는 Yes 단백질, 또는 유효량의 Src 및/또는 Yes 단백질을 발현시키는데 충분한 재조합 DNA 발현 벡터, 를 함유하고 통상적으로 총 치료학적 조성물 중량당 Src 또는 Yes 단백질의 0.1 중량% 이상의 향을 함유하도록 제형화된다. 중량 %는 총 조성물에 대한 Src 또는 Yes 단백질의 중량 비율이다. 따라서, 에를 들어, 0.1 중량%는 총 조성물 100g당 Src 또는 Yes 단백질의 0.1g이다. DNA 발현 벡터에 대해 투여되는 양은 발현 벡터의 성질, 치료될 조직 및 기타 고려될 사항에 좌우된다.

F(ii). 본 발명의 Src 계열 타이로신 키나제 억제제의 치료학적 조성물

본 발명의 화학적 치료학적 조성물은 활성 성분으로서 분산되어 있거나 용해되어 있는 Src 계열 타이로신 키나제 억제제와 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 함유한다.

본 발명의 단백질 치료학적 조성물은 Src 계열 타이로신 키나제 억제제로서 용해되어 있거나 분산되어 있는 불활성 Src, 불활성 Yes 또는 활성 CSK 단백질과 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 함유한다.

본 발명의 핵산 치료학적 조성물은 Src 계열 타이로신 키나제 억제제로서 용해되어 있거나 분산되어 있는 불활성 Src, 불활성 Yes, 또는 활성 CSK 단백질을 암호화하는 핵산과 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 함유한다.

적합한 Src 계열 타이로신 키나제 억제제는 특이적으로 Src 계열 타이로신 키나제의 생물학적 타이로신 키나제 활성을 억제한다. 가장 적합한 Src 계열 타이로신 키나제는^pp60Src 단백질의 활성을 억제하는 1차 특이성을 갖고 2차적으로 가장 밀접하게 관련된 Yes와 같은 Src 계열 타이로신 키나제를 억제한다. 특히 적합한 Src 계열 타이로신 키나제 억제제의 예는 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146, 겔다나마이신등을 포함한다. 추가로 적합한 화학적 Src 계열 타이로신 키나제 억제제는 당해 기술분야에 공지된 표준 분석을 사용하여 동정되고 특징화될 수 있다.

VP를 자극하는 대신 억제하는 것으로 밝혀진 Src의 돌연변이는 불활성 Src 돌연변이로서 언급된다. 이러한 억제 활성을 부여하는 돌연변이를 갖는 단백질은 또한 Src의 내인성 활성에 의한 것 뿐만 아니라 성장 인자 자극으로부터 비롯된 증진된 Src 활성에 의한 것을 포함하는 VP를 억제하는 우성 네가티브 Src 단백질로서 언급된다. 따라서, 본 발명의 야생형 c-Src의 특정 돌연변이는 도한 혈관 성장 및VP를 차단함에 따라서 예를 들어, 생체내 VP를 감소시키는 이의 능력 관점에서 우성 네가티브로서 작용할 수 있다. 따라서, 또 다른 적합한 Src 계열 타이로신 키나제 억제제는 Src 또는 Yes 활성을 길항시켜 표적 조직내 혈관의 혈관 투과성을 억제하거나 감소시킬 수 있는 불활성 형태의 Src 및 Yes 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 불활성 Src 단백질은 Src 251이다. 또 다른 바람직한 불활성 Src 단백질은 Src K295M이다. 바람직한 불활성 Yes 단밸질은 야생형 단백질과 비교하여 키나제 활성이 감소되었다.

또 다른 Src 계열 타이로신 키나제 억제제는 표적화된 세포에서 Src 또는 Yes 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 핵산, 핵산 동족체 또는 단백질 핵산일 수 있다. 안티센스 분자는, Src 또는 Yes 단백질을 암호화하는 mRNA와 하이브리드화 할 수 있는 안티센스 핵산이 상기 mRNA와 하이브리드화하여 타이로신 키나제 단백질 Src 또는 Yes의 세포 발현을 억제시키는 경우 및 적합한 약제학적 담체로 표적 세포로 형질감염되는 경우 치료학적 VP 유효 조절량일 수 있다.

상기된 바와 같이, 바람직한 억제 c-Src 단백질은 Src의 처음 251개의 아미노산만이 발현되는 Src 251을 포함한다. 상기 상제물에는 완전한 키나제 도메인이 결핍되어 있고 따라서 "키나제 사멸" Src 단백질로서 언급된다. 2번째 작제물은 259번 라이신 아미노산 잔기가 메티오닌으로 돌연변이된 Src(K295M) 돌연변이다. 키나제 도메인중의 이러한 점 돌연변이는 ATP 결합을 방해하고 또한 혈관 세포 및 종양 세포 신호 전달 및 증식과 관련된 키나제 의존성 Src 기능을 차단한다.

점 돌연변이에 있어서, 목적하는 억제 활성을 유발하는 임의의 돌연변이가본 발명에 사용하기 위해 고려된다. Src 단백질의 목적하는 조절 효과가 완전한 경우 발현된 아미노산 태그, 항원 에피토프, 형광 단백질, 또는 기타 단백질 또는 펩타이드와 목적하는 Src 단백질(돌연변이 단백질 또는 이의 단편)이 배합된 융합 단백질 작제물이 고려된다.

유사하게, Src 단백질 활성(예를 들어, CSK(C-말단 Src 키나제))에 대한 외인성 억제제의 첨가 또는 표적화된 조직내 이러한 억제제 발현의 자극이 또한 Src 활성을 억제하기 위한 수단이다. Src를 불활성화시키는 타이로신의 인산화는 CSK로서 언급된 c-말단 Src 키나제에 의한 네가티브 조절을 위한 수단이다[문헌참조: Nada et al., 1991, Nature 351:69-72; Okada et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(36): 24249-24252]. CSK가 야생형 Src중에 527번 아미노산을 인산화하는 경우, Src 단백질은 불활성화된다. 따러서, CSK는 Src 활성의 유용하고 강력한 억제제이다. 450개 아미노산의 사람 CSK 단백질 서열은 승인 번호 P41240으로서 동정되고 스위스 단백질 데이타 베이스에서 발견될 수 있다. 사람 CSK를 암호화하는 mRNA 핵산 서열은 GenBank 데이타베이스에서 승인번호 제NM 00483호로 동정된다.

본 발명의 한 양태에서, 약제학적 조성물은 혈관 투과성 조절량의 Src, Yes 및/또는 CSK 단백질 또는 유효량의 Src, Yes 또는 활성 CSK 단백질을 발현시키기에 충분한 발현 벡터를 함유하고 통상적으로 총 약제학적 조성물의 중량당 단백질 0.1중량% 이상의 양을 함유하도록 제형화된다. 따라서, 0.1 중량%는 총 조성물 100g당 단백질 0.1g이다. 발현 벡터에 대한 투여량은 발현 벡터의 성질, 치료될 조직 및 기타 고려 사항에 좌우된다. 다라서 약제학적 조성물중 Src 계열 타이로신 키나제 억제제의 유효량은 Src 조절된 혈관 투과성을 치료학적으로 효과적인 조절이 되게하는 양이다. 임의의 약제학적 조성물의 치료학적 양은 그 자체가 출혈 또는 부종 관련 조직 손상을 완화시키는 양이다.

G(i) 일반 고려 사항; 제품

본원에 사용된 바와 같이, 용어 팩킹 재료는 유리, 플라스틱, 종이 및 포일등의 한정된 범위내에 약제학적 제제를 유지할 수 있는 재료를 언급한다. 따라서, 예를 들어, 팩킹 재료는 약제학적 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 함유시키는데 사용되는 플라스틱 또는 유리 바이엘, 적층화된 엔벨로프 및 기타 컨테이너일 수 있다.

바람직한 양태에서, 팩킹 재료는 제품의 내용물 및 여기에 함유된 약제학적 제제의 용도를 명확하게 기입하는 표지를 포함한다.

G(ii) VP 조절 치료학적 조성물; 제품

본 발명은 치료학적 유효량의 Src 단백질 및 Yes 단백질이 혼합물을 제공하기 위한 표지된 컨테이너를 포함하는 제품을 고려한다. 제품은 팩킹 재료 및 팩킹 재료내에 함유된 약제학적 제제를 포함한다.

제품내 약제학적 제제는 Src 및 Yes 단백질을 제공하는데 적합한 본 발명의 조성물이고 기술된 지침에 따라 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 허용되는 형태로 제형화된다. 따라서, 조성물은 Src 및 Yes 단백질, 또는 Src 단백질을 발현할 수 있는 DNA 분자, Yes 단백질을 발현할 수 있는 DNA 또는 2개의 단백질을 발현할 수 있는 DNA를 포함할 수 있다. 제품은 본원에 지적된 증상을 치료하는데 사용하기에 충분한 양의 약제학적 제제를 단일 또는 다중 투여 형태로 함유한다.

Src 또는 Yes 단백질은 활성 또는 불활성 또는 이의 혼합된 양태일 수 있고 목적하는 조절 수위에 의존한다. 활성 및 불활성 Src 및 Yes의 바람직한 형태가 상기 기술되어 있다.

팩킹 재료는 거기에 함유된 예를 들어, 약제학적 제제의 용도(즉, 혈관 투과성의 억제 또는 강화에 의해 도움이 되는 증상 및 본원에 기술된 증상을 치료하기 위한 용도)가 명시된 표지를 포함한다. 표지는 추가로 사용 지침서 및 시판에 요구될 수 있는 관련 정보를 포함할 수 있다. 팩킹 재료는 약제학적 제제를 저장하기 위한 컨테이너를 포함한다.

G(iii) Src 계열 타이로신 키나제 억제제 조성물; 제품

본 발명은 또한 치료학적 유효량의 Src 계열 타이로신 키나제 억제제ㅓ를 제공하기 위한 표지된 컨테이너인 제품을 고려한다. 억제제는 팩킹된 화학물질, 단백질 또는 핵산 Src 계열 타이로신 키나제 억제제, 하나 이상의 이들의 배합물 또는 이의 혼합물일 수 있다. 제품은 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 제제를 포함한다. 제품은 또한 2개이상의 준 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 포함할 수 있고 이것은 함께 공동 상승 효과적으로 작용하여 출혈 또는 부종으로 인한 조직 손상을 완화시킨다.

제품내 약제학적 제제는 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 제공하는데 적합한 본 발명의 조성물이고 기술된 지적에 따른 본원 기술된 약제학적으로 허용되는 형태로 제형화된다. 따라서, 조성물은 PP1, PP2, PD173955, AGL1872,PD162531, 라디시콜 R2146 및 겔다나마이신, 불활성 Src, 불활성 Yes와 같은 단백질 억제제, 활성 CSK 단백질 또는 상기 단백질 또는 조합된 단백질을 발현할 수 있는 핵산분자를 포함할 수 있다. 제품은 본원에 지적된 증상을 치료하는데 사용하기에 충분한 양의 약제학적 제제를 단일 또는 다중 투여 형태로 포함한다.

팩킹 재료는 여기에 함유된 약제학적 제제의 용도(즉, 혈관 투과성 증가 억제에 의해 도움이 되는 증상 및 본원에 기술된 증상을 치료하기 위한 용도)를 명시한 표지를 포함한다. 표지는 추가로 사용 지침서 및 시판하는데 요구될 수 있는 관련 정보를 포함할 수 있다. 팩킹 재료는 약제학적 제제의 저장용 컨테이너를 포함할 수 있다.

실시예

본 발명에 관한 하기 실시예는 예시하고자 하는 것이지 특별히 본 발명을 제한하고자 하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 더욱이, 당해 분야의 기술자가 인지할 수 있는, 지금 공지되어 있거나 후에 개발될 본 발명의 변형된 방법이 이후에 청구되는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 사료되어야만 한다.

1. c-src 또는 c-yes 발현 작제물의 제조

본 발명의 방법에 의해 VP 및 혈관 형성을 조절하는데 유용한 발현 작제물을 제조하기 위해 c-src cDNA를 유전자 조작하여 발현 작제물/벡터에 삽입한다.

야생형(즉 내인성) 닭 c-src를 암호화하는 cDNA 서열은 도 2에 도시된 암호화된 아미노산 잔기 서열(서열 3)과 함께 도 1(서열 2)에 나타낸다. 암호화된 단백질 서열을 112 내지 1713번 위치의 cDNA 뉴클레오타이드로부터 해독한다. 사람c-src cDNA의 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열(서열 4) 및 암호화된 아미노산 잔기 서열(서열 5)을 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다. 사람 단백질 서열에 있어서, 암호화 서열은 cDNA의 134번 내지 1486번의 뉴클레오타이드 위치에서 시작한다. 야생형 뿐만 아니라 다수의 돌연변이된 c-src cDNA를 제조한다. 돌연변이된 c-src 작제물을 문헌[참조: Kaplan et al., EMBO J., 13:4745-4756(1994)]에 기술된 바와 같은 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 제조한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 돌연변이된 Src 단백질을 암호화하는 돌연변이된 c-Src 작제물은 문헌[참조: Kaplan et al., id.. Kaplan et al.]에 기술되어 있고 이 문헌은 본 발명을 실시하는데 유용한 다양한 돌연변이된 c-Src 작제물 및 암호화된 단백질을 기술하고 있다. 예를 들어, 캐플란등은 SrcA 및 Src251을 포함하여, 도 1의 닭 c-src 대립 형질 유전자의 다양한 생성물을 기술하고 있다.

본 발명은 VP를 조절하기 위한 2개 카테고리의 c-Src 기능을 기술하고 있다. 이전에 논의된 바와 같이, 하나의 카테고리는 VP를 증가시켜 활성 단백질일 것으로 사료되는 Src 분자를 포함한다. 다양한 돌연변이와 함께 야생형 Src는 본 발명에서 VP를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 혈관 성장 및 VP를 유도하는 능력으로 작용하는 야생형 c-src의 하나의 돌연변이체는 527번의 아미노산 잔기 위치의 타이로신이 페닐알라닌으로 대체된 점 돌연변이를 갖는 Src A 돌연변이체이다. 이러한 부위는 정상적으로 키나제 CSK로서 언급되는 c-Src 키나제에 의한 네가티브 조절을 위한 부위이다. CSK가 야생형 Src의 527번 아미노산을 인산화하는 경우, 단백질은 불활성화된다. 그러나, 527번 아미노산에서 돌연변이된 Src A에서, 타이로신이 페닐알라닌으로 전환됨에 따라서 단백질에 지속적(즉, 영구적)인 활성을 부여하여 단백질이 인산화에 의해 불활성화되지 않는다.

Src에서 또 다른 돌연변이는 VP를 자극하는 대신에 이를 억제하는 VP에 대해 반대 조절 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 돌연변이는 불활성 Src 돌연변이로서 언급된다. 억제 활성을 부여하는 돌연변이를 갖는 단백질은 또한 Src의 내인성 활성으로부터 유래할 뿐만 아니라 성장 인자 자극으로부터 유래된 증진된 Src 활성을 포함하여, 이들이 VP를 억제한다는 점에서 우성 네가티브 Src 단백질로서 언급된다. 따라서, 본 발명의 야생형 c-src의 특정 돌연변이는 또한 혈관 성장 및 VP를 차단하는 능력 및 예를 들어 생체내 VP를 감소시키는 능력 관점에서 우성 네가티브로서 작용할 수 있다.

이러한 바람직한 억제 c-Src 단백질은 Src의 처음 251개의 아미노산만이 발현되는 Src 251를 포함한다. 이러한 작제물은 완전한 키나제 도메인이 결핍되어 있어 "키나제 사멸" Src 단백질로서 언급된다. 2번째 작제물은 295번의 라이신 아미노산 잔기가 메티오닌으로 돌연변이된 Src(K295M) 돌연변이이다. 키나제 도메인내 이러한 점 돌연변이는 ATP 결합을 방해하고 또한 혈관 세포 및 종양 세포 신호 전달 및 증식과 관련된 키나제-의존성 Src 기능을 차단한다.

점 돌연변이에 대해서, 목적하는 억제 또는 자극 활성을 유발하는 임의의 돌연변이를 본 발명에 사용하기 위해 고려되고 있다. Src 단백질의 목적하는 조절 효과가 온전하기만 하다면 발현된 아미노산 태그, 항원 에피토프, 형광 단백질 또는 상기 단백질 또는 펩타이드와 목적하는 Src 단백질(돌연변이체 또는 이의 단편)을 조합한 융합 단백질 작제물이 또한 고려된다.

예를 들어, 수득한 돌연변이된 아미노산 잔기가 타이로신, 세린 또는 트레오닌이 아닌 이상 527번 잔기에서 Src의 활성화 돌연변이를 위해서 본 발명은 목적하는 위치에서 아미노산이 교대로 나타나도록 존재하여 Src 단백질에게 목적하는 활성인 VP 촉진 조절 활성을 부여할 것으로 사료되고 있다.

Src 계열 키나제 Yes는 선행 기술 분야에 기술되어 있지만 이의 세포 기능에 대해서는 많이 공지되어 있지 않다[문헌참조: Burck et al., 1988, The Oncogenes, Springer-Verlag, New York, pp. 133-155; Marth et al., 1985, Cell, 43:393; Semba et al., 1986, PNAS(USA) 83:5459; Shibuya et al., 1982, J. Virol. 42:143; Yoshida et al., 1985, Jpn. J. Cancer Res. 76:559]. 바람직한 활성 사람 Yes 단백질은 문헌[참조: Sukegawa et al. 1987, Mol Cell Biol. 7:41-47]에 기술된 핵산에 의해 암호화되어 있다. 사람 Yes 단백질 및 Yes를 암호화하는 핵산에 대한 불활성화 변형은 Src에 대해 기술된 바와 같이 성취될 수 있다.

Src/돌연변이	Src 기능	VP 및 혈관 형성에 대한 효과
c-src	+ 활성	자극
SrcA(T527F)	+ 활성	자극
Src251(점)	+ 활성	자극
Src251	- 불활성	억제
Src(절단형)	- 불활성	억제
Src(K295M)	- 불활성	억제
Src(점)	- 불활성	억제

본 발명에 사용하기 위한 하나의 바람직한 발현 작제물은 RCASBP(A) 작제물(서열 1)이다. 이러한 발현 벡터는 역가가 개선된 증진된 브라이언 폴리머라제(BP)와 함께 일련의 복제 컴피턴트 아비안 사르코마 바이러스를 기본으로 한 것이고 정상적인 아비안 세포상에 발현되는 A 유형의 엔벨로프 당단백질에 특이적이다[문헌참조: Methods in Cell Biology, 52:179-214(1997); Hughes et al., 1987, J. Virol. 61:3004-3012; Fekete & Cepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4):2604-2613; Itoh et al., 1996, Development 122:291-300; and Stott et al., 1998, BioTechniques 24:660-666]. RCASBP(A)에 대한 완전한 서열(서열 1)은 서열 목록에 나타내고 본원에서 RCAS로 언급되는 작제물의 제한 지도는 도 10에 묘사되어 있다.

최초 Src 251 작제물을 문헌[참조: Dr. Pam Schwartzberg, et NIH in Dr. Harold Varmus'laboratory]에 따라 서브클로닝한다. Not I-BstB1-Not I 제한 부위를 포함하는 링커를 Src 251 5' 말단중에 유일한 Not I 부위로 삽입하여 발현용 src cDNA 서열을 클로닝한다. Src는 3' 말단에 유일한 Cla I 부위를 갖는다. Src 251의 BstB1 및 Cla I로의 분해는 BstB1-ClaI 단편을 생성시키고 이것은 이어서 RCASBP(A)상의 Cla I 부위에 연결시킨다. BstB1 오버행(overhang)은 Cla I로 다시 절단되지 않는 ClaI 오버행에 연결시킨다.

본 발명을 실시하는데 사용되기 적합한 Src 작제물은 첫번째로 Src 251을 함유한 RCAS 벡터를 Not I 및 Cla I(DAM+ 배경하에)로 분해시켜 유사하게 분해된 Src cDNA를 삽입시켜 상기 벡터중에 용이하게 수득한다. 따라서, Src 251를 포함하는 상기 초기 RCASBP(A) 작제물을 사용하여 상기된 바와 같고 문헌[참조:Kaplan et al. 1994, The EMBO J. 13(20):4745-4756]에 기술된 바와 같은 모든 다른 Src 작제물을 Src 251 작제를 통해 생성된 Not I-Cla I 단편을 통해 RCASBP(A)에 서브클로닝한다. cDNA에서 목적하는 c-src 돌연변이를 제조하 위해 당해 기술 분야의 기술자에게 친숙한 표준 부위 지시된 돌연변이 유발 과정을 사용한다. 목적하는 c-src 돌연변이를 cDNA에서 생성시키기 위해 당해 기술 분야의 기술자에게 친숙한 표준 부위 지시된 돌연변이 유발 과정을 사용한다. 목적하는 돌연변이를 도입하도록 디자인된 PCR 프라이머를 제한 절단 부위를 갖도록 디자인하여 후속 클로닝 단계를 수월하게 한다. Src 암호화 핵산 서열의 전체 절편은 닭, 사람 및 Src의 동족체의 공지된 cDNA를 기본으로 하는 PCR 증폭 기술을 통해 핵산 서열로부터 삭제함에 이어서 새로운 작제물을 형성한다.

본 발명의 한 양태에 있어서, src 핵산을 증폭시키는데 사용되는 3' PCR 프라이머는 또한 판독내 서열을 암호화하고 있다. 이러한 프라이머를 사용하여 9E10-myc 에피토프 태그를 후속의 Src 작제물의 카복시 말단에 첨가한다. 하기 아미노산은 Src의 251번째 아미노산 뒤에 첨가하여 9E10-myc 에피토프 태그[VDMEQKLIAEEDIN(서열 6)]를 함유한 벡터 작제물을 제조한다. 2개 별도의 PCR을 각 작제물에 대해 수행하고 유사한 결과를 수득한다. PCR에 의해 작제된 모든 돌연변이 작제물을 PCR로 서열분석하여 클론의 예상된 DNA 서열을 확인한다. 본 발명의 발현 시스템에 사용하기 위한 야생형 및 돌연변이된 Src cDNA는 또한 사람 src 뿐만 아니라 아비안 및 여러개의 키나제 사멸 및 활성화된 돌연변이된 형태를 판매하는 제조원[Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY]으로부터 입수한다.

본 발명의 Src 또는 Yes 단백질을 발현하는데 사용하기 위한 또 다른 발현 벡터는 또한 미국 특허 제4,797,368호, 제5,173,414호, 제5,436,146호, 제5,589,377호 및 제5,670,488호에 기술된 바와 같은 아데노바이러스 벡터를 포함한다. Src 또는 Yes 조절 단백질을 전달하기 위한 또 다른 방법은 미국 특허 제5,675,954호에 기술된 바와 같은 비-바이러스 벡터 시스템을 사용한 Src 또는 Yes cDNA의 전달 및 미국 특허 제5,589,466호에 기술된 바와 같은 알몸 DNA 그 자체로서 cDNA의 전달을 포함한다. 본 발명의 작제물의 전달은 또한 하기 CAM 분석 시스템에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터를 국소적으로 적용하는 것으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 바이러스 벡터 제제는 또한 전신성 전달을 위해 혈관 베드로 정맥내 주사된다. 이들 벡터는 또한 일례로서 종양을 국부적으로 주사하여 혈관신생이 증가된 부위에 표적화될 수 있다.

시험관내 발현된 단백질이 또한 단백질 또는 폴리펩타이드의 전달을 위해 유용한 방법에 의해 선택된 Src 단백질의 발현 및 정제에 이어서 전달하기 위해 고려된다. 한가지 그러한 방법은 미국 특허 제4,356,167호, 제5,580,575호, 제5,542,935호 및 제5,643,599호에 기술된 바와 같은 리포좀 전달 시스템을 포함한다. 또 다른 벡터 및 단백질 전달 시스템이 본 발명의 Src 또는 Yes 단백질을 발현하고/하거나 전달하는데 사용하기 위해 당해 기술 분야의 통상적인 기술자에게 널리 공지되어 있다.

2. 비처리된 병아리 융모막요막성 막(CAM)의 특성화

A. CAM의 제조

정상적인 배아 혈관 형성이 성숙한 혈관을 형성한 후 병아리 융모막요막성 막상에 혈관 형성을 유도할 수 있다. 문헌[참조: Leibovich et al., Nature, 329:630(1987) and Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597(1975)]에 기술된 바와 같이 특정 사이토킨 또는 종양 단편에 응답하여 혈관 형성이 유발되는 것으로 밝혀졌다. CAMs는 후속의 혈관 형성 유도 및 이의 억제를 위해 병아리 배아로 부터 제조한다. 10일된 병아리 배아를 공급원[McIntyre Poultry(Lakeside, CA)]으로부터 수득하고 60% 습도와 함께 37℃에서 항온처리한다. 알이 소형 크래프트 드릴을 사용하여 공기 주머니에서 직접적으로 나오는 종결 시점에서 알 껍질에 작은 구멍이 생겨난다[문헌참조: Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI]. 2번째 구멍이 이전에 알을 캔들링(candling)하여 측정되는 배아 혈관이 없는 영역에서 알의 광범위 측면상에 생겨난다. 네가티브 압력을 본래의 구멍에 적용하여 껍질 막으로부터 CAM이 삐져나와 CAM에 대한 거짖 공기 주머니가 생긴다. 소형 모델 분쇄 휠(Dremel)을 사용하여 떨어뜨린 CAM에 대해 껍질을 통해 1.0cm x 1.0cm 평방의 창을 절단한다. 소형 창은 바탕이 되는 CAM에 직접적으로 접근가능하게 한다.

이어서 수득한 CAM 제제를, 배아 혈관신생에 대한 효과를 평가하는데 사용되는 모델을 반영한 CAM에 대한 추가의 처리 없이 혈관 신생 활성화를 특징으로하는 단계인 배아 형성 6일째에 사용하거나 혈관 형성이 감소되는 배아 형성의 10일째에 사용한다. 후자의 제제가 하기에 기술되는 바와 같이 사이토킨 처리 또는 종양 접촉에 응답하는 새로운 혈관 신생을 유도하기 위한 본 발명에서 사용된다.

3. CAM 혈관 형성 분석

A. 성장 인자에 의해 유도된 혈관 형성

혈관 형성은 사이토킨 또는 성장 인자에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 행크스 바란스드 솔트 용액(HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) 또는 2㎍/mm의 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 또는 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)(Genzyme, Cambrige, MA)를 함유하는 HBSS로 포화된 5mm x 5mm 와트만 여과지를 혈관이 없는 영역에 9일 또는 10일ㄹ된 병아리 배아의 CAM상에 놓아 혈관 형성을 유도하고 창을 테이프로 밀봉한다. 또 다른 농도의 성장 인자가 혈관 성장을 유도하는데 효과적이다. 혈관 형성의 억제가 길항제의 정맥내 주사로 평가되는 분석을 위해, 혈관 형성은 처음에 섬유아세포 성장 배지내 1 내지 2㎍/ml의 bFGF 또는 VEGF를 사용하여 유도한다. 72시간후에 현미경으로 혈관 형성을 모니터한다.

B. 배아 혈관 형성

천연적으로 형성되는 배아 혈관 신생에 대한 혈관 형성 억제제의 효과를 평가하기 위한 CAM 제제는 이전에 기술된 바와 같이 6일된 배아 병아리 배아이다. 이러한 발육 단계에서, 혈관이 드 노보 성장하게됨에 따라서 본 발명의 Src 단백질에 의한 혈관 형성 조절을 평가하기 위한 유용한 시스템을 제공한다. 9 또는 10일 보다는 6일된 배아에서 분석된다는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 CAM 시스템을 제조한다.

4. CAM 분석에서 측정되는 바와 같이 혈관 형성의 조절

혈관 형성에 대한 Src 단백질의 효과를 평가하기 위해, 10일된 병아리 CAM제제상에서 하기의 분석을 수행한다. 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 RCAS 작제물 5㎍을 닭 불멸화 섬유아세포주(DF-1,gift of Doug Foster, U. of Minn)에 형질감염시킨다. 이러한 세포주 및 1차 병아리 배아 섬유아세포는 바이러스를 생산할 수 있지만 DF-1 세포주는 보다 높은 역가를 나타낸다. 바이러스 상등액을 무혈청 CLM 배지[조성: DMSO, 폴산, 글루탐산 및 MEM 비타민 용액이 보충된 F-10 배지 염기]에서 서브컨플루언트 DF-1 생산자 세포주로부터 수거한다. 35ml의 바이러스 상등액을 4℃에서 2시간동안 22,000rpm에서 초원심분리하여 농축시킨다. 이들 농축된 바이러스 펠렛을 최초 용적 100분 1의 무혈청 CLM 배지에 재현탁시키고 분취하여 -80℃에서 저장한다. RCAS-GFP로서 언급된 녹색 형광 단백질(GFP)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 일련의 희석된 대조구 바이러스 벡터를 48 내지 72시간동안 항온처리된 1차 병아리 배아 섬유아세포상에 감염시켜 역가를 평가한다. 하기의 일반적인 농축법에 따라 수득한 바이러스 스톡의 역가는 10⁸I.U./ml을 초과한다. 바이러스 스톡을 사용한 CAM 분석을 위해, 코르티손 아세테이트로 적셔진 직경 6mm의 와트만 여과지 디스크를 95% 에탄올중에 30분동안 3mg/ml의 코르티손 아세테이트중에서 제조한다. 당해 디스크를 라미나 유동 후드에 건조시킴에 이어서 디스크당 바이러스 스톡 20㎕를 10분동안 적신다. 이들 디스크를 9 또는 10일된 병아리 배아의 CAM상에 적용하고 셀로판 테이프로 밀봉하고 18 내지 24시간동안 37℃에서 항온처리한다. 이어서, 모의 PBS 또는 성장 인자중 하나를 5㎍/ml의 농도에서 CAM 조직에 대한 바이러스의 추가 부스트로서 적절한 바이러스스톡 20㎕ 용적으로 CAM에 첨가한다. 72시간 후에, CAM을 수거하고 디스크 밑에 있는 CAM에서 분기점의 수를 이중 맹검 계수하여 측정되는 바와 같이 혈관 형성 지수의 변화에 대해 조사한다, 키나제 분석을 위해, 디스크 밑의 조직을 RIPA로 수거하고 모터 분쇄기를 사용하여 파쇄하고 Src를 동량의 총 단백질로부터 면역침전시키고 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하는 시험관내 키나제 분석을 한다. 면역형광 연구를 위해, 디스크 밑의 CAM 조직을 OCT에서 동결시키고 냉동보존하며 4㎛로 절단하고 1분동안 아세톤중에 고정화시키고 이어서 이전에 기술된 바와 같이 1차 래빗 항인산화된 ERK 항체로 항온처리하고[문헌참조: Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140:1255-1263(1998)], PBS로 세척하고 형광 2차 항체를 사용하여 검출한다.

A. bFGF 또는 VEGF에 의한 내인성 Src의 활성화

혈관 형성을 조절하는 Src 활성에 대한 성장 인자의 효과를 평가하기 위해 하기의 분석을 수행한다. bFGF 또는 VEGF(2㎍/ml)에 2시간동안 노출시킨 10일된 병아리 CAM의 조직 추출물을 용해시킨다. 내인성 Src를 동량의 총 단백질로부터 면역침전시키고 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하여 시험관내 면역 복합체 키나제 분석을 수행하고 전기영동하고 니트로셀룰로스로 이전시킨다.

분석 결과는 CAM 분석에서 기본 Src 활성을 지적하는 비처리된(모의) 샘플과 비교하여 bFGF 또는 VEGF 처리된 겔의 밀도가 Src 활성의 증가에 따라 증가되었음을 입증하는 도 5에 나타낸다. bFGF 및 VEGF 둘 다는 CAM에 존재하는 내인성 Src 활성의 약 2배 증가시켰다. 상기 키나제 분석 블롯을 또한 동일량의 Src 및 IgG에대한 로딩 대조구로서 항 Src 항체로 프로브한다.

B. 병아리 CAM에서 혈관 형성에 대한 Src A의 레트로바이러스 매개 유전자 발현의 효과

CAM 제제에서 혈관 형성에 대한 돌연변이된 Src 단백질의 효과를 평가하기 위해 하기의 분석을 수행한다. 상기 분석을 위해, 9일된 병아리 CAM을 상기된 프로토콜에 따라 72시간동안 RCAS-Src A 또는 RCAS-GFP를 발현하는 레트로바이러스 또는 완충액에 노출시킨다.

상기 분석 결과는 혈관 형성의 수준이 상기된 바와 같이 정량화되는 도 5에 나타낸다. 대표적인 현미경 사진(4x)을 도 6B에 나타낸 바와 같이 입체 현미경으로 촬영한다. 기본 내인 Src 활성은 약 50의 혈관 형성 지수를 갖는다. 대조적으로 527번 아미노산 잔기가 타이로신에서 페닐알라닌으로 점 돌연변이된 레트로바이러스 벡터 발현된 RCAS-Src A로 처리된 CAM은 약 90의 혈관 형성 지수로 혈관 형성을 증가(유도)시킨다. Src-A 매개 혈관 형성의 증가는 또한 도 6B에 나타낸 사진에서 명백하다.

C. Src A의 레트로바이러스 발현은 혈관 MAP 키나제 인산화를 활성화시킨다.

혈관 MAP 키나제 인산화에 대한 성장 인자 VEGF 및 PMA와 비교되는 SrcA의 효과는 상기된 바와 같은 분석 과정에 따라 평가한다. 30분동안 VEGF 또는 PMA(상응하는 농도에서 또 다른 유사분열물질)에 노출된 10일된 병아리 CAM의 조직 추출물을 48시간동안 Src A를 발현하는 레트로바이러스로 감염된 것들과 비교한다. Src는 동일량의 총 단백질 추출물로부터 면역침전된 것 보다 많고 기질로서 FAK-GST 융합 단백질을 사용하는 시험관내 면역 복합 키나제 분석을 수행하고 전기영동하고 니트로셀룰로스로 이전시킨다.

상기 분석의 결과는 비처리된 CAM(NT)가 기본 내인성 Src 매개 혈관 MAP 키나제 인산화를 나타내는 도 7A에 나타낸다. VEGF 및 PMA 둘 다는 기본 보다 약 2배를 증가시킨다. 반대로, Src A는 비처리된 샘플에서 나타나는 것 보다 약 5배 내지 10배의 활성을 증가사킨다.

상기 총 조직 용해물의 분취량에 대해 또한 도 7B에 나타낸 항-인-ERK 항체로 면역블롯팅시킴에 의한 내인성 ERK 인산화를 측정한다. 상기 평가를 위해, 10일된 CAM을 모의 RCAS 또는 Src A를 발현하는 RCAS로 감염시킨다. 2일 후에 CAM을 절개하고 OCT에 동결보존하고 4㎛로 절단한다. 절단물을 항-인산화된 ERK 항체(New England Biolaps)로 면역염색하고 세척하고 염소 항-래빗 FITC-결합된 2차 항체로 검출한다. 형광 이미지를 냉각-CCD 카메라(Princeton Inst)로 포착한다. 현미경 사진은 모의 대조구와 비교하여 Src-A 처리된 제제로 면역 형광성이 증진되었음을 지적한다.

D. bFGF에 유도된 것이 아닌 VEGF에 의해 유도된 혈관 형성동안에 Src 활성에 대한 선택적 요구조건

성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 Src 조절 활성의 효과를 평가하기 위해, 하기의 분석을 수행한다. 9일된 병아리 CAM을 이전에 기술된 바와 같이 Src 251 또는 Src K295M으로서 언급된 우성 네가티브 Src 돌연변이를 발현하는 레트로바이러스 벡터 제제에 노출시킨다. RCAS-Src 251 또는 대조구 RCAS-GFP 레트로바이러스 또는 완충액 CAM을 20시간동안 처리함에 이어서 bFGF 또는 VEGF의 존재 또는 부재하에 추가로 72시간동안 항온처리한다.

상기된 바와 같이 정량화된 혈관 형성의 수준은 도 8A에 나타낸다. 도 8B에 나타낸 대표적인 현미경 사진(6 x)을 입체 현미경으로 촬영한다. 도 8C는 항-Src 항체로 프로브된 블롯을 설명하고 모의 처리물과 비교되는 바와 같이 형질감염된 세포에서 Src 251이 발현된다는 것을 확증한다.

상기된 분석 결과는 RCAS-GFP 대조구 유도된 혈관 형성의 존재하에 bFGF 및 VEGF 둘 다로 처리된 CAMS가 모의 또는 비처리된 CAM 제제에서 나타나는 Src 매개 기본 혈관 형성 이상으로 혈관 형성을 유도함을 지적한다. 발현된 우성 네가티브 돌연변이 Src 251은 bFGF 매개 혈관 형성을 억제하는데 효과적이지는 않지만 본래의 기선으로 되돌리면서 VEGF 유도 혈관 형성을 억제한다. 도 6B의 현미경 사진은 도 8A에 나타낸 결과를 그림으로 확인시킨다. 따라서, 혈관 형성이 VEGF로 유도되는 경우 레트로바이러스 발현된 Src 251은 효과적인 혈관 형성 억제제이다.

하기 실시예에 기술된 바와 같이 또 다른 혈관 형성 모델을 사용한 본 발명의 Src 단백질의 응용이 본 발명에 의해 고려된다.

5. 생체내 래빗 안구 모델 분석에 의해 측정되는 바와 같은 Src 조절제를 사용한 종양 조직 성장의 퇴화

성장 인자 유도된 혈관 형성에 대한 Src 조절제의 효과는 안구의 각막에 의해 예시되는 바와 같이 천연적으로 투명 구조인 것으로 관찰될 수 있다. 새로운 혈관은 혈액 공급이 풍부한 각막의 가장자리에서 혈액 공급이 일반적으로 충분하지않은 각막의 중심쪽으로 성장한다. 각막에 적용되는 경우 bFGF와 같은 혈관 형성의 자극제는 각막의 가장자리에서 새로운 혈관의 성장을 유도한다. 각막에 적용되는 혈관 형성의 길항제는 각막의 가장자리에서 새로운 혈관의 성장을 억제한다. 따라서 각막은 각막의 가장자리에서 용이하게 가시적인 단단한 콜라겐 응집된 각막 조직으로 내피 세포가 침투하여 혈관 형성이 진행된다. 따라서, 래빗 안구 모델 분석은 직접적으로 안구의 각막으로 화합물을 이식함에 따른 혈관 형성의 자극 및 억제를 직접 관찰할 생체내 모델을 제공한다.

생체내 래빗 안구 모델 분석은 성장 인자에 의해 유도된 혈관 형성을 입증한다.

성장 인자 bFGF 또는 VEGF를 사용한 생체내 래빗 아구 모델 분석에서 혈관 형성이 유도되고 하기 섹션에서 기술한다.

성장 인자 함유 하이드론 중합체 펠렛을 문헌[참조: D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085(1994)]에 기술된 바와 같이 제조한다. 각각의 펠렛은 수크랄페이트(Carafet, Marion Merrell Dow Corporation)에 따로 결합된 성장 인자 650ng을 함유하여 성장 인자를 안정화시키고 이것이 주변 조직으로 서서히 방출되도록 한다. 추가로, 이전에 기술된 바와 같이 목적하는 Src-발현 레트로바이러스를 함유하는 하이드론 펠렛을 제조한다. 펠렛은 표면에 2.5mm 코어의 구멍이 뚫린 특별히 제조된 테플론 마개의 주형이다. 이어서 펠렛을 자외선 조사에 의해 멸균시킨다. 이어서 Src 단백질의 효과를 이전에 기술한 바와 같이 평가한다.

6. 키메릭 마우스:사람 분석에 의해 측정된 바와 같이 Src 조절제를 사용한 종양 조직 성장의 생체내 퇴화

생체내 키메릭 마우스:사람 모델을 SCID 마우스의 피부 일부를 사람 신생아 포피로 대체하여 제조한다. 생체내 키메릭 마우스:사람 모델을 근본적으로 문헌[참조: Yan, et al., J. Clin. Invest., 91:986-996(1993)]에 기술된 바와 같이 제조한다. 피부의 2cm²평방 면적을 수술적으로 SCID 마우스(6 내지 8주의 나이)로부터 제거하고 사람 포피로 대체한다. 마우스를 마취시키고 외측 복부 영역의 각 측면을 면도하여 5cm²면적의 털을 제거한다. 2cm²의 2개의 환형 이식체 베드를 근막 아래의 완전한 두께의 피부를 제거하여 제조한다. 사람 신생아 포피로부터 유래된 동일 크기의 완전한 두께의 사람 피부 이식체를 상처 베드에 놓고 그 위치에 봉합한다. 미세 공극 천 테이프를 또한 상처를 덮는데 사용한다.

M21-L 사람 흑색종 세포주 또는 MDA 23.1 유방암 세포주(조직 절편과 mAb LM609와의 면역반응에 네가티브인 ATCC HTB 26; α_vβ₃)를 사용하여 SCID 마우스상의 사람 피부 이식체상에 사람 고형 종양을 형성시킨다. 5 x 10⁶M21-L 또는 MDA 23.1 세포의 단일 세포 현탁액을 피내로 주사한다. 측정 감지할만한 사람 종양의 성장을 허용하는 2 내지 4주동안 마우스를 관찰한다.

측정 감지할만한 종양이 확립된 후에, 본 발명의 레트로바이러스 제제 또는 PBS를 마우스 꼬리 정맥에 주사한다. 2 내지 3주 후에 종양을 절개하고 중량 및조직을 분석한다. 이어서 종양에 대한 본 발명의 발현된 Src 단백질의 효과를 평가한다.

7. CAM 분석에 의해 측정되는 바와 같이 Src 조절제를 사용한 사람 종양 조직 성장의 시험관내 퇴화

종양 성장은 혈관 형성에 의존한다[문헌참조: Folkman, 1992, J.Biol.Chem. 267:10931-10934; Weidner et al., 1991, N.E. J. Med. 324:1-8; Brooks et al., 1994, Cell 79:1157-1164]. 사실, 최근의 보고는 종양 성장이 VEGF 수용체 길항제의 혈관 형성 억제 효과에 민감하다는 것을 제안한다[문헌참조: Kim et al., 1993, Nature 362:8451-844]. 따라서, 본 발명자는 키나제 결실 Src 251을 전달하여 혈관 형성을 억제하는 것이 VEGF 및 매우 적은양의 bFGF를 생산하는 것으로 공지된 고도의 혈관 형성 종양인 사람 수모세포종(DAOY)의 성장에 영향을 미칠 것인가를 조사하였다.

3일 및 6일된 DAOY 수모세포종 종양 성장 분석을 이전에 기술된 바와 같이 필수적으로 병아리 CAM에서 수행한다[문헌참조: Brooks et al., 1994, supra]. 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640에서 배양된 5 x 10⁶DAOY 세포를 세척하여 DAOY 종양 단편을 생성하도록 10일된 배아의 CAM상에 접종한다. 7일된 50mg 종양 단편을 절개하고 또 다른 10일되 ㄴ배아에 재접종하고 대조구 RCAS-GFP 레트로바이러스, RCAS-Src 251, 또는 모의 처리물을 국소적으로 투여(25㎕)와 함께 추가로 3일 또는 6일동안 배양한다. 가이드로서 감염된 종양의 전체 조직 공초점 이미지를사용하여 본 발명자는 국소적 투여에 의한 종양 단편내 및 주변에 RCAS 작제물이 상당히 발현된다는 것을 측정할 수 있었다. 종양 절개 및 칭량을 단지 용이하게 한정될 수 있는 고형 종양 매쓰를 제거하는 이중 맹검 방식으로 수행한다[문헌참조: Brooks et al., 1994, supra]. 3 또는 6일후의 습윤 종양 중량을 초기 중량과 비교하고 종양 중량의 변화%를 각 그룹에 대해 측정한다.

이들 종양은 CAM상에서 용이하게 성장하고 본 발명자가 조류 특이적 RCAS 레트로바이러스를 사용함에 의해 조류 유래된 종양 혈관 형성을 선택적으로 표적화할 수 있도록 하는 활성 혈관 형성(도 9)을 나타낸다.

도 9는 RCAS-Src 251의 병아리 CAM상에서 성장하는 사람 종양으로의 전달이 종양 성장을 퇴화시킨다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다. 도 9A는 상기된 바와 같이 병아리 배아의 CAM상에서 성장하는 사람 수모세포종을 보여준다. RCAS-GFP 또는 RCAS-Src 251을 함유하는 레트로바이러스를 50mg을 초과하는 미리 확립된 종양에 국소적으로 투여한다. GFP를 발현하는 RCAS-GFP로 감염된 수모세포종 종양 단편의 대표적인 현미경 사진은 바이오 래드 레이저 공초점 스캐닝 현미경(막대 = 500㎛)을 사용한 광학적 절단에 의해 측정되는 바와 같이 종양 혈관(화살표)이 상당히 발현된다는 것을 밝힌다. 도 9B는 3 또는 6일동안 성장치시콕 이후에 이들을 절개하고 습윤 중량을 측정하는 상기된 바와 같이 처리된 종양에 대한 결과를 보여준다. 데이타는 2회의 종량 중량(종양의 초기 중량 50mg) +/- SEM의 평균 변화로서 표현한다. RCAS-Src 251은 3일후(*, P<0.002) 및 6일후(**, P<0.05)에 종양 성장에 대한 상당한 영향을 부여한다. 도 9C는 올림푸스 입체 현미경(막대 = 350㎛)으로 촬영된 배아로부터 수술적으로 제거된 수모세포종 종양의 대표적인 입체 현미경 사진을 보여준다. (하부 판넬) 각 종양에 대한 고해상도의 현미경 사진은 각 종양의 혈관 형성을 상세하게 보여준다(막대 = 350㎛). 화살표는 RCAS-Src251 처리된 종양에서 혈관이 붕괴었음을 지적한다.

상기 결과는 Src 251 함유 RCAS의 미리 확립된 수모세포종으로의 전달이 종양 관련 혈관(도 9A)에서 바이러스를 선택적으로 발현시켜 궁극적으로 6일 이내에 이들 종양을 퇴화(도 9B)시킴을 보여준다. 중요하게, Src 251 함유 바이러스로 처리된 종양 관련 혈관이 심하게 붕괴되고 대조구 동물에서의 종양 혈관에 비해 그 수가 적다(도 9C). RCAS-GFP 감염된 종양이 단지 종양 혈관 형성에서만 GFP가 위치함을 보여주는 사실은 레트로바이러스로 전달된 Src 251을 사용하여 관찰된 항 종양 효과가 이의 혈관 형성 억제 성질로 인한 것임을 제안한다.

8. bFGF 매개 혈관 형성이 아닌 VGEF 매개 혈관 형성동안에 내피 세포 생존을 위해 요구되는 Src

최근 증거는 성장 인자 수용체[문헌참조: Choi and Ballermann, 1995, J.Biol.Chem.270:21144-21150; Satake et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm. 244:642-646] 및 인테그린[문헌참조: Meredith et al., 1993, Mol. Biol. Cell 4:953-961; Brooks et al., 1994a, Science 264:569-571]이 혈관 형성 내피 세포의 생존을 촉진시킴을 제안한다. 성장 인자 및 접착 수용체 둘 다가 또한 Src 활성을 조절한다는 사실은 혈관 형성 동안에 내피 세포 생존에서 Src 역할에 대한 연구조사를 가속화시켰다. bFGF 또는 VEGF로 자극된 CAM을 Src 251 함유 레트로바이러스로 감염시키고 이들 조직의 냉각 절편에서 괴사된 세포가 존재하는지를 조사한다.

간략하게, RCAS-GFP로 처리된 CAM 또는 bFGF 또는 VEGF로 처리된 RCAS-Src 251로 처리된 CAM의 냉각 절편에서 Apoptag 키트(Oncor, Gaithersburg, MD)를 사용하여 분석한다. 또한 절편을 래빗 폴리클로날 항-vWf(biogenix, San Ramon, CA)로 면역 염색시키고 1㎍/ml DAPI로 역염색시킨다. 형광 이미지를 냉각 CCD 카메라로 포착[문헌참조: Roper, Trenton, NJ]시키고 형광 이미지를 처리하고 노출을 이전에 기술된 바와 같은 실험 처리물간에 일치시킨다[문헌참조: Ellcelri et al. 1998, supra].

레트로 바이러스 감염된 CAM 조직의 괴사 지수를 측정하기 위해, FITC-결합된 어넥신 V[문헌참조: Clontech, Palo Alto, CA]를 사용하여 세포 현탁액을 염색시키고 세척된 세포를 유동 세포측정기로 분석한다. CAM 세포의 세포 현탁액을, 이전에 기술한 바와 같이 1시간동안 37℃에서 파쇄된 절단된 CAM 조직[문헌참조: Brooks et al., 1994b]의 RPMI 1640중에서 0.1%(w/v) 콜라게나제 IV형[ Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ]으로 분해하고 100 μM 나일론 메쉬(Becton Dickinson, Fountain Lakes, NJ)를 통해 여과하여 모의 또는 바이러스 감염된 CAM으로부터 제조한다. FAC 스캔 유동 세포 측정기(Becton Dickinson)로 형광을 측정하여 10,000개의 세포를 계수한다.

1.8% 파라포름알데하이드에 고정시킨 CAM 조직 세포 제제를 콜라게나제로 분해하고 70% 에탄올중에 침지시키고 항-vWf 항체로 항온처리학고 FITC-결합된 2차항체로 검출하여 FAC에 의한 vWf 염색 측정을 수행한다.

Src 251의 전달은 bFGF에 의해서가 아닌 VEGF에 의해 자극된 CAMS에서 VIII인자 관련 항원(본 빌레브란드 인자[vWf]) 양성 혈관중에서 TUNEL이 광범위하게 염색되는 것을 촉진한다. 사실, 이들 CAM중에서 다른 세포 유형중에 최소의 어팝토시스가 관찰되고 이것은 VEGF 활성화된 혈관에서 세포 생존을 위한 Src 키나제 활성을 위해 내피 세포에 특이적일 필요가 있다는 것을 제안한다. 2번째 시리즈의 실험에서, VEGF 또는 bFGF로 자극된 레트로바이러스 감염된 CAM을 제한적으로 콜라게나제로 분해하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 이들 CAM 유래 세포가 약 20 내지 50%의 내피 세포(vWf 양성)를 함유하는 것으로 나타났고 조기 세포 괴사 마커인 어넥신 V-양성 세포의 유동 세포측정기 검출에 의해 어팝토시스를 분석한다. Src 251로 감염된 VEGF 자극 CAM으로부터 유래된 세포에서 VEGF로 처리된 모의 RCAS-GFP 감염된 CAM 유래의 세포와 비교하여 어넥신 V의 염색이 상당히 증가되었다. 반대로, 모의 감염된 CAM 유래 세포 또는 RCAS-Src 251로 감염된 세포 및 bFGF로 자극된 세포가 거의 어떠한 어넥신 V 염색을 나타내지 않는다. 추가로, 비자극되거나 bFGF 자극된 CAM 유래의 세포중에서 어떠한 어넥신 V 염색이 검출되지 않았다. 이들 데이타는 Src 키나제 활성이 CAM에서 bFGF 매개가 아닌 VEGF 매개 혈관 형성동안에 내피 세포 생존을 위해 선택적으로 요구된다는 것을 입증한다.

9. 혈관 형성의 피하 쥐 모델로서 Src 키나제 활성에 대한 선택적 요구

혈관 형성에 있어서 Src의 역할을 추가로 분석하기 위해, 쥐 모델을 사용한다. 이 경우에, 흉선 없는 wehl(nu/nu) 성인 마우스중에서 bFGF(100 ng/ml) 또는VEGF(400ng/ml)이 보충된 성장 인자 고갈된 마트리겔(Matrigel)을 피하 주사하여 혈관 형성을 유도하고 5일 후에 분석한다[문헌참조: Passaniti et al., 1992]. 조직을 제거하고 파쇄하고 단백질을 추출하고 내피 세포에 대해 특이적인 VEGF 수용체 항체(flk-1)로 면역블롯팅하여 혈관 형성을 정량한다. 병아리에서 관찰되는 바와 같이, 키나제 결실 Src 251 cDNA의 발현은 이러한 쥐 모델에서 VEGF 유도 혈관 형성을 차단하지만 bFGF 유도 혈관 형성에는 어떠한 효과를 나타내지 않는다(도 13B). 이러한 모델에서 내인성 Src의 역할을 밝히기 위해 C-말단 조절 부위를 인산화시켜 내인성 Src 활성을 억제하는 Cak 발현 레트로바이러스로 조직을 감염시킨다[문헌참조: Nada et al., 1991, Nature 361:68-72]. Cak의 발현은 bFGF 유도 혈관 형성이 아닌 VEGF 유도 혈관 형성을 차단하고(도 13), 이것은 VEGF-매개 혈관 형성에서의 내인성 Src 활성의 역할을 확증한다. 이들 바이러스 감염 VEGF 자극 조직의 혈관 신생을 FITC-결합된 항-DC34 항체(도 13) 또는 항-flk-1 항체를 사용하여 직접적으로 면역형광시켜 확인하고 각각의 냉동 절편에서 양성적으로 염색된 CD34 혈관의 수를 계수하여 정량화한다(도 13C).

간략하게, 흉선 없는 wahl(nu/nu) 마우스에서 GFP 레트로바이러스를 발현하는 2 x 20⁶의 엑트로픽 팩키징 세포와 함께 식염수 또는 VEGF(400ng/ml)을 함유하는 성장 인자 고갈된 마트리겔을 피하 주사하여 혈관 형성을 유도하고 5일 배양후에 분석한다. 내피 세포에 특이적인 VEGF 수용체 항체(flk-1)를 사용한 면역브롯팅으로 혈관 신생을 정량한다. 도 15A는 면역블롯팅 결과를 도시한다. VEGF-(400ng/ml) 또는 bFGF-(400ng/ml) 유도 혈관 형성에 대한 키나제 고갈된 Src-251, Csk 또는 GFP 레트로바이러스의 효과는 조직 용해물을 항-flk-1 항체로 면역블롯팅하여 분석한다. 이들 결과의 예는 도 15B에 도시한다. VEGF 유도 혈관 신생에 대한 Src 251- 및 Csk 발현 레트로바이러스의 효과는 20x의 3회 무작위 필드에서 간접적으로 면역형광시켜 조직 절단면의 CD34 양성 혈관의 수를 계수하여 정량한다. 플러그의 냉동절편을 항 CD34 항체 또는 항 flk 항체로 면역형광 염색하고 사진 촬영하고 CAM 혈관 형성 분석에 대해 상기된 바와 같이 정량한다.

RCAS GFP 감염 종양 단편의 전체에 걸친 형광도는 직접적으로 종양 단편을 절개하고 레어저 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드상에 직접적으로 고정되지 않은 조직을 이미지화하여 성취된다.

10. src^-/-또는 src^+/-마우스 귀에서의 VEGF의 피내 발현의 효과

닭 및 마우스 혈관 형성 모델로 수득한 결과에 이어서 직접적인 유전자 방법을 사용하여 Src^-/-마우스에서의 피내 VEGF 유도 혈관 형성을 조사한다. VEGF 둘 다가 새로운 혈관 성장을 개시하고 혈관 투과성을 촉진시킬 수 있는 것으로 공지되어 있기때문에 혈관 투과성에 대한 효과를 조사한다[문헌참조: Senger et al., 1983 Science 218:983-985; Ferrera and Davis-Smyth, 1997, Endocr. Rev. 16:4-25].

사람 VEGF cDNA를 발현하는 아데노바이러스를 src^-/-및 src^+/-마우스의 귀에 피내 주사하고 조절 β-갈락토시다제 발현 아데노바이러스를 각 마우스의 반대편귀에 주사한다. src^+/-귀에서 F 의존성 신생 혈관 성장은 처음 48시간 이내에 검출가능하고 5일동안 혈관신생을 분석한다.

간략하게, pp60^c-src, pp60^c-yes, pp60^c-fyn, 결핍 마우스(129/8v/Ev x C57B16/J)를 이전에 기술된 바와 같이 제조한다[문헌참조: Soriano et al., 1991, Cell 64:693-702]. 추가의 스톡을 잭슨 연구실로부터 구입한다. VEGF 또는 β-갈락토시다제를 발현하는 아데노바이러스 5㎕를 마우스 귀의 피내로 주사하고[문헌참조: Eriksson et al., 1980, Microvasc.Res. 19:374-378] 입체경을 사용하여 5일후에 귀를 촬영한다.

귀로 주사된 β-갈락토시다제-아데노바이러스의 X-gal 염색에 의해 측정되는 바와 같이 src^+/-및 src^-/-에서 바이러스의 발현 수준이 동일한 것으로 밝혀졌다. VEGF 주사된 src^-/-귀에서, 분기점을 계수(p < 0.05)함에 의해 측정되는 바와 같이 혈관 형성이 상당히 감소하지 않았다. 그러나, 놀랍게도 이들 동물에서 가장 명백한 표현형은 VEGF 주사된 src^+/-와 비교하여 출혈이 완전히 차단된다는 것이다. VEGF가 주사된 귀를 조사함으로써, 근본적으로 src^-/-에는 없는 src^+/-마우스에서 출혈 정도를 확인한다. 이들 동물에서의 출혈은 생체내 혈관 형성과 연관된 VP 활성[문헌참조: Dvorak et al., 1995, Am.J.Pathol. 148:1029-1039]이 pp60^c-src결핍 마우스에서 선택적으로 붕괴될 수 있다는 것을 제안한다.

11. VEGF는 pp60^c-src결핍 마우스에는 혈뇌 장벽을 극복하지 못한다.

뇌 혈관 형성은 저분자가 주변 뇌 조직으로 유출되는 것을 억제할 정도로 혈뇌 장벽이 고도로 제한적임을 특징으로 한다. 뇌에서의 종양 성장은 VEGF와 같은 혈관 형성 성장 인자의 생산으로 인해 부분적으로 당해 장벽을 극복할 수 있다. 따라서, 본 발명자는 src^+/-또는 src^-/-에서의 혈뇌 장벽 특성을 조사한다. 상기 경우에, VEGF 또는 식염수를 각각 뇌의 좌반구 또는 우반구로 주사한다. 모든 마우스에 에반스 블루 염료를 전신성 주사하여 VP 활성을 모니터한다.

간략하게, 식염수 또는 VEGF(2㎕중의 200ng)를 입체적으로 각각 정중선 좌측/우측으로 92mm인 좌전두엽 또는 우전두엽, 정수리에서 입쪽으로 0.5mm 경질막에서 깊이가 3mm으로 주사한다. 주사한지 30분후에 에반스 블루 염료 용액을 정맥내로 상기된 바와 같이 동물에게 투여한다. 추가로 30분후에, 마우스를 관류하고 뇌를 제거한다. 뇌의 신선한 고정되지 않은 냉동 절편에 대한 공초점 레이저 현미경을 사용하여 에반스 블루 염료 형광성을 관찰한다.

src^+/-에서 VGEF 주사된 반구의 위치에 뇌출혈이 일어나지만 src^-/-마우스에서는 출혈이 전혀 없다. 이것은 또한 이들 뇌의 냉각 절편에 대한 형광성 분석에 의해 검출되는 바와 같이 축적된 에반스 블루 염료를 측정하여 VP를 조사하는 경우이다. 따라서, VEGF는 활성 pp60^c-src에 의존하는 방식으로 혈뇌 장벽을 극복한다.

12. 염증과 관련이 없는 VEGF-매개 VP는 pp60^c-src에 의존한다.

src^+/-또는 src^-/-마우스에서 VP 인자로서 VEGF의 효과를 추가로 분석하고 정량하기 위해, 마일즈 분석법(Miles & Miles, 1952)을 사용하여 이들 동물 피부의 혈관 투과성을 정량적으로 측정한다. 에반스 블루 염료를 정맥내로 전신 투여 받은 src^+/-또는 src^-/-마우스의 피내로 주사한다. VEGF 주사한지 15분 이내에 src^+/-마우스에서 3배로 VP가 증가한다. 그러나, src^-/-마우스에서는 어떠한 검출 가능한 VP 활성이 관찰되지 않는다. 주사된 피부 패취의 염료 용출을 정량하고 대조구 식염수 및 bFGF와 비교한다. VEGF에 인접한 위치에 주사된 bFGF 또는 식염수 대조구는 VP를 상당히 증가시키지 못하였다.

간략하게, 마일즈 분석(Miles et al., 1962)을 사용하여 마우스에 VEGF 10㎕(400ng/ml), 알릴 이소티오시아네이트(겨자유, 광유중 20% w/v), 또는 식염수를, 0.5% 에반스 블루 염료 100㎕를 정맥내로 주사받았던 마우의 피내로 주사한다. 15분후에, 피부 패취를 절개하고 촬영하고 58℃에서 포르말린으로 용출시키고 분광측정로 정량한다.

출혈/투과성은 또한 염증동안에 일어나는 것으로 공지되어 있고 조직내 혈청 과련 접착 단백질 및 염증 세포가 축적시킨다. 사실, 염증 매개체 자체가 직접적으로 출혈을 촉진시킨다. 따라서, 이러한 염증 매개체인 알릴 이소티오시아네이트(또한 겨자유로서 공지됨)[문헌참조: Inoue et al., 1997, supra]의 VP 생성 능력에 대해 src^+/-또는 src^-/-에서 시험한다. VEGF-자극 src^-/-동물에서 관찰되는 것과 다르게는 염증 매개체 알릴 이소티오시아네이트를 주사하여도 VP가 감소되지 않는 것으로 관찰되었다. 따라서, Src가 VEGF로 유도된 VP 활성에 선택적 역할을 하지만 염증과 관련된 VP에는 영향을 주지 않는다.

13. VEGF 매개 VP 활성은 Src 및 Yes에 의존하지만 Fyn에는 의존하지 않는다.

Src 처럼 내피 세포에서 발현되는 것으로 공지된 Fyn 또는 Yes와 같은 SFK와 연관된 VEGF 유도 VP 활성을 조사하여 VP에 대해 요구되는 Src의 특이성을 조사한다[문헌참조: Bull et al., 1994, FEBS Letters, 361:41-44; Kiefer et al., 1994, Curr. Biol. 4:100-109]. 이들 3개의 SFK가 야생형 마우스의 대동맥에서 동일하게 발현되는 것으로 입증되었다. src^-/-마우스처럼, Yes 결핍 동물은 또한 VEGF 유도 VP가 결핍되어 있다. 그러나, 놀랍게도, Fyn 결핍 마우스가 대조구 동물과 크게 상이할 것이 없는 VEGF에 응답하여 높은 VP를 보유한다. src^-/-또는 yes^-/-마우스에서 VEGF 유도 VP의 붕괴는 VP 활성을 유도하지만 혈관 형성을 유도하지 않는 VEGF 매개 신호 전달 과정에 필수적임이 입증되었다.

src^+/-(도 14A, 좌측 판넬) 또는 src^-/-(도 14A, 우측 판넬) 마우스에서 VEGF의 혈관 투과성을 에반스 블루 염료를 정맥내로 주사받은 마우스의 피내로 식염수 또는 VEGF(400ng)를 주사하여 측정한다. 15분후에, 피부 패취를 촬영한다(스케일 막대 = 1mm). 별표는 주사 위치를 지적한다. VEGF, bFGF 또는 식염수의 주사 부위의 주변 영역을 절개하고 포름아미드에서 24시간동안 58℃에서 에반스 블루 염료를 용출시켜 VP를 정량하고 흡광도를 500nm에서 측정한다(도 14B, 좌측 그래프). 염증 관련 VP를 유도하는 것으로 공지된 염증 매개체(알릴 이소티오시아네이트)의 활성을 src^+/-또는 src^-/-마우스에서 시험한다(도 14B, 우측)

VP를 유도하는 VEGF의 능력을 마일즈 분석으로 src^-/-, fyn^-/-, 또는 yes^-/-마우스에서 비교한다(도 14C). 마일즈 분석 각각에 대한 데이타는 3개의 동물의 평균 ±SD로서 표현한다. 대조구 동물과 비교하여 src^-/-및 yes^-/-VP 결함은 통계학적으로 상당한 반면(^*p < 0.05, 쌍을 이룬 t 시험) VEGF 처리된 fyn^-/-마우스 또는 알릴 이소티오시아네이트 처리된 src^+/-마우스에서 VP결함은 통계학적으로 상당하지 않다(^**p < 0.05).

14. Src 계열 타이로신 키나제 억제제 처리된 마우스 및 Src^-/-마우스는 비처리된 야생형 마우스 보다 혈관에 대한 외상 또는 손상과 관련된 조직 손상이 감소하였다.

특정 투여된 Src 계열 키나제의 억제제는 발작과 같은 혈관 손상 또는 장애동안에 병리학적 출혈 및 투과성의 억제제로서 작용한다. 혈관 내피는 종양의 혈관 형성 동안에 새로운 혈관의 발생과 같은 과정을 조절하고 발작 유도된 부종 및 조직 손상동안의 혈관벽의 투과성을 조절하기 위한 많은 자극에 응답하는 율동적인세포 유형이다.

2개의 마우스 발작 모델에서 Src 경로의 약물 억제에 의한 혈관 투과성의 감소는 허혈 유도 출혈을 감소시켜 뇌 손상을 감소시키는데 충분하다. 더욱이, 유전적으로 감소된 출혈/투과성을 갖는 Src가 결핍된 마우스에서 경색 용적이 또한 감소한다. 합성 Src 억제제 데이타와 발작 및 또 다른 관련 모델에서의 출혈이 감소됨을 지지하는 유전학적 증거를 조합하여 상기 방법이 발작후 뇌손상을 감소시키는데 생리학적으로 적절함을 입증한다. 이들 신호전달 캐스케이드의 다양한 입수가능한 Src 계열 키나제 억제제를 사용한 이들 경로의 억제는 혈관 투과성 관련 조직 손상으로부터 뇌 손상을 완화시킨다는 치료학적 잇점을 갖는다.

병소 뇌 허혈을 유도하기 위한 2개의 방법을 사용한다. 병소 뇌 허혈에 대한 2개의 동물 모델이 확립되었고 발작 연구에 광범위하게 사용된다. 2개의 모델은 이전부터 뇌 허혈의 병인을 조사하고 신규 발작 억제 약물을 시험하기 위해 사용되어 왔다.

a) 마우스를 아버틴으로 마취시키고 동물을 가열 패드에 유지하여 체온을 유지한다. 우측 귀 및 우측 눈사이를 절개한다. 측두근을 함몰시켜 스컬을 노출시키고 작은 천공기를 사용하여 중간 대뇌 동맥(MCA)상의 영역에 구멍을 낸다. 뇌막을 제거하고 우측 MCA를 가열 필라멘트를 사용하여 응고시켜 폐쇄시킨다. 동물이 회복되도록 하고 이의 케이지로 다시 옮긴다. 24시간후에, 뇌를 관류시키고 제거하고 1mm 횡단 절편으로 절단한다. 절편을 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)에 침지시키고 경색된 뇌 영역을 생존(적색) 조직에 의해 둘러싸인 비염색된 (백색) 조직으로서 동정한다. 절편의 비염색된 영역의 총합에 이들의 두께를 곱하여 경색 용적을 한정한다. Src(Src -/-)가 결핍된 마우스를 사용하여 대뇌 허혈에서 Src의 역할을 연구한다. Src +/- 마우스를 대조구로서 사용한다. 본 발명자는 Src -/- 마우스에서 경색 용적이 외상을 가한지 24시간 후 대조구에서 26 ±10mm³에서 16±4mm³로 감소한다. 혈관 폐쇄한지 30분후에 직장내로 1.5mg/kg의 PP1을 C57B16 야생형 마우스에 주사하는 경우 그 효과는 현저하게 나타난다. 경색 크기를 비처리된 그룹에서의 31 ± 12mm³에서 PP1-처리된 그룹에서의 8 ±2mm³로 감소시킨다.

b) 병소 대뇌 허혈의 2번째 모델에서, MCA의 최초 지점에 색전을 일으켜 MCA를 폐쇄시킨다. 하나의 온전한 피브린 풍부 24시간된 동종성 응괴를 변형된 PE-50 카테터를 사용하여 MCA의 초기 지점에 형성시킨다. 대뇌 허혈의 유도는 반대측 반구와 비교하여 동측의 반구에서의 대뇌 혈류가 감소함으로써 입증되었다. 24시간후에 뇌를 제거하고 연속적인 절편을 제조하고 헤마톡실린-에오신(HE)으로 염색시킨다. 각 절편간의 거리를 곱한 연속 HE 절편에 경색 면적을 더하여 경색 용적을 측정한다.

본 연구에 사용되는 PP1 투여량(1.5mg/kg, 복강내)을 경험적으로 선택한다. VEGF는 뇌에서 대뇌 허혈후 약 3시간, 최대 12 내지 24시간후에 나타나는 것으로 공지되어 있다. 이러한 연구에서 PP1은 경색 개시 30분후에 투여되어 VEGF-유도 혈관 투과성 증가를 완전히 차단한다. 전형적인 VEGF 발현의 시간 경과에 따라,Src 억제제를 투여하기 위한 효험있는 치료학적 창은 발작후 12시간까지가 된다. 혈관 투과성에서 지속적인 증가와 관련되 질환에서, Src 억제 약물의 만성적인 투여가 적절하다.

도 15는 손상후 마우스 뇌에서 평균 경색 용적(mm³)의 비교 결과를 나타내는 그래프이고 이때 마우스는 이종성 Src(Src +/-), 우성 네가티브 Src 돌연변이(Src -/-), 야생형 마우스(WT) 또는 1.5mg/kg PP1(PP1)으로 처리된 야생형 마우스이다.

도 16은 CNS 손상을 유도하기 위한 처리후 추출된 관류 마우스 뇌의 샘플 연속 MRI 스캔을 설명하고 여기서, PP1 처리된 동물(우측)에서 스캔 진행 결과는 대조구 비처리된 동물(좌측)에서 스캔의 진행 결과 보다 덜 경색적임을 명백하게 보여준다.

본 발명의 방법은 Src 계열 타이로신 키나제 작용의 표적화된 억제가 억제 손상으로부터 회복되어 이로울 수 있는 또 다른 VEGF 유도 반응에 대한 장기 효과 없이 특히, VP 유도된 조직 손상의 VP를 억제하는데 초점이 맞추어져 있기 때문에 VP 유도된 조직 손상을 예방하는데 특히 적합하다. VEGF 단백질을 중화시키는 것과는 반대로, Src의 억제는 질환 후기 단계에서 이로울 수 있는 VEGF의 누적된 혈관 형성 효과를 방해하지 못한다.

합성 저분자 억제제의 사용은 일반적으로 거대 단백질을 사용하는 것 보다는 더 안전하고 취급하기가 수월하다. VEGF 수용체-쥐 면역글로불린 융합 단백질(즉, 사람 항-마우스 항체; HAMA)과 같은 재조합 단백질의 용도는 매우 해롭고 사람에게사용되는 경우 알레르기 반응을 일으킬 두려움 때문에 반복적으로 투여되지 않는다.

최종적으로, VEGF는 혈관 투과성에 영향을 미칠 수 있는 대뇌 허혈의 병인에 관여하는 다운스트림 Src, 또 다른 사이토킨(예를 들어, IL-6 및 TNF-α)의 유일한 활성화 인자가 아니다. 따라서, VEGF의 억제는 모든 후속적인 손상 관련 Src 활성화를 억제할 수 없다. 사실, PP1에 의한 경색 크기는 VEGF 길항작용에 의한 것보다 보다 현저하게 감소하는데 이것은 다른 경로가 투과성의 증가를 촉진시키는 Src 키나제를 활성화시킬 수 있다는 것을 지적한다.

앞서 기술한 내용은 당해 기술 분야의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 사료된다. 임의의 기탁된 기탁물은 본 발명의 한 측면을 설명하고자 하는 것이고 기능적으로 동등한 임의의 세포는 본 발명의 범위내에 있기 때문에 본 발명은 임의의 세포주 기탁물에 의해 이의 범위가 제한되지 말아야한다. 기탁물은 본원에 포함된 기재가 이의 최상의 양태를 포함한 본 발명의 임의의 측면을 실시할 수 있는데 비적절한 것이라는 인정하는데 참고될 사항이 아니고 또한 청구항의 범위를 특정 양태로 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 실질적으로 본원에서 밝혀지고 기술된 것들 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형된 형태가 이전에 기술된 내용을 토대로부터 당해 기술 분야의 기술자에게 명백해질 것이고 이것은 첨부된 청구항의 범위내에 있는 것이다.

Claims (115)

1. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes를 포함하는 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, Src 단백질이 Src-A인 약제학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, Src 단백질이 불활성인 약제학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, Src 단백질이 Src K295M인 약제학적 조성물.
6. 제4항에 있어서, Src 단백질이 Src 251인 약제학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, Yes 단백질이 불활성 Yes 단백질인 약제학적 조성물.
8. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 타이로신 키나제 단백질 Src 및 Yes를 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
9. 제8항에 있어서, Src 단백질이 Src-A인 약제학적 조성물.
10. 제8항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 약제학적 조성물.
11. 제8항에 있어서, Src 단백질이 불활성 Src인 약제학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, Src 단백질이 Src K295M인 약제학적 조성물.
13. 제11항에 있어서, Src 단백질이 Src 251인 약제학적 조성물.
14. 제8항에 있어서, Yes 단백질이 불활성 Yes 단백질인 약제학적 조성물.
15. 제8항에 있어서, 바이러스 유전자 전달 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
16. 제8항에 있어서, 비-바이러스 유전자 전달 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
17. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 타이로신 키나제 단백질 Src를 발현할수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 타이로신 키나제 단백질 Yes를 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
18. 제17항에 있어서, Src 단백질이 Src-A인 약제학적 조성물.
19. 제17항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 약제학적 조성물.
20. 제17항에 있어서, Src 단백질이 불활성 Src인 약제학적 조성물.
21. 제20항에 있어서, Src 단백질이 Src K295M인 약제학적 조성물.
22. 제20항에 있어서, Src 단백질이 Src 251인 약제학적 조성물.
23. 제17항에 있어서, Yes 단백질이 불활성 Yes 단백질인 약제학적 조성물.
24. 제17항에 있어서, 바이러스 유전자 전달 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
25. 제17항에 있어서, 비-바이러스 유전자 전달 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
26. Src, Yes 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 타이로신 키나제 단백질을 포함하는, 치료학적 VP 조절 유효량의 약제학적 조성물과 조직을 접촉시킴을 포함하는, 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 활성 Src이고 조절이 혈관 투과성을 강화시키는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 활성 Src 단백질이 Src A인 방법.
29. 제27항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 방법.
30. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 활성 Yes 단백질이고 조절이 혈관 투과성을 강화시키는 것인 방법.
31. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 활성 Src 단백질 및 Yes 단백질의 혼합물이고 조절이 혈관 투과성을 강화시키는 것인 방법.
32. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 불활성 Src 단백질이고 조절이혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 방법.
34. 제32항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 방법.
35. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 불활성 Yes 단백질이고 조절이 혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
36. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 불활성 Src 단백질을 포함하는 혼합물이고 조절이 혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 방법.
38. 제36항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 방법.
39. 제26항에 있어서, 타이로신 키나제 단백질이 불활성 Yes 단백질을 포함하는 혼합물이고 조절이 혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
40. Src 단백질, Yes 단백질 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는타이로신 키나제 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함하는, 치료학적 VP 조절 유효량의 약제학적 조성물과 조직을 접촉시킴을 포함하는, 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 약제학적 조성물이 레트로바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
42. 제40항에 있어서, 약제학적 조성물이 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
43. 제40항에 있어서, 핵산이 활성 Src 단백질을 발현할 수 있고 조절이 혈관 투과성을 강화시키는 것인 방법.
44. 제43항에 있어서, Src 단백질이 Src-A인 방법.
45. 제43항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 방법.
46. 제40항에 있어서, 핵산이 불활성 Src 단백질을 발현할 수 있고 조절이 혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
47. 제46항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 방법.
48. 제46항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 방법.
49. 제40항에 있어서, 핵산이 불활성 Yes 단백질을 발현할 수 있고 조절이 혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
50. 제40항에 있어서, 핵산이 불활성 Yes 단백질을 발현할 수 있고 조절이 혈관 투과성을 강화시키는 것인 방법.
51. 제40항에 있어서, 핵산이 불활성 Src 단백질 및 불활성 Yes 단백질을 발현할 수 있고 조절이 혈관 투과성을 억제하는 것인 방법.
52. 제40항에 있어서, 핵산이 불활성 Yes 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함하는 혼합물인 방법.
53. 제40항에 있어서, 핵산이 불활성 Src 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함하는 혼합물인 방법.
54. 제53항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 방법.
55. 제53항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 방법.
56. 제53항에 있어서, 불활성 Src 타이로신 키나제 단백질이 불활성 Src 251 및 Src K295M 단백질의 혼합물인 방법.
57. 제40항에 있어서, 핵산이 활성 Src 단백질 및 활성 Yes 단백질을 발현할 수 있는 방법.
58. 제40항에 있어서, 핵산이 활성 Yes 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함하는 혼합물인 방법.
59. 제40항에 있어서, 핵산이 활성 Src 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함하는 혼합물인 방법.
60. 약제학적 조성물이 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절할 수 있고 팩킹 재료가, 상기 약제학적 조성물이 혈관 투과성을 조절함에 의해 질환 증상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지적하는 표지를 포함하고 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체내에 타이로신 키나제 Src 단백질 및 Yes 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
61. 제60항에 있어서, Src 단백질이 활성 Src인 제품.
62. 제61항에 있어서, 활성 Src 단백질이 Src-A인 제품.
63. 제61항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 제품.
64. 제60항에 있어서, Src 단백질이 불활성인 제품.
65. 제64항에 있어서, Src 단백질이 Src K295M인 제품.
66. 제64항에 있어서, Src 단백질이 Src 251인 제품.
67. 제60항에 있어서, Yes 단백질이 활성인 제품.
68. 제60항에 있어서, Yes 단백질이 불활성인 제품.
69. 약제학적 조성물이 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절할 수 있고 팩킹 재료가, 상기 약제학적 조성물이 혈관 투과성을 조절함에 의해 질환 증상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지적하는 표지를 포함하고 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체내에 타이로신 키나제 Src 단백질 및 Yes 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
70. 제69항에 있어서, Src 단백질이 활성 Src인 제품.
71. 제70항에 있어서, 활성 Src 단백질이 Src-A인 제품.
72. 제70항에 있어서, Src 단백질이 527번 아미노산 잔기에 타이로신, 세린 또는 트레오닌을 제외한 다른 아미노산 잔기를 갖는 제품.
73. 제69항에 있어서, Src 단백질이 불활성인 제품.
74. 제73항에 있어서, Src 단백질이 Src K295M인 제품.
75. 제73항에 있어서, Src 단백질이 Src 251인 제품.
76. 제69항에 있어서, Yes 단백질이 활성인 제품.
77. 제69항에 있어서, Yes 단백질이 불활성인 제품.
78. 제69항에 있어서, Src 및 Yes 단백질이 약제학적으로 허용되는 담체내에 Src 단백질 및 Yes 단백질을 발현할 수 있는 핵산의 혼합물에 의해 암호화된 제품.
79. 약제학적 조성물이 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절할 수 있고 팩킹 재료가, 상기 약제학적 조성물이 혈관 투과성을 조절함에 의해 질환 증상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지적하는 표지를 포함하고 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체내에 타이로신 키나제 Yes 단백질을 발현할 수 있는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
80. 제79항에 있어서, Yes 단백질이 활성인 제품.
81. 제79항에 있어서, Yes 단백질이 불활성인 제품.
82. 약제학적 조성물이 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절할 수 있고 팩킹 재료가, 상기 약제학적 조성물이 혈관 투과성을 조절함에 의해 질환 증상을치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지적하는 표지를 포함하고 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체내에 타이로신 키나제 Yes 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
83. 제82항에 있어서, Yes 단백질이 활성인 제품.
84. 제82항에 있어서, Yes 단백질이 불활성인 제품.
85. Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 포함하는 혈관 투과성 조절량의 약제학적 조성물과 조직을 접촉시킴을 포함하는, 출혈 또는 부종과 관련된 조직 손상을 완화시키는 방법.
86. 제85항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 화학적 억제제인 방법.
87. 제86항에 있어서, 화학적 억제제가 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146 및 겔다나마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
88. 제87항에 있어서, 억제제가 PP1인 방법.
89. 제85항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 불활성 Src 단백질인 방법.
90. 제89항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 방법.
91. 제89항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 방법.
92. 제85항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 불활성 Yes 단백질인 방법.
93. 제85항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 활성 c-말단 Src 키나제(CSK) 단백질인 방법.
94. 제85항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 Src 계열 타이로신 키나제 억제제 단백질을 암호화하는 핵산인 방법.
95. 제94항에 있어서, 약제학적 조성물이 레트로바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
96. 제94항에 있어서, 약제학적 조성물이 비-바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
97. 제94항에 있어서, 억제제 단백질이 불활성 Src 단백질, 불활성 Yes 단백질, 활성 c-말단 Src 키나제(CSK) 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
98. 제97항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 방법.
99. 제97항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 방법.
100. 제85항에 있어서, 억제제가 Src 타이로신 키나제 억제제인 방법.
101. 약제학적 조성물이 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성 증가를 조절할 수 있고 팩킹 재료가, 상기 약제학적 조성물이 출혈 또는 부종 관련 질환 증상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지적하는 표지를 포함하고 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체 및 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 포함함을 특징으로 하는, 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
102. 제101항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 화학적 억제제인 제품.
103. 제102항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, 라디시콜 R2146 및 겔다나마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제품.
104. 제102항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 PP1인 제품.
105. 제101항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 불활성 Src 단백질인 제품.
106. 제105항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 제품.
107. 제105항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 제품.
108. 제101항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 불활성 Yes 단백질인 제품.
109. 제101항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 활성 c-말단 Src 키나제(CSK) 단백질인 제품.
110. 약제학적 조성물이 질환 증상을 앓는 조직내 혈관 투과성을 조절할 수 있고 팩킹 재료가, 상기 약제학적 조성물이 출혈 또는 부종 관련 질환 증상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지적하는 표지를 포함하고 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체내에 Src 계열 타이로신 키나제 억제제를 암호화하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 팩킹 재료 및 여기에 함유된 약제학적 조성물을 포함하는 제품.
111. 제110항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 불활성 Src 단백질인 제품.
112. 제111항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src K295M인 제품.
113. 제111항에 있어서, 불활성 Src 단백질이 Src 251인 제품.
114. 제110항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 불활성 Yes 단백질인 제품.
115. 제110항에 있어서, Src 계열 타이로신 키나제 억제제가 활성 c-말단 Src 키나제(CSK) 단백질인 제품.